CN110499355A - 一种pcr检测前痰液标本的改良处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PCR检测前痰液标本的改良处理方法，包括：痰液标本中去掉用于涂片镜检所需痰液后，余下的痰液加入含有NaOH和NALC的前处理液形成既用于实时荧光PCR检测且又用于痰结核分枝杆菌培养的混合液。本发明通过改良痰处理方法，无需患者另外提供一份痰标本，利用痰培养所用的前处理液处理后的痰标本进行实时荧光PCR检测，患者只需提供满足常规痰涂片和痰培养的量，就可以同时做结核分枝杆菌DNA检测，且检测结果依然准确、精密，克服了现有技术中仅严格按照PCR检测才能定量准确的技术偏见，简单易操作，减轻了患者的负担，提高了诊断效率，因其临床评价优良，为基层实验室提供了参考依据。

Description

一种PCR检测前痰液标本的改良处理方法
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，具体涉及一种PCR检测前痰液标本的改良处理方法。
背景技术
结核病(tuberculosis，TB)是全球面临的主要公共卫生挑战之一，结核病的防治已从“遏制结核病”向“终止结核病”的目标迈进。快速、有效诊断结核病对于控制结核病的防控意义重大。随着核酸扩增技术的发展，实时荧光PCR(Polymerase Chain Reaction，全文中简称PCR)广泛应用于临床痰标本结核分枝杆菌的检测，与显微镜检相比，显著提高了病原学阳性检出率；与结核分枝杆菌培养相比，显著缩短了检出时间。针对临床工作中遇到疑似肺结核病患者少痰、难以咳出痰的情况，有些患者只能提供少量的痰液用于常规的涂片镜检、痰培养之后没有足够的痰液用于核酸检测，通知患者补送标本又会耽误时间，而且要求少痰、难以咳出痰液的患者再提供一份痰液也是非常困难的事情。
发明内容
本发明的目的是提供一种PCR检测前痰液标本的改良处理方法，解决现有技术中患者痰液量少而影响实时荧光PCR检测的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种PCR检测前痰液标本的改良处理方法，包括：痰液标本中去掉用于涂片镜检所需痰液后，余下的痰液加入含有NaOH和NALC的前处理液形成既用于实时荧光PCR检测且又用于痰结核分枝杆菌培养的混合液。
在本发明的改良处理方法中，含有NaOH和NALC的前处理液中NaOH的浓度是1％-3％，NALC的浓度是0.1％-1.0％。
在本发明的改良处理方法中，含有NaOH和NALC的前处理液中NaOH的浓度是1.5％-2.5％，NALC的浓度是0.3％-0.8％。
在本发明的改良处理方法中，含有NaOH和NALC的前处理液中NaOH的浓度是2％，NALC的浓度是0.5％。
在本发明的改良处理方法中，所述前处理液中还含有柠檬酸钠。
在本发明的改良处理方法中，所述柠檬酸钠的浓度1.2％-1.8％。
在本发明的改良处理方法中，余下的痰液中加入含有NaOH和NALC的前处理液的体积是余下的痰液的体积的1-2倍。
在本发明的改良处理方法中，所述改良处理方法还包括：在余下的痰液加入含有NaOH和NALC的前处理液后，进行涡旋振荡，离心，并弃上清液。
在本发明的改良处理方法中，所述改良处理方法还进一步包括：进一步加入1mL无菌生理盐水涡悬；再次离心，弃上清液。
在本发明的改良处理方法中，所述改良处理方法还进一步包括：加入核酸释放剂，金属浴加热，然后离心，取上清液作为待测样本。
实施本发明的PCR检测前痰液标本的改良处理方法，具有以下有益效果：本发明通过改良痰处理方法，无需患者另外提供一份痰标本，利用痰培养所用的前处理液处理后的痰标本进行实时荧光PCR检测，患者只需提供满足常规痰涂片和痰培养的量，就可以同时做结核分枝杆菌DNA检测，且检测结果依然准确、精密，克服了现有技术中仅严格按照PCR检测才能定量准确的技术偏见，简单易操作，减轻了患者的负担，提高了诊断效率，因其临床评价优良，为基层实验室提供了参考依据。
附图说明
图1是实施例1-3中CT值均值与痰涂片镜检阳性分级的相关性的块形图；
图2是实施例1-3中CT值与MGIT960培养报阳时间的相关性的曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的PCR检测前痰液标本的改良处理方法作进一步说明：
结核病是全球传染病中的头号杀手。结核病的早期准确诊断对于结束结核病流行至关重要。细菌学检查是发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的主要方法，最常见的结核病诊断方法有痰涂片(包括抗酸染色、显微镜检)和痰培养(包括固体培养和液体培养)，前者敏感性太低，后者敏感性高，但培养时间较长，会延误诊断和治疗。分子病理学检测常用的技术有实时荧光定量PCR(FQ-PCR)、核酸杂交技术和高分辨溶解曲线技术。三种技术都是基于PCR的分子病理检测技术，FQ-PCR技术由于方法学的优越性，是目前临床应用最为广泛的方法。检验科接收痰标本时，经常遇到痰液不够量不足以完成检测项目，包括：痰涂片(用无菌棉签挑取少量)、痰培养(≥1mL)、结核分枝杆菌DNA定性(≥1mL)等。要求少痰、难以咳出痰液的患者再提供一份痰液是非常困难的事情。为减轻患者的负担，提高诊断效率，本发明改良了痰标本处理方法。
本发明通过改良痰处理方法，无需患者另外提供一份痰标本，利用痰培养所用的前处理液处理后的痰标本进行实时荧光PCR检测，患者只需提供满足常规痰涂片和痰培养的量，就可以同时做结核分枝杆菌DNA检测，且检测结果依然准确、精密，简单易操作，减轻了患者的负担，提高了诊断效率，因其临床评价优良，为基层实验室提供了参考依据。其中，前处理液含有NaOH和NALC(即N-乙酰半胱氨酸)，NaOH的浓度是1％-3％，NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的浓度是0.1％-1.0％，优选地，含有NaOH和NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的前处理液中NaOH的浓度是1.5％-2.5％，NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的浓度是0.3％-0.8％；更优选地，含有NaOH和NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的前处理液中NaOH的浓度是2％，NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的浓度是0.5％。前处理液中还含有柠檬酸钠，柠檬酸钠的浓度1.2％-1.8％，优选地，柠檬酸钠的浓度1.4％-1.5％；更优选地，柠檬酸钠的浓度1.45％。
需要说明的是，全文中的NALC是指N-乙酰半胱氨酸。且在全文中的用X％所表示的浓度无特殊说明则是指质量体积浓度，即每100ml溶液中含有X克的目标物。比如，NaOH的浓度是2％，NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的浓度是0.5％，即指100ml溶液中含有2g的NaOH，100ml溶液中含有0.5g的NALC。
下面进行详细说明。
研究对象：痰液标本采自门诊患者1749例，其中男性1158例，女性591例，年龄(5-88)岁，平均年龄(37.17±15.81)岁，含初诊1508例，复诊241例。
仪器与试剂：Ziehl-Neelsen(ZN)抗酸染色液(珠海贝索)，显微镜(日本Olympus)，BACTEC MGIT960系统及配套MGIT培养管、营养添加剂、抑菌剂(美国BD)，氢氧化钠(NaOH)和N-乙酰半胱氨酸(NALC)(Sigma)，实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480Ⅱ，罗氏)，结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(湖南圣湘)。
实施例1
标本留取、涂片染色和镜检：每个患者要求送早、晚、随机痰液三份，挑取痰液质量合格的部分用于涂片镜检，余下的痰液混匀，用于MGIT960培养和改良痰处理PCR检测。涂片、Z-N抗酸染色、镜检和结果判读参照《现代结核病诊断技术》中相关操作执行。
实施例2
痰结核分枝杆菌培养：取适量痰标本加入50mL离心管，视痰性状加入1-2倍体积的含有NaOH和NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的前处理液，涡旋振荡2min，室温放置20min后加入0.1M无菌pH6.8磷酸盐缓冲液至50mL；3000rpm、4℃离心15min，小心弃上清，加入1mL-2mL0.1M无菌pH6.8磷酸盐缓冲液，混匀，得待测标本；将营养添加剂倒入杂菌抑制剂PANTA试剂瓶中，充分溶解混匀后吸取0.8mL加入到MGIT7mL液体培养管中，然后再加入0.5mL的本实施例的待测标本，置于BACTEC MGIT960系统内进行培养，操作严格按仪器和试剂盒说明书进行。其中，前处理液中NaOH的浓度是2％，NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的浓度是0.5％。前处理液中还含有柠檬酸钠，柠檬酸钠的浓度1.45％。
实施例3
改良痰处理方法和实时荧光PCR(以下称：改良PCR)：直接取实施例2中加入1-2倍体积的含有NaOH和NALC(即N-乙酰半胱氨酸)的前处理液处理的痰标本1mL，涡旋振荡后静置30min；10000rpm离心3min，弃上清，加入1mL无菌生理盐水重悬；再次12000rpm离心3min，弃上清，加入50uL核酸释放剂，100℃金属浴加热10min，然后12000rpm离心3min，取上清作为待测样本。PCR管中加入PCR-Mix(反应液38uL，酶混合液2uL，内标1uL)，再分别加入前处理的样本、阴性对照、阳性对照各5uL，盖上管盖，低速离心30s，上实时荧光定量PCR仪反应；扩增程序如下：50℃2min；94℃2min；94℃5s、57℃30s(45循环)；40℃10s。
实施例4
实施例1-3所用的统计学方法：采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料用(均值±标准差)表示，差异性应用配对四格表X2检验判别，P＜0.05为差异有统计学意义。两种方法检测结果的一致性应用Kappa检验判别：Kappa≥0.75表示一致性较好，0.40＜Kappa＜0.75表示一致性一般，Kappa≤0.40表示一致性较差。线性回归分析用GraphpadPrism(V5.0)软件分析，相关性分析采用Pearson相关性分析。
实施例5
实施例1-3中改良PCR的敏感性和特异性：收集1749例痰标本，其中有86例MIGT960培养为污染，污染率为4.92％，有效样本为1663例。MGIT960培养阳性313例，阳性率为18.82％(313/1663)；痰涂片阳性151例，阳性率为9.08％(151/1663)；改良PCR阳性281例，阳性率16.90％(281/1663)。
痰涂片的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)依次为40.26％(126/313)、98.15％(1325/1350)、83.44％(126/151)、87.63％(1325/1512)；改良PCR的敏感性、特异性、PPV、NPV依次为88.82％(278/313)、99.78％(1347/1350)、98.93％(278/281)、97.47％(1347/1382)(见表1)。痰涂片、改良PCR分别与MGIT960培养结果比较，差异有显著统计学意义(X2＝123.79，25.29，P＜0.001)。以MGIT960培养为金标准，痰涂片与改良PCR的敏感性、特异性比较，差异有显著统计学意义(X2＝142.62，P＜0.01；X2＝20.05，P＜0.001)。
表1改良PCR、MGIT960培养和痰涂片三种方法检测结果比较(n为例数)
Table 1Diagnostic performance of modified PCR assay compare withsmear microscopy and MGIT960 system
实施例6
实施例1-3中改良PCR、痰涂片和MGIT960培养结果的一致性分析：痰涂片与MGIT960培养结果的一致性为87.25％[(126+1325)/1663]，Kappa值为0.48，表明一致性一般；改良PCR与MGIT960培养结果的一致性为97.71％[(278+1347)/1663]，Kappa值为0.92，表明一致性良好。
实施例7
以往的经验认为，由于痰液标本前处理的特殊性，其前处理会严格按照PCR检测要求进行前处理，但实施例1-3中改良PCR前处理的CT值与痰标本结核分枝杆菌载量的相关性表明：改良PCR的CT值均值与痰涂片阳性分级的相关性见图1。按涂片镜检报告结果分6组：阴性、少量、1+、2+、3+、4+，各组PCR阳性检出率分别为13.15％、76.92％、83.33％、89.19％、95.78％、99.44％。涂片阴性组的CT值均值与少量组比较，差异有统计学意义(34.15±2.11vs 31.06±2.92，P＜0.001)。改良PCR的CT值与MGIT960培养报阳时间的相关性见图2，两者呈正相关，R＝0.80，P＜0.0001。
综上所述，实施例1-3研究1749例标本，其中MIGT960培养污染86例，污染率为4.60％，符合临床结核病实验室痰培养污染率控制低于5％的要求。培养阳性而改良PCR阴性有35例，其中有4例胞内分枝杆菌，2例戈登分枝杆菌，7例偶发分枝杆菌，4例脓肿分枝杆菌，1例戈登/脓肿分枝杆菌混合感染，3例鸟分枝杆菌，14例未分型NTM。由此可见，改良PCR可以很好地鉴别MTB和NTM。
实施例1-3研究中痰涂片的阳性检出率是9.08％，MGIT960系统培养阳性检出率为18.82％，虽然后者的阳性检出率比较高，接近于改良PCR阳性检出率16.90％(281/1663)，但是MGIT960培养报阳时间为(12.19±5.47)天(313例)，培养报阴时间则需42天。改良PCR从痰液样本处理、加样、上机、软件分析结果、出报告，整个实验过程在3小时内完成，明显缩短了诊断时间，且灵敏度更高。改良PCR检测痰液标本MTB的敏感性88.82％，显著高于痰涂片40.26％(P＜0.01)；特异性99.78％，同样显著高于痰涂片98.15％(P＜0.001)。另外，改良PCR的PPV 98.93％，显著高于痰涂片83.44％(P＜0.01)；改良PCR的NPV 97.47％，显著高于痰涂片87.63％(P＜0.01)。改良PCR和痰涂片分别与MGIT960培养结果做一致性分析显示，前者一致性比后者更好。因此，改良PCR方法优良，可以应用于临床检测。
FQ-PCR检测的CT值是可以在一定程度上反映患者的痰标本MTB载量的，改良PCR检测CT值越低，反映痰标本MTB载量越高；反之CT值越高，则反映MTB载量越低。
由此可见，改良PCR方法简单易操作，无需患者另外提供一份痰标本，只需与痰培养前处理步骤中采用相同的前处理液开展结核分枝杆菌DNA检测。该方法经临床验证，检测痰液MTB准确可靠，CT值可在一定程度上反映痰液标本中结核分枝杆菌载量。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种PCR检测前痰液标本的改良处理方法，其特征在于，包括：痰液标本中去掉用于涂片镜检所需痰液后，余下的痰液加入含有NaOH和NALC的前处理液形成既用于实时荧光PCR检测且又用于痰结核分枝杆菌培养的混合液。
2.根据权利要求1所述的改良处理方法，其特征在于，含有NaOH和NALC的前处理液中NaOH的浓度是1％-3％，NALC的浓度是0.1％-1.0％。
3.根据权利要求2所述的改良处理方法，其特征在于，含有NaOH和NALC的前处理液中NaOH的浓度是1.5％-2.5％，NALC的浓度是0.3％-0.8％。
4.根据权利要求3所述的改良处理方法，其特征在于，含有NaOH和NALC的前处理液中NaOH的浓度是2％，NALC的浓度是0.5％。
5.根据权利要求1所述的改良处理方法，其特征在于，所述前处理液中还含有柠檬酸钠。
6.根据权利要求5所述的改良处理方法，其特征在于，所述柠檬酸钠的浓度1.2％-1.8％。
7.根据权利要求1所述的改良处理方法，其特征在于，余下的痰液中加入含有NaOH和NALC的前处理液的体积是余下的痰液的体积的1-2倍。
8.根据权利要求1所述的改良处理方法，其特征在于，所述改良处理方法还包括：在余下的痰液加入含有NaOH和NALC的前处理液后，进行涡旋振荡，离心，并弃上清液。
9.根据权利要求8所述的改良处理方法，其特征在于，所述改良处理方法还进一步包括：进一步加入1mL无菌生理盐水涡悬；再次离心，弃上清液。
10.根据权利要求9所述的改良处理方法，其特征在于，所述改良处理方法还进一步包括：加入核酸释放剂，金属浴加热，然后离心，取上清液作为待测样本。
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