CN104540958A

CN104540958A - 用于核酸扩增的核酸

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Publication number: CN104540958A
Application number: CN201380026175.3A
Authority: CN
Inventors: P·麦德波谷; D·考芬博格; K·肖恩顿
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: EP2831260A4; EP3486332B1; WO2013148212A8; JP2018064587A; ES2948896T3; CA2869033C; US20180112262A1; EP2831260B1; ES2705849T3; JP6270814B2; EP3486332A1; WO2013148212A1; EP2831260A1; US20150050651A1; US9822402B2; CN104540958B; JP2015512638A; US10308984B2; CA2869033A1; JP6707072B2

Abstract

本文提供可用于核酸扩增例如定量核酸扩增的核酸序列。

Description

用于核酸扩增的核酸

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年3月29日提交的美国临时专利申请号61/617562的优先权，其全部内容被引入本文作为参考。

序列表参考

电子形式的序列表随本申请一同被提交。序列表以命名为PCT_SEQLIST_GENOM_115WO.txt的文件提供，该文件最后存储于2013年3月13日，建立于2013年3月13日，其大小为15,257字节。全部信息被引入本文作为参考。

发明领域

本文实施方式总体上涉及可用于监测在核酸测试(NAT)中来自样品的核酸扩增和/或提取的内部对照核酸。

发明背景

核酸测试(NAT)分析提供用于快速检测和/或定量目标核酸的强大的工具。因此，NAT分析常用于检测样品——例如，临床设施中的患者样品、食物样品、环境样品及类似物——中生物体的存在。NAT分析也常用于诊断设施中，例如，检测遗传多态性、遗传重复、插入、缺失或类似情况，或基因表达改变，作为状况诸如疾病或病症的指示。

在多种情况下，期望获得关于给定样品中目标核酸序列量的定量信息。例如，定量核酸分析，例如扩增分析，可用于检测生物学样品中病原体特异性目标序列的存在和/或存在量，以确定样品是否感染病原体，和/或监测感染进程或严重程度。定量核酸分析还可有效用于监测细胞或组织状态——通过监测细胞或组织中标记物核酸序列的存在量，或有效用于定量样品中具体DNA元件，例如重复或转位元件，的存在量。

定量核酸扩增反应可用于定量样品中存在的目标核酸序列的相对和/或绝对量。这种方法已变得高度先进和灵敏，使得仅少数拷贝的目标核酸便可在样品中被检测到。由于定量核酸扩增反应的高度灵敏性，为避免假阳性、假阴性、高估目标或产物量、或低估目标或产物量，在选择适当的内部对照时必须非常小心。除关于内部对照(例如，内部对照模板、引物和/或探针)的特异性的考虑因素外，还存在关于对照核酸序列的固有特征的考虑因素，包括，例如，发夹、极低退火温度下的A/T数(A/T runs)、极高退火温度下的G/C数(G/C runs)——其不使核酸适于扩增和/或探针杂交。此外，可期望对于多种目标序列、在多种多重反应中使用相同的内部对照模板序列、引物组和探针。但是，很多核酸序列在狭窄反应条件组下适于扩增和/或探针杂交，并非足够稳健以在多种反应条件下用作内部对照。

因此，本领域技术人员将认识到确定用于充当内部对照以监测核酸扩增的内部对照序列、引物、和探针的稳健组合的复杂性。另外，本领域技术人员将认识到，通常进行大量实证检验以验证多核苷酸模板序列、引物对、探针、或其组合将充当对于定量核酸扩增可行的/适当的内部对照。

发明概述

本文公开的实施方式涉及可用作核酸测试(NAT)分析内部对照的改进的组合物。因此，本文提供内部对照反应剂、包含内部对照反应剂的试剂盒、以及其制备和在核酸测试分析中使用的方法。如下文进一步详细描述，本文公开的内部对照反应剂呈现高度有利的性质，包括极大灵敏性和再现性。此外，本文公开的内部对照反应剂具有高度通用性，并且可用作NAT分析中的对照，用于检测和/或定量多种不同的目标序列。

因此，在一些实施方式中，提供在核酸扩增反应——包括但不限于定量和/或定性核酸扩增反应——中可用作模板的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸可用作定量核酸测试分析如定量PCR的内部对照模板。示例性内部对照模板多核苷酸包括下列，主要由下列组成，或由下列组成：SEQ ID NOs：1、8、9、10、11、12、13、14、或15的序列或包括其子序列的其变体。

在一些实施方式中，提供可用作核酸扩增——例如，以扩增用作标准和/或内部对照的模板对照序列——的引物的寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于核酸扩增的独立引物和/或引物对。在一些实施方式中，引物可用于扩增对照模板序列(例如SEQ ID NOs：1、8、9、10、11、12、13、14、15和包括其子序列的其变体)。示例性引物包括下列，主要由下列组成，或由下列组成：SEQ ID NOs：3、4、5、或6的序列，或其变体。

在一些实施方式中，提供可用作探针的寡核苷酸。在一些实施方式中，探针包括可与本文公开的对照序列(例如，SEQ ID NOs：1、8、9、10、11、12、13、14、15和其变体)的扩增子杂交的寡核苷酸。示例性探针包括下列，主要由下列组成，或由下列组成：SEQ ID NO：2的序列、或其变体。

在一些实施方式中，提供试剂盒。试剂盒可包括本文描述的多核苷酸和/或寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒可包括用于定量核酸扩增内部对照的多核苷酸和/或寡核苷酸。试剂盒可包括多核苷酸模板、特异性扩增模板序列的引物中的至少一种。在一些实施方式中，试剂盒可包括特异性扩增模板序列的扩增引物对。在一些实施方式中，试剂盒可任选地包括与多核苷酸模板特异性杂交的探针。本文公开的试剂盒可任选地包括聚合酶、反应缓冲液、一种或多种dNTPs、或其任意组合、以及用于扩增反应的其他反应剂。

一些实施方式提供进行NAT分析的方法。在一些实施方式中，该方法包括提供多核苷酸模板序列，其包括下列，主要由下列组成，或由下列组成：SEQ ID NO：1；和使模板序列接触至少一种特异性杂交于模板序列的引物，例如，SEQ IDNO：3、4、5、或6的引物。在一些实施方式中，多核苷酸包括SEQ ID NO：1的变体。在一些实施方式中，该方法包括延伸引物，因此产生模板序列的扩增子。在一些实施方式中，该方法包括检测扩增子的存在和/或数量。在一些实施方式中，检测步骤包括使扩增子接触探针，其中探针包括可检测部分，并且其中探针结合扩增子。在一些实施方式中，该方法包括确定特异性结合扩增子的探针的量的步骤。在一些实施方式中，确定步骤随扩增子生成实时进行。在一些实施方式中，探针包括可检测部分，并且测量来自可检测部分的信号量。在一些实施方式中，测量特异地杂交或结合扩增子的探针的积累，作为时间或周期的函数，并生成扩增曲线。在一些实施方式中，进行一系列反应，其中在每个反应中，提供不同的已知量的模板序列。在一些实施方式中，该方法包括通过一系列扩增曲线生成标准曲线的步骤。在一些实施方式中，标准曲线用于确定扩增反应中多核苷酸序列的初始浓度。在一些实施方式中，扩增反应包括多重扩增反应。

附图简述

图1示例具有SEQ IDNO：8序列的修饰的PUC 119载体的载体图。

图2A和2B显示修饰的PUC 119载体的序列(图2A显示序列的第1-1800位，并且图2B显示序列的第1801-3350位)，其包含插入段——该插入段包括示例性内部对照模板序列(“DrosScaff2”；SEQ ID NO：8)、以及包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物、和包括SEQ ID NO：2的探针的相对位置。如菱形符号所示，处于此序列第1668位置的“t”残基不同于在SEQ ID NO：15(“DrosScaff1”)中的相应位置处发现的“C”残基。

图3A示例利用扩增引物对5得自5拷贝的模板、50拷贝的模板和500拷贝的包括SEQ ID NO：8的内部对照模板的实时扩增反应的标准曲线。对于5拷贝的模板、50拷贝的模板、和500拷贝的模板的每一个起始量而言，进行四次重复，并且确定Cq。标准曲线表示Cq-对-log模板起始量。

图3B显示用于生成图3A显示的标准曲线的扩增反应系列的扩增曲线(荧光-对-周期)。

图4A显示一系列扩增反应的扩增曲线(荧光度-对-周期)，其中初始模板浓度为200、50、25、或5拷贝的包括SEQ ID NO：8的线性化质粒，并且其中引物对5的引物用作扩增引物。包括序列SEQ ID NO：2的荧光探针用于反应。

图4B显示一系列实时扩增反应的扩增曲线(荧光度-对-周期)，其中初始模板浓度为200、50、25、或5拷贝的包括SEQ ID NO：8的线性化质粒，并且其中引物对1的引物用作扩增引物。包括序列SEQ ID NO：2的荧光探针用于反应。

图4C显示一系列实时扩增反应的扩增曲线(荧光度-对-周期)，其中初始模板浓度为200、50、25、或5拷贝的包括SEQ ID NO：8的线性化质粒，并且其中引物对5的引物用作扩增引物。包括序列SEQ ID NO：2的荧光探针用于反应。

图4D显示一系列实时扩增反应的扩增曲线(荧光度-对-周期)，其中初始模板浓度为200、50、25、和5拷贝的包括SEQ ID NO：8的线性化质粒，并且其中引物对5的引物用作扩增引物。包括序列SEQ ID NO：2的荧光探针用于反应。

图5示例PCR性能(PCR效率、R2和斜率)和灵敏度，检测少如5拷贝/反应的具有序列SEQ ID NO：15的线性化质粒(“DrosScaff1”质粒)。

发明详述

要理解，前文总体描述和下文详细描述均仅具有示例性和说明性，而不意图限制本教导的范围。在本申请中，单数的使用包括复数，除非另外特别陈述。而且，“包括”、“包含”、和“含有”或其词根变型的使用——例如但不限于，“包括”、“包含”和“包括”——不意图限制。使用“或”的意思是“和/或”，除非另外陈述。术语“和/或”意为该术语的前后项可被一起或单独采用。以示例为目的，而非作为限制，“X和/或Y”可意为“X”或“Y”，或“X和Y”。

无论本文在何时提供值范围，该范围意为包括起始值和结束值以及其间的任何值或值范围，除非另外特别陈述。例如，“0.2至0.5”意为0.2、0.3、0.4、0.5；其间的范围如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4；其间的增量如0.25、0.35、0.225、0.335、0.49；其间的增量范围如0.26-0.39；等。

本文使用的章节标题仅以组织编辑为目的，而不以任何方式被解释为限制所述主题。本申请引用的所有文献和类似材料——包括但不限于，专利、专利申请、论文、书籍、著作和互联网页——无论这些文献和类似材料是何种形式，其全部内容均被明确引入作为参考，用于任何用途。在被引入的文献或类似材料中的一个或多个定义或使用术语的方式与本申请中的该术语定义冲突的情况下，以本申请为准。虽然本教导结合多种实施方式被描述，但并不意为本教导受限于这种实施方式。相反，本教导涵盖被本领域技术人员理解的各种替代、改动和等同形式。

本公开的不同实施方式描述用于核酸测试(NAT)分析的组合物和试剂盒及其使用方法。因此，一些实施方式提供用于NAT分析例如扩增分析的核酸序列。本领域技术人员将理解，对于任何核酸序列而言可容易获得反向互补(reversecompliment)，并且核酸序列的公开还提供该序列反向互补的公开。本领域技术人员将理解，可容易获得本文公开的核酸序列的子序列。

本文提供的核酸可处于多种形式。例如，在一些实施方式中，核酸溶解(单独或组合不同的其他核酸)在溶液中，例如缓冲液。在一些实施方式中，以盐提供核酸——单独或组合其他分离的核酸。在一些实施方式中，以可重构的冻干形式提供核酸。例如，在一些实施方式中，可以单独冻干小球或以与其他分离的核酸一起的冻干小球提供本文公开的分离的核酸。在一些实施方式中，提供附着于固体物如小珠、膜或类似物的核酸。在一些实施方式中，提供处于宿主细胞——例如携带质粒的细胞系、或携带稳定整合的序列的细胞系——中的核酸。

对照序列

本文公开的一些实施方式提供NAT分析的对照核酸序列。在一些实施方式中，对照序列可用作与测试样品平行处理的外部对照或标准。在一些实施方式中，对照序列可用作内部对照，并且在处理前与测试样品组合。

技术人员将理解，术语“核酸”包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)、以及任何其他类型的多核苷酸——其是具有嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷、和包含非核苷酸骨架——例如，多酰胺(例如，肽核酸(PNAs))和多吗啉代(可购自Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oreg.，如NEUGENE^TM聚合物)——的其他聚合物、和其他合成序列特异性核酸聚合物，条件是聚合物包含允许如在DNA和RNA中发现的碱基配对和碱基堆积的构型的核碱基。

术语核苷酸和多核苷酸包括，例如，3′-脱氧-2′，5′-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3′→P5′磷酰胺酯、2′-O-烷基取代的RNA、双-和单-链DNA、以及双-和单-链RNA、DNA：RNA杂合物、和PNAs和DNA或RNA之间的杂合物。该术语还包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记、甲基化、“帽”、用类似物取代天然存在的核苷酸中的一种或多种、核苷酸间修饰，如例如，通过不带电的连接体(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)、带负电连接体(例如，硫代磷酸基、二硫代磷酸酯等)、和带正电连接体(例如，氨基烷基磷酰胺酯、氨基烷基磷酸三酯)修饰、包含侧链部分如例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多-L-赖氨酸等)的修饰、通过嵌入剂(例如，吖啶、扫若仑等)修饰、包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属、等)的修饰、包含烷化剂的修饰、通过修饰连接体(例如，α异头核酸等)修饰以及无修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。

要理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且还包含其他已修饰杂环碱基的那些部分。这种修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶、或其他杂环。修饰核苷或核苷酸还将包括糖部分上的修饰，例如，其中羟基中的一个或多个被卤素、脂肪族基团替代，或被功能化为醚、胺或类似物。其他核苷酸或多核苷酸修饰包括重排、附加、取代、或以其他形式改变与各自的互补嘧啶或嘌呤例如异鸟嘌呤、异半胱氨酸及类似物构成氢键的嘌呤或嘧啶碱基上的官能团。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或探针包括至少一个、两个、三个或四个修饰核苷酸。

在一些实施方式中，本文公开的核酸包括一个或多个通用碱基。如本文所用，术语“通用碱基”指代可与选自A、T、C和G的一种以上核苷酸杂交的核苷酸类似物。在一些实施方式中，通用碱基可选自脱氧肌苷、3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、6-硝基吲哚、5-硝基吲哚。

在一些实施方式中，本文公开的对照核酸序列是目标对照序列(“TCSs”)，其是核酸扩增反应的模板。本领域技术人员将理解，本文公开的TCS的子序列可通过PCR或本文进一步详细讨论的其他扩增方法扩增，本文公开的TCS的整体也可如此。在一些实施方式中，提供TCS作为多重分析的对照，其中已知量的TCS和所要定量的至少一种目标核酸均在相同反应混合物中扩增。在一些实施方式中，已知量的TCS在第一反应混合物中扩增，而所要定量的目标核酸在第二反应混合物中扩增。

在一些实施方式中，TCS由下列组成，主要由下列组成，或包括下列：SEQ IDNO：1的序列或其变体。在一些实施方式中，TCS被提供在载体例如质粒中。因此，一些实施方式提供由下列组成，主要由下列组成，或包括下列的多核苷酸序列：处于质粒中的SEQ ID NO：1，例如，由SEQ ID NO：8组成、主要由SEQ IDNO：8组成、或包括SEQ ID NO：8的序列。在其中TCS被提供在质粒中的实施方式中，质粒可以是线性化的，或可选地，质粒可以是非线性化的(例如，处于超螺旋或非缠绕环形式)。在一些实施方式中，模板序列包括这样的多核苷酸：其包括SEQ IDNOs：9、10、11、12、或13的序列或其变体中的至少一种。本文公开的序列的“变体”在下文中讨论。

在一些实施方式中，TCS包括从果蝇(Drosophila)属生物体基因组DNA或基因组片段或其修饰分离的多核苷酸，所述果蝇属生物体例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、拟果蝇(Drosophila simulans)、Drosophila sechellia、Drosophila yakuba、Drosophila erecta、Drosophila ficusphila、Drosophila eugracilis、Drosophila biarmipes、Drosophila takahashii、Drosophila elegans、Drosophilarhopaloa、Drosophila kikkawai、嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)、Drosophilabipectinata、Drosophila pseudoobscura、Drosophila persimilis、或Drosophilawillistoni。优选地，TCS序列包括下列，由下列组成，或主要由下列组成：SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：14。例如，SEQ ID NO：14总体上相应于黑腹果蝇基因组(GenBank：AC246436；核苷酸35779至35978)中发现的序列，并且SEQ ID NO：1包括对SEQ ID NO：14的修饰：SEQ ID NO：14第93位的“C”残基变为SEQ IDNO：1相同位置处的“T”。这种修饰——也被发现于SEQ ID NO：8的质粒中，在图2中由菱形符号标示。

寡核苷酸

在一些实施方式中，提供寡核苷酸，例如引物和/或探针。如本文所用，术语“引物”和“探针”包括但不限于寡核苷酸。优选地，本文公开的寡核苷酸引物和/或探针的长度可在8和45个核苷酸之间。例如，引物和或探针的长度可以为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多核苷酸。可以任何适当的形式提供引物和/或探针，包括例如结合于固体支撑体、液体和冻干。本文公开的引物和探针序列可被修饰以在5′或3′端或两者包含另外的核苷酸。但是，技术人员会理解，扩增引物(不一定是探针)3′端的另外的碱基总体上与模板序列互补。本文公开的引物和探针序列还可被修饰以去除5′或3′端的核苷酸。技术人员会理解，为了用于扩增，引物或探针将具有本文公开的最小长度和退火温度。

寡核苷酸引物和探针可在退火温度下结合于其目标，该退火温度是小于熔融温度(T_m)的温度。如本文所用，“T_m”和“熔融温度”是可交换的术语，其指代双链多核苷酸分子群的50％分解成单链的温度。计算多核苷酸的T_m的公式在本领域公知。例如，T_m可通过下列等式计算：T_m＝69.3+0.41x.(G+C)％-6-50/L，其中L是核苷酸中的探针长度。杂合多核苷酸的T_m也可利用沿用自1M盐中的杂交分析并且常用于计算PCR引物的T_m的公式来估测：[(A+T数)×2℃+(G+C数)×4℃]。参见，例如，C.R.Newton et al.PCR，第二版，Springer-Verlag(New York：1997)，p.24。本领域存在其他更精细的计算，其考虑结构以及序列特征以计算T_m。寡核苷酸的熔融温度可取决于寡核苷酸引物或探针和结合序列之间的互补性和盐条件。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸引物或探针在50mM KC1、10mMTris-HCl缓冲液中具有小于约90℃的T_m，例如约89℃、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39℃或更小，包括所列值中任意两个之间的范围。如下文进一步详细讨论，在一些实施方式中，本文公开的引物被提供作为扩增引物对，例如，包括正向引物和反向引物。优选地，正向和反向引物具有差异不大于10℃的T_m，例如，差异小于10℃、小于9℃、小于8℃、小于7℃、小于6℃、小于5℃、小于4℃、小于3℃、小于2℃、或小于1℃的T_m。

引物和探针序列可通过寡核苷酸序列中的核苷酸置换(相对于目标序列)被修饰，条件是寡核苷酸包含足够的互补性以与目标核酸序列特异地杂交。以这种方式，至少1、2、3、4、或上至约5个核苷酸可被置换。如本文所用，术语“互补”指代两个多核苷酸链的区域之间或同一多核苷酸链两个区域之间的序列互补。多核苷酸的第一区域与相同或不同多核苷酸的第二区域互补，如果当两个区域以反平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸能够与第二区域的碱基进行碱基配对。因此，无需在每个核苷酸位置处的两个互补多核苷酸碱基配对。“完全互补”指代这样的第一多核苷酸：与第二多核苷酸100％或“完全”互补，因此在每个核苷酸位置处形成碱基对。“部分互补”也指代这样的第一多核苷酸：非100％互补(例如，90％、或80％或70％互补)，并且在一个或多个核苷酸位置处包含错配核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸包括通用碱基。

如本文所用，术语“杂交”用于指代互补(包括部分互补)多核苷酸链的配对。杂交和杂交强度(即，多核苷酸链之间相关的强度)受本领域公知的多种因素影响，包括多核苷酸之间的互补程度、条件严格性——其涉及受如下条件影响：盐浓度、形成的杂合物的熔融温度、其他组分的存在(例如，存在或不存在聚乙二醇)、杂交链摩尔浓度和多核苷酸链G：C含量。在一些实施方式中，设计引物使得组中一种引物的Tm处于组中其他引物的Tm的2℃以内。核酸杂交的广泛指导存在于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，第2章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel et al，编辑.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York).参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，New York)。如本文进一步讨论，术语“特异性杂交”或“特异性地杂交”指代在一般用于核酸扩增的条件下，多核苷酸——例如，寡核苷酸引物或探针或类似物——与目标序列如样品中所要定量的序列、阳性对照目标核酸序列或类似物杂交，而不与不相关序列杂交。

在一些实施方式中，引物和/或探针包括在寡核苷酸序列全长范围与目标核酸序列杂交的寡核苷酸。这种序列可被称为彼此“完全互补”。在寡核苷酸在本文被称为与核酸序列“基本上互补”的情况下，这两个序列可完全互补，或其可在杂交时形成错配，但保持在严格条件或下文讨论的标准PCR条件下杂交的能力。如本文所用，术语“基本上互补”指代两个核酸之间的互补，例如，寡核苷酸和目标序列的互补区域。互补无需是完全的；两个核酸之间可存在任意数量的碱基对错配。但是，如果错配数大到即使在最低严格性杂交条件下也不可发生杂交，则序列不是基本上互补序列。当两个序列在本文中被称为“基本上互补″时，意为序列足以彼此互补从而在选定反应条件下杂交。足以实现特异性的核酸互补性与杂交严格性的关系在本领域公知，并且在下文中参考序列同一性、熔融温度和杂交条件被进一步描述。因此，基本上互补序列可用于本文公开的任意检测方法。这种探针可例如完全互补，或可包含1至多个错配，只要杂交条件足以允许例如目标序列和非目标序列之间的辨别。因此，基本上互补序列可指代相比于参考序列同一性百分比处于100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70或更小的范围或其之间任意数值的序列。例如，本文公开的寡核苷酸可包含，相比于寡核苷酸杂交的目标序列，1、2、3、4、5、或更多个错配和/或简并碱基，条件是寡核苷酸能够在例如标准核酸扩增条件下与目标序列特异性杂交。

本文描述的引物可利用本领域已知的技术制备，包括但不限于，适当序列的克隆和消化以及直接化学合成。可用于制备本文所述引物的化学合成方法包括但不限于，Narang et al.(1979)Methods in Enzymology 68：90描述的磷酸三酯法、Brown et al.(1979)Methods in Enzymology 68：109公开的磷酸二酯法、Beaucage etal.(1981)Tetrahedron Letters 22：1859公开的二乙基磷酰胺酸法、和美国专利号4,458,066描述的固体支撑体法。本文还考虑利用自动寡核苷酸合成器制备本文描述的合成寡核苷酸引物。此外，如需，可利用本领域已知和下文描述的技术标记引物。

优选地，本文公开的寡核苷酸与目标序列或目标多核苷酸，例如TCS，完全或基本上互补。如本文所用，术语“目标多核苷酸”和“目标核酸”指代其存在将要在反应中确定的多核苷酸，例如内部对照序列，和/或所要测量的样品序列。

因此，本文提供包括下列，主要由下列组成，或由下列组成的引物：SEQ IDNO 3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6其中之一的序列或其变体。

引物组

在一些实施方式中，提供扩增引物组。扩增引物组可包括一个或多个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个引物对。如本文所用，术语“引物对”可指代分别杂交于目标核酸——例如，定量PCR内部对照序列——的相反链的两个引物，其中各引物可在其3’端处延伸，以形成目标扩增产物，例如在PCR中。引物对可包括正向和反向引物。

在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括这样的引物对：其包括至少一组杂交并扩增目标对照序列的扩增引物。第一寡核苷酸——包括SEQ ID NO：3的序列、主要由SEQ ID NO：3的序列组成、或由SEQ ID NO：3的序列组成——和第二寡核苷酸——包括SEQ ID NO：4的序列、主要由SEQ ID NO：4的序列组成、或由SEQ ID NO：4的序列组成——是可结合本文公开的实施方式应用的示例性引物对(下文“引物对5”)。第一寡核苷酸——包括SEQ ID NO：5的序列、基本上由SEQ ID NO：5的序列组成、或由SEQ ID NO：5的序列组成——和第二寡核苷酸——包括SEQ ID NO：6的序列、基本上由SEQ ID NO：6的序列组成、或由SEQ ID NO：6的序列组成——是另一可结合本文公开的实施方式应用的示例性引物对(下文“引物对1”)。引物对1和引物对2的特征在表1中描述。

表1

在一些实施方式中，引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列，或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的变体；所述第二引物包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列，或SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的变体。

在一些实施方式中，引物对可用于扩增目标对照序列(TCS)——例如包括SEQ ID NO：1的序列、SEQ ID NO：8的序列、或其变体的模板——的扩增子。在一些实施方式中，引物对1或引物对5用于从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8(例如，模板对照序列)扩增序列。因此，在一些实施方式中，引物对5产生SEQID NO：9所示的扩增子。在一些实施方式中，引物对1或引物对5扩增包括SEQID NO：1的变体——例如，SEQ ID NO：10、11、12、或13的序列——的模板。在一些实施方式中，引物对1或引物对5扩增包括果蝇基因组DNA或基因组片段的模板。

探针

在一些实施方式中，提供序列特异性探针。探针包括但不限于，本文描述的寡核苷酸。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与目标序列，如TCS特异地杂交。在一些实施方式中，序列特异性探针与侧翼是本文公开的正向引物和反向引物的结合位点的核苷酸序列特异性杂交并且完全或基本上互补。在一些实施方式中，序列特异性探针包括SEQ ID NO：3、4、5、或6的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸，使得序列特异性探针与本文公开的扩增引物的结合位点重叠。

不同类型的可检测部分已被描述用于检测扩增产物。一类可检测部分是嵌入剂，其非特异性地结合双链核酸。嵌入剂在未结合时具有相对低的荧光度，和在结合双链核酸后具有相对高的荧光度。因此，嵌入剂可用于在核酸扩增反应期间监测双链核酸的积累。这种非特异性染料的实例包括嵌入剂如SYBR绿I(分子探针)、碘化丙锭(propidium iodide)、溴化乙锭及类似物。其他类型的可检测部分应用序列特异性核酸探针的衍生物。例如，一种或多种染料标记的寡核苷酸探针，使得在与模板核酸杂交后，产生荧光度的可检测变化。虽然一些应用可能需要非特异性染料，但序列特异性探针可提供更准确的扩增测量。序列特异性探针的一种构型可包括连接于荧光团的探针一端和连接于猝灭剂的探针另一端。当探针未杂交时，其可保持茎-环构型——其中荧光团通过猝灭剂猝灭，从而防止荧光团发光。当探针杂交于模板核酸序列时，其被线性化，使荧光团远离猝灭剂，因此允许荧光团发荧光。序列特异性探针的另一构型可包括连接于FRET对的第一荧光团的第一探针，和连接于FRET对的第二荧光团的第二探针。第一探针和第二探针可被配置以杂交于扩增子中一定近度内的序列，该近度足以允许在第一探针和第二探针杂交于相同扩增子时通过FRET进行能量转移。

在一些实施方式中，序列特异性探针包括本文公开的寡核苷酸，该寡核苷酸与荧光团结合。在一些实施方式中，探针与两个或更多个荧光团结合。荧光团的实例包括：呫吨染料例如荧光素，和罗丹明染料如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、单盐酸2-[乙基氨基)-3-(乙基亚氨基)-2-7-二甲基-3H-呫吨-9-基]苯甲酸乙基酯(R6G)(发出波长范围为约500至560nm的响应辐射)、1，1，3，3，3′，3′-六甲基吲哚二羰花青碘(HIDC)(发出波长范围为约600至660nm的响应辐射)、6-羧基荧光素(公知简称FAM和F)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)、和罗丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如，伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩嗪染料；卟啉染料；多次甲基(polymethine)染料，例如花青染料，如Cy3(发出波长范围为约540至580nm的响应辐射)、Cy5(发出波长范围为约640至680nm的响应辐射)等；BODIPY染料和喹啉染料。具体目标荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪基、荧光素、R110、曙红、JOE、R6G、HIDC、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、ROX、萘酚荧光素、德克萨斯红、萘酚荧光素、Cy3，和Cy5及类似物。

在一些实施方式中，探针与猝灭剂结合。猝灭剂可吸收电磁辐射和使其作为热消散，因此保持深暗。实例猝灭剂包括Dabcyl、NFQ’s如BHQ-1或BHQ-2(Biosearch)、IOWA BLACK FQ(IDT)、和IOWA BLACK RQ(IDT)。在一些实施方式中，猝灭剂被选择以与荧光团配对，从而吸收荧光团发出的电磁辐射。可用于本文公开的组合物和方法的荧光团/猝灭剂对在本领域公知，和可被找到，例如，描述于S.Marras，“Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for FluorescentNucleic Acid Hybridization Probes”，可获自万维网站molecular-beacons.org/download/marras，mmb06％28335％293.pdf。

在一些实施方式中，荧光团连接于探针的第一端，并且猝灭剂连接于探针的第二端。连接可包括共价键合，和可任选地可包括位于探针和荧光团或猝灭剂之间的至少一个连接分子。在一些实施方式中，荧光团连接于探针的5’端，并且猝灭剂连接于探针的3’端。在一些实施方式中，荧光团连接于探针的3’端，并且猝灭剂连接于探针的5’端。可用于定量核酸扩增的探针的实例包括分子信标、SCORPIONS^TM探针(Sigma)和TAQMAN^TM探针(Life Technologies)。

本文公开的一些实施方式提供与如下模板对照序列或模板对照序列的扩增子特异杂交的探针：SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：8、或其子序列。因此，本文公开的一些实施方式提供这样的探针：其与来自通过引物对1或引物对5其中一种扩增包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8的模板的扩增子杂交。在一些实施方式中，探针测量SEQ ID NO：1的变体或其子序列的扩增——通过与SEQ ID NO：8、9、10、11、12、或13中的至少一种的扩增子杂交。因此，在一些实施方式中，提供寡核苷酸探针，其包括下列，主要由下列组成，或由下列组成：SEQ ID NO：2或16的序列或其变体。在一些实施方式中，探针包括本文描述的荧光团和/或猝灭剂。在优选实施方式中，探针可包括SEQ ID NO：2，其中荧光团6-羧基-X-罗丹明(“ROX”或“R”)连接于探针的5’端，并且猝灭剂IOWA BLACK Black-hole2(IDT)(“BHQ”)连接于探针的3’端(例如5’-(ROX)-TGA TGC CTCTTC ACA TTG CTC CAC CTT TCC T-BHQ-2-3’)。

在一些实施方式中，提供两种或更多种探针。在一些实施方式中，提供第一探针并且提供第二探针。第一探针可连接于第一FRET荧光团。第二探针可连接于第二FRET荧光团。第一探针和第二探针可均被配置以与所要定量的扩增子序列杂交。在一些实施方式中，第一探针被配置以与扩增子的第一子序列杂交，并且第二探针被配置以与扩增子的第二子序列杂交。在一些实施方式中，第一子序列位于第二子序列的5’端，并且第一子序列的3’端和第二子序列的5’端之间的碱基数量不大于约10个碱基，例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0个碱基。在一些实施方式中，第一探针和第二探针均与作为SEQ ID NO：1或其变体的子序列的序列杂交。在一些实施方式中，第一探针包括SEQ ID NO：2的序列，或SEQID NO：2的变体或子序列，并且第二探针如本文所述。

载体

在一些实施方式中，本文提供的核酸序列(例如，TCS)存在于载体例如质粒或病毒中。载体在本领域公知，并且本领域技术人员将理解，多种载体可用于提供核酸序列。另外，存在多种载体变体，并且另外的载体可由本领域技术人员生产。载体可通过如下修饰：定点诱变、随机诱变，或一个或多个克隆步骤，以添加、移除、和/或置换载体的至少一个核酸序列，例如多克隆位点、抗生素抗性基因、原点或复制、或编码标记物的基因，该标记物促进携带载体的细胞的可视化，如β半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白质。

在一些实施方式中，载体包含核酸扩增模板序列。核酸扩增模板序列可被移至不同的载体——例如通过限制性消化，以从第一载体移除核酸扩增模板序列，并且连接从而将核酸扩增模板序列插入第二载体；或通过核酸扩增，例如核酸扩增模板序列的PCR扩增，和将核酸扩增模板序列连接到第二载体中。

作为实例，得自pUC 119的质粒显示在SEQ ID NO：7中。在一些实施方式中，不包含内部对照模板序列(例如，TCS)的质粒，例如SEQ ID NO：7的质粒可用作NAT分析中的阴性对照。包含PCR模板序列SEQ ID NO：1的pUC119衍生的质粒的序列被提供在SEQ ID NO：8中。图1示例包括SEQ ID NO：8的序列的质粒图。

变体

本领域技术人员将理解，所示核酸序列的变体可利用本领域已知的技术生成，例如通过随机诱变、定点诱变、或化学合成所需变体。在一些实施方式中，提供所示序列的变体，其中各变体具有至少一个核苷酸不同于参考序列的序列。在一些实施方式中，变体核酸包括基本上互补的序列，其与参考序列具有至少约70％nt-nt同一性，例如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％、或99.99％，包括所列值中任意两个之间的范围。

在一些实施方式中，变体具有与参考序列基本上等同或类似的功能。例如，对于具有引物和/或探针结合位点的参考序列，引物和/或探针结合位点以外的多种核酸变体不影响引物结合和随后的扩增、或探针杂交。

在一些实施方式中，参考模板的变体通过与参考模板相同的引物扩增。在一些实施方式中，参考探针杂交位点的变体与和参考序列相同的探针杂交。在一些实施方式中，TCS的变体通过与TCS相同的引物扩增，并且通过与TCS相同的引物杂交。在一些实施方式中，提供TCS的变体，并且提供一种或多种相应变体引物以与变体TCS退火。在一些实施方式中，提供探针结合位点的变体，并且提供一种或多种相应变体探针以与变体探针结合位点杂交。在一些实施方式中，提供定量核酸扩增内部对照序列的变体，并且提供相应变体引物/或探针以与变体内部对照序列退火。

在一些实施方式中，变体导致引物和/或探针杂交位点的部分错配，但仍允许引物或探针结合。变体可在探针和/或引物中。可选地，变体可在探针和/或引物结合的序列中。在一些实施方式中，引物或探针变体导致不大于5个核酸错配，例如5、4、3、2、或1个核苷酸。在一些实施方式中，即使有错配时，引物也可与结合位点退火并用于PCR扩增，只要错配不在引物3’端的前两个核苷酸中。在一些实施方式中，即使有错配时，探针也可与目标序列杂交，而与错配位置无关。

在一些实施方式中，变体PCR引物或探针在本文描述的退火温度下结合于目标序列，并且因此用于核酸序列的扩增和/或检测。

在一些实施方式中，提供与SEQ ID NO：1具有至少约85％，例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多序列同一性的变体。SEQ ID NO：1表示黑腹果蝇的分离序列。当SEQID NO：3和SEQ ID NO：4的引物用于扩增SEQ ID NO：1时，生成SEQ ID NO：9的序列。在一些实施方式中，引物对——包括正向引物，其包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列；和反向引物，其包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列——被用于扩增黑腹果蝇的基因组DNA。由于此基因组DNA中存在重复，包括SEQ ID NO：8、9、10、或11的序列或其子序列可通过本文描述的引物对生成。在一些实施方式中，虽然序列包括SEQ ID NO：1序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多个核苷酸变体，但此序列可通过包括如下的引物对扩增：包括序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的其中一个引物，和包括序列SEQID NO：4或SEQ ID NO：6的其中一个引物，和/或可通过SEQ ID NO：2的探针杂交。

方法

本文提供应用本文公开的组合物的方法，例如，用于监测NAT分析性能的效力。在一些实施方式中，本文公开的组合物可用于监测测试样品制备以及处理的效率。例如，在一些实施方式中，本文提供的组合物可与测试样品组合，并且用于监测核酸提取和/或处理(例如，扩增和/或检测)。在一些实施方式中，本文提供的组合物不与测试样品组合，但被平行处理，以监测核酸提取和/或处理(例如，扩增和/或检测)。在一些实施方式中，本文公开的引物和核酸模板提供稳健且可再现的方法以确定多种自动或手动工艺样品处理系统的提取效率或其他性能度量，此外还充当多种分析物扩增的对照。例如，本文公开的组合物可有利地联合自动进行NAT分析的装置应用，该装置包括但不限于自动制备和处理NAT分析中的样品的装置(例如，自动进行核酸提取和制备，以及扩增和检测)。

在一些实施方式中，提供提取性能对照。可利用本领域已知多种技术从不同类型的样本中提取核酸，包括生物学或临床样本，例如组织样品、体液、或细胞培养样品，以及食物样品、土壤样品或类似物。核酸提取可包括从生物学样品中的其他物质——例如，蛋白质、脂质、膜、细胞器、糖和无机分子——分离核酸。核酸提取可手动进行，或通过多种自动系统中的一种。本文提供的方法可有效用于监测核酸提取效率，例如从而验证提取方法、装置和/或反应剂，以在提取方法进行时提供阳性对照，和/或对自动处理装置的一个或多个组件进行维护检查。

在一些实施方式中，将已知量的核酸模板，例如目标对照序列(TCS)，加入生物学样品，例如，SEQ ID NOs：1、8、9、10、11、12、13、其变体、或其反向互补序列。在一些实施方式中，在进行核酸提取方案的任何步骤前，将已知量的核酸模板加入测试样品。在一些实施方式中，在核酸提取方案至少一个步骤已进行后，添加已知量的核酸模板。

在一些实施方式中，本文公开的组合物可用于核酸扩增方法。在一些实施方式中，核酸扩增可包括定量核酸扩增，例如从而测量核酸样品中存在的相对或绝对量。在一些实施方式中，核酸可包括定性核酸扩增，例如从而确定核酸序列是否存在于样品中。在一些实施方式中，核酸扩增可包括定量和定性核酸扩增，例如从而确定核酸序列是否存在于样品中，并且若存在，测量样品中存在的核酸序列的相对或绝对量。核酸扩增方法可包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、例如多重置换扩增(MDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、连接酶链式反应(LCR)、免疫扩增、和多种基于转录的扩增程序，包括转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)和滚环扩增。参见，例如，Mullis，″Process for Amplifying，Detecting，and/or CloningNucleic Acid Sequences，″美国专利号4,683,195；Walker，″Strand DisplacementAmplification，″美国专利号5,455,166；Dean et al，“Multiple displacementamplification，”美国专利号6,977,148；Notomi et al.，″Process for SynthesizingNucleic Acid，″美国专利号6,410,278；Landegren et al.美国专利号4,988,617″Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids″；Birkenmeyer，″Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction，″美国专利号5,427,930；Cashman，″Blocked-Polymerase Polynucleotide ImmunoassayMethod and Kit，″美国专利号5,849,478；Kacian et al.，″Nucleic Acid SequenceAmplification Methods，″美国专利号5,399,491；Malek et al.，″Enhanced Nucleic AcidAmplification Process，″美国专利号5，130,238；Lizardi et al.，BioTechnology，6：1197(1988)；Lizardi et al.，美国专利号5,854,033“Rolling circle replication reportersystems”。在一些实施方式中，进行所列核酸扩增方法中的两种或更多种，例如相继进行。

在一些实施方式中，利用已知量的核酸模板如本文公开的模板对照序列(TCSs)进行一系列单独的扩增反应，以生成标准曲线。基于标准曲线，可确定单独扩增反应中的目标模板量。在一些实施方式中，将已知量的内部对照模板(例如，模板对照序列如SEQ ID NO：1、8、9、10、11、12或13，或其变体)与可包含或可不包含所要扩增的目标核酸的样品组合，并且模板对照序列和目标核酸(如存在)均在多重反应中扩增。在一些实施方式中，一系列核酸扩增反应——各反应具有已知量的模板对照序列(例如，SEQ ID NO：1、8、9、10、11、12、或13)，并且确定每一数量的内部对照模板的检测阈，从而生成标准曲线。在一些实施方式中，每一数量的对照模板进行多次重复，例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10次重复。然后，可利用内部对照序列的标准曲线确定样品中的目标反应的量。核酸定量的多重和标准曲线方法被详细描述于McMillan等(美国专利号6,783,934)。在一些实施方式中，进行多次扩增循环，直到经计算目标扩增子达到检测阈(“Cq”)。在一些实施方式中，方法包括在扩增反应中提供探针。例如，在一些实施方式中，提供非序列特异性探针。在一些实施方式中，本文公开的方法包括在扩增反应中提供序列特异性探针，例如，探针包括下列，由下列组成，或基本上由下列组成：SEQ ID NO：2或其变体。

在一些实施方式中，方法包括检测扩增子生成量。检测可连续或周期进行。例如，检测可在每个第N次(Nth)循环或其部分结束时进行，其中N是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或类似数字之一。在一些实施方式中，检测可包括测量荧光度，例如在连接于探针的荧光团的发射波长或包括连接于探针的荧光团的发射波长的波长范围下的电磁辐射强度。在一些实施方式中，检测可包括检测FRET。

在一些实施方式中，测量定量核酸扩增的效率。其可有效用于测量定量核酸扩增反应的效率，例如确定反应对低拷贝数核酸的灵敏度，或优化或验证定量核酸扩增的方案、反应剂和/或装置。在一些实施方式中，将已知量的核酸模板加入定量核酸反应。在一些实施方式中，模板是内部对照模板。在一些实施方式中，将被配置以扩增核酸模板的扩增子的引物对加入反应。引物对的正向引物和反向引物可与模板杂交和被延伸，因此生成扩增子。扩增子生成量可在扩增反应期间的一个或多个时间点进行监测，或可利用本文公开的方法进行连续监测。在一些实施方式中，阈值循环Cq可被定义为相对荧光度单位(RFU’s)表示的水平，例如约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1700、2000、2500、或3000RFU。在本文实施例2中，Cq被定义为500RFU。在一些实施方式中，标准曲线被表示为Cq-对-模板起始量或其对数变换。在一些实施方式中，标准曲线被表示为相对荧光单位-对-模板起始量或其对数变换。

在一些实施方式中，通过本文描述的定量核酸扩增反应，例如定量PCR，来定量已知量的核酸模板。在一些实施方式中，例如在提取RNA的实施方式中，RNA在定量步骤前被逆转录到DNA中。在一些实施方式中，在提取程序已完成后定量已知量的核酸模板。在一些实施方式中，在提取过程的中间步骤后定量已知量的核酸模板，例如从而确定提取过程后续步骤的效率。

技术人员将理解，本文公开的组合物可用于如本文公开的多种类型的核酸扩增反应。在一些实施方式中，本文公开的组合物可用于聚合酶链式反应(PCR)。关于PCR技术的综述，包括适用于临床微生物学的标准PCR条件，参见ClinicalMicrobiology，Singleton P.，由Dordrecht出版；Boston：Kluwer Academic，(2000)Molecular Cloning to Genetic Engineering White，B.A.Ed.，在Methods in Molecular Biology67：Humana Press，Totowa(1997)中；和“PCR Methods and Applications”，1991至1995(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中的DNA方法。“PCR条件”的非限制性实例包括本文引用的参考文献中公开的条件，如例如，50mM KCl，10mMTris-HCl(pH 9.0)，0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂，其中退火温度为72℃；或4mM MgCl₂，100mM Tris，pH 8.3，10mM KCl，5mM(NH₄)₂SO₄、0.15mgBSA，4％Trehalose，其中退火温度为59℃，或50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0)，0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂，其中退火温度为55℃或类似条件。

在一些实施方式中，提供至少一种聚合酶。聚合酶可用于定量PCR。不同的核酸聚合酶可适用，包括但不限于FASTSTART^TM Taq DNA聚合酶(Roche)、KlenTaq 1(AB peptides Inc.)、HOTGOLDSTAR^TM DNA聚合酶(Eurogentec)、KAPATAQ^TM HotStart DNA聚合酶或KAPA2G^TM Fast HotStart DNA聚合酶(KapaBiosystemss)和PHUSION^TM Hot Start(Finnzymes)。

在一些实施方式中，单一引物，例如SEQ ID NO：3、4、5、6或其变体，用于扩增。

热循环

每一个不同步骤的热循环条件可在时间以及温度方面不同，这取决于所用的热循环器以及可改变扩增性能的其他变量。在一些实施方式中，实施2步方案，其中该方案在对于引物和探针退火以及延伸步骤均最佳的共同温度下组合退火和延长步骤。在一些实施方式中，实施3步方案，其中进行变性步骤、退火步骤和延长步骤。

在一些实施方式中，本文公开的组合物可结合实时扩增反应装置应用，例如，BD(Becton Dickinson and Co.，Franklin Lakes，NJ)，the(Becton Dickinson and Co.，Franklin Lakes，NJ)，VIPER(Becton Dickinsonand Co.，Franklin Lakes，NJ)，(Cepheid，Sunnyvale，CA)，ABI PRISM(Applied Biosystems，福斯特市，CA)，ROTOR-GENE^TM(Corbett Research，悉尼，澳大利亚)，(Roche DiagnosticsCorp，印第安纳波利斯，IN)，(BioRad Laboratories，Hercules，CA)，(Stratagene，La Jolla，CA)，CFX96^TM实时PCR系统(Bio-RadLaboratories Inc)及类似装置。

等温扩增

在一些实施方式中，本文公开的组合物可用于包括等温扩增核酸的方法。等温扩增条件可在时间以及温度方面不同，这取决于变量如方法、酶、模板和所用一种或多种引物。可在等温条件下进行的扩增方法的实例包括但不限于，一些版本的LAMP、SDA及类似方法。

等温扩增可包括任选的变性步骤，然后其中核酸进行扩增的等温温育。在一些实施方式中，等温温育在无初始变性步骤的情况下进行。在一些实施方式中，等温温育在至少约25℃下进行，例如约25℃、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、或75℃，包括任意所示值之间的范围。在一些实施方式中，等温温育在约37℃下进行。在一些实施方式中，等温温育在约64℃下进行。在一些实施方式中，等温温育进行180分钟或更少，例如约180、165、150、135、120、105、90、75、60、45、30或15分钟，包括所示值中任意两个之间的范围。

原位杂交

在一些实施方式中，提供原位杂交的方法。可如本文或其部分所述对样品进行原位杂交。在一些实施方式中，可利用原位杂交确定核酸目标序列的定位——例如在胞内、在细胞群之间、在组织或器官内、和/或在整个生物体内。在一些实施方式中，利用原位杂交来定量样品中目标核酸的拷贝数。在一些实施方式中，本文描述的探针可用于原位杂交。在一些实施方式中，探针可包括基本上由SEQ IDNO：2或其变体和/或子序列组成的寡核苷酸。在一些实施方式中，探针可包括这样的寡核苷酸：包括SEQ ID NO：3-6中的一种或其变体和/或子序列或基本上由SEQ ID NO：3-6中的一种或其变体和/或子序列组成。

主混合物

在一些实施方式中，提供主混合物。主混合物可包括至少两种用于分析的反应剂，该至少两种反应剂以与NAT分析中反应剂的相对浓度成比例的相对浓度被提供。因此，可将单一量的主混合物加入反应，以提供适当相对浓度的两种或更多种反应剂。在一些实施方式中，主混合物可包括下列中的至少两种：聚合酶、缓冲液、盐——例如镁离子、三磷酸核苷、引物对和水。在一些实施方式中，可以高于反应所用的浓度提供主混合物。在一些实施方式中，主混合物以冻干形式提供，并且在高于反应所用的浓度下重构。在一些实施方式中，主混合物包括至少约2x反应浓度的浓度下的反应剂，例如2x、2.5x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、40x、50x、100x、200x、250x、或500x。

试剂盒

在一些实施方式中，提供试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括下列中的一种或多种：引物对、一种探针、模板多核苷酸——例如定量NAT内部对照模板序列、聚合酶、缓冲液、一种或多种核苷酸(例如，dNTP混合物)、说明书或包装。在一些实施方式中，试剂盒的至少一种反应剂被提供在主混合物中。

在一些实施方式中，内部对照模板、至少一种用于扩增内部对照模板的引物对、和至少一种与引物对扩增子杂交的探针与目标多核苷酸的至少一种引物对和至少一种探针一起被提供。

在一些实施方式中，试剂盒的内部对照序列包括多核苷酸模板，其包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、或SEQ IDNO：13中的至少一种。

在一些实施方式中，试剂盒包括至少一种本文描述的引物，例如包括SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6中的一种的寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒包括至少一种本文描述的引物对，例如引物对1和/或引物对5。

在一些实施方式中，试剂盒包括至少一种本文描述的探针，例如包括SEQ IDNO：2或16的寡核苷酸探针。

在一些实施方式中，试剂盒包括下列中的至少一种：反向转录酶；RNA酶，例如RNA酶H；或RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶或类似物。

实例1：具有灵敏性、稳健性和再现性的定量PCR[为何先安排前瞻性实施例？]

为评估本文公开的组合物作为对照/标准序列的灵敏性、稳健性和再现性，进行一系列聚合酶链式反应扩增反应。

各反应包括已知拷贝数的模板质粒、具有SEQ ID NO：2(或SEQ ID NO：16，在图4D所示分析的情况下)序列的TAQMAN^TM(Life Technologies)探针、和引物对1或引物对5中的一种。在图3A、3B、4A、4B、4C和4D所示的分析中，模板是具有SEQ ID NO：8序列的质粒。在图5所示分析中，模板是具有SEQ IDNO：15序列的线性化质粒。反应用5拷贝的模板、50拷贝的模板、和500拷贝的模板进行，并且进行四次重复。实时PCR利用CFX96^TM实时PCR系统(Bio-RadLaboratories Inc)在光学96孔反应板中进行。热循环特征为：95℃，15min(1循环)；95℃，15sec，60℃，1min(50个循环)。PCR反应条件为：Tris pH 8.0(70mM)、NaOH 5.0mM、反向引物0.60uM、正向引物0.60uM、Dros.MAX探针(0.40uM)(注：使用4个不同的探针组，如本文所述)、MgCl₂(3.5mM)、dATP(0.05mM)、dCTP(0.05mM)、dGTP(0.05mM)、dTTP(0.05mM)、HGS聚合酶(2.7单位)。对于每一个数量的模板，以相对荧光单位测量各循环结束时的产物量，并且确定检测产物的阈值水平(如通过荧光探针杂交测量)所需的循环数(Cq)。Cq的阈值水平被设置在500RFU。

图3A、3B、4A、4B、4C和4D示例这些分析的结果。即使仅具有5拷贝的质粒反应也获得了高度再现性结果。如图3A所示，每次重复的模板拷贝数相对于Cq绘制的标准曲线具有0.993的R²值。

图4A、4C和4D所示的扩增曲线证明引物对5的高灵敏度和再现性，并且图4B证明对于200、50、25和5拷贝的质粒/PCR反应的定量PCR反应而言引物对1的高灵敏度和再现性。图4A、4B和4C表示每个分析使用不同探针组(图4A＝第1组；图4B＝第2组，图4C＝第3组)并且具有SEQ ID NO：2序列(即，在探针5’端上单一“T”)的探针的结果，而图4D表示使用具有SEQ ID NO：16序列(即在探针5’端上“TT”，双t)的探针的分析的结果。图4D的结果证明，系统具有高灵敏度和再现性——即使使用变体探针(注意，SEQ ID NO：16的探针不完全与SEQ ID NO：8模板的探针结合序列互补，因为探针5’端的T对应于SEQ IDNO：16等同链上的“C”)。如图4B所示，具有5拷贝的模板(参考编号1)，50拷贝的模板(参考编号2)和500拷贝的模板(参考编号3)的反应的检测阈和扩增速率是可再现的和灵敏的。

实例2：定量扩增反应

收集细胞样品。自细胞样品分离RNA。将分离的样品RNA逆转录，从而生成样品cDNAs。通过添加稀释剂，将冻干的主混合物——其包括聚合酶、缓冲液、镁离子和三磷酸核苷——重构至2×浓度。等份的主混合物和液体在薄壁塑料分析管中混合，该液体包括：2×浓度的样品cDNA(或阴性对照或阳性对照)；扩增病毒RNA标记物的引物、测量病毒标记物扩增量的SCORPION^TM探针和内部对照核酸。

每个分析测试管中存在内部对照，以监测PCR反应剂完整性和检测PCR抑制剂的存在。两个外部对照也如下进行：一个阴性对照——除了无模板DNA包含全部反应剂；和一个阳性对照——已知包含目标基因的样品，作为样品进行处理，但运行充当对照。全部对照在相同扩增反应中利用相同反应剂同时进行。内部对照利用包括具有核酸序列SEQ ID NO：8的质粒的模板进行。内部对照包括引物对，该引物对包括第一寡核苷酸引物——其具有SEQ ID NO：3的序列，和第二寡核苷酸引物——其具有SEQ ID NO：4的序列。引物对将扩增SEQ ID NO：6的子序列，生成具有SEQ ID NO：7序列的多核苷酸产物。内部对照包括具有SEQ ID NO：2序列的SCORPION^TM探针。

反应混合物是下列的典型组合：模板核酸、浓度各在0.4μM左右的寡核苷酸引物、0.35μM左右的探针、酶的适当缓冲液、盐(在本实例中MgCl₂)以及当然0.06U/rx左右的最小浓度的聚合酶。FastStart Taq DNA聚合酶用作聚合酶。还向反应混合物加入浓度各在0.15mM左右的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)(dTTP、dATP、dGTP和dCTP)，以及0.15mg/mL左右的牛血清白蛋白(BSA)。BSA是任选的，并且可有助于反应进行——即使存在PCR抑制剂。

允许引物延伸和目标DNA扩增的循环条件包括变性步骤、退火步骤和聚合步骤。第一步骤是在95℃下15分钟初始变性步骤。然后是95℃下1秒短变性步骤、60℃下9秒退火步骤和72℃下10秒延长步骤。此循环重复45次。还有在结束时最终72℃下10分钟延长步骤，以确保酶完成每个单链DNA延伸。

在每个扩增循环后，通过内部对照SCORPION^TM探针的荧光团发出的荧光强度(以相对荧光度单位表示)的强度，测量内部对照多核苷酸产物量。

Claims

1.分离的核酸，其与由与SEQ ID NO：1的序列或其反向互补序列具有至少97％同一性的序列组成的核酸杂交，其中所述分离的核酸在至少约50℃的温度下、在50mM KCl、10mM Tris-HCl缓冲液中杂交。

2.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸在至少约55℃的温度下杂交。

3.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸包括与SEQ ID NOs：1-6中的至少一种或其反向互补序列具有至少约85％互补性的序列。

4.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸包括与SEQ ID NOs：1-6中的至少一种或其反向互补序列具有至少约95％互补性的序列。

5.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸包括SEQ ID NOs：1-6中的至少一种的序列或其反向互补序列。

6.试剂盒，包括：

用于核酸扩增的分离的核酸模板，包括与SEQ ID NO：1或其反向互补序列具有至少约97％同一性的序列；

至少第一引物，包括与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中的至少一种具有至少约85％同一性的寡核苷酸；

至少第二引物，包括与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中的至少一种具有至少约85％同一性的寡核苷酸。

7.权利要求6所述的试剂盒，其中所述的分离的核酸模板包括SEQ ID NO：1的序列或其反向互补序列。

8.权利要求6所述的试剂盒，其中所述的分离的核酸模板包括SEQ ID NO：8的序列或其反向互补序列。

9.权利要求6所述的试剂盒，其中所述第一引物包括与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中的至少一种具有至少约95％同一性的寡核苷酸。

10.权利要求6所述的试剂盒，其中所述第二引物包括与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中的至少一种具有至少约95％同一性的寡核苷酸。

11.权利要求6所述的试剂盒，其中所述第一引物包括包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中的至少一种的寡核苷酸。

12.权利要求6所述的试剂盒，其中所述第二引物包括包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中的至少一种的寡核苷酸。

13.权利要求6所述的试剂盒，进一步包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括与SEQ ID NO：2或其反向互补序列具有至少约95％同一性的序列。

14.权利要求6所述的试剂盒，其中所述第一引物包括包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸，并且所述第二引物包括SEQ ID NO：4的寡核苷酸，或其中所述第一引物包括包含SEQ ID NO：5的寡核苷酸，并且所述第二引物包括SEQ ID NO：6的寡核苷酸。

15.权利要求6所述的试剂盒，

其中所述的分离的核酸模板包括SEQ ID NO：1的序列或其反向互补序列，并且

其中所述第一引物包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列，并且所述第二引物包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列，并且

进一步包括至少一种探针，其中所述至少一种探针包括包含SEQ ID NO：2的序列的寡核苷酸。

16.定量样品中的核酸量的方法，所述方法包括：

提供一定量的多核苷酸，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO：1的序列具有至少约97％同一性的序列；

使所述多核苷酸接触正向引物，其中所述正向引物包括与SEQ ID NO：3或5中的一种具有至少约85％同一性的寡核苷酸，并且其中所述反向引物包括与SEQID NO；4或6中的一种具有至少约85％同一性的寡核苷酸，并且其中所述接触在标准PCR条件下发生；

延伸所述正向引物和反向引物，从而生成至少一种目标扩增子；

检测与所述至少一种目标扩增子的数量成比例的信号。

17.权利要求16所述的方法，其中所述正向引物与SEQ ID NO：3或5中的至少一种具有至少约95％同一性。

18.权利要求16所述的方法，其中所述反向引物与SEQ ID NO：4或6中的至少一种具有至少约95％同一性。

19.权利要求16所述的方法，其中所述正向引物包括具有序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸，并且所述反向引物包括具有序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸。

20.权利要求16所述的方法，其中所述正向引物包括具有序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸，并且所述反向引物包括具有序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸。

21.权利要求16所述的方法，其中检测与扩增子的提供量成比例的信号包括使所述扩增子与单链寡核苷酸探针接触，所述单链寡核苷酸探针在标准PCR条件下、在至少50℃的温度下与所述扩增子退火，其中所述探针被配置以在其结合于基本上互补的核酸时发出可检测信号，但在其为单链时不发出所述可检测信号。

22.权利要求21所述的方法，其中所述单链寡核苷酸探针包括与SEQ ID NO：2具有至少约95％同一性的序列，或其反向互补序列。

23.权利要求22或22所述的方法，其中所述单链寡核苷酸探针进一步包括至少一种荧光团和至少一种猝灭剂。

24.权利要求16所述的方法，进一步包括，在从生物学样品提取核酸前，使所述量的多核苷酸接触样品。

25.权利要求16所述的方法，其中延伸所述正向引物和反向引物包括下列中的至少一种：聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、连接酶链式反应(LCR)、免疫扩增、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)和滚环扩增。