CN101506384A - 专一性寡核苷酸和其在核酸扩增与检测中的用途 - Google Patents
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Abstract
本文阐述可用于核酸扩增反应中的经标记探针和未经标记寡核苷酸。对这些探针和寡核苷酸加以修饰以相对于其相应的未经修饰对应物改变其对热稳定DNA聚合酶非引物依赖性5’外切核酸酶活性的敏感性。本文也阐述采用这些经标记探针和未经标记寡核苷酸的不对称聚合酶链反应(PCR)扩增和检测方法。本文也阐述包括经标记探针和未经标记寡核苷酸的核酸扩增反应试剂盒。
Description
相关申请交叉参考案
本申请案主张2006年7月17日申请的美国临时专利申请案第60/831,223号的优先权和权益,其全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本申请案涉及核酸扩增反应和扩增产物的检测,具体来说其包括采用聚合酶链反应(一般称为PCR)的扩增。
背景技术
核酸扩增技术和分析为人所熟知。某些扩增DNA的反应是等温的,例如基于核酸序列的扩增(NASBA)。其它技术采用热循环,例如聚合酶链反应(PCR)。采用使用PCR的扩增的扩增和分析阐述于(例如)美国专利第4,683,202号、第4,683,195号和第4,965,188号中,并且概述于PCR方案,方法和应用的引导(PCR PROTOCOLS,aguide to Methods and Applications),英尼斯(INNIS)等人编辑,学术出版社(AcademicPress)(圣地亚哥,CA(USA)1990)中,所述各文献都是全文以引用方式并入本文中。PCR扩增一般设计为对称性,也就是说通过使用等摩尔或大致等摩尔浓度的匹配引物对(也就是说具有相等熔融温度(Tm′s)的正向引物和反向引物)来制备双链产物(或“扩增子”)。已发现在用PCR扩增反应直接大量制备单链扩增子中具有有限应用的技术是阐述于以下文献中的“不对称PCR”:吉伦斯顿(Gyllensten)和厄里克(Erlich),“通过聚合酶链反应生成单链DNA和其在HLA-DQA基因座直接测序中的应用(Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and ItsApplication to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus)”,国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)85:7652-7656(1988);和美国专利第5.066,584号。不对称PCR是不对称PCR扩增方法,其与对称PCR的不同之处在于将引物中的一种稀释至五分之一至百分之一浓度,以使其以其它三种引物浓度1-20%的有限量存在。因此,扩增由指数期和随后的线性扩增组成,在指数期中两种引物延伸生成双链扩增子,并且在线性扩增中仅保留一种引物,其生成单链扩增子。
较新的不对称PCR扩增方法是“指数后线性扩增PCR”(LATE-PCR),其以不同浓度使用各引物但其中所述引物并不像对称PCR和不对称PCR中那样是“匹配的”。桑切斯(Sanchez)等人(2004),国家科学院学报(USA)101:1933-1938,公开的国际专利申请案WO03/054233(2003年7月3日),和皮尔斯(Pierce)等人(2005),国家科学院学报(USA)102,8609-8614,上述所有文献都是全文以引用方式并入本文中。DNA扩增方法可通过以下方式用于RNA靶:首先实施逆转录以产生cDNA,然后通过(例如)上述PCR方法中的一种对其实施扩增。
可以各种方式实施核酸扩增产物的检测和分析。可使用在嵌入双链DNA后或在与双链DNA交互作用后发荧光的染料来监测双链扩增子,例如SYBR绿或SYBR金。例如,可参见美国专利第5,994,056号。可对扩增子实施测序反应,例如习用双脱氧测序或焦磷酸测序、实时测序-合成方法。杂交探针通常用于检测中。探针可经标记或未经标记。杂交探针的检测可通过以下方式来进行:物理特征,例如尺寸;在诸如成色反应等后续事件中的参与;或检测施用至探针的标记,例如放射活性或荧光标记。经标记探针的实例是在引物延伸期间解离的5’核酸酶探针(美国专利第5,210,015号、第5,487,972号和第5,538,848号)、分子信标探针(美国专利第5,925,517号、第6,103,476号和第6,365,729号)、尹-杨(Yin-Yang)双链探针(李(Li),Q.等人(2002),核酸研究(Nucl.Acid Res.),30:e5)和FRET探针对。
所有上述基于PCR的扩增方法都依赖自细菌来源回收的热稳定DNA聚合酶的作用。在其天然形式中,这些酶是具有若干个结构域和若干种活性的单一多肽:包括3’-5’聚合酶、5’-3’外切核酸酶、和3’-5’编辑功能(商用酶中缺失此功能)。包括热启动形式在内的Taq DNA聚合酶(来自水生栖热菌(Thermus aquaticus))使用最为广泛,但TfiDNA聚合酶(英杰(Invitrogen)公司,产品编号30342-011)是另一种所述酶。除了这些热稳定DNA聚合酶外,存在若干种热稳定DNA聚合酶,其也可实施使RNA变为DNA的逆转录,以及DNA链的聚合和某些5’末端的外切核酸酶解离。这些酶包括ZO5聚合酶和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(TTH)聚合酶。
已使用Taq聚合酶对在热稳定DNA聚合酶中所发现的5’-3’外切核酸酶活性实施充分研究。例如,此外切核酸酶活性是结合对称PCR使用的所谓5’核酸酶分析的基础。5’核酸酶分析使用两种引物和一种探针。探针是线性或不规则螺旋DNA寡核苷酸,其具有与一个末端核苷酸共价连接的荧光团和与另一个末端核苷酸共价连接的非荧光性猝灭剂。其与两个靶链中结合两个引物之一的一条链杂交。5’核酸酶探针的熔融温度高于其上游引物,因此探针位于延伸引物的下游。具有5’-3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶遇到并解离探针的5’末端,同时所述酶的3’-5’聚合酶结构域延伸引物的3’末端。如果探针在其5’末端具有荧光性部分,那么所述部分和其共价连接的核苷酸通过解离与寡核苷酸的其余部分分离。如果寡核苷酸的剩余部分仍与靶序列结合,那么通过上述聚合酶的5’外切核酸酶再次对其实施解离。此为探针的引物依赖性解离。
探针的引物依赖性解离具有以下特征:1)引物的3’末端必须具有未封闭(或未加帽)3’-OH基团。因此,向所述3’-OH加成-PO4或其它化学部分或移除所述3’-OH可阻止解离。2)引物必须前进至和/或“侵入”探针的5’末端。因此,除下文所述情况外,如果引物未前进至探针的5’末端,那么一或多个来自引物依赖性反应的核苷三磷酸的缺失可阻止解离。此规则的例外情况是可设计具有3’-OH的引物,其不发生额外延伸即可侵入探针的5’末端。3)如果引物的3’末端已侵入探针的5’末端,那么所述3’末端必须与靶序列互补。因此,即使3’-OH未经加帽,在引物3’末端的2个或更多个核苷酸的非互补3’延伸(臂)也可阻止探针的引物依赖性解离。移除Taq聚合酶的5’-3’结构域可生成称为斯托费尔(Stoffel)片段的酶。采用斯托费尔片段的PCR扩增不能使用5’核酸酶(TAQMAN,罗氏分子系统(Roche Molecular Systems)的商标)探针。在诸如分子信标等探针的整个长度上使用某些经修饰核苷酸(例如2′邻甲基核苷酸)来构造探针可阻止探针的引物依赖性解离。
莱明查(Lyamichev)等人(生物化学(Biochemistry)(2000)39:9523-9532)基于这三个寡核苷酸结构特征阐述了特征为探针的引物依赖性解离的侵入性信号扩增反应。其报导“通过在高温下进行反应,下游寡核苷酸循环发生与靶的结合和分离,从而使每个靶分子在没有温度循环的情况下发生多次解离事件”。
同样已知热稳定DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性可对探针-靶杂合体实施非引物依赖性解离。已使用发夹形靶分子对此反应进行研究,所述分子具有16个碱基对的茎部、4个核苷酸的环、和经P32-PO4标记的5’末端。发夹的两个臂等长(即其具有平头末端),或3’臂延伸超过5’末端,或5’末端延伸超过3’末端。使用具有此设计的分子可显示Taq聚合酶的非引物依赖性5’-3’外切核酸酶活性具有以下特征:1)莱明查,V.等人(科学(Science)260,778-783(1993))报导,在无引物情况下,Taq聚合酶的5’-3’核酸酶在底物链与靶链的最后两个碱基对之间解离发夹底物的凹陷5’末端。2)莱明查等人((国家科学院学报)96:6143-6148(1999))证实,完整Taq聚合酶(TaqNP)的5’-3’外切核酸酶活性不能有效解离3’末端凹陷6个核苷酸的发夹结构的5’末端。这些作者得出结论:“解离的低效可能是由于此酶的聚合酶结构域与双螺旋的末端结合,其类似于模板-引物复合体”。其未测试与靶杂交探针而非靶杂交引物类似的底物。
对于某些扩增目的和某些检测目的来说,业内已知的扩增方法和检测方法不合适或具有局限性。例如,多重PCR分析只能通过发不同颜色荧光的探针来区分5或6个靶。同样,在含有高丰度等位基因的样品中极难检测到稀有等位基因。
发明内容
在一实施例中,本发明提供包括使用低温线性DNA杂交探针来实施信号扩增的不对称PCR方法,对所述探针进行修饰以使其相对于其相应的未经修饰对应物对热稳定DNA聚合酶的非引物依赖性5’外切核酸酶活性敏感。
在另一实施例中,本发明提供包括检测低温线性DNA杂交探针的杂交的不对称PCR方法,对所述探针实施修饰以使其可抵抗热稳定DNA聚合酶的非引物依赖性5’外切核酸酶活性。
在另一实施例中,本发明提供选择性阻断一种靶或等位基因的扩增的PCR方法。
附图说明
图1展示不同类型探针的示意图。
图2展示图1中所示探针的各种解离机制的示意图。
图3展示低温探针相对于引物和靶的最佳Tm关系的示意图。
图4 ZO5解离各种探针结构的能力。
图5A:ZO5聚合酶,将用TET EXO-R探针检测的H5和用FAM EXO-R探针检测的H3扩增10,000份拷贝。
图5B:图5A的熔融曲线。
图5C:铂Taq聚合酶,将用TET EXO-R探针检测的H5和用FAM EXO-R探针检测的H3扩增10,000份拷贝。
图5D:图5B的熔融曲线。
图6展示EXO-R探针与实例3和图7中所用各引物对的关系的示意图。
图7A:在用高Tm引物对实施的实时LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的95℃分析。
图7B:在用高Tm引物对实施的实时LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的45℃分析。
图7C:在使用高Tm引物对实施的LATE-PCR中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的终点熔融曲线分析。
图7D:在用中Tm引物对实施的实时LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的95℃分析。
图7E:在用中Tm引物对实施的实时LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的45℃分析。
图7F:在用中Tm引物对实施的LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的终点熔融曲线分析。
图7G:在用低Tm引物对实施的实时LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的95℃分析。
图7H:在用低Tm引物对实施的实时LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的45℃分析。
图7I:在用低Tm引物对实施的LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探针的终点熔融曲线分析。
图8:在5’末端使用FAM的EXO-S探针。
图9:在5’末端使用BHQ1的EXO-R探针。
图10:使用EXO-R ROX探针来检测7500份拷贝的新城(Newcastle)DNA扩增子。
图11:在等温条件对振荡条件下EXO-S探针的解离速率。
图12:EXO-S探针与其互补靶3’末端的距离影响解离速率。
图13:在45℃至70℃振荡期间探针5’末端与靶发生单碱基配对错配时的不同信号生成速率(情况1)。
图14:在45℃至70℃振荡期间探针5’末端与靶发生单碱基配对错配时的不同信号扩增速率(情况2)。
图15:在30分钟内于等温条件(50℃)下的信号扩增速率。
图16:在振荡条件下(45℃至70℃)的信号扩增速率。
图17:增加探针5’臂的长度可影响到其是EXO-S探针还是EXO-R探针。
具体实施方式
A.定义
本文所用“样品”可为任一待测试材料,例如生物或环境样品。生物样品可自任一有机体获得。在一实施例中,可自诸如人类等哺乳动物、伴侣动物、或家畜来获得样品。也可自其它动物获得样品,例如鸟类。在一实施例中,来自动物的样品包含鼻咽抽出液、血液、唾液、粪便、尿、或任何其它体液。在另一实施例中,可自任何环境获得环境样品,例如土壤、水、人造结构的环境和表面。
本文所用“扩增靶序列”、“靶序列”与“核酸靶序列”可互换,其意指为通过扩增反应(例如PCR扩增技术)复制提供模板的DNA序列。扩增靶序列可为单链或双链。如果起始材料是RNA(例如信使RNA),那么通过RNA的逆转录产生互补DNA(cDNA)来产生DNA扩增靶序列,并且扩增靶序列是cDNA分子。因此,在RNA的PCR分析中,杂交探针与cDNA扩增靶序列杂交并由此表现cDNA扩增靶序列的复制,间接表明存在通过逆转录产生含扩增靶序列的cDNA分子的RNA。整个长度的扩增靶序列的两端通常是一对用于其扩增的引物。不论是双链或是单链,延伸产物或“扩增子”都由引物对界定。扩增靶序列可为单一核酸序列。然而,在某些情况下,其可含有等位基因变异或突变且因此不是单一序列。
本文所用“Tm”是指在一半标的核酸物质以双链形式存在并且剩余部分为单链时的温度。在历史上,引物、探针或扩增子的Tm是在引物和盐浓度的标准条件下使用“%GC”法(怀特玛(Wetmar),J.G.(1991),“DNA探针:核酸杂交原理的应用(DNAProbes:Applications of the Principles of Nucleic Acid Hybridization)”,生物化学与分子生物学研究评论(Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.)26:227-259)或“2(A+T)加4(G+C)”法计算得到的数值,这两种方法都为人所熟知。然而,通过使用“最近邻”方法(桑塔露琪亚(Santa Lucia),J.(1998)PNAS(USA)95:1460-1465),LATE-PCR在确定Tm时考虑实际引物和探针起始浓度(桑切斯(Sanche)等人(2004),PNAS(USA)101:1933-1938,和皮尔斯(Pierce)等人(2005),PNAS(USA)102:8609-8614),其使用下式来计算Tm:Tm=ΔH/(ΔS+R ln(C/2))+12.5log[M]-273.15(里诺沃(Le Novere),N.(2001),“熔融,计算核酸双螺旋的熔融温度(MELTING,Computing the MeltingTemperature of Nucleic Acid Duplex)”,生物信息学(Bioinformatics)17:1226-7)。ΔH是焓并且ΔS是熵(ΔH与ΔS计算是基于阿拉维(Allawi),H.T.和桑塔露琪亚,生物化学期刊(J.Biochem.)(1997)36:10581-10594),C是寡核苷酸的浓度,R是普适气体常数,并且[M]是单价阳离子的摩尔浓度(在实例中为0.07)。根据此公式,寡核苷酸的核苷酸碱基组成(含于术语ΔH和ΔS中)、单价盐浓度、和寡核苷酸的浓度(含于术语C中)可影响Tm。然而,尽管PCR缓冲液中所用镁或其它二价阳离子的浓度未包括于此式中,但已知二价阳离子可提高Tm。通常使用3mM镁可将探针Tm提高约5℃。因此,如果期望Tm是50℃,并且使用3mM镁,那么上述不使用镁的Tm最近邻公式应得出45℃的Tm,然后根据经验对其进行检验,并且根据需要对探针长度和组成进行最小调整。已发现来自DNA Software(安阿伯,MI)的授权软件VisualOMP(6.1.9版)软件包括对最近邻公式的此一调整,并且所产生结果接近根据经验确定的结果。除非另外说明,否则本文中在提及引物或探针的Tm时意指考虑到镁浓度的数值。
本文所用“等位基因识别”和“序列特异性”二者都是指探针(或者在某些情况下指引物)与完全互补的靶序列选择性杂交并且强烈排斥具有一个或几个错配碱基的紧密相关序列的能力。本文所用“错配耐受性”是指探针(或者在某些情况下指引物)与完全互补序列和具有一或多个错配碱基的部分互补序列杂交的能力。
本文所用“单管”是指包含至少两个操作(例如样品制备、扩增或测序)的系列的方法,在实施时可不将样品自一个容器(试管、反应孔、微流体器件中的室、玻璃载玻片、或能容纳反应混合物的任何其它装置)转移至另一个容器中。
本文所用“外切核酸酶活性”是指PCR扩增中所用包括Taq DNA聚合酶在内的热稳定聚合酶的酶特性之一。外切核酸酶活性是指不同于3’-5’消化的5’-3’消化,其可视为酶的校对阅读功能。外切核酸酶活性并不意欲表示精确解离DNA糖-磷酸酯骨架的模式或定位,具体来说解离发生在与5’末端连接的部分与末端5’核苷酸之间,或发生在末端与倒数第二位5’核苷酸之间,或发生在3’末端下游的一或多个核苷酸之间。除非另外说明,否则用途阐述于本文中的所有聚合酶都应理解为单独包括外切核酸酶结构域,或同时包括将碱基对加成至上游引物3’末端的聚合酶结构域。
本文所用“引物依赖性”解离是指杂交寡核苷酸在其引物的延伸期间遇到聚合酶后解离。已知引物依赖性解离需要延伸链上存在3’末端-OH。甚至在不存在dNTP的情况下,本文所用“引物依赖性”解离也包括在上游寡核苷酸的3’-OH替代下游寡核苷酸(例如杂交探针)的5’末端时引发的解离。例如磷酸根基团的化学加成(加帽)和末端2′3’双脱氧核苷酸的存在是阻止引物依赖性解离的已知途径,如同下游寡核苷酸中某些非天然核苷酸和非天然核苷酸间连接一般。
本文所用“非引物依赖性”解离是指杂交寡核苷酸通过聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性发生的5’-3’解离,其与引物依赖性解离不同。在此情况下,聚合酶直接结合寡核苷酸/靶杂合体并解离所结合寡核苷酸的5’末端。不涉及引物或引物延伸。
本文所用“LATE-PCR”意指采用聚合酶链反应(PCR)方法的不对称DNA扩增,其利用相对于一种引物(“限制引物”)至少过量5倍的另一种寡核苷酸引物(“过量引物”),限制引物本身以至多200nM的低浓度使用,以便在大致足够的PCR循环中耗尽以产生荧光可检测双链扩增子,其中在扩增开始时限制引物的浓度调节熔融温度Tm[0] L比扩增开始时过量引物的浓度调节熔融温度Tm[0] X低不超过5℃,优选地至少一样高并且更优选地高3-10℃;并且其中在限制引物耗尽后继续实施多个循环的热循环以产生单链产物,即过量引物的延伸产物,有时称作“过量引物链”。
本文所用术语“低Tm探针”意指在与靶杂交后发出信号的经标记杂交探针,其在LATE-PCR中是通过延伸过量引物生成的过量引物链,并且其Tm[0] P比与过量引物链杂交并沿过量引物链延伸的引物(在LATE-PCR中为限制引物)的Tm[0]低至少5℃并且更优选地低至少10℃。本文所用低Tm探针是线性探针。
B.实施方式
本文阐述修饰后在DNA扩增反应中用于特定目的的经标记探针和未经标记寡核苷酸,和其在扩增期间或在扩增后检测期间达成特定效应的用途。DNA扩增反应(例如PCR扩增)包括通过DNA聚合酶进行的引物延伸。如本文所述,探针-靶结构包含在3’方向上比5’方向上的杂交探针长的模板链。因此,探针在靶链的单链3’末端凹进不同数量的核苷酸,并且探针具有可完全匹配靶链的5’末端或具有不同长度的经延伸5’臂。具有这些结构特征的单分子发夹分子可用于模拟根据本文所述构造的这些分子。
在某些实施例中,DNA聚合酶必须是未显示非靶依赖性探针解离的热稳定聚合酶或用于组成可导致表现非靶依赖性探针解离的反应混合物中。“表现非靶依赖性探针解离”意指当寡核苷酸含有末端发夹(具有长3-5个核苷酸的环和长2-5个核苷酸的茎部)时,在将其在比酶的最佳延伸温度低至多20℃的温度下培养10min后,在无靶序列存在时所述酶解离所述寡核苷酸的能力。存于具有Mn++的二甘氨酸缓冲液中的ZO5聚合酶是表现非靶依赖性探针解离的酶的实例。相反,存于含有Mg++并且经Tris钠缓冲的反应混合物中的Taq DNA聚合酶是未显示非靶依赖性探针解离的酶的实例。本文所述方法应理解为包括未显示非靶依赖性探针解离的聚合酶的应用。可通过使用探针5’末端具有5’核苷酸延伸的探针来确认酶是否表现非靶依赖性探针解离,其中所述延伸通过在70℃以上温度下自退火来形成具有长2-5个核苷酸的茎部的发夹结构。在实时PCR、或终点等温、或终点振荡温度条件下,未显示非靶依赖性探针解离的酶不能解离这些发夹探针。
本文所述探针是结构上经修饰且与位于引物中间的靶扩增子链杂交的线性或不规则螺旋DNA杂交探针,并且是低温探针,其Tm[0]比包括所述探针的扩增反应中的平均引物退火温度低至少5℃,优选地低至少10℃。如果扩增反应是(例如)三温PCR反应,那么除非在扩增结束时或在某些扩增循环期间(例如在LATE-PCR的线性扩增期间)增加低温步骤,否则探针不会发生杂交。未解离探针是具有荧光团的双重标记荧光探针,当探针在溶液中游离时所述荧光团优选地与非荧光猝灭剂发生猝灭,例如DABCYL、黑洞(Black Hole)猝灭剂或诸如QSY7或9等另一种猝灭剂。黑洞猝灭剂是百奥知(Biosearch Technologies)公司,诺瓦托(Novato),CA(USA)的专卖猝灭剂。QSY猝灭剂可自英杰公司,卡尔斯巴德(Carlsbad),CA(USA)购得。经解离探针也可以是双重标记探针,但其并非必须是双重标记探针。对于经解离探针来说,只需要以任何方式来检测经解离探针片段,检测方式是藉助片段上的标记或是藉助片段的某些特性,例如重量或尺寸或实施可检测功能的能力,所述可检测功能例如是引起成色。在上述最后一种情况下,对解离的检测是间接检测。
本文所述封闭寡核苷酸是与引物下游(3’)杂交并且未经标记的经修饰线性寡核苷酸。
一类经修饰杂交探针是结构经修饰而在扩增前添加至PCR反应混合物中时可增强等温非引物依赖性5’-外切核酸酶解离的探针。将此一探针称作“外切敏感性”探针或简称为EXO-S探针。其为线性或不规则螺旋DNA探针,其Tm比使用所述探针的扩增反应中的平均引物退火温度低至少5℃,优选地低至少10℃。在经受等温非引物依赖性解离条件时,其解离速度比对应未经修饰探针快至少两倍、优选地快至少五倍、并且更优选地快至少十倍。
在一实施例中,可赋予探针外切敏感性的修饰涉及至少一个标记部分的共价连接,例如荧光团或非荧光猝灭剂与探针5’末端通过包括至少三个、优选地三个以上、并且最优选地六个连续亚甲基(CH2)的链共价连接。在与5’核苷酸连接的末端,所述亚甲基链不能位于羧基、胺、酰胺、或另一庞大化学基团之后,但预计所述连续亚甲基链可位于(在与5’核苷酸连接的末端)醚基(-O-)之后。在另一实施例中,在探针5’末端处的修饰包括与紧邻杂交探针上游(3’)的靶核苷酸不互补的经加成核苷酸。此修饰也可称作位于探针5’末端的单碱基“臂”。EXO-S探针可不具有5’臂,也就是说不具有与靶不互补的核苷酸,或至多具有不超过5个核苷酸、优选地不多于一个核苷酸的短臂。EXO-S探针应设计为可在距其靶链3’末端超过六个核苷酸处、优选地距3’末端10-30个核苷酸处形成杂合体。距离末端超过40个核苷酸的杂合体并非优选杂合体,因为其可减慢探针的非靶依赖性等温解离。正如所属领域技术人员可了解,相对于特定EXO-S探针特异性靶的3’末端对其实施定位的最佳位置可取决于采用所述探针的扩增反应的确切条件和组成;其中最重要的因素是EXO-S探针上游限制引物的长度和欲探测靶序列的碱基组成。然而,在所有情况下,在限制引物耗尽前,EXO-S探针的5’末端都不应与靶链上限制引物3’末端所杂交的位置重叠。换句话说,靶链上与限制引物3’末端互补的碱基应距离探针5’末端上游至少两个碱基,或距离EXO-S探针5’末端臂的5’末端至少两个碱基。
本文所述方法包括在外切敏感性探针存在下扩增至少一个DNA靶序列,其中扩增过程不包括可使探针发生杂交的低温步骤,也就是说在可延伸生成与探针互补的扩增子链的引物耗尽之前不包括在比探针Tm低的温度下培养。当用于PCR扩增中时,在不具有低温检测步骤的循环期间EXO-S探针不与扩增子杂交。不对称PCR方法在限制引物耗尽后的扩增循环中(也就是说在生成与探针互补的单链过量引物扩增子链的循环中)包括低温检测步骤,其可导致探针以非引物依赖性方式发生杂交和解离,由此扩增探针所生成的信号。如果仅包括扩增后低温检测步骤,那么来自含有荧光团和猝灭剂(优选地为非荧光猝灭剂)的双重荧光标记探针的信号也可在30min或更长时间内继续产生,此表明在所述终点检测以及在实时检测期间发生重复杂交和解离。由于此原因,应在预定时间后、优选地在至少1min后、并且更优选地在至少2min后实施终点阅读。例如,如果探针经荧光团和猝灭剂标记,那么重复杂交和解离可使未猝灭片段和扩增荧光信号的产量增加。所述方法包括对探针解离的均相检测。
本文所述另一类探针是结构经修饰而在扩增前添加至PCR反应中时可抵抗非引物依赖性5’-核酸酶解离的探针。将所述探针称为“外切抗性”探针或简称为EXO-R探针。外切抗性探针是低温探针。外切抗性探针不必对引物依赖性外切核酸酶解离具有抗性。然而某些实施例对非引物依赖性5’外切核酸酶解离和引物依赖性5’外切核酸酶解离二者都具有抗性。外切抗性探针抵抗非引物依赖性解离的程度如下所述:如果所述探针经荧光团和猝灭剂标记、与互补靶链杂交、并且经受等温非引物依赖性5’核酸酶解离条件,那么在25分钟时间内荧光不发生显著增加(不超过10%)。如下所述,某些实施例甚至在经受围绕探针-靶Tm的快速热振荡时仍保持抗性,而其它实施例可通过所述振荡发生解离而生成扩增信号。外切抗性探针是线性或不规则螺旋杂交探针,其未经修饰的结构是经标记或未经标记DNA寡核苷酸。一种可赋予探针外切抗性的修饰是通过除亚甲基链以外的方式将标记部分(例如荧光团或非荧光猝灭剂)连接至5’末端核苷酸。另一种赋予探针外切抗性的修饰是加成5’末端臂,其包含二至七个不与探针的靶杂交的核苷酸。另一种赋予探针外切抗性的修饰是向探针5’末端加成核苷酸延伸,其中所述延伸通过在70℃以上温度下自退火形成具有长2-5个核苷酸的环的发夹结构。这些5’发夹也可抵抗振荡温度引发的解离。
本文所述方法包括在外切抗性探针存在下通过不对称PCR扩增方法(优选地LATE-PCR方法)扩增至少一个DNA靶序列,其中在限制引物耗尽之前扩增过程不包括可使探针发生杂交的低温步骤。当用于PCR扩增中时,在不含低温检测步骤的循环期间EXO-R探针不与扩增子杂交。在扩增后或(对于不对称方法来说)在限制引物耗尽后包括低温检测步骤的PCR方法可产生经杂交探针。如果检测是等温检测,也就是说不围绕探针的Tm进行快速温度振荡,那么探针可不发生解离,并且其信号仅为得自杂交的信号。在所述实施例中,探针在杂交后必须发射可检测信号。如果检测是终点检测并且包括围绕探针Tm的快速热振荡(例如自Tm以上5℃至Tm以下5℃,或优选地自Tm以上10℃至Tm以下10℃,其中每次振荡循环耗时30秒或更短时间),那么某些实施例可以上述非引物依赖性方式解离,但其它实施例可不发生解离。通过快速振荡以非引物依赖性方式解离可提高探针信号生成的速率。在这些实施例中,如上文对外切敏感性探针所述,解离可直接或间接生成信号。在任一给定时间点的信号强度可取决于反应中的解离速率和探针总量。例如,如果探针经荧光团和猝灭剂标记,那么重复振荡可导致含有未猝灭荧光团的片段和经扩增荧光信号的产量增加直至所有可用探针都发生解离。所述方法包括对探针杂交或探针解离的均相检测。
本文同样阐述结构上经修饰的寡核苷酸,其与互补链杂交并形成对引物依赖性5’核酸酶解离和非引物依赖性5’核酸酶解离二者都具有抗性的杂合体。有时将所述寡核苷酸称作EXO-N寡核苷酸。EXO-N是线性寡核苷酸,其Tm高至足以在使用所述寡核苷酸的PCR扩增反应(对称PCR扩增或不对称PCR扩增)中于引物延伸步骤期间与一引物下游的靶链杂交。由于其在引物延伸期间未被聚合酶解离,因此其抑制与其杂交的链延伸,由此使所述链的扩增无效。一种使线性寡核苷酸变为EXO-N寡核苷酸的修饰是向线性寡核苷酸5’末端加成与所述寡核苷酸的靶不互补的寡核苷酸延伸,并且所述延伸形成发夹结构,其具有长为2-5个核苷酸的茎部并且Tm为至少70℃。
本文所述方法包括在EXO-N寡核苷酸存在下实施对称或不对称PCR扩增反应,所述EXO-N寡核苷酸对一个原本可通过所用引物对扩增的可能靶等位基因具有特异性,由此促进一或多个在引物延伸期间不与EXO-N寡核苷酸杂交的替代等位基因变体序列扩增。本文所述方法同样包括在期望时间点将EXO-N寡核苷酸插入对称PCR扩增反应中,也就是说在两次或更多次热循环后插入,以使一个链(正链或负链)的扩增无效,并由此在后续循环中促进另一链的扩增。
本文阐述通过用于DNA扩增靶序列(包括cDNA序列)的聚合酶链反应(PCR)方法、尤其诸如不对称PCR和LATE-PCR等不对称PCR方法实施的DNA扩增,其中一个引物(过量引物)相对另一个引物(限制引物)以大幅度过量存在,其比率为至少5:1并且优选地为至少10:1。优选扩增方法为LATE-PCR,但可使用其它方法。
在某些实施例中,所述方法使用经修饰低温DNA杂交探针。DNA杂交探针是不可延伸DNA寡核苷酸,其与由PCR扩增反应所产生扩增子中的靶互补,在此情况下所述靶是过量引物(过量引物链)延伸产物中的DNA序列。未经修饰探针是一段DNA或含有所述DNA段,即探针的靶互补序列。探针的靶互补序列可与反应中可产生的过量引物链完全互补,与反应中可产生的至少一个过量引物链不完全互补,或两种情况都存在。探针与完全互补靶的Tm(在LATE-PCR情况下为Tm[0])可高于其与不完全互补靶的Tm例如,如果探针设计为与完全互补靶的Tm为55℃,那么其与含有一或多个错配碱基(核苷酸缺失或核苷酸插入)的靶的Tm有时可低10℃或更多。此使得探针可通过所形成杂合体的Tm来区别各靶。在所有实施例中探针都是低温探针。
采用探针的不对称PCR方法在起始扩增反应混合物中包括探针,其也包括引物、dNTP、缓冲液、热稳定DNA聚合酶,并且如果核酸起始材料是RNA,那么其也包括逆转录酶。任何在扩增期间或在扩增结束时不解离的探针都可作为在杂交后发射可检测荧光信号的双重荧光标记探针。适宜标记方案为业内所熟知。优选标记是一个末端与荧光团共价连接并且另一个末端与非荧光猝灭剂共价连接,但也可使用其它标记方法。业内已知多种猝灭剂,包括DABCYL、DABMI、黑洞猝灭剂、QSY猝灭剂、市售深黑(Deep Dark)猝灭剂、和其它猝灭剂。任何在检测期间解离的探针可经类似方式标记,但其并非必须经标记。对于此一探针来说,所需要的只是解离应可检测,因此可用可检测标记对探针进行单一标记,或其可不经标记。
所用探针可为线性或不规则螺旋DNA杂交探针,对其进行修饰以在PCR扩增期间与靶杂交时(也就是说在实时检测中)或在扩增后(也就是说在终点检测中)增强或基本消除其非引物依赖性等温5’核酸酶解离。如上所述,将具有增强可解离性的探针称作外切敏感性或EXO-S探针,并且将对解离具有抗性的探针称作外切抗性或EXO-R探针。在等温非引物依赖性解离条件下保持25分钟后,EXO-R探针基本上保持未解离。某些EXO-R探针可通过围绕探针-靶杂合体Tm进行快速温度振荡来解离,而其它探针甚至可抵抗所述振荡。在限制引物耗尽后实施检测,因此所发生的任何解离都归因于非引物依赖性5’核酸酶活性。EXO-S和EXO-R探针是低温探针。
使不规则螺旋DNA探针成为EXO-S探针的修饰是加成与探针靶不互补的5’核苷酸,和通过具有至少三个并且优选地六个亚甲基的亚甲基链将标记部分(优选地荧光部分)与探针的5’核苷酸连接。
使不规则螺旋DNA探针成为EXO-R探针的修饰可根据其5’末端的结构修饰分为三类:
第(1)类将某些非核酸化学部分加成至寡核苷酸探针的5’末端,所述探针的5’末端与完全互补靶序列杂交;
第(2)类将一或多个非互补核苷酸加成至寡核苷酸探针的5’末端,以使所述探针的5’末端与靶序列不互补并且由此形成延伸一或多个碱基的单链“臂”;
第(3)类将多个非互补核苷酸加成至寡核苷酸探针的5’末端,以使位于5’末端的单链“臂”形成发夹结构,所述发夹结构具有3-5个核苷酸的茎部并且自退火Tm>70℃。
图1展示每一类EXO-R探针的实例以及用于比较的实例性5’核酸酶探针。图2展示第(1)-(3)类探针的实例性解离机制。
例如在Taq系统中,某些第(1)类和第(2)类EXO-R探针可通过引物依赖性解离来解离,其中探针-靶杂合体的Tm未低至足以避免探针结合在引物延伸路径上。相反,如果探针-靶杂合体的Tm未低至足以避免引物延伸路径上的探针结合,那么第(3)类探针不会被延伸引物解离,并且可使引物延伸无效。
为确定经特定修饰的不规则螺旋探针是EXO-S还是EXO-R探针,可在施加PCR扩增反应条件之后施加等温非引物依赖性解离条件,此时将其可解离性与对应未经修饰探针的可解离性进行比较。为确定EXO-R探针是否可通过围绕其Tm进行快速温度振荡来解离,可将其解离绘制为温度循环时间或次数的函数。
如上所述,EXO-S和EXO-R探针方法是增加了对杂交探针的检测或对经解离探针片段的检测的不对称PCR扩增。如果探针由于杂交或由于解离发射可检测信号(例如荧光信号),那么可在扩增反应期间(实时)或在反应完成后(终点)借助于可包括或不包括振荡的低温检测步骤来实施检测。用所述探针实施检测也可包括生成探针-靶杂合体的熔融曲线。
以下说明阐释如何将具有相同或不同标记的若干个EXO-S探针或若干个EXO-R探针添加至多重PCR反应中以增加所述反应生成的信息量。可通过在同一反应中组合EXO-S探针与EXO-R探针来达成类似结果。
可构建多重不对称PCR反应来使用若干对引物,每一对引物用于不同的靶序列。可通过以下方式对所得每个单链扩增子实施检测:在反应期间或在反应结束时降低温度以使一或多个EXO-S探针与其在所述单链靶扩增子中的互补序列杂交。如果每个EXO-S探针都经不同颜色荧光团或具有独特分子量或电子特征的不同部分标记,那么每个探针-扩增子杂合体都能生成其自身所特有的信号。然而,两个EXO-S探针也可经相同信号基团标记,前提是其在不同温度下形成探针-扩增子杂合体。类似地,EXO-S探针可与具有相同颜色但Tm显著不同的EXO-R探针一起使用,在此情况下如果EXO-R探针可通过温度振荡来解离,那么差异可变大,因为在探针和扩增子的等温培养期间所述探针中只有一种发生解离,第二种探针在随后的或之前的温度振荡期间解离。
可使用EXO-S探针生成不同信号的可能靶集合可通过使用克莱默(Kramer)(美国专利第6,150,097号)阐述的“颜色三联体编码(Color Triplet Coding)”原理来进一步扩大。在此情况下每个扩增子(唯一序列或等位基因变体)可用其自身的经两个或三个不同5’标记标记的EXO-S探针来靶向。因此,在探针-扩增子杂合体形成并解离时,两个或三个标记通过解离而释放。根据克莱默所述,可采用多种方式将多个标记组合为各组具有两个或三个标记的群组。
类似地,可构建多重不对称PCR反应,其使用若干对引物来生成多个单链扩增子,在反应期间或在反应结束时温度降低,此时可用多个EXO-R探针对所述扩增子进行检测。在此情况下,可用不同颜色荧光团对每个EXO-R探针进行标记。此外,根据其长度,每个EXO-R探针都可为序列特异性(即等位基因识别)或错配耐受性。在此情况下,区分探针-扩增子杂交的最佳方式是实施熔融曲线分析,其中使反应温度自预设低温逐渐降低或逐渐升高。在这些情形下,每个EXO-R探针都表现其自身特有的熔融曲线,并且两个具有相同颜色的EXO-R探针的组合可产生复合熔融曲线。此外,对温度振荡具有抗性的EXO-R探针和对温度振荡具有敏感性的EXO-R探针可为多重曲线,因为在所述探针中温度振荡只可改变其中一种的信号。
可使用EXO-R探针生成不同信号的可能靶集合可通过使用克莱默(美国专利第6,150,097号)所述的“颜色三联体编码”原理来进一步扩大。在此情况下每个扩增子(唯一序列或等位基因变体)可用其自身的经两个或三个不同5’标记标记的EXO-R探针来靶向。因此,在探针-扩增子杂合体形成和熔融时,其以两种或三种颜色生成相同熔融曲线。根据克莱默所述,可采用多种方式将多个标记组合为各组具有两个或三个标记的群组。
使用EXO-S和EXO-R探针的另一种方式涉及将其在单一多重不对称PCR反应中组合。在此情况下,通过熔融曲线分析或解离分析不同探针可检测不同单链扩增子。例如,在反应温度下降时,错配耐受性EXO-R探针可经生成独特熔融曲线的彩色荧光团标记。一旦EXO-R探针与其靶在低温下达成最大结合,反应温度可进一步下降以使可具有相同颜色的EXO-S探针与其靶达成杂交和等温或振荡温度依赖性解离,且其Tm低于EXO-R探针与其靶的Tm。可在低温下实施对EXO-S探针解离产物的检测,但优选地在较高温度下实施,例如70℃,在此温度下EXO-S探针和EXO-R探针都不与其靶杂交。由于在每个所述线性探针上都存在猝灭剂,因此在较高温度下只有自EXO-S探针5’末端解离出的荧光团可生成高于本底的信号。
实例
实例1(图4)
此实例显示,在此处所用条件下,聚合酶ZO5不能表现非引物依赖性抗性。
扩增反应各自含有1x RT-PCR缓冲液(罗氏诊断(Roche Diagnostic))、50mM二甘氨酸/KOH,pH8.2(25℃)、115mM K-乙酸盐、8%甘油(v/v)、和3mM乙酸锰(MnOAc2)。ZO5聚合酶浓度为200单位/反应,探针为0.5μM并且互补靶为1.5μM。反应为等温反应并在52℃下进行。以20秒的间隔收集15分钟的荧光数据。使用ABI7700热循环机来进行反应。
使用以下探针和其互补靶:
探针名称 序列(5’-3’)
线性FT(无臂) Fam-CCATGATACAAGCTTCC-BHQ1
线性FT BHQ5’ BHQ1-CCATGATACAAGCTTCC-Fam
线性FT(5’3’臂) Fam-TTTTTTCCATGATACAAGCTTCCTTTTTT-BHQ1
0-4-0MW-BG Fam-CGGTGAAACCGCGCCTGCAATATACAGC-BHQ1
靶名称
FT靶 ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACC
BG靶 AAAAAAGCTGTATATTGCAGGCGAAAAAA
测试以下探针-靶组合(每种测试两次)。具有最快切割速率的两条线(41)是FT靶+线性FT探针,所述探针具有6个非互补核苷酸(都是T)的5’3’臂。具有第二快切割速率的两条线(42)(红线)是FT靶+线性FT探针,所述探针不具有5’3’臂。两条线(43)是BG靶+0-4-0MW-BG探针,所述探针含有具有4-bp茎部和3碱基环的5’发夹。上述所有三种探针都具有5’FAM荧光团。
两条线(44)是FT靶+线性FT探针,所述探针不具有5’3’臂,但黑洞猝灭剂1位于5’末端。
两条虚线(45)是具有5’发夹的0-4-0MW-BG探针,但未将BG靶添加至反应中。
图4中所示结果显示,在这些条件下,甚至在不存在BG靶的情况下,聚合酶ZO5也可解离具有5’发夹的0-4-0W-BG探针。所有其它探针在其靶序列不存在的情况下都不发生解离(结果未显示)。因此,这些结果显示,在这些条件下聚合酶ZO5表现非靶依赖性探针解离。以下事实可支持此结论:在这些条件下,当具有6个非互补核苷酸(都是T)5’3’臂的线性FT探针与其FT靶结合时,即使此EXO-R探针未被Taq聚合酶解离,聚合酶ZO5也可解离所述探针。
实例2(图5(A-D))
在此实例中显示,表现非靶依赖性探针解离(实例1)的酶ZO5聚合酶解离EXO-R探针,而未显示非靶依赖性探针解离的铂Taq聚合酶不解离EXO-R探针。图5展示检测H5和H3流感基因的四个实验的结果,每次检测都始于10,000份拷贝并且在相同反应条件下进行,其中仅改变聚合反应中所用酶。H5基因是通过5’TET EXO-R探针(实线)来检测并且H3基因是通过5’FAM EXO-R探针来检测(混列线)。NTC值显示为虚线。
图5A展示使用ZO5酶实施LATE-PCR扩增的结果,其中(51)是TET探针荧光,(52)是FAM探针荧光,并且(53)是使用TET和FAM两种探针的NTC结果。
图5B展示探针的熔融,其中(54)是TET探针荧光,(55)是FAM探针荧光,并且(56)是FAM和TET两种探针的NTC结果。
图5C展示使用铂Taq聚合酶作为酶的LATE-PCR扩增结果,其中(57)是TET探针荧光,(58)是FAM探针荧光,并且(59)是NTC TET和FAM探针荧光。
图5D展示探针的熔融,其中(510)是TET探针荧光,(511)是FAM探针荧光,并且(512)是NTC TET和FAM探针荧光。
LATE-PCR似乎在ZO5实例(图5A)中更有效,其中两种基因的Ct值都为29,而在铂Taq(图5C)中Ct值为30(H5)和33(H3)。然而,两条熔融曲线并未显示此情形。TET探针(54)在ZO5反应中被完全切割并将游离TET释放至反应物中,而FAM探针(55)只被ZO5部分切割。此可参见图6B,其中在ZO5反应探针熔融曲线中,当探针不再与靶结合时,探针荧光(54、55)达到NTC荧光值(56)。此也会在扩增中导致较低Ct值。在铂Taq反应(图5D)中结果显著不同,其中当探针不再与靶结合时,探针熔融曲线不显示游离TET(510)或FAM(511)。因为未检测到游离FAM或TET,因此Ct值较低(图5C)。
EXO-R探针:
5’TET-CACTAGGGAACTCGCTG-BHQ13’,Tm=52.7(H5)
5’FAM-CGTTTCTCGAGGTCCTGCG-BHQ13’,Tm=54.5(H3)
限制引物:
5’AAGGATAGACCAGCTACCATGATTGCC3’, Tm=66.8(H5)
5’CGTTGTATGACCAGAGATCTATTTTAGTGTCCT3’, Tm=67.9(H3)
过量引物:
5’ATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGG3’,Tm=63.6(H5)
5’CCATCAGATTGAAAAAGAATTCT3’, Tm=62.7(H3)
反应条件(以毫摩尔(mM)或微摩尔(μM)表示浓度,以微升(μL)表示体积):
10 x PCR缓冲液 1x 2.5μL
10mM dNTP 250μM 0.625μL
50mM Mg++ 3mM 1.5μL
10μM限制引物 2x 0.125μL
100μM过量引物 2x 0.250μL
10μM探针500nM 2x 1.25μL
10μM C3 引物安全(Primesafe) 500nM 1.50μL
总混合物: 9.375μL
ZO-5(5单位),铂TAQ (1.25单位): 1.0/0.25最终单位
水: 12.625μL或13.375μL
DNA扩增子(在10,000份拷贝/μL下为2) 2.0
总体积: 25.0μL
热条件:(退火ZO-5=58℃,Taq=62℃)
阶段1:95℃/3:00分钟
阶段2:(95℃/10秒:58℃或62℃保持15秒:72℃保持30秒)重复20次
阶段3:(95℃/10秒-58℃或62℃/15秒-72℃/30秒-45℃/20秒)重复30次
阶段4:熔融35℃-94℃
实例3(图7A-I)
在引物依赖性和非引物依赖性LATE-PCR反应中的EXO-N探针
在此实例中显示,在LATE-PCR循环的初始循环中5’发夹EXO-R探针未被TAQ聚合酶以引物依赖性方式解离,并且当限制引物耗尽时未以非引物依赖性方式解离。此外,根据所用LATE-PCR引物对的Tm,EXO-R探针可使BG靶的扩增无效。结果展示于图7A-I中。
图7A-C展示高Tm引物对的结果:图7A是在95℃下进行的实时分析,图7B是在45℃下进行的实时分析,图7C是终点熔融曲线分析((73)是探针-靶,(74)只有探针)。图7D-F展示中Tm引物对的结果:图7D是在95℃下进行的实时分析,图7E是在45℃下进行的实时分析,图7F是终点熔融曲线分析((77)是探针-靶,(78)只有探针)。图7G-I展示低Tm引物对的结果:图7G是在95℃下进行的实时分析,图7H是在45℃下进行的实时分析,图7I是终点熔融曲线分析((711)是探针-靶,(712)只有探针)。
图7A、7D、7G显示,在95℃下50个循环内使用任一引物对时探针信号都不改变。此结果表明,EXO-R探针不以引物依赖性机制被切割,并且进一步显示,在LATE-PCR期间EXO-R探针不以非引物依赖性解离被切割。图7B、7E、7H展示在72℃下实施三个引物对的延伸步骤后,45℃下探针荧光的实时结果。在高Tm引物对(图7B)情况下,EXO-R探针不发生结合并且不阻断扩增。在中Tm引物对(图7E)情况下,EXO-R探针开始阻断扩增,其表现为Ct的延迟和信号强度的降低。在低Tm引物对(图7H)情况下,EXO-R探针显著抑制扩增,其表现为Ct的显著延迟和信号强度的显著降低。图7C、7F、7I展示每个引物实例的EXO-R FAM探针35C-94C熔融曲线。在7C中显示最大量的PCR产物,同时7F中由于EXO-R探针的阻断能力而显示较小量,并且在(7I)中几乎未产生PCR产物。由于熔融曲线是在LATE-PCR后绘制,因此未检测到游离FAM表明探针未以引物依赖性或非引物依赖性方式被切割。黑色实线表示使用10,000份拷贝BG起始拷贝的反应,而黑色虚线表示NTC。
序列
限制引物:
TGCGTTCTGACTGAACAGTGATCGAG, Tm=72℃(高Tm引物对)
TTCTGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=64℃(中Tm引物对)
TGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=61℃(低Tm引物对)
过量引物:
CCCTCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=66℃(高Tm引物对)
TCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=61℃(中Tm引物对)
TTGAAATTCCCGAATGG, Tm=58℃(低Tm引物对)
EXO-R探针04017:
5’FAM-CGCTGAAAGCGCGCCTGCAATTTACAGC-BHQ1,3’Tm=60℃
反应条件:微升(μL)
10x PCR缓冲液 1x 2.5μL
10mM dNTP 250μM 0.625μL
50mM Mg++ 3mM 1.5μL
10μM 限制引物 50nM 0.125μL
10μM 过量引物 1000nM 0.250μL
10μM EXO-N探针 100nM 0.250μL
10μM 引物安全9-3DD 500nM 1.250μL
1.25U 铂TAQ 0.250μL
水
17.25μL
BG靶 104拷贝/μL 1.0μL 总 25μL
热条件:
阶段1:95℃保持5min。
阶段2:重复50次以下循环:95℃保持10秒,61℃/58℃保持15秒,72℃保持20秒,并且45℃保持20秒。
阶段3:熔融35℃-94℃
实例4(图8)
在5’末端使用FAM的EXO-S探针
实例4的图8展示在LATE-PCR反应完成后通过振荡15分钟实施的EXO-S探针信号扩增。反应条件为45轮95℃下10秒、64℃下10秒和72℃下20秒的循环。最终试剂浓度存于25微升(μL)体积中的1x英杰PCR缓冲液、3mM Mg++、和1.25单位英杰Taq聚合酶、200nM dNTP、50纳摩尔(nM)FT2号限制引物、1000nM FT2号过量引物和0.6x引物安全TM022号(引物安全是可自史密斯检测(Smiths Detection)公司获得的试剂)和300nM FT MBseq4。
FT2号限制引物的序列为
5’GGAAGTGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGA3’。
FT2号过量引物的序列为5’GTTGCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA3’。
FT MBseq4EXO-S探针为5’FAM-CATGATACAAGCTTC-BHQ13’。
在PCR完成后;实施45轮45℃(10秒)至65℃(20秒)的振荡。在65℃下收集荧光。线条(81)是含有FT MBseq4探针和经扩增FT产物二者的复制物,而线条(82)是无模板对照样品。
实例5(图9)
在5’末端上使用BHQ1的EXO-R探针
在此实例中显示,(1)用5’BHQ-1猝灭剂替代Exo-S探针的5’荧光团可使Exo-S探针转化为不再以非引物依赖性方式被TAQ DNA聚合酶解离的Exo-R探针,以及(2)与通过LATE-PCR生成的单链DNA结合的Exo-R探针不以非引物依赖性方式被TAQDNA聚合酶解离。图xx展示此实例的结果。图A展示在不存在(线条91)或存在(线条92)TAQ DNA聚合酶的情况下Exo-S探针的探针/靶杂合体的熔融曲线。此特定Exo-S探针由5’HEX荧光团和3’BHQ-1猝灭剂构成。线条93对应于无模板对照样品的本底荧光信号。反应是以25μL体积实施并且由以下组成:1X PCR缓冲液(英杰,卡尔斯巴德,CA)、3mM MgCl2、150nM合成靶(见下文)、500nM Exo-S探针(见下文)和(在具有TAQ DNA聚合酶的样品的情况下)1.25单位TAQ DNA聚合酶(英杰,卡尔斯巴德,CA)。对于无模板对照样品来说,其包括TAQ DNA聚合酶并且靶序列经10mM Tris-Cl pH8.3替代。在95℃下将样品培养10秒然后在20℃下培养20分钟以使得形成Exo-S探针/靶杂合体。然后在样品温度以1℃的间隔自20℃升高至95℃时收集荧光信号,每次间隔长90秒。对于不含TAQ DNA聚合酶的样品(线条91)来说,探针荧光信号与在65℃以上温度下来自无模板对照的探针荧光信号相匹配,在此温度范围内探针与靶完全熔融。相反,对于具有TAQ DNA聚合酶的样品来说,在65℃以上探针荧光信号强于来自无模板对照的荧光信号,此显示探针中HEX荧光团与BHQ-1猝灭剂的解离和分离。此结果显示,与合成靶结合的Exo-S探针易于以非引物依赖性方式被TAQ DNA聚合酶解离。
序列
Exo-S探针:5’HEX AGCATACGGTTCAGTT3’BHQ1
合成靶:
5’AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC3’
加下划线的序列对应于探针靶位点。
对上述相同探针序列进行修饰以使其具有5’BHQ-1猝灭剂和3’HEX荧光团。5’BHQ-1部分的存在将探针转变为对TAQ DNA聚合酶的非引物依赖性解离方式具有抗性的Exo-R探针。图B展示在TAQ DNA聚合酶存在下所述Exo-R探针-靶杂合体的熔融曲线(线条94)。线条95对应于在TAQ DNA聚合酶存在下探针自身/无模板对照样品的本底荧光信号。反应条件由存于25μl的最终体积中的1X PCR缓冲液(英杰,卡尔斯巴德,CA)、3mM MgCl2、150nM合成靶、500nM Exo-R探针(见下文)和1.25单位TAQ DNA聚合酶(英杰,卡尔斯巴德,CA)组成。对于无模板对照样品来说,靶序列经10nM Tris-Cl Ph 8.3替代。在20℃下将样品培养20分钟以使得形成Exo-R探针/靶杂合体,并且随后在样品温度以1℃的间隔自20℃升高至95℃时收集荧光信号,每次间隔长90秒。对于具有Exo-R探针/靶杂合体的样品(线条94)来说,荧光信号与在65℃以上温度下来自无模板对照样品的荧光信号相匹配,在此温度范围内探针与靶完全熔融(线条95)。此结果表明,(1)与合成靶结合的Exo-R探针对TAQ DNA聚合酶的非引物依赖性解离方式具有抗性,以及(2)用5’BHQ-1猝灭剂替代5’HEX荧光团可使Exo-S探针转变为Exo-R探针。
序列
Exo-R探针:5’BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT3’HEX
合成靶:(与上文所示相同)
5’AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC3’
加下划线序列对应于探针靶位点。
图C显示,当与通过LATE-PCR生成的单链DNA结合时,上述Exo-R探针也对TAQ DNA聚合酶有抗性。含有上述Exo-R探针靶序列的单链DNA产物是在Exo-R探针存在下通过LATE-PCR生成。在扩增结束时,温度下降至20℃并且将其培养20min以使得形成Exo-R/单链扩增子杂合体。此图展示Exo-R探针/单链扩增子杂合体的PCR后熔融曲线分析(线条96)。线条97对应于探针自身/无模板对照样品的本底荧光信号。与杂合至合成靶的Exo-R探针(图B)类似,Exo-R探针-扩增子杂合体在65℃以上温度下完全熔融,导致本底荧光信号等效于无模板对照样品的荧光信号。此结果表明,与通过PCR生成的靶结合的Exo-R探针对TAQ DNA聚合酶的非引物依赖性解离方式具有抗性。LATE-PCR扩增的反应条件是存于25μl最终体积中的1XPCR缓冲液(英杰,卡尔斯巴德,CA)、3mM MgCl2、250nM dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、25nM 9-22DD引物安全、500nM 9-C3引物安全、1.25单位TAQ DNA聚合酶(英杰,卡尔斯巴德,CA)、50nM限制引物、1μM过量引物、500nM Exo-R探针、1000基因组当量的人类DNA(康奈尔细胞库(Cornell CellRepository),卡姆登(Camden),NJ,目录号;NA07348)。热循环方案为95℃保持3min,70次95℃保持10秒、64℃保持10秒、和72℃保持20秒的循环,然后在20℃下保持20分钟并实施熔融步骤,其中以1℃的间隔自20℃至95℃收集荧光,每次间隔长90秒。
序列
限制引物:
5’CCATTTCTTCCTCCTCCTCATAAGCATGGTACCTAT3’
过量引物:
5’CCCGCTGGTTCAATAATGTCTTTAA3’
Exo-R探针(与上文所示相同)
5’BHQ-1AGCATACGGTTCAGTT3’HEX
图A-在合成靶上测试的Exo-S探针的实例:此图展示在不存在(线条91)或存在(线条92)TAQ DNA聚合酶的情况下Exo-S探针-靶杂合体的熔融曲线分析。线条93对应于在TAQ DNA聚合酶存在下探针自身/无模板对照样品的本底荧光信号。对于不含TAQ DNA聚合酶的样品(线条91)来说,在65℃以上温度下探针-靶杂合体的完全熔融可导致本底荧光信号等效于无模板对照样品的荧光信号。对于具有TAQ DNA聚合酶的样品来说,由于探针中HEX荧光团与BHQ-1猝灭剂的解离和分离,在65℃以上温度下探针-靶杂合体的完全熔融可导致荧光信号比未结合探针的荧光信号强。此结果表明,与合成靶结合的Exo-S探针易于以非引物依赖性方式被TAQDNA聚合酶解离。在95℃下对荧光信号实施标准化以帮助复制样品的对比。
图B:在合成靶上测试的Exo-R探针的实例:此图展示在TAQ DNA聚合酶存在下Exo-R探针-靶杂合体的熔融曲线分析(线条94)。线条95对应于在TAQ DNA聚合酶存在下探针自身/无模板对照样品的本底荧光信号。尽管存在TAQ DNA聚合酶,但探针-靶杂合体的熔融可导致本底荧光信号等效于未结合探针的荧光信号。此结果表明,与合成靶结合的Exo-R探针对TAQ DNA聚合酶的非引物依赖性解离方式具有抗性。在95℃下对荧光信号实施标准化以帮助复制样品的对照。
图C:在PCR产物上测试的Exo-R探针的实例:在结合通过LATE-PCR生成的单链DNA时,上述Exo-R探针对TAQ DNA聚合酶的解离具有抗性。含有上述Exo-R探针靶序列的单链DNA产物是在Exo-R探针存在下通过LATE-PCR来生成。在扩增结束时,温度降低至20℃并且将其培养20min以使得形成Exo-R/扩增子杂合体。此图展示Exo-R探针/扩增子杂合体的PCR后熔融曲线分析(线条95)。线条96对应于探针自身/无靶样品的本底荧光信号。与杂合至合成靶的Exo-R探针类似,Exo-R探针-扩增子杂合体的熔融可导致本底荧光信号等效于无模板对照样品的荧光信号。此结果表明,与通过PCR生成的靶结合的Exo-R探针对TAQ DNA聚合酶的非引物依赖性解离方式具有抗性。在95℃下对荧光信号实施标准化以帮助复制样品的对照。
实例6(图10)
在此实例中展示LATE-PCR反应,其使用EXO-R ROX探针来检测7500份拷贝的新城DNA扩增子,其中在LATE-PCR扩增期间未观察到ROX EXO-R探针降解。
图10A展示7500份拷贝新城病毒扩增子的LATE-PCR扩增(线条101)和ROXEXO-R探针熔融曲线(实线)与NTC(线条102)的相对关系。在熔融曲线图10B中未观察到探针降解,因为当探针在高温下未结合时,所有探针荧光(线条103)和NTC荧光(线条104)重叠,此表明不存在游离ROX荧光。
序列
限制引物:
5’GCATCAAATTCCCCACTGAGCCTC3’,Tm:67.9℃
过量引物:
5’CCTGGTATTTATTCCTGTTTGAG3’,Tm:63.2℃
探针序列:
5’ROX-ATTTTGCGATATGATACCC-BHQ23’,Tm:56℃
原液浓度: 最终浓度 在25μL分析中的体积(μL)
10x PCR缓冲液 1x 2.5 μL
10mM dNTP 250μM 0.625 μL
50mM Mg++ 3mM 1.5 μL
10μM限制引物 0.125 μL
100μM过量引物 0.250 μL
10μM 探针 500nM2x 1.25 μL
10μM C3-12B 引物安全300nM .750 μL
总混合物: 8.25 μL
Pt TAQ(1.25单位): 0.25
水: 14.5μL
DNA扩增子
(在750、7,500份拷贝/μL下为2) 2.0μL
总体积: 25.0μL
热循环条件:
阶段1:95℃/3:00分钟
阶段2:(95℃/0:10秒-58℃/62℃/0:15秒-72℃/0:30秒)重复20次
阶段3:(95℃/0:10秒-58℃/62℃/0:15秒-72℃/0:30秒-45℃/0:20秒-25℃/0:20秒)重复20次
阶段4:保持25℃/2:00分钟
阶段5:熔融25℃-94℃
实例7(图11)
在等温条件对振荡条件下EXO-S探针的解离速率
在50℃等温条件下或在50℃至70℃温度振荡条件下保持5分钟,比较信号扩增速率。探针和互补靶浓度都为0.5μM;最终试剂浓度为1x英杰PCR缓冲液、3mMMg++、和1.25单位英杰Taq聚合酶。线条(111)是在振荡条件下的复制物,而线条(112)是在等温条件下的复制物。
E9L探针:FAM5’TTTCTAAATCCCATCAGACC 3’BHQ1
具有12个碱基对的3’和5’突出端的E9L靶:
3’ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA5’
实例8(图12)
EXO-S探针与其互补靶3’末端的距离可影响解离速率。
以0.2μM使用E9L探针而以0.05μM使用两种靶;最终试剂浓度为1x英杰PCR缓冲液、3mM Mg++、和1.25单位英杰Taq聚合酶。线条(121)是相对于探针-靶杂合体复合物末端具有12个碱基对的5’和3’突出端的复制物。而线条(122)是相对于探针-靶杂合体复合体5’末端具有44个碱基对的3’突出端的复制物。
E9L探针:FAM5’TTTCTAAATCCCATCAGACC 3’BHQ1
具有12个碱基对的3’和5’突出端的E9L靶:
3’ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA5’
具有44个碱基对的3’突出端的E9L靶:
3’ACCTACACGTTGAGAATCGGCTTCCCATACTCATATCTCGT
GATAAAGATTTAGGGTAGTCTGG5’
实例9(图13)
在45℃至70℃振荡期间探针5’末端与靶发生单碱基配对错配时的不同信号生成速率(情况1)。
探针浓度为0.2μM rs498,靶浓度为0.05μM;最终试剂浓度为1x英杰PCR缓冲液、3mM Mg++、和1.25单位英杰Taq聚合酶,并且在70℃下进行数据收集。线条(131)是含有A-A错配的复制物,线条(132)是具有A-T匹配的复制物。线条(133)是仅具有探针的复制物。
rs498探针:FAM5’AGACATGTTCCCTACT3’BHQ1。
具有末端碱基错配的靶(粗体)
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC
完全匹配的靶CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC
实例10(图14)
在45℃至70℃振荡期间探针5’末端与靶发生单碱基配对错配时的不同信号扩增速率(情况2)。
探针浓度为0.2μM rs498,而靶浓度为0.05μM,试剂与上文所述相同并在70℃下实施数据收集。线条(141)是含有C-A错配的复制物,线条(142)是含有C-T错配的复制物,线条(143)是含有C-C错配的复制物,线条(144)是含有C-G碱基配对匹配的复制物。而线条(145)是仅含有探针的复制物。rs498探针序列为3’FAMCGACATGTTCCCTACT BHQ 15’。在靶链内位于探针序列末端的5’T与其互补序列(加下划线)的3’末端错配(粗体):
5’CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC3’,
5’CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC3’,
5’CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCCGCCATAGGTTTC3’,
或在靶链内与其互补序列(加下划线)的3’末端错配(非粗体)。
5’CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCGGCCATAGGTTTC3’。
实例11(图15)
在等温条件(50℃)下保持30分钟的信号扩增速率。FT探针为0.5μM并且其互补靶为1.0μM;最终试剂浓度为1x英杰PCR缓冲液、3mM Mg++、和1.25单位英杰Taq聚合酶。线条(151)是FT探针和其互补靶的复制物,而线条(152)仅为FT探针。FT探针的序列为5’CCATGATACAAGCTTCC3’并且互补序列为5’ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT3’。
实例12(图16)
在振荡条件(45℃至70℃)下的信号扩增速率。FT探针为0.5μM并且其互补靶为0.5μM;最终试剂浓度为1x英杰PCR缓冲液、3mM Mg++、和1.25单位英杰Taq聚合酶。线条(161)是FT探针和其互补靶的复制物,而线条(162)仅为FT探针。FT探针的序列为5’CCATGATACAAGCTTCC3’,并且互补序列为5’ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT3’。
实例13(图17)
探针5’臂长度的增加可影响到其是EXO-S还是EXO-R探针。图17A至C展示在存在或不存在Taq聚合酶的情况下,将探针和其互补靶于50℃下等温培养30分钟后实施的熔融分析。可与不含Taq的样品达到相同荧光值的含Taq样品指示EXO-R探针。将所有荧光值都标准化至70℃。在图17A中,线条(171)是不含Taq聚合酶的FT探针(无修饰)靶复合体的复制样品。线条(172)是含有FT探针和靶以及Taq聚合酶的复制样品。而线条(173)仅为FT探针。在图17B中,线条(174)是在靶存在下在探针5’末端具有与靶不互补的单碱基的FT(1bp)探针复制样品,且其不含Taq聚合酶。线条(175)是含有FT(1bp)探针和靶以及Taq聚合酶的复制样品。而线条(176)仅为FT(1bp)探针。在图17C中,线条(177)是在靶存在下在探针5’末端具有与靶不互补的五个碱基的FT(5bp)探针复制样品,且其不含Taq聚合酶。线条(178)是含有FT(5bp)探针和靶以及Taq聚合酶的复制样品。而线条(179)仅为FT(5bp)探针。
FT探针序列为5’CCATGATACAAGCTTCC 3’;FT(1bp)探针序列为5’ACCATGATACAAGCTTCC3’;FT(5bp)探针为5TTTTTCCATGATACAAGCTTCC3’。FT靶为3’TCCAAGATTCACGGTACTATGTTCGAAGGGTTAATGATTCA5’
Claims (18)
1、一种不对称聚合酶链反应(PCR)扩增和检测方法,其包含
(a)通过包括引物退火温度的重复热循环对反应混合物实施热循环,所述反应混合物含有第一脱氧核糖核酸(DNA)扩增靶序列、第一过量引物和第一限制引物、dNTP、未显示非靶依赖性探针解离的热稳定DNA聚合酶、和低温第一杂交探针,所述第一杂交探针的浓度调节熔融温度比所述第一限制引物的浓度调节熔融温度低至少5℃并且为线性DNA寡核苷酸,其对非引物依赖性5’外切核酸酶解离的敏感性已通过对所述寡核苷酸的结构修饰而改变;
(b)使所述探针与第一扩增子链杂交,所述第一扩增子链是在所述限制引物耗尽后所述过量引物于第一温度下的延伸产物;和
(c)检测所述探针的杂交。
2、如权利要求1所述的方法,其中所述探针的结构修饰能够增强非引物依赖性5’核酸酶解离,并且其中检测包括检测所述探针是否已解离。
3、如权利要求2所述的方法,其中所述结构修饰选自由以下组成的群组:不与所述扩增子链的对应核苷酸互补的5’核苷酸,和具有通过包括至少三个连续亚甲基的链与其连接的标记部分的5’核苷酸。
4、如权利要求3所述的方法,其中所述链包括三个以上连续亚甲基。
5、如权利要求4所述的方法,其中所述链包括六个连续亚甲基。
6、如权利要求2所述的方法,其中所述反应混合物含有第二DNA扩增靶序列、用于所述第二DNA扩增靶序列的第二过量引物和第二限制引物、和用于通过所述第二过量引物的延伸形成的第二扩增子链的第二杂交探针,其中检测包括在第二温度下检测所述第二探针是否已杂交。
7、如权利要求6所述的方法,其中所述第一和第二探针是经相同荧光团标记的双重标记荧光探针。
8、如权利要求7所述的方法,其中所述第二探针是低温探针,其浓度调节熔融温度比所述第一限制引物的浓度调节熔融温度低至少5℃,并且与所述第一温度相差至少5℃。
9、如权利要求8所述的方法,其中所述第二温度比所述第一温度低至少10℃。
10、如权利要求8所述的方法,其中所述第二探针通过使所述反应温度围绕其熔融温度快速振荡而解离。
11、如权利要求7所述的方法,其中所述第二温度比所述第一温度高至少10℃。
12、如权利要求1所述的方法,其中所述探针的结构修饰能够防止等温非引物依赖性5’核酸酶解离。
13、如权利要求12所述的方法,其中所述结构修饰选自由以下组成的群组:由2-7个不与所述第一扩增子链杂交的核苷酸构成的5’末端臂、具有通过除3个或更多个连续亚甲基的链以外的方式与其连接的标记部分的5’末端核苷酸、和位于所述探针5’末端且由于在70℃以上温度下自退火而形成发夹结构的非互补核苷酸,所述发夹结构具有长为2-5个核苷酸的茎部。
14、如权利要求12所述的方法,其中所述探针对通过在所述探针Tm附近温度下热振荡引发的解离无抗性,并且检测包括围绕所述探针-扩增子杂合体之熔融温度对其进行快速热振荡以产生探针解离。
15、一种在聚合酶链反应(PCR)扩增中阻止DNA靶链延伸的方法,其包含向含有与所述链杂交的引物和DNA聚合酶的PCR反应混合物中添加与所述引物下游(5’)的所述靶链杂交并且通过所述DNA聚合酶阻止所述引物延伸的寡核苷酸,所述DNA聚合酶在所述混合物中未显示非靶依赖性探针解离。
16、如权利要求15所述的方法,其中所述寡核苷酸包括5’末端寡核苷酸发夹,所述发夹不与所述靶链杂交并且具有含2-5个核苷酸的茎部,且其熔融温度为至少70℃。
17、如权利要求15所述的方法,其中所述寡核苷酸与至少两个可能等位基因之一杂交,所述两个等位基因原本都会受到扩增。
18、如权利要求15所述的方法,其中所述PCR反应混合物是对称PCR反应混合物,其中所述引物是平衡引物对中的一个,并且其中所述寡核苷酸在两个或更多个热循环后被添加至所述反应混合物中以阻止所述引物的延伸。
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