发明内容
本发明的目的是提供一种具有特异性识别燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型及该模型的蛋白质检测分析数据库,以及该模型或分析系统在燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测和鉴定中的应用。
本发明的另一目的是提供一种燕麦噬酸菌西瓜亚种的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测方法。
为了实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
本发明公开了一种燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型,该模型根据多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成,其中蛋白质的质荷 比(m/z值)分别为3171.4、3735.0、4963.5、5139.0、5866.4、6554.1、7466.1、7948.0、8384.5、9304.2、9504.3、9920.0、10272.8、10840.7、12530.5、12896.5。需要说明的是,上述质荷比的值是一组相对稳定的值,但是,本领域技术人员可以理解,在不同实验条件下,在这些数值的基础上进行的小数点值的变化,或者说在1‰误差范围内个别值进行的数值变化,也属于本申请的保护范围。
进一步地,蛋白质的质荷比及蛋白质波峰强度系数由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的软件统计分析得到。
本发明还公开了一种包括上述蛋白质指纹图谱模型的蛋白质检测分析数据库。
本发明还公开了上述蛋白质指纹图谱模型或蛋白质检测分析系统在燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测或鉴定中的应用。
本发明还公开了一种燕麦噬酸菌西瓜亚种的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测方法,包括样品蛋白质芯片制备、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测,以及样品蛋白质图谱比对;其中,样品蛋白质图谱比对是将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测分析获得的样品蛋白质图谱,与上述的蛋白质指纹图谱模型比较;或者在上述的蛋白质检测分析数据库中比对。
本发明实施方式的检测方法中,样品蛋白质芯片制备包括释放样品蛋白质的前处理和点样,点样的步骤包括,先在质谱靶芯片上滴加样品上清液,晾干后再滴加基质溶液。
进一步地,检测方法中,基质溶液的溶剂乙腈:甲醇:无菌去离子水按体积比1:0.8-1.2:0.8-1.2混合而成。
进一步地,检测方法中,基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
本发明实施方式的检测方法中,释放样品蛋白质的前处理采用的溶剂包括第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中的至少一种;第一溶剂为0.1%的三氟乙酸;第二溶剂为70%的甲酸;第三溶剂为100%乙腈。
本发明实施方式的检测方法中,样品蛋白质图谱比对采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪自带的软件进行,且比对获得的log(score)值大于2.2小于3.0时,即可实现样品的检测鉴定。即当未知菌株获得谱图与本发明中公开的所有燕麦噬酸菌西瓜亚种标准谱图比较,其log(score)值大于2.2小于3.0时,即可鉴定未知菌株为燕麦嗜酸菌西瓜亚种。
由于采用以上技术方案,本申请的有益效果在于:
本申请的燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型是一种全新的,区别 于现有的蛋白质指纹图谱的模型。该蛋白质指纹图谱模型包含燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性的蛋白质图谱信息,具有特异识别作用,可用于商业化的检测分析系统,用以对燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性检测或鉴定。
本申请的燕麦噬酸菌西瓜亚种的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测方法,该方法将检测获得的样品蛋白质图谱与本申请提供的燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型进行比对,可以准确的定性检测出样品中的燕麦噬酸菌西瓜亚种。为燕麦噬酸菌西瓜亚种提供了一种快速、高通量、特异性强的检测方法,特别适用于口岸检验检疫等部门。
具体实施方式
本申请的蛋白质指纹图谱模型是一种现有的蛋白质图谱中没有的,新的MALDI TOF MS蛋白质指纹图谱;根据燕麦噬酸菌西瓜亚种的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成,其中蛋白质的质荷比值分别为3171.4、3735.0、4963.5、5139.0、5866.4、6554.1、7466.1、7948.0、8384.5、9304.2、9504.3、9920.0、10272.8、10840.7、12530.5、12896.5。这些质荷比是不同的燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株采用本发明中公开的有机溶剂进行前处理释放蛋白质并采用MADLITOF MS分析获得的,区别于其它供试菌株的质荷比,因此,能够稳定而特异地表征燕麦噬酸菌西瓜亚种。此处所说的其它供试菌株,是本申请实施例中采用的用于试验的除燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株以外的菌株。也就是说,通过与该模型进行比较,就可以判断出,检测的材料里面是否含有燕麦噬酸菌西瓜亚种。需要说明的是,在采用燕麦噬酸菌西瓜亚种进行试验时,由于采用的具体处理试剂或处理方法不同,最终还会获得以上提到的质荷比以外的其它质荷比;但是,本申请以上提到的质荷比是会稳定而特异的出现的,因此,这并不影响燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测和判断。还需要说明的是,由于本申请的上述质荷比值是通过对22株不同来源以及不同株型的燕麦噬酸菌西瓜亚种进行检测后获得的平均值,因此,在不同的实验室或实验条件下,具体检测的质荷比在小数点值的变化,或者个别值在1‰范围内的变化也在本申请的保护范围内。
此外,还需要说明的是,由于本申请提供的是燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型,是根据燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性的质荷比绘制出来的波峰图,也就是说,只要能够对燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质的质荷比进行检测,并绘制出波峰图就能特异性的反映出燕麦噬酸菌西瓜亚种,这与采用的仪器没有直接和必然的关联。但是,基于现有技术的限制,本申请的具体实施方式中采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对燕麦噬酸菌西瓜亚种进行检测,并利用其软件统计分析得到质荷比与蛋白质波峰强度系数的波峰图。即对应的蛋白质波峰强度系数是由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪根据具体检测对象中对应的蛋白质的含量自动计算得出的。一般来说某个蛋白质的含量越高,其蛋白质波峰强度系数就越大,在质谱图中的波峰值就越高。由于不同的菌株或者同一菌株在不同时期在不同的检测条件下,其蛋白质波峰强度系数会有细微差异,因此,具体的蛋白质波峰强度系数值在本申请中不做具体限定。同时,由于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪自带软件的参数设置条件的限制,谱图中仅显示部分标注了主要峰的质荷比值,而无法显示所有标注峰对应的质荷比(m/z)值,但可以通过导出数据获得谱图中无论标注还是没有标注显示的所有峰对应的质荷比(m/z)值。该蛋白质指纹图谱根据燕麦噬酸菌西瓜亚种标准菌株的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测获得的,具有特异识别作用,可用于燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性检测或鉴定。同时,该蛋白质指纹图谱模型也可以用于商业化的蛋白质检测分析系统,用于燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测或鉴定。
在此基础上,本申请提供了一种燕麦噬酸菌西瓜亚种的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测方法,包括样品蛋白质芯片制备、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测,以及样品蛋白质图谱比对。其中,样品蛋白质图谱比对即,将检测获得的样品的蛋白质图谱与本申请的提供的蛋白质指纹图谱模型比对,从而定性的判断样品中是否含有燕麦噬酸菌西瓜亚种,即实现燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测。
本申请中,样品蛋白质芯片制备包括蛋白质样品溶液制备和点样,其中点样的步骤包括,先在质谱靶芯片上点蛋白质样品溶液,晾干后再点基质溶液。需要指出的是,点样步骤中蛋白质样品溶液和基质溶液的顺序,主要是影响基质和样品形成结晶的均匀性,从而影响蛋白质图谱中质荷比对应的蛋白质波峰效果。本申请的点样步骤,使得基质和样品的结晶均匀,从而获得重复性好的蛋白质图谱。
本申请中,基质溶液的溶剂为乙腈:甲醇:无菌去离子水按体积比1:0.8-1.2: 0.8-1.2混合而成。基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。释放菌体蛋白质样品溶液的前处理溶剂包括第一溶剂、第二溶剂、第三溶剂中的至少一种;第一溶剂为0.1%三氟乙酸,第二溶剂为70%甲酸,第三溶剂为100%乙腈。
本领域技术人员熟知,在实际操作过程中,对上述基质溶剂或蛋白质溶剂的体积比进行适当调整同样可以满足本申请的要求;因此,在该范围外进行的,符合本领域技术人员认知的适当调整,仍然在本申请的体积比保护范围内。
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明,不应理解为对本发明的限制。
实施例
一、材料
1.供试菌株
本例中采用了22株燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株,以及17株燕麦噬酸菌西瓜亚种近似种的供试菌株进行试验。其中22株燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株包括由中国农业大学种子病理实验室提供的编号为470144(ZZ-1)、470141(SY-1)、470142(SY-3)、470150(LS-2)、470138(LS-3)、470140(LS-10)、470131(XJ-1)、470133(XJ-4)、470139(LS-5)、470136(XJ-6)、470152(BJ-A)的10株菌株,由中国农业科学院植物保护研究所提供的编号为470145(pslb-25)的菌株,以及USDA/ARS/FDWSRU提供的编号为470149(FC512)、470126(FC376)、470125(FC374)、470148(FC455)、470123(FC248)、470122(FC247T,ATCC29625)、470121(FC183)、470127(FC380)、470130(FC520)、470151(pslb91)的10株菌株。17株其他供试菌株包括USDA/ARS/FDWSRU提供的编号为470101(FC371)、470102(FC369)、470103(FC963)、470104(FC966)的4株Acidovorax avenae subsp.avenae菌株、编号为470162(FC362,NCPPB961,30075)的1株Acidovorax avenae subsp.cattleyae菌株、编号为470171(FC321T,ATCC33996,30072)的1株Acidovorax konjaci菌株、编号为470205(80259)和470206(80260)的2株Burkholderia glumae菌株,深圳出入境检验检疫局植检室提供编号为470410的1株Erwania carotovora subsp.carotovora菌株、编号为470513(psg363)的1株Pseudomonas syringae pv.glycinea菌株,北京出入境检验检疫局提供的编号为470201(Ba-1)的1株Burkholderia gladioli pv.alliicola菌株、编号为470321(cmn-1)的1株Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis菌株,广东农业科学院植物保护研究所提供的编号为470411的1株Erwania chrysanthemi菌株,中国农业大学种子病理实验室提供的编号为470303(NCPPB1468)和470304(LP0301)的2株Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis菌株,由中国农业科学院植物保护研究所提供的编号为470331(cms-1)的1株Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus菌株和编号为470713的1株Xanthomonas campestris subsp.campestris。
2.实验试剂
(1)基质溶液的溶质
α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA;Alpha-cyano-4hydroxy-cinnamic acid),来源于德国Bruker Daltonics公司
(2)其它试剂
乙醇(Ethanol absolute,HPLC/spectroscopy grade),来源于Scharlau ChemieS.A.公司
三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,DNA synthesis reagent),来源于Burdick &Jackson公司
乙腈(Acetonitrile,AC S/HPLC certified solvent),来源于Burdick&Jackson公司
甲醇(Methanol,HPLC/spectroscopy grade)来源于Burdick&Jackson公司
Peptide Calibration Standard(No.206195)和Protein Calibration Standard I(No.206355),来源于Bruker Daltonics公司
琼脂粉、葡萄糖均为分析纯,来源于上海生工生物工程有限公司。
3.主要仪器设备和材料
质谱仪:microflex MALDI TOF(德国Bruker Daltonics公司)
超声波清洗仪:舒美KQ5200B型(昆山市超声波仪器有限公司)
Eppendorf离心机:5481(德国Eppendorf公司)
斡旋振荡器:其林贝尔CL-861
样品靶:德国Bruker Daltonics公司
高压灭菌锅:HV 50
生物安全柜:SC18RW 1800型
电子天平:XP603S
离心机:Spectrafuge 24D
Eppendorf离心管及tips,购自德国Eppendorf公司。
4.主要试剂的配制
(1)基质溶液的配制
分别准确称量5mg HCCA溶于500μL乙腈:甲醇:水(1:1:1)溶剂中,振荡使其尽量溶解,但离心管底部仍会有少量结晶,使其饱和溶液约10mg/mL。同时每次使用时均新鲜配置。
(3)样品处理溶剂的配制
按照体积比进行如下三种溶剂的配置,混匀,室温放置使用
A.0.1%三氟乙酸
B.70%甲酸
C.100%乙腈
(4)YDC培养基
酵母粉10g,碳酸钙超微粉末20g,葡萄糖20g,琼脂粉15g,蒸馏水定容至1L,其中葡萄糖单独置于100ml蒸馏水中溶解,121°C高温灭菌15min后置于水浴锅后冷却至55°C,将1ml过滤灭菌的250mg/ml放线菌酮和葡萄糖加入培养基中并充分摇匀后倒入培养皿或试管备用。
(5)NBY培养基
牛肉浸膏3g,蛋白胨5g,酵母粉2g,三水磷酸氢二钾2.6g,磷酸二氢钾0.5g,葡萄糖2.5g,蒸馏水1000ml,121°C高温灭菌15min后加入1M硫酸镁溶液1ml;对于NBY固体培养基,需要加入15g琼脂粉。
(6)标准校正品制备
分别选取1管Peptide Calibration Standard和Protein Calibration Standard I,并加入125μL0.1%TFA的50%乙腈溶剂,充分混匀后,-20℃保存备用。当校准时,分别取0.5μL两种标准校正溶液混合滴到样品板同一样品孔中使用。
二、实验方法
1.菌株培养
挑取燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)单菌落接种于YDC固体培养基培养,挑取其他供试菌株单菌落也接种于YDC或NBY固体培养基培养,30℃,黑暗培养48h后备用。
2.样品处理
称取供试菌株1-2mg用1000μL无菌水水洗2次,分别10000rpm离心2min,弃上清;再取200μL的0.1%三氟乙酸重悬混匀后,10000rpm离心2min,弃上清;加入25μL的70%甲酸重悬,混匀后再加入25μL的100%乙腈处理;然后以HCCA为基质,乙腈:甲醇:水(1:1:1)作为基质溶剂,采用改进的干滴法点样进行MALDI分析。
3.蛋白质芯片点样
即吸取1μL样品上清液点样于MALDI样品板上,室温条件下晾干,再直接滴加1μL基质溶液覆盖于样品之上,室温条件下晾干。
4.MALDI TOF MS检测
(1)设置仪器参数
离子源1:20.08KV;离子源2:18.60KV;脉冲离子提取时间:30ns;线性正离子检测方式;质量范围m/z值:1000Da-20000Da;激光频率:60.0Hz;激光能量:35﹪左右。
(2)质量校正
当利用FlexControl软件对样品进行采集图谱前,需使用校正标准样品Peptide Calibration Standard和Protein Calibration Standard I混合液进行自动或手工校正,其m/z值见表1。
表1校正标准物质对应的质荷比范围
Peptide Calibration Standard
|
平均质荷比(m/z) |
1 |
1047.19 |
2 |
1297.49 |
3 |
1348.64 |
4 |
1620.86 |
5 |
2094.43 |
6 |
2466.68 |
7 |
3149.57 |
Protein Calibration Standard I
|
|
1 |
5734.51 |
2 |
6180.99 |
3 |
8476.65 |
4 |
8565.76 |
5 |
12360.97 |
6 |
16952.30 |
5.图谱分析
(1)图谱的调基
MALDI TOF MS带有flexanalysis专业技术软件,在此软件中打开需要分析的图谱,点击工具栏process,选择subtract mass spectrum baseline。调基目的是使基线降低,比较直观。
(2)图谱的标峰
调基之后的图谱,点击工具栏Method,点击open,选择proteins1-20kDafullprocess.FAMSMethod,点击工具栏Mass List选择find。
对其他图谱同样标峰,可以通过copy已标峰图谱,然后选定待标峰图谱pastespecial,选择method,后点击工具栏Mass List选择find。标峰的目的是使主要信号峰的m/z值显示,比较直观。
三、蛋白质指纹图谱模型的建立
利用MALDI TOF MS自带的Biotyper专业技术软件,对22株燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株的蛋白质图谱进行分析,获得22株菌株的特异性识别图谱。部分结果如图2所述,其对应的质荷比检测值见表2。图2中470123、470126、470127、470139分别表示菌株编号为470123、470126、470127、470139的菌株的检测结果图,其中带下划线的数字表示共同特有峰对应的质荷比值。
表2部分燕麦噬酸菌西瓜亚种蛋白质谱峰图的质荷比值
本例中建立的燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性识别图谱包括22株菌株均具有的特异性质荷比值,质荷比值包括3171.4、3735.0、4963.5、5139.0、5866.4、6554.1、7466.1、7948.0、8384.5、9304.2、9504.3、9920.0、10272.8、10840.7、12530.5、12896.5。需要说明的是,这些值是22株菌株均具有的质荷比值,并通过对具体检测值进行平均后获得的,能够较为准确地反应燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性识别图谱。从表2中可见,实际上各个菌株还包括其它的质荷比值,但是,这些值并不是燕麦噬酸菌西瓜亚种所共有的值,这可能是由于各个菌株的个体差异造成的,不具有种识别作用,因此,不被包括在本例的燕麦噬酸菌西瓜亚种特异性识别图谱中。此外,从图2中可见,并非本例中所有特异性质荷比均能被显示,这是因为图片显示的是经过软件自动压缩处理的峰图,在部分值彼此较接近或者虽然存在该特异性蛋白的质荷比,但是该蛋白质含量较少的情况下,无法全部被显示在图中。
本例的蛋白质指纹图谱模型可单独的用于燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测鉴定,或者,整合到其它商业用途的蛋白质检测分析系统或数据库,用于燕麦噬酸菌西瓜亚种的检测鉴定。
四、燕麦噬酸菌西瓜亚种特异性和稳定性检测
1.稳定性检测
按照上述试验方法对22株燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovorax avene subsp.citrulli)进行检测,每个样品点采集5张峰图,4次重复,获得的20张峰图与本例中建立的燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型进行比对,并通过软件计算得到一个log(score)值,log(score)值大于2.2小于3.0则为阳性。结果显示,所有燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株均为阳性。
2.特异性检测
采用所有菌株,按照本例提供的试验方法进行检测,每个样品点采集5张峰图,获得的峰图与本例中建立的燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型进行比对,能够匹配并且通过软件计算得到一个log(score)值,log(score)值大于2.2小于3则为阳性,否则为阴性。结果显示,所有22株燕麦噬酸菌西瓜亚种菌株均为阳性,其它供试菌株均为阴性。部分结果见图1,燕麦噬酸菌西 瓜亚种近似种的部分质荷比值见表3,图1中470123、470101、470162、470171分别表示菌株编号为470123、470101、470162、470171的菌株的检测结果图,其中带下划线的数字表示燕麦噬酸菌西瓜亚种共同特有峰对应的质荷比值。
从表3可见,燕麦噬酸菌西瓜亚种近似种中也有个别质荷比与燕麦噬酸菌西瓜亚种相同,这可能是由于彼此之间同源关系较近或其它原因,但是近似种中并没有全部的燕麦噬酸菌西瓜亚种的特异性质荷比值,并且,从图1中也可以看到,其质谱图的图形与图2中的燕麦噬酸菌西瓜亚种质谱图存在很大差异。
表3部分燕麦噬酸菌西瓜亚种近似种的蛋白质谱峰图的质荷比值
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。