CN104833803A - 一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库 - Google Patents

一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库 Download PDF

Info

Publication number
CN104833803A
CN104833803A CN201510205881.5A CN201510205881A CN104833803A CN 104833803 A CN104833803 A CN 104833803A CN 201510205881 A CN201510205881 A CN 201510205881A CN 104833803 A CN104833803 A CN 104833803A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
print
finger
mass
standard protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510205881.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104833803B (zh
Inventor
冯建军
章桂明
龙海
史秀杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Priority to CN201510205881.5A priority Critical patent/CN104833803B/zh
Publication of CN104833803A publication Critical patent/CN104833803A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104833803B publication Critical patent/CN104833803B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/40—Monitoring or fighting invasive species

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开了一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库。具体公开了运用本申请构建的数据库对菜豆晕疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、豌豆细菌性疫病菌、大豆细菌性疫病、大豆细菌性褐斑病、大豆斑疹病菌和菜豆细菌性疫病等豆类重要植物病原菌的七重特异性检测方法。本申请的多重检测方法，能同时检测豆类上七种病原细菌，提高了检测速度，为口岸检验检疫等部门提供了一种快速、灵敏、高通量的分析检测方法，可以缩短传统检测时间，提高通关速度，降低企业成本；同时对豆类作物安全生产、引种和外销提供技术保障，提高进境豆类作物及其产品疫情截获率，提高防范外来有害生物入侵能力，具有重要实用性和技术性。

Description

一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库
技术领域
本申请涉及豆类细菌性病害检测领域，特别是涉及一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，及该检测方法所采用的数据库。
背景技术
据中国海关总署数据显示，2012年中国大豆进口量为5838万吨，2013年进口量为6338万吨，2014年进口量约为7070万吨，可见中国大豆对外依存度超过80％。豆类上重要植物病原细菌主要有大豆细菌性疫病(Pseudomonassavastanoi pv.glycinea)、大豆细菌性褐斑病(Pseudomonas syringae pv.syringae)、大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)、菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens)、菜豆晕疫病菌(Pseudomonassavastanoi pv.phaseolicola)、菜豆细菌性疫病(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)和豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi)。其中菜豆细菌性萎蔫病菌、菜豆晕疫病菌和豌豆细菌性疫病菌是我国进境植物检疫性有害生物。随着豆类进口量的不断增加，豆类细菌性病害传入我国的风险也随之加大。
目前，植物病原细菌的传统检测鉴定检测方法主要是依据分离培养、菌落形态、生理生化反应、血清学反应等手段。但这些方法通常取决于病原细菌的生长代谢过程，一般需要24-48小时，而且这些方法通常操作复杂，灵敏度比较低，不能满足口岸植物检疫的快速通关要求。随着分子生物学技术的发展，基于核酸的基因序列分析、实时荧光PCR等各种检测技术成为植物细菌鉴定的首选方法，因其快速、灵敏度高等特点，使得植物细菌的快速检测和病害诊断成为现实；但存在检测成本高，以及特异性探针引物的选择困难复杂等问题，而且有时很难达到对细菌种、菌株水平的鉴定。因此，建立一种快速、灵敏、高通量的分析方法用于检测豆类植物病原细菌具有重要的意义，也是我国口岸检疫部门急需解决的问题。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是近几年发展起来的一种用于微生物检测方法，其基本原理是将微生物微量样品与小分子基质混合，在样品盘上形成共结晶，然后在脉冲激光作用下，基质吸收激光能量跃迁到激发态，使样品电离后从离子源被传送到质量分析器内测定其分子量。样品的离子质荷比(m/z)与离子在飞行管内的飞行速度成正比，不同m/z值的样品离子到达检测器的时间不同，从而得到不同m/z值的峰图。目前，MALDI-TOF MS技术以蛋白质为靶标分子已广泛应用于鉴定志贺氏菌(Shigella spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等食源性致病细菌，由于该技术具有快速、操作简单、高通量以及质量范围广等特点，也逐渐被引入植物病原菌的鉴定研究中。但是，目前尚没有特别针对豆类细菌性病害的多重检测方法及相应的标准蛋白质指纹图谱数据库。
发明内容
本申请的目的是提供一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请公开了一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，该方法包括以下步骤，(1)在无菌条件下取受检细菌1-2mg，用无菌水进行至少一次洗涤后，离心弃上清，再用无菌水:无水乙醇体积比为1:3的溶液洗涤至少一次，离心弃上清，然后加入浓度70％的甲酸和/或浓度100％的乙腈，混匀，离心留取上清液，即受检细菌蛋白液；(2)分别取1μL受检细菌蛋白液和1μL蛋白标准样品点在质谱靶芯片上，室温晾干，再滴加1μL基质溶液覆盖在受检细菌蛋白液和蛋白标准样品上，室温晾干；每个受检细菌蛋白液至少重复4个检测点；(3)采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受检细菌蛋白液进行检测，每个检测点至少采集5张蛋白质峰图，将至少20张蛋白质峰图叠加制成受检细菌质谱图；(4)将步骤(3)获得的受检细菌质谱图与数据库比对，与数据库的比对结果Log(score)≥2.5时，判断为阳性；其中，数据库为本申请构建的包含豆类上七种植物病原细菌的标准蛋白质指纹图谱。
需要说明的是，本申请的多重检测方法，采用本申请特别针对豆类上七种植物病原细菌构建的数据库，能够实现同时对豆类上七种重要的植物病原细菌进行特异性检测。还需要说明的是，上述质荷比的值是一组相对稳定的值，并且这些值是至少20张图叠加后出现概率为90％以上的数值，本领域技术人员可以理解，在不同实验条件下，在这些数值的基础上进行的小数点值的变化，或者说在1‰允许误差范围内个别值进行的数值变化，也属于本申请的保护范围。
还需要说明的是，其中Log(score)是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对待检样品进行检测分析后输出的一个判别参数，而2.5的数值是构建检测方法时，根据多个阳性样品统计得出的，不同的数据库该数值是不同的；也就是说，在对待检样品进行判断时，只有Log(score)≥2.5，其检测结果才具有意义，否则即便检测结果与七个峰图之一很近似，也不能认定为待检样品中含有峰图对应的病原细菌。
优选的，基质溶液的溶剂为10％三氟乙酸:无菌去离子水:乙腈按体积比1:1:2混合而成。
优选的，基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
本申请的另一面公开了一种蛋白质指纹图谱数据库，该数据库包含豆类上七种植物病原细菌的七个标准蛋白质指纹图谱，蛋白指纹图谱分别由七种植物病原细菌的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成；第一个标准蛋白质指纹图谱为菜豆晕疫病菌的特征峰图，第二个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性疫病的特征峰图，第三个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性褐斑病的特征峰图，第四个标准蛋白质指纹图谱为豌豆细菌性疫病菌的特征峰图，第五个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性疫病的特征峰图，第六个标准蛋白质指纹图谱为大豆斑疹病菌的特征峰图，七个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图。
需要说明的是，本申请的数据库是采用豆类上七种重要病原细菌的标准菌株为基础制备的，具有比较好的稳定性和特异性，为豆类上七种重要病原细菌的多重检测奠定了基础。
优选的，数据库适用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
需要说明的是，本申请的数据库是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪构建的，因此，该数据库可以很好的适用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；但是，数据库与检测结果的比对，实际上是通过质谱仪中的其中一个分析软件实现的，也就是说，在这个分析软件可以单独使用的情况下，或者，有其他的分析软件可以读取并分析标准蛋白质指纹图谱的情况下，本申请的数据库也可以单独用于其他分析软件或设备。
本申请的另一面还公开了蛋白质指纹图谱数据库在豆类细菌性病害的检测或鉴定中的应用。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的多重检测方法，能够同时检测豆类上的七种重要植物病原细菌，大大提高了检验检疫速度；尤其是近年来豆类作物及其产品进口量日益增加的情况下，本申请的多重检测方法为口岸检验检疫等部门在豆类细菌性病害检测上提供了一种快速、灵敏、高通量的分析检测方法，可以缩短传统检测时间，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本；同时这对于豆类作物安全生产、种子引进和外销提供技术保障，提高进境豆类作物及其产品疫情截获率，提高防范外来有害生物入侵能力，都具有重要实用性和技术性。
附图说明
图1是本申请实施例中菜豆晕疫病菌菌株470582的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱；
图2是本申请实施例中大豆细菌性疫病菌株470513的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱；
图3是本申请实施例中大豆细菌性褐斑病菌株470543的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱；
图4是本申请实施例中豌豆细菌性疫病菌菌株470575的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱；
图5是本申请实施例中菜豆细菌性疫病菌株470719的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱；
图6是本申请实施例中大豆斑疹病菌菌株470709的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱；
图7是本申请实施例中菜豆细菌性萎蔫病菌菌株470366的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图谱。
具体实施方式
本申请的关键在于对豆类上的七种植物病原细菌进行了系统的研究，从而建立了基于七种细菌性病害的特异性的蛋白质指纹图谱数据库的多重检测方法，依据本申请构建的数据库，可以同时快速、简便地对豆类上七种细菌性病害进行判别，从而为缩短进境豆类的通关时间提供技术支撑，为进一步开展植物病原细菌的检疫鉴定，建立相关的检测数据库提供科学依据。
需要说明的是，虽然本申请检测的七种豆类植物病原细菌目前都分别有不同的检测方法，如菌落形态、生理生化反应、血清学反应等，但是尚无同时对七种病原细菌进行检测的多重检测方法；本申请的技术方案正好填补了这样一个检验检疫技术上的空缺和需求。
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例
一、材料
1.供试菌株
本例的供式菌株如表1所示。
表1 供式菌株情况
菌株编号a 菌株名称 菌株来源b
470582(ATCC11365) Pseduomonas savastanoi pv.phaseolicola 1
470575(ICMP2452) Pseduomonas syringae pv.pisi 2
470513(psg363) Pseduomonas savastanoi pv.glycinea 4
470543(NCPPB3869) Pseduomonas syringae pv.syringae 3
470709(ATCC43911) Xanthomonas axonopodis pv.glycines 1
470719(ATCC49119) Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli 1
470366(ATCC7392) Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens 1
a，六位数字代码为深圳出入境检验检疫局植物检验检疫实验室植物病原细菌保存库菌株编号，括号中的数字代表为菌株的原始代码。
b，1-4分别代表菌株提供单位。1，ATCC,American Type Culture CollectionCenter；2，ICMP,International Collection of Microorganisms from Plants；3，NCPPB,National Collection of Plant Pathogenic Bacteria；4，深圳出入境检验检疫局。
所有供式菌株在NA培养基上28℃活化48h后通过菌落形态、Biolog生化特征以及分子生物学等方法鉴定后备用。
2.试剂和仪器
本例所用试剂乙腈、甲酸和三氟乙酸(TFA)均购于Burdick&Jackson，色谱纯；标准品Peptide Calibration Standard(No.206195)和Protein Calibration StandardI(No.206355)均购于德国Bruker Daltonics公司、基质ɑ-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)购自于Sigma公司；普通营养琼脂培养基(NA)、购自北京陆桥技术有限责任公司；质谱仪为德国Bruker Daltonics公司的microflex MALDI TOF。
3.基质溶液的配制
基质溶剂为10％TFA-水-100％乙腈按体积比1-1-2混合；每毫升基质溶剂中加入10mg CHCA经超声波溶解后形成基质饱和溶液，在-20℃可保存备用。
4.标准样品的配制
取990μL 50％乙腈与10μL 10％TFA混匀，取125μL混合液加至1管Peptide Calibration Standard中，混匀；取125μL混合液加至1管Protein CalibrationStandardⅠ中，混匀。从上述2管中各取等体积的溶液混匀配制成蛋白标准样品，用30％的乙腈按5倍稀释蛋白标准样品，分装至灭菌PCR管中，每管5μL，-20℃下保存。
二、实验方法
1.样品处理
用无菌牙签挑取1mg～2mg细菌放入1.5mL灭菌离心管里，用1000μL无菌水洗1次，在10000rpm下离心2min，弃去上清液，加入300μL无菌水混匀，再加入900μL无水乙醇混匀，在10000rpm下离心2min，弃上清液，向离心管中加入25μL70％甲酸混匀，再加入25μL 100％乙腈混匀，在10000rpm下离心2min，吸取上清液至1.5mL灭菌离心管中备用。
2.蛋白质芯片点样
分别取1μL处理好的待测样品上清液及蛋白标准样品点在MALDI-TOF专用样品板上，室温晾干，再滴加1μL基质溶剂覆盖在待测样品和蛋白标准样品上，室温晾干。每个待测样品重复4次。
3.MALDI TOF MS检测
N2激光；离子源1：20.08KV；离子源2：18.60KV；脉冲离子提取时间：30ns；线性正离子检测方式；质量范围m/z值：1000Da-20000Da；激光频率：60.0Hz；激光能量：35-40﹪。为保证在1000Da-20000Da范围内蛋白质质荷比的准确性，用标准样品进行校准，校准后获得的质荷比误差小于6。采用仪器microflex MALDI TOF MS自备图谱分析软件flexAnalysis对质谱图进行基线修正。每个样品4个重复样品点，每个样品点采集5张峰图，共计20张图谱的蛋白质谱图叠加处理后作为待测样品的质谱图。
4.数据库的建立
2.0软件是microflex MALDI-TOF MS自备图谱数据库构建和鉴定分析软件。当Biotyper构建数据库时，每个菌株所采集的图谱至少20张合成一张图谱建立数据库用于以后的鉴定工作。当待测菌株的质谱分析图谱与本申请构建的数据库进行比对并获得log(score)值，根据log(score)值的高低而判断未知菌的种类。
三、蛋白质指纹图谱数据库
采用Feng等(2012)方法分析了七种豆类植物病原细菌的MALDI-TOF质谱结果如图1-图7所示，统计结果如表2所示，当至少20张质谱图叠加后，峰值出现概率≥90％时，Pseudomonas syringae pv.phaseolicola具有2561.9、3329.9、3587.3、3617.9、4127.0、4369.6、4433.7、4740.2、4834.9、4939.9、5083.6、5123.3、5672.9、5826.2、5972.9、6000.5、6341.2、6651.3、6876.0、7169.8、7234.4、7262.7、7559.2、7876.0、8251.7、8430.1、8801.8、9665.9、9875.4、10198.7、10234.1、11336.5等32个特征峰；Pseudomonas syringae pv.glycinea具有2563.4、3330.8、3588.2、3620.5、3922.9、4129.2、4435.2、4857.2、4941.2、5126.1、5666.9、5976.1、6003.6、6344.1、6653.9、6879.0、7173.2、7238.5、7265.6、7876.7、8255.9、8829.3、9670.3、9877.9、9882.4、10203.5、11332.7等27个特征峰；Pseudomonas syringaepv.syringae具有2533.8、3551.2、3588.9、3620.3、3728.7、4129.0、4435.2、4835.2、4942.9、5125.1、5975.3、6006.1、6639.1、6879.1、7173.2、7237.9、7560.2、7670.9、8255.7、9671.8、9797.0、9880.9、10203.0、10235.2、11343.3等25个特征峰；Pseudomonas syringae pv.pisi具有2562.7、3329.5、3620.9、3475.2、3588.4、3620.9、4128.2、4435.1、4940.8、5124.5、5973.7、6001.8、6354.7、6652.2、6877.6、7171.7、7237.5、7611.6、8252.1、9135.5、9502.3、9668.5、9877.4、10200.7、11338.8等25个特征峰；其中，当峰值(m/z)在1‰允许误差范围内，上述四种致病变种具有12个共同质谱峰，分别为3620、4129、4435、4940、5124、5974、6003、6878、7173、7237、8255、9670。
同时，Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli仅具有4572.3、4630.1、5854.5、5885.4、6099.7、7558.2、8114.2、8269.3、8269.3、8407.2、8735.9、9162.9、9322.3、9595.6、9783.6、9820.4、10586.6、11940.2、12408.5、13561.4等20个质谱峰；Xanthomonas axonopodis pv.gylcines具有2485.4、2641.2、2728.4、2914.1、3061.4、3620.9、3714.4、4244.3、4971.0、5003.8、5374.8、6003.8、6103.0、7079.0、7385.0、8011.3、8484.7、8870.3、9095.4、9662.7、14755.0等21个质谱峰；Curtobacteriumflaccumfaciens pv.flaccumfaciens具有2583.6、3264.2、3426.5、3535.8、3739.9、3954.0、4146.5、4269.6、4470.4、4584.5、4624.4、4771.7、5166.3、5305.1、5683.4、5724.6、5898.4、6525.1、6673.0、7069.0、7280.8、7476.8、8119.3、8286.6、8527.4、9163.5、9244.9、9539.1、10246.8、10605.0、11362.4、11793.7、13342.3等33个质谱峰。
表2七种豆类植物病原细菌蛋白质谱峰图的质荷比值
注：带有下划线的质荷比值表示在1‰允许误差范围内视为不同致病变种之间具备同一峰值。
基于以上分析，本例建立了七种豆类细菌性病害的特异性识别图谱数据库包括七组特异峰图，第一峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：2561.9、3329.9、3587.3、3617.9、4127.0、4369.6、4433.7、4740.2、4834.9、4939.9、5083.6、5123.3、5672.9、5826.2、5972.9、6000.5、6341.2、6651.3、6876.0、7169.8、7234.4、7262.7、7559.2、7876.0、8251.7、8430.1、8801.8、9665.9、9875.4、10198.7、10234.1、11336.5；第二峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：2563.4、3330.8、3588.2、3620.5、3922.9、4129.2、4435.2、4857.2、4941.2、5126.1、5666.9、5976.1、6003.6、6344.1、6653.9、6879.0、7173.2、7238.5、7265.6、7876.7、8255.9、8829.3、9670.3、9877.9、9882.4、10203.5、11332.7；第三峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：2533.8、3551.2、3588.9、3620.3、3728.7、4129.0、4435.2、4835.2、4942.9、5125.1、5975.3、6006.1、6639.1、6879.1、7173.2、7237.9、7560.2、7670.9、8255.7、9671.8、9797.0、9880.9、10203.0、10235.2、11343.3；第四峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：2562.7、3329.5、3620.9、3475.2、3588.4、3620.9、4128.2、4435.1、4940.8、5124.5、5973.7、6001.8、6354.7、6652.2、6877.6、7171.7、7237.5、7611.6、8252.1、9135.5、9502.3、9668.5、9877.4、10200.7、11338.8；第五峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：4572.3、4630.1、5854.5、5885.4、6099.7、7558.2、8114.2、8269.3、8269.3、8407.2、8735.9、9162.9、9322.3、9595.6、9783.6、9820.4、10586.6、11940.2、12408.5、13561.4；第六峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：2485.4、2641.2、2728.4、2914.1、3061.4、3620.9、3714.4、4244.3、4971.0、5003.8、5374.8、6003.8、6103.0、7079.0、7385.0、8011.3、8484.7、8870.3、9095.4、9662.7、14755.0；第七峰图由多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，多个蛋白质的质荷比为：2583.6、3264.2、3426.5、3535.8、3739.9、3954.0、4146.5、4269.6、4470.4、4584.5、4624.4、4771.7、5166.3、5305.1、5683.4、5724.6、5898.4、6525.1、6673.0、7069.0、7280.8、7476.8、8119.3、8286.6、8527.4、9163.5、9244.9、9539.1、10246.8、10605.0、11362.4、11793.7、13342.3；第一峰图为菜豆晕疫病菌的特征峰图，第二峰图为大豆细菌性疫病特征峰图、第三峰图为大豆细菌性褐斑病特征峰图，第四峰图为豌豆细菌性疫病菌特征峰图，第五峰图为菜豆细菌性疫病的特征峰图，第六峰图为大豆斑疹病菌的特征峰图，第七峰图为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图。
判定时，当Log(score)≥2.5，且与第一峰图相符，判定为菜豆晕疫病菌；与第二峰图相符，判定为大豆细菌性疫病；与第三峰图相符判定为大豆细菌性褐斑病；与第四峰图相符判定为豌豆细菌性疫病；与第五峰图相符判定为菜豆细菌性疫病；与第六峰图相符判定为大豆斑疹病菌；与第七峰图相符判定为菜豆细菌性萎蔫病菌。
采用本例构建的数据库，分别对菜豆晕疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、豌豆细菌性疫病菌、大豆细菌性疫病、大豆细菌性褐斑病、大豆斑疹病菌和菜豆细菌性疫病七种豆类植物病原细菌进行检测，结果如表3所示。
表3豆类上七种植物病原细菌菌株之间的Log比较值
470582 470513 470575 470543 470366 470719 470709
470582 2.537 - - - - - -
470513 2.167 2.577 - - - - -
470575 2.035 2.092 2.647 - - - -
470543 2.016 2.026 2.023 2.914 - - -
470366 0.049 0.034 0.579 0.037 2.688 - -
470719 0.366 0.258 0.432 0.631 0.166 2.870 -
470709 0.374 0.491 0.516 0.078 0.401 2.197 2.940
可见，本例构建的数据库能够有效的对豆类上的七种重要植物病原细菌进行检测，实现了豆类上重要植物病原细菌的多重检测，为检验检疫等工作提供了一种新的快速的分析检测方法。
可以理解，本例的蛋白质指纹图谱数据库可用于七种豆类细菌性病害的检测鉴定，或者，整合到其它商业用途的蛋白质检测分析系统或数据库，用于豆类细菌性病害的检测鉴定。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)在无菌条件下取受检细菌1-2mg，用无菌水进行至少一次洗涤后，离心弃上清，再用无菌水:无水乙醇体积比为1:3的溶液洗涤至少一次，离心弃上清，然后加入浓度70％的甲酸和/或浓度100％的乙腈，混匀，离心留取上清液，即受检细菌蛋白液；
(2)分别取1μL受检细菌蛋白液和1μL蛋白标准样品点在质谱靶芯片上，室温晾干，再滴加1μL基质溶液覆盖在受检细菌蛋白液和蛋白标准样品上，室温晾干；每个受检细菌蛋白液至少重复4个检测点；
(3)采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受检细菌蛋白液进行检测，每个检测点至少采集5张蛋白质峰图，将至少20张蛋白质峰图叠加制成受检细菌质谱图；
(4)将步骤(3)获得的受检细菌质谱图与数据库比对，与数据库的比对结果Log(score)≥2.5时，判断为阳性；
所述数据库中包含豆类上七种植物病原细菌的七个标准蛋白质指纹图谱，所述蛋白指纹图谱由植物病原细菌的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成；
第一个标准蛋白质指纹图谱为菜豆晕疫病菌的特征峰图，构成第一个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2561.9、3329.9、3587.3、3617.9、4127.0、4369.6、4433.7、4740.2、4834.9、4939.9、5083.6、5123.3、5672.9、5826.2、5972.9、6000.5、6341.2、6651.3、6876.0、7169.8、7234.4、7262.7、7559.2、7876.0、8251.7、8430.1、8801.8、9665.9、9875.4、10198.7、10234.1、11336.5；
第二个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性疫病的特征峰图，构成第二个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2563.4、3330.8、3588.2、3620.5、3922.9、4129.2、4435.2、4857.2、4941.2、5126.1、5666.9、5976.1、6003.6、6344.1、6653.9、6879.0、7173.2、7238.5、7265.6、7876.7、8255.9、8829.3、9670.3、9877.9、9882.4、10203.5、11332.7；
第三个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性褐斑病的特征峰图，构成第三个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2533.8、3551.2、3588.9、3620.3、3728.7、4129.0、4435.2、4835.2、4942.9、5125.1、5975.3、6006.1、6639.1、6879.1、7173.2、7237.9、7560.2、7670.9、8255.7、9671.8、9797.0、9880.9、10203.0、10235.2、11343.3；
第四个标准蛋白质指纹图谱为豌豆细菌性疫病菌的特征峰图，构成第四个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2562.7、3329.5、3620.9、3475.2、3588.4、3620.9、4128.2、4435.1、4940.8、5124.5、5973.7、6001.8、6354.7、6652.2、6877.6、7171.7、7237.5、7611.6、8252.1、9135.5、9502.3、9668.5、9877.4、10200.7、11338.8；
第五个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性疫病的特征峰图，构成第五个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：4572.3、4630.1、5854.5、5885.4、6099.7、7558.2、8114.2、8269.3、8269.3、8407.2、8735.9、9162.9、9322.3、9595.6、9783.6、9820.4、10586.6、11940.2、12408.5、13561.4；
第六个标准蛋白质指纹图谱为大豆斑疹病菌的特征峰图，构成第六个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2485.4、2641.2、2728.4、2914.1、3061.4、3620.9、3714.4、4244.3、4971.0、5003.8、5374.8、6003.8、6103.0、7079.0、7385.0、8011.3、8484.7、8870.3、9095.4、9662.7、14755.0；
第七个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图，构成第七个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2583.6、3264.2、3426.5、3535.8、3739.9、3954.0、4146.5、4269.6、4470.4、4584.5、4624.4、4771.7、5166.3、5305.1、5683.4、5724.6、5898.4、6525.1、6673.0、7069.0、7280.8、7476.8、8119.3、8286.6、8527.4、9163.5、9244.9、9539.1、10246.8、10605.0、11362.4、11793.7、13342.3。
2.根据权利要求1所述的多重检测方法，其特征在于：所述基质溶液的溶剂为10％三氟乙酸:无菌去离子:乙腈水按体积比1:1:2混合而成。
3.根据权利要求1所述的多重检测方法，其特征在于：所述基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
4.一种蛋白质指纹图谱数据库，其特征在于：所述数据库包含豆类上七种植物病原细菌的标准蛋白质指纹图谱，所述蛋白指纹图谱分别由七种植物病原细菌的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成；
第一个标准蛋白质指纹图谱为菜豆晕疫病菌的特征峰图，构成第一个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2561.9、3329.9、3587.3、3617.9、4127.0、4369.6、4433.7、4740.2、4834.9、4939.9、5083.6、5123.3、5672.9、5826.2、5972.9、6000.5、6341.2、6651.3、6876.0、7169.8、7234.4、7262.7、7559.2、7876.0、8251.7、8430.1、8801.8、9665.9、9875.4、10198.7、10234.1、11336.5；
第二个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性疫病的特征峰图，构成第二个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2563.4、3330.8、3588.2、3620.5、3922.9、4129.2、4435.2、4857.2、4941.2、5126.1、5666.9、5976.1、6003.6、6344.1、6653.9、6879.0、7173.2、7238.5、7265.6、7876.7、8255.9、8829.3、9670.3、9877.9、9882.4、10203.5、11332.7；
第三个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性褐斑病的特征峰图，构成第三个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2533.8、3551.2、3588.9、3620.3、3728.7、4129.0、4435.2、4835.2、4942.9、5125.1、5975.3、6006.1、6639.1、6879.1、7173.2、7237.9、7560.2、7670.9、8255.7、9671.8、9797.0、9880.9、10203.0、10235.2、11343.3；
第四个标准蛋白质指纹图谱为豌豆细菌性疫病菌的特征峰图，构成第四个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2562.7、3329.5、3620.9、3475.2、3588.4、3620.9、4128.2、4435.1、4940.8、5124.5、5973.7、6001.8、6354.7、6652.2、6877.6、7171.7、7237.5、7611.6、8252.1、9135.5、9502.3、9668.5、9877.4、10200.7、11338.8；
第五个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性疫病的特征峰图，构成第五个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：4572.3、4630.1、5854.5、5885.4、6099.7、7558.2、8114.2、8269.3、8269.3、8407.2、8735.9、9162.9、9322.3、9595.6、9783.6、9820.4、10586.6、11940.2、12408.5、13561.4；
第六个标准蛋白质指纹图谱为大豆斑疹病菌的特征峰图，构成第六个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2485.4、2641.2、2728.4、2914.1、3061.4、3620.9、3714.4、4244.3、4971.0、5003.8、5374.8、6003.8、6103.0、7079.0、7385.0、8011.3、8484.7、8870.3、9095.4、9662.7、14755.0；
第七个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图，构成第七个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2583.6、3264.2、3426.5、3535.8、3739.9、3954.0、4146.5、4269.6、4470.4、4584.5、4624.4、4771.7、5166.3、5305.1、5683.4、5724.6、5898.4、6525.1、6673.0、7069.0、7280.8、7476.8、8119.3、8286.6、8527.4、9163.5、9244.9、9539.1、10246.8、10605.0、11362.4、11793.7、13342.3。
5.根据权利要求4所述的数据库，其特征在于：所述数据库适用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
6.权利要求4或5所述的蛋白质指纹图谱数据库在豆类细菌性病害的检测或鉴定中的应用。
CN201510205881.5A 2015-04-27 2015-04-27 一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库 Expired - Fee Related CN104833803B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510205881.5A CN104833803B (zh) 2015-04-27 2015-04-27 一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510205881.5A CN104833803B (zh) 2015-04-27 2015-04-27 一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104833803A true CN104833803A (zh) 2015-08-12
CN104833803B CN104833803B (zh) 2017-01-04

Family

ID=53811815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510205881.5A Expired - Fee Related CN104833803B (zh) 2015-04-27 2015-04-27 一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104833803B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410448A (zh) * 2020-12-17 2021-02-26 中华人民共和国金陵海关 一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字pcr分子检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008149088A2 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 The Nottingham Trent University Melanoma assay and antigens
CN103308696A (zh) * 2013-05-30 2013-09-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒
CN103323518A (zh) * 2013-05-28 2013-09-25 浙江大学 一种结直肠癌晚期蛋白质指纹图谱建模分析方法及试剂盒
CN103424463A (zh) * 2012-05-21 2013-12-04 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型及其应用
CN104007165A (zh) * 2014-05-29 2014-08-27 深圳市第二人民医院 筛选甲状腺癌的唾液蛋白质组决策树诊断模型及构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008149088A2 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 The Nottingham Trent University Melanoma assay and antigens
CN103424463A (zh) * 2012-05-21 2013-12-04 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型及其应用
CN103323518A (zh) * 2013-05-28 2013-09-25 浙江大学 一种结直肠癌晚期蛋白质指纹图谱建模分析方法及试剂盒
CN103308696A (zh) * 2013-05-30 2013-09-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒
CN104007165A (zh) * 2014-05-29 2014-08-27 深圳市第二人民医院 筛选甲状腺癌的唾液蛋白质组决策树诊断模型及构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯建军等: "基于M A L D I T O F 质谱技术检测瓜类细菌性果斑病菌", 《中国植物病理学会2012年学术论文年会集》, 31 December 2012 (2012-12-31) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410448A (zh) * 2020-12-17 2021-02-26 中华人民共和国金陵海关 一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字pcr分子检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104833803B (zh) 2017-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Santos et al. Filamentous fungal characterizations by matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry
US10913968B2 (en) Mass-spectrometric resistance determination by growth measurement
CN108507845B (zh) 一种飞行时间质谱系统微生物样本前处理的试剂盒
CN107024530A (zh) 通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品
EP2354796A1 (en) Multi-stage search for microbe mass spectra in reference libraries
CN102253111A (zh) Maldi-tof ms辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法
CN112798679B (zh) 用于诊断新冠病毒感染的试剂盒
CN106199003A (zh) 基于飞行时间质谱原理的微生物肽质量指纹图谱库的构建方法
CN107957464B (zh) 一种动物源性食品中多种糖肽类抗生素的同时检测方法
CN113376298A (zh) 一种快速测定大米中4种农药残留量的方法
CN111239235A (zh) 一种巴尔通体菌株maldi-tof ms的数据库建立方法和鉴定方法
CN105548338A (zh) 唐菖蒲伯克霍尔徳氏菌的蛋白质指纹图谱模型及其应用
CN103868876A (zh) Maldi-tof-ms检测致病性弧菌的方法
CN103424463A (zh) 燕麦噬酸菌西瓜亚种的蛋白质指纹图谱模型及其应用
CN104833803B (zh) 一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库
Spitaler et al. PTR-MS in enology: Advances in analytics and data analysis
CN111220594B (zh) 一种利用超高分辨质谱筛选链霉菌农药活性菌株的方法
CN112051321B (zh) 结合氘水培养和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析的快速抗生素敏感性测试方法
Tao et al. Detection of pathogenic Verticillium spp. using matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry
CN102749233A (zh) 一种maldi-tof ms直接检测感染尿液病原菌前处理方法
KR20170040078A (ko) 식중독균 고속 검출방법
CN113219046B (zh) 基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法
CN113376245B (zh) 用于检测微生物活性的标记峰筛选方法及应用
CN104561256A (zh) 核桃质谱检测特征序列组及检测试剂盒
CN116337986B (zh) 一种基于maldi-tof ms的肯塔基沙门氏菌的快速鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170104