WO2015053061A1 - メチシリン耐性遺伝子の検出方法および黄色ブドウ球菌の検出方法 - Google Patents

メチシリン耐性遺伝子の検出方法および黄色ブドウ球菌の検出方法 Download PDF

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WO2015053061A1
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nucleic acid
probe
primer set
seq
acid primer
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洋介 川嶋
曽家　義博
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東洋紡株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide for detecting methicillin resistance gene quickly, reliably and simply, a method for detecting a methicillin resistance gene using the oligonucleotide, and a reagent for carrying out the detection method.
  • the present invention also relates to a reagent for detecting S. aureus having a genetic mutation that has not been known so far.
  • Methicillin-resistant Staphylococcus aureus is a Staphylococcus aureus that has acquired a methicillin resistance gene (mecA gene) and exhibits resistance to a wide range of antibiotics.
  • mecA gene methicillin resistance gene
  • a methicillin resistance gene may be obtained in staphylococci other than Staphylococcus aureus.
  • Methods for testing methicillin resistance include drug susceptibility testing, a method of detecting PBP-2 ′ encoded by a methicillin resistance gene by an immunoassay using an anti-PBP-2 ′ antibody, a methicillin resistance gene or DNA linked to the gene.
  • a method of detecting by amplification by PCR has been implemented (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • Staphylococcus aureus obtained from the subject must be cultured as a preliminary stage of the test. For this reason, it takes more than one day for examination, including the time required for culture.
  • Patent Document 1 a methicillin-resistant gene detection method excellent in accuracy using a fluorescent dye-labeled probe QProbe having a characteristic of quenching when bound to a target nucleic acid has been proposed.
  • Patent Document 1 since nucleic acid amplification and nucleic acid detection can be performed continuously, it is not necessary to open the reaction system after nucleic acid amplification, and carry-over contamination can be prevented.
  • Staphylococcus aureus is a resident bacterium and causes various infections such as bloodstream infection, pneumonia and meningitis. Especially in the case of bloodstream infection, since various complications can be caused, an early and accurate diagnosis method is indispensable.
  • Staphylococcus aureus is often examined by Gram stain and coagulase test. This is based on the finding that the only staphylococci that are normally detected in humans and are coagulase positive are S. aureus. Although this method is a well-known test method, since it is performed on colonies obtained by performing isolation culture, in order to perform the test, it is necessary to first culture the bacteria.
  • Non-patent Document 3 a method of amplifying and detecting a nuc gene (gene encoding a thermostable nuclease) specific to S. aureus by PCR.
  • Patent Document 3 a highly accurate S. aureus gene detection method using a fluorescent dye-labeled probe QProbe that has a characteristic of quenching when bound to a target nucleic acid has been proposed.
  • Patent Document 3 since nucleic acid amplification and nucleic acid detection can be performed continuously, there is no need to open the reaction system after nucleic acid amplification, and carry-over contamination can be prevented.
  • the present inventors have focused on storage stability in a liquid state with the aim of establishing a better methicillin resistance gene detection method. That is, the problem to be solved by the present invention is to provide a nucleic acid primer set for constituting a composition having good storage stability in liquid for detecting a methicillin resistance gene, and a composition comprising the nucleic acid primer set.
  • the present invention relates to a method for detecting a methicillin resistance gene using the method.
  • the detection reagent for performing nucleic acid amplification test can be stored for a certain period of time. If it is not necessary to prepare a reagent for each test, a quick test can be performed. In addition, the risk of contamination due to foreign DNA or the like during reagent preparation can be greatly reduced or eliminated, and as a result, it contributes to an improvement in test accuracy.
  • the detection system described in Patent Document 1 has not been confirmed for a certain period of stability.
  • Patent Document 2 describes a method for improving storage stability in a liquid state by using DNA polymerase, magnesium ions, and a nucleic acid primer as separate liquid compositions.
  • sufficient verification has not been made as to whether the storage period depends on the difference in the nucleic acid primer used.
  • Patent Document 3 proposes a method for detecting a nuc gene as a target.
  • this method when a mutation occurs in the base sequence of the nuc gene, there is a possibility that a primer or probe mismatch occurs and the nuc gene cannot be detected.
  • the present inventors have discovered a type of Staphylococcus aureus that cannot be detected by the method described in Patent Document 3.
  • the problem to be solved by the present invention relates to a method for detecting a newly discovered staphylococcus aureus having a mutated nuc gene in the same manner as normal S. aureus, and a detection reagent for carrying out the method. .
  • the present inventors have found a nucleic acid primer that can specifically amplify a partial region of a methicillin resistance gene and can provide a composition that can be stored refrigerated, thereby completing the present invention. It came to.
  • the present inventors have obtained a nucleic acid primer for specifically amplifying a partial region of the nuc gene and an amplified nucleic acid obtained by a nucleic acid amplification reaction using the nucleic acid primer.
  • the present inventors have found a reagent composition containing a nucleic acid probe for detection that can be stored refrigerated and completed the present invention. That is, the present invention has the following configuration.
  • [Claim 1] A nucleic acid primer set for detecting a methicillin resistant gene, comprising a forward primer represented by (A) below and a reverse primer represented by (B) below.
  • (A) Nucleic acid primer (B) sequence having a base sequence in which the 1560th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 3 ′ end, and any of the 1526 to 1534 bases of the sequence is the 5 ′ end
  • the nucleic acid primer set according to Item 1 wherein the composition containing the nucleic acid primer set is liquid and can be refrigerated for 3 months or longer.
  • Item 3 The nucleic acid primer set according to Item 1 or 2, wherein the nucleic acid primer set contained in the composition has a forward primer having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 5, and a reverse primer is SEQ ID NO: A nucleic acid primer set having a base sequence represented by any of 6 to 8.
  • [Section 4] A method for detecting a methicillin resistance gene in a sample, comprising the following steps (1) to (3): (1) A step of amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a composition comprising the nucleic acid primer set according to any one of Items 1 to 3, (2) a nucleic acid amplification product obtained by step (1), and the nucleic acid A step of hybridizing a part of the amplification product and a nucleic acid probe capable of forming a complex to form a complex (3) A step of detecting the complex obtained in step (2) [Section 5] The sample is selected from whole blood, blood culture medium, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, nasal wipe, pharyngeal wipe, sputum, catheter washing solution, tissue section, and those diluted with an appropriate solution.
  • [Claim 9] A kit for carrying out the method according to any one of Items 4 to 7, comprising the nucleic acid primer set according to any one of Items 1 to 3 or the composition according to Item 8.
  • [Section 10] A method for detecting the nuc gene of Staphylococcus aureus, the method comprising the following steps (1) to (3), wherein the nucleic acid primer set used in step (1) of the method is (A ) And (B), and the nucleic acid probe has the characteristics (C) and (D).
  • oligonucleotide is a nucleotide sequence having a nucleic acid probe (D) SEQ ID NO: 14 and 95% or more identity that can, nucleic acid probe [Claim 11] capable of forming a complex with the amplified region by the nucleic acid primer set Item 11.
  • nucleic acid primer set used in the step (1) of the method has the characteristics (A ′) and (B ′), and the nucleic acid probe used in the step (2) Having the features of (C ′) and (D ′).
  • a ′ Nucleic acid primer set capable of amplifying a part or all of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • B ′ Part or all of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 14
  • Nucleic acid primer set (C ′) capable of amplifying the nucleic acid probe (D ′) of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 that can form a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set
  • the sample is selected from whole blood, blood culture medium, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, nasal wipe, pharyngeal wipe, sputum, catheter washing solution, tissue section, and those diluted with an appropriate solution.
  • Item 12 The method according to Item 10 or Item 11.
  • Item 13 The method according to any one of Items 10 to 12, wherein at least one end of the nucleic acid probe is fluorescently labeled, and the nucleic acid base of the nucleic acid probe that is fluorescently labeled is cytosine.
  • a nucleic acid primer set comprising a pair of nucleic acid primers, wherein the forward primer has the following characteristics (E) and the reverse primer has the following characteristics (F).
  • nucleic acid according to Item 14 wherein the forward primer is a nucleic acid primer having the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 18 to 20, and the reverse primer is a nucleic acid primer having the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 21 to 23.
  • Primer set. [Section 16] A nucleic acid probe for detecting a partial region of a nuc gene, wherein the 137th base sequence of SEQ ID NO: 15 is the 3 'end, and the arbitrary bases 118 to 123 of the sequence are the 5' end A nucleic acid probe having a base sequence of [Section 17] Item 8.
  • nucleic acid probe according to Item 7 wherein the nucleic acid probe has a base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 25.
  • Item 14 The method according to any one of Items 10 to 13, wherein the nucleic acid primer set is the nucleic acid primer set according to Item 14 or 15, and the nucleic acid probe is the nucleic acid probe according to Item 16 or Item 17.
  • a composition for carrying out the method according to any one of Items 10 to 13 and Item 18, wherein the nucleic acid primer set according to any one of Items 14 or 15 and any one of Items 16 or 17 A composition comprising the nucleic acid probe according to 1.
  • the present invention it is possible to provide a liquid detection reagent for detecting a methicillin resistance gene having good storage stability and a method for detecting a methicillin resistance gene using the reagent.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of Example 1. It is a figure which shows the result of Example 2. It is a figure which shows the result of Example 3. It is a figure which shows the result of the comparative example 1. It is a figure which shows the result of Example 4. It is a figure which shows the result of Example 6. It is a figure which shows the result of Example 6. It is a figure which shows the result of Example 6. It is a figure which shows the result of the comparative example 2.
  • the present invention detects a methicillin resistance gene using a nucleic acid primer set for constituting a composition having good storage stability in liquid for detecting a methicillin resistance gene, and a composition containing the nucleic acid primer set It is related with the method to do.
  • Nucleic acid primer set for detecting a methicillin resistant gene.
  • the nucleic acid primer set is composed of a forward primer shown in the following (A) and a reverse primer shown in the following (B), and a partial region of the methicillin resistance gene by a reaction solution containing a composition containing this set.
  • SEQ ID NO: 1 is a complementary sequence of a methicillin resistant gene sequence
  • SEQ ID NO: 2 is a methicillin resistant gene sequence. Sequence information is obtained from NCBI (National Center for Biotechnology Information) (ACCESSION No. BX571856).
  • Nucleic acid primer sets are usually composed of one (one sequence) or more forward primers and one (one sequence) or more reverse primers. Preferably, it is composed of one kind of forward primer and one kind of reverse primer.
  • nucleic acid primer set in particular, one having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 5 as a forward primer and one having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 8 as a reverse primer
  • a forward primer in particular, one having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 5 as a forward primer and one having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 8 as a reverse primer
  • the combination with is preferred.
  • compositions comprising the nucleic acid primer set for use in a method for detecting a methicillin resistance gene.
  • the composition may be a part of a component reagent of a kit for use in a method for detecting a methicillin resistance gene.
  • the composition includes the nucleic acid primer set.
  • the other components contained in the composition are not particularly limited, but a nucleic acid probe described later is preferably contained in the composition, and magnesium ions are preferably contained in the composition.
  • the form of magnesium ions added to the composition is not particularly limited, but it is preferably added as a magnesium salt such as magnesium chloride or magnesium sulfate.
  • the composition does not contain DNA polymerase. This is because a non-specific product may be generated if the DNA polymerase and the nucleic acid primer set are mixed and stored.
  • a composition containing DNA polymerase or the like and not containing the nucleic acid primer set or the nucleic acid probe is referred to as a nucleic acid amplification reagent in distinction from the composition.
  • composition containing the nucleic acid primer set of the present invention can be stored in a liquid for a long period of time.
  • “can be stored (storable)” means that the nucleic acid amplification performance of the composition is not impaired by storage.
  • the composition includes a component having a function of detecting an amplification product generated by the nucleic acid primer set, such as a nucleic acid probe, the detection performance of the amplification product by the component may not be impaired. include.
  • the term “before storage” refers to a state immediately after the composition is prepared.
  • the term “after storage” refers to a state after standing for a predetermined period of time under predetermined conditions.
  • “Performance is not impaired by storage” does not necessarily mean that there is no performance change before and after storage. As the performance of the composition, it is sufficient that the nucleic acid amplification performance and the amplification product detection performance for the target nucleic acid are maintained when the composition is mixed with an appropriate nucleic acid amplification reagent.
  • the method for determining that the above performance is maintained is not particularly limited as long as it can be performed by those skilled in the art. If it can be confirmed by at least one method, the performance may be maintained regardless of the result of other methods. Judgment that the performance is maintained depends on the method of detecting the amplification product.For example, if the detection method is agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis, the band of the amplification product is usually used. If it can be detected, the nucleic acid amplification performance may be maintained.
  • a detection method using a fluorescent substance such as a fluorescently labeled probe for example, a signal value such as a fluorescence intensity or a fluorescence change amount obtained by a detection reaction is measured, and the signal value is a composition before storage. 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, of the signal value obtained by performing nucleic acid amplification and amplification product detection using the product, More preferably, the nucleic acid amplification performance and the amplification product detection performance may be maintained if they are 80% or more, more preferably 90% or more.
  • refrigerated refers to a general temperature condition such as a refrigerator or a cold room
  • refrigerated storage refers to storing under the above conditions.
  • the upper temperature limit for refrigeration is 10 ° C, but it may be 9 ° C, 8 ° C, 7 ° C, 6 ° C, or 5 ° C. It may be present, or it may be a lower temperature as long as it does not freeze.
  • the lower temperature limit of refrigeration is not limited as long as it does not freeze, but it may be 0 ° C, 1 ° C, 2 ° C, or even higher within a range not exceeding 10 ° C. It may be temperature.
  • the combination of the upper limit and the lower limit of the temperature is arbitrary as long as it is within the above range. For example, it may be maintained in the range of 7 ° C to 10 ° C, 2 ° C to 5 ° C.
  • Storage period is at least 3 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, 13 months, 14 months, It can be stored for 15 months, 18 months, and 24 months.
  • nucleic acid probe used in the methicillin resistant gene detection method of the present invention described later is not particularly limited as long as it can form a complex with a part or all of the nucleic acid amplification product amplified by the nucleic acid primer set. . More preferably, it is a nucleic acid probe that specifically forms a complex only with the nucleic acid amplification product and does not form a complex with a nucleic acid having other base sequence, more preferably a part of the nucleic acid amplification product or A nucleic acid probe having the same or complementary base sequence as the entire base sequence.
  • nucleic acid probes examples include nucleic acid probes represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10.
  • the nucleic acid probe may or may not be labeled with a nucleic acid.
  • the position and number of the nucleic acid to be labeled are not limited, but preferably the nucleic acid at the end of the nucleic acid probe is labeled, and more preferably, one of the ends is labeled. is there. More preferably, the base of the terminal nucleic acid to be labeled is cytosine.
  • the labeling substance is not particularly limited, but is preferably a fluorescent substance, more preferably a fluorescent substance that exhibits fluorescence alone and quenches when it forms a hybrid with the target nucleic acid.
  • the fluorescent substance include, but are not limited to, fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives, and the like.
  • commercially available fluorescent dyes include BODIPY FL (trademark, manufactured by Molecular Probe), FluorePrime (trademark, Amersham). Pharmacia), Fluoredite (trademark, manufactured by Millipore), FAM (ABI), Cy3 and Cy5 (Amersham Pharmacia), TAMRA (Molecular Probes), carboxyrhodamine 6G (CR6G), and the like.
  • a different aspect of the present invention is a method for detecting a methicillin resistance gene in a sample.
  • the method includes the following steps (1) to (3). (1) Amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a composition containing the nucleic acid primer set (2) A nucleic acid amplification product obtained by step (1), a part of the nucleic acid amplification product, and a complex A step of hybridizing with a nucleic acid probe capable of forming a complex to form a complex (3) a step of detecting the complex obtained in step (2)
  • the method for detecting a methicillin resistant gene of the present invention is not particularly limited except that the above steps are included. If a methicillin resistance gene can be detected, a new step may be added to the above step.
  • nucleic acid primer set and the nucleic acid probe for amplifying and detecting the methicillin resistance gene used in the method those described above can be used. Furthermore, for example, for the purpose of amplifying and detecting a gene different from the methicillin resistance gene, addition of a nucleic acid primer or nucleic acid probe different from the nucleic acid primer set and nucleic acid probe is not particularly limited.
  • test nucleic acid in the present invention may be, for example, single-stranded or double-stranded.
  • double strand for example, it is preferable to include a step of dissociating the double strand into a single strand by heating in order to hybridize a test nucleic acid and a probe to form a hybrid.
  • test nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA such as total RNA and mRNA, and the like.
  • examples of the test nucleic acid include nucleic acids contained in samples such as a blood culture sample of S. aureus, a catheter washing solution, and a biological sample. These samples may be used as they are, or those diluted with an appropriate solution may be used. Suitable solutions include water, physiological saline, buffer solution, alkaline aqueous solution, acidic aqueous solution, nucleic acid extraction reagent, surfactant, organic solvent and the like.
  • a method for collecting a sample, a method for preparing a nucleic acid such as DNA or RNA, and the like are not limited, and a conventionally known method can be employed.
  • a sequence including a base site for detection is amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the above-described nucleic acid primer set.
  • the specific nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate.
  • the PCR (Polymerase Chain Reaction) method the NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, the TMA (Transscription-mediated amplification Amplification method), and the SDA (Strand displacement Amplification method). It is preferable to use the PCR method.
  • the conditions for the amplification reaction are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
  • the DNA polymerase to be used is not particularly limited, but ⁇ -type DNA polymerase is preferably used. The reason will be described below.
  • the nucleic acid probe can bind to the methicillin resistant gene of the sample or their amplification product during the nucleic acid amplification step.
  • the nucleic acid probe bound to the methicillin resistance gene during the nucleic acid amplification step inhibits the nucleic acid amplification reaction by the nucleic acid primer and DNA polymerase.
  • PolI type DNA polymerases such as Taq DNA Polymerase are known to have 5'-3 'exonuclease activity. Due to this activity, when there is a nucleic acid bound to a methicillin resistance gene as a template during the nucleic acid amplification reaction, the bound nucleic acid is degraded by exonuclease activity. For this reason, the nucleic acid probe in the reaction system may be reduced, causing a problem in the nucleic acid detection process. Therefore, it is not preferable to carry out the present invention using PolI type DNA polymerase.
  • ⁇ -type DNA polymerases such as KOD DNA Polymerase (derived from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1) do not have 5'-3 'exonuclease activity but have 3'-5' exonuclease activity. Therefore, the use of ⁇ -type DNA polymerase not only solves the above problem, but also exhibits high accuracy in the nucleic acid amplification step due to the 3′-5 ′ exonuclease activity.
  • ⁇ -type DNA polymerase has a 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity, so that the nucleic acid amplification rate tends to be lower than that of PolI-type enzyme.
  • KOD DNA Polymerase is an ⁇ -type DNA polymerase, it has high DNA synthesis activity, has a DNA synthesis rate of 100 bases / second or more, and has excellent elongation efficiency. Therefore, in the practice of the present invention, it is preferable to use KOD DNA Polymerase (trademark, manufactured by Toyobo) among ⁇ -type DNA polymerases.
  • DNA polymerase composition in which the performance is achieved by a combination of wild type and / or mutant type
  • DNA polymerase suitable for the practice of the present invention DNA polymerase suitable for the practice of the present invention.
  • DNA polymerases having a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more include “KOD FX (trade name, manufactured by Toyobo)”, “KOD-Plus- (trade name, manufactured by Toyobo)”, “KOD”.
  • Dash (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), PrimeSTAR HS DNA polymerase (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can also be used.
  • KOD-Plus- having both high accuracy and DNA synthesis activity is desirable.
  • DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleic acid by covalently binding the ⁇ -phosphate of deoxyribonucleoside 5'-triphosphate to the 3'-hydroxyl group of an oligonucleotide or polynucleotide annealed to template DNA.
  • DNA synthesis activity refers to the activity of catalyzing the reaction of introducing deoxyribonucleoside 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
  • the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer.
  • 25 ⁇ l of the following A solution, 5 ⁇ l of each of B solution and C solution, and 10 ⁇ l of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring.
  • 5 ⁇ l of the enzyme solution is added and reacted at 75 ° C. for 10 minutes.
  • the mixture is ice-cooled, 50 ⁇ l of E solution and 100 ⁇ l of D solution are added, and after stirring, the mixture is further ice-cooled for 10 minutes.
  • This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. taking measurement.
  • One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
  • 3'-5' exonuclease activity refers to the activity of excising the 3 'terminal region of DNA and releasing 5'-mononucleotide. The activity was measured using 50 ⁇ l of a reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 ⁇ g tritium-labeled E. coli DNA) is dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube and DNA polymerase is added.
  • a reaction solution 120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 ⁇ g tritium-labeled
  • the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 ⁇ l of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 ⁇ l of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 ⁇ l of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
  • a liquid scintillation counter manufactured by Packard
  • the methicillin resistant gene detection method of the present invention is designed to form a complex with the nucleic acid amplification product obtained in step (1) and a part of the nucleic acid amplification product.
  • the nucleic acid probe is hybridized to form a complex.
  • the timing of adding a nucleic acid probe to a sample containing a nucleic acid amplification product is not particularly limited. For example, it may be added to the reaction system of the amplification reaction before, during or after the nucleic acid amplification reaction. May be. Especially, since an amplification reaction and a detection reaction described later can be performed continuously, it is preferable to add them before the amplification reaction. Thus, when the probe is added before the nucleic acid amplification reaction, for example, as described later, it is preferable to add a fluorescent dye or a phosphate group to the 3 ′ end.
  • the probe may be added to a liquid sample containing a nucleic acid amplification product, or may be mixed with a nucleic acid amplification product in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known solvents such as a buffer solution such as Tris-HCl, a solvent containing KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol and the like, and a PCR reaction solution.
  • the method for detecting the complex obtained is not particularly limited.
  • a method by melting curve analysis can be mentioned.
  • the absorbance at 260 nm increases. This is because hydrogen bonds between both strands in double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting).
  • DNA melting dissociated into single-stranded DNA
  • the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of only double-stranded DNA), thereby melting. Can be determined to be completed.
  • the measurement of the signal fluctuation accompanying the temperature change for performing the melting curve analysis can be performed by measuring the absorbance at 260 nm based on the principle as described above, but the signal of the label added to the probe of the present invention is measured. It is preferable to measure. For this reason, it is preferable to use a labeled probe as a probe used in the method for detecting a methicillin resistance gene of the present invention.
  • the labeled probe examples include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization.
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization.
  • no signal is shown when a hybrid (double strand) is formed with the detection target sequence, and a signal is shown when the probe is released by heating.
  • a signal is shown by forming a hybrid (double strand) with the sequence to be detected, and the signal decreases (disappears) when the probe is released by heating. Therefore, by detecting the signal from the label under signal-specific conditions (absorbance and the like), the progress of melting can be grasped in the same manner as the absorbance measurement at 260 nm.
  • the labeled probe for example, a probe that is labeled with a fluorescent dye, exhibits fluorescence alone, and fluorescence decreases (for example, quenches) by hybridization is preferable. Such a phenomenon is generally called a fluorescence quenching phenomenon.
  • a probe using this fluorescence quenching phenomenon a probe generally called a guanine quenching probe is preferable.
  • Such a probe is known as a so-called QProbe (registered trademark).
  • a guanine quenching probe is, for example, a fluorescent dye designed so that the base at the 3 ′ end or 5 ′ end of an oligonucleotide becomes cytosine, and light emission becomes weaker when the base cytosine at the end approaches a complementary base guanine. It is a probe labeled at the end.
  • a fluorescent dye exhibiting a fluorescence quenching phenomenon may be bound to cytosine at the 3 ′ end of the oligonucleotide, or the 5 ′ end of the oligonucleotide is designed to be cytosine. It may be combined.
  • a phosphate group may be added to the 3 'end.
  • a test nucleic acid (target nucleic acid) for detecting the presence or absence of a gene can be prepared by a nucleic acid amplification method such as PCR.
  • the probe of the present invention is allowed to coexist in the reaction system of the nucleic acid amplification reaction. be able to.
  • the probe itself can be sufficiently prevented from extending due to the nucleic acid amplification reaction. The same effect can be obtained by adding a labeling substance as described above to the 3 'end.
  • the dissociation of the obtained PCR amplification product and the hybridization between the single-stranded DNA obtained by the dissociation and the labeled probe can be performed, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
  • the heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 98 ° C.
  • the heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
  • hybridization between the dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step.
  • the temperature condition is, for example, 35 to 50 ° C.
  • the volume and concentration of each composition in the reaction system (reaction system) of the hybridization process are not particularly limited.
  • the concentration of DNA is, for example, 0.01 to 100 ⁇ mol / L, preferably 0.1 to 10 ⁇ mol / L, and the concentration of the labeled probe is, for example, relative to the DNA.
  • a range satisfying the addition ratio is preferable, for example, 0.01 to 100 ⁇ mol / L, and preferably 0.01 to 10 ⁇ mol / L.
  • the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybridized product of the amplification product and the labeled probe is measured.
  • the reaction solution hybridized body of the single-stranded DNA and the labeled probe
  • a change in signal value accompanying a temperature rise is measured.
  • a probe labeled with a terminal C base (guanine quenching probe)
  • fluorescence is reduced (or quenched) in a hybridized state with single-stranded DNA, and in a dissociated state, Fluoresce. Therefore, for example, the hybrid formed body in which the fluorescence is decreased (or quenched) may be gradually heated, and the increase in the fluorescence intensity accompanying the temperature increase may be measured.
  • the temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited.
  • the start temperature is room temperature to 85 ° C., preferably 25 to 70 ° C.
  • the end temperature is 40 to 105 ° C., for example. is there.
  • the rate of temperature increase is not particularly limited, but is, for example, 0.05 to 20 ° C./second, preferably 0.08 to 5 ° C./second.
  • the determination of the presence or absence of the test nucleic acid can be performed, for example, by measuring signal fluctuations during hybridization. That is, when a hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop is measured.
  • a labeled probe for example, a guanine quenching probe
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization
  • the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease.
  • a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization it does not emit fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated, but the hybrid is not released due to a decrease in temperature. Once formed, it will fluoresce. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
  • the signal variation may be analyzed and determined as a Tm (melting temperature) value.
  • the methicillin resistance gene detection kit of the present invention includes the nucleic acid primer set and can be used in the methicillin resistance gene detection method. It is preferable that the kit further includes the nucleic acid probe and, in addition to that, a reagent necessary for a nucleic acid amplification reaction and / or a nucleic acid amplification product detection reaction as appropriate.
  • the composition containing the nucleic acid primer set and the nucleic acid amplification reagent containing DNA polymerase and the like are preferably packed in separate containers.
  • the present invention relates to a nucleic acid primer (primer), a nucleic acid probe (probe) for detecting both S. aureus having a normal nuc gene and S. aureus having a mutated nuc gene, and yellow grapes using these.
  • the present invention relates to a method for detecting cocci, a kit for carrying out the method, and the like.
  • the normal nuc gene in the present invention is NCBI accession no. This refers to the nuc gene having the nucleotide sequence listed in Regions 895561 to 896347 of BX571856.
  • SEQ ID NO: 13 shows positions 303 to 542 of the gene.
  • the “mutated nuc gene” in the present invention refers to a nuc gene whose positions 303 to 542 are the base sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • S. aureus having the nuc gene having the partial sequence of SEQ ID NO: 14 has not been reported so far, and is the first base sequence discovered this time.
  • SEQ ID NO: 15 is a complementary sequence of SEQ ID NO: 13
  • SEQ ID NO: 16 is a complementary sequence of SEQ ID NO: 14.
  • SEQ ID NO: 17 is the base sequence of the entire nuc gene registered in the database.
  • nucleic acid primer set in the method for detecting Staphylococcus aureus of the present invention, the nucleic acid primer set that specifically amplifies a region of the nuc gene specific to S. aureus comprises a pair of nucleic acid primers, and the following (A) And (B).
  • B A nucleic acid primer set capable of nucleic acid amplification of part or all of an oligonucleotide having a base sequence represented by a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 14.
  • the identity with SEQ ID NO: 13 is preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and further preferably 100% (ie SEQ ID NO: 13 itself).
  • the identity with SEQ ID NO: 14 is preferably 96% or higher, more preferably 97% or higher, more preferably 98% or higher, more preferably 99% or higher, and more preferably 100%.
  • % Ie, SEQ ID NO: 14 itself).
  • a pair of nucleic acid primer sets is composed of one type (one sequence) of a forward primer and one type (one sequence) of a reverse primer.
  • nucleic acid sequence homology in the present specification, the identity of a nucleic acid sequence means a value compared with GENETYX software.
  • GENETYX software for example, the GENETYX WIN Version 6.1 software sold by GENETYX CORPORATION can be used.
  • the nucleic acid primer set is not particularly limited as long as it has both the features (A) and (B).
  • the forward primer comprises the following (E)
  • the reverse primer comprises the following (F) Consists of.
  • E Nucleic acid primer (F) sequence having a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 having the 3rd end at the 83rd or 84th base and the 5 'end at any of the 54th to 65th bases of the sequence
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid primer (E) is such that the 3 ′ end is either the 83rd or 84th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, and the 5 ′ end is from the 54th to the beginning of SEQ ID NO: 13. It may be any base in the 65th position. Preferably, the 5 ′ end is the 56th to 62nd position of SEQ ID NO: 13, more preferably the 58th to 61st position. If the nucleotide sequence of the nucleic acid primer (F) is the 59th base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 at the 3 'end, the 5' end is the 31st to 41st of SEQ ID NO: 15. Any base may be used. Preferably, the 5 ′ end is the 32nd to 40th positions of SEQ ID NO: 15, more preferably the 34th to 38th positions.
  • Each nucleic acid primer constituting the nucleic acid primer set is designed so that at least the 5th nucleic acid from the 3 ′ end matches both SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14. Accordingly, the nucleic acid primer set can amplify both a part of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a part of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 14. ing.
  • nucleic acid primer set examples include a combination of a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 18 to 20 as a forward primer and a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 21 to 23 as a reverse primer. it can.
  • nucleic acid probe used in the present invention is not particularly limited as long as it can hybridize with a part or all of the nucleic acid amplification product amplified by the nucleic acid primer set to form a complex. More preferably, it is a nucleic acid probe that specifically forms a complex only with the nucleic acid amplification product and does not form a complex with a nucleic acid having other base sequence, more preferably a part of the nucleic acid amplification product or A nucleic acid probe having the same or complementary base sequence as the entire base sequence.
  • Such a nucleic acid probe is preferably a nucleic acid probe having both the features (C) and (D).
  • C Nucleic acid probe capable of forming a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set among oligonucleotides having a nucleotide sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 13
  • D SEQ ID NO: 14 and 95%
  • the identity with SEQ ID NO: 13 is preferably It is 96% or more, more preferably 97% or more, further preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and further preferably 100% (that is, SEQ ID NO: 13 itself).
  • the identity with SEQ ID NO: 14 is preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, more preferably 100%.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it satisfies the above (C) and (D), but preferably the 137th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 is the 3 'end, and the 118th nucleotide of the sequence is A nucleic acid probe having a base sequence having the 5th end at any of the 123rd to 123rd bases.
  • the nucleic acid probe of the base sequence has the same sequence as a part of the common sequence of SEQ ID NOs: 13 and 14, and is complexed with a nucleic acid amplification product containing the base sequence represented by any of the sequence numbers 13 and 14 Can be formed.
  • nucleic acid probes examples include nucleic acid probes represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 24 and 25.
  • the nucleic acid probe may or may not be labeled with a nucleic acid.
  • the position and number of the nucleic acid to be labeled are not limited, but preferably the nucleic acid at the end of the nucleic acid probe is labeled, and more preferably, one of the ends is labeled. is there. More preferably, the base of the terminal nucleic acid to be labeled is cytosine.
  • the labeling substance is not particularly limited, but is preferably a fluorescent substance, more preferably a fluorescent substance that exhibits fluorescence alone and quenches when it forms a hybrid with the target nucleic acid.
  • the fluorescent substance include, but are not limited to, fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives, and the like.
  • commercially available fluorescent dyes include BODIPY FL (trademark, manufactured by Molecular Probes), FluorePrime (trademark, Amersham). Pharmacia), Fluoredite (trademark, manufactured by Millipore), FAM (ABI), Cy3 and Cy5 (Amersham Pharmacia), TAMRA (Molecular Probes), carboxyrhodamine 6G (CR6G), and the like.
  • the method for detecting Staphylococcus aureus of the present invention is a method for detecting Staphylococcus aureus in a sample, and detecting nucleic acid derived from Staphylococcus aureus in a sample by a specific process. Including a method of performing.
  • One embodiment of the method includes a method for detecting the nuc gene of Staphylococcus aureus comprising the following steps (1) to (3).
  • (1) Amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a pair of nucleic acid primer sets (2) Forming a complex with the nucleic acid amplification product obtained by (1) and part or all of the nucleic acid amplification product
  • a step of hybridizing with a possible nucleic acid probe to form a complex (3) a step of detecting the complex obtained in (2)
  • the above-described nucleic acid primer sets and nucleic acid probes used in the method are used it can.
  • the nuc gene detection method of the present invention is not particularly limited except that the above steps are included. If the nuc gene can be detected, a new process may be added to the above process.
  • nucleic acid primer set and the nucleic acid probe for amplifying and detecting the nuc gene used in the method those described above can be used. Furthermore, for example, for the purpose of amplifying and detecting a gene different from the nuc gene, addition of a nucleic acid primer or nucleic acid probe different from the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe is not particularly limited.
  • test nucleic acid in the present invention may be, for example, single-stranded or double-stranded.
  • double strand for example, it is preferable to include a step of dissociating the double strand into a single strand by heating in order to hybridize a test nucleic acid and a probe to form a hybrid.
  • test nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA such as total RNA and mRNA, and the like.
  • examples of the test nucleic acid include nucleic acids contained in samples such as a blood culture sample of S. aureus, a catheter washing solution, and a biological sample. These samples may be used as they are, or those diluted with an appropriate solution may be used. Suitable solutions include water, saline, buffer solution, alkaline aqueous solution, acidic aqueous solution, nucleic acid extraction reagent, surfactant, organic solvent and the like.
  • a sequence including a base site for detection is amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the above-described nucleic acid primer set.
  • the specific nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate.
  • the PCR (Polymerase Chain Reaction) method the NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, the TMA (Transscription-mediated amplification Amplification method), and the SDA (Strand displacement Amplification method). It is preferable to use the PCR method.
  • the conditions for the amplification reaction are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
  • the DNA polymerase to be used is not particularly limited, but ⁇ -type DNA polymerase is preferably used. The reason will be described below.
  • the nucleic acid probe can bind to the nuc gene of the sample or their amplification product during the nucleic acid amplification step.
  • the nucleic acid probe bound to the nuc gene during the nucleic acid amplification step inhibits the nucleic acid amplification reaction by the nucleic acid primer and DNA polymerase.
  • PolI type DNA polymerases such as Taq DNA Polymerase are known to have 5'-3 'exonuclease activity. Because of this activity, if there is a nucleic acid bound to the nuc gene as a template during the nucleic acid amplification reaction, the bound nucleic acid is degraded by exonuclease activity. For this reason, the nucleic acid probe in the reaction system may be reduced, causing a problem in the nucleic acid detection process. Therefore, it is not preferable to carry out the present invention using PolI type DNA polymerase.
  • ⁇ -type DNA polymerases such as KOD DNA Polymerase (derived from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1) do not have 5'-3 'exonuclease activity but have 3'-5' exonuclease activity. Therefore, the use of ⁇ -type DNA polymerase not only solves the above problem, but also exhibits high accuracy in the nucleic acid amplification step due to the 3′-5 ′ exonuclease activity.
  • ⁇ -type DNA polymerase has a 3′-5 ′ exonuclease activity, and therefore the nucleic acid amplification rate tends to be lower than that of PolI-type enzyme.
  • KOD DNA Polymerase is an ⁇ -type DNA polymerase, it has high DNA synthesis activity, has a DNA synthesis rate of 100 bases / second or more, and has excellent elongation efficiency. Therefore, in the practice of the present invention, it is preferable to use KOD DNA Polymerase (trademark, manufactured by Toyobo) among ⁇ -type DNA polymerases.
  • DNA polymerase composition in which the performance is achieved by a combination of wild type and / or mutant type
  • DNA polymerase suitable for the practice of the present invention DNA polymerase suitable for the practice of the present invention.
  • DNA polymerases having a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more include “KOD FX (trade name, manufactured by Toyobo)”, “KOD-Plus- (trade name, manufactured by Toyobo)”, “KOD”.
  • Dash (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), PrimeSTAR HS DNA polymerase (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can also be used.
  • KOD-Plus- having both high accuracy and DNA synthesis activity is desirable.
  • DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleic acid by covalently binding the ⁇ -phosphate of deoxyribonucleoside 5'-triphosphate to the 3'-hydroxyl group of an oligonucleotide or polynucleotide annealed to template DNA.
  • DNA synthesis activity refers to the activity of catalyzing the reaction of introducing deoxyribonucleoside 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
  • the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer.
  • 25 ⁇ l of the following solution A, 5 ⁇ l of each of solution B and C, and 10 ⁇ l of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring. Thereafter, the mixture is ice-cooled, 50 ⁇ l of E solution and 100 ⁇ l of D solution are added, and after stirring, the mixture is further ice-cooled for 10 minutes.
  • This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA.
  • 3'-5' exonuclease activity refers to the activity of excising the 3 'terminal region of DNA and releasing 5'-mononucleotide. The activity was measured using 50 ⁇ l of a reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 ⁇ g tritium-labeled E. coli DNA) is dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube and DNA polymerase is added.
  • a reaction solution 120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 ⁇ g tritium-labeled
  • the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 ⁇ l of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 ⁇ l of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 ⁇ l of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
  • a liquid scintillation counter manufactured by Packard
  • the nuc gene detection method of the present invention is designed to form a complex with the nucleic acid amplification product obtained in step (1) and a part of the nucleic acid amplification product.
  • the nucleic acid probe is hybridized to form a complex.
  • the timing of adding a nucleic acid probe to a sample containing a nucleic acid amplification product is not particularly limited. For example, it may be added to the reaction system of the amplification reaction before, during or after the nucleic acid amplification reaction. May be. Especially, since an amplification reaction and a detection reaction described later can be performed continuously, it is preferable to add them before the amplification reaction. Thus, when the probe is added before the nucleic acid amplification reaction, for example, as described later, it is preferable to add a fluorescent dye or a phosphate group to the 3 ′ end.
  • the probe may be added to a liquid sample containing a nucleic acid amplification product, or may be mixed with a nucleic acid amplification product in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known solvents such as a buffer solution such as Tris-HCl, a solvent containing KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol and the like, and a PCR reaction solution.
  • the method for detecting the complex obtained is not particularly limited.
  • a method by melting curve analysis can be mentioned.
  • the absorbance at 260 nm increases. This is because hydrogen bonds between both strands in double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting).
  • DNA melting dissociated into single-stranded DNA
  • the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of only double-stranded DNA), thereby melting. Can be determined to be completed.
  • the measurement of the signal fluctuation accompanying the temperature change for performing the melting curve analysis can be performed by measuring the absorbance at 260 nm based on the principle as described above, but the signal of the label added to the probe of the present invention is measured. It is preferable to measure. For this reason, it is preferable to use a labeled probe as a probe used in the nuc gene detection method of the present invention.
  • the labeled probe examples include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization.
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization.
  • no signal is shown when a hybrid (double strand) is formed with the detection target sequence, and a signal is shown when the probe is released by heating.
  • a signal is shown by forming a hybrid (double strand) with the sequence to be detected, and the signal decreases (disappears) when the probe is released by heating. Therefore, by detecting the signal from the label under signal-specific conditions (absorbance and the like), the progress of melting can be grasped in the same manner as the absorbance measurement at 260 nm.
  • the labeled probe for example, a probe that is labeled with a fluorescent dye, exhibits fluorescence alone, and fluorescence decreases (for example, quenches) by hybridization is preferable. Such a phenomenon is generally called a fluorescence quenching phenomenon.
  • a probe using this fluorescence quenching phenomenon a probe generally called a guanine quenching probe is preferable.
  • Such a probe is known as a so-called QProbe (registered trademark).
  • a guanine quenching probe is, for example, a fluorescent dye designed so that the base at the 3 ′ end or 5 ′ end of an oligonucleotide becomes cytosine, and light emission becomes weaker when the base cytosine at the end approaches a complementary base guanine. It is a probe labeled at the end.
  • a fluorescent dye exhibiting a fluorescence quenching phenomenon may be bound to cytosine at the 3 ′ end of the oligonucleotide, or the 5 ′ end of the oligonucleotide is designed to be cytosine. It may be combined.
  • the probe used in the nuc gene detection method of the present invention may have a phosphate group added to the 3 'end, for example.
  • a test nucleic acid (target nucleic acid) for detecting the presence or absence of a gene can be prepared by a nucleic acid amplification method such as PCR.
  • the probe of the present invention is allowed to coexist in the reaction system of the nucleic acid amplification reaction. be able to.
  • the probe itself can be sufficiently prevented from extending due to the nucleic acid amplification reaction. The same effect can be obtained by adding a labeling substance as described above to the 3 'end.
  • the dissociation of the obtained PCR amplification product and the hybridization between the single-stranded DNA obtained by the dissociation and the labeled probe can be performed, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
  • the heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 98 ° C.
  • the heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
  • hybridization between the dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step.
  • the temperature condition is, for example, 35 to 50 ° C.
  • the volume and concentration of each composition in the reaction system (reaction system) of the hybridization process are not particularly limited.
  • the concentration of DNA is, for example, 0.01 to 100 ⁇ mol / L, preferably 0.1 to 10 ⁇ mol / L, and the concentration of the labeled probe is, for example, relative to the DNA.
  • a range satisfying the addition ratio is preferable, for example, 0.01 to 100 ⁇ mol / L, and preferably 0.01 to 10 ⁇ mol / L.
  • the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybridized product of the amplification product and the labeled probe is measured.
  • the reaction solution hybridized body of the single-stranded DNA and the labeled probe
  • a change in signal value accompanying a temperature rise is measured.
  • a probe labeled with a terminal C base (guanine quenching probe)
  • fluorescence is reduced (or quenched) in a hybridized state with single-stranded DNA, and in a dissociated state, Fluoresce. Therefore, for example, the hybrid formed body in which the fluorescence is decreased (or quenched) may be gradually heated, and the increase in the fluorescence intensity accompanying the temperature increase may be measured.
  • the temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited.
  • the start temperature is room temperature to 85 ° C., preferably 25 to 70 ° C.
  • the end temperature is 40 to 105 ° C., for example. is there.
  • the rate of temperature increase is not particularly limited, but is, for example, 0.05 to 20 ° C./second, preferably 0.08 to 5 ° C./second.
  • the determination of the presence or absence of the test nucleic acid can be performed, for example, by measuring signal fluctuations during hybridization. That is, when a hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop is measured.
  • a labeled probe for example, a guanine quenching probe
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization
  • the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease.
  • a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization it does not emit fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated, but the hybrid is not released due to a decrease in temperature. Once formed, it will fluoresce. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
  • the signal variation may be analyzed and determined as a Tm (melting temperature) value.
  • the nuc gene detection kit of the present invention includes the nucleic acid primer set and can be used in the nuc gene detection method. It is preferable that the kit further includes the nucleic acid probe and, in addition to that, a reagent necessary for a nucleic acid amplification reaction and / or a nucleic acid amplification product detection reaction as appropriate.
  • Example 1 Detection of methicillin resistance gene from DNA derived from MRSA
  • GENECUBE registered trademark manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used for nucleic acid amplification and melting curve analysis.
  • Reagents A solution containing the following reagents was prepared. 100 ⁇ M nucleic acid primer (SEQ ID NO: 4) 0.25 ⁇ l 100 ⁇ M nucleic acid primer (SEQ ID NO: 7) 0.05 ⁇ l 10 ⁇ M nucleic acid probe (SEQ ID NO: 9, 3 ′ end labeled with BODIPY-FL) 0.3 ⁇ l KOD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 ⁇ l PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 ⁇ l Sample MRSA genome equivalent to 100 copies or purified water (3 ⁇ l) 0.4 ⁇ l purified water
  • Nucleic acid amplification and melting curve analysis 94 ° C, 2 minutes (1 cycle or more) 97 ° C, 1 second 58 ° C, 3 seconds 63 ° C, 5 seconds (over 50 cycles) 94 ° C, 30 seconds 39 ° C, 30 seconds 39 ° C to 75 ° C (temperature rises at 0.09 ° C / second)
  • FIG. 1 shows nucleic acid amplification using the nucleic acid primer set, and the change in the fluorescence amount with the subsequent increase in temperature, the analysis result with the horizontal axis of the graph as the temperature and the vertical axis as the differential value of the fluorescence signal.
  • FIG. 1 When a methicillin resistance gene is present, a partial region of the methicillin resistance gene is nucleic acid amplified by the nucleic acid primer set, and the nucleic acid amplification product and the nucleic acid probe are hybridized in the subsequent step.
  • the nucleic acid probe is labeled with a fluorescent substance that has the property of quenching when hybridized.
  • the hybridized nucleic acid probe dissociates from the nucleic acid amplification product and emits light, so that the amount of fluorescence changes. Therefore, if a change in the amount of fluorescence can be detected, the presence of the methicillin resistance gene can be confirmed. From FIG. 1, when the above method was carried out using the MRSA genome as a sample, a change in the amount of fluorescence was observed, and a methicillin resistance gene was detected (FIG. 1 PC). On the other hand, when water was used as a sample in the same manner, no gene was detected (FIG. 1 NC). From the above, it was shown that the detection method of the present invention is effective for detecting a methicillin resistance gene.
  • Example 2 Confirmation of storage stability of detection reagent using nucleic acid primer set of the present invention
  • reagent (1) The following reagent (1) was prepared.
  • PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 150 ⁇ l
  • IC Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 50 ⁇ l
  • Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 4) 1250 pmol
  • Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 7 ) 250 pmol
  • nucleic acid probe SEQ ID NO: 9 with 150 pmol added
  • FIG. 2 shows the results of this example.
  • a detection peak could be confirmed (FIG. 2 PC).
  • water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 2 NC).
  • Example 3 Extended storage stability confirmation of detection reagent using nucleic acid primer set of the present invention
  • Reagent (1) of Example 2 was stored for an additional 3 months under the same conditions as in Example 2, and stored for a total of 6 months. After storage for 6 months, a reaction solution having the following composition was prepared.
  • Reagent (1) 4 ⁇ l KOD Mix 3 ⁇ l Sample MRSA genome equivalent to 200 copies or water
  • FIG. 3 shows the results of this example.
  • a detection peak could be confirmed (FIG. 3 PC).
  • water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 3 NC).
  • Comparative Example 1 Confirmation of Storage Stability of Detection Reagent Using Different Nucleic Acid Primers and Nucleic Acid Probes (1) Preparation of Sample Same as Example 2. (2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 2.
  • Reagent (2) The following reagent (2) was prepared.
  • PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 150 ⁇ l
  • IC Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 50 ⁇ l
  • Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 11) 150 pmol
  • Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 12) )
  • nucleic acid probe (SEQ ID NO: 9) with 150 pmol added
  • Reagent (2) and KOD Mix were stored at 7-10 ° C. for 3 months. After completion of storage for 3 months, a reaction solution having the following composition was prepared.
  • Reagent (1) 4 ⁇ l KOD Mix 3 ⁇ l Sample MRSA genome equivalent to 200 copies or water
  • FIG. 4 shows the results of this comparative example.
  • the detection reagent using the nucleic acid primer set of the comparative example had a problem in storage.
  • the nucleic acid primer set the only difference between the examples and the comparative example is the nucleic acid primer set. Therefore, it is considered that the difference in the storage period can be attributed to different nucleic acid primer sets. From the above, the nucleic acid primer set of the present invention can provide a detection reagent more suitable for storage.
  • Example 4 Confirmation of storage stability (temperature change) of detection reagent using nucleic acid primer set of the present invention] (1) Preparation of sample Same as Example 1. (2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
  • reagent (1) The following reagent (1) was prepared.
  • PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 150 ⁇ l
  • IC Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 50 ⁇ l
  • Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 4) 1250 pmol
  • Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 7 ) 250 pmol
  • nucleic acid probe SEQ ID NO: 9 with 150 pmol added
  • FIG. 5 shows the results of this example.
  • a detection peak could be confirmed (FIG. 5 PC).
  • water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 5 NC).
  • the detection reagent using the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe of the present invention can maintain the reagent performance even when stored for 3 months at 2 to 5 ° C., which is a lower temperature than Examples 1 to 3. It was revealed. From Examples 1 to 3 and this example, it was shown that the composition using the nucleic acid primer set of the present invention can be stored under general refrigeration conditions without requiring strict temperature control.
  • Example 5 Sequence analysis of nuc gene
  • (2) Nucleic acid amplification and sequencing The following reagents were added to the above samples, respectively, and the nuc gene was nucleic acid amplified by PCR under the following conditions. The nucleic acid amplification product was subjected to sequence analysis using nucleic acid primers used in PCR, and the base sequence was decoded.
  • Nucleic acid amplification reagent A solution containing the following reagents was prepared. 1.0 ⁇ l of 10 ⁇ M nucleic acid primer (SEQ ID NO: 26) 10 ⁇ M nucleic acid primer (SEQ ID NO: 27) 1.0 ⁇ l 10 ⁇ KOD Plus Buffer Ver. 2 (Toyobo) 2.5 ⁇ l 25 mM MgSO 4 1.5 ⁇ l 2 mM dNTP 2.5 ⁇ l KOD -Plus- 0.5 ⁇ l Sample 2 ⁇ l 14 ⁇ l of purified water
  • Example 6 Detection of nuc gene using the primer / probe of the present invention
  • a colony dilution obtained by suspending a cocci colony in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and diluting it 10 times with the above Tris buffer was used as a sample.
  • the former was sample 3 and the latter was sample 4.
  • Sample 3 has a nuc gene containing a base sequence consisting of SEQ ID NO: 13
  • sample 4 has a nuc gene containing a base sequence consisting of SEQ ID NO: 14.
  • purified water was used as a sample as a negative control (NC).
  • NC negative control
  • Reagents A solution containing the following reagents was prepared. 100 ⁇ M nucleic acid primer (any one of SEQ ID NOs: 18, 19, and 20) 0.15 ⁇ l 0.3 ⁇ l of 10 ⁇ M nucleic acid primer (SEQ ID NO: 22) 10 ⁇ M nucleic acid probe (SEQ ID NO: 24, 3 ′ end labeled with BODIPY-FL) 0.3 ⁇ l KOD Mix (Gen Cube Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 ⁇ l PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 ⁇ l Sample One of sample 3, sample 4 and purified water (1 ⁇ l) 2.25 ⁇ l of purified water
  • Nucleic acid amplification and melting curve analysis 94 ° C, 2 minutes (1 cycle or more) 97 ° C, 1 second 58 ° C, 3 seconds 63 ° C, 5 seconds (over 50 cycles) 94 ° C, 30 seconds 39 ° C, 30 seconds 39 ° C to 75 ° C (temperature rises at 0.09 ° C / second)
  • FIG. 6 shows that the nucleic acid amplification was performed using the nucleic acid primer / probe combination consisting of SEQ ID NO: 18 for the forward primer, SEQ ID NO: 22 for the reverse primer, and SEQ ID NO: 24 for the nucleic acid probe.
  • FIG. 6 is a graph showing the analysis results of the change in the graph with the horizontal axis of the graph representing the temperature and the vertical axis representing the differential value of the fluorescence signal. As is clear from FIG. 6, the nuc gene is detected from both sample 3 (F6, sample 3) and sample 4 (F6, sample 4).
  • nucleic acid primer of the present invention can amplify a partial region of any of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, and the nucleic acid probe of the present invention can detect both the nucleic acid amplification products derived from SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • the method of the present invention has been shown to be a method that can detect both a nuc gene having a base sequence including SEQ ID NO: 13 and a nuc gene having a base sequence including SEQ ID NO: 14. .
  • FIG. 9 is a graph showing the results of analysis of the change in fluorescence intensity with subsequent increase in temperature with the above reagent composition, with the horizontal axis of the graph representing temperature and the vertical axis representing the differential value of the fluorescence signal. From FIG. 9, the nuc gene was detected from sample 3 (comparative sample 3), but sample 4 obtained the same results as NC (comparative sample 4, comparative NC), and the nuc gene from sample 4 was obtained. It is clear that no detection has been made.
  • nucleotide sequence including the nuc gene having the nucleotide sequence including SEQ ID NO: 13 and the nucleotide sequence including SEQ ID NO: 14 as in the present invention It has been shown that it cannot be a method capable of detecting both of the nuc genes having. From the above, it was shown that it is important to carry out the detection method of the present invention using a nucleic acid primer set and a nucleic acid probe having the characteristics defined in the present invention.
  • a detection method excellent in both rapidity and accuracy can be provided.
  • a detection reagent that can be stored refrigerated can be provided by using the nucleic acid primer set of the present invention.
  • the present invention for genetic testing of Staphylococcus aureus it is possible to detect Staphylococcus aureus with both high speed and accuracy and high sensitivity.
  • Methods and detection reagents can be provided.

Abstract

　本発明は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。または、本発明が解決しようとする課題は、新たに発見された変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌を、通常の黄色ブドウ球菌と同様に検出するための方法および該方法を実施するための検出試薬に関する。　特定のフォワードプライマーと、特定のリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット、または、特定のフォワードプライマー、リバースプライマー、および、プローブを用いる、黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出するための方法。

Description

メチシリン耐性遺伝子の検出方法および黄色ブドウ球菌の検出方法
　本発明は、迅速、確実かつ簡便なメチシリン耐性遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用するメチシリン耐性遺伝子の検出方法、ならびに該検出方法を実行するための試薬に関する。
　本発明は、また、従来知られていなかった遺伝子変異を有する黄色ブドウ球菌を検出するための試薬に関する。
（１）
　メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、メチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ遺伝子）を獲得した黄色ブドウ球菌であり、幅広い抗生物質に対する耐性を示す。また、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌属でもメチシリン耐性遺伝子を獲得することがある。
　メチシリン耐性を試験する方法としては、薬剤感受性試験、メチシリン耐性遺伝子がコードするＰＢＰ－２’を抗ＰＢＰ－２’抗体を用いたイムノアッセイで検出する方法、メチシリン耐性遺伝子又は該遺伝子と連鎖するＤＮＡをＰＣＲで増幅して検出する方法などが実施されている（非特許文献１、非特許文献２）。
　薬剤感受性試験およびイムノアッセイ法は検査の前段階として被験者から得られた黄色ブドウ球菌を培養する必要がある。このため培養に要する時間も含めると検査には一日以上を要する。
　これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌の遺伝子以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌の遺伝子を検出することが可能である（非特許文献３）。
　核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も一般的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
　この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて正確性に優れたメチシリン耐性遺伝子検出方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１に記載の検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。
（２）
　黄色ブドウ球菌は、常在菌であり、かつ血流感染、肺炎、髄膜炎など様々な感染症の原因菌である。特に血流感染の場合は様々な合併症を引き起こしうるため、早期にかつ正確に診断する方法が必要不可欠である。
　通常、黄色ブドウ球菌の検査はグラム染色およびコアグラーゼ試験によって行われることが多い。これは、人から通常検出され、かつコアグラーゼ陽性であるブドウ球菌は黄色ブドウ球菌のみであるという知見に基づく。該方法は広く知られる検査法であるが、分離培養を行って得られたコロニーに対して行われるため、検査を行うにはまず菌の培養を行わなければならない。
　これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌を検出することが可能である（非特許文献３）。核酸増幅検査では、例えば黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子（熱安定性ヌクレアーゼをコードしている遺伝子）をＰＣＲによって増幅し検出する方法が知られている（非特許文献４）。
　核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も古典的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
　この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて正確性に優れた黄色ブドウ球菌の遺伝子検出方法が提案されている（特許文献３）。特許文献３に記載の検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。
特開２０１３－４８６２０ 特開２０１０－２３３５０５ 特開２０１３－４８６１９
Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1685-1691 Journal of Clinical Microbiology, July 2000, p.2170-2173 German Medical Science, July, 2009, 7:Doc06 Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1654-1660
（１）
　本発明者らは、より優れたメチシリン耐性遺伝子検出方法の確立を目指して、液状における保存安定性に着目した。すなわち本発明が解決しようとする課題は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。
　核酸増幅検査を行うための検出試薬には一定期間保存可能であることが求められる。検査を行うごとに試薬を調製する必要がなければ迅速な検査が可能となる。また、試薬調製時に外来ＤＮＡ等によるコンタミネーションが生じる危険を大幅に低減もしくは排除することができ、結果として検査の正確性の向上にも寄与する。しかし特許文献１に記載の検出系は一定期間の安定性については確認されていなかった。
　一方、特許文献２にはＤＮＡポリメラーゼとマグネシウムイオンおよび核酸プライマーとを別の液状組成物にすることで、液状における保存安定性を向上させる方法が記載されている。しかし前記文献では使用する核酸プライマーの違いによって保存期間が左右されるかどうかについて十分な検証がされていなかった。
（２）
　特許文献３ではｎｕｃ遺伝子を標的として検出する方法が提示されている。しかし、該方法はｎｕｃ遺伝子の塩基配列に変異が生じた場合、プライマーまたはプローブのミスマッチが生じてｎｕｃ遺伝子を検出できなくなる可能性があった。そして現実に、本発明者らは、特許文献３に記載の方法で検出できないタイプの黄色ブドウ球菌を発見した。
　本発明が解決しようとする課題は、新たに発見された変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌を、通常の黄色ブドウ球菌と同様に検出するための方法および該方法を実施するための検出試薬に関する。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、メチシリン耐性遺伝子の一部領域を特異的に増幅し、かつ冷蔵で保存可能な組成物を提供できる核酸プライマーを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明者らは、また、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ｎｕｃ遺伝子の一部領域を特異的に増幅するための核酸プライマーおよび該核酸プライマーを用いた核酸増幅反応によって得られた増幅核酸を検出するための核酸プローブを含んだ冷蔵で保存が可能な試薬組成を見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
　下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目～１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目～３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
［項２］
　前記核酸プライマーセットを含む組成物が、液体で３ヶ月以上の冷蔵保存が可能である、項１に記載の核酸プライマーセット。
［項３］
　項１または２に記載の核酸プライマーセットであって、該組成物に含まれる核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３～５のいずれかで示される塩基配列を有し、リバースプライマーが配列番号６～８のいずれで示される塩基配列を有する、核酸プライマーセット。
［項４]
　以下の（１）～（３）の工程を含む、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法。（１）項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
［項５］
　前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される、項４に記載の方法。
［項６］
　前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基がシトシンである、項４または５に記載の方法。
［項７］
　前記核酸プローブが、配列番号９または１０で示される塩基配列を有する、項４から６のいずれかに記載の方法。
［項８］
　項４から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物。
［項９］
　項４から７のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセット、または、項８に記載の組成物を含むキット。
 [項１０]
　黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法であって、該方法は以下の工程（１）～（３）からなる方法であり、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有し、核酸プローブが（Ｃ）および（Ｄ）の特徴を有する方法。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
（Ａ）配列番号１３と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ）配列番号１４と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ）配列番号１３と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号１４と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
［項１１］
　項１０に記載の方法であって、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ´）および（Ｂ´）の特徴を有し、（２）の工程で用いられる核酸プローブが（Ｃ´）および（Ｄ´）の特徴を有する、方法。
（Ａ´）配列番号１３で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ´）配列番号１４で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ´）配列番号１３で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ´）配列番号１４で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
[項１２]
　前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される項１０または項１１に記載の方法。
[項１３]
　前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項１０～１２のいずれかに記載の方法。
[項１４]
　１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ｅ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｆ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
（Ｅ）配列番号１３で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目～６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号１５で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１～４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
[項１５]
　フォワードプライマーが配列番号１８～２０のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが配列番号２１～２３のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、項１４に記載の核酸プライマーセット。
[項１６]
　ｎｕｃ遺伝子の一部領域を検出するための核酸プローブであって、配列番号１５で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目～１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
[項１７]
　前記核酸プローブが、配列番号２４または２５で示される塩基配列を有する、項７に記載の核酸プローブ
[項１８]
　前記核酸プライマーセットが項１４または項１５に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが項１６または項１７に記載の核酸プローブである、項１０～１３のいずれかに記載の方法。
[項１９]
　項１０～１３および項１８のうちいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項１４または項１５のいずれかに記載の核酸プライマーセットと、項１６または項１７のいずれかに記載の核酸プローブとを含む組成物。
[項２０]
　項１０～１３および項１８のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項１４または項１５のいずれかに記載の核酸プライマーセットと項１６または項１７のいずれかに記載の核酸プローブ、または、項１０に記載の組成物を含むキット。
　本発明によれば、良好な保存安定性を有する液状のメチシリン耐性遺伝子検出用検出試薬、および該試薬を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法が提供可能である。
　また、本発明によれば、通常の黄色ブドウ球菌の検出と、従来報告されていなかったｎｕｃ遺伝子変異を有する黄色ブドウ球菌の検出とを区別することなく、迅速、確実かつ簡便に行うことが可能となる。
実施例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例３の結果を示す図である。 比較例１の結果を示す図である。 実施例４の結果を示す図である。 実施例６の結果を示す図である。 実施例６の結果を示す図である。 実施例６の結果を示す図である。 比較例２の結果を示す図である。
（１）
　本発明は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。
核酸プライマーセット
　本発明の様態の一つは、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセットである。該核酸プライマーセットは、下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなり、このセットを含む組成物を含む反応液によってメチシリン耐性遺伝子の一部領域を増幅することができる。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目～１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目～３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
　上記において、配列番号１はメチシリン耐性遺伝子配列の相補的配列であり、配列番号２はメチシリン耐性遺伝子配列である。配列情報はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から取得している（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＢＸ５７１８５６）。
　核酸プライマーセットは、通常は１種類（１配列）以上のフォワードプライマーと１種類（１配列）以上のリバースプライマーとで構成される。好ましくは１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとで構成される。
　このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号３～５のいずれかで示される塩基配列を有するものと、リバースプライマーとして配列番号６～８のいずれかで示される塩基配列を有するものとの組合せが好ましい。
組成物
　本発明の別の一つの様態は、メチシリン耐性遺伝子を検出する方法に用いるための前記核酸プライマーセットを含む組成物である。
　前記組成物は、メチシリン耐性遺伝子を検出する方法に用いるためのキットの構成試薬の一部分であってもよい。
　前記組成物には前記核酸プライマーセットが含まれる。前記組成物に含まれるその他の成分は特に限定されないが、後述する核酸プローブは前記組成物に含まれることが好ましく、マグネシウムイオンが前記組成物に含まれることが好ましい。前記組成物に添加されるマグネシウムイオンの形態は特に限定されないが、塩化マグネシウムや硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩として添加することが好ましい。
また、前記組成物として既存の核酸増幅用キットに含まれる試薬を利用してもよい。
　前記組成物にはＤＮＡポリメラーゼは含まれないほうが好ましい。これは、ＤＮＡポリメラーゼと核酸プライマーセットとを混合したまま保存しておくと、非特異産物が生じる可能性が考えられるためである。
　本明細書では、ＤＮＡポリメラーゼ等が含まれ、かつ前記核酸プライマーセットや核酸プローブが含まれない組成物を、前記組成物と区別して核酸増幅用試薬と記載する。
保存
　本発明の核酸プライマーセットを含む組成物は、液体で長期間冷蔵保存することが可能である。
　本明細書における「保存することが可能（保存可能）」とは、組成物の核酸増幅性能が保存によって損なわれないことを意味する。また、組成物中に、例えば核酸プローブなど、前記核酸プライマーセットによって生じる増幅産物を検出する機能を有する構成物が含まれる場合は、前記構成物による前記増幅産物の検出性能が損なわれないことも含める。
　本明細書における保存前とは、組成物を調製した直後の状態を指す。また、保存後とは所定の期間、所定の条件で静置した後の状態を指す。
　保存によって性能が損なわれないとは、必ずしも保存前後で性能変化が全く無いことを意味しない。組成物の性能としては、該組成物を適切な核酸増幅用試薬と混合した場合に標的としている核酸に対する核酸増幅性能および増幅産物検出性能が保たれていればよい。
　上記の性能が保たれていることを判定する方法は、当業者が実施できる方法であれば特に限定されない。少なくとも１つ以上の方法で確認できれば、他の方法の結果にかかわらず性能は保たれているとしてよい。
　性能が保たれていることの判定は、増幅産物検出の実施方法によっても異なるが、例えば、検出方法がアガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動であれば、増幅産物のバンドが通常実施される方法で検出可能であれば、核酸増幅性能は保たれているとしてよい。
　また、蛍光標識プローブなど、蛍光物質を利用して検出する方法を用いるのであれば、例えば、検出反応で得られる蛍光強度や蛍光変化量などのシグナル値を測定し、当該シグナル値が保存前組成物を用いて核酸増幅および増幅産物検出を実施して得られるシグナル値の３０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であれば、核酸増幅性能および増幅産物検出性能は保たれているとしてよい。
　本発明における「冷蔵」とは、一般的な冷蔵庫や低温室などの温度条件を指し、冷蔵保存とは前記条件で保存することを指す。冷蔵の温度上限は１０℃であるが、９℃であってもよいし、８℃であってもよいし、７℃であってもよいし、６℃であってもよいし、５℃であってもよいし、凍結しない範囲でさらに低い温度であってもよい。冷蔵の温度下限は凍結しない温度であればよいが、０℃であってもよいし、１℃であってもよいし、２℃であってもよいし、１０℃を超えない範囲でさらに高い温度であってもよい。温度の上限と下限の組み合わせは前記の範囲であれば任意だが、たとえば、７℃から１０℃、２℃から５℃の範囲に維持すればよい。
　前記核酸プライマーセットを用いることで、冷蔵で保存可能な組成物を用意することが可能になる。保存期間としては少なくとも３ヶ月間は保存可能であり、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２４ヶ月間保存可能である。
核酸プローブ
　後述の本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法において用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
　このような核酸プローブとして、配列番号９、１０の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。
　上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。
　標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
メチシリン耐性遺伝子の検出方法
　本発明の異なる様態として、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法が挙げられる。該方法は、以下の（１）～（３）の工程を含む。
（１）前記の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
　本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。メチシリン耐性遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
　該方法で用いられるメチシリン耐性遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記のものを用いることができる。さらに、例えばメチシリン耐性遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
被検核酸の増幅
　本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
　前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる。
　前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。
　試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
　続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
　核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
　本発明プローブが含まれる反応系でメチシリン耐性遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のメチシリン耐性遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にメチシリン耐性遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’－　３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるメチシリン耐性遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
　他方、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
　通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→　５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
　さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
　例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ　Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
　なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－が望ましい。
ＤＮＡ合成活性
　本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’－ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’－トリホスフェートのα－ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’－モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
　その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
　Ａ：　４０ｍＭ　　　　　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
　　　　１６ｍＭ　　　　　塩化マグネシウム
　　　　１５ｍＭ　　　　　ジチオスレイトール
　　　　１００μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ
　Ｂ：　２μｇ／μｌ　　　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
　Ｃ：　１．５ｍＭ　　　　ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
　Ｄ：　２０％　　　　　　トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
　Ｅ：　１μｇ／μｌ　　　キャリアーＤＮＡ
３’－５’エキソヌクレアーゼ活性
　本発明において、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’－モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
　その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８　ａｔ　２５℃），　１０ｍＭ　ＫＣｌ，　６ｍＭ　硫酸アンモニウム，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，　０．００１％　ＢＳＡ，５　μｇ　トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
　本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
　核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
　中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
　前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
　前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
　融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
　二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
　本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のメチシリン耐性遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
　標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
　標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
　本発明のメチシリン耐性遺伝子の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
　得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
　前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５～９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒～１０分であり、好ましくは１秒～５分である。
　また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５～５０℃である。
　ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌである。
　そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
　蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温～８５℃であり、好ましくは２５～７０℃であり、終了温度は、例えば、４０～１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５～２０℃／秒であり、好ましくは０．０８～５℃／秒である。
　被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
　具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
　また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
メチシリン耐性遺伝子検出キット
　本発明のメチシリン耐性遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記メチシリン耐性遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。該キットは、核酸プライマーセットを含む組成物と、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む核酸増幅用試薬とは別々の容器に充填されていることが好ましい。
（２）
　本発明は、通常のｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌と、変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌の両方を検出するための核酸プライマー（プライマー）、核酸プローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いて黄色ブドウ球菌を検出するための方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。
　本発明における通常のｎｕｃ遺伝子とは、ＮＣＢＩのアクセションＮｏ．ＢＸ５７１８５６のＲｅｇｉｏｎ８９５６６１～８９６３４７に掲載された塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子を指す。該遺伝子の３０３位～５４２位を示したものが配列番号１３である。また、本発明における「変異したｎｕｃ遺伝子」とは、３０３位～５４２位が配列番号１４で示される塩基配列であるｎｕｃ遺伝子を指す。配列番号１４の部分配列を有するｎｕｃ遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌はこれまで報告がなく、今回初めて発見された塩基配列である。
　また、配列番号１５は配列番号１３の相補的配列であり、配列番号１６は配列番号１４の相補的配列である。配列番号１７はデータベースに登録されているｎｕｃ遺伝子全体の塩基配列である。
核酸プライマーセット
　本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法において、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、１対の核酸プライマーからなり、かつ以下の（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有する。
（Ａ）配列番号１３と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
（Ｂ）配列番号１４と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
　上記の（Ａ）において、配列番号１３との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１３そのもの）である。同様に、上記の（Ｂ）において、配列番号１４との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１４そのもの）である。
　本明細書における「１対の核酸プライマーセット」は、１種類（１配列）のフォワードプライマーと１種類（１配列）のリバースプライマーとで構成される。
［核酸配列の相同性］
　本願明細書において、核酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
　ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ　ＷＩＮ　Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用できる。
　上記の核酸プライマーセットは、（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーが以下の（Ｅ）からなり、リバースプライマーが以下の（Ｆ）からなる。
（Ｅ）配列番号１３で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目～６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号１５で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１～４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
　前記（Ｅ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号１３で示される塩基配列の８３番目または８４番目のいずれかの塩基であるならば、５´末端は配列番号１３の５４番目～６５番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号１３の５６番目～６２番目であり、より好ましくは５８番目～６１番目である。
　また、前記（Ｆ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号１５で示される塩基配列の５９番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号１５の３１番目～４１番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号１５の３２～４０番目であり、より好ましくは３４～３８番目である。
　前記核酸プライマーセットを構成するそれぞれの核酸プライマーは、少なくとも３´末端から５番目までの核酸が配列番号１３および配列番号１４の両方と一致するように設計されている。従って、該核酸プライマーセットは配列番号１３で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部、および配列番号１４で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部の両方を核酸増幅することが可能になっている。
　このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号１８～２０のいずれかで示される塩基配列、および、リバースプライマーとして配列番号２１～２３のいずれかで示される塩基配列、の組合せが例示できる。
核酸プローブ
　本発明で用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
　そのような核酸プローブとして好ましくは（Ｃ）および（Ｄ）の両方の特徴を備えた核酸プローブが挙げられる。
（Ｃ）配列番号１３と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号１４と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
　上記の（Ｃ）において、配列番号１３との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１３そのもの）である。同様に、上記の（Ｄ）において、配列番号１４との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１４そのもの）である。
　前記核酸プローブの塩基配列は、前記（Ｃ）（Ｄ）を満たすものであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号１５で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目～１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プローブである。前記塩基配列の核酸プローブは、配列番号１３および１４の共通配列の一部と同じ配列を有しており、１３と１４のいずれの配列番号で示される塩基配列を含む核酸増幅産物とも複合体を形成することができる。
　このような核酸プローブとして、配列番号２４、２５の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。
　上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。
　標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法
　本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法は、試料中の黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
　該方法の一つの様態として、以下の（１）～（３）の工程を含む黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法が挙げられる。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
該方法で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
　本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。ｎｕｃ遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
　該方法で用いられるｎｕｃ遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記したものを用いることができる。さらに、例えばｎｕｃ遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
被検核酸の増幅
　本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
　前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる
　前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。
　試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
　続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
　核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
　本発明プローブが含まれる反応系でｎｕｃ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のｎｕｃ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にｎｕｃ遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’－　３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるｎｕｃ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
　他方、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
　通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’－５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
　さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
　例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ　Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
　なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－が望ましい。
ＤＮＡ合成活性
　本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’－ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’－トリホスフェートのα－ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’－モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
　その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
　Ａ：　４０ｍＭ　　　　　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
　　　　１６ｍＭ　　　　　塩化マグネシウム
　　　　１５ｍＭ　　　　　ジチオスレイトール
　　　　１００μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ
　Ｂ：　２μｇ／μｌ　　　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
　Ｃ：　１．５ｍＭ　　　　ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
　Ｄ：　２０％　　　　　　トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
　Ｅ：　１μｇ／μｌ　　　キャリアーＤＮＡ
３’－５’エキソヌクレアーゼ活性
　本発明において、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’－モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
　その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８　ａｔ　２５℃），　１０ｍＭ　ＫＣｌ，　６ｍＭ　硫酸アンモニウム，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，　０．００１％　ＢＳＡ，５　μｇ　トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
　本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
　核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
　中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
　前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
　前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
　融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
　二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
　本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のｎｕｃ遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
　標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
　標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
　本発明のｎｕｃ遺伝子の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
　得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
　前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５～９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒～１０分であり、好ましくは１秒～５分である。
　また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５～５０℃である。
　ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌである。
　そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
　蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温～８５℃であり、好ましくは２５～７０℃であり、終了温度は、例えば、４０～１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５～２０℃／秒であり、好ましくは０．０８～５℃／秒である。
　被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
　具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
　また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
ｎｕｃ遺伝子検出キット
　本発明のｎｕｃ遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記ｎｕｃ遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
　以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：ＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのメチシリン耐性遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
　　ＭＲＳＡゲノムを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
　以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号４）０．２５μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号７）０．０５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号９、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料　ＭＲＳＡゲノム１００コピー相当または精製水（３μｌ）
精製水０．４μｌ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
結果
　図１は、前記核酸プライマーセットを用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光量の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。
　メチシリン耐性遺伝子が存在する場合、核酸プライマーセットによってメチシリン耐性遺伝子の一部領域が核酸増幅され、続く工程で核酸増幅産物と核酸プローブとがハイブリダイズする。核酸プローブにはハイブリダイズすると消光する性質を持つ蛍光物質が標識されている。その後反応系の温度を上昇させると、ハイブリダイズしていた核酸プローブが核酸増幅産物から解離し発光するため、蛍光量が変化する。従って、蛍光量の変化が検出できればメチシリン耐性遺伝子の存在が確認できる。
　図１より、ＭＲＳＡゲノムを試料として上記方法を実施したところ蛍光量の変化が観測され、メチシリン耐性遺伝子が検出された（図１　ＰＣ）。一方、水を試料として同様に実施した場合は遺伝子の検出は認められなかった（図１　ＮＣ）。以上から、本発明の検出方法がメチシリン耐性遺伝子の検出に有効であることが示された。
〔実施例２：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認〕
（１）試料の調製
　　実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　実施例１と同じ。
試薬
　以下の試薬（１）を調製した。
（１）ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号４）１２５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号７）２５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
測定
　試薬（１）およびＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を７～１０℃の条件で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。保存温度は常に一定ではなく上記範囲内で上下していた。
　試薬（１）　４μｌ
ＫＯＤ　Ｍｉｘ　３μｌ
試料　ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
　核酸増幅および融解曲線解析
　実施例１と同じ。
結果
　図２は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図２　ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図２　ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、７～１０℃で３ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。
〔実施例３：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認延長〕
（１）試料の調製
　　実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　実施例１と同じ。
試薬
　実施例２と同じ。
測定
　実施例２の試薬（１）を、実施例２と同条件でさらに３ヶ月間追加で保存し、合計６ヶ月間保存した。６ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。
　試薬（１）　４μｌ
ＫＯＤ　Ｍｉｘ　３μｌ
試料　ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
　核酸増幅および融解曲線解析
　実施例１と同じ。
結果
　図３は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図３　ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図３　ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、７～１０℃で６ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。
〔比較例１：異なる核酸プライマー、核酸プローブを用いた検出試薬の保存安定性確認〕（１）試料の調製
　　実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　実施例２と同じ。
試薬
　以下の試薬（２）を調製した。
（２）ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号１１）１５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号１２）７５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
測定
　試薬（２）およびＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を７～１０℃で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。
　試薬（１）　４μｌ
ＫＯＤ　Ｍｉｘ　３μｌ
試料　ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
結果
　図４は本比較例の結果である。この例では、ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合に微弱な検出ピークしか確認できなかった（図４　ＰＣ）。また、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図４　ＮＣ）。以上から、比較例の核酸プライマーセットを用いた検出試薬は保存に問題があった。使用した試薬成分のうち前記実施例と本比較例とで異なるのは核酸プライマーセットのみである。従って、保存可能期間の差は核酸プライマーセットが異なることに由来すると考えられる。以上から、本発明の核酸プライマーセットはより保存に適している検出試薬を提供可能である。
〔実施例４：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認（温度変更）〕
（１）試料の調製
　　実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　実施例１と同じ。
試薬
　以下の試薬（１）を調製した。
（１）ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号４）１２５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号７）２５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
測定
　試薬（１）およびＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を２～５℃の条件で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。なお、保存温度は一定ではなく上記範囲内で前後していた。
　試薬（１）　４μｌ
ＫＯＤ　Ｍｉｘ　３μｌ
試料　ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
　核酸増幅および融解曲線解析
　実施例１と同じ。
結果
　図５は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図５　ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図５　ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、実施例１～３よりも低温である２～５℃で３ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。実施例１～３および本実施例から、本発明の核酸プライマーセットを用いた組成物は、厳密な温度管理を必要とせず一般的な冷蔵条件で保存可能であることが示された。
〔実施例５：ｎｕｃ遺伝子のシークエンス解析〕
（１）試料の調製
　　ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ　ＡＵＲＥＵＳ　（ｍｅｃＡ＋）　ＤＮＡ　ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００００（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁したコロニー液を試料とした。前者を試料１、後者を試料２とした。
（２）核酸増幅およびシークエンス
　　上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｎｕｃ遺伝子をＰＣＲによって核酸増幅した。この核酸増幅産物をＰＣＲで使用した核酸プライマーを用いてシークエンス解析し、塩基配列を解読した。
核酸増幅用試薬
　以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ核酸プライマー（配列番号２６）１．０μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号２７）１．０μｌ
１０×ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｖｅｒ．２（東洋紡）２．５μｌ
２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４　１．５μｌ
２ｍＭ　ｄＮＴＰ　２．５μｌ
ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　０．５μｌ
試料　２μｌ
精製水　１４μｌ　
核酸増幅
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９８℃・１０秒
６０℃・３０秒
６８℃・２０秒
（以上３５サイクル）
６８℃・１分
（以上１サイクル）
結果
　シークエンス解析の結果、試料１からは配列番号１３の塩基配列が、試料２からは配列番号１４の塩基配列が得られ、両者でｎｕｃ遺伝子の塩基配列が大きく異なることが明らかになった。
〔実施例６：本発明プライマー・プローブによるｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
　ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ　ＡＵＲＥＵＳ　（ｍｅｃＡ＋）　ＤＮＡ　ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５０（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、それをＴｒｉｓ前記緩衝液で１０倍希釈したコロニー希釈液を試料とした。前者を試料３、後者を試料４とした。試料３は配列番号１３からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有しており、試料４は配列番号１４からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有している。また、陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
　以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号１８、１９、２０のいずれか一つ）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号２２）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２４、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μｌＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料　試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
結果
　図６は、フォワードプライマーが配列番号１８、リバースプライマーが配列番号２２、核酸プローブが配列番号２４からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図６より明らかなように、試料３（Ｆ６,試料３）と試料４（Ｆ６,試料４）の両方からｎｕｃ遺伝子が検出されている。また、図７、図８は、フォワードプライマーとしてそれぞれ配列番号１９、２０の塩基配列からなる核酸プライマーを用い、リバースプライマーと核酸プローブは上記と同じものを用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでも，試料３と試料４の両方が検出されていることが明らかである。
　以上から、本発明の核酸プライマーは配列番号１３および配列番号１４のいずれの一部領域も核酸増幅可能であり、本発明の核酸プローブは配列番号１３および配列番号１４由来の核酸増幅産物の両方を検出できることが示され、また、本発明の方法は、配列番号１３を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号１４を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法であることが示された。
〔比較例２：異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いたｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
　　実施例６と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
　　実施例６と同じ。
試薬
　以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表３に記載した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号２８）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号２９）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号３０、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）０．３μｌＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料　試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
結果
　図９は上記試薬組成で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図９から、試料３からはｎｕｃ遺伝子を検出できているが（比較 試料３）、試料４はＮＣと同様の結果が得られており（比較 試料４、比較 ＮＣ）、試料４からのｎｕｃ遺伝子検出はできていないことが明らかである。
　従って、異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いると、本発明の検出方法と同様の方法を用いても、本発明のように配列番号１３を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号１４を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法には成りえないことが示された。以上から、本発明で規定した特徴を有する核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いて、本発明の検出方法を実施することが重要であることが示された。
　本発明をメチシリン耐性遺伝子遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れた検出方法を提供できる。さらに、本発明の核酸プライマーセットを用いることで冷蔵で保存可能な検出試薬を提供できる。
　また、本発明を黄色ブドウ球菌の遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に黄色ブドウ球菌を検出することができる。さらに、配列番号１３と９５％以上相同な塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌と、配列番号１４と９５％以上相同な塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌の両方を検出できる検出方法、検出試薬を提供できる。

Claims (20)

  1. 下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット。
    （Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目～１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
    （Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目～３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
  2. 前記核酸プライマーセットを含む組成物が、液体で３ヶ月以上の冷蔵保存が可能である、請求項１に記載の核酸プライマーセット。
  3. 請求項１または２に記載の核酸プライマーセットであって、該組成物に含まれる核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３～５のいずれかで示される塩基配列を有し、リバースプライマーが配列番号６～８のいずれで示される塩基配列を有する、核酸プライマーセット。
  4. 以下の（１）～（３）の工程を含む、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法。
    （１）請求項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
    （２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
    （３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
  5. 前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基がシトシンである、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記核酸プローブが、配列番号９または１０で示される塩基配列を有する、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
  8. 請求項４から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、請求項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物。
  9. 請求項４から７のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、請求項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセット、または、請求項８に記載の組成物を含むキット。
  10. 黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法であって、該方法は以下の工程（１）～（３）からなる方法であり、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有し、核酸プローブが（Ｃ）および（Ｄ）の特徴を有する方法。
    （１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
    （２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
    （３）（２）で得られた複合体を検出する工程
    （Ａ）配列番号１３と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
    （Ｂ）配列番号１４と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
    （Ｃ）配列番号１３と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
    （Ｄ）配列番号１４と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
  11. 請求項１０に記載の方法であって、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ´）および（Ｂ´）の特徴を有し、（２）の工程で用いられる核酸プローブが（Ｃ´）および（Ｄ´）の特徴を有する、方法。
    （Ａ´）配列番号１３で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
    （Ｂ´）配列番号１４で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
    （Ｃ´）配列番号１３で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
    （Ｄ´）配列番号１４で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
  12. 前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される請求項１０または請求項１１に記載の方法。
  13. 前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. １対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ｅ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｆ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
    （Ｅ）配列番号１３で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目～６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
    （Ｆ）配列番号１５で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１～４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
  15. フォワードプライマーが配列番号１８～２０のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列２１～２３のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、請求項１４に記載の核酸プライマーセット。
  16. ｎｕｃ遺伝子の一部領域を検出するための核酸プローブであって、配列番号１５で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目～１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
  17. 前記核酸プローブが、配列番号２４または２５で示される塩基配列を有する、請求項１６に記載の核酸プローブ。
  18. 前記核酸プライマーセットが請求項１４または請求項１５に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが請求項１６または請求項１７に記載の核酸プローブである、請求項１０～１３のいずれかに記載の方法。
  19. 請求項１０～１３および請求項１８のうちいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、請求項１４または請求項１５のいずれかに記載の核酸プライマーセットと、請求項１６または請求項１７のいずれかに記載の核酸プローブとを含む組成物。
  20. 請求項１０～１３および請求項１８のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、請求項１４または請求項１５のいずれかに記載の核酸プライマーセットと請求項１６または請求項１７のいずれかに記載の核酸プローブ、または、請求項１０に記載の組成物を含むキット。
     
     
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008520232A (ja) * 2004-11-22 2008-06-19 ビオ−ラド・パストゥール 核酸を増幅するための組成物
WO2009084603A1 (ja) * 2007-12-27 2009-07-09 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. エクオール合成に関与する酵素
JP2010233505A (ja) * 2009-03-31 2010-10-21 Toyobo Co Ltd 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
JP2011500062A (ja) * 2007-10-19 2011-01-06 ニューヨーク ブラッド センター， インコーポレイテッド 血液型群遺伝子の検出
JP2013048620A (ja) * 2011-08-03 2013-03-14 Toyobo Co Ltd メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法
JP2013535951A (ja) * 2010-03-19 2013-09-19 ザ トランスレーショナル ゲノミクス リサーチ インスティテュート Ｍｒｓａの検出のための方法、キット及び組成物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008520232A (ja) * 2004-11-22 2008-06-19 ビオ−ラド・パストゥール 核酸を増幅するための組成物
JP2011500062A (ja) * 2007-10-19 2011-01-06 ニューヨーク ブラッド センター， インコーポレイテッド 血液型群遺伝子の検出
WO2009084603A1 (ja) * 2007-12-27 2009-07-09 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. エクオール合成に関与する酵素
JP2010233505A (ja) * 2009-03-31 2010-10-21 Toyobo Co Ltd 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
JP2013535951A (ja) * 2010-03-19 2013-09-19 ザ トランスレーショナル ゲノミクス リサーチ インスティテュート Ｍｒｓａの検出のための方法、キット及び組成物
JP2013048620A (ja) * 2011-08-03 2013-03-14 Toyobo Co Ltd メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAKSTAD ODD G. ET AL.: "Detection of Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 30, no. 7, 1992, pages 1654 - 1660 *
CHIKKALA ROSY ET AL.: "Heterogeneity in femA in the Indian Isolates of Staphylococcus aureus Limits Its Usefulness as a Species Specific Marker", ADVANCES IN INFECTIOUS DISEASES, vol. 2, 2012, pages 82 - 88 *
CHU CHISHIH ET AL.: "Genetic and Antimicrobial Susceptibility Variations of Staphylococcus aureus from Dairy Goat Raw Milk", TAIWAN VETERINARY JOURNAL, vol. 37, no. 1, 2011, pages 1 - 11 *
DATABASE NCBI 24 November 2011 (2011-11-24), accession no. R 821777 *
MCDONALD RYAN R. ET AL.: "Development of a Triplex Real-Time PCR Assay for Detection of Panton-Valentine Leukocidin Toxin Genes in Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 43, no. 12, 2005, pages 6147 - 6149 *
PICHON BRUNO ET AL.: "Development ot a real-time quadruplex PCR assay for simultaneous detection of nuc, Panton-Valentine leucocidin (PVL), mecA and homologue mecALGA251", JOURNAL OF ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY, vol. 67, 2012, pages 2338 - 2341 *

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