CN106967828A

CN106967828A - 一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN106967828A
Application number: CN201710349783.8A
Authority: CN
Inventors: 齐飞虎; 董振国
Original assignee: Shanghai Gift Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Gift Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-05-17
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2017-07-21

Abstract

本发明涉及一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其包括含有SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：2所示序列的捕获引物的裂解液；本发明还涉及包括上述核酸提取试剂的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括冻干粉型荧光PCR反应体系，该反应体系包括如SEQ ID NO：3‑SEQ ID NO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQ ID NO：5所示的结核分枝杆菌扩增探针、冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。本发明通过优化结核分枝杆菌核酸的提取过程，尽量减少对荧光PCR产生的干扰物质，能够针对多种样本应用荧光PCR技术完成对低拷贝结核分枝杆菌核酸的检测；同时通过将结核分枝杆菌检测体系冻成干粉状，最大程度上增加荧光PCR的上样量，增强了结核分枝杆菌的检测出率。

Description

一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域和临床检测诊断领域，尤其涉及一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法。

背景技术

我国是世界上22个结核病高疫情国家之一，患者数居世界第2位，感染率为44.5％，活动性肺结核患者为450万例，每年新发病例约100万左右，死亡人数达13万例每年，是其他传染病死亡人数的2倍以上。目前针对结核的诊断方法主要包括痰涂片抗酸染色、痰培养方法、结核分枝杆菌核酸检测和干扰素释放试验等，虽然这些技术已经在临床检测和对结核分枝杆菌感染的监测等方面被广泛应用，但检出率相对较低，检出时间长，操作过程复杂，易受到其他疾病干扰等因素影响，这些检测手段已不能满足临床需求。

目前，临床上对菌阴性肺结核(指患者在进行痰液涂片时或是在进行一次的痰液培养阴性的活动性肺结核)缺乏相对可靠的检测方法，菌阴性肺结核在初期属于非传染性结核病，但若对于部分体质较差的患者，多表现为与呼吸道症状相似的临床症状，如咳嗽、咳痰及严重者出现咯血的症状，故多数患者因误诊而导致病情加重，最终因为治疗延误使其转为阳性肺结核。

市场上已经有多种商业化的分枝杆菌结核核酸检测试剂产品，但由于诸多因素限制因素使得其检出符合率与临床诊断结果相差很大，这些因素主要包括：1)样本质量达不到检测要求；2)对MTB-DNA提取能力较差，不能完全富集样本中的MTB-DNA，使得检测结果不理想；3)试剂盒敏感性不够；4)目前大部分检测产品为液体试剂，其对运输过程要求较高，实际运输中很难完全按照要求运送，导致试剂盒的检测性能有所降低；5)常规的检测试剂产品还不能准确地对外周血中的结核DNA进行检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒及其方法，该方法从根本上解决现有结核分枝杆菌核酸检测试剂盒敏感性低，稳定性差、检测样本单一和对运输温度要求高等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其包括裂解液，所述裂解液含有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示序列的捕获引物。

优选地，所述核酸提取试剂还包括液化液、蛋白酶K、磁珠液、洗涤液和洗脱液。

优选地，所述捕获引物5’端采用生物素标记。

优选地，所述裂解液含有：50～200mM氯化钠、30～60mM三羟甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸钠、1～5mM乙二胺四乙酸、1～5mM氯化钙和1～10nM捕获引物。

本发明还提供一种包含如上所述的核酸提取试剂的用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

优选地，所述试剂盒还包括荧光PCR反应体系，所述荧光PCR反应体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其包括如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQ ID NO：5所示序列的结核分枝杆菌扩增探针；

其中，所述探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour；所述探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL；更优选地，所述探针的5’端连接荧光基团FAM，所述探针的3’端连接淬灭基团BHQ1。

优选地，所述荧光PCR反应体系还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。

优选地，所述荧光PCR反应体系为30～100μL。

优选地，所述冻干骨架包括0.3％～2.5％甲基纤维素和/或羟甲基纤维素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮。

优选地，所述冻干保护剂包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖。

优选地，所述dNTPs包括0.1～0.5mM的dNTP和dUT。

优选地，所述酶混合液包括1.5～5U Taq DNA聚合酶、UNG酶和缓冲液。

上述引物及探针的核苷酸序列如表1所示。

表1引物及探针核苷酸序列表

最后，本发明提供一种用于非诊断和治疗目的的采用上述试剂盒来来检测低拷贝结核分枝杆菌的方法，其包括如下所述的核酸提取步骤：采用核酸提取试剂对样本进行酶促消化、寡核苷酸杂交和捕获、结核DNA富集、洗涤和洗脱。

优选地，所述样本为痰液、灌洗液、外周血和脑脊液，当样本为痰液或灌洗液时，所述酶促消化之前先对样本进行液化。

优选地，所述液化方法选自4％氢氧化钠(NaOH)、5-10％二硫代苏糖醇(DDT)、1.45％N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)、2％氢氧化钠(NaOH)、Saccomanno法、二硫苏糖醇(DTT)法、0.5％N-乙酸-L半胱氨酸、1.45％枸橼酸钠、2％氢氧化钠、0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、400u/mL的胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、高压液化法及其组合；更优选地，所述液化方法为1.45％N-乙酰-L-半胱氨酸及2％氢氧化钠(NALC-NaOH)的联合应用、Saccomanno法和二硫苏糖醇(DTT)法的联合应用、0.5％N-乙酸-L半胱氨酸和1.45％枸橼酸钠和2％氢氧化钠的液化剂振摇液化、4％氢氧化钠(NaOH)和5％二硫代苏糖醇(DDT)的联合应用。

优选地，所述核酸提取步骤的具体过程如下：

1)痰液和灌洗液样本需采用上述的液化方法进行预先液化，而外周血、脑脊液样本直接进入步骤2)。

2)取0.5～1mL步骤1)处理后的样本，加入0.5～1倍体积裂解液和20mg/mL蛋白酶K，其中裂解液含有：50～200mM氯化钠、30～60mM三羟甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸钠、1～5mM乙二胺四乙酸、1～5mM氯化钙和1～10nM捕获引物，所述的捕获引物的序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，捕获引物5’端采用生物素(biotin)标记；

3)充分混匀后56℃消化30min；

4)消化结束后95℃孵育10min，将蛋白酶K失活，随后将温℃维持在55℃孵育10min；

5)加入10～50mg 1～10μM链霉亲和素标记的超顺磁珠，充分混匀，孵育10min；

6)将样本放置磁力架上，静置2～5min，吸去液体；

7)加入200～500μL洗涤液，洗涤1～2次，所述的洗涤液中含有：10mM三羟甲基氨基甲烷和0.1～0.5mM乙二胺四乙酸，pH为8.0；

8)加入30～100μL洗脱液，所述洗脱液即为PCR扩增模板DNA，混匀后备用，若不及时检测，保存于-20℃；

9)阴性质控品和阳性质控品参照上述同样的方法进行处理。

优选地，上述检测低拷贝结核分枝杆菌的方法还包括如下所述的荧光PCR扩增程度：

1)将上述所获得的30～100μL含PCR扩增模板DNA的洗脱液直接加入到冻干粉型荧光PCR反应体系中，盖好管盖，上机反应；

2)PCR扩增的最佳反应温度和时间为：UNG酶反应55℃2min，1个循环；Taq酶活化95℃10min，1个循环；变性95℃15s，退火、延伸、荧光采集55℃45s，45个循环；仪器冷却37℃2min，1个循环。

优选地，上述检测低拷贝结核分枝杆菌的方法还包括上述荧光PCR反应的结果判读：荧光基团信号通路Ct值<42循环，且扩增曲线为“S”型，检测结果为阳性。

优选地，冻干粉型荧光PCR反应体系的制备方法如下：

1)将预先配置的荧光PCR反应体系按30～100μL分装到八联排管中；

2)-60℃预冻4h；

3)-45℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为20h；

4)25℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为2h；

经过上述处理获得冻干粉型荧光PCR反应体系。

在本发明中，检测样本是经过核酸提取的DNA模板，可选地，DNA提取的方法包括本发明上述的核酸提取步骤，也可采用本领域常用的超声破碎法、煮沸法或苯酚氯仿抽提法进行核酸提取。

本发明针对现有技术中液体试剂盒上样量为5到10μL而不能保证检测体系中含有分枝杆菌DNA的问题，通过将结核分枝杆菌检测体系冻成干粉状，在扩增检测过程中，直接加入提取的DNA进行反应，最大程度上增加荧光PCR的上样量，极大的增强了结核分枝杆菌的检测出率；同时优化样本中结核DNA提取过程，尽量减少荧光PCR干扰物质。

本发明的要点在于一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒及其方法。其基本原理是：首先对待检样本进行预处理，通过优化结核分枝杆菌核酸的提取过程，尽量减少对荧光PCR产生的干扰物质，以多种样本中的结核分枝杆菌DNA作为扩增模板，应用荧光PCR技术完成对低拷贝结核分枝杆菌核酸的检测。同时将结核分枝杆菌核酸检测体系冻成干粉状，便于储存和运输，最大程度的保持了检测体系的稳定性，也简化了操作步骤、降低了污染的风险，只需将提取的DNA加入其中便可上机进行反应，可以最大程度上增加上样量，极大的增强了结核分枝杆菌的检测出率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明结合磁珠法进行核酸的提取，不需要高速离心和煮沸等操作步骤，可以最大程度的保持核酸的完整性，同时避免了气溶胶所带来的生物风险。

(2)本发明可以对低拷贝的结核分枝杆菌核酸进行检测，所以既可以结合临床上常用的4％NaOH进行液化的常规步骤，又可以与其他形式的液化方法很好的融合，可以很大程度的降低假阴性结果。

(3)本发明具有极高的灵敏度和良好的重复性，相比于常规的核酸检测，具有更好的检出率和稳定性，同时简化了提取和检测的操作步骤，极大地缩短了检测时间，最大程度的降低了检测成本，为自动化检测和大样本量的检测奠定了基础。

本发明所述的用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒及其方法相比于现有的检测方法和产品，操作简便快速、成本降低、易于开发成为自动化检测系统和装置，检测的灵敏度高、特异性强、重复性好，能够针对多种样本进行检测，可广泛的应用于生物医学临床诊疗领域中。

具体实施方式

本发明提供一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其包括液化液、裂解液、蛋白酶K、磁珠液、洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液中含有SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：2所示序列的捕获引物，所述捕获引物5’端采用生物素标记；本发明还提供一种含有上述核酸提取试剂的用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括荧光PCR反应体系，其包括如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQ ID NO：5所示的结核分枝杆菌扩增探针。

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1-冻干粉型PCR反应体系的制备

制备冻干粉型荧光PCR反应体系的步骤如下：

(1)在预先配置的荧光PCR反应体系按30～100μL分装到八联排管中；

(2)-60℃预冻4h；

(3)-45℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为20h；

(4)25℃抽真空大气压小于100mTorr，作用时间为2h。

通过上述处理，经过上述处理获得冻干粉型荧光PCR反应体系。

上述荧光PCR反应体系的组成如下：

包括如SEQ ID NO：3(5’-CTACTACGACCACATCA-3’)和SEQ ID NO：4(5’-CCGTAAACACCGTAGTTG-3’)所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQ ID NO：5(5’-CTGATGTGCTCCTTGAGTTCGCCA-3’)所示序列的结核分枝杆菌扩增探针，其中所述探针的5’端连接有荧光基团FAM，所述探针的3’端连接有淬灭基团BHQ1；

冻干骨架，所述冻干骨架包括0.3％～2.5％甲基纤维素和/或羟甲基纤维素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮；

冻干保护剂，所述冻干保护剂包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖；

dNTPs，所述dNTPs包括0.1～0.5mM的dNTP和dUT；以及

酶混合液，所述酶混合液包括1.5～5U Taq DNA聚合酶、UNG酶和缓冲液。

实施例2-冻干粉结核分枝杆菌核酸检测试剂盒检测痰液中结核分枝杆菌的实例

1)样本选取

选取痰液中含100菌/mL、50菌/mL和20菌/mL各20人份。取2mL痰液样本等分两份：一份加入2倍体积的10％DTT充分混匀液化30min后采用捕获提取法进行核酸提取，另一份加入2倍体积4％NaOH充分混匀液化30min后超声裂解细胞。

2)捕获提取法步骤

a、取1mL DTT液化痰液加入到1.5mL无菌离心管中，加入0.5倍体积的裂解液和30mg蛋白酶K混匀后，56℃孵育30min，所述裂解液组成为50～200mM氯化钠、30～60mM三羟甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸钠、1～5mM乙二胺四乙酸、1～5mM氯化钙和1～10nM捕获引物，所述的捕获引物1序列为：5’-AAAAACTACTACGACCACATCA-3’和捕获引物2序列为5’-AAAAACCGTAAACACCGTAGTTG-3，捕获引物5’端采用生物素(biotin)标记；

b、95℃孵育5min以后，55℃孵育10min；

c、加入50mg 6μm链霉亲和素标记的超顺磁珠，充分混匀后孵育10min。孵育结束后，将离心管置于磁力架上，静置2min，尽量吸干、弃掉上清液；

d、加入洗涤液，用移液器反复吹打混匀后，将离心管放在磁力架上吸附2min，吸弃上清，重复洗涤1次，所述的洗涤液组成为10mM三羟甲基氨基甲烷和0.1～0.5mM乙二胺四乙酸，pH为8.0；

e、加入100μL洗脱液，充分振荡混匀后，将离心管放在磁力架上吸附2min，吸取上清备用，若不及时进行检测，需保存于-20℃条件下。

3)超声破碎提取法步骤

a、取1mL 4％NaOH液化后的痰液，12000rpm离心5min；

b、去上清加入1mL生理盐水洗涤1次，12000rpm离心5min；

c、去掉上清后加入100μL洗脱液，悬浮细菌；

d、300w超声15min后，8000rpm离心5min备用。

4)加样

每个提取的DNA所需的荧光PCR反应体系为1管50μL冻干的结核分枝杆菌荧光PCR反应体系和2管新配置的液体荧光PCR反应体系。其中液体荧光PCR体系1加入5μL提取的DNA，液体荧光PCR体系2加入20μL提取的DNA，冻干粉型荧光PCR反应体系加入50μL提取的DNA。

5)荧光PCR扩增条件

Cutoff值：FAM信号通路Ct值<42循环为阳性。

6)结果分析：

a、采用NaOH液化结合超声破碎提取的方法

液体荧光PCR体系1加入了5μL提取的DNA，其敏感性为100菌/mL，检出率为95％；对50菌/mL参考品检出率为35％；20菌/mL参考品检出率为5％。

液体荧光PCR体系2加入了20μL提取的DNA，其对50菌/mL检出率为74％，对20菌/mL参考品检出率为25％。

冻干粉型荧光PCR反应体系加入了50μL提取的DNA，对50菌/mL检出率为100％，对20菌/mL检出率为82％。

因此，通过加大提取DNA的上样量，可以显著提高结核分枝杆菌核酸的检出率，同时冻干粉型试剂的敏感性高于液体试剂。

b、捕获法提取DNA：

液体荧光PCR体系1加入了5μL提取的DNA，其对50菌/mL参考品检出率为95％，20菌/mL参考品检测率为32％。

液体荧光PCR体系2加入了20μL提取的DNA，其对50菌/mL参考品检出率为100％，20菌/mL参考品检测率为75％。

冻干粉型荧光PCR反应体系加入了50μL提取的DNA，对50菌/mL参考品检出率为100％，20菌/mL参考品检测率为100％。

所述液体荧光PCR体系1、液体荧光PCR体系2和冻干粉型荧光PCR反应体系具有相同的成分。

综合上述，1)采用捕获法提取的痰液结核分枝杆菌DNA具有更高的检出率和敏感性；2)通过增加提取的痰液结核分枝杆菌DNA的上样量可以有效提高检出率，同时冻干粉型试剂的敏感性高于液体试剂；3)捕获方法提取DNA结合冻干粉型试剂进行检测，可以实现低拷贝结核分枝杆菌的核酸检测。

实施例3-外周血结核分枝杆菌DNA检测

取20份临床外周血样本，10份为健康人外周血，10份为痰液涂片呈阳性患者的外周血。上述样本收集后2小时内离心获得血浆，并将其置于-80℃冷冻2小时。

1)结核分枝杆菌DNA提取

a、取1mL血浆充分混匀后分为两等份；

b、1份加入采用凯杰公司外周血游离DNA提取试剂盒提取，凯杰的提取方法参照试剂盒说明书，最后100μL洗脱液溶解备用；

c、1份采用捕获方法提取，捕获方法提取步骤：

i)0.5mL血浆加入0.5mL裂解液和20mg蛋白酶K，56℃消化30min，所述裂解液组成为50～200mM氯化钠、30～60mM三羟甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸钠、1～5mM乙二胺四乙酸、1～5mM氯化钙和1～10nM捕获引物，所述的捕获引物1序列为：5’-AAAAACTACTACGACCACATCA-3’和捕获引物2序列为5’-AAAAACCGTAAACACCGTAGTTG-3，捕获引物5’端采用生物素(biotin)标记；

ii)95℃孵育5min后，55℃孵育10min；

iii)加入20mg链霉亲和素标记的超顺磁珠，充分混匀后孵育10min。孵育结束后，将离心管置于磁力架上，静置2min，尽量吸干、弃掉上清液；

iv)加入洗涤液，用移液器反复吹打混匀后，将离心管放在磁力架上吸附2min，吸弃上清，重复洗涤1次，所述的洗涤液组成为10mM三羟甲基氨基甲烷和0.1～0.5mM乙二胺四乙酸，pH为8.0；

v)加入100μL洗脱液，充分振荡混匀后，将离心管放在磁力架上吸附2min，吸取上清备用，若不及时进行检测，需保存于-20℃条件下。

2)加样

3)荧光PCR扩增条件

Cutoff值：FAM信号通路Ct值<42循环为阳性。

3)结果分析：

a、采用凯杰外周血DNA提取试剂盒提取DNA

10例阳性血清中，液体试剂1仅仅能检测2例；液体试剂2能检测出4例；冻干型试剂10均可以检测出，且阴性血清均为阴性。

b、捕获法提取DNA

10例阳性血清中，液体试剂1仅仅能检测2例；液体试剂2能检测出5例；冻干型试剂10均可以检测出，且阴性血清均为阴性。

因此，在外周血结核分枝杆菌DNA检测中，捕获法和凯杰试剂盒提取结果基本一致，但是冻干粉型试剂敏感性明显高于液体试剂，同时加大提取的外周血结核分枝杆菌DNA的量可以增加阳性检出率。

由上述实施例可知，在本发明实施例提供的一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒及其方法，本发明所设计的引物和探针灵敏度高且特异性好，该技术操作简单、生物风险小、结果准确度高，优化的提取DNA的捕获法和冻干粉型试剂相结合，可以极大的提高结核分枝杆菌的检出率，检测出低拷贝分枝杆菌，具有非常广的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海默礼生物医药科技有限公司

<120> 一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 捕获引物1

<400> 1

aaaaactact acgaccacat ca 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 捕获引物2

<400> 2

aaaaaccgta aacaccgtag ttg 23

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 结核分枝杆菌扩增引物1

<400> 3

ctactacgac cacatca 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 结核分枝杆菌扩增引物2

<400> 4

ccgtaaacac cgtagttg 18

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 结核分枝杆菌扩增探针

<400> 5

ctgatgtgct ccttgagttc gcca 24

Claims

1.一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其特征在于，包括裂解液，所述裂解液含有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示序列的捕获引物。

2.一种包含如权利要求1所述的核酸提取试剂的用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光PCR反应体系，所述荧光PCR反应体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其包括如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQ ID NO：5所示序列的结核分枝杆菌扩增探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour；所述探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应体系还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干骨架包括0.3％～2.5％甲基纤维素和/或羟甲基纤维素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮；所述冻干保护剂包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖；所述dNTPs包括0.1～0.5mM的dNTP和dUT；所述酶混合液包括1.5～5U Taq DNA聚合酶、UNG酶和缓冲液。

7.一种用于非诊断和非治疗目的的采用权利要求2～6中任一项所述的试剂盒来检测低拷贝结核分枝杆菌的方法，其特征在于，包括如下所述的核酸提取步骤：采用核酸提取试剂对样本进行酶促消化、寡核苷酸杂交和捕获、结核DNA富集、洗涤和洗脱。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样本为痰液、灌洗液、外周血和脑脊液，当样本为痰液或灌洗液时，所述酶促消化之前先对样本进行液化。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液化方法选自4％氢氧化钠、5-10％二硫代苏糖醇、1.45％N-乙酰-L-半胱氨酸、2％氢氧化钠、Saccomanno法、二硫苏糖醇法、0.5％N-乙酸-L半胱氨酸、1.45％枸橼酸钠、2％氢氧化钠、0.25％胰蛋白酶、400u/mL的胰凝乳蛋白酶、高压液化法及其组合。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括如下所述的荧光PCR扩增程度：UNG酶反应55℃2min，1个循环；Taq酶活化95℃10min，1个循环；变性95℃15s，退火、延伸、荧光采集55℃45s，45个循环；仪器冷却37℃2min，1个循环。