CN113376245B - 用于检测微生物活性的标记峰筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于检测微生物活性的标记峰筛选方法及应用。本发明的检测福氏志贺氏菌活性的方法包括点样基质溶液的制备，将待测菌体样本点在靶板上样孔中，待其自然干燥，选用线性正离子模式进行MALDI‑TOF MS质谱检测得到图谱，根据标志峰来鉴定待测菌体样本是否具有活性。本发明可对菌群活性进行快速检测，对于菌落、菌群、菌液、实验处理后模拟水样，都有检测效力，样本适用性更广。

Description

用于检测微生物活性的标记峰筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速检测菌群活性的方法。
背景技术
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型的软电离生物质谱技术，在微生物鉴定、代谢组学方面具有广泛应用前景。福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)是一类广泛存在于自然环境中的肠道条件致病菌，能够引起人和灵长类动物细菌性痢疾。在细菌耐药性问题突显的今天，对该类病原菌的消杀研究已成为热点课题。在对细菌的消杀过程中需分时分段取样检测细菌活性从而判断细菌消杀效果。然而常规的细菌活性检测方法如平板计数法，需要24～48h培养后逐个计数，费时且耗费大量培养试剂和人力，结果出具时间长，不适合大规模样本检测实验。
目前已公开了利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行微生物鉴定的方法，然而这些方法大部分为用于鉴定微生物种类的区分或鉴定。在鉴定微生物活性时则采用添加指示剂。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明通过特定方法比较活性微生物与灭活微生物质谱图谱的差异，不仅方法本身快速有效，而且还鉴定出了能够检测微生物活性的特异峰。至少部分地基于上述内容完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，其包括以下步骤：
(1)点样基质溶液的制备：将乙腈和三氟乙酸按比例混合，向其中加入HCCA基质，得到点样基质溶液；
(2)将待测菌体样本点在靶板上样孔中，待其自然干燥；
(3)选用线性正离子模式进行MALDI-TOF MS质谱检测得到图谱，以质荷比2089±0.5、4162±0.5、10463±0.5、13097±0.5、5751±0.5、6254±0.5、7271±0.5、7706±0.5、8324±0.5、9063±0.5和9739±0.5位置处的至少一个位置的峰作为鉴定待测菌体样本是否具有活性的标志峰。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，如果2089±0.5、4162±0.5、10463±0.5、13097±0.5处存在峰，则将待测菌体样本鉴定为具有活性，如果2089±0.5、4162±0.5、10463±0.5、13097±0.5处不存在峰或峰消失，则将待测菌体样本鉴定为没有活性。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，以5751±0.5、6254±0.5、7271±0.5、7706±0.5、8324±0.5、9063±0.5和9739±0.5位置处至少一个位置的峰高度作为待测菌体样本中福氏志贺氏菌活性大小的标志。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，包括获取第一质谱图谱和第二质谱图谱的步骤，比较第一质谱图谱和第二质谱图谱中标志峰高度的步骤。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，第一质谱图谱为第一时间点获取的图谱，第二质谱图谱为在第一时间点之后的第二时间点获取的图谱，根据第一质谱图谱和第二质谱图谱的高度变化来检测福氏志贺氏菌活性变化。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，第一质谱图谱为由第一样本获取的图谱，第二质谱图谱为由第二样本获取的图谱，根据第一质谱图谱和第二质谱图谱的高度大小来判断第一样本不习惯第二样本中福氏志贺氏菌活性大小。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，步骤(3)的检测条件包括选用线性正离子模式，2000Da～20000Da分子量范围，激光大小118272pts，延迟55800pts，频率2000Hz，电压2772V，激光强度60％，500shots/次，合计点击叠加10次。
根据本发明所述的用于检测福氏志贺氏菌活性的方法，优选地，待测菌体样本的制备包括在将福氏志贺氏菌菌液在3000rpm～5000rpm下离心10～30s，弃上清，加入等体积无菌水，漩涡混匀，然后再次于3000rpm～5000rpm离心10～30s，弃上清，再次漩涡混匀，得到待测菌体样本，该步骤在10min之内完成。
本发明的第二方面，提供一种用于检测微生物是否具有活性的标志峰的筛选方法，其包括以下步骤：
(1’)点样基质溶液的制备：将乙腈和三氟乙酸按比例混合，向其中加入HCCA基质，得到点样基质溶液；
(2’)将菌体样本点在靶板上样孔中，待其自然干燥，其中菌体样本包括活性样本、第一灭活样本和第二灭活样本，且第一灭活样本为灭菌试剂处理的样本，第二灭活样本为紫外照射和灭菌试剂处理的样本；
(3’)选用线性正离子模式进行MALDI-TOF MS质谱检测得到对应于活性样本的参考图谱、对应于第一灭活样本的第一比较图谱和对应于第二灭活样本的第二比较图谱；
(4’)比较参考图谱、第一比较图谱和第二比较图谱的步骤，其中，包括选择在参考图谱中存在，而在第一比较图谱和第二比较图谱中均不存在的峰作为标志峰，或者选择在参考图谱中存在，而在第一比较图谱和第二比较图谱中峰高度依次降低或升高的峰作为标志峰。
本发明的第三方面，提供一种用于检测微生物是否具有活性的方法，其包括以根据本发明第二方面所述的筛选方法作为其步骤。
MALDI在细菌鉴定方面的应用原理一般是基于微生物特种蛋白指纹图谱(MALDIBio Typer,MBT)，每一种微生物都有其特征的蛋白质指纹图谱，通过菌落培养-预处理-样品制备-质谱测量-鉴定结果搜库，基于微生物的特种蛋白指纹图谱比对，从而实现微生物的鉴定。MBT局限性在于对待测菌要求单菌落，平板培养，菌落新鲜不可冰冻冷藏过，且必须要求仪器自带相应软件或数据库才能实现微生物鉴定功能。
不同于MBT鉴定微生物，本发明旨在解决对菌群活性的快速检测问题；当前对于菌群活性检测的方法如平板计数法费时费力，而本发明具有时效性和半定量的功能。另外，本发明对于菌落、菌群、菌液、实验处理后模拟水样，都有检测效力，样本适用性更广。
本发明选用福氏志贺氏菌进行实验，事实上该方法同样可套用于其他菌株，只要找到相应体系中特征峰即可；基于每一种微生物都有其特征的蛋白质指纹图谱，但并不是每种微生物都存在活性特异峰。本发明找到了相应于福氏志贺氏菌特征蛋白质的峰值及信号值，从而实验对样本中菌群活性的判断和半定量。
附图说明
图1福氏志贺氏菌样本检测方法示意图。
图2由活性福氏志贺氏菌样本得到的质谱图。
图3由紫外+灭菌材料处理后福氏志贺氏菌样本得到的质谱图。
图4由灭菌材料处理后福氏志贺氏菌样本得到的质谱图。
图5为活性大肠杆菌得到的质谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
实施例
一、实验方法
本实施例为一种基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)活性的方法。该方法的步骤如图1所示，其大致包括：
1.将乙腈(TA)和0.1％三氟乙酸(TFA)以1:1比例混合为1mL，向其中加入50mgHCCA基质，得点样基质溶液；
2.对50mL福氏志贺氏菌菌液(107CFU/mL)进行紫外灯照射消杀操作，在0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min分别取样1mL作为待检样本；
3.取样后，无菌操作实验，在生物安全柜中吸取适量福氏志贺氏菌菌液10～1000uL于1.5mL Eppendorf管，于5000rpm离心30s，弃上清，加入等体积无菌水，漩涡混匀；然后于5000rpm离心30s，弃上清；再次漩涡混匀，得到待测菌体样本；上述步骤在10min之内完成；
4.取1uL待测菌体样本点在靶板上样孔中，待其自然干燥；
5.将点样基质溶液取1uL覆盖在待测菌体样本上，待其自然干燥；
6.将MALDI-TOF MS参数设置选用线性正离子模式，2000Da～20000Da分子量范围，激光大小118272pts，延迟55800pts，频率2000Hz，电压2772V，激光强度60％，500shots/次；
7.开始数据采集操作，在样品孔各处均匀采样收集，合计点击叠加10次；
8.将采集后的数据用MALDI-TOF MS分析。
二、实验结果
将以培养得到的具有活性的福氏志贺氏菌作为样本进行检测时，得到的质谱数据如表1所示，质谱图如图2所示。
表1
Figure BDA0002954303400000061
Figure BDA0002954303400000071
当在福式志贺氏菌中加入碳纳米管改性的钒酸铋材料，通过紫外照射光催化150min，杀灭福氏志贺氏菌后，以灭菌样本进行同样的实验，得到的质谱数据如表2所示，其质谱图为图3。
表2
Figure BDA0002954303400000072
Figure BDA0002954303400000081
Figure BDA0002954303400000091
另外，还检测了只加入碳纳米管改性的钒酸铋材料得到的福氏志贺氏菌样本的质谱数据。结果如表3和图4所示。
表3
Figure BDA0002954303400000092
Figure BDA0002954303400000101
通过比较表1-3以及图2-4可知，具有活性的福氏志贺氏菌中，质谱图的2089.582、2488.616、2637.843、4162.706、4869.382、5751.483、6254.743、7271.246、7706.507、8324.776、9063.832、9739.666、10463.847、13097.273位置处存在较强的峰。接下来分析这些峰在不同灭菌处理的样本中的变化情况。其中，2089.582、4162.706、10463.847和13097.273位置处的峰在两种处理的样本中均消失。因此，这四个位置的峰可作为活性的标志峰。为方便起见，称作第一标志峰组。
另外，在不同处理的细菌质谱中，发现5751.483、7271.246、7706.507、8324.776、9063.832和9739.666位置处的峰强度降低，其中，8324.776处的位置峰在紫外+灭菌材料处理的样本中则消失。而6254.743处的峰则强度变高。这些峰的变化呈现规律性。因此，这些峰也可以用作活性的标志峰。为方便起见，称作第二标志峰组。
为了进一步确认上述峰是否为福氏志贺氏菌特异峰，发明人进一步检测了大肠杆菌的质谱数据。结果如表4和图5所示。
表4
Figure BDA0002954303400000111
Figure BDA0002954303400000121
由表4和图5可知，除了9739.911位置处的峰外，在大肠杆菌的质谱图中不存在与第一标志峰组和第二标志峰组中的峰对应的峰。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (1)

1.一种用于检测福氏志贺氏菌是否具有活性的标志峰的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1’)点样基质溶液的制备：将乙腈和三氟乙酸按比例混合，向其中加入HCCA基质，得到点样基质溶液；
(2’) 将待测菌体点在靶板上样孔中，待其自然干燥，其中菌体样本包括活性样本、第一灭活样本和第二灭活样本，且第一灭活样本为灭菌试剂处理的样本，第二灭活样本为紫外照射和灭菌试剂处理的样本，所述灭菌试剂为碳纳米管改性的钒酸铋材料，其中，待测菌体样本的制备包括将福氏志贺氏菌菌液在3000rpm～5000rpm下离心10～30s，弃上清，加入等体积无菌水，漩涡混匀，然后再次于3000rpm～5000rpm离心10～30s，弃上清，再次漩涡混匀，得到待测菌体样本，该制备在10min之内完成；
(3’)选用线性正离子模式进行MALDI-TOF MS质谱检测得到对应于活性样本的参考图谱、对应于第一灭活样本的第一比较图谱和对应于第二灭活样本的第二比较图谱；检测条件包括，线性正离子模式，2000Da～20000Da分子量范围，激光大小118272pts，延迟55800pts，频率2000Hz，电压2772V，激光强度60％，500shots/次，合计点击叠加10次；
(4’)比较参考图谱、第一比较图谱和第二比较图谱的步骤，包括选择在参考图谱中存在，而在第一比较图谱和第二比较图谱中均不存在的峰作为第一标志峰，选择在参考图谱中存在，而在第一比较图谱和第二比较图谱中峰高度降低或升高的峰作为第二标志峰；
如果质荷比2089±0.5、4162±0.5、10463±0.5、13097±0.5位置处至少一个位置处存在峰，则将待测菌体样本鉴定为具有活性，如果质荷比2089±0.5、4162±0.5、10463±0.5、13097±0.5处均不存在峰或峰消失，则将待测菌体样本鉴定为没有活性；以质荷比5751±0.5、6254±0.5、7271±0.5、7706±0.5、8324±0.5、9063±0.5和9739±0.5位置处至少一个位置的峰高度作为待测菌体样本中福氏志贺氏菌活性大小的标志。
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