JPH06501389A

JPH06501389A - 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH06501389A
Application number: JP3516590A
Authority: JP
Inventors: クック，フィリップ・ダン; サングービ，ヨゲシュ，シャンティラル
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: EP0544824A1; AU8720591A; DE69126530T2; ATE154246T1; BR9106702A; EP0544824A4; CA2088258A1; DE69126530D1; JPH0874B2; EP0544824B1; CA2088258C; WO1992002258A1; AU641565B2; US5614617A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド発明の分野本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチド治療、診断および研究試薬に有用なヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの設計、合成および応用に関するものである。ヌクレアーゼ分解に耐性であり、ＤＮＡおよびＲＮＡの活性を変調できるピリミジン修飾オリゴヌクレオチドが提供される。本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用するタンパク質生産の変調法も提供される。

発明の背景感染性疾患状態を含む哺乳動物の身体状態の多くがタンパク質によって引き起こされることが知られている。そのようなタンパク質は、直接的またはそれらの酵素機能を介して、動物および人間の多くの疾患の主要な割合を占める。

古典的な治療法はそれらのタンパク質での相互作用に注目し、それらの疾患の発生または機能を広げる疾患の緩和に努力して来た。しかしながら最近、それらタンパク質の合成を指示する分子、細胞内ＲＮ＾、との相互反応によりそのようなタンパク質の実際の生産を緩和する試みがなされた。タンパク質の生産に干渉することにより、最大の効果および最小の副作用の治療結果を生じることが期待された。

特定の遺伝子発現を阻害する研究のひとつは、アンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の使用である。

アンチセンス法とは比較的短いオリゴヌクレオチドの単鎖ｍＲＮＡまたは単鎖ＤＮＡへのノゾブリダイゼーンヨンにより、これら細胞内核酸の正常、必須な機能が破壊される。ハイブリダイゼーションはＲＮＡのワトソンークリック塩基対または単鎖ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドの配列特異的水素結合である。このような塩基対は互いに相補的であると言う。核酸機能の崩壊を導く自然発生的な出来事がＣｏｈｅｎによりオリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス阻害剤（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ・餅ｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＣＲＣ社、ボカラトンＦＬ　１９８９：ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　ＦＬ、　１９８９）で述べられている。これらの著者はフタツノ可能な終結反応のタイプを提案する。第一は、ハイブリダイゼーション制止はオリゴヌクレオチド阻害剤が結合した標的核酸中での終結反応を示し、これは単純な立体障害により本質的なタンパク質（多くの場合リボゾームである）の核酸への結合を妨害する。メチルホスホネートオリゴヌクレオチド、ミラーおよびテスオ（Ｐ、　Ｓ、　Ｍｉｌｌｅｒ　＆　Ｐ、　０．　Ｐ丁ｓ’　０．　）　Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｖｏｌ、　２．　ｐｐ、　１１７−P２８（１９８７）　；およびα−アノマーオリゴヌクレオチド、コーエン４ｉＪＩ（Ｃｏｈｅｎ　Ｊ、　Ｓ、　）オリゴヌクレオチド・遺伝子発現ノアンチセンス阻害剤（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ＣＣＲＣ社、ボカラトンＦＬ　１９８９）はハイブリダイゼーンヨン制止により核酸機能が破壊されると思われる、徹底的に研究されたふたつのアンチセンス剤である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する第二のタイプの終結反応は、細胞内ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮ＾の酵素的開裂が関与する。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、これらはデオキシリボ型でなければならないが、標的ＲＮＡとハイブリダイズし、そしてこの二重鎖はＲＮａｓｅＨ酵素を活性化してｌ？ＮＡ鎖を開裂し、すなわちＲＮＡの正常機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはアンチセンス剤の顕著な例であり、このタイプのアンチセンス終結反応により作用する。

注目すべき研究が治療を目的とするアンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の応用に対して同けられている。診断、研究試薬および有力な治療剤としてのオリゴヌクレオチドの応用にはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が大量に合成できること、細胞膜を通過することまたは細胞により取り込まれること、標的ＲＮ＾またはＤＮＡに適当にハイブリダイズすること、および核酸の機能を引き続き終結または破壊することが必要である。このような重要な機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期耐性に依存する。

天然に発生するオリゴヌクレオチドおよび存在するオリゴヌクレオチド類似体のこれらの目的のための、特にアンチセンス治療のための重大な欠点は、今後”ヌクレアーゼ”という細胞内および細胞外に局在する、偏在する種々の核酸溶解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）酵素による投与したオリゴヌクレオチドの酵素的分解である。非修飾オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼにより迅速に分解されるので有用な治療薬にはなりそうもない。オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にするための修飾はそれゆえに大いなる要望である。

ヌクレアーゼ耐性を増大するためのオリゴヌクレオチドの修飾はこれまで糖−リン酸骨格上で一般的に行われ、特にリン原子上で行われた。ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミダイトおよびホスホトリエステル（リン酸メチル化ＤＮＡ）は種々の水準のヌクレアーゼ耐性を有すると報告されている。しかし特異的ＤＮＡまたはＲＮＡへアンチセンスオリゴヌクレオチドが正確に結合する能力はアンチセンス法においては基本であり、修飾リンオリゴヌクレオチドは種々の程度のヌクレアーゼ耐性を提供するが、一般的に劣ったハイブリダイゼーション特性に悩まされる。

この低質なハイブリダイゼーシヨンの理由の一つはリン原子のプロキラルな性質によるものかもしれない。修飾リンオリゴヌクレオチドの内部リン原子上の修飾は、ＲｐおよびＳｐ立体異性体を生じる。立体規則性オリゴヌクレオチド（すべてがＲｐまたはＳｐリン酸結合）の実際の合成は知られていないから、修飾リン原子をもつオリゴヌクレオチドはｎ２個の異性体を有する（ｎはオリゴヌクレオチドの長さまたは塩基の数に等しい）。さらにリン原子上の修飾はホスホジエステル結合について不自然な嵩を有し、糖−リン酸骨格の配置、および結果的に二重鎖の安定性に干渉する。リン原子修飾の効果は、同じ標的に対する非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに比して標的核酸への低質なハイブリダイゼーションを引き起こす。

オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対能力は、特定のハイブリダイゼーション複合体の溶解温度を測定することにより比較できる。溶解温度（Ｔｍ）はダブルへりックスの物理性質の特徴であるが、コイル（パブリダイズしていない）に対して５０％へリックスが存在する時の温度を表す。ＴＩｌはＵＶスペクトルを使用してハイブリダイゼーションの形成および崩壊（溶解）を決定することにより測定される。ハイブリダイゼータ３ン中に起こる塩基スタッキングはＵＶ吸収の減少を伴う（濃色効果）。結果として、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを指示する。高いＴｍはど鎖の結合力がより強い。非−ワトソンークリック塩基対はＴｍに関し強い不安定効果をもつ。結局、塩基対の絶対的な正確さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡへの至適な結合が得られることが必要なようである。

メチルホスホネートおよびホスホロチオエートのハイブリダイゼーション特性の重大な減少が報告された：Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｓ、　、編集オリゴヌクレオチド：遺伝子発現の鎖において終結反応であるＲＮＡａｓｅ　Ｈによる分解を活性化せず、かわりにリボゾーム上に局在するヘリックス溶解活性から逆になり得るハイブリダイゼーション制止により作用する。ホスホロチオエートは多くのヌクレアーゼに高度に耐性である。しかしながら、ホスホロチオエートは典型的には非−アンチセンス型作用を表し、特に非特異的結合による種々の酵素の阻害を表す。配列−特異的オリゴヌクレオチドによる酵素阻害は、アンチセンス化学療法の種々の基礎を危うくする。

それゆえに、ヌクレアーゼに耐性を示すように、ＲＮａｓｅ■終結反応を活性化するために、ならびに適当な強さおよび正確さでその標的ＲＮＡ（またはＤＮＡ）とにハイブリダイズする修飾されたオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド診断、治療および研究のために大いに望まれている。

発明の目的発明の主要な目的はアンチセンスオリゴヌクレオチド診断、研究試薬および治療において使用されるオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。

発明のさらなる目的はＤＮＡまたはＲＮＡの活性を変調するに効果的なオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。

発明のもうひとつの目的は、所望しない、または毒性の副反応を引き起こすことが少ないと思われるオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。

さらに発明のもうひとつの目的は、動物の身体状態、特に疾患状態をアッセイするための研究および診断法および物質を提供することである。

発明のさらなる目的はＤＮＡおよびＲＮＡの活性の変調を通じて疾患の処置に関する治療および研究法および物質を提供することである。

これらのおよび他の目的は本明細書および付髄する請求の範囲の吟味により当業者に明らかなものとなろう。

発明の概要本発明によれば、ヌクレアーゼ分解に耐性があり、ならびにＤＮＡおよびＲＩＩＩＡの活性を変調する組成物が提供される。これらの組成物は、そのなかに修飾されたピリミジン塩基を包含するオリゴヌクレオチドを含み、その標的部分はＤＮＡおよびＲＮＡの単鎖または二重鎖のあらかじめ選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼ−ンヨンできる。ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドは、単鎖ＤＮＡおよびｌ？ＮＡを認識して二重鎖を形成するか、または二重鎖ＤＮＡおよびｌ？Ｎ＾と二重鎖を形成する。

ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、結合基を介して共に連結した核酸塩基の鎖からなる。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの標的部分は約５から約５０核酸塩基の長さの範囲でよい。しかし本発明の好適な態様によれば１５塩基長の標的配列が至適と思われる。

本発明のピリミジン修飾オリゴヌクレオチドはチミン、ウラシルまたはシトシンのようなピリミジンまたはグアニンまたはアデニンようなプリン、またはそれらの修飾物である塩基を含み、選択配列中に配置される。このような塩基の糖部分は、チオキシリボまたはリポース糖であってよい。塩基を結合する基はともに通常の糖リン酸核酸骨格であってよいが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデートのようなアルキルホスホネート、またはピリミジン修飾オリゴヌクレオチド特性をさらに増大するに有用な他の修飾骨格で修飾されることができる。例えば、ホスホジエステル結合は炭素またはエーテル結合に置き換える事もできる。

本発明の他の好適態様によれば、標的部分はオリゴヌクレオチドの類似体であり、ここで少なくともピリミジン塩基、チミン、シトシンまたはウラシルのひとつが修飾された核酸塩基に置換されており、これはワトソンークリック水素−結合塩基対則（ＴとＡＳＣとＧおよびＵとＡ）に対して正確であり、さらにオリゴヌクレオチドに対してヌクレアーゼ耐性を付与する。ピリミジン塩基または複数のピリミジン塩基の修飾は好ましくはピリミジン環の５または６位で起こる。別法では、ひとつまたはひとつ以上のピリミジン塩基がピリミジン環の５および６位の双方で修飾されてもよい。

５および６位で起こり得る置換にはピリミジンの５および６位の炭素原子についてヘテロ原子の付加、またはメチル、ヒドロキシル、エーテル、アルコール、ベンジルまたはフェニル基の付加を含んでもよい。修飾はまたニトロ基、チオール基、ハロゲン基またはフルオロカーボン基を含むハロカーボン基を含むことができる。

択一的に、修飾はピリミジン環の５および６位への基質の融合を介して形成される炭素環または複素環であってもよい。５および６位で起こる付加は同じであってもなくてもよい。

生成した新規オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に耐性であり、野生型（ＤＮＡ−ＤＡＮおよびＲＮＡ−ＤＮＡ）二重鎖およびホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミダイトおよびホスホトリエステルを含有する現在知られているリン修飾オリゴヌクレオチドアンチセンス二重鎖に比してより高質のハイブリダイゼーション特性を示す。本発明は生物によるタンパク質生産を変調する方法も対象とし、生物を前述の考察に従って配合された組成物に接触させることから成る。変調されるべきＲＮＡまたはＤＮ＾部分は予め選択され、形成が変調されるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮ八へ分を含むようにすることが好ましい。採用されるべき組成物、　の標的部分は、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡの予め選択された部分と相補的になるように選択され、これはその部分に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドとなる。

本発明はまた所望しないタンパク質を生産することによって特徴付けられる疾患をもつ生物の処置法も対象とする。この方法は生物を前述の考察による組成物と接触させることから成る。組成物は好ましくは生産が抑制されるタンパク質をコードするメツセンジャーＲＮ＾と特異的に結合するために設計されたものである。

本発明はさらに生物体または細胞中で異常ＲＮ八へ子または正ｔＲＮへ分子の異常または不適当な発現の存在または不存在を検出するための診断法を対象とする。

本発明はまた研究および診断の目的のためにＲＮＡの選択的結合に関する方法も対象とする。このような選択的な強い結合は、そのようなＲＮＡまたはＤＮＡがヌクレアーゼ分解耐性で既知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体よりも強く且つより正確にハイブリダイゼーションする、本発明の組成物と相互作用することによって達成される。

好適な態様の詳細な説明本発明によるＲＮＡまたはＤＮＡ分子の活性変調のために有用な組成物は、一般的に標的配列のオリゴヌクレオチドを含有する修飾ピリミジンから成り、これはＤＮＡまたはＲＮ八へ子の単鎖または二重鎖の予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし、それはヌクレアーゼ耐性である。

一般的に合成が最終的に変調または全く抑制されるタンパク質の生産のためのＤＮＡまたはＲＮＡ配列、またはそれに関与するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を選択することが望まれる。組成物の標的部分は一般的にオリゴヌクレオチド類似体である。既知の方法論の固体状態合成を介して簡便に合成され、相補的になるかまたはｌ？ＮＡまたはＤＮＡの予め選択されたヌクレオチド配列と少なくとも特異的にハイブリダイズし得るようになる。核酸合成機は市販されており、その使用法は一般的に当業者が所望するであろうほぼ任意の妥当な長さのオリゴヌクレオチドを生成するに効果的であると知られている。

本発明の文脈において、”オリゴヌクレオチド”という用語は天然に存在する塩基からの特別配列中に形成された複数の連結したヌクレオチド単位、および天然のホスホジエステル結合によるヌクレオチド内結合を介したペントフラノシル糖基を言う。これらのヌクレオチド単位はグアニン、アデニン、シトシン、チミンまたはウラシルのような核酸塩基であり得る。糖基はデオキシリボースまたはリボース糖であってよい。この用語は天然に存在するまたは天然に存在するサブユニットからの合成種の双方を言う。

用語としての”オリゴヌクレオチド類似体”は、本発明との関連において、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが天然には存在しない部分を有する一部分を言う。

オリゴヌクレオチド類似体は改変された糖部分または糖−内結合を有し、例えばホスホロチオエートおよび当業界にて知られた他の硫黄含有種である。オリゴヌクレオチド類似体は改変された塩基単位または本発明の精神と一致する他の修飾も含むことができ、ならびに特にそのような修飾において、特定オリゴヌクレオチドのアンチセン治療、診断または研究試薬使用を利用するために、オリゴヌクレオチド組成物のヌクレアーゼ耐性を増加できる。

本発明のいくつかの態様においては、組成物のヌクレアーゼ耐性を増加させるためのに、ヌクレオチド塩基のある部分が置換され、一方オリゴヌクレオチド結合能の完全さが維持されることが一般的に好ましい。そのような置換は、ひとつまたはひとつ以上のピリミジン環の５または６位においてピリミジン環のこれらの位置の炭素原子をヘテロ原子に置換することにより生じ得る。択一的に、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性はピリミジン環の５および６位に置換基を付加することにより増加できる。

置換基は、メチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコール、エステル、ペンシル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、ハロカーボン、または融合炭素環又はヘテロ原子含有種であり得る。本発明の幾つかの好適な態様によれば１、ピリミジン環の置換は５または６または５および６双方のアザであり得る。本発明の他の好適な態様によれば、５または６位に付加される置換基はひとつまたはそれ以上のニトロ−、メチル−、ブロモ−、イオドー、クロロ−、フルオロ−、トリフルオロ−、トリフルオロメチル−１２，４−ジニトロフェニル−、メルカプト−１またはメチルメルカプト−基であり得る。ヌクレアーゼ耐性に対する使用のために好適でもある他の付加はエーテル、チオエーテル、アルコールおよび＋１ｓ−Ｃ，ＭｅＳ−Ｃ−のようなチオアルコール、Ｏ［ｌ−Ｃ− 、ＭｅＯ−Ｃ−、ＨＯＣＨ２−Ｃ−およびピリミジン環の５または６位を介して融合されたシクロペンチル、シクロヘキシルおよびイミダソ環であり得る。

したがって、本発明のいくつかの好適な態様には修飾されたピリミジン塩基または構造：を有する塩基が包含され、ここでＸ＝ＯｔｌまたはＮＨ３，およびＡおよびＢは同じかまたは異なっていてもよく、ならびにＣ−低級アルキル、Ｎ、　Ｃ−ＣＦ４．　Ｃ−Ｆ、　Ｃ−Ｃ１，Ｃ−Ｂｒ、　Ｃ−１，Ｃ−フルオロカーボンを含むＣ−ハロカーボン、Ｃ−Ｎｏｔ、　Ｃ−０ＣＦｓ、　Ｃ−３Ｒ，Ｃ−３ＣＨｓ、　Ｃ−ＯＨ，Ｃ−０−低級アルキル、Ｃ−Ｃ１＋２０Ｈ，Ｃ−ＣＨ２Ｓ１１．　Ｃ−ＣＬＳＣＨ３，Ｃ−ＣＢ２０ＣＨ３，Ｃ−ＮＦ２．　Ｃ−ＣＨ２！ｔＨ２，Ｃ−アルキル−）Ｊｌ’１２DＣ−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリール、Ｃ−置換ベンジル、または＾およびＢのひとつが上記のものであり、他がＣ−Ｈ；またはＡおよびＢが一緒にＡおよびＢを介してピリミジン環に融合した炭素環または複素環の部分である。＾およびＢのひとつまたは双方がＣ−低級アルキル、Ｃ−〇−低級アルキル、Ｃ−０ｆ（、Ｃ− フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボン、まはたＣ−ハロゲンであることが好ましい。他の好適な態様によれば、少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ハロゲンまたはＣ−フルオロカーボン、特にＣ−トリフルオロメチルを含むＣ−ハロカーボンである。他のフルオロカーボンはＣ−Ｃ（ＣＦり！、　Ｃ−ＣＦ２−ＣＦ２．およびＣ−ＣＦ　ｘ　−ＣＦ　！　−ＣＦ　ｓである。ハロゲンはフッ素、臭素、塩素およびヨウ素を含む。その他の好適な態様によればＡおよびＢのうちのひとつまたは双方は窒素原子である。Ａが窒素原子であることがなお一層好ましい。他の態様によれば、Ａはｃ−ｃＩｌ１３．またはＣ−ＣＦ、且つＢは窒素、または＾はＣ−Ｂｒ且つＢは窒素である。

少なくともひとつの修飾ピリミジンが該オリゴヌクレオチド類似体の一つの末端に存在することが好ましく、特に該オリゴヌクレオチドの３゛末端が好ましい。

他の好適な態様によれば、オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドの３゛末端に最高３つの修飾ピリミジンを含有する。他の態様において少な（とも約１％の該ピリミジンが修飾される。他の態様によれば大量の修飾、例えば少なくとも該ピリミジンの約１０％以上、すなわち２５％、５０％でさえも、または実質的に該ピリミジンの全部を有することが好ましい。

修飾ピリミジンに結合した糖部分はリボースまたはデオキシリボース糖のいずれかであってよい。修飾ピリミジンの糖結合基はホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミダイト、ホスホトリエステルを含むアルキルホスホネートまたはリン酸アルキレート構造にも修飾されることができる。他の態様において、オリゴヌクレオチド類似体は、炭素またはエーテル結合に置換された修飾ピリミジンの糖結合基を有することができる。

治療のためには、薬学的に受容できるキャリアー中にオリゴヌクレオチド類似体が調製されることが便利である。

本発明のい（つかの態様によれば、さらに修飾されたピリミジン修飾オリゴヌクレオチドを採用することが好ましい。この意味において、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド類似体とは一般的に天然のオリゴヌクレオチドと同様であるが、ひとつまたはそれ以上の有意な方法で修飾されたものを言う。

そのような修飾は発明の糖骨格において起こる。ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドの標的配列がメツセンジャーＲＮＡおよびＤＮＡが存在する（これは全組成物の標的である）細胞の細胞内空間に浸透する能力を増強することが好ましい。

それゆえにオリゴヌクレオチドが細胞内空間に浸透しやすくするために一般的にオリゴヌクレオチドに修飾を施して、実質的に天然の形態よりも少ないイオン性であることが好ましい。この目的を達成するための現存する、または今後開発されるであろう方法は本発明の実施に従い採用されるであろう。現在ではホスホジエステル結合への置換が好ましいと見いだされているが、この置換は天然に存在する結合よりもより少ないイオン性であるばかりでなく、実質的に非−キラル性である。理解されることであろうが、ホスホジエステル結合のリン原子は”ブローキラル”である。メチルホスホネートおよびホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドにおいて行われるようなリン位での修飾は、本質的にキラル構造を生じる。キラリティーは各々のキラル中心で細胞内分子と異なる反応をするであろうふたつの異性体を生じる。このような未解決の異性体混合物は生成した組成物が細胞内空間へ運搬されることを阻害、または特異的標的であるＲＮＡまたはＤＩＩＡに対するハイブリダイゼーションの親和性または特異性を減少させ得る。すなわち、すべて、またはい（つかのホスホジエステル結合の代わりに実質的に非 −イオン性、実質的に非−キラルな実在物を採用することが好ましい。この目的に関して、短鎖アルキルまたはノクロアルキル構造、特にＣ２−Ｃ４構造が好ましい。酸素官能性のひとつの除去を含む糖構造の修飾はそのような実質的に非− キラル、非−イオン性の置換体をこの位置に導入することを可能とする。

本発明の目的を達成するために、Ｓ−Ｐ、　Ｍｅ−Ｐ、　ＭｅＯ−ＰまたはＥ１２Ｎ−Ｐ（これはホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステルまたはホスホアミダイト）を０−Ｐ（ホスホジエステル結合）と置換することが意図される。これらの置換の幾つかの場合は、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド特性を増強するものと思われる。

本発明の組成物の標的部分は、好ましくは５から約５０塩基単位を有するオリゴヌクレオチド類似体である。より好ましくは、このような官能性は８がら約４０塩基単位を有し、そしてさらに好ましくは約１２から約２０塩基単位が採用されるべきである。約１５塩基単位を有するオリゴヌクレオチド類似体は本発明の特定の態様の実施に好ましい。

標的部分は変調のために選択されたＲＮＡまたはＤＮＡの予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできるように適合される。本発明のひとつまたはそれ以上の態様の実施のために特に適するオリゴヌクレオチド類似体は、修飾されたリボースまたはデオキシリボースピリミジンのひとつまたはそれ以上のサブユニットから成る。ピリミジン環の５または６位で起こり得る置換はメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコール、ベンジルまたはフェニル基の付加を含んで良い。この修飾はニトロ基、チオール基またはハロゲン基の付加も含むことができる。

択一的に、この修飾は５および６位に融合した炭素環またはへテロ原子含有環であ得る。５および６位に起こる付加は同じであってもなくても良い。

これらの修飾された塩基は互いに結合し、ならびに糖結合基を介してオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の残部と結合する。結合基はここに記載された構造の任意のものでよく、オリゴヌクレオチドの糖部分と結合でき、本発明の組成物の標的部分を形成する。これらの糖結合基はホスホジエステル構造またはそのような誘導体から成ることが好ましい。ホスホジエステル構造の誘導体には、硫黄、メチル、メチル酸化物または酸素についてはアミン基を含むことができる。糖リン酸核酸骨格はホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミダイトまたはホスホトリエステル部分として修飾できる。ホスホジエステル結合または炭素またはエーテル結合に置換されることもできる。

本発明の他の態様によれば、結合部分は、修飾したピリミジンと修飾オリゴヌクレオチドの３゛終結末端との直接的な付着を可能とするように考案された。すなわちブロモメチルケト基のようなエステル前駆体は、シメトキントリチル基（ジメトキシトリフェニルメチル基）で５゛−ヒドロキシ保護を有する修飾されたピリミジンヌクレオチドの３′−ヒドロキシルに付加でき、必要であれば例えばヌクレオシドのント／ン系についてはベンゾレート保護基のような適当な保護基で保護されたピリミジン複素環である。もし標的配列が終結３゛−チミンまたは一ントシン塩基を有するならば、プロモメヂルケトリン力−を含有する所望の修飾チミンまたはシトンン塩基は、３゛−ヒドロキシ保護を介して結合した正常ヌクレオチドを含有する調節ボアーガラス（ＣＰＧ）固体支持体へ付着させるための第一単量体として利用できる。修飾したピリミジンとＣＰＧに付着したヌクレオシドを付着させるエステル結合に感受性の塩基は通常の濃水酸化アンモニウム条件下で開裂でき、これはＣＰＧ支持体からオリゴヌクレオチドを回収するために利用される。これは修飾したチミンまたはントンンをその３′−末端に有する修飾オリゴヌクレオチドを可能にするであろう。

核酸溶解酵素によるオリゴヌクレオチドの開裂には、酵素−基質複合体、またはとくにヌクレアーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成が必要である。ヌクレアーゼ酵素は適当な付着に関してオリゴヌクレオチド上に局在する特異的結合部位が必要である。ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに付着しないようにもしオリゴヌクレオチド結合部位が除去されたり隠されたりすると、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドが生じる。配列−特異的回文的二重鎖ＤＮＡを開裂する制限エンドヌクレアーゼの場合は、特定の結合部位、例えばプリン環の３−および７− 位の窒素原子が結合部位として必要であると同定されている。これらの部位をひとつまたはそれ以上の除去またはヌクレアーゼが認識配列中のこれらの特別な位置へ接近することを妨害することにより、特異的ヌクレアーゼに対する種々の水準の耐性が提供された。

不規則な構造−活性関連性に関する研究が行われ、適当なハイブリダイゼーション特性を維持するヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドが見いだされた。チミンおよびシトシンのリポヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの５−および２／または６−位に対する一連の修飾が行われた。これらの修飾ヌクレオシドは配列−特異的オリゴヌクレオチドに固相核酸合成を通じて挿入された。新規アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれらのヌクレアーゼによる分解耐性能力および修飾していない親のオリゴ−ヌクレオチドに比較してのハイブリダイゼーション特性がアッセイされた。なぜなら核酸ピリミジン位置の５−および６−位の好適な態様が選択された末端修飾およびこれらの位置でのアザ／デアザのような環修飾は、必要なワトソンークリック塩基対水素結合パターンに立体的に干渉するとは思われないからである。しかしながら、環系においてすでに発見された電気的変化はそのような見かけは重要ではない複素環変化から生じる。

これらの電気的変化は二極モーメントを芳香族系に加え、ならびに／または存在する二極モーメントの方向および強さを変えることができる。ＰＫａ強度は電気的摂動により影響されるであろう。アザ／デアザでの末端または珊変化は理系の電子性および核性を変化させて（ヌクレアーゼの分解活性のためにはオリゴヌクレオチドの核酸塩基に対して共有結合形成が要求されるが）、ヌクレアーゼが作用しないようにできる。

構造活性の関連性を研究している中、ピリミジン、チミン、ノドシンおよびウラシルの５−および／または６−位における末端およびアザ／デアザ修飾がヌクレアーゼ耐性を提供し、これはヌクレアーゼ耐性であると知られているホスホロチオエートに匹敵し、さらに修飾したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は未修飾の親オリゴヌクレオチドと同等かより良かった。

本発明のいくつかの態様において、ピリミジン核塩基の修飾は修飾されるべきアンチセンスオリゴヌクレオチドの約５０％となるであろう（４つのうちの２つの塩基が可能である）。６−アザ−チミンおよび６−アザ−シトシン（１５塩基のうちの８）に置換されたすべてのチミンおよびノドシンを有する修飾配列は、未修飾の親配列に比べてＴｈが約１０％低いヌクレアーゼ耐性を表した。ヌクレアーゼ耐性および結合安定性の好適な組み合わせは、オリゴヌクレオチドの３−末端に１から３の修飾ピリミジンを配置することから生じる。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療、研究試薬として、およびキットに使用できる。治療のための使用に関し、オリゴヌクレオチド類似体はあるタンパク質によって生じた疾患にかかっている動物に投与される。そのような疾患にかかっていると疑われる患者にその疾患の症状を減少するのに効果のあるオリゴヌクレオチド類似体の量を投与することが好ましい。そのような処置法に関する至適な投与量および処置計画を決定することは当業者に既知の範囲内である。

本発明の治療剤は経口、静脈内または筋肉内のように内部適用されることが好ましい。経皮、局所または損傷部内などの投与の他の形態も有用である。座薬中の包含物としても有用である。薬学的に受容できるキャリアーもある態様においては有用である。

寡輿男実施例１６−アザ−５’−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホスホアミジチル）チミジンの合成、即ち６−メチル −２−（５’−（！−ジメトキシトリフェニルメチル−３′−０−β−ンアノエチルジイソブロピルホスホアミジチル−２′−デオキシ−β−り一エリスローベントフラノシル）−１，２゜４−トリアジン−３，５（２Ｂ、４Ｈ）−ジオンＡ、６−メチルー３．５−ビス（トリメチルシロキン）−１，２，４−トリアジンの合成濃縮器および乾燥管に取り付けられた回転ボトムフラスコ中（５軸１）の６−アザチミン（アルドリッチ化学社から購入Ｘ５．　Ｏｇ、３９．４醜■ｏ１）、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）（１５ｍｌ）、およびりｏｏトリメチルシラン（ＴＭＳＣＩＸｏ、　５ｍ１）混合物を油浴中にて加熱（１５０℃）により還流する。ＮＨ，Ｃ１を白色粉末として濃縮器中に回収する。透明な溶液が得られた時（〜１時間）、過剰のＨＭＤＳ／ＴＭＳＣＩを３０℃／トル（浴温度１００℃）で蒸留により除去した。残渣油は真空下（０，１トル）の乾燥で結晶化し６．５７ｇ（６１％）の６−メチル−３，５−ビス（トリメチルシロキシ） −１，２，４−トリアジンを得た、ｍｐ　４３℃。

Ｂ、　２−（２−デオキシ−３，５−ジー０−ｐ−トルオイル−β−ｐ−エリスローペントフラノシル）−６メチルー１．２．４−　トリアジン−３，５（２Ｂ、４Ｅ［）−ジオンの合成乾燥ＣＨＣＩｇ（３０ｈｌ）中の６−メチル−３，５ −ビス（トリメチルシロキシ）−１，２，４−トリアジン（４，０ｇ、　１４．７ｍｏｌ）および２−デオキシ−３，５−ジー０−ｐ−トルオイル−ａ−Ｄ−エリスローペントフラノシルクロライド（４，８ｇ　１２．４ａｎｏｌ）を無水状態で室温で撹拌した。ＣｕＩ（２４ｇ、　１２．４ａｎｏｌ）をこの溶液に加え、生成したスラリーを３時間環境温度で撹拌し、このとき薄相トロマドグラフィー（ＴＬＣ）にて反応が完了した事が示された。混合物を飽和水性ＮａＨＣＯｓ　（２００ｍｌ）で処理し、１５分間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌで洗浄した（２Ｘ５ｈｌ）セライトのバットを通して濾過した。有機相を飽和ＮａＣ１（２００ｍｌ）で洗い、乾燥（ＭｇＳＯ＜）および濃縮して粘着性の残渣を得た。この物質は本質的にＴＬＣで１スポツトであった。ＥｔＯ＾Ｃ／ヘキサン（１：１）を使用して短いシリカゲルカラムを通して迅速な濾過を行い、所望の幾つかの化合物の画分を得た。ＥｔＯＨからの残渣の結晶化は白色針状の生成物を与えた：３．６４ｇ（６３％）、ｉｐ　１７０℃。第二群は濾過物より回収した（７３ｈｇ、　１２．６％）。

０．６−アザチミジン［２−（２−デオキシ−β−ｐ−エリスローペントフラノシル）−６メチルー１゜２、４−　トリアジン−３，５（２Ｈ，４Ｈ））−ジオン］の合成無水ＭｅＯＨ（１５ｍｌ）中のブロックされたヌクレオシド、２−（２−デオキシ−３，５、−ジー０−ｐ−トルオイル−β−ｐ−エリスローペントフラノシル）−６−メチル−１，２，４−トリアジン−３，５（２Ｈ１４Ｈ）− ジオン、上記（４８ｈｇ、　１ａｎｏｌ）に乾燥ＮａＯＭｅ（５０ｍｇ）を加え、室温で撹拌した。１時間後のＴＬＣはトルオイル基の完全脱ブロッキングを示した。溶液を１ｍｌのＤｏｗｅｘ−５０（水素型）イオン交換樹脂を添加することにより中性にした。懸濁液を濾過し、濾過物を乾燥するまで減圧下で蒸発させた。残渣を水（３ｆｆｉｌ）に溶解し、ＣＫＩ、で洗浄した（３Ｘ５ｍｌ）。水性相は凍結乾燥させ、堅い泡（ｈａｒｄ　ｆｏａｍ）を与え、さらに０．１トルの真空デシケータ−中でＰ２Ｏ，上で乾燥させた。化合物は９６％の収率で得られ（２３０ｍｇ）文献値と比較した時、例えばＵＶ、ＮＩＩＲ，ＴＬＣおよび叩が同一であった。

Ｄ、　２−［２−デオキシ−５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−ｐ− エリスローペントフラノシル）−６−メチル−Ｌ　２．４−　トリアジン−３，５（２１１，４Ｈ）−ジオンの合成（６−アザチミジン５’　−ＤＭＴ）上記のように合成した乾燥ピリジン（１０ｋｌ）中のアザチミジン（２，４３ｇ、　１０ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、４．４’−ジメトキシトリチルクロライド（４，０６ｇ、１２ｉｉｏ１）および４−ジメチルアミノピリジン（１２ｈｇ、　１＋１１ｏｌ）を室温で加えた。生成した黄色い溶液を６時間室温で撹拌し、この時ＴＬＣでは反応が完了したことを示した。１ｌｅＯＨ（１０■１）を加え溶液を真空で濃縮した。残渣をＣＢｚＣｂ（２００＋＊１）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ）、次いで飽和ＮａＣ１（１００ｍｌ）で抽出し、次ぎに乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過物および洗浄物を混合し、濃縮して粘着性の残渣を得、ＥｔＯＡＣ／トリエチルアミン（９９／１）を使用してシリカゲルクロクトグラフィーで溶出にし精製した。適当な分画がプールされ、濃縮されて白色泡（３，１１１２ｇ　７０％）を得た：’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　６６゜５６（ｔ、　１Ｂ、　Ｃ，、Ｈ）および他のプロトン。

Ｅ、　２−ｒ２−デオキシー〇−（，４，４’ジメトキントリチル）−ｊ−ｐ− エリスローベントフラノフル］−６−メチル−１，２，４−トリアジン−３，５（２１１１，４Ｈ）−ジオン３’−０−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−３−ンアノエチルーホスホアミダイトの合成上記合成６−アザチミジン５°−ＤＭＴ、の撹拌した溶液に（乾燥ＴＨＦ　５０ｍ１中の１．６３ｇ３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１，、５６ｍ１．９＋＋ｍｏｌ）を加え、溶液を０℃に冷却した。

塩化Ｎ、Ｎ−ノーイソプロピル−β−ンアノエチルホスホンアミド（１，４２ｍ１．６ｍａ＋ｏｌ）を滴下により上記溶液に１５分間にわたって加えた。反応混合物を次ぎに室温で２時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍ１．１％のトリエチルアミンを含有する）を加え、溶液を飽和Ｎａｃ１溶液（２ｘ１．００ｍ１）で洗浄した。有機相を乾燥（１１１ｇＳＯ４）　Ｌ、溶媒を真空下で除去し、粘着性残渣を得た。精製物をＥｔＯ＾ｃ／トリエチルアミン（９９／Ｉ　Ｖ／Ｖ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで溶出し精製した。適当な両分をプールし濃縮して白色泡１．４１ｇ（６６％）を得た；’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）６６．６５（ｍ、１．ｃ岬）、１０．２（ｂｒｓ、　１．　ＮＨ）および他のプロトン。

６−アザ−ピリミジンの他の種類は６−アザ−２′−デオキシシチジン（６−Ａｚａ　ｄＣ）、６−アザ−２“−デオキシウリジン（６−Ａｚａ　ｄＵ）、　６ −アザ−５−メチルンチジン（６−＾ｚａ−５−メチルＣ）、６−アザ−５−ブロモウリジン（６−アザ−５−ブロモＵ）、５−フルオロンチンン（５−フルオロＣ）および５−プロモンチジン（５−ブロモＣ）を含む手順を使用して合成できる。加えて、５−アサウリジンは開始物質１．３．５．−　トリアジン−２，４（１，Ｅ、　３１１１）−ジオン（シグマ化学）から同様に合成できる。

実施例２５−および、′または６−修飾チミンおよびノドノン２゛−デオキシリボヌクレオシド−５゛−ＤＭＴ−３“−ホスホアミダイトからオリゴヌクレオチドへの転換法表工はＣＧＰ支持体上でのＤＮＡ合成合成手間して示している。５−および／または６−修飾チミン、ノドノン５−シメトキントリフェニルメチル−２′− デオキソリボヌクレオノドの合成前に、すなわち一般的に複素１および、／または糖において修飾を有する任意のヌクレオシドを、そのような修飾ヌクレオシドをオリゴヌクレオチド配列の各３゛末端に付着するためにＣＰＧ支持体に結合したヌクレオシドの５°−ヒドロキシルへ結合させる事ができる。

あるアンチセンスオリゴヌクレオチドの終結３゛−位に存在するであろう修飾したチミジンまたは２゛−デオキシシチジンは、それらの５’−ＤＭＴ（ノドノン４−エキソサイクリックアミノはベンゾイル化されている）により保護され、ピリジンおよびジメチルアミノピリジン中でトリフルオロ酢酸／ブロモ酢酸混合無水物で５０℃で５時間処理される。溶液を減圧下で蒸発さ也酢酸エチルに溶解した薄いシロップとしシリカゲルのカラムに通す。均一の画分を集めて、乾燥するまで蒸発させた。１０ｍ１のアセトニトリル溶液、１０マイクロモルの３’−０ −ブロモメチルエステル修飾ビリミジンヌクレオシドおよび１ｍｌのピリジン／ジメチルアミノピリジン（１：１）をゆっくりと（６０から９０秒）１マイクロモルのＣＰＧチミジンのカラム（遊離の５゛−ヒドロキシル基を与えるための標準的条件にしたがった酸処理を予め行ったもの：アプライドバイオンステムズ社）に注入して通す。ＣＰＧカラムに結合した他のヌクレオシドも採用できるであろう。溶出液を集めて、カラムに再び注入して通す。この工程を３度繰り返す。

ＣＰＧカラムを１０ｍ１のアセトニトリルでゆっくりと洗浄し、次にＡＢＩ３ｇＯＢ核酸合成機につける。表Ｉに記載されたオリゴヌクレオチド合成が今開始される。

ＣＰＧ支持体からチミジンエステル結合を開裂する濃水酸化アンモニウム脱保護の標準条件は、ピリミジン修飾ヌクレオシドＣＰＧヌクレオシドに始めに結合したチミジンとを連結するエステル結合も開裂する。

ＤＮＡの標準的合成は表工にしたがって、支持体上の１−１０マイクロモルのヌクレオシドを使用して、ＣＰＧ　ＬＣＡＡ上で完了できる。ヌクレオシドに結合したポリマーはアプライドバイオシステム社から購入した。合成は自動合成機（＾ＢＩ　３８０Ｂ）を使用して連続流（３，０−３，５ｍｌ／ｗｉｎ）で完了した。ホスホアミダイトの縮合は乾燥窒素下で行った。合成の完了時に、オリゴヌクレオチド開裂および脱保護を濃アンモニアで５５℃、２４時間処理して行った。最終生産物の純度および大きさはポリアクリルアミドゲルの電気泳動的分析で確認した。

ＣＰＧ支持体上でのＤＮＡ合成手順（１−１，０マイクロモルスケール）１、　ジクロロエタン　１：３０　５．０２、　ジクロロエタン中３％ＤＣＡ　１：３０　５．０３、　ジクロロエタン　１：００　３．５４、　アセトニトリル　２：００　５．０５、　縮合−ホスホアミダイト　１：００　３．５系内混合−ホスホアミダイト／ｃＨｓｃＮ。

およびＣＨ３ＣＮ中３％トリアゾールの２０マイクロモル繰り返す　１・００６、　酸化−ＣＢｓＣＢ：Ｈ２Ｏ：２−ルチジン中の　０：２０　ｉ、。

Ｏ，０１Ｍヨード７、　キャッピング（系内混合）　１：００　３．５ａ）　ＣＨ３ＣＮ中の２０％（ＡＣＯ）２：２−ルチジン（８０：２０）ｂ）　ＣＨ３ＣＮ中の３％ＤＭＡＰ繰り返す　１・００合成サイクルは４つの基本的な工程が組合わされている：ｌ）５°−ジメトキシトリチル保護基を除去するための酸処理；２）ＤＮＡについてのヌクレオシド− ３′−ジイソプロピルホスホアミダイトでのポリマー結合ヌクレオシドの縮合、および３）酸化、アセトニトリル中のヨードおよび水を使用してホスファイト結合をホスフェイト結合に変換する；および４）無水酢酸でのキャッピングおよびＤＭＡＰでの未反応部位のブロックオフ（ｂｌｏｃｋ　ｏｆｆ）および残存湿度の除去。

自動合成機により所望の配列を集成させた後、最終生産物をポリマーから開裂させ、脱保護し単離した。

脱保護はポリマー支持体を水酸化アンモニウム（Ｎ１１１４０Ｈ）で５５℃、２０時間処理することにより行った。組物質はＨＰＬＣ上のトリチル−により精製した。脱トリチル化は３％酢酸エチル続いて酢酸エチルでの抽出で行った。精製は塩化ナトリウム／エタノール沈殿（２ｘ）およびＨＰＬＣにより行った。すべての上記混合配列は試料のリン酸転移（ｋｉｎａｓｉｎｇ）および大きさの測定により特性決定した。

実施例３以下に掲げる６−アザ−チミン−修飾オリゴヌクレオチドの合成は実施例２に従って行われ、５−および／または６−修飾チミンまたはシトシン５−ジメトキシトリフェニルメチル−２゛−デオキシリボヌクレオシドの、ｃＰＧに結合したヌクレオシドの５゛ヒドロキシルへの付着が提供された。実施例１において提供された方法に従って合成されたホスホアミダイトは以下の配列を有するオリゴヌクレオチドに含有され、それらのヌクレアーゼ耐性特性ゆえに有用である。

６−アザチミジン（Ｔ゛）置換体を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置！曽Ｃユ５Ｔ’ＣＣＡＧＧ？ｃ？ＣＣＧＣＡ’！’Ｃ１’ｒ＋Ｃ（Ｊ（−コ−ｒ’ＧＴＣＣＧＣＡ？’Ｃ１，？ＣてｕｃＴＩＡ？ｌＧｃＭＧ’！’ＩＡｃ’５，７４３ＣＧＡＣＴＡＴＧＣＭ？’Ｔ’ＴＴＣ’　！２，１コ、１４’！”？”！’１ｃＴＡ？ＧｃＡＡ（ＹＡＣ’　！、２．３Ｇ？１Ｃ（Ｊ？’ＧＴ’ＣＧ？’ＡＣＧＣ’ 　２，６．ＪＩ、！ＩＣＣ？’Ｔ’ＣＣＣＣＴ’Ｃ“３，４．９＋　５リポキシゲナーゼゲノムからの選択配列１゛ホスホジエステル結合のｐが１３．１４および１５位置でＳにより置換されている３　パピローマウィルスゲノムからの選択配列４　単純へルペスウイルスゲノムからの選択配列ｓ２．３．９．１０．１５および１９位置での６アザーシチジン置換６　二重鎖として特に効果的と見い出された配列実施例４以下に掲げる６−アザージトシンー修飾オリゴヌクレオチドの合成は実施例２に従って行われ、５−および／または６−修飾チミンおよびシトシン２−デオキシリボヌクレオシド−５−ＤＩＩＰ−３’−ホスホアミダイトオリゴヌクレオチド中へ転換法が提供された。

実施例１において特定された方法に従って合成されたホスホアミダイトはヌクレアーゼ耐性を増加させるために以下の配列野生型塩基から置換される。

６−アザ−シチジン置換を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置ＣＩＣＩＣ’ｅｌＣＩＣ’ｌ：Ｉｃ菅ｃｔｃ’ｃ＋ｃ＋ｃ’ｅ＋ｃｘ−１＋Ｃ’ Ｃ’Ｃ’Ｎンｍ〒ＣαにλτＣ’　１，２．コ？ＣＣＡＧり侶にＣＧＣＡπ　１０．１１ｍｃｃＧｃＪＣＩＣ’ＣＺ３，１４，１１５’Ｉ’ＣＧαｎπＣＣＧＣＣ’Ｃ’Ｃ１４，１５ＣＧＡＣ′ｒＡＴＧＣＡＡＣＩＣＩＣ’Ｃ”　！２，１３．ｉ４Ｃ’ＣＩ（：’ＣＴＡ？Ｇ口λπ＾Ｃ！、２．３Ｃ’　ａｃ　’　？Ａ’ ！’ＧＣ’　ＪＬＩＭ；？ＡＣｌ、　４　、９ＡＣ’Ｃ”ＧＡＧＧＴＣ’Ｃ’ｋＴｃｎｃ嘲ＧＴＡＣ’ＧＣ２，コ、９．！０，１５．１９ＡＣ’Ｃ”Ｇ＾ＧＧテ ’Ｃ’Ｃ’Ａ？’ＧＴ’Ｃ’ＧＴ’入Ｃ’ＧＣ”　２，３，９ｔｌＯｔ１５．１９＋　５リポキシゲナーゼゲノムからの選択配列２　パピローマウィルスゲノムからの選択配列’　ｇ、１２．１４および１７位置での６７ザ一チミジン置換実施例５５−および／または６−位修飾チミンの対応するチミジンへの転換（デオキシリボシレーション）チミン類似体を、たとえばヘキサメチルジンラザン（ＨＭＤＳ）および酸触媒（即ち、塩化アンモニウム）のような種々の標準的条件下でトリメチルシリル化し、次に３゜５−０−リトルオイル−２−デオキシ−σ−ｐ−エリスローペントフラノシルクロライドで種々のルイス酸触媒（即ち、塩化第二スズ、ヨード、ホウ素、テトラフルオホウ酸塩等）の存在下において処理した。特異的な方法が最近フレスコス（Ｊ、　Ｎ、　Ｆｒｅｓｋｏｓ）により記載された。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、８：１０７５−１０７６　（１９８９）、これには銅（１）ヨウ化物が触媒として採用されている。

実施例６ローアザー５−ブロモ−５−〇−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３−〇− （β−シアノエチルジイソプロピルホスホアミジチル）−２゛−デオキシウリジンの合成、即ち６−ブロモ−２−（５−０−［ジメトキシトリフェニルメチル］ −３−０−［β−シアノエチルンイソプロピルホスホアミジチルコー２−デオキシ−ｊ−９−エリスローペントフラノシル）−１，２，４−トリアジン−３，５ −（２＋１．４Ｈ）−ジオン必要な複素環、６−ブロモ−１，、２，３−トリアジン−３，５（２１１，４Ｈ）−ジオンをクリステスフ（Ｃ，Ｃｒ１ｓｔｅｓｃｕ）、Ｒｅｖ、　Ｒｏｕｍａｎｉｅ　Ｃｈｉｔ２０：１２８７　（１９７５）に従って調製した。この物質のデオキシリボシレージョンおよび引き続きのＤＭＴおよびアミダイト化学は、実施例１．２および５に説明したように行った。

実施例７５−および／または６−位修飾チミジンの対応する２′デオキシシチジンへの転換（ピリミジン型４−ケト基から４−アミノ基への化学転換）修飾チミジン型の３°、５−糖水酸基を、トルオイル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、アセチル、イソブチル、トリフルオロアセチル等で、酸クロライドまたは無水物、およびピリジン／ジメチルアミノピリジン溶媒および触媒を使用して保護する。

保護されたヌクレオシドはピリジンまたは他の適当な塩基性溶媒中の塩化チオニルまたは塩化ホスホリルで塩素化する。ピリミジン型４−塩素基はつぎにメタノール中のアンモニウムで置換される。糖水酸基の脱保護もまた起こる。アミノ基は標準的な２段階の完全ペンシレージョンによりベンゾイル化され（糖水酸基およびアミン基）ならびにアシル基は水酸化ナトリウム溶液により選択的に除去される。択一的に、ヌクレオシドをクロロトリメチルシランで第一に処理するｉｎ　５ｉｔｕ工程および引き続きアンレーションから糖水酸基を保護するための塩基を採用できる。

もうひとつの転換法はピリミジン型４−塩素基を１．２．４−１−リアゾロ基（ＤＮＡ合成機上にオリゴヌクレオチド合成を通じて完全に維持され、オリゴヌクレオチドをＣＰＧ支持体から除去し複素環の脱保護をおこなう水酸化アンモニウム工程中のアンモニウムにより置き換えられる）で置換する。さらに多くの場合、ピリジン型４−塩素基は単に記載され、オリゴヌクレオチド合成の最後に置換されるものとして利用され得る。５−アザーンチジンおよび５−ニトロ−シチジンはそのウリンン類似体に従って得ることができる。同様に、４−クロロ−５− メチルメルカプトシチジンは記載のごとく合成される。

実施例８６−アザ−５−ブロモ−５°−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’− ０−Ｕ−シアノエチルジイソプロビルホスホアミジチル）−２゛−デオキシシチジンの合成、即ち５−アミノ−６−ブロモ−２−（５’−０−ジメトキシトリフェニルメチル−３′−０−β−シアンエチルジイソプロピルホスホアミジチル− ２−デオキシーβ−Ｄ−エリスローベントフルオロシル）−１，２，４−トリアジン−３（２Ｈ）−オンこの単量体はデオキシリボシル化６−ブロモ−１，２，３−トリアジン−３，５（２１１，４ｆｌ）−ジオン（実施例７に従う）を実施例５による２−デオキシシチジン類似体への転換により調製される。

実施例９１．５−トリフルオロ−５’−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’− ０−（β−シアンエチルジイソプロピルホスホアミジチル）−２°−デオキシウリジンの合成、即ち１−（５°−［４，４−ジメトキントリチル］−２−デオキシ−β−ｐ−エリスローペントフラノシル）５．５゜５−トリフルオロチミントリフルオロチミン（１，２，０ｇ）、（ＰＣＲ社、グランスピル、ＦＬから購入）を２度ピリジンと共蒸発させ、ついで無水ピリジン（１０ｈｌ）中にアルゴン雰囲気下で溶解した。

４．４−ジメチルアミノピリジン（５ｈｇ）および４．４゛−ジメトキシトリチルクロライド（２，７４ｇ）を連続的に溶液に加えて、次に室温で６時間撹拌した。反応混合物を１０ｈｌの水で処理しジエチルエーテル（４Ｘ１０ｈｌ）で繰り返し抽出した。エーテル抽出物をプールし、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し次に蒸発させオレンジガムを得た。

このガムはトルエンと共蒸発させ（３ｘ２５ｍｌ）次に酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（４９／４９／２．　Ｖ／Ｖ）を溶出液として使用する１２０ｇのシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。適当な画分をプールし、蒸発させて０．７７ｇの（１９％）の固形泡を得た。’！Ｉｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　６８．０５　（ｓ、　ＬＨ，Ｈ−６）　：１．４−６．７　（２ｍ、　１３Ｈ，芳香族）G６．０５（ｔ、　Ｉｌ’１．　Ｈ−１°）。

２、１−（５−［４，４−ジメトキシトリチル］−２′−デオキシ−β−ｐ−エリスローベントフラノツルー）−５，５，５−トリフルオロチミン−３−０−Ｎ、　Ｎ−ジイソプルピル−β−ンアノエチルホスホアノダイト（３）の合成無水ＴＨＦ中の５−トリフルオロ−５−０−（ジメトキシトリフェニルメチル） −３“−〇−（β−シアンエチルジイソプロピルホスホアミジチル）−２−デオキシウリジン、即ち１−（５’　−Ｃ４，４’−ジメトキントリチルコー２′− デオキシ−β−ｐ−エリスローベントフラノツル）−５゜５．５−トリフルオロチミン（２ＭＯ，７０ｇ、　１．２ｍ１ｌｏｌ）撹拌溶液中に、ジイソプロピルエチルアミン（１，ｈｌ）をアルゴン雰囲気下で加えた。この溶液に、塩化Ｎ、Ｎ−ジイソプロビルノアノエチルホスホアミダイ（０，３３１１１１，１，４４ｍＭｏｌ）を５分間にわたって滴下した。

この混合物を室温で３時間撹拌した。この終わりの時に、反応混合物を乾燥するまで真空で蒸発させ、生成した粘性残渣をＣＨ２Ｃｌ□（７５＋ａｌ）に溶解した。溶液を飽和ＮａＨＣ０３（２Ｘ３５１１１）および塩水（３５ｍｌ）で洗浄した。有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過および真空で蒸発させ無色のガムを得た。この物質をＣＨＣｌ３／トリエチルアミン（９９／１．　Ｖ／ｖ）を溶出液として使用する６０ｇのシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。適当な画分をプールし、蒸発させて無色泡を得た（０．６ｇ、　６７％）。’Ｈ−ＩＪＩＩＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）６８．１５　（ｓ、　Ｉｎ、　Ｈ−６）　ニア、　４−６．８　（１ｍ、　１３Ｈ，芳香族）　G６．０５　（ｔ、　ＩＨ。

Ｂ−１°）。このホスホアミダイトは引き続き実施例２に説明したオリゴヌクレオチド中に包含された。幾つかの例は次のとおりである。

５−トリフルオロメチル−２゛−デオキシウリジン置換を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置〒１（ローσにテα工Ｃ入ＴＣ１？　’　ＣＣｋＧＧＴ　’　Ｇ’！’ＣＣＧＣＡ？’Ｃｌ、　７？　’　ＣＣＡＧＧＴ　’　ＧＴ　’　ＣＣＧＣＡＴＣｌ、　７　、９ＴＣＣＡＧＧＴ　’　にＴ　’　ＣｃＧＣＡＴＣ７、９↑ＣＣＡ＃ＴＣＣＧＣＡＴ’Ｃ１５ＣＣ入Ｃτ＾πＣ＾ＡＴ’Ｔ’τ’Ｃ１２，１コ、工４’！”ＴｌＴｌＣＴＡ’ ！’ＧＣＡＡＧＴ入Ｃｉ、２，３ＡＣＣＧＡＧＧＴ’ＣＣＡＴＩＣＴ’ＣにＴ’ ＡＣＧＣ”　８，１２，１４４７１５リポキンゲナーゼゲノムから選択された配列２　パピローマウィルスゲノムから選択された配列３　ｍ純へルペスゲノムから選択された配列実施例１０５−フルオロ−５−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３°−０−（β− シアノエチルジイソプルビルホスホアミジチル）−２゛−デオキシウリジンをグレンリサーチ社（Ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入した。これは以前オリゴヌクレオチドに挿入された。ハーベナー（Ｊ、Ｆ、　Ｈａｒｂｅｎｅｒ）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎモ■ 配列　置換位置！電ＴＩ’ｉ’ｌＴｌ？’ＴＩＴ−〒１７１７１７１丁曾’ｌ”’！”ＴＩ’ｌ ’１−１５ＴＣＣＡＧＧｌＩＣＴ（：ＣＧＣＡＴ’Ｃ”　１５ＴＣＣＡＧＧ？’ Ｔ’ＣＣＧＣＡＴ’Ｃ７，ｇＴ’Ｃ（ＪＧＧＴ’ＧＴ’ＣＣＧＣＡ？’ＣｚＴＩＣＣＡＧＧＴＧｉＴＣＣＧ’！”丁’Ｔ’Ｃ１コ、１４．１５τ’ＣＣＡＧＧＴ ’Ｇ丁’ＣＣＧＣＡＴ’Ｃ１，〕、９．１５１５リポキシゲナーゼゲノムから選択された配列実施例１１５−ブロモ−５−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’−０−（β−シアンエチルジイソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジン（これはグレンリサーチ社から購入）を実施例２に説明した手順にしたがって合成する間に、オリゴヌクレオチド中に挿入した。

５−ブロモ−２゛−デオキシウリジン置換を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置Ｔ−慧丁−τ１ＴＩＴ１７１丁１７１ｆ１丁１丁１τ１７１７１７　１−１５ＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＣＡＴ’Ｃ”　ＢＴＩＣＣＡの：ワτＣα×コシで　１ τｃｃａｃａテ−テ菅ＣａにＱＴＣ７，９ＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＴＩＴＩＴＩＣ１３，１４，ユ５ＴＩＣＣＡαπ＋ｃｒｒ’ｃｃｃｃ入Ｔ’Ｃｌ、フケ９．工５＋　５リポキシゲナーゼゲノムから選択された配列実施例１２５−ブロモ−２−デオキシンチジンー修飾オリゴヌクレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明した方法で達成した。

５−ブロモ−２°−デオキシウリジン（Ｃ゛）置換を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置ＣＩＣ’Ｃ’Ｃ’Ｃ’ＣＩＣＩＣ”ＣＩＣ’Ｃ’ＣＩＣ’Ｃ’Ｃ’Ｃｌ　−１５ｅ１ｃｍｃＡＴｌ（：　１ｍＴＣＣＡＧＧπＴ’ＣＣＧＣＡＣＩ（１’　１５冗ユ■π’！’（：Ｉｃ’ＧｃＡＴ０　１０．１１テ℃χコ１；Ｇ１工；ＴＯ（’ＧＣ’Ｃ’Ｃ’ＣＬコ、１４．１５ＴＣＩＣＩＡＧＯ’ｌ’Ｇ’Ｌ’Ｃ’ＣＩＧＣ’Ａ丁（２，３，１０，１１，１３１５リポキンゲナーゼゲノムから選択された配列実施例１３５−メチル−２゛−デオキシシチジン−修飾オリゴヌクレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明した方法で、野性型シチジン塩基を５−メチル−２′ デオキシシチジン（これはグレンリサーチ社から購入した）に置換して達成した。

５−メチル−２°−デオキシシチジン（Ｃ゛）置換を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置九Ｃ’ＣＩＣＩＣ”Ｃ’ＣＩＣＩ（：ＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣｌ　−１５ｃ’ｃｃｘαｉｔＣ命ユ丁看Ｃ１１ πａ工π’ＥＣＧＣＡＣＩ　Ｃ１５？’ＣＣＡＧＧ？Ｇ？Ｃ’ＣＩＧＣＡＴＣ１０，１ｉＴＣＣ八〇Ｇ？σＴＣＣＤＣ’Ｃ’Ｃ藝Ｃ１コ、１４．１５ＴＣＩＣ’Ｊｕコ；（＝；ｉコｍｃ’ｃ’ｃｃ ’λつ？Ｃ２，コ、１０，１１．４３１５リポキシゲナーゼゲノムから選択された配列実施例１４５−イオドー２゛−デオキシウリジンー修飾オリゴヌクレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明した方法で、野性型ウリジン塩基を５−イオドー２° デオキシウリジン（これはグレンリサーチ社から購入した）に置換して達成した。

５−イオドー２−デオキシウリジン置換を有するオリゴヌクレオチド配列　置換位置？１τｌ　？　１７１　Ｔ　ｌ　？　ｌ　Ｔ　１１！ＩＩ　Ｔ　Ｉ？ｌ　Ｔ豐Ｔｌ？”Ｉ”ＴＩＴ　ｌ　−１５？ＣＩＪｍ’！’ＣＣＧＣ）ｋＴｌ（：　”　１５？ｍ　’　ＧＴ　ｌ　ＣＣＧＣＡ’ｌ’Ｃ７、９ＴＣＣＡＧＧＷＴ’ＣＣＧτ Ｔ？１丁’Ｃユ３，１４．１５テ’Ｃ（ＪＧＧＴＩＧ？１ＣＣＧＣ入Ｔ’ＣＬ、７，９，１５１５リポキンゲナーゼゲノムから選択された配列実施例１５５−イオドー５’−Ｑ−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３−〇−（β−シアノエチルジイソプロビルホスホアミジチル）−２゛−デオキシシチジンの合或は実施例２および７に説明された方法を利用して達成された。

実施例１６５−クロロ−５°−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’−０−（β− シアノエチルジイソプロビルホスホアミジチル）−２°−デオキシウリジンの合成５−クロロウラシルはアルドリッチ化学社から入手できる。この物質は実施例１．２および５に説明された方法をに従って表題のホスホアミダイトに転換される。

実施例１７５−クロロ−５’−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’−０−（β− シアノエチルジイソプロビルホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジンの合成は実施例２および７に説明された方法に従って達成された。

実施例１８５−ニトロ−５°−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’−０−（β− シアノエチルジイソプロビルホスホアミジチル）−２−デオキシウリジンの合成５−ニトロウラシルはアルドリッチ化学社から入手できる。この物質は実施例１，２および５に説明された方法に従って表題のホスホアミダイトに転換される。

実施例１９５−（２，４−ジニトロフェニルメルカプト−５°−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３゜−〇−（β−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィニル）−２′−デオキシウリジンの合成５−メルカプト−２−デオキシウリジン（Ｆａｘらの方法、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅａｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　８］：１７ｇ　（１９５９）によって得た）を等量の水素化ナトリウムおよび２．４−ジニトロフェニルフルオライドで処理することにより２．４−ジニトロフェニルスルフィニル誘導体に転換する。この物を質実施例１に説明されたように５°−ＤＭＴ３°−ホスホアミダイトに転換する。

実施例２０４−クロロ−５−（２，４−ジニトロフェニルメルカプト−５−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３−０−（ｂ−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィニル）−２′−デオキシシチジンの合成５−メルカプト−２−デオキシウリジン（Ｆｏｘらの方法、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　８１：１７８　（１９５９）によって得た）を等量の水素化ナトリウムおよび２．４−ジニトロフェニルフルオライドで処理して２．４−ジニトロフェニルスルフィニル誘導体に転換する。この物質をアセチル化、塩素化および実施例１および５に説明されたように５−〇ＭＴ−３’−ホスホアミダイトに転換する。

実施例２１５−メチルメルカプト−５°〜０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３’− ０−（６−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィニル）−２゛−デオキシウリジンの合成５−メルカプト−２゛−デオキシウリジン（Ｆａｘらの方法、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｌ！１：１７８　（１９５９）によって得た）を等量の水素化ナトリウムおよびヨウ化メチルで処理してメチル誘導体に転換する。この物質を実施例１に説明された方法に記載されたように５−ＤＭＴ−３’−ホスホアミダイトに転換する。

実施例２２ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドがそれらの相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を熱溶解分析で決定した。ＲＮＡ相補体はＴ７ＲＮＡポリメラーゼで合成し、ＤＮＡの鋳型−プロモーター（ｔｍｐｌａｔｅ−ｐｒｏＩＩｏｔｅｒ）はアプライドバイオシステム社の３８０Ｂで合成した。ＲＮＡ種はＦＰＬＣ（ＬＫＢ−ファルマシア社）を使用してイオン交換により精製した。天然アンチオリゴヌクレオチドまたはピリミジン修飾を特異的位置に含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれもＲＮＡまたはＤＮＡ相補体のいずれかを化学量論的濃度で添加され、二重鎖がランダムコイルに転移する時の濃色効果（２６０ｎ＋＊）をギルホードレスポンス分光光度計で監視された。これらの測定は１０ｍＭ　Ｎａ−リン酸、ｐＨ７，４，０，１１Ｍ　ＥＤＴＡ、およびＮａＣ１で０．１Ｍ６Ａら１．ＯＭの１０のイオン強度を作成した緩衝液中で行われた。データは１／Ｔ＋対１ｎ　［Ｃｔｌのグラフ表示され、ここで［Ｃｔｌは全オリゴヌクレオチド濃度であった。この分析から熱力学的パラメーターが決定された。特定のこれらの結果を表Ｈに表す。

表■ 修飾に関する融解温度（Ｔｍ）データ５°から３゛ヘノ修飾を読むオリゴヌクレオチド５°ＴＣＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＧＧ　ＣＡＴ　Ｃ３’　ノ１から１６位のピリミジン修飾のＴｓ　（℃）６−Ａｚａ　Ｔ１６２．　Ｕ３６２．０？、　９５ｇ、　２１．７．９．１５５４．５６−Ａｚａ　ｄＣ２６３，０２，３５９，８１０，１P５１，０６−３ｉｅｄ［１１６３，２１５６２，５７，９＋５．７１．７．９．１５５２．３５．６ −Ｄｉｌｌｅ　ｄＵ１５６０．３７．９５４．７１．７．９D１５５２．５５− Ｉａｄｏ　ｄ［１１６３，５１５６３，３７，９６３，３１，７，９，１５６１，５５−Ｂｒｏ＋＊ｏ　ｄＵ１６３．５１５６３．３７．９６R．３１．７．９．１５６１、５５−Ｆｌｕｏｒｏ　ｄＵ１６３．２１５６３．２７．９６５．０１．７．９．１５６３．７５−Ｂｒｏｍｏ　ｄｃｌｏ、　１１６５D８２．３．１０．１１、１３６８．０５−Ｍｅ　ｄｃｌｏ、　１１６５．３２．３．１０．１１．１３６７、０形成されたヘテロ二重鎖の二重安定性に関して得られた情報に基づいて修飾ピリミジンのオリゴヌクレオチド中への配置は、そのヘリックス安定性効果に関して評価された。ハイブリッドの安定性を劇的に変える修飾は、自由エネルギー（デルタＧ）の減少を表し、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドとしてのそれらの有用性に関して決定された。このような安定性間するレトロスペクティブな研究を表■に示す。

表■ 二重鎖安定性および特異性に関するピリミジン修飾の効果化合物安定性対特異性対ＤＮＡ標的ＤＮＡ標的天然ＤＮＡ０＋４．２６−Ａｚａ　Ｔ＋０．６＋３．７６−Ａｚａ　ｄｃ＋１．９＋６．０６−Ｍｅ　ｄＵ＋１．３＋３．０５．６−Ｄｉｍｅ　ｄｌｊ＋１．１＋１．５５−Ｉｏｄｏ　ｄＵ＋０．３−３−T−Ｂｒｏ　ｄＵ−０゜３＋４．９５−Ｆｌｕｏｒｏ　ｄＵ−０，２＋４．４５−Ｂｒｏｍｏ　ｄＣ−０，１＋６．５５−Ｍｅｔｈｙｌ　ｄＣ−０，２＋６．３ピリミジン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的に標的＋ａＲＮ＾にハイブリダイズする能力は、全細胞性ＲＮ＾の存在下で精製標的ｍＲＮ＾のノーザンプロット分析により示された。標的ｍＲＮ＾は、Ｔ７ＲＮ＾ポリメラーゼプロモーターから下流に位置する標的ｄＮＡに関するｃＤＮＡを含有するベクターから合成された。合成されたｍＲＮＡはアガロースゲル電気泳動ならびに適当な支持体膜（すなわちニトロセルロース）に転写された。支持体膜はブロックされ、　、［３２ｐ］−標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してプローブとされた。

ストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）はプロットを複製し、上昇温度または減少イオン強度の洗浄バッファーのいずれかで洗浄して測定された。オートラジオグラフィーはへテロ二重鎮形成の存在を評価するために行い、ならびにオートラジオグラムはレーザーテンントメーター（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により定量した。

ハイブリッド形成の特異性は、標準法にて全細胞性ＲＮ＾の単離およびそのアガロース電気泳動による分析により、膜転写および標識ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドによるブロービングにより決定した。非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに関するストリンジエンシーは予め決定され、ならびに使用された条件は標識ｍＲＮ＾のみがピリミジン修飾オリゴヌクレオチドとへテロ二重鎖を形成できものであった。

実施例２３天然、ホスホロチオエートおよびピリミジン修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを種々の濃度の胎児ウシ血清（Ｆｅ２）または成人ヒト血清を含有する培地中でそれらの血清ヌクレアーゼ耐性に関して評価された。標識したオリゴヌクレオチドは種々の時間インキュベーションされ、プロテアーゼにで処理されて次に２０％ポリアクリルアミド−尿素変性ゲル電気泳動、引き続きオートラジオグラフィーで分析された。オートラジオグラムは、レーザーデンシトメトリーで定量した。

修飾の位置およびオリゴヌクレオチドの既知の長さに基づき、特定のピリミジン修飾によりヌクレアーゼ分解に関する効果を決定することが可能である。細胞質ヌクレアーゼについてはＨＬ６０細胞系を使用した。ミトコンドリア上澄後を分画遠心分離によって調製し、標識オリゴヌクレオチドをこの上澄中で種々の時間インキュベーションした。インキュベーションの後、オリゴヌクレオチドは、血清核酸溶解分解に関して上記に既述されたように評価された。オートラジオグラフィーの結果は、非修飾、ホスホロチオエートおよびとりミシン修飾オリゴヌクレオチドの比較用に定量された。

特別なヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼ、３°、５−エキソ−および５′、３′−エキソヌクレアーゼ）に対する天然、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドの耐性の評価がなされ、分解に対する修飾の正確な効果が決定された。

修飾されたオリゴヌクレオチドを種々の選択されたヌクレアーゼに特異的で明確な反応緩衝液中でインキュベーションした。プロテアーゼにで生成物を処理した後に尿素が添加され、尿素含有２０％ポリアクリルアミドゲルの分析がなされた。ゲル生成物はスティンズオール（Ｓｔｅｉｎｓ　Ａｌｌ：シグマ化学社）を使用して染色することにより視覚化された。

レーザーデンシトメトリーは、分解の程度を定量するために使用された。ピリミジン修飾の効果は特別なヌクレアーゼに関して行なわれ、血清および細胞賀系から得た結果と比較された。

そのような試験のひとつにおいて、約１ｍｇ／ｍｌの修飾ピリミジン関連オリゴヌクレオチドを３７℃で、熱活性化１０％ＦＣ３を補給したＤＭＥＤ中でインキュベーションした。

種々の時間点において、アリコートが分取され、等量の９Ｍ尿素／ＩＸＴＢＥ緩衝液中で混合され、−２０℃で凍結された。試料をポリアクリルアミド電気泳動（２０％Ｐ＾／７Ｍ尿素）で分析しステインズオール試薬にて視覚化し、ＬＫＢレーザーデンシトメーターを使用する定量に供した。ピークの積算は完全長のオリゴヌクレオチドを表し、およびｎ−１オリゴヌクレオチドを作成した。％分解を、試料の時間点Ｏと比較することにより各時間に関して計算した。データをグラフ化し、修飾オリゴヌクレオチドのＴＩ／□に関するグラフでの推定を天然非修飾オリゴヌクレオチドとの比較により行った。

５−ａｚａ　Ｔ含有オリゴヌクレオチドを利用して、そのような５−ａｚａ　Ｔ修飾オリゴヌクレオチドが核酸溶解分解に対するより大きな耐性を示すことが分かった。６一アザＴ化合物に関して、修飾の数を増加させるとＦＣ３中での分解に対する安定性が増大した。さらに、最良の結果は、６−ａｚａ　Ｔを３°−末端キャップとして使用した時に得られた。そのような３−末端キャップを含有するオリゴヌクレオチドは、天然オリゴヌクレオチドを比較して３’−５’工キソ核酸溶解分解からの保護を与えた。Ｔ１７２は天然オリゴヌクレオチドの２０分から修飾オリゴヌクレオチドに関する４時間の１１７２に増加した。これはＦＣ３存在下におけるオリゴヌクレオチドの分解の感受性を１２倍減少させたことを表した。この試験結果はＦｅ２．これは天然非修飾オリゴヌクレオチドを３゛末端から分解すると知られているが、３つの６−ａｚａ　Ｔブロックを適当な基質として認識しないことを示唆する。このような認識の欠如は修飾オリゴヌクレオチドの加水分解をおおいに減少させる。

実施例２４リポリクレアーゼＨ活性標的ｍ１ｉＮ＾のＲＮａｓｅによる開裂は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果をおおいに増大させる。現在では大腸菌ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ部分上のたった３から４個の非修飾残基結合部位がＲＮＡの開裂を引き出すために必要であると思われている。この試験に関し、各Ｔヌクレオチドを置換した６−ａｚａ　Ｔを有する５ＬＯｍＲＮＡ（５−ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　Ｃ−３’　）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ試験に関して利用された。試験オリゴヌクレオチドの中で、５−ａｚａ　Ｔを含むように修飾された位置は、２天然塩基より離れないようにし−即ち、オリゴヌクレオチドは大腸菌ＲＮａｓｅＨによる認識を実証すべきである。天然相補的ＤＮＡ（５’　ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　Ｃ−３’　）ヲ比較ノ目的テ合成Ｌり、５−ＬＯｍＲＮＡ（２，５ｋｂ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成した。天然ＤＮＡ（ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　Ｃ）および６−ａｚａ　Ｔ含有修飾オリゴヌクレオチド（ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　Ｃ）、（双方とも５−ＬＯｌｌｌＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡである）を自動ＤＮＡ合成で合成した。各々の天然および修飾オリゴヌクレオチドが３倍モル過剰量の存在下でｍＲＮＡを３０分間、６０℃で加熱し、天然オリゴヌクレオチドを対照に使用した。インキュベーション後、溶液を３７℃にゆっくりと冷却し、ＲＮａｓｅ　Ｈ（大腸菌）を添加した。ＲＮａｓｅ　Ｈ処理溶液を３７℃で３０分静置した。分解生成物は１．２％アガロース／ホルムアルデヒド電気泳動で分析し、および定量のためにエチジウムブロマイドで視覚化した。この結果は、ＲＮａｓｅ　Ｈ（大腸菌）が、天然のまたは６−ａｚａ　７を含有する修飾［ＩＮ＾のいずれかに結合したｍＲＮＡを間等の効力で認識かつ開裂できることを示している。

手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０４６８１、発明の名称遺伝子発現を検ａおよび変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド３゜補正をする者事件との関係　特許出願人（別紙）１．請求の範囲を次のとおりに補正する。

「１．リボースまたはデオキシリボースおよび塩基部分を独立して含む複数の共有結合ヌクレオシド単位から成る化合物であって、ここで複数の塩基部分はピリミジン塩基であす；ソして少なくともひとつのピリミジン塩基が構造：を有する修飾されたピリミジン塩基であす、ココで：Ｘ＝ＯＲまたはＮＨ［２゜ＢハＣ−低級アルキル、Ｎ、　Ｃ−ＣＦｓ、　ＣＪ、　Ｃ−Ｃｌ。

Ｃ−Ｂｒ、　Ｃ−１，Ｃ−ハｏ　ｈ　／ｌ／ボン、Ｃ−ＮＯ２，Ｃ−０ＣＦｓ、　Ｃ−５Ｒ，Ｃ−３ＣＨ３，Ｃ−ＯＨ，Ｃ−０−低級アルキル、Ｃ−Ｃ１１Ｉ２０ＥＩ、　Ｃ−Ｃｕ３Ｓｎ、　Ｃ＜Ｈ２ＳＣＦｉｓ、　Ｃ−ＣＨ２０ＣＨ３，Ｃ −ＮＨ２，Ｃ−ＣＨ２ＮＨ２，アルキル−ＮＨ２，Ｃ−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリールまた特表十６−５０１３８９　（１２）はベンジルから成る群から選択され、Ａｆｔ　Ｃ−Ｈ，Ｎ、　Ｃ−ＣＦ３．　Ｃ−Ｆ、　Ｃ−Ｃ１，Ｃ−Ｂｒ、　Ｃ− Ｉ、　Ｃ−ハロカルボン、Ｃ−ＮＯ２，Ｃ−０ＣＦ３．　Ｃ−５Ｈ，Ｃ−３ＣＨ３，Ｃ−ＯＨ。

Ｃ−０−低級アルキル、Ｃ−ＣＨ２０Ｈ，Ｃ−Ｃｕ３Ｓｎ、　Ｃ−Ｃｌ１２ＳＣＨ３，Ｃ−ＣＨ２０ＣＨ３，Ｃ−ＮＨ２，ｃ−ｃｉ２Ｎｎ２．　ｃ−ヘンシル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリールまたはベンジル、ならびにＡおよびＢを通じて融合された炭素環または複素環がら成る群から選択され二またはＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に融合された炭素または複素環の部分である、化合物。

２、上記修飾されたピリミジンが上記化合物の３′または５′末端にある請求項１に記載の化合物。

３、最高約３個の修飾されたピリミジンが上記化合物の３′末端に包含される請求項１に記載の化合物。

４、少なくとも約１％の上記ピリミジン塩基が修飾されている請求項１に記載の化合物。

５、ピリミジンの糖部分がリボースまたはデオキシリボースである請求項１に記載の化合物。

６、修飾されたピリミジンの糖結合基がホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレート基に修飾されている請求項１に記載の化合物。

７、上記ヌクレオシド単位が炭素またはエーテル結合基に連結している請求項１に記載の化合物。

８、薬学的に受容できるキャリアー中の請求項１に記載の化合物。

９、対応する野生型化合物と比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を示す請求項１に記載の化合物。

１０、生物によるタンパク質の生産を変調させる方法であって、生物を該タンパク質をコードする選択された核酸配列と特異的にハイブリダイズする化合物と接触させ、ここで該化合物はリボースまたはデオキシリボース糖部分および塩基部分を独立して含む複数の共有結合ヌクレオシド単位から成り、ここで複数の塩基部分はピリミジン塩基であり；そして少なくともひとつの該ピリミジン塩基が構造を有する修飾されされたピリミジン塩基であり、ここで：Ｘ＝ＯＨまたはＮＨ２゜ＢはＣ−低級アルキル、Ｎ、　Ｃ−ＣＦｓ、　Ｃ−Ｆ、　Ｃ−Ｃｌ、　Ｃ−Ｂｒ。

Ｃ−Ｉ、　Ｃ−ハロカルボン、Ｃ−ＮＯ２，Ｃ−０ＣＦ３．　Ｃ−５Ｈ，Ｃ−５ＣＨ３゜Ｃ−ＯＨ，Ｃ−０−低級アルキル、Ｃ−Ｃｌ１２０Ｈ，Ｃ−ＣＨ３ＳＨ，Ｃ−ＣＨ２０ＣＨ３，Ｃ−ＣＨ，０Ｃ１１，、Ｃ−ＮＨ２，Ｃ−ＣＨ２ＮＨ２，アルキル−ＮＨ２，Ｃ−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリールまたはベンジルから成る群から選択され、ＡはＣ−Ｈ，Ｎ、　Ｃ−ＣＦ、、　Ｃ−Ｆ、　Ｃ−Ｃｌ、　Ｃ−Ｂｒ、　Ｃ−Ｌ　Ｃ−ハ。

ｈ　ルポ：／　、Ｃ−Ｎｏ２．　Ｃ−０ＣＦ３．　Ｃ−５Ｈ，Ｃ−５ＣＨ３，Ｃ −ＯＨ，Ｃ−０−低級７　ｋ　＊　ル、Ｃ−ＣＨ２０Ｈ，Ｃ−ＣＨ２ＳＨ，Ｃ− ＣＨ２ＳＣＢ　３．　Ｃ−ＣＨ２０ＣＲ３，Ｃ−ＮＨ２，Ｃ−ＣＨ２ＮＨ２，Ｃ −ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリールまたはベンジル、ならびにＡおヨヒＢを通じて融合された炭素環または複素環から成る群から選択され：またはＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に融合された炭素または複素環の部分である方法。

１１、上記修飾されたピリミジンが上記化合物の３′または５′の末端にある請求項１０に記載の方法。

１２、最高約３個の修飾されたピリミジンが上記化合物の３“末端に包含される請求項１０に記載の方法。

１３、少なくとも約１％の上記ピリミジンが修飾されている請求項１０に記載の方法。

１４、ピリミジンの糖部分がリボースまたはデオキシリボースである請求項１０に記載の方法。

１５、修飾されたピリミジンの糖結合基がホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレートに修飾されている請求項１０に記載の方法。

１６、上記ヌクレオシド単位が炭素または二−テ特表千６−５０１３８９　（１３）ル結合に連結している請求項１０に記載の方法。

１７、薬学的に受容できるキャリアー中の請求項１０に記載の方法。

１８、対応する野生型化合物と比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を示す孤求、−，，ｌ　Ｏに記載の方法。Ｊ２、明細書第４頁第７行から第１０行の記載である「メチルホスホネートはＲＮＡと形成する二重鎖において、−ｍ−作用する。」を「さらにメチルホスホネートはＲＮＡと形成する二重鎖において終結反応であるＲＮａｓｅ　Ｈによる分解を活性化せず、かわりにリボゾーム上に局在するヘリックス溶解活性によって打ち消され得るハイブリダイゼーション制止により作用する点に欠点がある。」と訂正する。

３、明細書中の次の記載を訂正する。

頁　行　誤　正７　１１　固体状態　固相状態１０２０　未解決　未分離１４１６　回転ボトム　丸底１６２６゜５６　６．５６以上国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するように修飾された少なくともひとつのピリミジン塩基修飾を有するオリゴヌクレオチド類似体であって；ここでＸ＝ＯＨまたはＮＨ２；およびＡおよびＢは同じか、または異なってもよく、ならびに；Ｃ−低級アルキル、Ｎ，Ｃ−ＣＦ３，Ｃ−Ｆ，Ｃ−Ｃ（ＣＦ３），Ｃ−ＣＦ２−ＣＦ３，Ｃ−ＣＦ２− ＣＦ２−ＣＦ３，Ｃ−Ｃ１，Ｃ−Ｂｒ，Ｃ−Ｉ，Ｃ−ハロカルボン、Ｃ−ＮＯ２，Ｃ−ＯＣＦ３，Ｃ−ＳＨ，Ｃ−ＳＣＨ３，Ｃ−ＯＨ，Ｃ−Ｏ−低級アルキルレ、Ｃ−ＣＨ２ＯＨ．，Ｃ−ＣＨ２ＳＨ．，Ｃ−ＣＨ２ＳＣＨ３，Ｃ−ＣＨ２ＯＣＨ３，Ｃ−ＮＨ２，Ｃ−ＣＨ２ＮＨ２，Ｃ−アルキル−ＮＨ２，Ｃ−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−アラルキル、Ｃ−置換アリール、Ｃ−置換ベンジル；またはＡまたはＢのひとつが上記であり、且つ一方がＣ−Ｈ；またはＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に融合された炭素または複素環の部分である。
２．ＡがＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
３．ＢがＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
４．ＡおよびＢがそれぞれ独立して、Ｃ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
５．少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ハロゲンまたはＣ−ハロカーボンである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
６．少なくともＡおよびＢのひとつが窒素である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
７．少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ＣＨ３またはＣ−ＣＦ３である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
８．ＡがＣ−ＣＨ３またはＣ−ＣＦ３且つＢが窒素である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
９．ＡがＣ−Ｂｒ且つＢが窒素である請求項１のオリゴヌクレオチド類似体。
１０．上記修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチド類似体のひとつの末端にある請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
１１．上記修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチド類似体の３′末端にある請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
１２．最高約３個の修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチドの３′末端に包含される請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
１３．少なくとも約１％の上記ピリミジンが修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
１４．少なくとも約１０％の上記ピリミジンが修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
１５．少なくとも約２５％の上記ピリミジンが修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
１６．少なくとも約５０％の上記ピリミジンが修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
１７．実質的にすべての上記ピリミジンが修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
１８．ピリミジンの糖部分がリボースまたはデオキシリボースである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
１９．修飾されたピリミジンの糖結合基がホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレートに修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
２０．修飾されたピリミジンの糖結合基が炭素またはエーテル結合で置換されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
２１．薬学的に受容できるキャリアー中の請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
２２．対応する野生型オリゴヌクレオチドと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を示す請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
２３．生物によるタンパク質の生産を変調させる方法であって、生物を該タンパク質をコードする選択された核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド類似体と接触させ、ここで該オリゴヌクレオチド類似体の少なくともひとつのピリミジン塩基が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するように修飾され、ここでＸ＝ＯＨまたはＮＨ２；およびＡおよびＢは同じまたは異なってもよく、ならびに；Ｃ−低級アルキル、Ｎ，Ｃ −ＣＦ３，Ｃ−Ｆ，Ｃ−Ｃ（ＣＦ３），Ｃ−ＣＦ２−ＣＦ３，Ｃ−ＣＦ２−ＣＦ２−ＣＦ３，Ｃ−Ｃ１，Ｃ−Ｂｒ，Ｃ−Ｉ，Ｃ−ハロカーボン、Ｃ−ＮＯ２，Ｃ −ＯＣＦ３，Ｃ−ＳＨ，Ｃ−ＳＣＨ３，Ｃ−ＯＨ．Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ− ＣＨ２ＯＨ，，Ｃ−ＣＨ２ＳＨ，Ｃ−ＣＨ２ＳＣＨ３，Ｃ−ＣＨ２ＯＣＨ３，Ｃ −ＮＨ２，Ｃ−ＣＨ２ＮＨ２，アルキル−ＮＨ２，Ｃ−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−アラルキル、Ｃ−置換アリール、Ｃ−置換ベンジル；またはＡまたはＢのひとつが上記であり、且つ一方がＣ−Ｈ；またはＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に融合された炭素または複素環の部分である。
２４．ＡがＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項２３に記載の方法。
２５．ＢがＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項２３に記載の方法。
２６．ＡおよびＢがそれぞれ独立して、Ｃ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ− ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項２３に記載の方法。
２７．少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ハロゲンまたはＣ−ハロカーボンである請求項２３に記載の方法。
２８．少なくともＡおよびＢのひとつが窒素である請求項２３に記載の方法。
２９．少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ＣＨ３またはＣ−ＣＦ３である請求項２３に記載の方法。
３０．ＡがＣ−ＣＨ３またはＣ−ＣＦ３且つＢが窒素である請求項２３に記載の方法。
３１．ＡがＣ−Ｂｒ且つＢが窒素である請求項２３の方法。
３２．上記修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチド類似体のひとつの末端にある請求項２３に記載の方法。
３３．上記修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチド類似体の３′末端にある請求項２３に方法。
３４．最高約３個の修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチドの３′末端に包含される請求項２３に記載の方法。
３５．少なくとも約１％の上記ピリミジンが修飾されている請求項２３に記載の方法。
３６．少なくとも約１０％の上記ピリミジンが修飾されている請求項２３に記載の方法。
３７．少なくとも約２５％の上記ピリミジンが修飾されている請求項２３に記載の方法。
３８．少なくとも約５０％の上記ピリミジンが修飾されている請求項２３に記載の方法。
３９．実質的にすべての上記ピリミジンが修飾されている請求項２３に記載の方法。
４０．ピリミジンの糖部分がリボースまたはデオキシリボースである請求項２３に記載の方法。
４１．修飾されたピリミジンの糖結合基がホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレートに修飾されている請求項２３に記載の方法。
４２．修飾されたピリミジンの糖結合基が炭素またはエーテル結合で置換されている請求項２３に記載の方法。
４３．薬学的に受容できるキャリアー中の請求項２３に記載の方法。
４４．対応する野生型オリゴヌクレオチドと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を示す請求項２３に記載の方法。
４５．タンパク質の所望しない生産により特徴づけられる疾患を有する生物の治療法であって、生物を該タンパク質をコードする選択された核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド類似体と単独で、または薬学的に受容されるキャリアー中で接触させることからなり、ここで該オリゴヌクレオチド類似体の少なくともひとつのピリミジン塩基が構造：▲数式、化学式、表等があります▼ を有するように修飾され、ここでＸ＝ＯＨまたはＮＨ２；およびＡおよびＢは同じまたは異なってもよく、ならびに；Ｃ−低級アルキル、Ｎ，Ｃ −ＣＦ３，Ｃ−Ｆ，Ｃ−Ｃ（ＣＦ３），Ｃ−ＣＦ２−ＣＦ３，Ｃ−ＣＦ２−ＣＦ２−ＣＦ３，Ｃ−Ｃ１，Ｃ−Ｂｒ，Ｃ−Ｉ，Ｃ−ハロカーボン、Ｃ−ＮＯ２，Ｃ −ＯＣＦ３，Ｃ−ＳＨ，Ｃ−ＳＣＨ３，Ｃ−ＯＨ，Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ− ＣＨ２ＯＨ．，Ｃ−ＣＨ２ＳＨ，Ｃ−ＣＨ２ＳＣＨ３，Ｃ−ＣＨ２ＯＣＨ３，Ｃ −ＮＨ２，Ｃ−ＣＨ２ＮＨ２，アルキル−ＮＨ２，Ｃ−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−アラルキル、Ｃ−置換アリール、Ｃ−置換ベンジル；またはＡまたはＢのひとつが上記であり、且つ一方がＣ−Ｈ；またはＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に融合された炭素または複素環の部分である。
４６．ＡがＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項４５に記載の方法。
４７．ＢがＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ−ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項４５に記載の方法。
４８．ＡおよびＢがそれぞれ独立して、Ｃ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオール、Ｃ− ハロカーボンまたはＣ−ハロゲンである請求項４５に記載の方法。
４９．少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ハロゲンまたはＣ−ハロカーボンである請求項４５に記載の方法。
５０．少なくともＡおよびＢのひとつが窒素である請求項４５に記載の方法。
５１．少なくともＡおよびＢのひとつがＣ−ＣＨａまたはＣ−ＣＦ３である請求項４５に記載の方法。
５２．ＡがＣ−ＣＨ３またはＣ−ＣＦ３且つＢが窒素である請求項４５に記載の方法。
５３．ＡがＣ−Ｂｒ且つＢが窒素である請求項４５の方法。
５４．上記修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチド類似体のひとつの末端にある請求項４５に記載の方法。
５５．上記修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチド類似体の３′末端にある請求項４５に方法。
５６．最高約３個の修飾されたピリミジンが上記オリゴヌクレオチドの３′末端に包含される請求項４５に記載の方法。
５７．少なくとも約１％の上記ピリミジンが修飾されている請求項４５に記載の方法。
５８．少なくとも約１０％の上記ピリミジンが修飾されている請求項４５に記載の方法。
５９．少なくとも約２５％の上記ピリミジンが修飾されている請求項４５に記載の方法。
６０．少なくとも約５０％の上記ピリミジンが修飾されている請求項４５に記載の方法。
６１．実質的にすべての上記ピリミジンが修飾されている請求項４５に記載の方法。
６２．ピリミジンの糖部分がリボースまたはデオキシリボースである請求項４５に記載の方法。
６３．修飾されたピリミジンの糖結合基がホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレートに修飾されている請求項４５に記載の方法。
６４．修飾されたピリミジンの糖結合基が炭素またはエーテル結合で置換されている請求項４５に記載の方法。
６５．上記オリゴヌクレオチド類似体が薬学的に受容できるキャリアー中の請求項４５に記載の方法。
６６．上記オリゴヌクレオチド類似体が対応する野生型オリゴヌクレオチドと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を示す請求項４５に記載の方法。