CN102586439B - 一种同时快速检测多种核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物样品的检测与鉴别，提供了一种同时快速检测多种核酸的方法。一种同时快速检测多种核酸的方法，包括步骤：A.利用与多种靶标核酸分别对应的引物，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物中的至少一条带有标记物，各靶标核酸对应的引物所带的标记物不同；B.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。本发明通过LAMP技术在同一反应体系中同时快速检测多种靶标核酸，利用靶标核酸与引物及引物上所带标记物一一对应的关系，检测扩增产物并进行判断，实现准确区分待测样品中含有哪几种靶标核酸的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物样品的检测与鉴别，更具体地说，涉及一种同时快速检测多种核酸的方法。
背景技术
随着现代分子生物学的迅速发展，新的核酸扩增技术不断出现。2000年Notomi等建立了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，即环介导等温扩增技术(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计一对内引物、一对外引物共4种特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在等温条件下进行反应，在1h内就能扩增出109个靶序列拷贝。LAMP反应的原理以及所使用到内、外引物如图1所示。4条引物中2条为内引物，2条为外引物。其中，内引物FIP(forward inner primer)包含F1c序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5'-F1c—F2；内引物BIP(backwardiner primer)包含B1c(B1区域的互补序列)和B2序列，即5'-Blc—B2。外引物为F3和B3序列。LAMP技术特异性强、灵敏度高、过程快速、操作及结果判定简单，广泛应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发。
LAMP技术的结果判定方法常用的有三种：（1）琼脂糖电泳检测，若扩增条带呈明显梯状分布说明扩增成功；（2）焦磷酸镁作为LAMP的副产物是一种肉眼可见的白色沉淀，可以直接通过肉眼判断确定有没有扩增产物；（3）反应后在体系中加入SYBR GREENⅠ1-2μL,如果体系中颜色呈橙色，说明扩增失败；如果颜色呈绿色，说明存在扩增产物。当样品中只含有一种待测核酸时，LAMP技术简单快速易用；但是，利用现有LAMP技术对样品中可能存在的几种核酸进行检测时，上述判定方法只能区分样品中是否含有待测的核酸，却无法区分含有几种，或具体哪几种，检测结果不够准确。
因此，迫切需要一种新的同时快速检测多种核酸的方法，该方法能够同时快速检测多种核酸，并且能根据检测结果区分待测样品中具有哪几种核酸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时快速检测多种核酸的方法，旨在解决现有技术中同时检测多种核酸时，不能准确区分待测样品中含有哪几种核酸的问题。
为了实现本发明的目的，本发明是这样实现的，一种同时快速检测多种核酸的方法，包括以下步骤：
A.利用与多种靶标核酸分别对应的引物组，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物组中的至少一条引物带有标记物，各靶标核酸对应的引物组所带的标记物不同；
B.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。
其中，所述步骤B之前还包括步骤：
B’.对LAMP扩增反应之后的产物进行纯化，得到带标记的扩增产物。
其中，所述步骤A之前还包括步骤：
A’.对待测样品进行处理，得到待测靶标核酸处理液。
进一步的，所述步骤A’中的对待测样品进行处理的方法采用冻融处理、通透处理和核酸提取中的至少一种。
其中，上述步骤A’中对样品进行处理，其目的是使待测多种核酸的序列能够暴露于后续的扩增体系中，能够让带有不同标记的引物结合其上顺利进行LAMP扩增。
其中，所述步骤A中的标记物，与引物结合的连接形式为R1-R-R2，其中R1为引物上携带的末端基团，R2为标记物上所携带的末端基团，R则为R1与R2之间形成的化学键或中间偶联剂。
其中，上述步骤A中的标记物，包括但不限于：放射性物质、抗原、半抗原、抗体、酶、生物素、寡核苷酸标签或荧光标记物。
其中，所述标记物为寡核苷酸标签，该寡核苷酸标签优选位于内引物中。所述内引物如图1中所示，以FIP为例，该内引物包含F1c序列和F2-(F2c区域的互补序列)两部分，即5'-F1c-F2，其互补靶标序列相对外引物F3的位于靶标序列内部，因此称为内引物。当寡核苷酸标签位于内引物时，只能位于内引物中F1c与F2两部分连接的中间位置。
进一步的，若上述标记物为寡核苷酸标签，则步骤B中所述检测方法采用荧光探针杂交法、基因测序法中的至少一种；
若上述标记物为荧光标记物，则步骤B中所述检测方法采用光谱分离法。上述光谱分离法是指利用不同荧光标记物的激发光谱与发射光谱不同的特点，采用多色分光仪进行光谱分离从而准确区分扩增物的方法。
其中，上述待测样品包括但不限于食源性致病菌、病毒或临床检测样品。
其中，上述步骤A中扩增反应体系中包含有尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil-DNA Glycocasylase，UDG）。
由上可知，本发明所述同时快速检测多种核酸的方法，通过LAMP技术在同一反应体系中同时快速检测多种靶标核酸，根据待测的多种靶标核酸设计相对应带标记物的引物，扩增完成之后，通过检测扩增产物上携带的标记物进行判断，实现准确区分待测样品中含有哪几种靶标核酸的目的；同时在扩增反应体系中加入UDG酶，防止假阳性现象的出现，确保检测结果的正确性。
附图说明
图1是LAMP反应原理示意图；
图2是本发明一种同时快速检测多种核酸的方法流程图；
图3是本发明一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法流程图；
图4是本发明另一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法流程图；
图5是本发明一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
图2示出了本发明一种同时快速检测多种核酸的方法，包括以下步骤：
S1.利用与多种靶标核酸分别对应的引物组，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物组中的至少一条引物带有标记物，各靶标核酸对应的引物组所带的标记物不同；
S2.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。
本发明所述同时快速检测多种核酸的方法的优点在于：利用LAMP扩增技术在同一反应体系中同时快速检测多种靶标核酸，根据待测的多种靶标核酸设计相对应带不同标记物的引物，扩增结束后，通过对扩增产物上所携带的标记物进行检测，进而判断有哪些带标记的引物得到了扩增，从而根据引物与靶标核酸之间的一一对应关系准确区分待测样品中含有哪几种靶标核酸。
需要说明的是：
步骤S1中，所述多种靶标核酸是指待测样品中所包含的多种待测核酸，包括直接得到的或者是经过处理间接得到的，其种类包括但不限于基因组DNA、RNA或cDNA。所述待测样品包括但不限于食源性致病菌、病毒或临床检测样品。
在本步骤之前还可以包括对待测样品进行处理的步骤，所述对样品进行处理的目的在于使待测样品中的多种靶标核酸序列能够暴露于后续的扩增体系中，能够让带标记物的引物结合其上并顺利进行LAMP扩增。对于处理方法，只要能满足上述目的即可，结合后续图示将给出不同的优选处理方法。
步骤S1中所述的引物组对应于不同靶标核酸，两者之间一一对应；且对应每一种靶标核酸的引物组中的至少一条引物带有标记物，引物组与标记物之间也一一对应，即不同靶标核酸的引物组所带的标记物不同。
所述标记物，可以使用已知的标记物和方法与引物结合，其结合的方式以及结合的位置可以多变，原则上只要不抑制引物与模板链结合以及后续的延伸反应。标记物可以为多种物质，包括但不限于放射性物质、抗原、半抗原、抗体、酶、生物素、寡核苷酸标签或荧光标记物。
标记物与引物之间一一对应，两者结合后的连接形式为R1-R-R2，其中R1为引物上携带的末端基团，R2为标记物上所携带的末端基团，R则为R1与R2之间形成的化学键或中间偶联剂。上述末端基团是指暴露于引物或标记物外表，能用于连接的基团。
其中，R1为抗体携带的羧基或氨基；R2为寡核苷酸标签上携带的修饰基团如氨基、羧基或生物素等；R为酰胺键或中间偶联剂如均苯三甲酸（TMA）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、二异丙基乙胺（DIEA）等。
若R为R1和R2形成的化学键：在一个实施例中，R1选用抗体上所携带的氨基，而寡核苷酸标签经过羧基化修饰，从而R2为寡核苷酸标签上的羧基，R则为二者形成的酰胺键。在另一个实施例中，抗体经过链霉亲和素修饰，R1为抗体上所带的链霉亲和基团，而寡核苷酸标签经过生物素修饰，R2为生物素基团，R为链霉亲和生物素融合体。
若R为中间偶联剂：中间偶联剂可以包括均苯三甲酸（TMA）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）溶液、二异丙基乙胺（DIEA）的至少一种。在一个实施例中，R选用NHS，通过NHS将抗体与寡核苷酸标签偶联在一起。
对于标记物与引物结合位置的选择，同样遵循不抑制引物与模板链结合以及后续的延伸反应作为原则。因此，当标记物标记外引物时，优选位于外引物的5’端。若标记物标记内引物，则视所用的标记物而定：在本发明的一个实施例中，所用的标记物为寡核苷酸标签，且标记在内引物上，所述内引物如图1中所示，以FIP为例，该内引物包含F1c序列和F2(F2c区域的互补序列)两部分，即5'-F1c—F2，其互补靶标序列相对外引物F3的位于靶标序列内部，因此称为内引物。当标记物为寡核苷酸标签且位于内引物时，只能位于内引物中F1c与F2两部分连接的中间位置；在本发明的另一个实施例中，采用除寡核苷酸标签之外的标记物如荧光标记物标记内引物，所述荧光标记物优选位于内引物的5’端，当然，位于内引物序列的其他位置也是可行的。
在LAMP扩增反应中，可采用任意能够进行链置换反应的DNA聚合酶。所述DNA聚合酶可以是完整的酶或其生物学活性片段。所述酶包括但不限于Bst DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent（不带外切酶活性）DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent（不带外切酶活性）DNA聚合酶、Klenow聚合酶、Phi29聚合酶、90Nm DNA聚合酶。
当待测靶标核酸为RNA，可以在进行LAMP扩增之前利用逆转录反应先将RNA逆转录成cDNA，也可以直接在LAMP扩增反应体系中加入适宜的逆转录酶，进行逆转录环介导等温扩增反应（Reverse Transcription Loop—mediatedIsothermal Amplification，RT-LAMP）。所述逆转录酶包括但不限于禽类成髓细胞性白血病病毒（AWV）逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶、MonsterScript逆转录酶、Accuscript逆转录酶、AffinityScript逆转录酶、ImProm-Ⅱ逆转录酶、Thermoscript逆转录酶，以及上述逆转录酶的任何遗传改变形式或变体。
步骤S1中，所述LAMP扩增反应体系中，除加入必需的扩增试剂外，还可以加入UDG酶，以便消除假阳性扩增结果。
在步骤S2开始之前，为了保证后续对扩增产物进行检测的结果的准确性，可以对扩增产物进行纯化，纯化的方式利用现有技术中已知的常用方法即可，如蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离、凝胶电泳纯化等，也可直接利用商品化的PCR清洁试剂盒实现纯化，将未反应的引物、dNTP等与扩增产物进行分离。
步骤S2中，所述检测的方法根据之前所使用的标记物，采用与之对应的特异性方法对扩增产物上所带的标记物进行检测，然后根据检测得到的结果可以判断待测样品中所含有的靶标核酸有哪几种。
以下将结合后续的图示及具体实施例对上述本发明的优点以及具体实施方式进行详细阐述。
图3示出了本发明一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法流程，该方法包括：
S101.从待测样品中提取核酸，得到待测核酸处理液；
S102.利用与多种靶标核酸分别对应的引物组，在同一反应体系中，对待测核酸处理液同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；每一种引物组中的至少一条引物带有寡核苷酸标签，各靶标核酸对应的引物组所带的寡核苷酸标签不同；
S103.检测扩增产物上的寡核苷酸标签得到检测结果，根据检测结果判断待测样品中含有的靶标核酸种类。
本方法的优点在于：能够多种靶标核酸在同一反应体系中同时进行LAMP扩增，然后利用与引物一一对应的寡核苷酸标签，检测扩增产物上带有的寡核苷酸标签，根据检测结果得到与引物一一对应的靶标核酸的种类。
需要说明的是：
步骤S101中，样品的处理方法采用直接从待测样品中提取DNA或RNA的方式，得到待测核酸处理液。而提取DNA或RNA的方法可以采用常规的任意方法进行。
步骤S102中，引物组的设计与多种靶标核酸之间一一对应，每一种引物组对应一种靶标核酸，而寡核苷酸标签与引物组之间一一对应，从而使得靶标核酸与寡核苷酸标签之间也一一对应。
根据LAMP扩增的特性，本步骤中使用寡核苷酸标签作为标记物，若寡核苷酸标签标记内引物，所述寡核苷酸标签只能位于内引物的F1c和F2两部分核苷酸连接的中间，且至少有一条内引物被标记。
此外，在LAMP扩增反应中加入UDG酶，可以消除假阳性扩增结果。
LAMP扩增结束之后，为保证后续检测结果的准确性，需要对扩增产物进行纯化，纯化的方式利用现有技术中已知的常用方法，如蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离、凝胶电泳纯化等，也可直接利用商品化的PCR清洁试剂盒实现纯化，将未反应的引物、dNTP等与扩增产物进行分离。
步骤S103中，根据LAMP扩增结束后，扩增产物携带有寡核苷酸标签，通过荧光探针杂交法或基因测序法对扩增产物进行检测得到检测结果，根据检测结果进行判断，从而可以得到其中所含的靶标核酸种类。
其中，所述荧光探针杂交法，是指利用与寡核苷酸标签互补且带有不同荧光标记的荧光探针与寡核苷酸标签杂交，通过检测荧光探针所发出的荧光判断出扩增产物的种类，进而得知靶标核酸种类的方法。所述荧光探针与寡核苷酸标签之间也一一对应，以保证杂交结果的正确性与唯一性。
所述基因测序法，是利用碱基互补原则对寡核苷酸标签进行碱基序列测定，例如合成测序法或连接测序法，然后根据得到的碱基序列确定寡核苷酸标签，进而判断出所测靶标核酸的种类。所述基因测序的方法，包括但不限于sanger测序法、合成测序法或连接测序法。所述合成测序法，是利用与寡核苷酸标签互补的测序引物，通过DNA聚合酶以及带可去除标记的四种核苷酸混合物进行单碱基延伸合成反应，收集加入核苷酸的标记信号，即可得到相应碱基的序列信号，从而达到通过合成测序法采集所述寡核苷酸标签序列信号的目的。所述连接测序法，则是利用含数个碱基对的带荧光标记的核酸探针以及连接酶的作用，采集连接到寡核苷酸标签上的探针的荧光信号，再切除荧光探针，反复测定得到寡核苷酸标签序列信号。
对于图3所示的本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。
在步骤S101的一个实施例中，步骤S101具体实施如下：
以志贺氏菌及沙门氏菌为检测对象，首先对样品进行常规液体培养（37℃，12h）至浑浊，取菌液1mL，12000rpm离心5min，然后以1×TE（10mMTris-HCl1mM EDTA pH=8.0）缓冲液洗涤重悬，再次12000rpm离心5min，沉淀加入200μL ddH2O重悬混匀，沸水浴12min，然后冰浴5min，12000rpm离心5min，取上清即为含有待测核酸的处理液。
应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S101中的一个实施例，并不用以限制本发明的保护范围。
在步骤S102的一个实施例中，步骤S102具体实施如下：
以沙门氏菌高度保守的invA基因和志贺氏菌高度保守的ipaH基因作为靶基因，设计两组用于扩增这两个基因部分序列的特异性引物，每组2对。采用寡核苷酸标签作为标记物，在合成引物时，直接通过在每组引物中的一条内引物的中间位置分别连上寡核苷酸标签Ⅰ、Ⅱ的方式进行标记。最后使用的两组引物分别如下所示：
（1）沙门氏菌invA基因特异性扩增引物组：
invA-F3（SEQ ID NO:1）：5’-GCGGCCCGATTTTCTCTG-3’；
invA-B3（SEQ ID NO:2）：5’-CCACCGAAATACCGCCAAT-3’；
invA-FIP（SEQ ID NO:3）：
5’-GCGCGGCATCCGCATCAATAAGCTCGGACTCTAGCATGGTATGCCCGGTAAACAG-3’；
invA-BIP（SEQ ID NO:4）：
5’-AGGGAAAGCCAGCTTTACGGTT-ATGATGCCGGCAATAGCG-3’。
其中，引物invA-FIP的中间位置带有寡核苷酸标签Ⅰ（SEQ ID NO:13）。
（2）志贺氏菌ipaH基因特异性扩增引物组
ipaH-F3（SEQ ID NO:5）：5’-GCATGCCAACACCTTTTCC-3’；
ipaH-B3（SEQ ID NO:6）：5’-TGATGGACCAGGAGGGTT-3’；
ipaH-FIP（SEQ ID NO:7）：
5’-CGACCTGTTCACGGAATCCGGGCTACGCTGTCAGCACTTGACCGCCTTTCCGATAC-3’；
ipaH-BIP（SEQ ID NO:8）：
5’-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3’。
其中，引物ipaH-FIP的中间位置带有寡核苷酸标签Ⅱ（SEQ ID NO:14）。
本实施例所用LAMP扩增反应体系如下：
10×Bst buffer（200mM Tris-HCl（pH8.8），100mM KCl，100mM（NH4）2SO4，20mM MgSO4，0.1%Triton X-100），2.5μL；
混合引物（FIP：BIP：F3：B3=40μM：40μM：5μM：5μM），1μL；
dNTP（各10mM），3.5μL；
4M甜菜碱，2μL；
UDG酶，1U；
待测核酸处理液，6μL；
Bst DNA聚合酶，8U；
ddH2O加至25μL。
反应过程为：首先将除Bst DNA聚合酶外的试剂混匀，95℃加热5min，冷却后加入8U Bst DNA聚合酶；63℃反应1h，然后80℃加热10min，完成LAMP扩增，然后以柱层析的方法分离未反应的混合引物，缓冲液重悬得到分离纯化的扩增产物。
应当说明的是，本实施例仅是本发明步骤S102中的一个具体实施例，并不用以限制本发明的保护范围，例如在两条内引物上同时进行寡核苷酸标签的标记，同样可以实现。
在步骤S103的一个实施例中，步骤S103具体实施如下：
首先根据扩增结果中是否出现白色沉淀判断是否得到目的扩增产物，若无白色沉淀，则说明没有检测到待测靶标核酸，不需再进行后续操作；若有白色沉淀出现，说明至少有一种待测靶标核酸被检测到，需要进行进一步的检测判断到底是哪几种待测靶标核酸。
在本步骤的一个实施方案中，根据之前引物合成时连在5’端的寡核苷酸标签，合成：带有CY3标记的荧光探针Ⅰ（SEQ ID NO:15），对应于寡核苷酸标签Ⅰ；以及带有TR标记的荧光探针Ⅱ（SEQ ID NO:16），对应于寡核苷酸标签Ⅱ；同时合成荧光探针的时候，对其非荧光标记的一端进行生物素化标记。将合成的荧光探针加入纯化之后的扩增产物中进行杂交，然后杂交产物利用柱层析分离的方法，去掉未反应的荧光探针，截留物以缓冲液洗脱重悬，然后汞灯条件下检测显色，若只检测到绿光，则说明检测到与CY3杂交结合的寡核苷酸标签Ⅰ，进而说明只含有沙门氏菌invA基因的扩增产物，待测样品中只含有沙门氏菌；若只检测到黄光，则说明只检测到与TR杂交结合的寡核苷酸标签Ⅱ，进而说明只含有志贺氏菌ipaH基因的扩增产物，待测样品中只含有志贺氏菌；若绿光与黄光都能检测到，则说明待测样品中沙门氏菌和志贺氏菌都存在。
在本步骤的另一个实施方案中，利用基因测序法对寡核苷酸标签进行碱基序列的测定，通过得到的碱基序列直接判断寡核苷酸标签，进而判断对应的是哪一种或哪几种靶标核酸。
利用基因测序法对LAMP扩增产物进行检测，可以将纯化后的扩增产物随即酶切成小片段，然后在片段两端接上接头元件，利用接头元件进行测序引物的结合，加入四种碱基进行合成测序，得到各片段的碱基序列，通过生物信息技术对其进行处理，可以得到扩增产物的碱基序列，从而可以得知扩增产物所携带的寡核苷酸标签的序列信息，进而根据寡核苷酸标签去确定待测样品中靶标核酸的种类。
应当说明的是，上述实施方案仅是步骤S103中的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。
图4示出了本发明另一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法流程，该方法包括：
S201.对待测样品进行通透处理，得到待测核酸处理液；
S202.利用与多种靶标核酸分别对应的引物组，在同一反应体系中，对待测核酸处理液同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；每一种引物组中的至少一条引物带有荧光标记物，各靶标核酸对应的引物组所带的荧光标记物不同；
S203.检测扩增产物上的荧光标记物得到检测结果，根据检测结果判断待测样品中含有的靶标核酸种类。
本方法的优点在于：对样品进行通透处理，不再从中提取靶标核酸，在一定程度上简化操作；利用与靶标核酸一一对应的引物组上所带的荧光标记物，其标记位置更加灵活多变；同时检测扩增产物上所携带的荧光标记物，根据检测得到的结果判断LAMP扩增产物，进而得到具体靶标核酸的种类。
需要说明的是：
步骤S201中，所述对样品进行处理，是指不必提取样品中的核酸，而是利用物理或化学的方法对细胞样品进行处理增加其细胞膜的通透性使得细胞内的核酸能够穿过细胞膜到达体外与引物发生扩增反应，或通过冻融裂解细胞使样品中的核酸暴露出来。本发明可以采用常用的方法对样品进行通透处理，包括但不限于：化学法如有机溶剂法、抗生素法；物理法如空气干燥、渗透压冲击、温度冲击、超声波处理以及pH扰动。
步骤S202中，荧光标记物与引物组一一对应，而引物组与多种靶标核酸之间一一对应，每一种引物组对应一种靶标核酸，从而使得荧光标记物与靶标核酸也一一对应。
本步骤中，标记物采用荧光标记物，其标记位置灵活多变。在本步骤的一个实施例中，利用荧光标记物标记外引物，其位置优选位于外引物的5’端，同时还可以位于外引物其他位置。在本步骤的另一个实施例中，利用荧光标记物标记内引物，其位置优选于内引物中间位置，同时也可以位于内引物其他位置。
在步骤S203开始之前，为了消除未反应的引物所带的荧光标记对后续检测造成干扰，需要对扩增反应之后的产物进行纯化，纯化的方式利用现有技术中已知的常用方法即可，如蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离等，可直接利用商品化的PCR清洁试剂盒实现纯化，将未反应的引物与扩增产物进行分离。
步骤S203中，根据对引物进行荧光标记的是荧光标记物，所述检测方法采用光谱分离法。所述光谱分离法，是利用所使用的荧光标记物不同，其激发/发射光谱不同，通过多色分光仪分离它们的光谱检测荧光信号，或直接利用荧光显微镜发出不同波长的激发光，激发荧光标记物发出不同波长的波谱，检测收集不同的荧光信号，然后根据检测得到的荧光信号判断扩增产物的种类，进而判断对应的靶标核酸的种类。
对于图4所示的本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。
在步骤S201的一个实施例中，步骤S201具体实施如下：
将待测样品放入-80℃冰箱冷冻，取出自然融化，反复冻融数次，然后进行离心分离，取上清液得到待测核酸处理液。
应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S201中的一个实施例，并不用以限制本发明的保护范围。
在步骤S202的一个实施例中，步骤S202具体实施如下：
以高度保守的沙门氏菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因和金黄色葡萄球菌的clfA基因作为靶标基因，设计三组用于扩增上述三个基因序列的特异性引物，每组2对。同时在合成引物时，通过中间偶联剂亚磷酰胺试剂将荧光标记物-CY3、-FITC和-Texas Red（-TR）分别标记到每组引物中的一条内引物的5’端，所述引物分别如下所示：
（1）沙门氏菌invA基因特异性扩增引物组：
invA-F3（SEQ ID NO:1）：5’-GCGGCCCGATTTTCTCTG-3’；
invA-B3（SEQ ID NO:2）：5’-CCACCGAAATACCGCCAAT-3’；
invA-FIP（SEQ ID NO:17）：
5’-CY3GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG-3’；
invA-BIP（SEQ ID NO:4）：
5’-AGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTATGATGCCGGCAATAGCG-3’。
（2）志贺氏菌ipaH基因特异性扩增引物组：
ipaH-F3（SEQ ID NO:5）：5’-GCATGCCAACACCTTTTCC-3’；
ipaH-B3（SEQ ID NO:6）：5’-TGATGGACCAGGAGGGTT-3’；
ipaH-FIP（SEQ ID NO:18）：
5’-FITC-CGACCTGTTCACGGAATCCGGCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3’；
ipaH-BIP（SEQ ID NO:8）：
5’-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3’。
（3）金黄色葡萄球菌clfA基因异性扩增引物组：
clfA-F3（SEQ ID NO:9）：5’-GCATGCCAACACCTTTTCC-3’；
clfA-B3（SEQ ID NO:10）：5’-TGATGGACCAGGAGGGTT-3’；
clfA-FIP（SEQ ID NO:19）：
5’-TR-CGACCTGTTCACGGAATCCGGCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3’；
clfA-BIP（SEQ ID NO:12）：
5’-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3’。
本实施中所用LAMP扩增反应体系如下：
10×Bst buffer（200mM Tris-HCl（pH8.8），100mM KCl，100mM（NH4）2SO4,20mM MgSO4,0.1%Triton X-100），3μL；
混合引物（FIP：BIP：F3：B3=40μM：40μM：5μM：5μM），1.5μL；
dNTP（各10mM），4μL；
4M甜菜碱，2μL；
UDG酶，1U；
待测核酸处理液，6μL；
Bst DNA聚合酶，8U；
ddH2O加至25μL。
反应过程为：首先将除Bst DNA聚合酶外的试剂混匀，95℃加热5min，冷却后加入8U Bst DNA聚合酶；65℃反应1h，然后80℃加热15min，完成LAMP扩增，然后以柱层析的方法分离未反应的混合引物，缓冲液重悬得到分离纯化的扩增产物。
应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S202中的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制，如荧光标记物的标记位置位于内引物的中间位置同样可以实现本步骤。
在步骤S203的一个实施例中，步骤S203具体实施如下：
首先根据扩增结果中是否出现白色沉淀判断是否得到目的扩增产物，若无白色沉淀，则说明没有检测到靶标核酸，不需再进行后续操作；若有白色沉淀出现，说明至少有一种靶标核酸被检测到，需要进行进一步的检测判断到底是哪一种靶标核酸。
根据之前引物合成时连在5’端的荧光标记物，利用多色分光仪对扩增产物进行光谱分离。所用荧光标记物的激发光谱与发射光谱分别为：-CY3，550/570；-FITC，490/520；-TR，583/603。根据所分离得到的光谱图以及引物与荧光标记及靶标核酸的一一对应关系，若光谱图中发射光谱只有570nm波峰，说明待测样品中只含有沙门氏菌；若光谱图中发射光谱只有520波峰，说明待测样品中只含有志贺氏菌；若光谱图中发射光谱只有603波峰，说明待测样品中只含有金黄色葡萄球菌；其他情形，以此类推进行判断。
应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S203中的一个具体实施例，并不用以限制本发明的保护范围。
图5为本发明一实施例中同时快速检测多种核酸并利用基因测序法鉴别检测结果的方法示意图。该图直观的展示了利用LAMP在同一反应体系中同时快速检测多种核酸后通过基因测序法鉴别检测结果的过程：
步骤1.将样品进行常规液体培养，然后从培养菌液中直接提取DNA，得到含有多种待测靶标DNA的处理液。
步骤2.根据多种待测靶标DNA设计分别相对应的LAMP扩增特异性引物组，在引物合成时利用一一对应的寡核苷酸标签在内引物中F1c与F2两部分的中间进行标记，然后利用处理液与特异性引物配制LAMP反应体系，并加入UDG酶，进行LAMP扩增，扩增反应结束后经过层析柱纯化，将未反应的特异性引物去除，得到带有寡核苷酸标签的扩增产物。
步骤3.将扩增产物进行片段化处理，接上接头，结合测序引物，利用基因测序法检测扩增产物的碱基序列，从而可以得知寡核苷酸标签的碱基序列，根据检测得到的寡核苷酸标签序列信息，以及寡核苷酸标签与靶标DNA之间一一对应的关系，直接判断待测样品中所含有的靶标DNA种类。
应当说明的是，本发明对多种核酸同时进行快速检测的方法典型的应用于生物样品检测与鉴别，但不限于生物样品的检测与鉴别，任何其他类似的应用均应包含在本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于非疾病诊断治疗目的的同时快速检测多种核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A’.对待测样品进行处理，得到待测靶标核酸处理液；
A.利用与多种靶标核酸分别对应的引物组，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物组中的至少一条引物带有标记物，各靶标核酸对应的引物组所带的标记物不同；所述标记物为荧光标记物；
B.采用光谱分离法对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类；
所述多种靶标核酸是指待测样品中所包含的多种待测核酸；所述待测样品为食源性致病菌和/或病毒；所述待测样品包括志贺氏菌和沙门氏菌；所述多种靶标核酸包括沙门氏菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因和金黄色葡萄球菌clfA基因；
所述光谱分离法，是利用所使用的荧光标记物不同，其激发/发射光谱不同，通过多色分光仪分离它们的光谱检测荧光信号，然后根据检测得到的荧光信号判断扩增产物的种类，进而判断对应的靶标核酸的种类；
所述与沙门氏菌invA基因对应的引物组的核苷酸序列分别为：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:4；所述与志贺氏菌ipaH基因对应的引物组的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:8；所述与金黄色葡萄球菌clfA基因对应的引物组的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:12；
所述标记物为-CY3、-FITC和-Texas Red，它们通过中间偶联剂亚磷酰胺试剂分别标记于SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19的5’端；
针对志贺氏菌和沙门氏菌，所述步骤A’具体为：首先对样品在37℃进行常规液体培养12h至浑浊，取菌液1mL，12000rpm离心5min，然后以1×TE缓冲液洗涤重悬，再次12000rpm离心5min，沉淀加入200μL ddH2O重悬混匀，沸水浴12min，然后冰浴5min，12000rpm离心5min，取上清作为待测靶标核酸处理液。
2.根据权利要求1所述的同时快速检测多种核酸的方法，其特征在于，所述步骤B之前还包括步骤：
B’.对LAMP扩增反应之后的产物进行纯化，得到带标记的扩增产物。
3.根据权利要求1或2中所述的同时快速检测多种核酸的方法，其特征在于，所述步骤A中的LAMP扩增反应的反应体系中包含有尿嘧啶DNA糖基化酶。
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