JP5590438B2 - 内部コントロール組成物 - Google Patents
内部コントロール組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5590438B2 JP5590438B2 JP2010018120A JP2010018120A JP5590438B2 JP 5590438 B2 JP5590438 B2 JP 5590438B2 JP 2010018120 A JP2010018120 A JP 2010018120A JP 2010018120 A JP2010018120 A JP 2010018120A JP 5590438 B2 JP5590438 B2 JP 5590438B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- internal control
- amplification
- target gene
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
(1)標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用される内部コントロール組成物であって、前記組成物が、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対を含み、前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が、前記標的遺伝子が由来する生物の属する界とは異なる界に属する生物の遺伝子の塩基配列であること、及び前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が植物のmatK遺伝子の塩基配列であることを特徴とする内部コントロール組成物。
(2)核酸の増幅反応がPCR法又はRT−PCR法に基づくものであることを特徴とする(1)に記載の内部コントロール組成物。
(3)内部コントロール核酸の塩基配列のGC含量が10〜50%であることを特徴とする(1)又は(2)に記載の内部コントロール組成物。
(4)前記標的遺伝子が由来する生物が細菌又は動物であることを特徴とする(1)〜(3)のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
(5)内部コントロール組成物が、増幅された内部コントロール核酸を検出するための蛍光標識プローブをさらに含み、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする(1)〜(4)のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
(6)標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断する方法であって、(1)〜(5)のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物を、標的遺伝子の核酸、前記標的遺伝子の核酸を増幅するためのプライマー対、及び核酸の増幅のために必要な試薬と共に核酸の増幅反応に供し、内部コントロール核酸が増幅されたかどうかを確認し、内部コントロール核酸が増幅された場合は、増幅反応が正しく行われたと判断し、内部コントロール核酸が増幅されなかった場合は、増幅反応が正しく行われなかったと判断することを特徴とする方法。
(7)内部コントロール核酸の増幅の確認が、増幅された内部コントロール核酸を蛍光標識プローブで検出することによって行われ、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする(6)に記載の方法。
本発明の内部コントロール組成物は、標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用されるものであり、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対として、標的遺伝子とは系統分類学的に全く異なる生物のものを使用することを特徴とする。
(i)Tbr,Tfl,Tru,Tth,T1i,Tac,Tne,Tma,Tih、Tfi,Pfu,Pfutubo,Pyrobest(登録商標),Pwo,KOD,Bst,Sac,Sso,Poc,Pab,Mth,Pho,ES4,VENTおよびDEEPVENTからなる群。
(ii)(i)で示される群のDNAポリメラーゼの変異体であり、かつ、DNAポリメラーゼ活性を有する変異体。
(1)内部コントロール核酸の調製
内部コントロールの標的核酸領域としては、配列番号1に示されるLagarosiphon madagascariensis(水草、有茎草に分類、分布は主にマダガスカル)のmatK遺伝子の配列の一部を選択した。この塩基配列を大腸菌系プラスミドベクター(pUC18)に連結してプラスミドDNAを構築した。次に、このプラスミドDNAを、大腸菌DH5αに導入して形質転換株を作成し、アンピシリン存在下で培養して増殖させた。形質転換株からMagExtractor(商標登録)によりプラスミドを抽出した。エタノール沈殿法によって得られた沈殿をトリス緩衝液で溶解し、内部コントロール核酸を調製した。
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号2〜12に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ2〜12と示す)を合成した。合成は、マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護は、アンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製は、パーキンエルマー社OPCカラムにて実施するか、もしくはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン(株)、オペロンバイオテクノロジー(株)など)に依頼した。オリゴ2〜8がプライマーであり、オリゴ9〜12がプローブである。オリゴ9は、3’末端がCR6Gにより標識されている。オリゴ10は、3’末端がBODIPY(商標登録)−FLにより標識されており、オリゴ11、12は、5’末端がBODIPY(商標登録)−FLにより標識されている。
(1)標的遺伝子の試料の調製
M.bovis BCG(ヒト型結核菌)株を小川培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてDNAを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
標的遺伝子の試料(ヒト型結核菌群抽出DNA)および陰性コントロールを使用して下記試薬を調製し、下記条件により核酸増幅および融解曲線解析を行い、ヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には、ロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは、530nm及び610nmを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。調製した反応液は、ガラスキャピラリーに充填した。その後の操作は、ライトサイクラーの取り扱い説明書にしたがって実施した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ2 150nM、
オリゴ3 750nM、
オリゴ4 250nM、
オリゴ5 1500nM、
オリゴ9 100nM
オリゴ10 250nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.3U、
ジメチルスルホキシド 7.5%
標的遺伝子の試料又は陰性コントロール 20ng
内部コントロール核酸 10ng
94℃・2分
(i)98℃・0秒、
(ii)60℃・5秒、((i)及び(ii)を50サイクル)
94℃・1分、
40℃・1分、
40℃〜75℃(0.5℃/秒で温度上昇)。
ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した。図1に530nmの解析結果を、図2に610nmの解析結果を示す。図1より明らかなように、ヒト型結核菌のDNAを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、陰性コントロール(NC)の場合は検出ピークが認められなかった。図2ではヒト型結核菌のDNAを試料とした場合に加え、陰性コントロール(NC)を試料とした場合にも明瞭な検出ピークが得られた。これは内部コントロールの検出が同時に行なわれ、PCRによる核酸増幅の成功を確認できたことを示す。また、核酸増幅検出反応は1時間以内の時間で解析可能であるため、極めて短時間で内部コントロールの検出を含めた標的遺伝子の検出が可能であった。
(1)標的遺伝子の試料の調製
Mycobacterium avium(トリ型結核菌)を7H11寒天培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてDNAを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
標的遺伝子の試料(トリ結核菌群抽出DNA)および陰性コントロールを使用して、実施例2と同様にしてトリ結核菌を検出した。ただし、オリゴ4,5,10の代わりにオリゴ6,7,11をそれぞれ使用した。
ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した。図3に530nmの解析結果を、図4に610nmの解析結果を示す。図3より明らかなように、トリ型結核菌のDNAを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、陰性コントロール(NC)の場合は検出ピークが認められなかった。図4ではトリ型結核菌のDNAを試料とした場合に加え、陰性コントロール(NC)を試料とした場合にも明瞭な検出ピークが得られた。これは内部コントロールの検出が同時に行なわれ、PCRによる核酸増幅の成功を確認できたことを示す。
(1)標的遺伝子の試料の調製
Mycobacterium kansasii(カンサシイ)を7H11寒天培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてDNAを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
標的遺伝子の試料(カンサシイ抽出DNA)および陰性コントロールを使用して、実施例2と同様にしてカンサシイを検出した。ただし、オリゴ4 250nMの代わりにオリゴ8 1500nMを、オリゴ5 1500nMの代わりにオリゴ7 500nMを、オリゴ10 250nMの代わりにオリゴ12 250nMを使用した。
ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した。図5に530nmの解析結果を、図6に610nmの解析結果を示す。図5より明らかなように、カンサシイのDNAを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、陰性コントロール(NC)の場合は検出ピークが認められなかった。図6ではカンサシイのDNAを試料とした場合に加え、陰性コントロール(NC)を試料とした場合にも明瞭な検出ピークが得られた。これは内部コントロールの検出が同時に行なわれ、PCRによる核酸増幅の成功を確認できたことを示す。
(1)標的遺伝子の試料の調製
トリ型結核菌を小川培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてDNAを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
標的遺伝子の試料(トリ結核菌群抽出DNA)および陰性コントロールを使用して、実施例3と同様にしてトリ型結核菌を検出した。ただし、標的遺伝子の試料又は陰性コントロールの量を10ngに変更し、PCR阻害物質として、エタノールを1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、又は16%添加した。
ライトサイクラーソフトウェアの解析により解析を実施し、530nm及び610nmの検出ピークの有り無しで結果を判定した。表1に判定結果を示す。検出ピークが確認できた時は「+」、確認できない時は「−」で表示した。判定結果から、エタノール添加量を増やしていくと内部コントロールの検出系の検出ピークが先に消失することがわかった。プライマー量の調節により、内部コントロールの検出系がトリ型結核菌の検出系よりも増幅効率が低くなっており、内部コントロールとして正常に機能していることがわかった。
Claims (7)
- 標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用される内部コントロール組成物であって、前記組成物が、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対を含み、前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が、前記標的遺伝子が由来する生物の属する界とは異なる界に属する生物の遺伝子の塩基配列であること、及び前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が植物のmatK遺伝子の塩基配列であることを特徴とする内部コントロール組成物。
- 核酸の増幅反応がPCR法又はRT−PCR法に基づくものであることを特徴とする請求項1に記載の内部コントロール組成物。
- 内部コントロール核酸の塩基配列のGC含量が10〜50%であることを特徴とする請求項1又は2に記載の内部コントロール組成物。
- 前記標的遺伝子が由来する生物が細菌又は動物であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
- 内部コントロール組成物が、増幅された内部コントロール核酸を検出するための蛍光標識プローブをさらに含み、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
- 標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断する方法であって、請求項1〜5のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物を、標的遺伝子の核酸、前記標的遺伝子の核酸を増幅するためのプライマー対、及び核酸の増幅のために必要な試薬と共に核酸の増幅反応に供し、内部コントロール核酸が増幅されたかどうかを確認し、内部コントロール核酸が増幅された場合は、増幅反応が正しく行われたと判断し、内部コントロール核酸が増幅されなかった場合は、増幅反応が正しく行われなかったと判断することを特徴とする方法。
- 内部コントロール核酸の増幅の確認が、増幅された内部コントロール核酸を蛍光標識プローブで検出することによって行われ、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010018120A JP5590438B2 (ja) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | 内部コントロール組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010018120A JP5590438B2 (ja) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | 内部コントロール組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011155855A JP2011155855A (ja) | 2011-08-18 |
JP5590438B2 true JP5590438B2 (ja) | 2014-09-17 |
Family
ID=44588429
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010018120A Active JP5590438B2 (ja) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | 内部コントロール組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5590438B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6270814B2 (ja) * | 2012-03-29 | 2018-01-31 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company | 核酸増幅のための核酸 |
JP6379871B2 (ja) * | 2014-08-29 | 2018-08-29 | 東洋紡株式会社 | リファンピシリン耐性結核菌を検出する方法 |
WO2019163064A1 (ja) * | 2018-02-22 | 2019-08-29 | 学校法人 慶應義塾 | Pcr成否判定法 |
JP2021048785A (ja) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | 内部コントロール核酸、内部コントロールキット及び核酸検出方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1602736A1 (en) * | 2004-06-04 | 2005-12-07 | Bio-Rad Pasteur | HIV type and subtype detection |
DK1922415T3 (en) * | 2005-09-05 | 2014-03-10 | Bio Rad Innovations | USE OF BOTH RD9 AND IS6110 AS nucleic acid targets FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS, AND PROVISION OF MULTIPLEX-SUITABLE IS6110 AND RD9 TARGETS |
-
2010
- 2010-01-29 JP JP2010018120A patent/JP5590438B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011155855A (ja) | 2011-08-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020294316B2 (en) | Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification | |
ES2743050T3 (es) | Composiciones y procedimientos para cuantificar una secuencia de ácido nucleico en una muestra | |
JP6638122B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
CA2856663A1 (en) | Method for the detection of nucleic acid synthesis and/or amplification | |
JP6959257B2 (ja) | マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出するための組成物と方法 | |
Prada-Arismendy et al. | Real time PCR. Application in dengue studies | |
CA2733186A1 (en) | Detection algorithm for pcr assay | |
JP4249186B2 (ja) | 核酸の増幅方法 | |
JP5590438B2 (ja) | 内部コントロール組成物 | |
KR102030244B1 (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
JP6007652B2 (ja) | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 | |
JP2011050401A (ja) | 核酸の迅速な検出方法 | |
ES2644949T3 (es) | Oligonucleótidos para controlar la amplificación de ácidos nucleicos | |
KR102323375B1 (ko) | 다중 프로브 | |
JP2005328709A (ja) | 高速dnaポリメラーゼを用いた高速pcr | |
US20230031670A1 (en) | Method and kit for detection of polynucleotide | |
JP2013070639A (ja) | C型慢性肝炎に対する治療効果を予測するためのプローブ | |
JP2006061134A (ja) | 結核菌検出のためのプライマーおよび検出同定法 | |
CN108291252B (zh) | 稳定特定rna的通用方法 | |
CN112608913B (zh) | 一种基于C2c2的基因表达调控系统及其应用 | |
US20230242978A1 (en) | mecA GENE AMPLIFICATION PRIMER PAIR, mecA GENE DETECTION KIT AND mecA GENE DETECTION METHOD | |
RU2703803C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 101 и способ определения бактерий Francisella tularensis (варианты) | |
JP2012040004A (ja) | 合成siRNA検出方法 | |
JP6182844B2 (ja) | クラミジアトラコマチスの検出方法 | |
JP6343899B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌の検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121220 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140513 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140606 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140704 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140717 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5590438 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |