JP6178430B2 - Ｐｔｏ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーションアッセイによるターゲット核酸配列の検出 - Google Patents

Ｐｔｏ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーションアッセイによるターゲット核酸配列の検出 Download PDF

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Description

本特許出願は、大韓民国特許庁に２０１２年１２月２７日に提出された大韓民国特許出願第２０１２−０１５４８３４号、２０１３年１月２５日に提出された大韓民国特許出願第２０１３−０００８５８０号及び２０１３年３月２９日に提出された大韓民国特許出願第２０１３−００３４６７０号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイによるターゲット核酸配列の検出に関する。
ＤＮＡハイブリダイゼーションは、分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、核酸断片の長さ、ミスマッチング程度及び変性剤の存在により影響を受ける。ＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術は、特定核酸配列の決定に非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的実験分析に明確に役に立つだろう。しかし、大部分のハイブリダイゼーションにのみ依存する従来方法及び過程では、プローブと非ーターゲット配列間の非特異的なハイブリダイゼーションにより偽陽性結果が発生する可能性が高い。したがって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。
プローブハイブリダイゼーション過程の他にも、追加的に酵素的反応を利用した幾つかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法が提示された。
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法において、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた標識プローブは、アップストリーム依存的ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性により切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（特許文献１〜３）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、シグナル発生のための２つの接近法を提示する：重合依存的切断及び重合独立的切断。重合依存的切断において、アップストリームプライマーの延長は、必ず核酸重合酵素が標識プローブの５’−末端に接触する前に起こらなければならない。延長反応が進行されつつ、重合酵素は、標識プローブの５’−末端をだんだん切断する。重合独立的切断において、アップストリームプライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸にハイブリダイズされて、アップストリームプライマーの３’−末端と核酸重合酵素の結合は、前記核酸重合酵素が標識プローブの５’−末端に接触するようにして、標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、その５’−末端部位にターゲット配列とハイブリダイズされない５’−テイル区域を有する標識プローブが切断されて、５’−テイル区域を含む断片が形成されることを開示している。
ターゲット配列に非−相補的な５’−テイル区域を有するプローブが５’ヌクレアーゼにより切断され、５’−テイル区域を含む断片が放出される幾つかの方法が報告された。
例えば、特許文献４は、ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性により切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイズされて、アップストリームオリゴヌクレオチドは、非常に近接して鋳型にハイブリダイズされる切断構造が例示されている。切断構造は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素または減少された合成活性を有する変形ＤＮＡ重合酵素により切断され、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。その後、放出された５’部位は、ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて切断構造を形成し、これにより漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。
特許文献５は、３’−末端がブロッキングされたアップストリームオリゴヌクレオチドを有する切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼにより切断されて、非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出されて、放出された５’フラップ部位は、大きさ分析または相互作用的二重標識により検出される過程を開示している。特許文献６は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的増幅方法により生成されることを開示している。この方法において、一番目の切断構造から放出されたフラップは、核酸合成依存的な方式で二番目の切断構造を切断してフラップを放出させて、放出されたフラップを検出する。
特許文献７は、核酸合成により生成された放出されたフラップの生成、放出されたフラップの延長、フラップ延長の間オリゴヌクレオチドの切断及びオリゴヌクレオチド切断により生成されたシグナル検出を含む方法を開示している。
液相における蛍光−標識プローブのハイブリダイゼーションにより、一種類の蛍光標識を利用するとしても、メルティングカーブ分析により多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。しかし、相互作用的−二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ媒介切断によりターゲット配列を検出する従来の技術は、マルチプレックスターゲット検出において、互いに相異なるターゲット配列に対して互いに相異なる種類の蛍光標識を必要とし、このような蛍光標識の種類数の限界のため、検出されるターゲット配列の数は制限される。
特許文献８は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を有するプローブの切断及びキャプチャープローブのハイブリダイゼーションを利用したターゲット検出方法を開示している。標識は、非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイズされた標識プローブは、切断されて断片を放出して、以後断片は、キャプチャープローブにハイブリダイズされて、ターゲット配列の存在が検出される。この方法において、非切断の／完全な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブは、キャプチャープローブにハイブリダイズされないことが必須的である。このためには、短い長さを有するキャプチャープローブが固相基質上に固定化されなければならない。しかし、このような制限は、固相基質におけるハイブリダイゼーションの効率性を低めて、また反応条件の最適化も難しくする。
したがって、より便利で、且つ信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリダイゼーションだけではなく５’ヌクレオ切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素的反応により、液相及び固相でターゲット配列、より好ましくは、複数のターゲット配列を検出するための新規な接近法に対する開発要求が高まっている。また、当業界で標識（特に、蛍光標識）種類の数に制限されない新規なターゲット検出方法が要求されている。
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許及び文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第５，２１０，０１５号 米国特許第５，５３８，８４８号 米国特許第６，３２６，１４５号 米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国特許第６，８９３，８１９号 米国特許第７，３０９，５７３号 米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号
本発明者らは、より改善された正確性及び便利性を有して、特に、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコールを定立して、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、酵素的プローブ切断、延長及びＨＯ（ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ））を利用した延長産物（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）の検出によって達成される。本発明のプロトコールは、固相反応だけではなく、液相反応にも好適に適用されて、より改善された正確性及び便利性を有して複数のターゲット配列が検出されるようにする。
したがって、本発明の目的は、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するための方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明は、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイによるターゲット核酸配列を検出するための新規な方法及びＰＣＥ−ＮＨアッセイによりターゲット核酸配列を検出するためのキットに関する。本発明は、プローブハイブリダイゼーション、酵素的プローブ切断、延長及びＨＯ（ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）を利用した延長産物（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）の検出によって実施される。本発明は、ＨＯを利用した延長産物の検出のための方式によって、３つの様態に分類できる。
本発明の特徴及び利点は、下記のように要約される：
（ａ）ターゲット配列の存在の決定のために、本発明は、（ｉ）前記ターゲット配列とハイブリダイズされるＰＴＯ、（ｉｉ）ターゲット依存的方法で延長デュープレックスが形成できるＣＴＯ、（ｉｉｉ）前記ＣＴＯとハイブリダイズされるＨＯを利用して、これにより、ターゲット配列に特異性を極めて増加させる。また、シグナル発生のための条件は、ターゲット配列に関係なく調節できるため、本発明の方法に対する反応条件を容易に設定できる。前記特徴は、シグナル発生のための条件を容易に決定できるようにするだけではなく、試料、特に、臨床試料に対するマルチプレックスターゲット検出時、偽陽性シグナルを防止できるようにする。
（ｂ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドのＴｍ値は、配列及び／またはＨＯの長さによって調節できるため、前記ハイブリッドのＴｍ値を任意的に予め決定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）することができる。前記特徴を利用することにより、（ｉ）ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの固有のＴｍ値は、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在に対する区別因子として使用でき（例えば、メルティング分析で）；及び（ｉｉ）ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドを維持するための検出温度及び少なくとも２つのターゲット配列のマルチプレックス検出のための反応条件を容易に決定することができる。
（ｃ）本発明は、ターゲット依存的延長デュープレックスの形成によるＣＴＯと完全なＨＯ間にハイブリダイゼーション抑制の発生を利用する。したがって、本発明は、ＨＯが切断されなかった場合にもターゲット配列を検出することができる。これと関連し、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの検出は、ＣＴＯの延長反応とは別の容器で実施できる。
（ｄ）本発明の第１様態及び第３様態は、ＨＯの切断だけではなく、ＣＴＯと完全なＨＯ間にハイブリダイゼーションの抑制を利用する。したがって、ＰＴＯの５’−タギング部位、ＣＴＯ及びＨＯ配列のデザインが容易で、反応条件も容易に設定できる。
（ｅ）本発明の第１様態及び第３様態は、ターゲット配列検出のための多様な標識を利用することができる。
（ｆ）少なくとも２つのターゲット配列検出のための本発明の第１様態において、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが互いに相異なるＴｍ値を有する場合、前記少なくとも２つのターゲット核酸配列は、同一な蛍光特性を有したシグナルを提供する標識システムを使用しても、メルティングカーブ分析により検出できる。このような長所は、マルチプレックス実時間検出で検出可能な蛍光ラベル数の制限によるマルチプレックスの具現の限界を克服することができる。
（ｇ）メルティング分析を利用してプローブとターゲット配列間にハイブリッドまたはターゲット配列のＰＣＲ増幅産物を分析する従来技術は、臨床試料のようなヌクレオチド変異−敏感性試料（Ｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｓａｍｐｌｅｓ）の場合、分析偏差を示す可能性が高い。しかし、本発明の第１様態は、ターゲットの配列にかかわらずデザインできるＣＴＯ及びＨＯを使用して、試料に偏差のない分析結果を得ることができる。
（ｈ）固相に固定されたオリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列間の直接的なハイブリダイゼーションを通じてターゲット核酸配列を検出する従来の固相反応は、固相という制限された反応環境によって、効率的な反応結果が得られない場合がある。その反面、本発明は、固相ではターゲット核酸配列の関与無しにＣＴＯとＨＯとのハイブリダイゼーション反応を利用するため、定型化された反応条件においてもより効率的に結果を得ることができる。
（ｉ）本発明の固相反応において、少なくとも２つのターゲット配列が単一標識を使用するとしても、同時に検出することができる。
（ｊ）前記ＨＯが前記ＣＴＯとのハイブリダイゼーション側面で、前記断片と競争するヌクレオチド配列を含む場合、ＨＯの切断が実質的に排除できる。このような場合、ターゲット配列の検出は、ＨＯ切断の影響無しに行うことができる。
（ｋ）前記ＨＯが前記ＣＴＯとのハイブリダイゼーション側面で、前記断片と競争するヌクレオチド配列を含む場合、単一反応容器でＨＯは、ＰＴＯがＣＴＯに結合することを抑制するため、ＰＴＯは、ＣＴＯよりターゲット配列にもっとハイブリダイズされる可能性がある。
（ｌ）前記ＣＴＯとのハイブリダイゼーション側面で、前記断片と競争するヌクレオチド配列を含む前記ＨＯを使用する本発明の一具現例において、比較的短いＣＴＯを使用することができ、これは、ＣＴＯの合成効率性及び費用効率を改善させることができる。
図１は、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイに利用されるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＨＯ）の図式的な構造を示す。特に、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＨＯの３’−末端は、ブロッキングされて延長が防止される。 図２は、メルティング（ｍｅｌｔｉｎｇ）分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター（ｒｅｐｏｔｅｒ）分子及びクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）分子を有する。延長デュープレックス（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）の形成は、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。 図３は、メルティング分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。延長デュープレックスの形成は、ＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）だけではなく、ＨＯの切断により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。 図４は、メルティング分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子を有して、ＣＴＯは、クエンチャー分子を有する。 図５は、メルティング分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態を図式的に示す。ＨＯは、一本鎖または二本鎖上に存在するかによって相異なるシグナル強度を示す単一蛍光標識を有する。 図６は、メルティング分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図７は、メルティング分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子を有して、ＣＴＯは、クエンチャー分子を有する。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図８は、固相において単一標識を利用したＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態を図式的に示す。ＣＴＯは、単一標識を有して、ＨＯは、固相基質上に固定化される。延長デュープレックスの形成は、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。 図９は、固相において単一標識を利用したＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態を図式的に示す。ＣＴＯは、単一標識を有して、ＨＯは、固相基質上に固定化される。延長デュープレックスの形成は、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）だけではなく、ＨＯの切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）により、ＣＴＯとＨＯ間にハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。 図１０は、固相において単一標識を利用したＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態を図式的に示す。ＨＯは、単一標識を有して、ＣＴＯは、固相基質上に固定化される。延長デュープレックスの形成は、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。 図１１は、固相において単一標識を利用したＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態を図式的に示す。ＨＯは、単一標識を有して、ＣＴＯは、固相基質上に固定化される。延長デュープレックスの形成は、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）だけではなく、ＨＯの切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）により、ＣＴＯとＨＯ間にハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。 図１２は、固相において単一標識を利用したＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態を図式的に示す。ＣＴＯは、単一標識を有して、ＨＯは、固相基質上に固定化される。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図１３は、固相において単一標識を利用したＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態を図式的に示す。ＨＯは、単一標識を有して、ＣＴＯは、固相基質上に固定化される。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図１４は、延長デュープレックスの形成がＣＴＯにＨＯがハイブリダイズすることを抑制する新規な反応に基づく、指定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度における検出を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。 図１５は、延長デュープレックスの形成がＣＴＯにＨＯがハイブリダイズすることを抑制する新規な反応に基づく、指定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度における検出を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子を有して、ＣＴＯは、クエンチャー分子を有する。 図１６は、延長デュープレックスの形成がＣＴＯにＨＯがハイブリダイズすることを抑制する新規な反応に基づく、指定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度における検出を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態を図式的に示す。ＨＯは、一本鎖または二本鎖上に存在するかによって相異なるシグナル強度を示す単一蛍光標識を有する。 図１７は、延長デュープレックスの形成がＣＴＯにＨＯがハイブリダイズすることを抑制する新規な反応に基づく、指定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度における検出を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図１８は、延長デュープレックスの形成がＣＴＯにＨＯがハイブリダイズすることを抑制する新規な反応に基づく、指定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度における検出を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態を図式的に示す。ＨＯは、レポーター分子を有して、ＣＴＯは、クエンチャー分子を有する。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図１９Ａは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションが延長デュープレックスにより抑制されるかどうかを評価した結果を示す。Ｓｙｎ−Ｅｓは、合成延長鎖を意味する。 図１９Ｂは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションが延長デュープレックスにより抑制されるかどうかを評価した結果を示す。Ｓｙｎ−Ｅｓは、合成延長鎖を意味する。 図２０Ａは、指定温度（ハイブリダイゼーション温度、５５℃）において実時間ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。このような結果は、延長デュープレックスにより抑制されたシグナルを利用したターゲット検出を示す。 図２０Ｂは、指定温度（変性温度、９５℃）において実時間ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。この結果は、種々のＨＯが反応の間切断されることを示す。 図２０Ｃは、メルティング分析方式において、ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。 図２１Ａは、指定温度（ハイブリダイゼーション温度、６０℃）において実時間ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。検出されたシグナルは、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制から提供された。ＨＯの切断によって提供されるシグナルは排除される。 図２１Ｂは、指定温度（変性温度、９５℃）において実時間ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。この結果は、反応中にＨＯが切断されなかったことを示す。 図２１Ｃは、メルティング分析方式において、ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出の結果を示す。ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、ＰＴＯ断片と競争するヌクレオチド配列を含む。 図２２は、単一標識されたＣＴＯ及び固相に固定化されたＨＯを利用するＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出の結果を示す。 図２３は、延長段階及びＨＯハイブリダイゼーション段階を別途のチューブで実施し、ＨＯが切断されないようにしながら、単一標識されたＣＴＯ及び固相に固定化されたＨＯを利用するＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出の結果を示す。
Ｉ．ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出過程の第１様態
本発明の一様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）を生成して、延長デュープレックス（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）を形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
（ｅ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）の存在下で、一定温度範囲にかけて前記段階（ｄ）の結果物に対するメルティング分析またはハイブリダイゼーション分析を実施する段階（前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供し、前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって前記シグナルが提供されず、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）により提供される）と、
（ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有して、特に、マルチプレックス方式においてターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコールを定立して、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、酵素的プローブ切断、延長及びＨＯ（ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）を利用したメルティング分析（またはハイブリダイゼーション分析）により達成される。本発明のプロトコールは、固相反応だけではなく、液相反応にも好適に適用されて、より改善された正確性及び便宜性を持って複数のターゲット配列が検出されるようにする。
本発明は、プローブハイブリダイゼーションを含む連続的なイベントを利用する；ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断及び延長；延長デュープレックスの形成；及びＨＯを使用したハイブリダイゼーション分析またはメルティング分析。メルティング分析またはハイブリダイゼーション分析において、ＨＯを有するハイブリッドの非形成は、ターゲット核酸配列の存在を示す。したがって、本発明は、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイと命名される。
前記ターゲット核酸が存在する場合にのみ、前記延長デュープレックスが生成され、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止するため、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルの非存在は、ターゲット核酸の存在を示す。
前記延長デュープレックスに係わる用語‘ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）’は、延長デュープレックスによる前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド非形成に係わるあらゆるイベントを意味する。例えば、前記用語は、延長デュープレックスによるＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）及びハイブリッドを形成するＨＯを消耗させるＨＯの切断（即ち、ＰＴＯ断片の延長の間にＨＯの切断）を含む。
本発明は、前記ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの有無検出のための判別要因として、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドのＴｍ値を使用する特徴を有する。ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドは、ＣＴＯ及びＨＯの配列及び／または長さによって区別可能なＴｍ値を有する。メルティング分析またはハイブリダイゼーション分析による、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの有無は、Ｔｍ値に基づいて決定される。
特に、本発明は、前記ＨＯが切断された場合だけではなく、ＨＯが切断されていない場合（即ち、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーションが延長デュープレックスの形成により抑制される）も、ターゲット核酸配列の検出のために適用できる。
ターゲット配列とハイブリダイズされた後、切断されるプローブからのシグナル発生を含む従来技術は、メルティングカーブを提供しない可能性がある。これとは違って、本発明は、ターゲット配列と無関係の配列を有するＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが提供するメルティングシグナルの消滅（または減少）を使用する。したがって、本発明は、ＨＯがターゲット配列の存在に依存して切断される場合でも、メルティング分析によってターゲット配列を検出することができる。
メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態をより詳細に説明すると、以下のようである：
段階（ａ）：ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯのハイブリダイゼーション
本発明によると、まずターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる。
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’または‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリングまたは増幅条件下でプライマーまたはプローブとアニーリングまたはハイブリダイズされる。
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位または複数の部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。
本発明の特定具現例において、プローブ及びプライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。本発明で利用されるプローブまたはプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ， ｄＧＭＰ， ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非−天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブまたはプライマーは、リボヌクレオチドを含むことができる。
プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む複数の要素によって決定される。本明細書で使用された用語‘アニーリング’または‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部に相補的な核酸分子を形成するようにする。
本明細書で使用された用語‘ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（Ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起こるか、または一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こりうる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わり、特に温度によって調節され得る。
アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列のハイブリダイゼーションは、最適化過程により一般に決定される適したハイブリダイゼーション条件下で行うことができる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、バッファ成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ、ＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子によって様々である。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを利用する場合、低い厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが好ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ５ ， Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認できる。
用語‘アニーリング’と‘ハイブリダイズ’に差はなく、本明細書で混用される。
アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件または厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズするほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する。本明細書で使用される用語‘非相補的’は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされない程度に十分非相補的なことを意味し、用語‘実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に非相補的なことを意味する。
例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位を言及しながら使用される用語‘非相補的’は、所定のアニーリング条件または厳格条件下で、５’−タギング部位がターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされない程度に十分非相補的なことを意味し、用語‘実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に非相補的なことを意味する。
本明細書で使用される用語‘ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）’は、（ｉ）プローブとしての役割をする３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション後に切断されてＰＴＯから放出されて、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する５’−タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位は、必ず５’→３’の順に位置する。図１でＰＴＯを図式的に示す。
本発明の一具現例によると、３’−ターゲッティング部位がターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非ハイブリダイズされる厳格条件下で段階（ａ）のハイブリダイゼーションが実施される。
ＰＴＯは、どんな特定長さも要求しない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５−１５０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１５０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、３０−１５０ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、３０−５０ヌクレオチド、３５−１００ヌクレオチド、３５−８０ヌクレオチド、３５−６０ヌクレオチドまた３５−５０ヌクレオチドの長さを有することができる。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位がターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる限り、どんな長さも有することができる。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチドまたは２０−３０ヌクレオチドの長さを有することができる。５’−タギング部位は、ＣＴＯのキャプチャリング部位に特異的にハイブリダイズされた後に延長される限り、どんな長さも有することができる。例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位は、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチドまたは１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。
ＰＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を有することもできる。好ましくは、ＰＴＯの３’−末端は、‘ブロッキング’されて、その延長が防止される。
ブロッキングは、従来の方法により達成できる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非−ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエートまたはアルカン−ジオール残基のような化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して実施できる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを利用して実施できる。
択一的に、ＰＴＯがヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。
ＰＴＯの５’−タギング部位及びターゲット核酸配列間の非ハイブリダイゼーションは、特定ハイブリダイゼーション条件下でそれらの間に安定した二本鎖が非形成されることを意味する。本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しないＰＴＯの５’−タギング部位は、一本鎖を形成する。
アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯのアップストリームに位置する。
また、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたアップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
アップストリームオリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、２つの方式で達成できる：（ｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−独立的切断誘導；及び（ｉｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−依存的切断誘導。
アップストリームオリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯに近接して位置する場合、アップストリームオリゴヌクレオチドに結合した前記酵素は、延長反応無しにＰＴＯを切断する。その反面、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯから離隔されている場合、重合酵素活性を有する酵素（例えば、鋳型−依存的重合酵素）は、アップストリームオリゴヌクレオチド（例えば、アップストリームプライマー）の延長を促進させて、延長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素はＰＴＯを切断する。
したがって、アップストリームオリゴヌクレオチドは、２つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置することができる。アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−独立的な方式でＰＴＯの切断を誘導するに十分なほどＰＴＯに近接した位置に位置することができる。択一的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＴＯ切断を誘導するに十分な程度にＰＴＯから離隔された位置に位置することができる。
本明細書において、地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使用される用語‘近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）’は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位のすぐ近くに位置して、ニック（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、前記用語は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチドまたは１〜１５ヌクレオチド離隔されて位置することを意味する。
本明細書において、地点または位置を言及しながら使用される用語‘離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）’は、延長反応が起こるのに十分な程度のある地点または位置を含む。
本発明の一具現例によると、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するに十分なほどＰＴＯから離隔されて位置することができる。
本発明の一具現例によると、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。アップストリームプライマーは、延長−独立的切断誘導または延長−依存的切断に適しており、アップストリームプローブは、延長−独立的切断誘導に適している。
選択的に、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有することができる。好ましくは、重なる配列は、１〜１０ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチドまたは１〜３ヌクレオチドである。アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する場合、段階（ｂ）の切断反応において、３’−ターゲッティング部位は、５’−タギング部位と共に部分的に切断される。また、重なる配列は、３’−ターゲッティング部位の所望の特定位置が切断されるようにする。
本発明の一具現例によると、アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
アップストリームオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断を誘導してＰＴＯの５’−タギング部位またはＰＴＯの５’−タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、アップストリームオリゴヌクレオチドによる切断反応用従来技術は、本発明に適用することができる。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開第２００８−０２４１８３８号は、本発明に応用することができる。
本発明の一具現例によると、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施する。ダウンストリームプライマーは、ＰＴＯにハイブリダイズされるターゲット核酸配列を追加的に生成させて、ターゲット検出の敏感度を向上させる。
本発明の好ましい一具現例によると、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを利用する場合、プライマーの延長のために追加的に鋳型−依存的核酸重合酵素を使用する。
本発明の一具現例によると、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブ）、ダウンストリームプライマー及び／またはＰＴＯの５’−タギング部位は、本発明者により開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来プライマー及びプローブに比べて非常に改善されたターゲット特異度を示す（参照：ＷＯ ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３５：６ｅ４０（２００７））。
本発明の一具現例によると、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、本発明者により開発された変異二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来プローブに比べて非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ ２０１１／０２８０４１）。
段階（ｂ）：ＰＴＯから断片の放出
次いで、ＰＴＯの切断のための条件下で段階（ａ）の結果物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
本明細書で使用される用語‘ＰＴＯの切断のための条件’は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によりターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断が発生されるのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度及びバッファ、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が利用される場合、ＰＴＯの切断のための条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び温度を含む。
ＰＴＯがターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、その３’−ターゲッティング部位は、ハイブリダイゼーションに含まれるが、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖構造を全部含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られた多様な技術により、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して切断できる。
ＰＴＯの切断位置は、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプローブまたはアップストリームプライマー）の種類、アップストリームオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって多様である（参照：米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号及び第７，３８１，５３２号または米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。
ＰＴＯの切断反応のために、多数の従来技術を利用することができ、５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
まとめてみると、段階（ｂ）の切断反応において、３つの切断位置がありえる。第一の切断位置は、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクション位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）である。第二の切断位置は、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に一部ヌクレオチド離隔された位置である。第二の切断位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置できる。第三の切断位置は、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から５’−方向に一部ヌクレオチド離隔された位置である。
本発明の一具現例によると、アップストリームプライマーが延長されつつ、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素によりＰＴＯの切断が始まる位置は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が始まる地点またはその地点から１〜３ヌクレオチド離隔された位置である。
したがって、本明細書で５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使用される用語‘ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片’は、（ｉ）５’−タギング部位、（ｉｉ）５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部及び（ｉｉｉ）５’−タギング部位の一部を含む意味として使用される。また、本明細書で用語‘ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片’は、‘ＰＴＯ断片’と表現される。
本発明の一具現例によると、ＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に耐性のあるブロッカーを含むブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）部位を有して、ブロッカー部位は、初期切断位置及び／または連続的切断を調節するに使用される。
本発明の一具現例によると、ＰＴＯは、ブロッカーとして５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に耐性のある少なくとも一つのヌクレオチドを含むブロッカー部位を有する。
例えば、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクション位置に切断を誘導するために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ブロッカーでブロッキングされることがある。
ブロッカー部位に含まれるブロッカーの数に制限はないが、１−１０、２−１０、３−８または３−６ブロッカーを含むことができる。ＰＴＯに存在するブロッカーは、連続的または不連続的な方式であって、好ましくは連続的な方式である。ブロッカーとしてのヌクレオチド、即ち、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むヌクレオチドは、当業界に知られたあらゆるものを含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミダート連結及び２’−カーボヒドレート変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼに耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、アリールホスホロアミダート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形を含む。
本発明の一具現例によると、ブロッカーとしてヌクレオチドは、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）を含む。
本明細書において、ＰＴＯの５’−タギング部位の一部、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のように、ＰＴＯまたはＣＴＯを言及しながら使用される用語‘一部（ｐａｒｔ）’は、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０または１〜５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、好ましくは、１、２、３または４ヌクレオチドである。
本明細書の一具現例によると、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。
本発明に適した５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ （Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
択一的に、本発明は、重合酵素活性をより少なく有するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素を使用することができる。
使用されるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ−特異的ヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
本発明に適しているＦＥＮヌクレアーゼは、多様なバクテリア種から得たＦＥＮヌクレアーゼを含み、これは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ， Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。
段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用する場合、ＰＴＯの切断のための条件は、アップストリームプライマーの延長反応を含むことが好ましい。
本発明の一具現例によると、段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用して、前記アップストリームプライマーの延長のために鋳型−依存的重合酵素を利用して、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と同一な酵素である。
選択的に、段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用して、前記アップストリームプライマーの延長のために鋳型−依存的重合酵素を利用して、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と相異なる酵素である。
段階（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯのハイブリダイゼーション
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズされる。
ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
ＣＴＯは、ＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型の役割をする。プライマーとしての役割をする前記断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされて、延長されて延長デュープレックスを形成する。
テンプレーティング部位がＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的な配列を有する限り、どんな配列でも含むことができる。また、テンプレート部位がＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型の役割ができる限り、どんな配列でも含むことができる。
上述のように、ＰＴＯの５’−タギング部位を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる。ＰＴＯの５’−タギング部位の一部を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる。
一方、ＰＴＯの切断位置を予想することにより、ＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’−タギング部位の一部を有する断片または５’−タギング部位を有する断片は、キャプチャリング部位とハイブリダイズできて、以後延長される。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を含む断片が放出される場合、前記断片は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズでき、前記断片の３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにもかかわらず、成功的に延長できる。これは、プライマーの３’−末端が一部ミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにもかかわらず、プライマーが反応条件によって延長できるからである。
５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部は、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を有するようにデザインすることにより、ミスマッチヌクレオチドに係わる問題を解決することができる（参照：図１）。
本発明の一具現例において、切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位上の予想される切断位置によって選択できる。切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、または、１〜３ヌクレオチドである。
ＣＴＯの３’−末端は、断片とのハイブリダイゼーションに含まれない追加的なヌクレオチドを含むことができる。また、ＣＴＯが前記断片と安定してハイブリダイズされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記断片の一部（例えば、その３’−末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
本明細書で使用される用語‘５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位’は、上述のようにＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び構成を含んで説明する。
ＣＴＯは、ヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。
ＣＴＯの長さは、多様である。例えば、ＣＴＯは、７−１０００ヌクレオチド、７−５００ヌクレオチド、７−３００ヌクレオチド、７−１００ヌクレオチド、７−８０ヌクレオチド、７−６０ヌクレオチド、７−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチドまたは３０−４０ヌクレオチドの長さである。ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイズされる限り、どんな長さでも有することができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５−１００ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチドまたは１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。また、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の延長反応で鋳型の役割ができる限り、どんな長さでも有することができる。例えば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、２−９００ヌクレオチド、２−４００ヌクレオチド、２−３００ヌクレオチド、２−１００ヌクレオチド、２−８０ヌクレオチド、２−６０ヌクレオチド、２−４０ヌクレオチド、２−２０ヌクレオチド、５−９００ヌクレオチド、５−４００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−９００ヌクレオチド、１０−４００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１５−９００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチドまたは１５−２０ヌクレオチドの長さを有することができる。
ＣＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有することができる。好ましくは、ＣＴＯの３’−末端は、ブロッキングされて延長が防止される。ＣＴＯの非延長ブロッキングは、従来の方法によって達成できる。例えば、ブロッキングは、ＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非−ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエートまたはアルカン−ジオール残基のような化学的モイエティを追加して実施できる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを利用して実施できる。
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯとハイブリダイズされて、断片の延長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯがその５’−タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされるとしても、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ＣＴＯにハイブリダイズされず、延長デュープレックスの形成が防止される。
段階（ｃ）におけるハイブリダイゼーションは、段階（ａ）におけるハイブリダイゼーションに対する説明を参照して詳細に説明できる。
段階（ｄ）：断片の延長
延長反応は、鋳型−依存的核酸重合酵素及び段階（ｃ）の結果物を利用して実施する。ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片は、延長されて、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な延長鎖が生成されて延長デュープレックスを形成する。その反面、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた非切断ＰＴＯは延長されず、これにより、延長デュープレックスも形成されない。
本明細書で断片と共に使用された用語‘延長鎖’は、断片及び断片の延長配列で構成された配列を意味する。本明細書で使用される用語‘延長デュープレックス’は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片が鋳型−依存的核酸重合酵素とＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として利用して延長される延長反応により形成されたデュープレックスを意味する。
段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、どんな核酸重合酵素でも可能であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの‘Ｋｌｅｎｏｗ’断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ重合酵素である。好ましくは、重合酵素は、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ （Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。より好ましくは、鋳型−依存的核酸重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
本発明の一具現例によると、段階（ｂ）で利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素と同一である。より好ましくは、段階（ｂ）で利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、アップストリームプライマーの延長のために利用される鋳型−依存的核酸重合酵素及び段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、互いに同一である。
段階（ｅ）：ＨＯを利用したメルティング（ｍｅｌｔｉｎｇ）またはハイブリダイゼーション分析
延長反応に続いて、ＨＯ（ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）の存在下で、一定温度範囲にかけて段階（ｄ）の結果物に対するメルティング分析またはハイブリダイゼーション分析を実施し、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルの発生有無を測定した。
前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供する。前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止し、これによってシグナルを提供しない。
段階（ｅ）は、前記ＨＯを使用して実施される。
前記ＨＯは、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。前記延長デュープレックスが形成されず前記ＣＴＯが一本鎖である場合、前記ＨＯは、前記ＣＴＯとハイブリダイズされてハイブリッドを形成する。前記ハイブリッドは、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間一定温度範囲にかけて形成及び／またはメルティングされて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供する。前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯが二本鎖である場合、前記延長デュープレックスは、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド形成を防止し、これによって、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルが提供されない。
前記ＨＯの長さは、広範囲に変わる。例えば、ＨＯは、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、５−１０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、１５−２０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチドまたは２０−３０ヌクレオチド長さである。
本発明において、前記ＣＴＯ／延長鎖の延長デュープレックスは、前記ＣＴＯ／ＨＯのハイブリッドよりさらに安定したデュープレックスでありえる。このために、前記ＨＯのＴｍ値は、ＣＴＯのＴｍ値よりさらに低いことがある。本発明の一具現例によると、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドのＴｍ値は、前記ＣＴＯ／延長鎖の延長デュープレックスのＴｍ値より少なくとも１０℃、２０℃、３０℃、または４０℃さらに低い。
本発明の一具現例において、前記ＨＯは、３’−末端がブロッキングされてＨＯの延長を防止する。
前記延長デュープレックスによるＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド形成の防止は、ＣＴＯ及びＨＯ間に接触機会（ｃｏｎｔａｃｔ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）の発生時点（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）によって多様な方式で達成できる。
例えば、ＣＴＯ及びＨＯが段階（ｅ）で互いに最初に接触する場合（例えば、別途の反応容器で段階（ａ）−（ｄ）及び（ｅ）−（ｆ）実施）、本発明は、図２に示されたように実施できる。前記ＨＯは、前記ＰＴＯ断片の延長前に前記ＣＴＯと接触しないが、延長反応の結果物とのハイブリダイゼーションに関与（ｉｎｖｏｌｖｅ）する。メルティング分析段階において、前記延長デュープレックスの形成は、前記ＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制により、前記ＣＴＯ／ＨＯのハイブリッドの形成を防止する。
前記ＣＴＯとＨＯが段階（ｄ）で互いに接触する場合（例えば、１つの反応容器で段階（ａ）−（ｆ）実施）、本発明は、図３に示されたように実施できる。前記ＨＯは、延長前に前記ＣＴＯとハイブリダイズでき、延長反応に関与する。ＨＯが断片の延長前にＣＴＯとハイブリダイズされる場合、断片の延長は、ＣＴＯからＨＯを切断または分離させる。特に、ＨＯが延長反応中に切断される場合、延長デュープレックスの形成は、切断によるＨＯの消耗によりメルティング分析段階でＣＴＯ／ＨＯのハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）する。ＨＯが段階（ｄ）でＣＴＯとハイブリダイズされる場合、延長デュープレックスの形成は、ＣＴＯからＨＯを放出（分離）させることができる（ＨＯの鎖置換）。このような場合、分離されたＨＯは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションの抑制により、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析においてＣＴＯとハイブリッドを形成しない。
本発明の一具現例によると、ＰＴＯ断片の延長によるＨＯの切断及び／または鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、鋳型−依存的核酸重合酵素の種類または反応条件によって影響を受ける。
前記ＣＴＯとＨＯが段階（ｄ）で互いに接触する機会を有するとしても、種々のＨＯは、延長前に前記ＣＴＯとハイブリダイズされないことがある。このような場合、前記ＨＯは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）により、段階（ｅ）でＣＴＯとハイブリッドを形成することができない。
本発明の一具現例によると、段階（ｄ）で反応条件（例えば、反応温度及びＨＯ及びＰＴＯ断片のＴｍ値）を調節することにより、ＨＯは、延長前ＣＴＯとハイブリダイズされず、延長反応に関与しない。
前記ＨＯがＣＴＯと最初に接触する段階に関係なく、ターゲット核酸配列の存在下で、延長デュープレックスが形成されて、次の方式（ｉ）ＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）及び／または（ｉｉ）切断によるＨＯの消耗により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止する。
前記ターゲット核酸配列の非存在下で、前記延長デュープレックスは形成されないため、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成される。
本発明の一具現例によると、段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、ＨＯは、ＣＴＯとハイブリダイズ及び／またはＣＴＯと非ハイブリダイズされる。本発明の一具現例によると、前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、（ｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、前記ＨＯのハイブリダイゼーション以前に延長されて、及び／または（ｉｉ）前記断片の延長前に前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイズされた場合、前記断片の延長は、前記ＣＴＯから前記ＨＯを切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅ）させて、これによって、前記延長デュープレックスの形成は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）及び／または切断によるＨＯの消耗により、前記段階（ｅ）で前記ＨＯとＣＴＯ間のハイブリッドの形成を防止する。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯにハイブリダイズされた断片の延長のための条件によって、前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイゼーションされている場合が優勢であるか、前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイゼーションされていない場合が優勢である。
前記ＨＯがＣＴＯに相補的な配列を含んでいるとしても、前記延長デュープレックスのターゲット依存的形成は、前記ＨＯがＣＴＯとハイブリダイズすることを防止する。ＨＯが延長デュープレックスの形成前にＣＴＯとハイブリダイズされる時も、ＨＯは、前記ＣＴＯから離れて、放出されるかまたは除去される（例えば、ＨＯの切断または分離によって）。
前記ＨＯは、ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。前記ＨＯのヌクレオチド配列は、ＣＴＯの区域中、ＰＴＯ断片がハイブリダイズされる区域以外の区域に相補的な配列を含むようにデザインすることができる。
このような場合、ＨＯは、ＣＴＯと結合にＰＴＯ断片（または非切断ＰＴＯ）と競争しない。
本発明の一具現例によると、ＨＯは、ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む。
本発明の特定具現例において、ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、断片（または非切断ＰＴＯ）と競争するヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる（図６及び７参照）。本発明の特定具現例において、前記競争的ＨＯ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＨＯ）は、前記断片またはその延長産物により切断されないか、あるいは延長反応の間分離されない。例えば、ＨＯは、ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含むようにデザインすることができる。
本明細書においてＨＯの配列を言及しながら使用される用語‘ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズできるヌクレオチド配列’は、前記ＨＯがＣＴＯとハイブリダイズされる時、ＣＴＯのキャプチャリング部位と二本鎖を形成するＨＯの部位を示す。前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズできるＨＯのヌクレオチド配列は、ＨＯの全体配列または一部配列である。前記ＨＯにおいてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズできるヌクレオチド配列は、前記ＨＯの全体配列または一部配列（例えば、１０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）に該当する。
ＨＯがＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む場合、前記ＨＯは、ＰＴＯ断片及び／または非切断のＰＴＯの５’−タギング部位と重なる配列を有することができる。このような場合、（ｉ）ＨＯ及びＰＴＯ断片、または（ｉｉ）ＨＯ及び非切断ＰＴＯの５’−タギング部位は、ＣＴＯに対するハイブリダイゼーションを競争する。
本明細書で使用される用語‘競争的ＨＯ’は、ＣＴＯとハイブリダイゼーション面でＰＴＯ断片または非切断のＰＴＯと競争する配列を含むＨＯを示す。本発明の一具現例によると、競争的ＨＯは、ＣＴＯとハイブリダイゼーション面でＰＴＯ断片（具体的には、ＰＴＯ断片の延長鎖）より競争力が低く、非切断ＰＴＯの５’−タギング部位よりは競争力が高い。
ターゲット核酸配列が存在して競争的ＨＯが段階（ｃ）及び／または（ｄ）に存在する場合、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、競争的ＨＯ及びＰＴＯ断片間の競争は、問題になりえる。このような場合、競争的ＨＯよりＰＴＯ断片がＣＴＯとハイブリダイズされて、延長され、延長鎖を生産することが好ましい。ＣＴＯとハイブリダイズされたＰＴＯ断片は、延長されるため、ＰＴＯ断片は、競争的ＨＯよりＣＴＯとのハイブリダイゼーションにさらに有利である。
本発明の特定具現例において、段階（ｃ）は、前記ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーションより、前記ＰＴＯ断片とＣＴＯ間のハイブリダイゼーションがさらに有利な条件下で実施される。このような有利な条件は、多様な方法により到達できる。例えば、有利な条件のために、前記ＨＯの３’−末端はブロッキングされる。ブロッキングされた３’−末端を有するＨＯは、延長されず、前記ＰＴＯ断片との競争によるＣＴＯからの解離確立が増加する。前記ＣＴＯとハイブリダイズされたＰＴＯ断片は、延長されて、延長鎖を形成して、さらに安定的に維持できる。したがって、前記段階（ｃ）及び（ｄ）を経た反応結果物は、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドより延長デュープレックスが優勢的になる。結論的に、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの数（または量）は、ターゲット核酸配列が存在する場合には、延長デュープレックスにより、ターゲット核酸配列が非存在の場合と比較し、相対的に減少する。
前記ターゲット核酸配列が非存在の場合、前記ＰＴＯの切断は起こらず、非切断のＰＴＯとして残っている。前記非切断のＰＴＯ及び競争的ＨＯが両者存在する場合、非切断のＰＴＯの５’−タギング部位と競争的ＨＯは、互いに重なる配列を有するため、ＣＴＯに対するハイブリダイゼーションに競争する。前記ターゲット核酸配列が非存在の場合、本発明の原理は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを必要とするため、競争的ＨＯは、非切断ＰＴＯの５’−タギング部位よりＣＴＯとのハイブリダイゼーションにさらに有利でなければならない。
前記ＰＴＯ断片のＴｍ値が競争的ＨＯのＴｍ値より高い場合、ＰＴＯ断片が競争的ＨＯよりＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいてさらに有利である。前記非切断のＰＴＯの５’−タギング部位と競争的ＨＯ間の競争を考慮すると、ＰＴＯ断片の高いＴｍ値がいつも好ましいわけではない。ＰＴＯ断片のＴｍ値が競争的ＨＯのＴｍ値よりさらに低いときも、ＣＴＯとハイブリダイズされたＰＴＯ断片の延長により、競争的ＨＯよりＣＴＯとのハイブリダイゼーションにさらに有利であることがある。
前記記載の数多い要因または問題を考慮し、適した競争的ＨＯをデザインしなければならない。本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯ／ＨＯハイブリッド及び前記ＰＴＯ断片／ＣＴＯハイブリッドのＴｍ値間の差は、±４０℃、±３０℃、±２０℃、±１５℃、±１０℃、±５℃または±３℃以内である。
本発明の一具現例によると、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッド及び非切断のＰＴＯの５’−タギング部位／ＣＴＯハイブリッドのＴｍ値間の差は、±４０℃、±３０℃、±２０℃、±１５℃、±１０℃、±５℃または±３℃以内である。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯ及び前記非切断のＰＴＯがＣＴＯと競争的にハイブリダイズされる場合、前記ＣＴＯ／ＨＯのＴｍ値は、前記ＣＴＯ／非切断のＰＴＯのＴｍ値よりさらに高い（例えば、少なくとも２℃、４℃、６℃、８℃、１０℃、１５℃または２０℃）。
前記非切断のＰＴＯ／ＣＴＯハイブリッドのＴｍ値は、ＣＴＯとハイブリダイズされるＰＴＯ配列の部位によって決定される。例えば、前記非切断のＰＴＯの５’−タギング部位が前記ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、５’−タギング部位のＴｍ値は、非切断のＰＴＯ／ＣＴＯハイブリッドのＴｍ値に対する決定要因である。
本明細書で使用される用語‘非切断のＰＴＯのＴｍ値’は、特に言及しない限り、ＣＴＯとハイブリダイズされた非切断ＰＴＯ配列の部位により決定されたＴｍ値を意味する。
本発明の一具現例によると、断片の延長鎖は、ＨＯよりさらに高いＴｍ値を有して、ＨＯは、ＰＴＯの５’−タギング部位よりさらに高いＴｍ値を有する。
本発明の一具現例によると、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションを考慮すると、ＰＴＯ断片の延長鎖のＴｍ値は、前記ＨＯのＴｍ値よりさらに高く、ＨＯのＴｍ値は、前記非切断のＰＴＯのＴｍ値よりさらに高い。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯ及びＰＴＯ断片は、重なる部位外の他の部位を通じてＣＴＯとハイブリダイズされないようにデザインした。このような場合、前記ＨＯとＰＴＯ断片とがＣＴＯに同時にハイブリダイズすることを防止することができる。
Ｔｍ値は、ハイブリダイズされるヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量により決定される。本発明の一具現例によると、Ｔｍ値は、Ｗａｌｌａｃｅ ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ． Ｗａｌｌａｃｅら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ方法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ． Ｊｒ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：３５５５−３５６２（１９９６））； Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような従来の方法により計算できる。
本発明の一具現例によると、Ｔｍ値は、実際使用する反応条件下での実際Ｔｍ値を意味する。
メルティング分析またはハイブリダイゼーションを含むＰＣＥ−ＮＨにおいて、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルは、多様な標識システムにより提供できる：（ｉ）ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）ＨＯに連結された標識及びＣＴＯに連結された標識、及び（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド形成に関するシグナルが、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド非形成に関するシグナルと相異なっている限度内で、多様な種類の標識及び標識位置が本発明に使用される。原理上、本発明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析において適したシグナルの提供を必要とする。これと関連し、上述の表現は、例えば下記の意味を含む：前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合に提供されるシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯが互いに離れている場合に提供されるシグナルとが相異なっている限度内で、多様な種類の標識及び標識位置が本発明に使用される。本明細書で使用される表現‘ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成される場合のシグナルと、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが非形成される場合のシグナルとが相異なっている’とは、例えば、下記の意味を含む：‘前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合に提供されるシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯが互いに離れている場合に提供されるシグナルとが相異なっている’。前記上述するシグナリングのための標識は、下記の特徴を備えていなければならない：前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合に提供されるシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯが互いに離れている場合に提供されるシグナルとが相異なっている。
本発明の一具現例によると、前記シグナルの相異は、シグナル生成及びシグナル消滅のような現象により提供される。
本発明の一具現例によると、前記シグナルの相異は、強度の変化（シグナル増加及びシグナル減少）のような現象により提供される。
本発明に有用な標識は、例えば、単一標識、相互作用的二重標識及びインターカレーティング標識を始めとした当業界に知られた多数の標識を含む。
本発明で有用な標識は、相互作用的二重標識を含む（図２〜４及び６〜７参照）。
相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴにおいてエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非蛍光性である。相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性または電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。供与体分子及び受容体分子は、本発明においてそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子で説明できる。相互作用的二重標識は、接触媒介クエンチング（ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）に基づいて検出可能なシグナルを提供する標識対を含む（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００２ （３０） ｎｏ．２１ ｅ１２２ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＡＭ． ＣＨＥＭ． ＳＯＣ ２００２ （１２４） ｐｐ ６９５０−６９５６）。本発明において、相互作用的標識システムは、少なくとも２つの分子（例えば、染料）間の相互作用によるシグナル変化を含む、あらゆるケースを含む。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの存在または非存在を示すシグナルは、相互作用的標識システム、特にＦＲＥＴ標識システム（即ち、相互作用的二重システム）により生成される。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯまたは前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して；前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置する。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有する。
前記ＨＯが一本鎖状態である場合、ＨＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ターゲット核酸配列が非存在でＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成される場合、ＨＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔されて、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、これにより、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間にシグナル変化を引き起こし、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルを提供する（図２及び３参照）。ターゲット核酸配列が存在して、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成されない場合、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間にシグナル変化は発生せず、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルは提供されない（図２及び３参照）。
本明細書で使用される表現‘レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に近接した’は、ＨＯまたはＣＴＯの形態的構造、例えば、ランダムコイル（ｃｏｉｌ）及びヘアピン構造により、レポーター分子及びクエンチャー分子が３次元的に互いに隣接するようになることを意味する。
本明細書で使用される表現‘レポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔されて’は、二本鎖の形成によるＣＴＯまたはＨＯの形態的構造の変化により、レポーター分子及びクエンチャー分子が３次元的に離隔されることを意味する。
本発明の一具現例によると、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、ＨＯは、ＣＴＯの標識−連結区域に相補的な配列を含む。ＣＴＯが一本鎖形態である場合、ＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ターゲット核酸配列が非存在でＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成される場合、ＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔されて、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングして、これにより、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間にシグナル変化を引き起こし、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルを提供する。ターゲット核酸配列が存在して、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成されない場合、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間にシグナル変化は発生せず、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルは提供されない。
本発明で相互作用的二重標識を有するＣＴＯを使用する場合、ＣＴＯ／延長鎖の延長デュープレックスは、メルティング分析でシグナルを提供することができる。前記延長デュープレックスのＴｍ値は、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドのＴｍ値とは相異なっているため、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドからのシグナルは、延長デュープレックスからのシグナルと区別される。ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドからのシグナルを利用する本発明は、延長デュープレックスからのシグナルを利用する発明とは明らかに異なっていることが分かる。
本発明の一具現例によると、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドのメルティングまたはＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションに依存的にレポーター分子からのシグナルがクエンチングされるかあるいはアンクエンチングされる限度内で、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＨＯまたはＣＴＯのどんな位置にも位置できる。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の１つは、その５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の１つは、ＨＯの形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング及びアンクエンチングする位置に位置する。本発明の一具現例によると、前記ＨＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の１つは、その３’−末端またはその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の１つは、ＨＯの形態によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング及びアンクエンチングする位置に位置する。本発明の特定具現例において、レポーター分子及びクエンチャー分子は、それぞれＨＯの両末端に位置する。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の１つは、その５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の１つは、ＣＴＯの形態によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング及びアンクエンチングする位置に位置する。本発明の一具現例によると、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子の１つは、その３’−末端またはその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、他の１つは、ＣＴＯの形態によって、レポーター分子からのシグナルをクエンチング及びアンクエンチングする位置に位置する。
本発明に有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、本明細書に詳述した蛍光標識を含むことができる。
適したレポーター−クエンチャー対は、多くの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ ら， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｗｈｉｔｅら， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０）； Ｂｅｒｌｍａｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．， １９９６）； 米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
本発明において、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子（またはブラッククエンチャー分子）が利用できるということは、注目すべきことである。非蛍光ブラッククエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。レポーター及びクエンチャーで構成されたシグナリングシステムにおいて、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）は、レポーターとして利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。
本発明の一具現例によると、クエンチャー分子が蛍光である場合、シグナル検出は、クエンチャー分子からのシグナル変化、またはクエンチャー分子及びレポーター分子からのシグナル変化を測定して実施される。
本発明は、鎖間−相互作用的二重標識システムが使用できる（図４参照）。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の１つを有して、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置する。
鎖間−相互作用的二重標識は、ＣＴＯに連結された標識（例えば、供与体分子）及びＨＯに連結された標識（受容体分子）間の相互作用を利用する。
前記ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、ＣＴＯは、他の１つの相互作用的二重標識を有する。前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションは、鎖間−相互作用的二重標識からのシグナルを変化させて、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルを提供する（図４参照）。本発明の特定具現例において、ＣＴＯに標識はテンプレーティング部位に連結される。
本発明の一具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、それぞれＨＯの３’−末端及びＣＴＯの５’−末端に連結される。
本発明の特定具現例において、本発明の方法は、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＨＯをさらに１つ使用して実施されて、前記２つのＨＯは、前記ＣＴＯに互いに近接してハイブリダイズされて、前記ＨＯの１つは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＨＯの他の１つは、前記相互作用的二重標識の他の１つを有し、前記ＣＴＯと２つのＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯと２つのＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置する。
前記２つのＨＯがＣＴＯとハイブリダイズされない場合、前記２つのＨＯは、互いに離れて存在し、クエンチャー分子からレポーター分子が離れて、これにより、レポーター分子からのシグナルをクエンチングしない。２つのＨＯがＣＴＯに互いに近接してハイブリダイズされる場合、ハイブリダイゼーションは、クエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルにクエンチングを可能にして、これにより、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間シグナル変化を引き起こし、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルを提供する。ターゲット核酸配列が存在して、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成されない場合、シグナル変化はメルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間に起こらず、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルは、発生しない。
単一標識を使用する場合、前記ＨＯまたはＣＴＯのいずれかに連結できる（図５参照）。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯまたは前記ＣＴＯは、単一標識を有して、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記単一標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記単一標識からのシグナルとが異なる位置に前記単一標識が位置する。
前記単一標識は、二本鎖上に存在するかあるいは一本鎖上に存在するかによって相異なるシグナルを提供することができなければならない。単一標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。好ましくは、単一標識は、蛍光標識を含む。
本発明の特定具現例において、前記単一標識は、単一標識を有した核酸配列が一本鎖にあるか二本鎖にあるかによって強度の相異なるシグナルを生成することができる蛍光標識を含む。
図５は、単一標識を利用して本発明を説明する。図５において、前記ＨＯは、単一標識を有する。ＨＯがメルティング分析の間ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、ＨＯに単一標識からのシグナルは変化される。対照的に、ＨＯがＣＴＯとハイブリダイズされない場合、ＨＯに単一標識からのシグナルは変化されない。
本発明の一具現例において、前記ＣＴＯが単一標識を有する場合、ＨＯは、ＣＴＯの標識連結区域に相補的な配列を含む。前記ＨＯがメルティング分析の間ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、ＣＴＯの単一標識からのシグナルが変化される。対照的に、前記ＨＯがＣＴＯとハイブリダイズされない場合、前記ＣＴＯの単一標識からのシグナルは、変化されない。このような場合、前記ＣＴＯ／延長鎖の延長デュープレックスは、メルティング分析でシグナルを提供することができる。前記延長デュープレックスのＴｍ値は、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドのＴｍ値とは相異なっているため、前記ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドからのシグナルは、延長デュープレックスからのシグナルと区別して検出できる。ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドからのシグナルを利用する本発明は、延長デュープレックスからのシグナルを利用する発明とは明らかに異なっていることが分かる。
本発明の具現例において、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、単一標識を有して、前記ＨＯは、ＣＴＯの標識連結区域に相補的な配列を含む。
蛍光標識の種類及び標識位置は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されている。
本発明で有用な前記蛍光標識は、当業界に知られたあらゆる分子を含むことができる。その例は、下記のようである： Ｃｙ２ＴＭ（５０６）， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１ （５０９）， ＹＯＹＯＴＭ−１ （５０９）， Ｃａｌｃｅｉｎ （５１７）， ＦＩＴＣ （５１８）， ＦｌｕｏｒＸＴＭ （５１９）， ＡｌｅｘａＴＭ （５２０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０ （５２０）， Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００ （５２２）， Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８ （５２４）， ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ （５２５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ （５２７）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３ （５２９）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ （５３３）， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１ （５３３）， ＴＯＴＯ１ （５３３）， ＪＯＥ （５４８）， ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ （５５０）， Ｄｉｌ （５６５）， ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０ （５７０）， Ｃｙ３ＴＭ （５７０）， ＡｌｅｘａＴＭ ５４６ （５７０）， ＴＲＩＴＣ （５７２）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ （５７５）， Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ （５７５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ （５７５）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）， Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ （５８０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （５８０）， ＴＡＭＲＡ （５８２）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ （５９０）， Ｃｙ３．５ＴＭ （５９６）， ＲＯＸ （６０８）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ （６１５）， ＡｌｅｘａＴＭ ５９４ （６１５）， Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）， Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ （６２８）， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３ （６３１）， ＹＯＹＯＴＭ−３ （６３１）， Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４２）， Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４８）， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３ （６６０）， ＴＯＴＯ３ （６６０）， ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５） （６６５）， Ｃｙ５ＴＭ （６７０）， Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ （６７１）， Ｃｙ５．５ （６９４）， ＨＥＸ （５５６）， ＴＥＴ （５３６）， Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ （４４７）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０ （５４４）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０ （５５９）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０ （５９１）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０ （６１０）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５ （６３７）， ＦＡＭ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３ （５２０）， Ｐｕｌｓａｒ ６５０ （５６６）， Ｑｕａｓａｒ ５７０ （６６７）， Ｑｕａｓａｒ ６７０ （７０５）及びＱｕａｓａｒ ７０５ （６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
例えば、前記蛍光標識は、ＪＯＥ， ＦＡＭ， ＴＡＭＲＡ， ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。
標識は、従来の方法により、ＨＯまたはＣＴＯのいずれかと連結される。例えば、標識は、炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−炭素スペーサー、６−炭素スペーサー、１２−炭素スペーサー）を通じてＨＯまたはＣＴＯに連結され得る。
本発明は、前記ＨＯとＣＴＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供するにインターカレーティング標識を利用することができる。本発明で有用なインターカレーティング標識の例は、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ， ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＳＹＴＯＴＭ４３， ＳＹＴＯＴＭ４４， ＳＹＴＯＴＭ４５， ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ， ＰＯＰＯＴＭ−１， ＰＯＰＯＴＭ−３， ＢＯＢＯＴＭ−１， ＢＯＢＯＴＭ−３， ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＳＹＴＯＴＭ１１， ＳＹＴＯＴＭ１３， ＳＹＴＯＴＭ１５， ＳＹＴＯＴＭ１６， ＳＹＴＯＴＭ２０， ＳＹＴＯＴＭ２３， ＴＯＴＯＴＭ−３， ＹＯＹＯＴＭ３， ＧｅｌＳｔａｒＴＭ及びｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅを含む。インターカレーティング染料は、二本鎖核酸分子内に特異的に入り込んでシグナルを発生させる。
本発明で前記インターカレーティング染料を使用する場合、前記ＣＴＯ／延長鎖の延長デュープレックスは、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析でシグナルを提供することができる。前記延長デュープレックスのＴｍ値が、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドのＴｍ値と相異なっているため、前記ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドからのシグナルは、延長デュープレックスからのシグナルと区別して検出できる。ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドからのシグナルを利用する本発明は、延長デュープレックスからのシグナルを利用する発明とは明らかに異なっていることが分かる。
本発明で使用される前記ＨＯは、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の間にハイブリダイゼーションによってシグナルを発生させることができる限度内で、如何なるプローブも含むことができて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎＴＭ （ＵＳ ５，９２５，５１７）， ＨｙｂｅａｃｏｎｓＴＭ （Ｄ． Ｊ． Ｆｒｅｎｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （２００１） １３， ３６３−３７４ ａｎｄ ＵＳ ７，３４８，１４１）， Ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ， ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｐｒｏｂｅ （ＵＳ ５，８７６，９３０）， ＬＵＸＴＭ （Ｉ． Ａ． Ｎａｚａｒｅｎｋｏ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２， ３０：２０８９−２０９５． ａｎｄ ＵＳ ｐａｔ ｎｏ． ７，５３７，８８６， Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ （Ｂｅｒｎａｒｄ ＰＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００， ４６， １４７−１４８ ａｎｄ Ｄｅｅｐｔｉ Ｐａｒａｓｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １２４， ｒｅｖｉｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００６ ３８５−３９８）を含む。
段階（ｅ）でメルティングまたはハイブリダイゼーション分析は、当業界に知られた多様な方法によって行える。
本明細書で使用される用語‘メルティング分析’は、デュープレックスのメルティングによって、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルを得る方法を意味し、２つの相異なる温度でシグナルを測定する方法、メルティングカーブ分析、メルティングパターン分析、及びメルティングピーク分析を含む。
本明細書で使用される用語‘ハイブリダイゼーション分析’（または、‘アニーリング分析’）は、デュープレックスが形成する間ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すターゲットシグナルを得る方法を意味し、２つの相異なる温度でシグナルを測定する方法、ハイブリダイゼーションカーブ分析、ハイブリダイゼーションパターン分析、及びハイブリダイゼーションピーク分析を含む。
一般に、ターゲットシグナルがメルティング分析により生成される場合、ターゲットシグナルは、ハイブリダイゼーション分析によっても得られて；及び反対の場合も同様である。本明細書で特に言及しない限り、用語‘メルティング分析’は、ハイブリダイゼーション分析を包括する意味を有する。
メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、従来の技術、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら， Ｇｅｎｅ １８８： ４５（１９９７））； Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １９：３４３（２００２）； Ｌｉｖｅｈｉｔｓら， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍ． １１：７８３（１９９４）； 及びＨｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８７（１９９９）で説明するように得ることができる。例えば、メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、ハイブリダイゼーション厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメーターに対するアウトプットシグナル（ｏｕｔｐｕｔ ｓｉｇｎａｌ）変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）またはディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成できる。アウトプットシグナルは、ハイブリダイゼーションパラメーターに対して直接的にプロッティングをすることができる。典型的に、メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、例えば、Ｙ−軸にはデュープレックス構造の程度（即ち、ハイブリダイゼーション程度）を示す蛍光が、Ｘ−軸にはハイブリダイゼーションパラメーターがプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）されたアウトプットシグナルを有する。
段階（ｆ）：ＣＨＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルの検出
メルティングまたはハイブリダイゼーション分析において、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルが検出される。ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、ターゲット核酸配列の非存在を示し、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の特定具現例において、前記メルティング分析は、定量分析のために少なくとも２回実施される。メルティング分析で得られたメルティングピークの面積または高さは、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドにより影響を受けて、ターゲット核酸配列の初期量に対する情報を提供する。Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ値以上のメルティングピーク面積または高さが到達されるメルティング分析のサイクル数を測定することにより、ターゲット核酸配列の量を決定することができる。
例えば、本発明は、（ｉ）反復サイクル中に変性過程を含む段階（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階（ｉｉ）；ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドに対するメルティング分析を実施する段階；及び（ｉｉｉ）段階（ｉ）及び段階（ｉｉ）を少なくとも２回繰り返す段階によって行うことができる。テータは、少なくとも二点の指定された反復間隔（Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）から得られる。次いで、メルティング分析結果（例えば、メルティングピーク面積または高さ）は、メルティング分析の各サイクル数（または累積サイクル数）に対してプロッティングされて比較され、これにより、ターゲット核酸配列の量を定量化する。段階（ａ）−（ｄ）の段階の反復数は、選択的に調節できる。
択一的に、メルティング分析結果（例えば、メルティング分析面積または高さ）は、メルティング分析の各サイクル数（または累積サイクル数）に対してプロッティングされて比較され、これにより、ターゲット核酸配列の量を定量化する。
本発明の一具現例によると、ターゲット配列が存在する場合のシグナルは、ターゲット配列が非存在の場合のシグナルと相異なっている。ターゲット配列がメルティング分析またはハイブリダイゼーション分析により検出される場合、このようなシグナルの相異は、メルティングピークの高さまたは相異を含む。本発明の一具現例において、このようなシグナルの相異は、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％である。
本発明の一具現例によると、前記方法は、ターゲット核酸配列がないか、あるいは指定の含量（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｍｏｕｎｔ）のターゲット核酸配列を含む対照群を使用して行われる。本発明は、対照群と共に関心のある核酸試料に対して実施されて、結果を比較し、核酸試料内にターゲット核酸配列の存在または量に対してより正確な検出を可能にする。
本発明は、液相または固相のいずれかにおいて実施できる。
固相におけるターゲット検出
本発明の一具現例によると、本発明は、固相で実施されて、前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、固相基質上に固定化されるか、または前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、前記シグナルは、前記固相基質上で検出される。
前記ＣＴＯまたはＨＯの固定化は、２つの方式で行うことができる。
第１の方式は、前記ＣＴＯまたはＨＯの１つを固相基質上に予め固定化して、段階（ｃ）−（ｆ）に関与させる。第２の方式は、前記ＣＴＯまたはＨＯの１つを段階（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）で非固定化された形態で関与させた後、固相基質上に固定化する。
本発明の一具現例によると、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイにおいて、前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、段階（ｄ）及び段階（ｅ）の間に固相基質上に固定化される。
前記固相反応に対する標識システムは、上述の標識システムと同一でありえる。さらに、固相反応に対する単一標識は、上述よりさらに多様に使用される。固相反応において、前記単一標識は、単一標識を有した核酸配列が一本鎖にあるか二本鎖にあるかによって強度の相異なるシグナルを生成する能力を有する必要がない。
単一標識は、化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）、放射性同位元素標識（例えば、Ｃ１４及びＩ１２５）、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及び金属標識（例えば、金）を含むが、これらに限定されない。
固相反応のために、前記ＣＴＯまたはＨＯの固定化は、その５’−末端または３’−末端（特に、３’−末端）を通じて固相基質の表面に直接的または間接的に（特に、間接的）固定化される。また、ＣＴＯまたはＨＯは、共有または非共有結合方式で固相基質表面上に固定化できる。固定化されたＣＴＯまたはＨＯが固相基質表面に間接的に固定化される場合、適したリンカーを利用する。本発明で有用なリンカーは、固相基質表面上のプローブ固定化に利用されるリンカーならどんなものでもよい。例えば、アミン基を有するアルキルまたはアリール化合物、またはチオール基を有するアルキルまたはアリール化合物が固定化のためのリンカーとして利用できる。また、ポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルはリンカーとして利用され、酵素作用（例えば、酵素的切断反応）に抑制因子の空間的妨害（Ｓｐａｃｅ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を減少させて、ハイブリダイゼーション効率を増加させる。リンカーとしてポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルは、プローブの配列と見なさない。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯまたはＨＯは、結合パートナー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）間に相互作用を通じて固相基質上に固定化できる。例えば、結合パートナー（ビオチン及びストレプトアビジン）の１つを有したＣＴＯまたはＨＯは、他の結合パートナーで表面が変形された固相基質上に固定化できる。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯまたはＨＯは、固定化のためのヌクレオチド配列により固相基質上に固定化できる。例えば、固定化のためのヌクレオチド配列で表面が変形された固相基質は、ＣＴＯまたは固定化のためのヌクレオチド配列に相補的な追加配列を有するＨＯを固定化するために使用できる。
本発明の一具現例によると、本発明で利用される固相基質は、マイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に知られた如何なるものでもよい。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、延長、メルティング及び蛍光検出は、マイクロアレイ上で実施される。マイクロアレイ上に固定化されたＣＴＯまたはＨＯは、ハイブリダイズできるアレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質（Ｓｏｌｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。固相基質は、ｄｉｐｓｔｉｃｋ、プレート、粒子（例えば、ビーズ）、親和性カラム及びメンブレインの形態でありえる。本発明の複数の固定化されたＣＴＯまたはＨＯは、固相基質上の１つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）区域または複数のアドレサブル区域に固定化されて、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル区域を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクジェッティング、機械的マイクロスポッティング及びその類似方法のような従来製作技術により、アレイまたは特定応用のためのアレイを生産するために、固定化されたＣＴＯまたはＨＯが製作（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）される。
固相で実施する本発明は、前記オリゴヌクレオチド上に標識は、物理的に離隔されているため、一種類の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。このような点で、本発明により固相で検出されるターゲット核酸配列の数は制限されない。
共焦点検出装置に使用して、液相内に懸濁された標識の影響無しに、前記固相基質上にシグナルのみを検出することができる。
本発明の一具現例によると、前記方法は、前記アップストリームオリゴヌクレオチドを使用せずに行われて、段階（ｂ）において、前記ＰＴＯの切断は、アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖の助け無しに発生する。アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性を使用する具現例は、下記のようにより詳細に説明される：
アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性に基づいたＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出
本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）前記ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
（ｅ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）の条件下で、一定温度範囲にかけて前記段階（ｄ）の結果物に対するメルティング分析またはハイブリダイゼーション分析を実施する段階（前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供し、前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって前記シグナルが提供されず、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）により提供される）と、
（ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するための方法を提供する。
前記アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性をベースとする本発明の方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用しないことを除いては、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用する前記ＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態と同一であるため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
興味深いことに、前記アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性をベースとする本発明の方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用しないＰＣＥ−ＮＨアッセイによってもターゲットシグナルを提供する。
本発明の方法は、前記アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する従来の酵素を使用することができる。５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素の中には、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のようないろいろな酵素がある。
前記ターゲット核酸配列の増幅及びＰＴＯの切断効率を考慮する時、本発明のＰＣＥ−ＮＨアッセイは、好ましくはアップストリームオリゴヌクレオチドを使用して実施される。
ターゲット検出のためのキット
本発明のまた他の様態によると、本発明は、
（ａ）アップストリームオリゴヌクレオチド（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む）と、
（ｂ）ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されない）と、
（ｄ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）（前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスが形成され、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）して、これにより、シグナルが提供されず、前記キットは、（ｉ）ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）ＨＯに連結された標識及びＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）を追加的に含む）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するキットを提供する。
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施するように構成されているため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
本発明の一具現例において、キットは、追加的に５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む。本発明の一具現例において、キットは、鋳型−依存的核酸重合酵素をさらに含む。
本発明のキットの他の具現例は、上述の本発明の方法を参照して説明できる。
本明細書で詳述した本発明のキットは、バッファ、ＤＮＡ重合酵素助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファ及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含むことができる。また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必須的な試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上述の構成成分を含む別途の包装またはコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で製作される。
ＩＩ． ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出方法の第２様態
本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
（ｅ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、前記段階（ｄ）の結果物とをハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識されて、標識されていない他の１つは、固相基質上に固定化されるか、あるいは前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯ及びＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより固相基質上で前記単一標識からのシグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって固相基質上で前記単一標識からのシグナルが提供されない）と、
（ｆ）前記固相基質上の前記シグナルを検出して、前記固相基質上で前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するための方法を提供する。
本発明の第２様態は、本発明の第１様態の接近法であるＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的非ハイブリダイゼーション）をベースとする。本発明の第２様態は、前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識し、標識していない他の１つは、固相基質上に固定化するか、または段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、シグナルは、指定された（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度で検出できることを特徴とする。
本発明の第２様態は、固相基質及び単一標識を利用してターゲット検出を効果的に達成するための、ＰＣＥ−ＮＨ接近法の変形されたバージョンであって、ＣＴＯ及びＨＯ、この２つのオリゴヌクレオチド組み合わせの使用によって、ターゲット核酸配列が非存在の場合に前記単一標識からのシグナルが固相基質上で生成されて、ターゲット核酸配列が存在する場合に前記単一標識からのシグナルが固相基質上で消滅されるか減少される。ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識して、標識していない他の１つは、固体基質に固定化されるか、または段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、標識からのシグナルは、ＣＴＯ及びＨＯ間のハイブリダイゼーションのための適した温度で検出される。
本発明の第２様態も第１様態と同様に、ＨＯが切断された時だけではなく、ＨＯが切断されていない時も（即ち、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーションが延長デュープレックスの形成により抑制される）、ターゲット核酸配列検出に適用できる。
固相においてＰＣＥ−ＮＨの第２様態は、以下、より詳細に説明される。
段階（ａ）：ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯのハイブリダイゼーション
前記段階（ａ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ａ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｂ）：ＰＴＯ切断から断片の放出
前記段階（ｂ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ｂ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯのハイブリダイゼーション
前記段階（ｃ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ｃ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｄ）：断片の延長
前記段階（ｄ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ｄ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｅ）：延長デュープレックスとＨＯハイブリダイゼーション
延長反応に続いて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記段階（ｄ）の結果物は、ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＨＯ（ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）とハイブリダイズされる。ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識されて、標識されていない他の１つは、固相基質上に固定化されるか、あるいは段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化される。
本発明の第２様態は、単一標識オリゴヌクレオチドは、固相基質上に固定化せず、ただ固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる時、固相基質上でシグナルを提供することを特徴とする。
前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記固相基質上で前記単一標識からシグナルが提供される。ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在する場合、延長デュープレックスが形成されて、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止し、これによって固相基質上で単一標識からのシグナルが提供されない。本発明の一具現例によると、洗浄段階は、段階（ｄ）の結果物とＨＯのハイブリダイゼーションのための段階（ｅ）及びシグナルの検出のための段階（ｆ）の間で実施される。本発明の一具現例によると、洗浄前、ＣＴＯまたはＨＯの１つを基質上に固定化することが必要である。
択一的に、洗浄段階が必要ではない。固相で共焦点検出装置を使用し、反応溶液に存在する標識からのシグナルの影響無しに、固相基質上に存在するシグナルを検出することができる。
前記ＨＯの詳細な説明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態のＨＯに対する説明を参照として説明できる。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯは、単一標識を有して、前記ＨＯは、固相基質上に固定化されるか、あるいは段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化される（例えば、図８〜９及び１２）。択一的に、ＨＯは、単一標識を有して、ＣＴＯは、固相基質上に固定化されるか、あるいは段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化される（例えば、図１０〜１１及び１３）。
本発明の一具現例によると、単一標識は、どんな標識でもよい。
単一標識は、化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）、放射性同位元素標識（例えば、Ｃ１４及びＩ１２５）、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及び金属標識（例えば、金）を含むが、これらに限定されない。
本発明の方法において、前記ＨＯまたは前記ＣＴＯは、単一標識を有して、前記単一標識は、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドを形成する場合の前記単一標識からのシグナルと、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドを非形成する場合の前記単一標識からのシグナルとが異なる位置に位置する。
図８は、単一標識を有するＣＴＯと固定化されたＨＯを使用する本発明の第２様態を図式的に示す。前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止し、これによって固相基質上でＣＴＯの単一標識からのシグナルが提供されない。前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に非存在の場合、前記延長デュープレックスが形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより固相でＣＴＯの単一標識からのシグナルが提供される。
延長デュープレックスによるＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド形成の防止に関する詳細な説明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態のハイブリッド形成の防止に対する説明を参照して説明できる。
例えば、前記ＣＴＯ及びＨＯが前記段階（ｅ）で互いに初めて接触した場合（例えば、別途の反応容器で段階（ａ）−（ｄ）及び（ｅ）−（ｆ）実施）、本発明は、図８及び１０に示されたように実施できる。前記ＨＯは、前記ＰＴＯ断片の延長前、前記ＣＴＯと接触しないが、延長反応の結果物とハイブリダイゼーションに関与する。段階（ｅ）において、延長デュープレックスの形成は、ＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制によりＣＴＯ／ＨＯのハイブリッドの形成を防止する。
前記ＣＴＯ及びＨＯが前記段階（ｄ）で互いに接触された場合（例えば、１つの反応容器で段階（ａ）−（ｆ）実施）、本発明は、図９及び１１に示されたように実施できる。前記ＨＯは、延長前、ＣＴＯとハイブリダイズでき、延長反応に関与する。ＨＯが断片の延長前、ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、断片の延長は、ＣＴＯからＨＯを切断または分離させる。特に、ＨＯが延長反応の間に切断される場合、延長デュープレックスの形成は、切断によるＨＯの消耗により、段階（ｅ）でＣＴＯ／ＨＯのハイブリッドの形成を防止する。
前記ＣＴＯとＨＯが段階（ｄ）で互いに接触する機会を有するとしても、ＨＯの一部は、延長前にＣＴＯとハイブリダイズされないことがある。このような場合、ＨＯは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーション抑制により、段階（ｅ）でＣＴＯとハイブリッドを形成することができない。
前記ＨＯがＣＴＯと最初に接触する段階に関係なく、ターゲット核酸配列が存在する場合に延長デュープレックスは形成されて、次の方式（ｉ）ＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制及び／または（ｉｉ）切断によるＨＯの消耗により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止する。
ターゲット核酸配列の非存在下で、延長デュープレックスは形成されないため、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドは形成される。
本発明の一具現例によると、前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、前記ＨＯは、ＣＴＯとハイブリダイズされて及び／またはＣＴＯとハイブリダイズされない。本発明の一具現例によると、前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、（ｉ）ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、ＨＯのハイブリダイゼーション以前に延長されて、及び／または（ｉｉ）前記断片の延長前に前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、前記断片の延長は、前記ＣＴＯから前記ＨＯを切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅ）させて、これによって、延長デュープレックスの形成は、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーション抑制及び／または切断によるＨＯの消耗により、段階（ｆ）でＨＯとＣＴＯ間のハイブリッドの形成を防止する。
前記ＨＯは、ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。前記ＨＯのヌクレオチド配列は、ＣＴＯの区域中、ＰＴＯ断片がハイブリダイズされる区域以外の区域に相補的な配列を含むようにデザインすることができる。本発明の特定具現例において、前記ＨＯは、ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、断片（または非切断ＰＴＯ）と競争するヌクレオチド配列が含まれるようにデザインすることができる（図１２及び１３参照）。具体的に、前記競争的ＨＯは、前記断片またはその延長産物により切断されない。
前記競争的ＨＯに対する詳細な説明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態のＨＯに対する説明を参照として説明できる。
本発明の一具現例によると、前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、前記段階（ｄ）及び段階（ｅ）の間または段階（ｅ）及び段階（ｆ）の間に固相基質上に固定化される。
段階（ｆ）：ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルの検出
最終的に、固相基質上のＣＴＯとＨＯ間のハイブリッド検出のために、固相基質上でシグナルを検出する。ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、ターゲット核酸配列の非存在を示し、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット配列が存在する場合のシグナルは、ターゲット配列が非存在の場合のシグナルと相異なっている。前記ターゲット配列が本発明の方法により検出される場合、前記シグナルの相異は、シグナルの強度の差を含む。本発明の一具現例によると、前記シグナルの差は、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％である。
本発明は、前記ＣＴＯ及びＨＯの１つが単一標識で標識して、標識されていない他の１つは、固体基質上に固定化されるか、または前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化される。ターゲット核酸配列が非存在の場合、前記単一標識からのシグナルは、固相基質上で生成されて、ターゲット核酸配列が存在する場合、前記単一標識からのシグナルは、固相基質上で消滅されるか減少される本発明の接近法は、このような２つのオリゴヌクレオチド組み合わせにより実現可能になる。
本発明の一具現例によると、前記固相基質上でシグナルの検出は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが二本鎖形態を維持する指定温度で、固相基質上でシグナルを測定することにより実施される。
前記段階（ｆ）の検出は、実時間方式、エンド−ポイント方式または指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）方式で実施することができる。本発明が段階（ａ）−（ｆ）の全部または一部を、変性を含んで繰り返す段階を追加的に含む場合、指定温度における前記反復の各サイクルにおいて（即ち、実時間方式）、指定温度における前記反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）または指定温度における前記反復の間、指定時間間隔のそれぞれでシグナル検出が実施される。
本発明の一具現例によると、固相基質上でシグナルの検出は、一定温度範囲にかけてメルティングまたはハイブリダイゼーション分析により実施される。前記メルティングまたはハイブリダイゼーション分析の詳細な説明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態にメルティングまたはハイブリダイゼーション分析に対する説明を参照して説明できる。
前記シグナル検出は、ベンチトップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）蛍光メーター機、蛍光マルチ−ウェルプレートレーダー機、光繊維蛍光メーター機、蛍光顕微鏡及びマイクロチップ／蛍光検出と結合されたマイクロ流体システムのような従来の方法によって実施できる。
本発明の一具現例によると、前記方法は、前記アップストリームオリゴヌクレオチドを使用せずに行われて、前記段階（ｂ）において、ＰＴＯの切断は、アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖の助け無しに発生する。アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性を使用する本発明の具現例は、以下、より詳細に説明される：
アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性に基いたＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出
本発明の他の様態において、本発明は、
（ａ）前記ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
（ｅ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、前記段階（ｄ）の結果物とをハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識されて、標識されていない他の１つは、固相基質上に固定化されるか、あるいは前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯ及びＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより固相基質上で前記単一標識からのシグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって固相基質上で前記単一標識からのシグナルが提供されない）と、
（ｆ）前記固相基質上の前記シグナルを検出して、前記固相基質上で前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するための方法を提供する。
アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性をベースとする本発明の方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用しないことを除いては、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用する前記ＰＣＥ−ＮＨアッセイの第２様態と同一であるため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
本発明の方法のために、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する従来の酵素を使用することができる。５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素のうち、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のようないろいろな酵素がある。
ターゲット検出のためのキット
本発明の他の様態において、本発明は、
（ａ）アップストリームオリゴヌクレオチド（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む）と、
（ｂ）ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されない）と、
（ｄ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）（前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識されて、標識されていない他の１つは、固相基質上に固定化されるか、あるいは前記単一標識からのシグナル検出前に固相基質に固定化されて、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって固相基質上で前記単一標識からのシグナルを提供せず、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより固相基質上で前記単一標識からのシグナルを提供する）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するキットを提供する。
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施するように構成されているため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
ＩＩＩ． ＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出方法の第３様態
本発明の他の様態において、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
（ｅ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、前記段階（ｄ）の結果物とをハイブリダイズさせる段階（前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これによって、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示す第１シグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスは、前記ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制し、これによって、前記ＣＴＯと非ハイブリダイズされたＨＯの存在を示す第２シグナルが提供されて、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識によって提供される）と、
（ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが二本鎖形態を維持する指定温度下で前記第１シグナルまたは前記第２シグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示して、前記第１シグナルと第２シグナルとの差は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在または非存在を決定できるようにして、前記核酸試料内の前記ターゲット核酸配列の存在または非存在を示す）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するための方法を提供する。
本発明の第３様態は、本発明の第１様態としてのＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション）接近法をベースとする。しかし、本発明の第３様態は、ターゲット核酸配列存在下で延長デュープレックスがＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制し、シグナルが指定温度で検出される現象に重点をおいていることを特徴とする。
本発明者らは、前記延長デュープレックスの形成がＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションの抑制を誘導し、前記ＨＯが切断されない場合も、前記ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが非形成されて、これをターゲット核酸配列の検出に成功的に適用することができることを確認した。前記原理と共に、本発明は、前記ＨＯが切断されず、一本鎖形態を維持する場合のシグナルと、前記ＨＯがＣＴＯ／ＨＯハイブリッドを形成する場合のシグナルとが相異でなければならない。
本発明は、前記ＰＴＯ断片の延長において、前記ＨＯの切断が必須的に要求されないため、ＰＴＯ断片の延長（即ち、段階（ａ）−（ｄ））、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーション及び検出（即ち、段階（ｅ）−（ｆ））は、別途に実施できる。相互作用的二重標識を有するＨＯを使用して、ターゲット核酸配列が存在する場合、ＨＯの切断からのシグナルは、ＣＴＯと完全なＨＯハイブリダイゼーションの抑制からのシグナルとは区別される相異なるプロファイルを示す。
本明細書で延長デュープレックスを言及しながら使用される用語‘ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）’は、延長デュープレックス内に延長鎖がＣＴＯと非切断のＨＯ（Ｕｎｃｌｅａｖｅｄ ＨＯ）または完全なＨＯ（Ｉｎｔａｃｔ ＨＯ）との結合（またはアニーリング）を抑制することを意味する。用語‘ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）’は、用語‘ＣＴＯとＨＯ間にハイブリッドの形成防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）’の制限された具現例と見なされる。
したがって、本発明の第３様態は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーション抑制の発生を必須的に要求する。下記詳述するように、前記要件は、延長鎖によるＨＯの切断または分離によるＣＴＯとＨＯ間にハイブリッドの形成防止の発生を排除しない。
ＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態は、以下のようにより詳細に説明される：
段階（ａ）：ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯのハイブリダイゼーション
前記段階（ａ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ａ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｂ）：ＰＴＯ切断から断片の放出
前記段階（ｂ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ｂ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯのハイブリダイゼーション
前記段階（ｃ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ｃ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｄ）：断片の延長
前記段階（ｄ）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の段階（ｄ）に対する説明を参照として説明できる。
段階（ｅ）：延長デュープレックスとＨＯハイブリダイゼーション
延長反応に続いて、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションのために適する条件下で、前記段階（ｄ）の結果物は、ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＨＯ（ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）とハイブリダイズされる。
前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これによりＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示す第１シグナルを提供する。前記ターゲット核酸配列が核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制して、これにより、ＣＴＯと非ハイブリダイズされたＨＯの存在を示す第２シグナルを提供する。
前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションは、前記段階（ｅ）で最初に発生し得る。択一的に、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションは、段階（ｄ）で最初に発生し得る。本発明の特定具現例において、前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、（ｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、前記ＨＯのハイブリダイゼーション以前に延長されて、及び／または（ｉｉ）前記断片の延長前に前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、前記断片の延長は、前記ＣＴＯから前記ＨＯを切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅ）させる。
ターゲット核酸配列の存在下で、延長デュープレックスが形成されて、次の方式（ｉ）ＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）及び／または（ｉｉ）切断によるＨＯの消耗により、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止する。
本発明の方法は、前記ＣＴＯと非切断のまたは完全なＨＯとのハイブリダイゼーション抑制により提供されたシグナル変化を使用することを特徴とする。本発明において、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する指定温度で、前記ＨＯがＣＴＯとハイブリダイズされた場合に提供されるシグナルは、ＣＴＯと非切断のまたは完全なＨＯとのハイブリダイゼーションが延長デュープレックスにより抑制された場合に提供されるシグナルと相異なっている。
前記段階（ｄ）がＨＯの存在下で実施される場合、一部ＨＯは、ＰＴＯ断片の延長の間切断されて、切断から提供されたシグナルが共存することができる。
前記ＨＯの詳細な説明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態のＨＯに対する説明を参照して説明できる。
前記ＨＯは、ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。前記ＨＯのヌクレオチド配列は、ＣＴＯの区域中、ＰＴＯ断片がハイブリダイゼーションされる区域以外の区域に相補的な配列を含むようにデザインすることができる。
択一的に、前記ＨＯは、前記ＣＴＯとのハイブリダイゼーション側面において、前記断片と競争するヌクレオチド配列を含むことができる（図１７及び１８参照）。具体的に、このような競争的ＨＯは、前記断片またはその延長産物により切断されない。
第１及び第２シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識によって提供される。
本発明の具現例によって、前記ＣＴＯとＨＯ間がハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合に提供されるシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている場合に提供されるシグナルとが相異なっている限度内で、多様な種類の標識及び標識位置が本発明に使用できる。
表現‘ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）’で使用される用語‘ＨＯ’は、非切断のまたは完全なＨＯを意味する。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯまたは前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置する（図１４及び１７参照）。
前記相互作用的二重標識を有するＨＯが使用される場合、前記ＨＯの切断からのシグナルは、前記ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーションの抑制からのシグナルと区別される、相異なっているパターンを示す。
前記ＨＯが一本鎖状態である場合、ＨＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。前記ターゲット核酸配列が非存在でＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成される場合、ＨＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔されて、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングする。
前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスの鋳型−依存的形成は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制して、これにより、ＨＯが一本鎖状態を維持できるようにし、レポーター分子からのシグナルをクエンチングする。一本鎖のＨＯの数は、延長デュープレックスの数が増加するにつれて増加し、結局、最終的に検出されたシグナル強度は減少されるパターンを示す。
一方、前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記ＣＴＯとハイブリダイズされたＨＯは、ＰＴＯ断片の延長の間切断され得る。前記切断は、永久的に離隔されたレポーター分子及びクエンチャー分子を生成させて、レポーター分子からのシグナルを完全にアンクエンチングさせる。ＨＯの切断によるアンクエンチング程度は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションによるアンクエンチング程度より大きい。したがって、ＨＯの切断により提供されたシグナルが検出される場合、シグナル強度は、切断されたＨＯの数の増加につれて増加されるパターンを示す。
前記完全なＨＯとＣＴＯ間にハイブリダイゼーションの抑制及びＨＯの切断を含む２つの状況が同時に発生する間、より優勢な状況に符合するシグナルパターンが提供される。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、ＣＴＯは、相互作用的二重標識の他の１つを有して、前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置する（図１５及び図１８参照）。
本発明の特定具現例において、前記本方法は、ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＨＯをさらに１つ使用して実施されて、前記２つのＨＯは、前記ＣＴＯに互いに近接してハイブリダイズされて、前記ＨＯの１つは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＨＯの他の１つは、前記相互作用的二重標識の他の１つを有し、前記ＣＴＯと２つのＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯと前記２つのＨＯとが互いに離れている場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置する。
本発明の一具現例によると、前記ＨＯまたはＣＴＯは、単一標識を有して、前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記単一標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている場合の前記単一標識からのシグナルとが異なる位置に前記単一標識が位置する（図１６参照）。
標識システムの詳細な説明（シグナリングメカニズム及び標識位置などを含む）は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態の標識システムに対する説明を参照して説明できる。
段階（ｆ）：指定温度で第１または第２シグナルの検出
最終的に、第１シグナルまたは第２シグナルは、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが二本鎖形態を維持する指定温度で検出される。
ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、ターゲット核酸配列の非存在を示し、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。第１シグナル及び第２シグナルの相異は、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在または非存在を決定できるようにして、核酸試料においてターゲット核酸配列の存在または非存在を示す。
本発明の一具現例によると、第１シグナル及び第２シグナルは、シグナル発生及びシグナル消滅のような現象によって区別される。
本発明の一具現例によると、第１シグナル及び第２シグナルは、強度の変化（シグナル増加及びシグナル減少）のような現象によって区別される。
本発明の一具現例によると、ターゲット配列が存在する場合のシグナルと、ターゲット配列が非存在の場合のシグナルとは相異なっている。ターゲット配列が本発明の方法により検出される場合、前記シグナルの相異は、シグナルの強度の差を含む。本発明の一具現例によると、前記シグナルの差は、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％である。
ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが二本鎖形態を維持する温度は、ＣＴＯとＨＯのＴｍ値を考慮して一般的に決定できる。
段階（ｆ）の検出は、実時間方式、エンド−ポイント方式または指定時間間隔方式で実施することができる。本発明が段階（ａ）−（ｆ）の全部または一部段階を、変性を含んで繰り返す段階を追加的に含む場合、指定温度における前記反復の各サイクルにおいて（即ち、実時間方式）、指定温度における前記反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）または指定温度における前記反復の間、指定時間間隔のそれぞれでシグナル検出が実施される。
本発明の一具現例によると、前記方法は、ターゲット核酸配列がないか、あるいは指定の含量（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｍｏｕｎｔ）のターゲット核酸配列を含む対照群を使用して行われる。
本発明は、液相または固相のいずれかにおいて実施できる。
固相におけるターゲット検出
本発明の一具現例によると、本発明は、固相で実施されて、前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、固相基質上に固定化されるか、または前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、前記シグナルは、固相基質上で検出される。
本発明の一具現例によると、ＣＴＯ及びＨＯの１つは、段階（ｄ）と段階（ｅ）の間または段階（ｅ）と段階（ｆ）の間に固相基質上に固定化される。
第３様態に対する固相でターゲット検出の詳細な説明は、メルティングまたはハイブリダイゼーション分析を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイの第１様態に対する説明を参照して説明できる。
本発明の一具現例によると、本発明の方法は、前記アップストリームオリゴヌクレオチドを使用せずに行われて、前記段階（ｂ）において、前記ＰＴＯの切断は、アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖の助け無しに発生する。前記アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性を使用する本発明の具現例は、下記のようにより詳細に説明される：
アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性に基づいたＰＣＥ−ＮＨアッセイによるターゲット検出
本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない）と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
（ｅ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、前記段階（ｄ）の結果物とをハイブリダイズさせる段階（前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これによって、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示す第１シグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスは、前記ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制し、これによって、前記ＣＴＯと非ハイブリダイズされたＨＯの存在を示す第２シグナルが提供されて、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識によって提供される）と、
（ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが二本鎖形態を維持する指定温度下で前記第１シグナルまたは前記第２シグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示して、前記第１シグナルと第２シグナルとの差は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在または非存在を決定できるようにして、前記核酸試料内の前記ターゲット核酸配列の存在または非存在を示す）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するための方法を提供する。
前記アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’−ヌクレアーゼ活性をベースとする本発明の方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用しないことを除いては、アップストリームオリゴヌクレオチドを使用する前記ＰＣＥ−ＮＨアッセイの第３様態と同一であるため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複を避けるために省く。
本発明のまた他の様態によると、本発明は、
（ａ）アップストリームオリゴヌクレオチド（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む）と、
（ｂ）ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されない）と、
（ｄ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）（前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これによって、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示す第１シグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスは、前記ＣＴＯと前記ＨＯのハイブリダイゼーションを抑制し、これによって、前記ＣＴＯと非ハイブリダイズされたＨＯの存在を示す第２シグナルを提供して、前記キットは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識を追加的に含む）と、
を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するキットを提供する。
本発明において共通する内容
本発明の第１、２及び３様態に対する共通する内容は、以下のように説明される。
プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＨＯは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓ及び／またはＮＭＰｓから構成できる。択一的に、プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＨＯは、変異ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ， 参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ， 参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２２４８９号、第ＷＯ ９８／３９３５２号及び第ＷＯ ９９／１４２２６号）を含むことができる。プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＨＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含むことができる。用語‘ユニバーサル塩基’は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれに対して、ほとんど区別無しに塩基対を形成することができるものを意味する。
上述のように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に離隔された一位置で切断できる。切断位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置できる。ＰＴＯ断片がＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を含む場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部にハイブリダイズされるＣＴＯの位置は、ユニバーサル塩基、縮退性配列（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、ＰＴＯがＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に１つのヌクレオチド離隔された一位置で切断されたら、前記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部は、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。もし、ＰＴＯがＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に２個のヌクレオチド離隔された一位置で切断されたら、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端は、縮退性配列を含み、その３’−方向−近接ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。このように、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部の多様な位置でＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を利用することが有用である。また、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、同一な５’−タギング部位を有するＰＴＯｓを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに利用する場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が相異なっているＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮退性配列は、ＣＴＯに有用に使用される。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を利用する戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために、一種のＣＴＯまたは最小限の種類のＣＴＯを使用するようにする。
本発明の一具現例によると、本発明の方法は、前記反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｆ）の全部または一部を繰り返す段階を追加的に含む。このような反復は、ターゲット核酸配列及び／またはターゲットシグナルを増幅できるようにする。本発明の一具現例によると、段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）または（ｅ）−（ｆ）は、変性過程を含んで繰り返される。本発明の特定具現例において、繰り返すサイクルの数は選択的に調節できる。変性過程は、従来技術により実施でき、例えば、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、メルティングは、８０〜１０５℃範囲の温度で熱処理して達成できる。上述の処理の一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）−（ｆ）は、１つの反応容器または別途の反応容器で実施する。例えば、前記段階（ａ）−（ｂ）、（ｃ）−（ｄ）及び（ｅ）−（ｆ）は、個別反応容器または別途の反応容器で実施できる。例えば、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位と前記ターゲット核酸配列間のハイブリダイゼーションが前記ＰＴＯ断片と前記ＣＴＯ間のハイブリダイゼーションよりさらに厳格な条件下で実施されるようにＰＴＯ及びＣＴＯの配列及び反応条件を決定する場合、前記段階（ａ）−（ｂ）は、前記段階（ｃ）−（ｆ）の過程無しに繰り返すことができる。段階（ａ）−（ｂ）の反復に続いて、段階（ｃ）−（ｆ）を実施することができる。
本発明の特定具現例において、前記段階（ａ）−（ｄ）及び（ｅ）−（ｆ）は、別途の反応容器で実施することができる。
本発明の特定具現例において、前記変性過程を含んで段階（ａ）−（ｄ）は繰り返される。
特定段階の反復、反復過程において、変性の介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）、特定段階の分離実施及び検出時点が幅広く変化できることは、当業者に明確である。
本発明の一具現例によると、前記反復が前記ＰＴＯに対するアップストリームプライマーを使用し、変性過程と共に実施される場合、前記反復は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施されて、特にＰＣＲによって実施される。前記ＰＴＯに対するアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーの使用は、ターゲット核酸配列を増幅させることができる。
本発明の一具現例によると、前記反復が前記ＰＴＯに対するアップストリームプローブを使用し、変性過程と共に実施される場合、前記反復は、ＰＴＯに対するダウンストリームプライマーの存在下で実施される。
本明細書で使用される用語‘核酸試料’は、非生物学的試料（例えば、食品、水、空気、土壌及び廃水）または核酸分子を含む生物学的試料を意味する。生物学的試料は、動物、植物、人間、菌類、バクテリア及びウイルスに由来する。生物学的試料は、細胞、組織または生物学的源泉からの流体、血液、血漿、血清、リンパ、牛乳、小便、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃組織抽出物などである。
本発明では、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列が、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含め、ある特定配列または長さを有するように要求しない。ターゲット核酸配列は、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、その詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＮｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６ （１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマーまたはｍＲＮＡにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用できる。
本発明で検出及び／または増幅可能なターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、 Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。
本発明により検出されたターゲット核酸配列は、核酸配列の広範囲な多様性、例えば、ゲノム内に配列、分離または断片配列及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列は、免疫−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲは、タンパク質を含むターゲットの多様な形態を検出するために、広範囲に利用されるＰＣＲと共に核酸マーカー配列と抗体間の結合体を利用する（ｓｅｅ Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ｐｐ：１２０−１２２（１９９２）， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，６６５，５３９， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３ ｐｐ：２０８−２１６（２００５）， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｐｕｂ． Ｎｏ． ２００５／０２３９１０８ ａｎｄ Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２ ｐｐ：７９６−８００（２０１０））。
本発明のターゲット核酸分子は、ＩＰＣＲ方法で使用される核酸マーカーとして含まれて、本発明は、ＩＰＣＲ方法で核酸マーカーを検出するために適用できる。
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出に有用である。好ましくは、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。本明細書で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片または配列の類似したＤＮＡ断片において、特定位置のＤＮＡ配列におけるあらゆる単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡ断片は、１つの遺伝子または１つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多形性対立遺伝子変異（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）でありえる。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係わる変異及び癌発生−関連変異を含む。本明細書で使用された用語‘ヌクレオチド変異’は、核酸配列において特定な位置に、ある変異を含む。即ち、用語‘ヌクレオチド変異’は、野生型及び核酸配列における特定な位置にそのある突然変異型を含む。
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明において、使用されるプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列の前記ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でマッチング鋳型（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。使用されるプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でミスマッチング鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。
ヌクレオチド変異の検出のために、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列におけるヌクレオチド変異位置の向こう側に位置するようにデザインすることができる。本発明の一具現例によると、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。ターゲット核酸配列でヌクレオチド変異に相補的な配列を有するアップストリームプライマーの３’−末端は、マッチング鋳型にアニーリングされて延長され、ＰＴＯ切断を誘導する。結果物として、ＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされて延長され、ターゲットシグナルを提供する核酸分子が生産される。逆に、アップストリームプライマーの３’−末端がミスマッチング鋳型でヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、アップストリームプライマーがミスマッチング鋳型にハイブリダイズされるとしても、延長反応のためにプライマーの３’−末端のアニーリングが必須的な条件下では延長されず、これにより、ターゲットシグナルが生成されない。
択一的に、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯ切断を利用することができる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯは、マッチング鋳型にハイブリダイズされた後、切断される。結果物として、ＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされて延長され、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止する延長デュープレックスを形成して、これによって、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルは提供されない。その反面、調節された条件下で、ＰＴＯは、ヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリダイズされず、切断されない。このような場合、好ましくは、ＰＴＯのヌクレオチド変異に対する相補的な配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の中間に位置する。
本発明の一具現例によると、人工的ミスマッチヌクレオチドの使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上させる。
択一的に、本発明は、特定ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの選択性のために、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を有するＰＴＯを使用する。ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置して、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。
ＰＴＯがヌクレオチド変異区別位置に相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（即ち、マッチング鋳型）とハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、マッチング鋳型と二本鎖を形成する。しかし、ＰＴＯがヌクレオチド変異区別位置に非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（即ち、ミスマッチング鋳型）とハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ミスマッチング鋳型と二本鎖を形成しない。
本明細書でＰＴＯを言及しながら使用される用語‘ヌクレオチド変異区別位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）’は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部にターゲット核酸配列にヌクレオチド変異に対して相補的な配列である。
本発明の好ましい具現例によると、ヌクレオチド変異区別位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０ヌクレオチド、より好ましくは、８ヌクレオチド、さらに好ましくは、６ヌクレオチド、よりさらに好ましくは、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド離隔された位置以内に位置する。好ましくは、ヌクレオチド変異区別位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に位置する。
本発明においてプローブのヌクレオチド変異区別位置またはターゲット配列にヌクレオチド変異位置で言及される用語‘位置’は、１つのヌクレオチドだけではなく、複数のヌクレオチドを含むものとして使用される。
このように関心のあるヌクレオチド変異に対する、区別されるハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯの初期切断位置における差異を提供して、これにより、２種のＰＴＯ断片が生成されて、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差異が発生するということは注目すべきことである。
前記関心のあるヌクレオチド変異の存在下で、第１断片は、ＰＴＯとマッチング鋳型間にハイブリッドの切断によって生成されて、関心のあるヌクレオチド変異の非存在下で、第２断片は、ＰＴＯとミスマッチング鋳型間にハイブリッドの切断により生成される。前記第２断片は、１次断片とは相異なる２次断片を生成するようにする追加的な３’−末端部位を含む。
本発明の単一ヌクレオチド変異の検出のための一具現例において、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端は、前記ターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。上述のように、マッチング鋳型にハイブリダイズされたＰＴＯの切断は、例えば、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に３’−方向にすぐ近接（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｄｊａｃｅｎｔ）した一位置で誘導できる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に対して相補的なヌクレオチドを有する。ＰＴＯ断片は、ヌクレオチド変異に該当する配列を含むキャプチャリング部位を有するＣＴＯにハイブリダイズされた後、延長され、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止する延長デュープレックスを形成し、これにより、ＣＴＯ／ＨＯハイブリッドの存在を示すシグナルを提供しない。もし、同一なＰＴＯが、単一ヌクレオチド変異を除いてはマッチング鋳型に対して同一な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリダイズされたら、ＰＴＯの切断がＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から３’−方向に２個のヌクレオチドだけ離隔された位置で生成できる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド以外に、追加的に切断されるヌクレオチドを有する。追加的に切断されたヌクレオチドにハイブリダイズされるＣＴＯの位置が、前記追加的に切断されるヌクレオチドに対して非相補的な配列を有するようにデザインされた場合、ＰＴＯ断片の３’−末端は、ＣＴＯにハイブリダイズされず、調節された条件でＰＴＯ断片が延長されない。
本発明の一具現例によると、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部にヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯの切断位置は、マッチング鋳型またはミスマッチング鋳型とのハイブリダイゼーションに依存的に変わり、これにより、前記２つのハイブリダイゼーションイベントから放出されるＰＴＯ断片は、相異なる配列を有して、好ましくは、その３’−末端の一部、より好ましくは、その３’−末端で相異なる配列を有する。
本発明の一具現例によると、前記ＰＴＯ断片の３’−末端の一部の相異を考慮したＣＴＯのヌクレオチド配列の選択により、マッチング鋳型とミスマッチング鋳型とを区別することができる。
本発明の一具現例によると、ある１つのＰＴＯ断片の生成は、ＣＴＯ上の延長反応により明白に検出できる。
本発明の一具現例によると、第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる場合、ＣＴＯが選別された配列を有しており、ＣＴＯは、第２断片の追加的な３’−末端部位にハイブリダイズされず、第２断片の延長を防止する。
上述のように、第１断片の延長は、延長デュープレックスの形成により、ＨＯと非ハイブリダイズにより検出される。
本発明の一具現例によると、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ヌクレオチド変異区別位置から１〜１０ヌクレオチド（より好ましくは、１〜５ヌクレオチド）以内で離隔された位置に非塩基対モイエティ（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。
変異区別位置に対して非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイズされる場合、非塩基対モイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを防止する。
非塩基対モイエティ（例えば、人為的ミスマッチヌクレオチド）の使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別能力を向上させる。
本発明の一具現例によると、非塩基対モイエティは、ＰＴＯがヌクレオチド変異区別位置に相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列とハイブリダイズされる場合、５’−末端の一部とターゲット核酸配列間に二本鎖の形成を抑制しない。
本発明の一具現例によると、非塩基対モイエティは、ＰＴＯとマッチング鋳型のハイブリッド上に初期切断位置とＰＴＯとミスマッチング鋳型のハイブリッド上に初期切断位置間の距離を拡大させる。
本発明の一具現例によると、非塩基対モイエティ配列の導入は、初期切断位置、特に、ＰＴＯとミスマッチング鋳型のハイブリッド上に初期切断位置を調節できるようにする。
本発明の一具現例によると、非塩基対モイエティは、ヌクレオチド変異区別位置のダウンストリームに位置する。
非塩基対モイエティは、ターゲット核酸配列間に塩基対を形成しないあるモイエティを含む。好ましくは、非塩基対モイエティは、（ｉ）人工的ミスマッチ塩基、塩基対をなせない天然的／非天然的塩基、塩基対またはユニバーサル塩基をなせないように変異された塩基、（ｉｉ）塩基対をなせないように変異された非塩基対ヌクレオチド、または（ｉｉｉ）非塩基対化学的化合物である。
例えば、非塩基対モイエティは、アルカリングループ、リボフラノシルナフタレン、ジオキシリボフラノシルナフタレン、メタホスフェート、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合及びアリールホスホロアミダート結合を含む。従来のカーボンスペーサーも非塩基対モイエティとして使用される。非塩基対モイエティとしてユニバーサル塩基は、ＰＴＯの近接した切断位置に有用である。
デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含む塩基対は、天然的塩基間でさらに低い結合強度を有することにより、ユニバーサル塩基は、特定ハイブリダイゼーション条件下で非塩基対モイエティとして利用できる。
５’−末端の一部に導入された非塩基対モイエティは、好ましくは、１−１０、より好ましくは、１−５、さらに好ましくは、１−２モイエティを有する。５’−末端の一部に複数の非塩基対モイエティは、連続または不連続的に存在できる。好ましくは、非塩基対モイエティは、２−５個の連続的なモイエティを有する。
好ましくは、非塩基対モイエティは、非塩基対化学的化合物である。
本発明の一具現例によると、ＰＴＯのヌクレオチド変異区別位置及び非塩基対モイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０ヌクレオチド（より好ましくは、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、１ヌクレオチド）離隔された位置以内に位置する。
本発明の位置具現例によると、ＰＴＯは、ブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に耐性のある少なくとも１個のヌクレオチドを含むブロッカー部位を有して、前記ブロッカー部位は、初期切断位置を調節するか、特定位置で切断を防止するために位置する。
ヌクレオチド変異の改善された検出効率のために、本発明は、クランピング方法で実施できる。ＰＮＡを使用した代表的なクランピング方法は、Ｈｅｎｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：５３３２−５３３６（１９９３） ａｎｄ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． ３４， Ｎｏ ２ ｅ１２ （２００６）に開示されている。
例えば、ＰＮＡを使用するクランピング技術は、野生型ヌクレオチド変異を有する核酸配列増幅だけではなく、突然変異型ヌクレオチド変異を有する核酸配列を増幅させて、次いで、本明細書に技術された方法により、ヌクレオチド変異のさらに効率的な検出を可能にする。特に、ＰＣＲクランピング技術は、特異的−タイプヌクレオチド変異を有する核酸配列のみを増幅するようにするため、ＰＣＲクランピング技術と本発明の方法を結合すると、さらに効果的な方式でマイノリティー変異体（ｍｉｎｏｒｉｔｙ−ｖａｒｉａｎｔ）を検出することができる。
本発明において、用語‘増幅ブロッカー’は、クランピングのために使用されたオリゴヌクレオチドを意味する。
一般に、クランピングのための増幅ブロッカーは、単一ミスマッチを有する鋳型ともハイブリダイズされないようにデザインされており、同一条件下で、専ら増幅ブロッカーと完全に相補的な配列を有する鋳型のみにハイブリダイズされる。プライマーアニーリングまたはチェーン延長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を抑制する増幅ブロッカーとハイブリダイズされた鋳型は、増幅されず、増幅ブロッカーとハイブリダイズされていない鋳型のみが増幅される。ＰＮＡ及びＬＮＡのような核酸類似体は、単一塩基差に対しても相当なＴｍ差を示すという点で、増幅ブロッカーとして有用である。
本発明の一具現例によると、増幅ブロッカーは、本発明において、特にマイノリティー変異体（ｍｉｎｏｒｉｔｙ−ｖａｒｉａｎｔ）の検出のために使用される。本発明の一具現例によると、増幅ブロッカーは、増幅ブロッカーのアップストリームに位置したプライマーの延長を防止する。本発明の一具現例によると、増幅ブロッカー及びＰＴＯは、二本鎖または互いに相異なっている鎖において、同一な鎖とハイブリダイズされるようにデザインすることができる。本発明の一具現例によると、増幅ブロッカーは、５’ヌクレアーゼ活性にバックボーン耐性を有するヌクレオシド／ヌクレオチドを含む。本発明の一具現例によると、増幅ブロッカーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ブリッジ核酸（ＢＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミダート（ＮＰ）オリゴマー、Ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅバインダー連結オリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−Ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホルアミダート、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、α−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドまたはこれらの混合を含む。
５’−末端部位に１つのヌクレオチド変異区別部位を有するプローブがミスマッチ鋳型とハイブリダイズする場合、５’−末端部位は、特定条件下で一本鎖を形成することができる。前記プローブは、ＰＴＯに該当する。シグナルは、本発明のＰＴＯアッセイにより生成できる。このような接近法は、プローブのヌクレオチド変異区別位置に非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の検出に有用である。
本発明の一具現例によると、本発明で使用されるターゲット核酸配列は、前−増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。前−増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出に敏感度及び特異度を有意に増加させる。
本発明の一具現例によると、本発明の方法は、ＰＴＯにダウンストリームプライマーの存在下で実施される。
少なくとも２種のターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス）されるという点で本発明の利点がさらに目立つ。
本発明の一具現例によると、本発明の方法は、ターゲット核酸配列の少なくとも２種の形態の（より具体的には、少なくとも３種の形態、さらに具体的には、少なくとも５種の形態）検出のために実施される。
本発明の一具現例によると、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するための方法（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のアップストリームオリゴヌクレオチドを含み（より具体的には、少なくとも３種、さらに具体的には、少なくとも５種）、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み（より具体的には、少なくとも３種、さらに具体的には、少なくとも５種）、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含み（より具体的には、少なくとも３種、さらに具体的には、少なくとも５種）、前記ＨＯは、少なくとも２種（より具体的には、少なくとも３種、さらに具体的には、少なくとも５種）のＨＯを含む。
本発明の特定具現例において、少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、それに該当するシグナルも、少なくとも２種が提供される。
本発明の一具現例によると、本発明は、前記ＰＴＯに対して少なくとも２種のダウンストリームプライマーを使用して実施される。
また、本発明は、延長鎖の数を増加させるために、（ｉ）前記延長鎖に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング部位に相補的であるが、延長鎖に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む追加的なＰＴＯを利用して、追加的な５’ヌクレアーゼ切断反応により、ＣＴＯ上に延長できる追加的断片を提供することが可能である。５’ヌクレアーゼ切断反応のために、延長鎖に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、追加的なＰＴＯのアップストリームに位置するアップストリームオリゴヌクレオチドを追加的に使用することが可能である。本発明の一具現例によると、ＨＯは、追加的ＰＴＯとして役割をすることができる。
前記好ましい具現例は、前記追加的な断片の形成が、延長鎖の形成に依存するという特徴を有する。
択一的に、前記追加的な断片は、（ｉ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング部位に相補的であるが、ＣＴＯに非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む追加的なＰＴＯの使用により提供できる。
本発明の一具現例によると、前記追加的な延長デュープレックスは、延長鎖の追加的生成によって形成されて、ターゲットシグナルの増幅に寄与する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
実施例１：ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションに対する延長デュープレックス形成の影響評価
本発明者らは、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）のＣＴＯに対するハイブリダイゼーションが、延長デュープレックスの数を増加させることにより減少されるかどうかを実験し、これは、延長デュープレックスの形成がＨＯ及びＣＴＯ間のハイブリダイゼーションを抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）することを示す。ＣＴＯに相補的なヌクレオチド配列を有する合成延長鎖（Ｓｙｎ−ＥＳ）を、延長デュープレックスの量を調節するために用意し、多様な量のＳｙｎ−ＥＳを、固定された量のＣＴＯと使用して、延長デュープレックスを形成させた。
Ｓｙｎ−ＥＳ及びＣＴＯは、標識を有しない。ＣＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサーでブロッキングされる。ＨＯは、５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を有して、３’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を有する。
本実施例において、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの存在は、メルティング分析により検出した。
本実施例で利用されたＳｙｎ−Ｅｓ、ＣＴＯ及びＨＯの配列は、下記のとおりである：
ＮＧ−Ｓｙｎ−ＥＳ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−ＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＨＯ−１ ５’−［Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧ［ＢＨＱ−２］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
反応は、Ｓｙｎ−ＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）（３， ２， １， ０．５， ０．１ ｏｒ ０ ｐｍｏｌｅ）， ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １ ｐｍｏｌｅ， ＨＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） １ ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス［２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ｄＮＴＰｓ ２００μｍ及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素１．６ ｕｎｉｔｓ （Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）含み］ １０μｌの量を含有した２０μｌの最終容量で実施した； 前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた； 前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させた。変性過程後、反応混合物を４０℃に冷却させて、４０℃で１０分間維持させた後、４０℃から８５℃に徐々に加熱させることにより、メルティングカーブを得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
図１９Ａ乃至１９Ｂから分かるように、Ｓｙｎ−ＥＳの０〜０．５ｐｍｏｌｅの範囲で、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの予想Ｔｍ値に当る５７℃でメルティングピークが検出されて、その高さは、Ｓｙｎ−ＥＳの量に反比例して減少した。Ｓｙｎ−ＥＳを１ｐｍｏｌｅ以上使用した場合、ピークが検出されなかった。
このような結果は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションが延長デュープレックス形成により減少されることを示し、延長デュープレックスの形成がＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションを抑制することを示す。
実施例２：ＰＣＥ−ＮＨアッセイを利用したターゲット核酸配列の検出
また、本発明者らは、ＰＣＥ−ＮＨアッセイが（ｉ）指定温度で実時間検出または（ｉｉ）メルティング分析方式でターゲット核酸配列を検出できるかどうかを実験した。
５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために使用した。
ＰＴＯ及びＣＴＯは、標識を有しない。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサーでブロッキングされる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子のゲノムＤＮＡをターゲットとして使用した。ＨＯは、５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を有して、３’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を有する。
本実施例で使用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＨＯの配列は、下記のとおりである：
ＮＧ−Ｆ−１ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＮＧ−Ｒ−１ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［ＳｐａｃｅｒＣ３］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−ＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＨＯ−１ ５’−［Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧ［ＢＨＱ−２］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
２−１．ＰＣＲの間、指定温度における実時間検出
反応は、ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） １０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） １０ｐｍｏｌｅ， ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） ５ｐｍｏｌｅ， ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） ０．５ｐｍｏｌｅ， ＨＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） ０．５ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス［ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ ， ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素 １．６ｕｎｉｔｓ（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）］ １０μｌの量を含有した２０μｌ最終容量で実施した； 前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた； 前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で３０秒過程を５０回繰り返した。シグナルの検出は、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドが二本鎖形態を維持すると予想される各サイクルのハイブリダイゼーション段階（５５℃）で実施した。また、シグナルを各サイクルの変性段階（９５℃）で測定した。
指定温度における実時間検出を含むＰＣＥ−ＮＨアッセイは、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖からのシグナルが、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションの抑制により存在する一本鎖ＨＯからのシグナルと相異なっているということを利用する。
本実施例において、ＨＯは、相互作用的二重標識を有する。ＨＯが一本鎖状態である場合、ＨＯのレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ターゲット核酸配列が非存在でＣＴＯ／ＨＯハイブリッドが形成される場合、ＨＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に互いに離隔されて、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングする。
ターゲット核酸配列が存在する場合、延長デュープレックスの鋳型−依存的形成は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制して、これにより、ＨＯが一本鎖状態になることを可能にし、レポーター分子からのシグナルがクエンチングされる。したがって、一本鎖状態のＨＯの数は、延長デュープレックスの数が増加するにつれて増加し、その結果、最終的に検出されるシグナル強度は減少されたパターンを示す。
一方、ターゲット核酸配列が存在する場合、ＣＴＯとハイブリダイズされたＨＯは、ＰＴＯ断片の延長の間切断され得る。前記切断は、永久的に離隔されたレポーター分子及びクエンチャー分子を生成させて、レポーター分子からのシグナルを完全にアンクエンチングさせる。ＨＯの切断によるアンクエンチング程度は、ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションによるアンクエンチング程度より大きい。したがって、ＨＯの切断により提供されるシグナルが検出される場合、シグナル強度は、切断されたＨＯの数が増加するにつれて増加されたパターンを示す。ＨＯの切断により提供されるシグナルは、多様な温度で検出できる。高い温度で検出は、ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーションにより提供されるシグナルを除去することができる。
本実施例において、完全なＨＯとＣＴＯ間にハイブリダイゼーションの抑制及びＨＯの切断を含む２つの状況が同時に発生する間、より優勢な状況に符合するシグナルパターンが提供される。
図２０Ａで示すように、ハイブリダイゼーション段階（５５℃）で測定された蛍光シグナルの強度は、ターゲットの存在下で減少されるパターンを示す。ターゲットの非存在時には、シグナルが検出されない。このような結果は、ＰＣＥ−ＮＨアッセイが実時間検出方法でターゲット核酸配列を検出できるということを示し、また、完全なＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制は、ＰＣＥ−ＮＨアッセイによりターゲット配列の存在を検出できるようにする。
また、反応の間一部ＨＯ切断の存在を観察するために、前記反応の間、各サイクルの変性段階（９５℃）でシグナルの検出を実施する。図２０Ｂに示したように、蛍光シグナルの強度は、ターゲット存在で増加される。如何なるシグナルもターゲットの非存在では検出されない。このような結果は、一部ＨＯが反応の間切断され得ることを示す。
２−２．メルティング分析
実施例２−１に反応後、メルティングカーブは、反応混合物を４０℃に冷却させて、４０℃で１０分間維持させた後、４０℃から８５℃に徐々に加熱させることにより得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
図２０Ｃに示されたように、メルティングピークは、ターゲットの非存在時には、予想されるＣＴＯ−ＨＯハイブリッドのＴｍ値に当る５９℃で検出される。ターゲットの存在時には、如何なるシグナルも検出されない。このような結果は、ＰＣＥ−ＮＨアッセイがメルティング分析方式でターゲット核酸配列を検出することができることを示す。
実施例３：ターゲット核酸配列の検出のために競争的ＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイの評価
また、本発明者らは、ＰＣＥ−ＮＨアッセイが（ｉ）指定温度で実時間検出または（ｉｉ）メルティング分析方式で、ＨＯの切断から提供されたシグナル無しに、ＣＴＯと完全なＨＯのハイブリダイゼーション抑制から提供されたシグナルを使用してターゲット核酸配列を検出できるかどうかを実験した。ＰＴＯ断片延長の間、ＨＯの切断の効果を排除させるために、競争的ＨＯは、ＣＴＯに対するハイブリダイゼーション側面でＰＴＯ断片と競争するようにデザインした。実施例において競争的ＨＯは、ＰＴＯ断片配列及びその３’−末端の一部にＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な追加的な配列を含む。
５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために使用した。
ＰＴＯ及びＣＴＯは、標識を有しない。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサーでブロッキングされる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子のゲノムＤＮＡをターゲットとして使用した。競争的ＨＯは、５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を有して、３’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を有する。
本実施例で使用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及び競争的ＨＯの配列は、下記のとおりである：
ＮＧ−Ｆ−２ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＮＧ−Ｒ−２ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［ＳｐａｃｅｒＣ３］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−ＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＨＯ−２ ５’−［Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＣＧＣ［ＢＨＱ−２］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
３−１．指定温度における実時間検出
反応は、ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７） １０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８） １０ｐｍｏｌｅ， ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） ５ｐｍｏｌｅ， ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） ０．５ｐｍｏｌｅ， 競争的ＨＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９） １ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス［ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ ， ｄＮＴＰｓ ２００μＭ及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素 １．６ｕｎｉｔｓ（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）］ １０μｌの量を含有した２０μｌ最終容量で実施した； 前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた； 前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒過程を５０回繰り返した。シグナルの検出は、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドが二本鎖形態を維持すると予想されるハイブリダイゼーション段階（６０℃）で実施した。また、シグナルを各サイクルの変性段階（９５℃）で測定した。
図２１Ａに示されたように、ターゲットの存在時、ハイブリダイゼーション段階（６０℃）で測定された蛍光シグナルの強度が減少するパターンが得られた。ターゲットの非存在の時は、シグナルが検出されない。
このような結果は、ＰＣＥ−ＮＨアッセイがＨＯの切断無しに、完全なＨＯとＣＴＯのハイブリダイゼーションの抑制を利用することにより、ターゲット核酸配列を検出できるということを示す。
また、反応の間一部ＨＯ切断の存在を観察するために、前記反応の間、各サイクルの変性段階（９５℃）でシグナルの検出を実施する。図２１Ｂに示したように、ターゲットの非存在だけではなく、ターゲットの存在下でも、如何なるシグナルも検出されない。このような結果は、ＨＯが反応の間切断されないことを示す。
３−２．メルティング分析
実施例４−１に反応後、メルティングカーブは、反応混合物を５５℃に冷却させて、５５℃で３０秒間維持させた後、５５℃から８５℃に徐々に加熱させることにより得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定し、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの解離をモニタリングした。メルティングピークは、メルティングカーブデータ由来である。
図２１Ｃに示されたように、ＣＴＯ−ＨＯハイブリッドの予想されるＴｍ値に当る７０℃で、メルティングピークは、ターゲットの非存在で検出される。ターゲットの存在では、如何なるシグナルも検出されない。
このような結果は、メルティング分析を含むＰＣＥ−ＮＨが、ＨＯ切断無しに、ＣＴＯに完全なＨＯのハイブリダイゼーションの抑制を使用してターゲット核酸配列を検出することができることを示す。
実施例４：単一標識されたＣＴＯ及びマイクロアレイに固定化されたＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイの評価
また、本発明者らは、単一標識されたＣＴＯ及びマイクロアレイに固定化されたＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイを実験した。ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長、固定化されたＨＯにＣＴＯのハイブリダイゼーションをマイクロアレイで同時に実施した。反応後、ＣＴＯ−ＨＯデュープレックスの存在または非存在を分析した。ＰＴＯ断片がＨＯの存在下で延長される場合、ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成は、（ｉ）ＨＯとＣＴＯ間のハイブリダイゼーションの抑制及び／または（ｉｉ）ＰＴＯ断片の延長の間、ＨＯの切断により防止できる。
５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素は、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯ断片の切断及び延長のために使用した。ＰＴＯの３’−末端は、カーボンスペーサーでブロッキングされる。ＣＴＯは、３’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ６７０）を有する。ＨＯは、リンカーアーム（Ｌｉｎｋｅｒ ａｒｍ）としてｐｏｌｙ（Ｔ）１０を有して、その３’−末端のアミノグループ（ＡｍｉｎｏＣ７）を使用してガラススライドの表面に固定化した。５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ６７０）を有するマーカープローブは、３’−末端のアミノグループを使用してガラススライドの表面に固定化した。
本実施例で使用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＨＯ及びマーカーの配列は、下記のとおりである：
ＮＧ−Ｆ−２ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＮＧ−Ｒ−２ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
ＮＧ−ＣＴＯ−２ ５’−ＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｑｕａｓａｒ６７０］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＮＧ−ＨＯ−３ ５’−ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［Ａｍｉｎｏ Ｃ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ６７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ， Ｋｏｒｅａ）をＨＯ及びマーカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１及び１２）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファ（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたＨＯ及びマーカーをＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ， Ｃｈｉｎａ）を利用し、ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。ＨＯ及びマーカーを２ｘ１ フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このように製作されたマイクロアレイを、約８５％湿度に維持されるチャンバーに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたＣＴＯ及びマーカーを除去するために、前記スライドを２ｘ ＳＳＰＥ（０．３Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２Ｍ リン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファ溶液に３７℃で３０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
ＰＣＥ−ＮＨ反応をＮＧ遺伝子のゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７） １０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０） ０．５ ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス［ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ， ｄＮＴＰｓ ２００μｍ及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素 １．６ｕｎｉｔｓ（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）］ １５μｌの量を含有した３０μｌの最終容量で実施した； 前記全体混合物をＨＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）が交互−結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面に組み立てられたチャンバーに適用した。前記スライドをｉｎ ｓｉｔｕブロック方式で熱循環器（ＧｅｎｅＰｒｏ Ｂ４Ｉ， Ｃｈｉｎａ）に位置させた； 前記ＰＣＥ−ＮＨ反応を下記のように実施した： ９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒過程を４０回繰り返して、５５℃で５分間ハイブリダイゼーション。
反応後、スライドを１分間蒸留水で洗浄した。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図２２に示したように、蛍光強度は、ターゲットの非存在時に比べ、ターゲットの存在時に明白に減少された。このような結果は、単一標識されたＣＴＯ及びマイクロアレイに固定化されたＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイが、ターゲット核酸配列を検出することができることを示す。
実施例５：ＨＯの切断無しに単一標識されたＣＴＯ及びマイクロアレイに固定化されたＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイの評価
また、本発明者らは、単一標識されたＣＴＯ及びマイクロアレイに固定化されたＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイを実験した。ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長を１つの容器で実施し、その結果物は、ＨＯが固定化されたマイクロアレイに移動させた。これは、ＰＴＯ断片の延長の間、ＨＯが切断されることを排除することができるようにする。ハイブリダイゼーション反応後、ＣＴＯ−ＨＯデュープレックスの存在または非存在を分析した。
前記実施例４のように、同一なＴａｑ ＤＮＡ重合酵素、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＨＯ及びマーカーを使用した。
スライド製造は、実施例４で使用されたプロトコールと同一に実施した。
ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長は、ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７） １０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０） ０．５ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス［ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ， ｄＮＴＰｓ ２００μｍ及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素 １．６ｕｎｉｔｓ（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）］ １５μｌの量を含有した３０μｌの最終容量で実施した； 反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた； 前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、及び７２℃で３０秒過程を４０回繰り返した。
前記結果物の混合物をＨＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）が交互−結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバーに適用した。スライドをｉｎ ｓｉｔｕブロック方式で熱循環器（ＧｅｎｅＰｒｏ Ｂ４Ｉ， Ｃｈｉｎａ）に位置させた； ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。最終的に、スライドを蒸留水で１分間洗浄した。イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を利用し、５−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図２３に示したように、蛍光強度は、ターゲットの非存在時に比べ、ターゲットの存在時に明白に減少された。このような結果は、単一標識されたＣＴＯ及びマイクロアレイに固定化されたＨＯを使用するＰＣＥ−ＮＨアッセイが、ＨＯを切断する段階無しにターゲット核酸配列を検出することができることを示す。
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims (24)

  1. （ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
    （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
    （ｅ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）の存在下で、一定温度範囲にかけて前記段階（ｄ）の結果物に対するメルティング分析またはハイブリダイゼーション分析を実施する段階（前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供し、前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって前記シグナルが提供されず、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結され
    た標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）により提供される）と、
    （ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
    を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法。
  2. 前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、（ｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング
    部位とハイブリダイズされた前記断片は、前記ＨＯのハイブリダイゼーション以前に延長されて、及び／または（ｉｉ）前記断片の延長前に前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイズされた場合、前記断片の延長は、前記ＣＴＯから前記ＨＯを切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅ）させて、これによって、前記延長デュープレックスの形成は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）及び／または切断によるＨＯの消耗により、前記段階（ｅ）で前記ＨＯとＣＴＯ間のハイブリッドの形成を防止することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＨＯまたは前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の１つを有して、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記方法は、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＨＯをさらに１つ使用して実施されて、前記２つのＨＯは、前記ＣＴＯに互いに近接してハイブリダイズされて、前記ＨＯの１つは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＨＯの他の１つは、相互作用的二重標識の他の１つを有し、前記ＣＴＯと２つのＨＯ間のハイブリッドが形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯと２つのＨＯ間のハイブリッドが非形成された場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. （ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲ
    ット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
    （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
    （ｅ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、前記段階（ｄ）の結果物とをハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、単一標識で標識されて、標識されていない他の１つは、固相基質上に固定化されるか、あるいは前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯ及びＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより固相基質上で前記単一標識からのシグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって固相基質上で前記単一標識からのシグナルが提供されない）と、
    （ｆ）前記固相基質上の前記シグナルを検出して、前記固相基質上で前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
    を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法。
  7. 前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、（ｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、前記ＨＯのハイブリダイゼーション以前に延長されて、及び／または（ｉｉ）前記断片の延長前に前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、前記断片の延長は、前記ＣＴＯから前記ＨＯを切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅ）させて、これによって、前記延長デュープレックスの形成は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーション抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）及び／または切断によるＨＯの消耗により、前記段階（ｅ）で前記ＨＯとＣＴＯ間のハイブリッドの形成を防止することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. （ｉ）前記ＣＴＯは、単一標識を有して、前記ＨＯは、固相基質上に固定化されるか、あるいは前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、または（ｉｉ）前記ＨＯは、単一標識を有して、前記ＣＴＯは、固相基質上に固定化されるか、あるいは前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  9. （ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する）と、
    （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
    （ｅ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリダイゼーションに適する条件下で、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、前記段階（ｄ）の結果物とをハイブリダイズさせる段階（前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これによって、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示す第１シグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスは、前記ＣＴＯとＨＯのハイブリダイゼーションを抑制し、これによって、前記ＣＴＯと非ハイブリダイズされたＨＯの存在を示す第２シグナルが提供されて、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識によって提供される）と、
    （ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドが二本鎖形態を維持する指定温度下で前記第１シグナルまたは前記第２シグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示して、前記第１シグナルと第２シグナルとの差は、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在または非存在を決定できるようにして、前記核酸試料内の前記ターゲット核酸配列の存在または非存在を示す）と、
    を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法。
  10. 前記段階（ｄ）は、ＨＯの存在下で実施されて、（ｉ）前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた前記断片は、前記ＨＯのハイブリダイゼーション以前に延長されて、及び／または（ｉｉ）前記断片の延長前に前記ＨＯが前記ＣＴＯとハイブリダイズされる場合、前記断片の延長は、前記ＣＴＯから前記ＨＯを切断または分離（ｄｉｓｐｌａｃｅ）させることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＨＯまたは前記ＣＴＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ＨＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＣＴＯは、前記相互作用的二重標識の他の１つを有して、前記ＣＴＯとＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯとＨＯとが互いに離れている場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  13. 前記方法は、前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＨＯをさらに１つ使用して実施されて、前記２つのＨＯは、前記ＣＴＯに互いに近接してハイブリダイズされて、前記ＨＯの１つは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の１つを有して、前記ＨＯの他の１つは、前記相互作用的二重標識の他の１つを有し、前記ＣＴＯと２つのＨＯがハイブリダイズされてハイブリッドを形成する場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルと、前記ＣＴＯと前記２つのＨＯとが互いに離れている場合の前記相互作用的二重標識からのシグナルとが異なる位置に前記相互作用的二重標識が位置することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  14. 前記ＣＴＯ及びＨＯの１つは、固相基質上に固定化されるか、または前記段階（ｆ）におけるシグナル検出前に固相基質上に固定化されて、前記シグナルは、前記固相基質上で検出されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  15. 前記ＨＯは、前記ＣＴＯとのハイブリダイゼーションにおいて、前記断片と競争するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  16. 前記ＨＯは、前記断片またはその延長産物により切断されないことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＰＴＯ、前記ＣＴＯ及び／または前記ＨＯは、延長されないようにその３’−末端がブロッキングされていることを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  18. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブであることを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  19. 前記方法は、前記段階（ａ）〜（ｆ）の全部または一部の段階を、変性を含み反復的に行うことを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  20. 前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するための方法であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のアップストリームオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＨＯは、少なくとも２種のＨＯを含むことを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含むことを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  22. 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で行われることを特徴とする、請求項１、６及び９のいずれかに記載の方法。
  23. （ａ）ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない）と、
    （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは、形成されない）と、
    （ｅ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）の存在下で、一定温度範囲にかけて前記段階（ｄ）の結果物に対するメルティング分析またはハイブリダイゼーション分析を実施する段階（前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供し、前記ターゲット核酸配列が前記核酸試料内に存在する場合、前記延長デュープレックスが形成されて、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、これによって前記シグナルが提供されず、前記シグナルは、（ｉ）前記ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＨＯに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）により提供される）と、
    （ｆ）前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを検出する段階（前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在は、前記ターゲット核酸配列の非存在を示し、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの非存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）と、
    を含み、ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法。
  24. 請求項１から５のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
    （ａ）アップストリームオリゴヌクレオチド（前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む）と、
    （ｂ）ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされて、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
    （ｃ）ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされた断片は、延長され、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を生成して、延長デュープレックスを形成し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されない）と、
    （ｄ）前記ＣＴＯに相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＨＯ）と、を含み、
    前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在しない場合、前記延長デュープレックスは形成されず、前記ＣＴＯとＨＯは、ハイブリッドを形成して、これにより前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの存在を示すシグナルを提供し、前記核酸試料内に前記ターゲット核酸配列が存在する場合、前記延長デュープレックスが形成され、前記ＣＴＯとＨＯ間のハイブリッドの形成を防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）して、これにより、シグナルが提供されず、
    前記キットは、（ｉ）ＨＯに連結された標識、（ｉｉ）ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）ＨＯに連結された標識及びＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）を追加的に含む、
    ＰＴＯ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＮＨ）アッセイにより、核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するキット。
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