CN108265105A - 用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法包括下述步骤：第一步，在收集的痰液标本中加入4倍量浓度4%~30% 的NaOH溶液，涡旋震荡使之液化，并室温放置5‑10min；第二步，在第一步处理后的样本液中加入浓度20%~80%的柠檬酸溶液震荡混匀；第三步，在第二步处理后的样本液中加入浓度5~14%的硫脲震荡混匀后，室温静置，去除沉淀即可。本发明的优点在于方法简单快捷，由于整个前处理过程不需要离心，操作方便，耗时较短（不足15分钟）；经本发明方法前处理后的样本液灵敏度较高，最低可检测出30个菌/ml，特异性好，根据临床样本验证结果，阴性符合率可达100%。

Description

用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法

技术领域

本发明涉及痰液标本的处理，尤其是涉及一种用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法。

背景技术

结核分枝杆菌引起的结核病是常见的人类传染病之一，约三分之一的世界人口曾经感染，亚洲地区感染者占全世界的三分之二，所以结核病已成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题。临床检测结核分枝杆菌主要有微生物学培养、免疫学检测及近年来发展迅速的分子生物学即核酸检测技术。

目前临床检测结核分枝杆菌的主要样本类型为痰液标本，但是痰液成分较复杂，其中主要包含粘液、异物、病原微生物、各种炎症细胞及坏死脱落的粘膜上皮细胞等成分，由于痰中粘单白、酸性糖蛋白、Ca^2＋含量高，导致痰液粘稠度很高，所以痰液在参与核酸提取前需要进行特殊的前处理，才能够参与后续PCR扩增检测。传统的痰液处理方法为碱裂解法，主要为NaOH液化，高速离心取沉淀，生理盐水或磷酸盐溶液清洗沉淀后，再离心收集菌体，该方法处理步骤复杂，操作不便捷且耗时较长（≥60min），反复离心洗涤过程中菌体损失率高，杂质去除率低，导致后续检测结果容易出现假阴性。目前市面上与其配合的核酸检测试剂盒采用的核酸提取方法为煮沸法，该方法不能与全自动核酸检测技术配套且灵敏度较低，易造成假阴性结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法，该方法具有快速、便捷、检测灵敏度高、特异性好、可与全自动核酸检测技术配套等优点，提高了临床痰液标本处理工作的效率及准确度。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法包括下述步骤：

第一步，在收集的痰液标本中加入4倍量浓度4%~30% 的NaOH溶液，涡旋震荡使之液化，并室温放置5-10min；

第二步，在第一步处理后的样本液中加入浓度20%~80%的柠檬酸溶液震荡混匀；

第三步，在第二步处理后的样本液中加入浓度5~14%的硫脲震荡混匀后，室温静置，去除沉淀即可。

所述第一步中NaOH溶液的最佳浓度为4%。

所述第二步中柠檬酸溶液的最佳浓度为40%。

所述第三步中硫脲的最佳浓度为10%。

本发明的优点在于方法简单快捷，由于整个前处理过程不需要离心，操作方便，耗时较短（不足15分钟）；经本发明方法前处理后的样本液灵敏度较高，最低可检测出30个菌/ml，特异性好，根据临床样本验证结果，阴性符合率可达100%。

为了解决痰液传统碱裂解法应用中的缺点，申请人的发明人团队通过大量的研究及实验筛选工作，在痰液标本传统碱裂解基础上进行改造优化，最终确定了本发明快速核酸检测用的痰液前处理方法，包括采用的前处理试剂和前处理操作步骤。由于磁珠法核酸提取要求必须在高盐酸性环境中磁珠才能高效率吸附核酸，痰液经过强碱溶液液化后，如参与提取核酸势必会提高磁珠吸附核酸环境pH值，导致核酸提取效率降低，故在前处理过程中增加酸中和即可快速解决该问题。由于临床样本检验中的痰液样本属于特殊样本中的一种，状态多种多样，给临床检验带来诸多不便，特别是其成分复杂，含有大量黏蛋白，影响后续PCR酶检测活性，从而导致假阴性出现。本发明通过对痰液进行酸中和、添加蛋白变性剂的处理，即减少了样本处理时间，又能降低样本杂质蛋白抑制率，同时配合磁珠法核酸提取试剂和荧光PCR扩增检测技术，实现了快速、便捷、检测灵敏度高、特异性好、可自动化等优点，提高了临床痰液标本处理工作效率及准确度。

附图说明

图1是经本发明方法处理后的痰液标本配合磁珠法提取试剂进行核酸提取纯度检测结果图。

图2是两种痰液前处理方法抑制率对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。

实施例1 采用磁珠法提取试剂对痰液标本进行核酸提取

1、配制前处理试剂：

痰液消化液：NaOH，浓度4%；

酸中和液：柠檬酸，浓度40%；

变性剂：硫脲，浓度10%；

2、痰液标本的前处理

采用本发明方法对痰液标本进行前处理，具体步骤为：

第一步，向模拟阳性痰液标本中加入4倍体积的浓度4%NaOH溶液，涡旋震荡使之液化，并室温放置5-10min（液化期间可继续涡旋震荡1~2次）；

第二步，取液化后样本500 ul于1.5ml离心管中（取样时要避免吸出明显的固体杂质），加入40%柠檬酸溶液100ul，震荡混匀；

第三步，再加入10%硫脲溶液150 ul，震荡混匀后，室温静置3min，取上清液体进行后续的核酸提取。

3、核酸提取并检测

收集的上清液体（痰液标本）配合磁珠法提取试剂（豫郑械备20180037号）进行核酸提取，然后将提取后核酸产物及系列10倍梯度稀释（如下表1所示）后，将核酸产物用荧光PCR检测试剂扩增检测鉴定提取结果，如附图1所示：

表1

结论：提取后核酸产物经过10倍梯度系列稀释后进行荧光PCR检测，图中曲线典型，梯度均一，结果显示样本Ct值随着10倍梯度稀释逐渐按梯度退后3-4个Ct值，证明痰液经过该发明方法处理后经过磁珠法提取试剂提取的核酸产物纯度较高。

实施例2 两种痰液标本前处理方法的对比

取培养灭活后的结核分枝杆菌加入36例临床检测结核分枝杆菌阴性的痰液中，使用本发明配制的前处理试剂处理模拟临床结核分枝杆菌阳性痰液样本（前处理试剂和对痰液标本前处理方法同实施例1），与传统痰液处理方法--碱裂解法进行平行对比，同时配合专属磁珠法提取试剂和荧光PCR检测试剂检测样本抑制率。

附：碱裂解法处理步骤：

1、向模拟随机阴阳性（因为结核分枝杆菌临床阳性具有传染性，申请人所用的阳性样本是用灭活的结核分枝杆菌直接加入临床阴性痰液中，自己制备阳性样本。制备的阳性样本随机穿插在阴性样本中，检测阴阳性符合率）痰液标本中加入4倍体积4%NaOH溶液，涡旋震荡，室温放置30min；

2、取液化后样本500ul于1.5ml离心管中（避免吸出明显的固体杂质），12000r/min，离心3min，弃上清取沉淀；

3、向沉淀中加入1ml无菌生理盐水重悬沉淀，12000r/min，离心3min，弃上清取沉淀；

4、重复3步骤1次，沉淀用600ul无菌生理盐水重悬后进行后续的核酸提取。

核酸提取时同样配合磁珠法提取试剂进行。

以上两种痰液前处理方法提取后的核酸产物分别用荧光PCR检测试剂扩增检测鉴定提取结果，如附图2所示，可以看出，本发明的痰液前处理方法--中和法与传统痰液处理方法--碱裂解法相比，36例模拟阳性临床样本中，碱裂解法假阴性3例，抑制率8.33%；中和法无假阴性出现，抑制率为0%，证明本发明痰液前处理方法-中和法提高了结核分枝杆菌荧光PCR核酸检测灵敏度及特异性。

Claims (4)

1.一种用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，在收集的痰液标本中加入4倍量浓度4%~30% 的NaOH溶液，涡旋震荡使之液化，并室温放置5-10min；

第二步，在第一步处理后的样本液中加入浓度20%~80%的柠檬酸溶液震荡混匀；

第三步，在第二步处理后的样本液中加入浓度5~14%的硫脲震荡混匀后，室温静置，去除沉淀即可。

2.根据权利要求1所述的用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法，其特征在于：所述第一步中NaOH溶液的浓度为4%。

3.根据权利要求1所述的用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法，其特征在于：所述第二步中柠檬酸溶液的浓度为40%。

4.根据权利要求1所述的用于快速进行核酸检测的痰液前处理方法，其特征在于：所述第三步中硫脲的浓度为10%。