JP2016119902A - 二重標識固定化プローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列の検出 - Google Patents
二重標識固定化プローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列の検出 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、3’−末端を通じて固相基質に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第1標識及び第2標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第1標識は、前記固定化プローブの5’−末端に結合し、前記第2標識は、前記第1標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、このような前記第2標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする工程と、
(b)前記工程(a)の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された前記固定化プローブは、前記DNAポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第1標識が前記固定化プローブから解離して、前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こす工程と、
(c)前記DNAポリメラーゼの前記エキソ切断反応を、前記第2標識で標識された前記ヌクレオチドで終了させる工程であって、前記エキソ核酸切断反応の終了は、前記第2標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により誘導され、前記第2標識は、前記固相基質上に残留する工程と、
(d)前記固相基質上におけるシグナルの変化を検出する工程であって、前記固定化プローブの前記切断による前記シグナルの変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む方法を提供する。
5’−X’p−Y’q−Z’r−3’ (I)
(式中、X’pは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する5’−第2ハイブリッド形成部位であり、Y’qは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Z’rは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する3’−第1ハイブリッド形成部位であり、前記TDプローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第1標識及び第2標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第1標識は、前記5’−第2ハイブリッド形成部位の5’−末端に結合し、前記第2標識は、前記第1標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合して、p、q及びrは、ヌクレオチドの数を示し、X’、Y’及びZ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記5’−第2ハイブリッド形成部位のTmは、前記3’−第1ハイブリッド形成部位のTmより低く、前記分割部位は、前記X’p、Y’q、Z’rの三つの部位のうち、最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記5’−第2ハイブリッド形成部位が前記3’−第1ハイブリッド形成部位から分割し、これにより、前記TDプローブのハイブリッド形成特異性は、前記5’−第2ハイブリッド形成部位及び前記3’−第1ハイブリッド形成部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記TDプローブの全体ハイブリッド形成特異性を向上させ、前記TDプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記5’−第2ハイブリッド形成部位及び前記3’−第1ハイブリッド形成部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリッド形成し、前記5’−第2ハイブリッド形成部位の5’−末端が前記DNAポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第1標識が前記TDプローブから解離して前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こし、前記第2標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により、前記第2標識が前記固相基質上に残留し、前記TDプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記5’−第2ハイブリッド形成部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記5’−第2ハイブリッド形成部位がDNAポリメラーゼにより切断されず、前記固相基質上におけるシグナルの変化を引き起こさず、これにより、前記TDプローブが前記ターゲット核酸配列及び非ターゲット核酸配列を区別して、前記固相基質上における前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す)。
(a)本発明は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの塩基成分と標識の結合が、オリゴヌクレオチドがDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにするという独特な特徴を利用する。本発明は、固相に固定化されたプローブ上の二重標識システムと共に、このような独特な特徴をターゲット検出システムに適用する。その5’−末端及び内部部位に標識を有する固定化プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、固定化プローブは、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、その5’−末端で5’→3’方向に徐々に切断されて、その5’−末端にある標識が解離する。抵抗性により塩基成分に標識された内部ヌクレオチドで切断反応は終了して、結局、内部ヌクレオチドの標識は、固相基質に残留するようになり、最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル変化が提供される。
(b)本発明は、内部ヌクレオチドの塩基成分の標識によるDNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性により、固相基質上に第2標識が残留するよう適した位置を考慮する必要がない。これとは異なって、DNAポリメラーゼのプライマー依存的5’→3’ヌクレアーゼ活性を利用する固相基質におけるTaqManプローブに基づく方法は、固相基質に第2標識を残留させるために、反応条件を考慮し、第2標識の位置を厳格に決定しなければならない。
(c)本発明は、プローブ上の内部標識の位置を自由に決定することができるため、二重標識システムのクエンチング効率を最大化するために適したプローブ上の位置に標識を位置させることにより、バックグラウンドシグナルを最小化する。
(d)本発明で使用される好ましいプローブであるmDSO構造を有するTDプローブは、標準的なプローブが非ターゲット核酸配列に非特異ハイブリッド形成することにより、一般的に発生する偽陽性シグナルの除去に部分的に寄与する。
(e)相互作用的二重標識を利用する本発明は、エンドポイント又はリアルタイム方式で固相におけるシグナル変化(シグナル減少又は増加)を測定することができ、ターゲット核酸配列の定性的分析だけではなく、定量的な分析もできる。
(f)本発明は、プローブ及びターゲット核酸配列間のハイブリッド形成だけではなく、酵素反応(DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性による)によるシグナル変化を提供する。即ち、本発明のターゲット特異性は、二重に決定され、プローブの非特異的ハイブリッド形成による偽陽性結果問題が成功的に解決される。しかも、本発明のサイクリック反復は、固定化プローブがシグナル変化を提供するようにして、これにより、シグナルの変化程度を最大化することができる。
(g)本発明は、TaqManプローブに基づく方法と異なり、プライマーの使用無しに、固定化されたプローブのみを利用して実施できる。したがって、本発明は、多数のオリゴヌクレオチドの配列決定及び反応条件の最適化における困難性及び費用に対する非効率性のような、オリゴヌクレオチドを利用する方法でみられる多くの問題点から完璧に自由である。このような利点は、マルチプレックスターゲット検出において、より明確に認識される。
(h)本発明は、固相基質上の固定化プローブが互いに物理的に離隔されているため、一種類の二重標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を固相基質上で同時に検出することができる。
本発明者は、その塩基に標識が結合したヌクレオチドがDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するかどうかを評価した。
SA−T 5’−GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAA
TTTA−3’(SEQ ID NO:1)
SA−Con−M1 [FAM]TCAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ−1](SEQ ID NO:2)
SA−Con−D0(dT) [T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ−1](SEQ ID NO:3)
SA−Con−D1(dT) G[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ−1](SEQ ID NO:4)
SA−Con−D3(dT) TGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ−1](SEQ ID NO:5)
SA−Con−D5(dT) CGTGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ−1](SEQ ID NO:6)
SA−Con−D8(dT) TTCCGTGG[T(FAM)]CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ−1](SEQ ID NO:7)
(下線の文字は、蛍光レポーター分子が結合したチミンを示す)
本発明者は、二重標識プローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列検出に、塩基に標識が結合したヌクレオチドの抵抗性を適用した。5’−ヌクレアーゼ活性を有するTaq DNAポリメラーゼを5’→3’エキソ核酸切断反応に利用した。
SA−T 5’−GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAA
TTTA−3’(SEQ ID NO:1)
SA−Con−M [BHQ−2][C6スペーサー]TCATTCCG[T(Quasar570)]GGTCAATCATTCGGTTTACGGCGTTG
TTACCTTTTT[AminoC7](SEQ ID NO:8)
Marker [Quasar570]ATATATATAT[AminoC7](SEQ ID NO:9)
(下線の文字は、蛍光レポーター分子が結合したチミンを示す)
本発明者は、二重標識TDプローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列検出に、塩基に標識が結合したヌクレオチドのDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を適用した。5’−ヌクレアーゼ活性を有するTaq DNAポリメラーゼを5’→3’エキソ核酸切断反応に利用した。
SA−T 5’−GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAA
TTTA−3’(SEQ ID NO:1)
SA−TD−M [BHQ2][C6スペーサー]TCATTCCG[T(Quasar570)]GGIIIII CATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7](SEQ ID NO:10)
Marker [Quasar570]ATATATATAT[AminoC7](SEQ ID NO:9)
(下線の文字は、蛍光レポーター分子が結合したチミンを示す)
Claims (12)
- DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でDNA又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
(a)ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、3’−末端を通じて固相基質に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第1標識及び第2標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第1標識は、前記固定化プローブの5’−末端に結合し、前記第2標識は、前記第1標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基であるチミン又はシトシンに結合し、このような前記第2標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする工程と、
(b)前記工程(a)の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下でプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された前記固定化プローブは、前記DNAポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第1標識が前記固定化プローブから解離して、前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こす工程と、
(c)前記DNAポリメラーゼの前記エキソ切断反応を、前記第2標識で標識された前記ヌクレオチドで終了させる工程であって、前記エキソ核酸切断反応の終了は、前記第2標識が結合したチミン又はシトシンを有する前記ヌクレオチドの抵抗性により誘導され、前記第2標識と前記チミン又はシトシンとの結合は、前記第2標識が結合したチミン又はシトシンを有する前記ヌクレオチドに前記DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を付与し、前記第2標識は、前記固相基質上に残留する工程と、
(d)前記固相基質上におけるシグナルの変化を検出する工程であって、前記固定化プローブの前記切断による前記シグナルの変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記第2標識は、プライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により前記第1標識から分離する請求項1に記載の方法。
- 前記第2標識は、前記第1標識から2〜20ヌクレオチド離隔された位置にある請求項1に記載の方法。
- 前記第1標識は、前記固定化プローブの5’−末端のホスフェート基に結合した請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記工程(a)−(b)又は(a)−(c)を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記工程(d)の前記検出は、リアルタイム方式、エンドポイント方式又は指定時間間隔方式で行う請求項1に記載の方法。
- 前記プライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記DNAポリメラーゼは、プライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性DNAポリメラーゼである請求項1に記載の方法。
- 前記工程(a)は、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列のコピーを生成するための逆方向プライマーを追加的に含む請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも2種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも2種のプローブを含む請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項1に記載の方法。
- DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でDNA又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する請求項1から10のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
(a)固相基質と、
(b)前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する固定化プローブであって、その3’−末端を通じて固相基質上に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第1標識及び第2標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第1標識は、前記固定化プローブの5’−末端に結合し、前記第2標識は、前記第1標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基であるチミン又はシトシンに結合し、このような前記第2標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする前記固定化プローブと、
(c)プライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記DNAポリメラーゼと、
を含むことを特徴とするキット。 - DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を二重標識オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドに付与する方法であって、
(a)前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程と、
(b)第1標識及び第2標識を有するオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記第1標識は、前記オリゴヌクレオチドの5’−末端に結合し、前記第2標識は、前記第1標識の下流に位置した前記内部ヌクレオチドの塩基であるチミン又はシトシンに結合し、このような前記第2標識の結合は、前記内部ヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにし、前記第1標識は、前記DNAポリメラーゼのプライマー非依存的5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されるようにする工程と、を含むことを特徴とする方法。
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