JP6182844B2 - クラミジアトラコマチスの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたクラミジアトラコマチスの検出方法に関する。

クラミジアトラコマチスは主に性器クラミジア感染症の原因菌であり、男性では尿道炎と精巣上体炎を、女性では子宮頸管炎と骨盤内炎症性疾患を発症する。これらの疾患は性行為により感染、伝播する。また、最近では咽頭感染も増えている（非特許文献１）。

クラミジアトラコマチスは細胞内寄生性の病原体であり、分離培養には培養細胞が必要とされる。しかし培養検査は困難を伴い、一般的な検査室では実施されない。

その他の検査法としては抗原抗体反応を利用する方法や核酸増幅法が挙げられる。しかし抗原抗体法については感度が劣ることが指摘されている。

現在はクラミジアトラコマチスの検査法としては核酸増幅法が主流になっており、日本国内で体外診断薬として販売されている。代表的なものとしてはＰＣＲを用いたアンプリコアＳＴＤ−１（登録商標、ロシュダイアグノスティックス製）、ＳＤＡ法を用いたＢＤプローブテック・クラミジア／ゴノレア（登録商標、日本ベクトン・ディッキンソン製）、ＴＭＡ法を用いたアプティマＣｏｍｂｏ２・クラミジア／ゴノレア（登録商標、富士レビオ製）がある（非特許文献１）。

上記の核酸増幅法はいずれも感度特異度とも優れた検査法であると言われている。しかし、いずれにも検査時間が数時間以上かかるという問題点がある。また、もう一つの問題点として検査費用が比較的高額であることが指摘されている。比較的高額と言われる理由の一つとして、上記の既存検査法は複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、あるいは複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用することが挙げられる。

核酸増幅法によるクラミジアトラコマチス検査法の中には、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ）を核酸増幅および検出ターゲットとするものがある。しかしスウェーデンで発見された変異株は内在性プラスミドのうち、アンプリコアＳＴＤ−１によって増幅される領域を含む部分領域を欠損しており、一部の核酸増幅法はこの領域をターゲットとしていたため、該変異株を検出できないという問題点も指摘されている（非特許文献２）。

日本性感染症学会誌 第２２巻 第１号 Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｉｐａ Ｔ. ａｎｄ Ｎｉｌｓｏｎ ＰＡ. （２００７）Ｓｅｘ Ｔｒａｎｓｍ Ｄｉｓ. ３４, ２５５−２５６

臨床現場においては、より迅速・正確かつ安価にクラミジアトラコマチスを検出できる核酸増幅法ならびに該核酸増幅法に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、そして上記方法を実施するためのキットが望まれていた。

本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミド領域を特異的に増幅する１対のオリゴヌクレオチドプライマー、および、該オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法によって増幅される領域を特異的に検出する１種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、従来技術よりも迅速・正確かつ安価にクラミジアトラコマチスを検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。

[項１]
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項２]
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号４で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項３]
項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号９〜１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項４]
項２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号１２〜１４で示されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項５]
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号５で示される塩基配列の中の連続する２５〜３０塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項６]
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号６で示される塩基配列の中の連続する２４〜２９塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項７]
項５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号１５〜１７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項８]
項６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号１８〜２０で示されるオリゴヌクレオチドプライマー。
[項９]
項１または項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのうちいずれか１本をフォワードプライマーとし、項５または項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのうちいずれか１本をリバースプライマーとする、１対のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
[項１０]
項２または項４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのうちいずれか１本をフォワードプライマーとし、項６または項８に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのうちいずれか１本をリバースプライマーとする、１対のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
[項１１]
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号７で示される塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。
[項１２]
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号８で示される塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。
[項１３]
項１１に記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、塩基配列が配列番号２１または２２で示され、なおかつ末端の核酸のうちいずれか片方のみが蛍光標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ。
[項１４]
項１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、塩基配列が配列番号２３または２４で示され、なおかつ末端の核酸のうちいずれか片方のみが蛍光標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ。
[項１５]
クラミジアトラコマチスを検出する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）項９に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、項１１または項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブのうちいずれか１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
[項１６]
クラミジアトラコマチスを検出する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）項１０に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、項１２または項１４に記載のオリゴヌクレオチドプローブのうちいずれか１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
[項１７]
項１５または項１６の（３）の工程を、連続的な温度上昇を行いながら、オリゴヌクレオチドプローブを標識している蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいてクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの存在を検出することを特徴とする、項１５または項１６に記載の方法。
[項１８]
項９に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット、項１１または項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブのうちいずれか１本、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウムイオン、ｄＮＴＰｓ、ＤＭＳＯを含む、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの検出を行う方法のためのキット。
[項１９]
項１０に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット、項１２または項１４に記載のオリゴヌクレオチドプローブのうちいずれか１本、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウムイオン、ｄＮＴＰｓ、ＤＭＳＯを含む、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの検出を行う方法のためのキット。

本発明によれば、クラミジアトラコマチスの検出を迅速、正確、安価に行うことができる。

実施例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。

本発明はクラミジアトラコマチスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）およびオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いてクラミジアトラコマチスを検出する方法、該方法を実施するためのキットに係る。

本発明ではクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの部分領域を検出対象としている。クラミジアトラコマチス内在性プラスミドの部分領域の塩基配列を配列番号１に示す。また、配列番号１の相補的塩基配列を配列番号２に示す。

［１］本発明のオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の実施形態の一つは、以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
（Ｉ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
（ＩＩ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号４で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
（ＩＩＩ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号５で示される塩基配列の中の連続する２５〜３０塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
（ＩＶ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号６で示される塩基配列の中の連続する２４〜２９塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。

上記配列番号３〜６のうち、配列番号３および４は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。また、配列番号５および６は配列番号２で示される塩基配列の一部分である。

上記（Ｉ）〜（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドプライマーのうち、（Ｉ）および（ＩＩ）はフォワードプライマー、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）はリバースプライマーとして用いられる。これらのオリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ単独で用いることを制限されるものではないが、（Ｉ）をフォワードプライマーとする場合は（ＩＩＩ）をリバースプライマーとするオリゴヌクレオチドプライマーセットとして用いることが好ましい。また、（ＩＩ）をフォワードプライマーとする場合は（ＩＶ）をリバースプライマーとして用いることが好ましい。

上記（Ｉ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。該オリゴヌクレオチドプライマーとして、配列番号９〜１１が例示できる。

上記（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号４で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。該オリゴヌクレオチドプライマーとして、配列番号１２〜１４が例示できる。

上記（ＩＩＩ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号５で示される塩基配列の中の連続する２５〜３０塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。該オリゴヌクレオチドプライマーとして、配列番号１５〜１７が例示できる。

上記（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号６で示される塩基配列の中の連続する２４〜２９塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。該オリゴヌクレオチドプライマーとして、配列番号１８〜２０が例示できる。

上記（Ｉ）〜（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドプライマーは全て非特許文献２に記載されているスウェーデンで発見された変異株の内在性プラスミドに対してもアニーリング可能な塩基配列であることをデータベースで確認している。従って、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、一部の核酸増幅法で問題となっていた変異株の核酸も増幅させることができる。

［２］本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
本発明の実施形態の一つは、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載されるオリゴヌクレオチドプローブである。
（Ａ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号７で示される塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｂ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号８で示される塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。

上記配列番号７および８は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。配列番号７および８の塩基配列はクラミジアトラコマチスに特異的であり、現在塩基配列が明らかになっている他のクラミジア属とは２塩基以上異なる塩基配列を選択している。従って、配列番号７または８で示される塩基配列の一部または全部をオリゴヌクレオチドプローブとすることで、クラミジアトラコマチスのみを特異的に検出することが可能である。

上記（Ａ）のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号７で示される塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプローブであれば特に制限されない。該オリゴヌクレオチドプローブとして、配列番号２１または２２が例示できる。

上記（Ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号８で示される塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプローブであれば特に制限されない。該オリゴヌクレオチドプローブとして、配列番号２３または２４が例示できる。

上記（Ａ）および（Ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブは核酸が標識されていてもされていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸が標識されている形態であり、より好ましくは末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光物質であることがより好ましい。蛍光標識としては特に標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質が好ましく、具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が例示できる。

上記（Ａ）（Ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブは全て非特許文献２に記載されているスウェーデンで発見された変異株の内在性プラスミドに対しても結合可能な塩基配列であることをデータベースで確認している。従って、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、一部の核酸増幅法で問題となっていた変異株の核酸を検出できる。また、前述したオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせることで、該変異株の核酸増幅および検出を連続的に行うことが可能である。

［３−（１）］本発明のクラミジアトラコマチス検出方法
本発明のクラミジアトラコマチスの検出方法において、試料中のクラミジアトラコマチス由来の核酸を検出する方法としては、以下の（１）〜（３）の工程を例示することができる。
（１）上記で説明したオリゴヌクレオチドプライマーセットのうちいずれか１セットを用いて核酸増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうちいずれか１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。

上記方法は、以下の（１）〜（４）に示す工程であっても良い。
（１）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを用意する。
（２）被検核酸および該オリゴヌクレオチドプライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する。

上記で示したプライマーセットとプローブセットの組み合わせは、上記で説明した範囲内であれば、原則、任意であるが、好ましくは、以下の組み合わせである。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるフォワードプライマー（たとえば、配列番号９〜１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー）と、配列番号５で示される塩基配列の中の連続する２５〜３０塩基からなる群から選択されるリバースプライマー（たとえば、配列番号１５〜１７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー）とからなる一対のプライマーセット、および、配列番号７で示される塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基からなる群から選択されるプローブの組み合わせ。
（ｂ）配列番号４で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるフォワードプライマー（たとえば、配列番号１２〜１４で示されるオリゴヌクレオチドプライマー）と、配列番号６で示される塩基配列の中の連続する２４〜２９塩基からなる群から選択されるリバースプライマー（たとえば、配列番号１８〜２０で示されるオリゴヌクレオチドプライマー）とからなる一対のプライマーセット、および、配列番号８で示される塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列の中の連続する２１〜２４塩基からなる群から選択されるプローブの組み合わせ。

上記の組み合わせ以外では、プライマーとプローブが重複する場合があるが、そのような場合でも、プライマー対を用いて増幅した後、二重鎖を解離させて、プローブとハイブリダイズさせ複合体を形成するので、理論的には問題ない。しかし、そのような場合は、それぞれの濃度など試薬組成の設定によっては、プライマーとプローブが鋳型に対して競合する可能性があるので、上記（ａ）または（ｂ）の組み合わせを選択することが好ましい。

さらに、後述の実施例からも明らかなように、（ｂ）の方が融解曲線分析におけるシグナルの微分値が相対的に高く、より好ましい。

なお、後述の実施例では、上記（ａ）または（ｂ）の組み合わせすべてについて実験を行ってはいない。しかし、以下の理由により、実験を行っていないプライマーセットにおいても、上記と同様の良好な結果を得られることが強く示唆される。
例えば、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるフォワードプライマーに関して、配列番号３の中で５’末端側および３’末端側から各７塩基を除いた１５塩基はいずれのフォワードプライマーにも含まれており、部分的な塩基配列の同一性はいずれのフォワードプライマーでも連続して保たれている。同様に、配列番号５で示される塩基配列の中の連続する２５〜３０塩基からなる群から選択されるリバースプライマーに関して、配列番号５の中で５’末端側および３’末端側から各５塩基を除いた２０塩基の同一性はいずれのリバースプライマーでも連続して保たれている。配列番号４で示される塩基配列の中の連続する２２〜２９塩基からなる群から選択されるフォワードプライマー、および、配列番号６で示される塩基配列の中の連続する２４〜２９塩基からなる群から選択されるリバースプライマーについても同様である。
このように、各プライマー群の中では、若干の長さの相違があるものの、いずれも部分的な塩基配列の同一性が保たれており、これによってターゲット部位に対する特異性が維持されている。したがって、上記（ａ）または（ｂ）の範囲内におけるバリエーションは、プライマーとしての機能を大きく変化させるものではないことがわかる。
実施例にて選択された複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、いずれを用いてもクラミジアトラコマチスの検出に成功していることからも、以上の推測が間違っていないことが強く示唆される。

［３−（２）］被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。

前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、クラミジアトラコマチスを寄生させた細胞培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。

前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、生殖器や咽頭をぬぐったスワブ、あるいは該スワブに付着したぬぐい液、尿、うがい液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。

続いて、単離したＤＮＡを鋳型として、上述のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。

本発明のクラミジアトラコマチスの検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。

核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。

本発明プローブが含まれる反応系でクラミジアトラコマチスに含まれるＤＮＡを増幅する場合、核酸増幅工程中に該オリゴヌクレオチドプローブが試料のクラミジアトラコマチスに含まれるＤＮＡ遺伝子またはその増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にクラミジアトラコマチスに含まれるＤＮＡ遺伝子またはその増幅産物と結合した該オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。

Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＤＮＡと結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該オリゴヌクレオチドプローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。

他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。

通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。

さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−が望ましい。

［ＤＮＡ合成活性］
本明細書において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。

その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μＬ、Ｂ液およびＣ液各５μＬおよび滅菌水１０μＬをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μＬを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μＬ、Ｄ液１００μＬを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μＬ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ^〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μＬ キャリアーＤＮＡ

［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本明細書において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μＬの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍＬのエッペンチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μＬ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μＬ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μＬの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。

［３−（３）］クラミジアトラコマチス由来の核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のクラミジアトラコマチスの検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。

核酸増幅産物を含む試料にオリゴヌクレオチドプローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。

［３−（４）］核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。

融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。

本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のクラミジアトラコマチスの検出方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。

標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。

標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。

前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。

本発明のクラミジアトラコマチスの検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。

得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。

前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。

また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。

ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。

そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。

蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。

被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。

具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。

また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

〔実施例１：クラミジアトラコマチス内在性プラスミドの検出〕
（１）試料の調製
クラミジアトラコマチスから抽出したＤＮＡ試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で内在性プラスミドが１００（コピー／μＬ）となるように調製し、試料とした。また、陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。

試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせについては表１に記載した。
１０μＭオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号９〜１１のいずれか１本）０．４μＬ
１００μＭオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５〜１７のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
試料３μＬ

核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）

結果
図１は、表１の組み合わせＮｏ．１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。グラフのうちＣＴ ＤＮＡはクラミジアトラコマチスＤＮＡ試料の解析結果を、ＷａｔｅｒはＮＣである水の解析結果を示している。図１より明らかなように、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドが検出されている。また、図２から図５は、それぞれ表１の組み合わせＮｏ．２から５で示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでもクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドが検出されており、本発明のクラミジアトラコマチス検出用オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはいずれもクラミジアトラコマチスの検出に有効であることが示された。また、本検査における核酸増幅および融解曲線解析は約４５分間で完了した。これは既存のクラミジアトラコマチス核酸増幅検査法と比較して、検査に要する時間が半分以下であり、本発明が迅速性に優れたクラミジアトラコマチス検査法を提供できることが示唆された。

〔実施例２：異なるオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびプローブを用いたクラミジアトラコマチス内在性プラスミドの検出〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。

試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせについては表２に記載した。
１０μＭオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２〜１４のいずれか１本）０．４μＬ
１００μＭオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１８または１９のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
試料３μＬ

核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。

結果
図６は、表２の組み合わせＮｏ．１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図６より明らかなように、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドが検出されている。また、図７から図１１は、それぞれ表２の組み合わせＮｏ．２から６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでもクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドが検出された。

本発明をクラミジアトラコマチス検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度にクラミジアトラコマチスを検出することができる。また、本発明は１対のオリゴヌクレオチドプライマーセットと１本のオリゴヌクレオチドプローブによって実施可能であるため、既存のクラミジアトラコマチス核酸増幅法よりも必要とするオリゴヌクレオチドの本数を抑えることができる。従って、本発明を利用することで既存の核酸増幅法よりも安価に検査を実施することができる。

Claims (8)

1. 以下の（ａ１）および（ａ２）からなるクラミジアトラコマチス検出用のプライマー・プローブのセット
   （ａ１）配列番号９〜１１で示されるオリゴヌクレオチドの群から１つ選択されるフォワードプライマーと配列番号１５〜１７で示されるオリゴヌクレオチドの群から１つ選択されるリバースプライマーとの組合せからなるプライマー対
   （ａ２）配列番号２１で示されるオリゴヌクレオチドプローブ
2. 以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなるクラミジアトラコマチス検出用のプライマー・プローブのセット
   （ｂ１）配列番号１２〜１４で示されるオリゴヌクレオチドの群から１つ選択されるフォワードプライマーと配列番号１８〜２０で示されるオリゴヌクレオチドの群から１つ選択されるリバースプライマーとの組合せからなるプライマー対
   （ｂ２）配列番号２３で示されるオリゴヌクレオチドプローブ
3. 以下の（ｃ１）〜（ｃ３）の工程を含む、クラミジアトラコマチスを検出する方法。
   （ｃ１）請求項１の（ａ１）に記載のプライマー対を用いて核酸増幅を行う工程。
   （ｃ２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、請求項１の（ａ２）に記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
   （ｃ３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
4. 以下の（ｄ１）〜（ｄ３）の工程を含む、クラミジアトラコマチスを検出する方法。
   （ｄ１）請求項２の（ｂ１）に記載のプライマー対を用いて核酸増幅を行う工程。
   （ｄ２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、請求項２の（ｂ２）に記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
   （ｄ３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
5. 請求項３の（ｃ３）の工程を、連続的な温度上昇を行いながら、オリゴヌクレオチドプローブを標識している蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいてクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの存在を検出することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
6. 請求項４の（ｄ３）の工程を、連続的な温度上昇を行いながら、オリゴヌクレオチドプローブを標識している蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいてクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの存在を検出することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
7. 請求項１に記載のプライマー・プローブのセット、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウムイオン、ｄＮＴＰｓ、ＤＭＳＯを含む、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの検出を行う方法のためのキット。
8. 請求項２に記載のプライマー・プローブのセット、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウムイオン、ｄＮＴＰｓ、ＤＭＳＯを含む、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの検出を行う方法のためのキット。