JP2009543578A - 特殊化オリゴヌクレオチドならびに核酸の増幅および検出でのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2006年7月17日に出願した米国仮出願第60/831223号に対する優先権およびその利益を主張するものである。
本明細書に使用されるように、「サンプル」は、たとえば生物学的サンプルまたは環境サンプル等の試験されることとなる任意の物質とすることができる。生物学的サンプルは任意の生物から得ることができる。一実施形態では、サンプルは、ヒト、コンパニオンアニマル、または家畜等の哺乳動物から得ることができる。サンプルはまた、たとえばトリ等の他の動物から得ることができる。一実施形態では、動物からのサンプルは、鼻咽頭吸引液、血液、唾液、糞便、尿、または任意の他の体液を含む。他の実施形態では、環境サンプルは、たとえば土壌、水、人工建造物の環境および表面等の任意の環境から得ることができる。
DNA増幅反応での特定の目的のために修飾される標識プローブおよび非標識オリゴヌクレオチドならびに増幅の間にまたは増幅後検出の間に特定の効果を達成するためのそれらの使用が記載される。DNA増幅反応、たとえばPCR増幅はDNAポリメラーゼによるプライマー伸長を含む。本明細書に記載されるように、プローブ−標的構造は、ハイブリダイズしたプローブが5’方向にあるよりも3’方向に長い鋳型鎖を含む。したがって、プローブは、可変数のヌクレオチドだけ標的鎖の一本鎖3’末端から陥凹しており、プローブは、標的鎖に完全にマッチし得るまたは可変長の伸長5’アームを有する5’末端を有する。これらの構造的特色を有する単分子ヘアピン分子は、本明細書に記載されるように、構築されたこれらのものをまねるために使用することができる。
クラス(1)5’末端が完全に相補的な標的配列とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの5’末端に対するある非核酸化学成分の追加;
クラス(2)プローブの5’末端が標的配列に相補的ではなく、したがって、1つまたは複数の塩基について伸長された一本鎖「アーム」を形成するような、オリゴヌクレオチドプローブの5’末端に対する1つまたは複数の非相補的ヌクレオチドの追加;
クラス(3)5’末端の一本鎖「アーム」が、3〜5つのヌクレオチドのステムおよび>70℃の自己アニーリングTmを有する、ヘアピン構造を形成するような、オリゴヌクレオチドプローブの5’末端に対する複数の非相補的ヌクレオチドの追加。
本実施例は、ここで使用される条件下で、ポリメラーゼZO5がプライマー非依存的抵抗性を呈しないことを実証する。
プローブ名 配列(5’−3’)
直鎖FT(アームなし) Fam-CCATGATACAAGCTTCC-BHQ1
直鎖FT BHQ5' BHQ1-CCATGATACAAGCTTCC-Fam
直鎖FT(5'3'アーム) Fam-TTTTTTCCATGATACAAGCTTCCTTTTTT-BHQ1
0-4-0 MW-BG Fam-CGGTGAAACCGCGCCTGCAATATACAGC-BHQ1
標的名
FT標的 ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAAC
BG標的 AAAAAAGCTGTATATTGCAGGCGAAAAAA
本実施例では、標的非依存的プローブ切断を呈する酵素ZO5ポリメラーゼ(実施例1)は、EXO−Rプローブを切断するが、標的非依存的プローブ切断を呈しないプラチナTaqポリメラーゼは、EXO−Rプローブを切断しないことを示す。図5は、唯一の変更を重合反応中で使用される酵素とする同じ反応条件下での、各実行を10,000コピーで始めた、H5およびH3のインフルエンザ遺伝子の検出についての4回の実験の結果を示す。H5遺伝子は5’TET EXO−Rプローブ(実線)によって検出し、H3遺伝子は5’FAM EXO−Rプローブ(破線)によって検出する。NTC値は点線で示す。
5' TET-CACTAGGGAACTCGCTG-BHQ1 3', Tm=52.7 (H5)
5' FAM-CGTTTCTCGAGGTCCTGCG-BHQ1 3', Tm=54.5 (H3)
制限プライマー:
5' AAGGATAGACCAGCTACCATGATTGCC 3', Tm=66.8 (H5)
5' CGTTGTATGACCAGAGATCTATTTTAGTGTCCT 3', Tm=67.9 (H3)
過剰プライマー:
5' ATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGG 3', Tm=63.6 (H5)
5' CCATCAGATTGAAAAAGAATTCT 3', Tm=62.7 (H3)
10×PCRバッファー 1× 2.5μL
10mM dNTPs 250μM 0.625μL
50mM Mg++ 3mM 1.5μL
10μM制限プライマー 2× 0.125μL
100μM過剰プライマー 2× 0.250μL
10μMプローブ 500nM 2× 1.25μL
10μM C3 Primesafe 500nM 1.50μL
混合合計: 9.375μL
ZO−5(5ユニット),プラチナTAQ(1.25u): 1.0/0.25最終ユニット
水: 12.625μLまたは13.375μL
DNAアンプリコン(10,000コピー/μLで2) 2.0
合計容量: 25.0μL
段階1:95℃/3:00分間
段階2:(95℃/10秒間:58℃または62℃、15秒間:72℃、30秒間)20回繰り返す
段階3:(95℃/10秒間−58℃または62℃/15秒間−72℃/30秒間−45℃/20秒間)30回繰り返す
段階4:融解35℃〜94℃
プライマー依存的およびプライマー非依存的LATE−PCR反応でのEXO−Nプローブ
本実施例では、5’ヘアピンEXO−RプローブはLATE−PCRサイクルの最初のサイクルの間にプライマー依存的様式でTAQポリメラーゼによって切断されず、制限プライマーが消耗された場合にプライマー非依存的様式で切断されないことを示す。さらに、使用されるLATE−PCRプライマーの対のTmに依存して、EXO−RプローブはBG標的の増幅を非効率にする。結果を図7A〜Iに示す。
配列:
制限プライマー:
TGCGTTCTGACTGAACAGTGATCGAG, Tm=72℃ (高Tmプライマー対)
TTCTGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=64℃ (中間Tmプライマー対)
TGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=61℃ (低Tmプライマー対)
過剰プライマー:
CCCTCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=66℃ (高Tmプライマー対)
TCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=61℃ (中間Tmプライマー対)
TTGAAATTCCCGAATGG, Tm=58℃ (低Tmプライマー対)
EXO−Rプローブ04017:
5' FAM-CGCTGAAAGCGCGCCTGCAATTTACAGC-BHQ1, 3' Tm=60C
10× PCRバッファー 1× 2.5μL
10mM dNTPs 250μM 0.625μL
50mM Mg++ 3mM 1.5μL
10μM 制限プライマー 50nM 0.125μL
100μM 過剰プライマー 1000nM 0.250μL
10μM EXO-Nプローブ 100nM 0.250μL
10μM Primesafe9-3DD 500nM 1.250μL
1.25U プラチナTAQ 0.250μL
水 17.25μL
BG標的 104コピー/μL 1.0μL
合計 25μL
熱性条件:
段階1:5分間95℃
段階2:繰り返し50サイクル、10秒間95℃、15秒間61℃/58℃、20秒間72℃、および20秒間45℃。
段階3:融解35℃〜94℃
5’末端にFAMを使用するEXO−Sプローブ
実施例4についての図8は、LATE−PCR反応の完了の後の15分間の変動によるEXO−Sプローブシグナル増幅を示す。反応条件は、95℃で10秒、64℃で10秒、および72℃で20秒の45ラウンドとした。最終の試薬濃度は、25マイクロリットル(μL)の容量中、1×Invitrogen社製PCRバッファー、3mM Mg++、および1.25ユニットのInvitrogen社製Taqポリメラーゼ、200nMのdNTP、50ナノモル(nM)FT#2制限プライマー、1000nM FT#2過剰プライマー、および0.6×PrimeSafe(商標)#022(PrimeSafeは、Smiths Detection社から入手可能な試薬である、ならびに300nM FT MBseq4とした。
5' GGAAGTGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGA 3'
とした。
5' GTTGCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA 3'
とした。
5' FAM-CATGATACAAGCTTC-BHQ1 3'
とした。
5’末端にBHQ1を使用するEXO−Rプローブ
本実施例では、(1)Exo−Sプローブの5’蛍光体を5’BHQ−1消光剤に交換することにより、TAQ DNAポリメラーゼによってプライマー非依存的様式でもはや切断されないExo−RプローブにExo−Sプローブを変換すること、および(2)LATE−PCRによって産出された一本鎖DNAに結合されたExo−Rプローブは、プライマー非依存的様式でTAQ DNAポリメラーゼによって切断されないことを示す。図xxは、本実施例の結果を示す。パネルAは、TAQ DNAポリメラーゼの非存在(線91)または存在(線92)下でのExo−Sプローブ/標的ハイブリッドの融解プロファイルを示す。この特定のExo−Sプローブは5’HEX蛍光体および3’BHQ−1消光剤からなる。線93は、鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。反応は、25μL容量中で実行し、1×PCRバッファー(Invitrogen社、カールスバード、CA)、3mM MgCl2、150nM合成標的(下記参照)、500nM Exo−Sプローブ(下記参照)、およびTAQ DNAポリメラーゼを用いたサンプルの場合には、1.25ユニット TAQ DNAポリメラーゼ(invitrogen社、カールスバード、CA)からなるものとした。鋳型なしコントロールサンプルについては、TAQ DNAポリメラーゼを含み、標的配列は10mM Tris−Cl pH 8.3と交換した。サンプルは10秒間95℃で、次いで20分間20℃でインキュベートし、Exo−Sプローブ/標的ハイブリッドの形成を可能にした。次いで、サンプル温度を、それぞれ90秒間の長さの1℃の間隔で20℃から95℃まで上げると共に、蛍光発光シグナルを収集した。TAQ DNAポリメラーゼなしのサンプル(線91)については、プローブ蛍光発光シグナルは、65℃の上で、プローブが標的から完全に融解される温度範囲で鋳型なしコントロールからのプローブ蛍光発光シグナルにマッチする。対照的に、TAQ DNAポリメラーゼを用いたサンプルについては、65℃の上のプローブ蛍光発光シグナルは、鋳型なしコントロールからの蛍光発光シグナルよりも高く、BHQ−1消光剤からのHEX蛍光体のプローブ切断および分離を示す。この結果は、合成標的に結合されたExo−Sプローブがプライマー非依存的様式でTAQ DNAポリメラーゼによる切断に感受性であることを実証する。
配列
Exo-Sプローブ: 5' HEX AGCATACGGTTCAGTT 3' BHQ1
合成標的:
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3'
下線を引いた配列はプローブ標的部位に相当する。
配列
Exo-Rプローブ: 5' BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3' HEX
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3'
下線を引いた配列はプローブ標的部位に相当する。
配列:
制限プライマー:
5' CCATTTCTTCCTCCTCCTCATAAGCATGGTACCTAT 3'
過剰プライマー:
5' CCCGCTGGTTCAATAATGTCTTTAA 3'
Exo-Rプローブ(上記と同じ)
5' BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3' HEX
本実施例では、LATE−PCR増幅の間にROX EXO−Rプローブの分解が観察されない、ニューカッスルDNAアンプリコンの7500コピーを検出するためにEXO−R ROXプローブを使用するLATE−PCR反応を示す。
配列:
制限プライマー:
5' GCATCAAATTCCCCACTGAGCCTC 3', Tm: 67.9℃
過剰プライマー:
5' CCTGGTATTTATTCCTGTTTGAG 3', Tm: 63.2℃
プローブ配列:
5' ROX-ATTTTGCGATATGATACCC-BHQ2 3', Tm: 56℃
10×PCRバッファー 1× 2.5μL
10mM dNTPs 250μM 0.625μL
50mM Mg++ 3mM 1.5μL
10μM制限プライマー 0.125μL
100μM過剰プライマー 0.250μL
10μMプローブ 500nM 2× 1.25μL
10μM C3-12B Primesafe 300nM .750μL
混合合計: 8.25μL
Pt TAQ(1.25ユニット):
水: 14.5μL
DNAアンプリコン
(750、7,500コピー/μLで2) 2.0μL
合計容量: 25.0μL
熱サイクル条件:
段階1:95℃/3:00分間
段階2:(95℃/0:10秒間−58°/62℃/0:15秒間−72℃/0:30秒間)20回繰り返す
段階3:(95℃/0:10秒間−58°/62℃/0:15秒間−72℃/0:30秒間−45℃/0:20秒間−25℃/0:20秒間)20回繰り返す
段階4:25℃/2:00分間保持
段階5:融解25℃〜94℃
等温対変動条件下でのEXO−Sプローブの切断の速度
5分間の等温条件50℃または50℃から70℃の温度の間での変動下でのシグナル増幅の速度の比較。プローブおよび相補標的の濃度の両方は0.5μMとした;最終試薬濃度は、1×Invitrogen社製PCRバッファー、3mM Mg++、および1.25ユニットのInvitrogen社製Taqポリメラーゼとした。線(111)は変動条件下での複製物であり、一方、線(112)は等温条件下での複製物である。
E9Lプローブ:
FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3' BHQ1
12塩基対の3’および5’突出を有するE9L標的:
3' ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5'
その相補的標的の3’末端に対するEXO−Sプローブの距離は切断の速度に影響を与える。
E9Lプローブ:
FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3' BHQ1
12塩基対の3’および5’突出を有するE9L標的:
3' ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5'
44塩基対の3’突出を有するE9L標的:
3 'ACCTACACGTTGAGAATCGGCTTCCCATACTCATATCTCGT
GATAAAGATTTAGGGTAGTCTGG 5'
45℃および70℃の間の変動の間の、標的に対するプローブの5’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル発生についての異なる速度(ケース1)。
rs498プローブ: FAM 5' AGACATGTTCCCTACT 3' BHQ1.
末端塩基がミスマッチの標的、(ボールド)
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC
完全にマッチした標的
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC
45℃および70℃の間の変動の間の、標的に対するプローブの5’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル増幅についての異なる速度(ケース2)。
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC 3',
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC 3',
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCCGCCATAGGTTTC 3',
または標的鎖内でその相補的配列(下線)の3’末端にマッチした(ボールドなし)。
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCGGCCATAGGTTTC 3'.
30分間の等温条件(50℃)下でのシグナル増幅の速度。FTプローブは0.5μMとし、その相補標的は1.0μMとした;最終試薬濃度は、1×Invitrogen社製PCRバッファー、3mM Mg++、および1.25ユニットのInvitrogen社製Taqポリメラーゼとした。線(151)はFTプローブおよびその相補標的の複製物であり、一方、線(152)はFTプローブのみである。FTプローブに対する配列は5’CCATGATACAAGCTTCC3’とし、相補的配列は5’ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT3’とする
変動条件(45℃〜70℃)下でのシグナル増幅の速度。FTプローブは0.5μMとし、その相補標的は0.5μMとした;最終試薬濃度は、1×Invitrogen社製PCRバッファー、3mM Mg++、および1.25ユニットのInvitrogen社製Taqポリメラーゼとした。線(161)はFTプローブおよびその相補標的の複製物であり、一方、線(162)はFTプローブのみである。FTプローブに対する配列は5’CCATGATACAAGCTTCC3’とし、相補配列は、5’ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT3’とする
プローブの5’アームの長さを増加させると、プローブはEXO−SまたはEXO−Rプローブとなる。図17A〜Cは、Taqポリメラーゼの存在下または非存在下での50℃でのプローブおよびその相補的標的の30分間の等温インキュベーション後に行った融解分析を示す。Taqを含有し、Taqを含有していないものと同じ蛍光発光値に達するサンプルは、EXO−Rプローブを示す。蛍光発光値はすべて70℃に標準化する。図17Aについては、線(171)は、TaqポリメラーゼなしのFTプローブ(修飾なし)標的複合体の複製サンプルである。線(172)は、TaqポリメラーゼありのFTプローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線(173)はFTプローブのみである。図17Bについては、線(174)は、Taqポリメラーゼなしの標的の存在下でプローブの5’末端で標的に対する単一の非相補的塩基を有するFT(1bp)プローブの複製サンプルである。線(175)は、TaqポリメラーゼありのFT(1bp)プローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線(176)はFT(1bp)プローブのみである。図17Cについては、線(177)は、Taqポリメラーゼなしの標的の存在下でプローブの5’末端で標的に対する5つの非相補塩基を有するFT(5bp)プローブの複製サンプルである。線(178)は、TaqポリメラーゼありのFT(5bp)プローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線(179)はFT(5bp)プローブのみである。
Claims (18)
- 非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅および検出方法であって、
(a)プライマーアニーリング温度を含む繰り返しの熱サイクルを通して反応混合物を熱的に循環させるステップであって、前記反応混合物が、第1のデオキシリボ核酸(DNA)増幅標的配列、第1の過剰プライマーおよび第1の制限プライマー、dNTP、標的非依存的プローブ切断を呈しない耐熱性DNAポリメラーゼ、ならびに第1の制限プライマーの濃度調整した融解温度を少なくとも5℃下回る濃度調整した融解温度を有し、プライマー非依存的5’エキソヌクレアーゼ切断に対する感受性がオリゴヌクレオチドの構造的修飾によって変化した直鎖DNAオリゴヌクレオチドである低温の第1のハイブリダイゼーションプローブを含有するステップと、
(b)制限プライマーの消耗後に第1の温度で過剰プライマーの伸長産物である第1のアンプリコン鎖に前記プローブをハイブリダイズするステップと、
(c)前記プローブのハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、前記方法。 - 前記プローブの構造的修飾がプライマー非依存的5’ヌクレアーゼ切断を増強し、検出するステップはプローブが切断されたかどうかを検出するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 構造的修飾が、前記アンプリコン鎖の対応するヌクレオチドに対して相補的ではない5’ヌクレオチドおよび少なくとも3つの連続したメチレン基からなる鎖によって連結された標識成分を有する5’ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記鎖が3つを超える連続したメチレン基からなる、請求項3に記載の方法。
- 前記鎖が6つの連続したメチレン基からなる、請求項4に記載の方法。
- 反応混合物が、第2のDNA増幅標的配列、前記第2のDNA増幅標的配列に対する第2の過剰プライマーおよび第2の制限プライマー、ならびに第2の過剰プライマーの伸長によって形成された第2のアンプリコン鎖に対する第2のハイブリダイゼーションプローブを含有し、検出するステップが、前記第2のプローブが第2の温度でハイブリダイズしたかどうかを検出するステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1および第2のプローブが同じ蛍光体で標識された2重標識蛍光プローブである、請求項6に記載の方法。
- 前記第2のプローブが、第1の制限プライマーの濃度調整した融解温度を少なくとも5℃下回り、かつ前記第1の温度と少なくとも5℃異なる、濃度調整した融解温度を有する低温プローブである、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の温度が前記第1の温度を少なくとも10℃下回る、請求項8に記載の方法。
- 第2のプローブがその融解温度のあたりで反応温度を急速に変動させることにより切断される、請求項8に記載の方法。
- 前記第2の温度が前記第1の温度を少なくとも10℃上回る、請求項7に記載の方法。
- 前記プローブの構造的修飾が等温プライマー非依存的5’ヌクレアーゼ切断を予防する、請求項1に記載の方法。
- 構造的修飾は、第1のアンプリコン鎖とハイブリダイズしない2〜7つのヌクレオチドから構成される5’末端アーム、3つ以上の連続したメチレン基の鎖以外によって連結された標識成分を有する5’末端ヌクレオチド、および70℃を上回る温度での自己アニーリングにより2〜5ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成するプローブの5’末端における非相補的ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- プローブが、プローブのTmのあたりの温度での熱変動によって誘発された切断に対して抵抗性ではなく、検出が、プローブ切断をもたらす、その融解温度のあたりでのプローブ−アンプリコンハイブリッドの急速な熱変動を含む、請求項12に記載の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅でDNA標的鎖の伸長を予防するための方法であって、混合物中で前記鎖とハイブリダイズするプライマーおよび標的非依存的プローブ切断を呈しないDNAポリメラーゼを含有するPCR反応混合物に、前記プライマーから下流(5’)の前記標的鎖とハイブリダイズし、前記DNAポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を予防するオリゴヌクレオチドを添加するステップを含む、前記方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的鎖とハイブリダイズせず、少なくとも70℃の融解温度を有する2〜5つのヌクレオチドのステムを有する5’末端オリゴヌクレオチドヘアピンを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、本来ならすべて増幅されるはずである少なくとも2つの考えられる対立遺伝子のうちの一方とハイブリダイズする、請求項15に記載の方法。
- 前記PCR反応混合物は、前記プライマーが1対の釣り合いのとれたプライマーのうちの一方である対称PCR反応混合物であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記プライマーの伸長を予防するために、2回以上の熱サイクル後に反応混合物に添加される、請求項15に記載の方法。
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