CN101864483B - 一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒包括Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，甜菜碱，硫酸镁，显色液，稳定液和阳性对照，还包括以沙门氏菌AgfA基因，志贺氏菌的ipaH基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的沙门氏菌与志贺氏菌检测试剂盒检测效果更全面、特异性高、漏检率低，适用于食品从业人员体检中沙门氏菌，志贺氏菌的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
沙门氏菌，属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌病是公共卫生病学上具有重要意义的人畜共患病之一，是主要的肠道致病菌之一，易引起食物中毒，人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。沙门氏菌通常是通过摄取受到动物粪便污染的食物进入人的体内。而一般容易受污染的食品主要是动物性食品，如牛肉、禽肉、牛奶、鸡蛋及其制品等，食品也可能被已感染沙门氏菌的食品加工人员污染。受到沙门氏菌污染的食物在外形与味觉上与正常食物没什么两样，因此准确、快速地检测食品中的沙门氏菌具有十分重要的意义。
志贺氏菌属也是一类革兰氏阴性菌，形态与其它肠杆菌科的种类似，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。人类对痢疾杆菌有很高的易感性在幼儿可引起急性中毒性菌痢死亡率甚高。据国内综合资料志贺氏菌属在我国感染性腹泻病原菌中居首位志贺氏菌既可通过水也可通过食品传播腹泻及痢疾等疾病。据报道国际上每年都有由志贺氏菌引起的疾病的暴发与流行根据WHO年度报告亚(不包括中国)非拉各洲仅小于5岁的儿童每人每年发生腹泻2.2次细菌性腹泻的病例多达1.5到2.5亿人，我国广大农村地区由于卫生条件差，经常有由于水源或食品受到志贺氏菌污染而引起痢疾腹泻等疾病流行的报道。因此，快速检测与鉴定水或食品中志贺氏菌不仅为及时有效地预防治疗和控制水或食源性传染病提供依据，同时也是保障人民身体健康的必要手段。
传统沙门氏菌，志贺氏菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(realtime PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)具有很多的优越性。
因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的沙门氏菌的检测试剂盒及志贺氏菌的检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。
基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测沙门氏菌与志贺氏菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。
一般的食源性致病菌的检测都包括沙门氏菌，志贺氏菌等菌株的检测。而本发明可同时检测沙门氏菌、志贺氏菌，从而更节省检测时间与成本。更适用于食品从业人员体检中沙门氏菌，志贺氏菌的快速检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术中耗时长，漏检率高的不足提供检测效果更全面、特异性高、漏检率低的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒。
搜集GeneBank已公布沙门氏菌AgfA基因与志贺氏菌的ipaH基因序列。通过用GeneTool软件进行比对，并在GeneBank上BLAST证明与其它菌高度特异。
本发明所提供的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒包括下列组成：以沙门氏菌AgfA基因，志贺氏菌的ipaH基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，甜菜碱，硫酸镁，显色液，稳定液和阳性对照。
所述的沙门氏菌，志贺氏菌的两对内外引物分别为
沙门氏菌属
AgfA-9-F3：AGTTTCTGGCAGTGCTGTG(SEQ ID NO 1)
AgfA-9-B3：AGTACTGTTATCCGCACCCT(SEQ ID NO 2)
AgfA-9-FIP：ATCCGGGCCGGAACTATTGCTTTTCTGGCGTCGTTCCACAAT(SEQ ID NO 3)
AgfA-9-BIP：CGCTTGCTCTGCAAAGCGATGTTTTACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 4)
或
AgfA-56-F3：CCCGGATTCCACGTTGAG(SEQ ID NO 5)
AgfA-56-B3：TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA(SEQ ID NO 6)
AgfA-56-FIP：CCGCTCTGGGTAATGGTCGTTTTTTCTAACGCTGCGCTTGCTC(SEQ ID NO 7)
AgfA-56-BIP：ATGTAGGCCAGGGTGCGGATATTTTTGGTCGATGGTGGCATTG(SEQ ID NO 8)
或
AgfA-19-F3：AGTTTCTGGCAGTGCTGTG(SEQ ID NO 9)
AgfA-19-B3：AGTACTGTTATCCGCACCCT(SEQ ID NO 10)
AgfA-19-FIP：ATCCGGGCCGGAACTATTGC CTGGCGTCGTTCCACAAT(SEQ ID NO 11)
AgfA-19-BIP：CGCTTGCTCTGCAAAGCGATG ACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 12)
或
AgfA-156-F3：CCCGGATTCCACGTTGAG(SEQ ID NO 13)
AgfA-156-B3：TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA(SEQ ID NO 14)
AgfA-156-FIP：CCGCTCTGGGTAATGGTCGT TCTAACGCTGCGCTTGCTC(SEQ ID NO 15)
AgfA-156-BIP：ATGTAGGCCAGGGTGCGGATAT GGTCGATGGTGGCATTG(SEQID NO 16)
志贺氏菌属
ipaH-69-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA其中Y代表C或T(SEQ ID NO 17)
ipaH-69-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)
ipaH-69-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)
ipaH-69-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT(SEQ ID NO 20)
或
ipaH-169-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA其中Y代表C或T(SEQ ID NO 21)
ipaH-169-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 22)
i paH-169-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTG CCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 23)
ipaH-169-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAA GCAGCAACAGCGAAAGACT(SEQ ID NO 24)
所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度7-10U/μL，优选为酶浓度8U/μL。
所述的缓冲液含：0.18-0.25mol/L Tris-HCl，0.10-0.15mol/L KCl，0.07-0.15mol/L(NH4)2SO4，15-30mmol/L MgSO4，1-2％TritonX-100；优选为0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％TritonX-100。
所述的dNTPs：每种核苷酸浓度10-20mmol/L，优选每种核苷酸浓度10mmol/L。
所述的甜菜碱：浓度3-6mol/L，优选浓度5mol/L。
所述的硫酸镁：浓度100-200mmol/L，优选浓度150mmol/L
所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green；
所述稳定液为石蜡油；
所述的阳性对照为沙门氏菌，志贺氏菌基因组DNA。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；
(2)将样品增菌液提取样品模板DNA；
(3)在反应容器中加入本发明联合检测试剂盒中的Bst DNA聚合酶1.8～2.4体积份数、缓冲液10体积份数、dNTPs 15～20体积分数、甜菜碱15～20体积分数、硫酸镁15～20体积分数、稳定液25～35体积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积分数，恒温反应；
(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
步骤(3)中所述的恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的沙门氏菌AgfA基因与志贺氏菌的ipaH基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测沙门氏菌与志贺氏菌的准确率更高；
附图说明
图1实施例4采用本发明方法进行特异性试验结果；
图中：1为阳性对照；2为阴性对照；3为ATCC29004；4为V405；5为EC102；6为CMCC54002；7为ATCC13048；8为ATCC1307；9为ATCC13182；10为ATCC12022；11为CMCC51334；12为CMCC51263(2)；13为CMCC(B)50071；14为S334；15为S217；16为CMCC51376(2)；
图2实施例4沙门氏菌不同稀释浓度LAMP检测结果；
图中：1为阴性对照；2为阳性对照；3-12分别为109---100稀释度；
图3实施例4志贺氏菌不同稀释浓度LAMP检测结果；
图中：1为阳性对照；2为阴性对照；3-12分别为100---109稀释倍；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
沙门氏菌属
AgfA-9-F3：AGTTTCTGGCAGTGCTGTG(SEQ ID NO 1)
AgfA-9-B3：AGTACTGTTATCCGCACCCT(SEQ ID NO 2)
AgfA-9-FIP：ATCCGGGCCGGAACTATTGCTTTTCTGGCGTCGTTCCACAAT(SEQ ID NO 3)
AgfA-9-BIP：CGCTTGCTCTGCAAAGCGATGTTTTACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 4)
志贺氏菌属
ipaH-69-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA Y代表C或T(SEQ ID NO 17)
ipaH-69-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)
ipaH-69-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)
ipaH-69-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT(SEQ ID NO 20)
(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制缓冲液：缓冲液按0.18mol/L Tris-HCl，0.10mol/L KCl，0.07mol/L(NH4)2SO4，15mmol/L MgSO4，1体积％TritonX-100配制，置于容器；
(4)配制dNTPs：每种核苷酸浓度按10mmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜碱：甜菜碱浓度按3mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸镁溶液：硫酸镁浓度按100mmol/L配制，置于容器；
(7)购置稳定液：石蜡油，置于容器；
(8)购置显色液：SYBR Green I，置于容器；
(9)提取阳性对照：提取沙门氏菌与志贺氏菌基因组DNA，置于容器；
(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；
制备工艺简述如下：
1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将反应液[即上述(2)-(6)步骤配制的液体]无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。
实施例2
试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
沙门氏菌属
AgfA-56-F3：CCCGGATTCCACGTTGAG(SEQ ID NO 5)
AgfA-56-B3：TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA(SEQ ID NO 6)
AgfA-56-FIP：CCGCTCTGGGTAATGGTCGTTTTTTCTAACGCTGCGCTTGCTC(SEQ ID NO 7)
AgfA-56-BIP：ATGTAGGCCAGGGTGCGGATATTTTTGGTCGATGGTGGCATTG(SEQ ID NO 8)
志贺氏菌属
ipaH-69-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA Y代表C或T(SEQ ID NO 17)
ipaH-69-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)
ipaH-69-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)
ipaH-69-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT (SEQ ID NO 20)
(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制缓冲液：缓冲液按0.25mol/L Tris-HCl，0.15mol/L KCl，0.15mol/L(NH4)2SO4，30mmol/L MgSO4，2体积％TritonX-100配制，置于容器；
(4)配制dNTPs：每种核苷酸浓度按20mmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜碱：甜菜碱浓度按6mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸镁溶液：硫酸镁浓度按200mmol/L配制，置于容器；
(7)购置稳定液：石蜡油，置于容器；
(8)购置显色液：Eva Green，置于容器；
(9)提取阳性对照：提取沙门氏菌与志贺氏菌基因组DNA，置于容器；
(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；
其他同实施例1。
实施例3
试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
沙门氏菌属
AgfA-19-F3：AGTTTCTGGCAGTGCTGTG(SEQ ID NO 9)
AgfA-19-B3：AGTACTGTTATCCGCACCCT(SEQ ID NO 10)
AgfA-19-FIP：ATCCGGGCCGGAACTATTGC CTGGCGTCGTTCCACAAT(SEQ ID NO 11)
AgfA-19-BIP：CGCTTGCTCTGCAAAGCGATG ACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 12)
志贺氏菌属
ipaH-69-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA Y代表C或T(SEQ ID NO 17)
ipaH-69-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)
ipaH-69-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)
ipaH-69-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT(SEQ ID NO 20)
(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制缓冲液：缓冲液按0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1体积％TritonX-100配制，置于容器；
(4)配制dNTPs：每种核苷酸浓度按10mmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜碱：甜菜碱浓度按5mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸镁溶液：硫酸镁浓度按150mmol/L配制，置于容器；
(7)购置稳定液：石蜡油，置于容器；
(8)购置显色液：Eva Green，置于容器；
(9)提取阳性对照：提取沙门氏菌，志贺氏菌基因组DNA，置于容器；
(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；
其他条件与实施例1相同。
实施例4
沙门氏菌与志贺氏菌检测试剂盒的应用
本方法的主要技术要点是：
1)样品的制备和选择性增菌：依据GB/T 4789.4-2003《食品微生物学检验沙门氏菌检验》与GB/T 4789.5-2003《食品微生物学检测志贺氏菌检验》的方法进行样品制备和选择性增菌。
2)提取增菌液模板DNA进行环介导等温扩增后进行快速筛选，沙门氏菌与志贺氏菌LAMP扩增反应体系见表1。
3)阴性结果可以直接出报告，阳性结果采用传统方法分离鉴定后确认。
表1沙门氏菌与志贺氏菌LAMP扩增反应体系
1、室内验证
1.1特异性
小批量特异性试验采用菌株见表2。采用的LAMP方法为：
1)、提取细菌DNA模板：直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量吸弃上清；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；10000r/min离心2min，上清即为核酸模板。
2)、按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。
反应管中加入22μL的反应液+0.5μL的DNA聚合酶+30μL的稳定液+2.5μL待检模板；65℃环介导等温反应60min；往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为沙门氏菌，志贺氏菌阳性，呈橙色则为阴性。
反应液的主要成分dNTP，Tris-HCl[pH 8.8]，MgSO4，Triton X-100，Betaine，内/外引物。
表2小批量特异性试验采用菌株
其中ATCC为American Type Culture Collection的标准菌，CMCC为中国医学细菌保藏管理中心的标准菌。
采用本发明方法对上述菌株的检测结果见表3，如图1。
表3采用本发明方法进行特异性试验结果
编号 检测结果
阳性对照 阳性
阴性对照 阴性
ATCC 29004 阴性
V405 阴性
EC102 阴性
CMCC 54002 阴性
ATCC 13048 阴性
ATCC 1307 阴性
ATCC13182 阳性
ATCC12022 阳性
CMCC51334 阳性
CMCC51263(2) 阳性
CMCC(B)50071 阳性
S334 阳性
S217 阳性
CMCC51376(2) 阳性
1.2灵敏度/检测低限
1)、分别接种沙门氏菌，志贺氏菌各5株于5支装有增菌液培养基的小试管中，生长至约1×108CFU/mL(测定OD600值约0.4)。
2)、分别取一定量的菌液，加入生理盐水以10倍稀释，分别标记为109，108，107，106，105，104，103，102，101，100。
3)、分别取各梯度的沙门氏菌，志贺氏菌液各1mL，同时取等体积生理盐水为空白对照，依据本发明方法进行检测，确定本发明方法的检出限。
沙门氏菌实验结果见表5，如图2；志贺氏菌实验结果见表6，如图3。
表五本发明方法检测沙门氏菌灵敏度结果
稀释度编号 检测结果
阴性对照 阳性
阳性对照 阳性
109 阳性
108 阳性
107 阳性
106 阳性
105 阳性
104 阳性
103 阳性
102 阳性
101 阳性
100 阳性
表六本发明方法检测志贺氏菌灵敏度结果
稀释度编号 检测结果
阴性对照 阳性
阳性对照 阳性
109 阳性
108 阳性
107 阳性
106 阳性
105 阳性
104 阳性
103 阳性
102 阳性
101 阳性
100 阳性
序列表
<110>广州华峰生物科技有限公司，上海市出入境检验检疫局
<120>沙门氏菌与志贺氏菌检测试剂盒及其使用方法
<160>24
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
agtttctggc agtgctgtg 19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atccgggccg gaactattgc ttttctggcg tcgttccaca at 42
<210>4
<211>43
<212>DNA
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<400>4
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<210>5
<211>18
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<212>DNA
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
agtttctggc agtgctgtg 19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
agtactgtta tccgcaccct 20
<210>11
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
atccgggccg gaactattgc ctggcgtcgt tccacaat 38
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cgcttgctct gcaaagcgat gaccataacc gctctgggt 39
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
cccggattcc acgttgag 18
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tcggagtttt tagcgttcca 20
<210>15
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ccgctctggg taatggtcgt tctaacgctg cgcttgctc 39
<210>16
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
atgtaggcca gggtgcggat atggtcgatg gtggcattg 39
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>y＝c或t
<400>17
acatgaagag caygccaaca 20
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tcctcacagc tctcagtgg 19
<210>19
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
cggaatccgg aggtattgcg tgttttcctt ttccgcgttc cttga 45
<210>20
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ggtcgctgca tggctggaaa ttttgcagca acagcgaaag act 43
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>y＝c或t
<400>21
acatgaagag caygccaaca 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
tcctcacagc tctcagtgg 19
<210>23
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
cggaatccgg aggtattgcg tgccttttcc gcgttccttg a 41
<210>24
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ggtcgctgca tggctggaaa gcagcaacag cgaaagact 39
Claims (7)
1.一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，包括Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，甜菜碱，硫酸镁，显色液，稳定液和阳性对照，其特征在于：还包括以沙门氏菌AgfA基因，志贺氏菌的ipaH基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3；其中，沙门氏菌，志贺氏菌的两对内外引物序列分别为：
沙门氏菌属
AgfA-9-F3：AGTTTCTGGCAGTGCTGTG SEQ ID NO 1
AgfA-9-B3：AGTACTGTTATCCGCACCCT SEQ ID NO 2
AgfA-9-FIP：ATCCGGGCCGGAACTATTGCTTTTCTGGCGTCGTTCCACAAT SEQ ID NO 3
AgfA-9-BIP：CGCTTGCTCTGCAAAGCGATGTTTTACCATAACCGCTCTGGGT SEQ ID NO 4
或
AgfA-56-F3：CCCGGATTCCACGTTGAG SEQ ID NO 5
AgfA-56-B3：TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA SEQ ID NO 6
AgfA-56-FIP：CCGCTCTGGGTAATGGTCGTTTTTTCTAACGCTGCGCTTGCTC SEQ ID NO 7
AgfA-56-BIP：ATGTAGGCCAGGGTGCGGATATTTTTGGTCGATGGTGGCATTG SEQ ID NO 8
或
AgfA-19-F3：AGTTTCTGGCAGTGCTGTG SEQ ID NO 9
AgfA-19-B3：AGTACTGTTATCCGCACCCT SEQ ID NO 10
AgfA-19-FIP：ATCCGGGCCGGAACTATTGC CTGGCGTCGTTCCACAAT SEQ ID NO 11
AgfA-19-BIP：CGCTTGCTCTGCAAAGCGATG ACCATAACCGCTCTGGGT SEQ ID NO 12
或
AgfA-156-F3：CCCGGATTCCACGTTGAG SEQ ID NO 13
AgfA-156-B3：TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA SEQ ID NO 14
AgfA-156-FIP：CCGCTCTGGGTAATGGTCGT TCTAACGCTGCGCTTGCTC SEQ ID NO 15
AgfA-156-BIP：ATGTAGGCCAGGGTGCGGATAT GGTCGATGGTGGCATTG SEQ ID NO 16
志贺氏菌属
ipaH-69-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA其中Y代表C或T SEQ ID NO 17
ipaH-69-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG SEQ ID NO 18
ipaH-69-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA SEQ ID NO 19
ipaH-69-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT SEQ ID NO 20
或
ipaH-169-F3：ACATGAAGAGCAYGCCAACA其中Y代表C或T SEQ ID NO 21
ipaH-169-B3：TCCTCACAGCTCTCAGTGG SEQ ID NO 22
ipaH-169-FIP：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTG CCTTTTCCGCGTTCCTTGA SEQ ID NO 23
ipaH-169-BIP：GGTCGCTGCATGGCTGGAAA GCAGCAACAGCGAAAGACT SEQ ID NO 24。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶浓度7-10U/μL。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶酶浓度8U/μL。
4.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液组成为：0.18-0.25mol/L Tris-HCl，0.10-0.15mol/L KCl，0.07-0.15mol/L(NH4)2SO4，15-30mmol/L MgSO4，1-2％TritonX-100。
5.根据权利要求4所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液组成为：0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％TritonX-100。
6.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于：所述的dNTPs每种核苷酸浓度10-20mmol/L，甜菜碱浓度3-6mol/L，硫酸镁浓度100-200mmol/L，显色液为SYBR Green I或Eva Green，稳定液为石蜡油，阳性对照为沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA。
7.根据权利要求6所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于：所述的dNTPs每种核苷酸浓度10mmol/L，甜菜碱浓度5mol/L，硫酸镁浓度150mmol/L。
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