JP6277603B2 - 百日咳菌の検出方法 - Google Patents
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Description
(A)
(1)配列番号1と95%以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の(I)または(II)のいずれか1つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
(I)フォワードプライマーが、配列番号2で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
(II)リバースプライマーが、配列番号3で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
(2)被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
(3)工程(2)によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
(4)工程(3)で得られた複合体を検出する工程。
[2]
[1]に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程(A)(I)に記載のフォワードプライマーが配列番号4、5のいずれかで示される塩基配列である[1]に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
[3]
[1]に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程(A)(II)に記載のリバースプライマーが配列番号6、7のいずれかで示される塩基配列である[1]に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
[4]
[1]〜[3]のいずれかに記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程(A)に記載の核酸プローブが、配列番号8〜17のいずれかに示される塩基配列からなる核酸プローブである、[1]〜[3]のいずれかに記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
[5]
[1]に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程(A)(I)に記載のフォワードプライマー、工程(A)(II)に記載のリバースプライマー、および、工程(A)に記載の核酸プローブが、それぞれ以下の(a)〜(k)のいずれかの塩基配列の組合せで示される、[1]に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
(a)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号8でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(b)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号9でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(c)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号10でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(d)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号11でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(e)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号12でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(f)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号13でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(g)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号14でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(h)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号15でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(i)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号16でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(j)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号17でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(k)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号18でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
[6]
[5]に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とする百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
[7]
[1]〜[6]のいずれかに記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法において、核酸増幅を、α型DNAポリメラーゼ、および、α型DNAポリメラーゼを変異させた変異型、のうち1つ以上を含む系で行うことを特徴とする[1]〜[6]のいずれかに記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
[8]
配列番号2で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号3で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、1対のプライマー。
[9]
配列番号4、5のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号6、7のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、[8]に記載の、1対のプライマー。
[10]
配列番号8〜17のいずれかで示される塩基配列からなる、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌を検出するためのプローブ。
[11]
[8]または[9]に示される一対のプライマーと、[10]に示されるプローブとを組み合わせてなる、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出用のプライマー・プローブのセット。
[12]
[6]〜[11]のいずれかに記載のプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出キット。
本発明の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号1と95%以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の(I)または(II)のいずれか1つ以上に該当する核酸プライマー対が例示される。
(I)フォワードプライマーが、配列番号2で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
(II)リバースプライマーが、配列番号3で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
本発明の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブ(プローブ)は、特に限定されないが、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の相同性が比較的高い領域が望ましい。望ましくは80%以上、特に90%以上の相同性を有する配列が望ましい。
本発明の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出方法において、試料中の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する方法としては、以下の(1)〜(4)の工程を例示することができる。
(1)配列番号1と95%以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の(I)または(II)のいずれか1つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
(I)フォワードプライマーが、配列番号2で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
(II)リバースプライマーが、配列番号3で示される塩基配列のうち16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
(2)被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
(3)工程(2)によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
(4)工程(3)で得られた複合体を検出する工程。
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
増幅反応としては、最初の熱変形工程が80〜100℃で10秒〜15分、繰り返しの熱変形工程が80〜100℃で1〜300秒、アニーリンクが40〜80℃で1〜300秒、伸長反応工程が60〜85℃で1〜300秒程度行い、この繰り返しを30〜70回繰り返しすことが好ましい。
例えば、上記KOD DNA Polymerase以外に、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ(タカラバイオ製、登録商標)、PfuTurbo DNAポリメラーゼ(アジレント・テクノロジー)なども利用できる。
本明細書において、DNA合成活性とは鋳型DNAにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの3’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド5’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド5’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
A: 40mM Tris−HCl(pH7.5)
16mM 塩化マグネシウム
15mM ジチオスレイトール
100μg/ml BSA
B: 2μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C: 1.5mM dNTP(250cpm/pmol〔3H〕dTTP)
D: 20% トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E: 1μg/μl キャリアーDNA
本発明において、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性とは、DNAの3’末端領域を切除し、5’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、50μlの反応液(120mM Tris−HCl(pH8.8 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム,1mM MgCl2, 0.1% Triton X−100, 0.001% BSA,5 μg トリチウムラベルされた大腸菌DNA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに分注し、DNAポリメラーゼを加える。75℃で10分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、0.1%のBSAを50μl加え、さらに10%のトリクロロ酢酸、2%ピロリン酸ナトリウム溶液を100μl加え混合する。氷上で15分放置した後、12,000回転で10分間遠心し沈殿を分離する。上清100μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード社製)で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
本発明の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その3’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
好ましい検出可能な標識は蛍光標識である。本明細書において用いる場合,“蛍光標識”とは,特定の波長(励起周波数)の光を吸収し,次により長い波長(放射周波数)の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合,“ドナー蛍光団”との用語は,消光剤成分と近接している場合に,放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果,ドナー蛍光団それ自体は,近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、
32P、35Sなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウム、エクオリンなどが挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えることがなければなにを用いても良い。また反応に影響がなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、3’末端、5’末端部位である。
本発明はまた、上記で説明した百日咳菌および/またはパラ百日咳菌を検出するための方法において用いるプライマー対、プローブまたは該プライマーと該プローブとを組合せたセットに関する。
本発明のキットは、その構成において、プライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセット以外については特に限定されない。たとえばPCR法など公知の方法において、プライマーおよび/またはプローブとして上記のものを適用すればよい。
<百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成>
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号4、6、8に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ4、6、8と示す)を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、シグマジェノシス(株)等)に依頼した。
オリゴ4はセンス鎖であり、オリゴ6がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ8はプローブとして使用され、3’末端は蛍光標識される。
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 50 pmol、
オリゴ8(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.09℃/秒
融解温度解析の結果、−dF(蛍光強度変化量)/dT(温度変化量)の最も大きな値を示す温度(Tm)は、65℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表1および図1の通りであった。
本検出系において、検出まで要する時間が60分以内であった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 50 pmol、
オリゴ8(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解温度解析の結果、−dF(蛍光強度変化量)/dT(温度変化量)の最も大きな値を示す温度(Tm)は、65℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表2および図2の通りであった。
本検出系において、検出まで要する時間が60分以内であった。
<百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成>
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号4、6、9に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ4、6、9と示す)を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、シグマジェノシス(株)等)に依頼した。
オリゴ4はセンス鎖であり、オリゴ6がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ9はプローブとして使用され、3’末端は蛍光標識される。
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ9(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 65.1℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ9(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 58.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ10(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 64℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ10(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 57.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ11(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 63℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ11(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 56.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ12(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 62℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ12(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 55.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ13(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 61℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ13(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 54.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ14(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 60℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ14(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 53.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ15(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 59℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ15(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 52.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ16(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 58℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ16(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 51.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ17(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 62℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ4 5pmol、
オリゴ6 15 pmol、
オリゴ17(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 55.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
(1)百日咳菌に由来する核酸のPCR法による増幅
<PCR法による増幅反応>
百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ18(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 61℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
<PCR法による増幅反応>
パラ百日咳菌より抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
以下の試薬を含む10μl溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.5U
オリゴ5 5pmol、
オリゴ7 15 pmol、
オリゴ18(3’末端をFITCにより標識) 5pmol、
×10緩衝液(KOD plus ver.2用) 1μl、
2mM dNTP 1μl、
25mM MgSO4 2μl、
抽出DNA溶液 100ng(or 蒸留水)
94℃・30秒、
97℃・1秒、
58℃・3秒、
63℃・5秒(50サイクル)
40℃・30秒
40℃から75℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は0.2℃/秒
融解曲線解析結果 抽出DNAを用いた場合 53.℃付近にピークが認められたが、抽出DNAがない場合は、ピークは認められなかった。
Claims (5)
- 試料中の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌を検出する方法であって、以下の(A)に示す工程により試料中の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
(A)
(1)以下の(a)〜(k)のいずれかの塩基配列の組合せで示される、フォワードプライマー及びリバースプライマーの核酸プライマー対、並びに核酸プローブの組合せを用意する工程。
(a)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号8でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(b)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号9でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(c)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号10でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(d)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号11でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(e)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号12でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(f)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号13でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(g)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号14でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(h)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号15でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(i)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号16でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(j)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号17でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(k)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号18でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(2)被検核酸および前記工程(1)で用意した核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
(3)工程(2)によって得られた核酸増幅産物と、前記工程(1)で用意した核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
(4)工程(3)で得られた複合体を検出する工程。 - 請求項1に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とする百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
- 請求項1又は2に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法において、核酸増幅を、α型DNAポリメラーゼ、および、α型DNAポリメラーゼを変異させた変異型、のうち1つ以上を含む系で行うことを特徴とする請求項1又は2に記載の百日咳菌および/またはパラ百日咳菌の検出方法。
- 以下の(a)〜(k)のいずれかの塩基配列の組合せで示される、フォワードプライマー及びリバースプライマーの一対の核酸プライマーと核酸プローブとを組み合わせてなる、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出用のプライマー・プローブのセット。
(a)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号8でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(b)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号9でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(c)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号10でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(d)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号11でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(e)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号12でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(f)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号13でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(g)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号14でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(h)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号15でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(i)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号16でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(j)フォワードプライマーが配列番号4、リバースプライマーが配列番号6、プローブが配列番号17でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
(k)フォワードプライマーが配列番号5、リバースプライマーが配列番号7、プローブが配列番号18でそれぞれ示される塩基配列の組合せ。 - 請求項4に記載のプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および/またはパラ百日咳菌検出キット。
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