CN106501347A - 一种肠球菌质谱库、建立方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠球菌质谱库、建立方法及用途。该肠球菌质谱库包含有16种肠球菌及各个肠球菌对应的MALDI‑TOF MS质谱图。通过常规分离鉴定方法得到上述菌株，并用16S rRNA鉴定确定为肠球菌，再通过MALDI‑TOF MS检测得到各个肠球菌的指纹图谱，采用得到的指纹图谱建立肠球菌质谱库。本发明通过对MALDI‑TOF‑MS建立的肠球菌数据库的补充和完善避免了漏检或假阳性结果的产生，弥补了目前肠球菌现有数据库信息的不足，为肠球菌种属的鉴定提供了全面、快速、准确的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于肠球菌质谱检测技术领域，具体涉及一种肠球菌质谱库、建立方法及用途。
背景技术
肠球菌是人和动物胃肠道的正常菌群，异位寄生易导致呼吸道和泌尿生殖道等部位的感染，是医院感染的重要致病菌之一，同时作为废水中的优势菌群，也是食品和饮用水中粪便污染的指示菌。目前，国内外对肠球菌感染动物的报道主要以感染粪肠球菌、屎肠球菌居多，肠球菌感染猪仔能引起一种高热、皮下及实质脏器肿大、出血为特征的传染病，给养猪业造成了严重的经济损失。
在药物防治肠球菌的同时，肠球菌对现有抗生素能产生不同程度的抗药性，其抗性基因通过食物链由动物传播给人或在其他细菌之间传递，这使得肠球菌快速准确的鉴定显得尤为重要，传统的肠球菌鉴定方法主要有革兰染色、细菌分离培养和生化试验等，但是这些鉴定方法的耗时长、鉴定范围有限，大大影响肠球菌的鉴定速度和准确性，对肠球菌的控制有一定程度的阻碍。
基于辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是近年来发展的用于病原微生物快速鉴定的一种方法。不同的细菌经过MALDI-TOF MS检测可以形成特异性的指纹图谱，将待测细菌的指纹图谱与标准图谱库进行比较，即可鉴定细菌种属。目前由于现有数据库的信息不足，容易漏检或造成假阳性，对于肠球菌的全面准确检测造成严重的制约。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种肠球菌质谱库及建库方法，该质谱库具有较为全面的MALDI-TOF MS检测数据库中的肠球菌的质谱图，能够对多种肠球菌进行快速、准确的检测，更加有利于肠球菌的早期防治；
本发明还提供了上述肠球菌质谱库在肠球菌检测中的用途。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种肠球菌质谱库，所述的肠球菌为HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，及各个肠球菌对应的MALDI-TOF MS质谱图。
所述的肠球菌质谱库，所述的肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26均是从病死猪的内脏中分离得到。
所述肠球菌质谱库的建立方法包括以下步骤：
（1） 使用常规的分离鉴定方法获得肠球菌菌落样品；
（2） 向EP离心管A中加入去离子水；然后取分离的单个菌落至离心管中，混合均匀后，加入无水乙醇，混合均匀；
（3） 将步骤（2）混合均匀的混合液放入离心机中以10000~13000rpm的转速离心2~5分钟，静置，倒去上清；剩余的物质再次进行离心，在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，移去残余的上清液，将得到的沉淀在室温下干燥2~4分钟；
（4） 在步骤（3）干燥之后的沉淀中加入甲酸的水溶液，混合均匀；然后加入纯乙腈，混合均匀后在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，吸取上清液置于另一新的离心管B中；
（5）移取步骤（4）所述离心管B中的上清液1μl置于MALDI的靶板上，每个样品做三个平行孔，在室温下晾干，然后加上1μl HCCA基质液覆盖样品，室温晾干后上机，进行数据图谱的采集；
（6）分别取等体积的标准肽溶液与HCCA基质液进行混合，然后取1 μl混合液置于MALDI靶板上作为标准品，室温晾干，待完全干燥后进行检测，每个标准品各做三个平行孔，作为仪器的校准品；
（7）在检测器中放入已点好样品和校准品的靶板，打开FlexControl，校准仪器，首先用校准品进行系统误差的校正，然后再进行待测样本的质谱分析，通过Biotyper软件进行分析鉴定，得到每个样品的指纹图谱；
（8）建立数据库：将步骤（7）得到的指纹图谱进行保存，然后用MALDI Biotyper打开对图谱的质量进行评估，除去低质量的图谱（即重复性的图谱），完成建库过程，得到自建库。
步骤（8）所述自建库的建立流程如下：
打开MALDI Biotyper软件，选中全部用于建库的文件，点击鼠标右键，选择Creat MSP
输入正确的菌名，生成MSP之后，软件右边数据库界面中的Unassigned MSPs由（0/0）变成（1/1），这说明已经将建好的MSP放进了临时数据库内；然后需要将自建的MSP加入到Projects自建库里，选中软件右边界面Projects，点击编辑按钮，开启编辑菜单，在选中的Projects节点上点击鼠标右键，出现New Node，在此节点的下一级建立新的节点，将自建的数据库名输入，选取未分配的临时数据库添加到自建库中，完成数据库的自建。
所述肠球菌质谱库的建立方法，其中步骤（2）所述的EP离心管为1.5ml，所述EP离心管与去离子水的体积比为5：1；所述去离子水、无水乙醇与所取菌落的用量比为0.3ml：0.9ml：（5~10）mg。
所述肠球菌质谱库的建立方法，步骤（4）所述加入的70%的甲酸水溶液与步骤（1）所述加入的去离子水的体积比为1：6，所述加入的70%的甲酸水溶液与纯乙腈的体积比为1：1。
上述肠球菌质谱库在细菌种属鉴定中的应用。
上述肠球菌质谱库的建立方法在细菌种属鉴定中的应用。
附图说明
图1 为本发明所得自建库中肠球菌HN1，HN4，HN5，HN8，HN9，HN10，HN12，HN18的指纹图谱；
图2 为本发明所得自建库中肠球菌HN6，HN11，HN13，HN16，HN17，HN19，HN22，HN26的指纹图谱；
图3 为肠球菌标准菌株ATCC33186的离子峰图谱；
图4 为标准肠球菌ATCC33186的可信度分值；
图5 为疑似肠球菌YC1、YC2的MALDI-TOF MS检测结果图，图中：上图为疑似肠球菌YC1的图谱，下图为疑似肠球菌YC2的图谱；
图6 为疑似肠球菌YC1、YC2与自建库和布鲁克图库的可信度分值，图中：左图为疑似肠球菌YC1的结果，右图为疑似肠球菌YC2的结果。
与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果
（1）本发明所述的由肠球菌指纹图谱建立的数据库用于肠球菌种属的鉴定，能够快速、准确的确定肠球菌所属种类，省时、省力；
（2）本发明通过对HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26肠球菌菌种的测定及数据库的建立，对MALDI-TOF-MS建立的肠球菌数据库进行了补充和完善；尽管MALDI-TOF-MS用于微生物分类与鉴定的研究已有很多，但是针对肠球菌研究的报道却不多见，尤其是肠球菌标准菌库的建立更是空白，目前由于肠球菌现有数据库信息不足，容易漏检或者造成假阳性，本发明通过对MALDI-TOF-MS建立的肠球菌数据库的补充和完善避免了漏检或假阳性结果的产生，弥补了目前肠球菌现有数据库信息的不足。
具体实施例
下面通过具体实施例对本发明进行更加详细的说明，但是并不用于限制本发明的保护范围。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为市售试剂。
实施例1
肠球菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
1）细菌的分离培养
在无菌条件下取病死猪的血液、肝、脾、肾、淋巴结组织的典型病料直接接种于营养琼脂平板和脑心萃取液琼脂平板（BHIA）上，在37℃温箱内培养24小时；
在BHIA琼脂平板上生长良好，37℃条件下培养24小时即能长出灰白色、不透明、圆形、微凸、湿润、表面光滑、边缘齐整的露珠状小菌落，菌落的大小在1.5~2.0mm以上；
2）染色镜检
将采集的病死猪血液、肝、脾、肾、淋巴结组织和琼脂平板上培养的细菌菌落直接涂片，革兰染色后进行镜检；
所有分离菌株均为G+球菌，细菌形态呈球形或卵圆形，呈单个、成对或链状排列，链的长短不一，短的4~6个，长的十几个；
3）细菌纯化培养
挑取BHIA平板上的典型菌落，无菌接种到脑心萃取液态培养基（BHI）中进行纯化，将纯的疑似肠球菌保存备用；
4）16S rRNA鉴定方法
提取步骤3）纯化培养的细菌DNA，进行PCR扩增；
PCR反应体系的总体积为50 µl，其中2× PCR TaqMix 10 µl （组成为 0.2 U Taq DNAPolymerase/µl；400 µM dNTP each；20 mM Tris-HCl，pH 8.7；100 mM KCl；3 mM MgCl2 )；两种引物各 1µl；模板DNA 5 µl。最后补充双蒸去离子水至50 µl 总容量；
扩增程序如下：95 ℃预变性5 min； 94 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、2 min，再行35个循环；最后于72 ℃延伸10 min；用蒸馏水作为阴性对照。扩增的引物序列为：
正向引物F 5'-CCGAATTCGTCGACA ACAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，
反向引物R 5'-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
克隆并鉴定16S rRNA基因，核苷酸序列测定后通过NCBI网站的BLAST工具进行DNA序列对比分析，得到菌株的所述类别，结果如表1所示：
上述16S rRNA检测结果表明：HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26为肠球菌菌株，能够用于MALDI-TOF MS数据库的建立。
实施例2
该实施例为MALDI-TOF MS数据库建立，包括以下步骤：
（1）取采用实施例1分离鉴定得到的肠球菌菌落样品；
（2）向1.5ml EP离心管中加入300 μl去离子水，取步骤（1）准备的待测菌落样品的单个菌落5~10mg至离心管中，充分混匀；然后加入900 μl无水乙醇，充分混匀；
（3）将步骤（2）得到的混合溶液在13000 rpm条件下离心2min，倒去上清，得到沉淀物；将沉淀物再次进行离心，13000rpm离心2min，用移液枪完全吸取残余的上清液且不触碰最终的沉淀，室温下干燥最终得到的沉淀2~3min；
（4）在步骤（3）得到的最终沉淀中加入70%的甲醛水溶液50 μl，充分混匀 ，然后加入50μl纯乙腈，充分混匀；在13000rpm条件下离心2min，吸取上清液置于另一新的离心管中，备用；
（5）取步骤（4）备用的上清液1μl置于MALDI靶板上，室温晾干，然后加上1μl HCCA基质液覆盖MALDI靶板上的样品，室温下晾干后上机进行数据图谱的采集；
所有样品用同样的方法进行数据图谱的采集，每个样品在MALDI靶板上做三个平行孔；
（6）分别取等体积的标准肽溶液与HCCA基质液进行混合，然后取1μl 混合液置于MALDI靶板上作为标准品，室温晾干，待完全干燥后上机进行数据图谱采集，每个标准品各做三个平行孔；作为校准品；
（7）在检测器中放入已点好样品和标准品的靶板，打开FlexControl，校准仪器，首先用校准品进行系统误差的校正，然后再进行待测样本及标准品的质谱分析，通过Biotyper软件进行分析鉴定，得到每个样品的指纹图谱；如图1、图2所示；
（8）将步骤（7）得到的待测样品的指纹图谱进行保存，然后用MALDI Biotyper软件打开，输入保存的数据图谱文件，选中全部用于建库的文件，点击鼠标右键，选择ShowNormalized Spectra in Gelview，查看用于自建库的质谱图的重复性，对图谱的质量进行评估，除去低质量的图谱（实际就是重复性的图谱），即完成建库过程，得到自建库。
步骤（8）所述自建库的完成过程如下：
打开MALDI Biotyper软件，选中全部用于建库的文件，点击鼠标右键，选择Creat MSP
输入正确的菌名，生成MSP之后，软件右边数据库界面中的Unassigned MSPs由（0/0）变成（1/1），这说明已经将建好的MSP放到了临时数据库内；然后需要将自建的MSP加入到Projects自建库里，选中软件右边界面Projects，点击编辑按钮，开启编辑菜单，在选中的Projects节点上点击鼠标右键，出现New Node，在此节点的下一级建立新的节点，将自建的数据库名输入，选取未分配的临时数据库添加到自建库中，完成数据库的自建。
将肠球菌与自建库中肠球菌指纹图谱比较，可信度大于2.3。实施例1利用16SrRNA检测HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26得到的检测表1结果与该实施例2得到的自建库中肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26的指纹图谱检测结果进行比较，结果一致。
实施例3
布鲁克图库（即全自动快速质谱微生物鉴定系统，型号为BD Biotyper 软件中自带的肠球菌标准细菌图库）与实施例2所述的自建库对肠球菌标准菌株ATCC33186的验证，包括以下步骤：
（1）肠球菌标准菌株ATCC33186的培养
将肠球菌标准菌株ATCC33186在BHI肉汤中活化，在划线接种到脑心萃取液琼脂平板（BHIA）上，37℃条件下培养24小时，然后选取单个菌落备用；
（2）MALDI-TOF MS鉴定
①.向1.5ml EP离心管中加入300 μl去离子水，然后加入步骤（1）得到的肠球菌标准菌株ATCC33186的单个菌落5~10mg，充分混匀，再加入900 μl无水乙醇，充分混匀，在13000rpm条件下离心2min，倒去上清液，剩余沉淀；然后再次对沉淀在13000rpm条件下离心2min，用移液枪完全吸取残余的上清液，最终剩余的沉淀在室温下干燥2~3min；
②.在步骤①最终得到的沉淀中加入70%的甲醛水溶液50 μl，充分混匀，然后加入50 μl的纯乙腈，充分混匀，在13000rpm条件下离心2min，离心之后吸取上清液置于另一新的离心管中，备用；
③.取步骤②备用的上清液1 μl置于MALDI靶板上，室温下晾干，然后点1μl HCCA基质液覆盖上清液样品，室温下晾干之后上机进行数据图谱采集，每个样品点三个平行孔进行数据图谱采集；如图3所示；
④.分别取等体积的标准肽溶液和HCCA基质溶液均匀混合，然后取1μl混合液置于MALDI靶板上，室温下晾干，完全干燥后上机进行数据图谱采集，每个样品做三个平行孔，作为校准品；
⑤.将已经点好肠球菌标准菌株ATCC33186和点好校准品的靶板，放入质谱仪中，开始操作，用FlexControl软件做质谱分析，先用校准品进行系统误差校正，然后再进行肠球菌标准菌株ATCC33186样品的质谱分析；
将采集到的肠球菌标准菌株ATCC33186的图谱与布鲁克图库和自建库中得到的图谱进行对比，标准肠球菌ATCC33186的可信度分值如图4所示，结果如下：标准菌株与自建库中粪肠球菌河南株N5的分值为2.434，N9的分值为2.403，N4的分值为2.384，N8的分值为2.372，N1的分值为2.370，N12的分值为2.364，以上6株河南株的可信度分值均大于2.3，表明鉴定结果的可信度很高，说明本发明的自建库对于肠球菌的鉴定准确、高效，具有较好的应用前景。
实施例4
疑似肠球菌YC1、YC2的分离与鉴定
（1）疑似肠球菌YC1、YC2的分离及纯化
①.疑似肠球菌的YC1的分离培养：在无菌条件下取病死猪的肝、脾组织的典型病料用接种环直接接种于营养琼脂平板和脑心萃取液琼脂平板（BHIA）上，在37℃温箱内培养24小时，
在BHIA琼脂平板上生长良好，37℃条件下培养24小时即能长出灰白色、不透明、圆形、微凸、湿润、表面光滑、边缘齐整的露珠状小菌落，菌落的大小在1.5~2.0mm以上；
②.染色镜检：将采集的病死猪的肝、脾组织和营养琼脂平板上培养的细菌菌落直接涂片，革兰染色后进行镜检；
所有分离菌株均为G+球菌，细菌形态呈球形或卵圆形，呈单个、成对或链状排列，链的长短不一，短的4~6个，长的十几个；
③.分离纯化：挑取BHIA平板上的典型菌落，接种到脑心萃取液态培养基（BHI）中进行纯化，将纯化的疑似肠球菌用MALDI-TOF MS方法进行检测；
疑似肠球菌YC2采用与疑似肠球菌YC1相同的方法进行分离纯化，并采用MALDI-TOF MS方法进行检测；
（2）所述MALDI-TOF MS检测方法，步骤如下：首先采用与实施例2相同的方法采集得到疑似肠球菌YC1、疑似肠球菌YC2的指纹图谱，如图5所示；
然后将疑似肠球菌YC1与布鲁克图谱和自建库可信度进行对比，结果如图6所示：疑似肠球菌YC1与自建库中河南株N4的可信度分值最高为2.474，与布鲁克库中的标准株匹配度分值为2.299，疑似肠球菌YC2与自建库中河南株N11的可信度分值最高为2.454，与布鲁克图库中的标准株匹配度分值为2.332，表明鉴定结果的可信度很高，说明该自建库能够对疑似肠球菌进行准确、高效的鉴定。
Claims (7)
1.一种肠球菌质谱库，其特征在于，所述的肠球菌质谱库包括肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，及各个肠球菌对应的MALDI-TOF MS质谱图。
2.根据权利要求1所述的肠球菌质谱库，其特征在于，所述的肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，均是从病死猪的内脏中分离得到。
3.一种权利要求1所述肠球菌质谱库的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 使用常规的分离鉴定方法获得肠球菌菌落样品；
（2） 向EP离心管A中加入去离子水；然后取分离的单个菌落至离心管中，混合均匀后，加入无水乙醇，混合均匀；
（3） 将步骤（2）混合均匀的混合液放入离心机中以10000~13000rpm的转速离心2~5分钟，静置，倒去上清；剩余的物质再次进行离心，在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，移去残余的上清液，将得到的沉淀在室温下干燥2~4分钟；
（4） 在步骤（3）干燥之后的沉淀中加入质量浓度为70%的甲酸水溶液，混合均匀；然后加入纯乙腈，混合均匀后在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，吸取上清液置于另一新的离心管B中；
（5）移取步骤（4）所述离心管B中的上清液1μl置于MALDI的靶板上，每个样品做三个平行孔，在室温下晾干，然后加上1μl HCCA基质液覆盖样品，室温晾干后上机，进行数据图谱采集；
（6）分别取等体积的标准肽溶液与HCCA基质液进行混合，然后取1 μl混合液置于MALDI靶板上作为标准品，室温晾干，待完全干燥后进行检测，每个标准品各做三个平行孔，作为仪器的校准品；
（7）在检测器中放入已点好样品和校准品的靶板，打开FlexControl，校准仪器，首先用校准品进行系统误差的校正，然后再进行待测样本的质谱分析，通过Biotyper软件进行分析鉴定，得到每个样品的指纹图谱；
（8）建立数据库：将步骤（7）得到的指纹图谱进行保存，然后用MALDI Biotyper打开对图谱的质量进行评估，除去低质量的图谱，完成建库过程，得到自建库。
4.根据权利要求3所述肠球菌质谱库的建立方法，其特征在于，步骤（2）所述的EP离心管为1.5ml，所述EP离心管与去离子水的体积比为5：1；所述去离子水、无水乙醇与所取菌落的用量比为0.3ml：0.9ml：（5~10）mg。
5.根据权利要求3所述肠球菌质谱库的建立方法，其特征在于，步骤（4）所述加入的70%的甲酸水溶液与步骤（1）所述加入的去离子水的体积比为1：6，所述加入的70%的甲酸水溶液与纯乙腈的体积比为1：1。
6.权利要求1所述肠球菌质谱库在肠球菌菌种属鉴定中的应用。
7.权利要求3所述肠球菌质谱库的建立方法在肠球菌菌种属鉴定中的应用。
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