JPH06504067A - 主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主鎖　飾されたオリゴヌクレオチド類似体関連特許出願 本特許出願は、１９９１年５月２１８提出の米国特許出願第７０３．６１９号の 一部継続出願であり、米国特許出願第７０３．６１９号は、１９９０年８月１３ 日提出の米国特許出願第５６６、８３６号および１９９０年７月２７日提出の米 国特許出願第５５８．６６３号の一部継続出願である。これらの特許出願はいず れも本特許出願の譲受人に譲渡されており、参照文献としてここに引用する。
発明の分野 本発明は、治療や診断用に適した、また学術研究用の試薬として適した耐ヌクレ アーゼ性のオリゴヌクレオチド類似体の設計、合成、および応用に関する。野生 型の核酸における糖量結合（ｉｎｔｅｒ−ｓｕｇａｒ　ｌｉｎｋａｇｅ）として 通常作用するホスホロジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒｂｒ ＋ｎｄ）の代わりに修飾された結合を有するオリゴヌクレオチド類似体が提供さ れる。このようなオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗 性があり、ＤＮＡとＲＮＡの活性を調節することができる。さらに、これらのオ リゴヌクレオチド類似体を合成するための方法、および本発明のオリゴヌクレオ チド類似体を使用して蛋白質の生成を調節する方法、ならびに中間体組成物およ び方法が提供される。
発明の背景 よく知られているように、哺乳動物における肉体状態（疾病状態も含めて）の殆 どは蛋白質によって作用を受ける。こうした蛋白質は、直接作用する場合でも、 あるいは醪素機能を介して作用する場合でも、動物や人間に種々の疾病を引き起 こす一因となることが多い。
従来からの治療学は一般に、疾病を引き起こす作用または疾病を重くする作用を 和らげるよう検討を進めていく上で、蛋白質との相互作用を調べることに重点を 置いている。しかしながら最近では、蛋白質の合成を方向づける分子（すなわち 細胞内ＲＮＡ）との相互作用によって、こうした蛋白質の実際の生成を和らげよ うとする検討がなされている。これらの相互作用には、相補的“アンチセンス” オリゴヌクレオチドまたはそれらの特定の類似体の、ＲＮＡに対するノ）イブリ ッド形成が含まれている。ハイブリッド形成は、オリゴヌクレオチドまたはオリ ゴヌクレオチド類似体の、ＲＮＡまたは一重鎖ＤＮＡに対する配列特異的水素結 合である。蛋白質の生成を妨げることによって、できるだけ高い効詣とできるだ け少ない副作用を示す治療学的結果が得られるものと期待される。同様に、オリ ゴヌクレオチド類似体は、生物による蛋白質の生成を調節することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体 の薬理学的活性は、他の治療の場合と同様、特定の細胞内標的においてこれらの 薬剤の有効濃度に影響を及ぼす種々の因子に依存する。オリゴヌクレオチドに関 する１つの重要な因子は、ヌクレアーゼの存在下における安定性である。未修飾 のオリゴヌクレオチドが有用な治療用薬剤になるとは考えられない。なぜなら、 未修飾のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによって速やかに分解されるからで ある。したがって、オリゴヌクレオチドを耐ヌクレアーゼ性にするようこれに修 飾を施すことが必要となる。
耐ヌクレアーゼ性を高めるためのオリゴヌクレオチドの修飾は、一般には糖−リ ン酸主鎖のリン原子上で行われる。ホスホロチオエート、メチルホスホネート、 ホスホルアミデート、およびホスホトリエステルが、種々のレベルの耐ヌクレア ーゼ性を付与することが報告されている。しかしながら、一般にこのタイプのリ ン酸修飾オリゴヌクレオチドはハイブリッド形成特性がよくない［α）ｈｅｎ、 　Ｊ、Ｓ、。
ｅｄ、　Ｏｌｉｇｎｎｕｃｌｅｎｔｉｄｅｓ：　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉ ｂｉｔｏｒｓ　ｎｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ、（bＲＣＰ ｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　ＢｔｌｃａＲａｔｎｎ　ＦＬ、　１９８９）　］。
他の重要な因子は、疾病プロセスに関与している特定の細胞の形質膜をアンチ速 用薬剤にとっては不透過性である（ｆｉｌｓｏｎ、　Ｄ、Ｂ、　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４７：９３３−９６５（１９７８））。培養した哺乳 類細胞における天然オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの生物学 的効果と抗ウイルス効果が、文献により立証されている。したがって、これらの 薬剤は膜を透過して細胞内の標的に達することができると考えられる。天然オリ ゴヌクレオチドおよびある特定の耐ヌクレアーゼ性類似体（例えばアルキルトリ エステル類）を使用して、種々の哺乳類細胞（ＨＬ−６０、ゴールデンハムスタ ーの繊維芽細胞、Ｕ９３７、Ｌ９２９、ＣＶ−１，およびＡＴＨ８等の細胞）に よるアンチセンス化合物の取り込みが研究されている［　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ− ３，。
Ｂｒａｉｔｅｒｗｎ、　Ｌ、Ｔ、およびＴｓ’Ｏ，Ｐ、Ｏ，Ｐ、、　町匹慝弘畦 α１６：１９８８−１９９６（１９７７）：メチルホスホネート、　Ｍａｒｃｕ ｓ−３ｅｋｕｒａ、　Ｃ，Ｈ，、ｆｏｅｒｎｅｒ、　Ａ、Ｍ、、５ｈｉｎｏｚｕ ｋａ、　Ｋ、、　Ｚ。
ｎ、Ｇ、、およびＱｕｉｎ就ｎ、　ＧＪ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　 １５：５７４９−５７６３（１９８７）　：　ＭｉｌｌｅｒB Ｐ、Ｓ、、　ＭｃＰａｒｌａｎｄ、　Ｋ、Ｂ、、　Ｈａｙｅｒｍａｎ、　Ｋ、お よびＴｓ’Ｏ，Ｐ、Ｏ，Ｐ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ@１６： １９８８−１９９６（１９７７）　；ならびにＬｏｋｅ、　Ｓ、に−、５ｔｅｉ ｎ、　Ｃ，、Ｚｈａｎｇ、　Ｘ、Ｈ，Ａｖｉｇａｎ、　Ｍ、B Ｃｏ）１ｅｎ、　Ｊ、およびＮｅｃｋｅｒｓ、　Ｌ、Ｍ、　Ｔｎ　、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　Ｉｗｕｎｏｌ、　１４１：　２８２：２８９i１９ ８８）］。
修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド類似体は、対応する天然 オリゴヌクレオチドに比べて簡単には取り込まれにくい場合が多い。このため、 従来より使用されている多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、実際 の治療目的、学術研究目的、または診断目的に対して充分であるとは言えない。
アンチセンス治療牛用に設計された従来技術のオリゴヌクレオチドが有する他の ２つの大きな欠点は、細胞内ＲＮＡに対するハイブリッド形成がよくないこと、 およびＲＮＡの基本的な機能を停止させるための、明確な化学的または酵素仲介 による事象が欠如していることである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を高め、かつ上記の問題点を解消する ための修飾は、これまで多くの形態をとってきている。これらの修飾としては、 塩基環の修飾、糖部分の修飾、および糖−リン酸主鎖の修飾などがある。従来の 糖−リン酸主鎖修飾（特にリン原子上での）によれば、種々のレベルの耐ヌクレ アーゼ性が達成されている。しかしながら、アンチセンス方法論にとっては、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドが特定のＤＮＡまたはＲＮＡと正確に結合する能 力が基本となるが、修飾リンオリゴヌクレオチドは一般にハイブリッド形成特性 が劣っている。
リン原子の置換は、プロキラルのリン酸部分の修飾に伴う問題点を避けようとホ モポリ７−＝によるリン結合の置換が、方法論、生成する分子の溶解性、および ハイブリッド形成特性によって制約を受けているＨ　Ｍａｚｕｒら、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｒ＋ｎ　４０：３９４９−３９５６（１９８４）、本文献によれば、 ホスホニック結合によるリン結合の置換は、ホモトリマー分子の合成以上には実 現されていない：および　Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、　Ｊ、、　暴いてリン酸結合を 置き換えるには不適切である。
リン主鎖に修飾を施すための有効な方法が限定されていることから、アンチセン スオリゴヌクレオチドによる診断、治療、および学術研究を進めることができる よう、耐ヌクレアーゼ性と満足できる／Ｘ＜ブリッド形成特性を付与する他の修 飾法の開発が長年にわたって強く要望されている。
薬、および治療に使用するためのオリゴヌクレオチド類似体を提供することにあ 本発明の他の目的は、細胞内取り込みを高めたオリゴヌクレオチド類似体を提供 することにある。
本発明のさらに他の目的は、未修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドより高い 有効性を有するオリゴヌクレオチド類似体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、このようなオリゴヌクレオチド類似体の合成法およ び使用法を提供することにある。
当業者にとっては、上記の目的および他の目的は、本明細書および特許請求の範 囲から明らかとなろう。
発明の要約 本発明にしたがってＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の活性を調節するのに有用な組 成物は一般に、修飾された主鎖結合を少なくとも一部有するオリゴヌクレオチド 類似体を含む。これらの修飾においては、野生型の核酸にみられる糖−リン酸主 鎖のホスホロジエステル結合が、種々の四原子結合基（ｆｏｕｒ　ａｔｏ■ｌ　 ｉｎｋ　ｉｎｇｇｒｏｕｐ）で償き喬えられる。このような四原子結合基は、あ る糖または糖類似体の３′−炭素とその隣接した糖または糖類似体の４′−炭素 との間に、所望の四原子空間配置を保持している。本発明の教示にしたがって製 造されるオリゴヌクレオチド類似体は、−重鎖または二重鎖のＤＮＡもしくはＲ ＮＡの、あらかじめ選定されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成す ることが可能な選定された配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、 公知の固相合成法により合成されるのが適切であり、ＲＮＡまたはＤＮＡのあら かじめ選定されたヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは少なくと もその配列と特異的にハイブリッド形成が可能である。核酸合成器は市販されて おり、それらを使用することは、必要とされる妥当な長さをもった殆どすべての オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を生成させる上で有効であ ることが、当業者によって一般的に認識されている。
本明細書において使用している“ヌクレオシド”とは、複素環塩基とその糖で構 成された単位を表している。“ヌクレオチド”とは、その３゛または５゛位の糖 ヒドロキシル基上にリン酸基を有するヌクレオシドを表している。したがってヌ クレオシドは、ヌクレオチドと異なってリン酸基をもたない。“オリゴヌクレオ チド”とは、天然に産する塩基と活性ホスホジエステル結合によって糖基を介し て結合し、たペントフラノシル基から、特定の配列にて形成された複数の連結ヌ ク１ノオチト単位を意味している。これらのヌクレオチド単位は、グアニン、ア デニン、シトシン、チミン、またはウラシル等の核酸塩基であってもよい。糖基 は、チオキシリボースまたはリボースのいずれであってもよい。この用語は、天 然産出化学種と天然に産するサブ、ユニットから形成される合成化学種の両方を 表している。
本発明に関して使用されている“オリゴヌクレオチド類似体”とは、オリゴヌク ［／オチトと類似的に機能するが、天然には産し７ない部分を有する化合物を意 味している１、オリゴヌクレオチド類似体は、変化させた糖部分、変化させた塩 基部分、あるいは変化させた糖量結合を有することができる。あるいはまた、本 発明の目的のためには、非ホスホジエステル結合（すなわち、変化させた糖量結 合）を有するオリゴヌクレオチド類似体は“オリゴヌクレオシド”とみなすこと ができる。したがってこのようなオリゴヌクレオシドは、天然のホスホジエステ ル結合基以外の結合基によって連結された、複数の連結ヌクレオシド単位を意味 している。さらに、本発明の目的のためには、“オリゴマー”は、オリゴヌクレ オチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはオリゴヌクレオシドを包含している と考えることができる。したがって“オリゴマー”について説明する際には、天 然ホスホジエステル結合を介して、または本発明の四原子結合基も含めた他の結 合を介して一緒に連結されている一連のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体 に対しても言及がなされているものとする。一般には、結合はある１つのヌクレ オシドの３゛炭素から別のヌクレオシドの５゛炭素までであるが、　“オリゴマ ー”は他の結合（例えば２’−５’結合）も含むことができる。
オリゴヌクレオチド類似体はさらに、本発明の精神と矛盾しない他の修飾、特に 、ある特定のオリゴヌクレオチドをアンチセンスの治療用、診断用、または学術 研究試薬用として使用するのを容易にするために、オリゴヌクレオチド組成物の 耐ヌクレアーゼ性を増大させるような修飾も含むことができる。例えば、ヌクレ オシドまたはヌクレオチドの糖部分が炭素環式化合物や他の化合物で置き換えら れると、もはや糖ではない。さらに、他の置換（例えば、糖量ホスホジエステル 結合に対する１換）がなされると、得られる物質はもはや真の核酸化学種ではな い。このような置換から得られる化合物もすべて類似体とみなす。本明細書の全 体にわたって、核酸化学種の糖部分に言及しているときは、真の糖または天然核 酸の糖の従来の空間配列をもった化学種のいずれかに言及しているものとする。
さらに、糖量結合への言及では、糖部分または糖類似体部分を天然核酸の態様に おいて一緒に連結するよう作用する化合物も含んでいるものとする。
本発明によれば、細胞内への取り込み、耐ヌクレアーゼ性、およびハイブリット 形成特性を高めるように、かっＲＮＡの基本的な機能を停止させるための明確な 化学的または酵素仲介による事象を与えるように修飾された、新規タイプのアン チセンスオリゴヌクレオチド類似体およびオリゴヌクレオシドが提供される。
ある種類のオリゴヌクレオチド類似体組成物が、治療にとって有用であり、かつ 本発明の他の目的に対して有用であることが見いだされた。このようなオリゴヌ クレオチド類似体は、少なくとも一部が以下のような構造式を有するサブユニツ １−から形成される。
上記の構造式において、Ｂ、は可変の塩基部分であり、ＱはＯ，ＣＨ２，Ｃ）（ Ｆ。
またはＣＦ、であり、ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ，〜ＣＩＯ低級アルキル、置換低級アル キル。
アルカリール、アラルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ、、、０ＣＦ７．ＯＣ Ｎ。
Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、０−アルケニル、Ｓ−アルケニル 。
Ｎ−アルケニル、５ＯＣＨｚ、ＳＯ，ＩＣＨｉ、０ＮＯ２，ＮＯ２，Ｎｉ＋　Ｎ Ｈ２，ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミ ノ、ポリアルキルアミノ、または置換シリルである。さらに、Ｘは、ＲＮＡ開裂 基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴ ヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であってもよい。
ＬｌおよびＲ４は互いに独立的に、ＣＨ２，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ、Ｃ−ＮＨ２゜Ｃ− ＮＨＲ３，Ｃ−ＯＨ，Ｃ−５Ｈ，Ｃ−０−Ｒ１，またはＣ−３−Ｒ，である。
Ｒ２およびＬ：は互いに独立的に、ＣＲ＋　Ｒ２，Ｃ＝　ＣＲ＋　Ｒ２、Ｃ＝　 Ｎ　Ｒ１゜Ｐ　（０）　Ｒ，、Ｐ　（Ｓ）　Ｒ４＋　Ｃ＝０．　Ｃ＝Ｓ、　０． Ｓ、　ＳＯ，Ｓｏ、、　ＮＲ，、もしくはＳｉＲ５Ｒｇであるか、あるいは−緒 になってアルケン、アルキン、芳香環、炭素環、もしくは複素環の一部を形成す る。Ｌ、、Ｒ２，Ｌ、、およびＲ４は、Ｌ。
がＣ＝０まＲはＣ＝Ｓであるとぎは、Ｒ２はＮＲ，ではなく、またＲ４がＣ＝Ｏ またはＣ＝−８であるときは、ＬｌはＮＲ１ではないという条件の下にある。さ らに、Ｌ、、Ｌ、Ｌｌ、およびり、は、−緒になって−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＨ， 一部分。
または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ一部分を構成してもよい。
Ｒ１およびＲ２は互いに独立的に、Ｈ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，Ｃ１〜Ｃ１゜アル キル。
置換アルキル、アルケニル、アルカリール、アラルキル、アルコキシ、チオアル コキシ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、ヘテロシク ロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ ルアミノ、ハロ、ホルミル、ケト、ベンゾキシ、カルボキサミド、チオカルポキ ’ｊミｌ’、エステル、チオエステル、カルボギサミジン、カルバミル、ウレイ ド。
またはグアニジノである。さらにＲ７およびＲ２は互いに独立的に、ＲＮＡ開裂 基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴ ヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基を構成してもよい。
Ｒ３は、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ２，低級アルキル、置換低級アルキル、アルコキシ、低 級アルケニル、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキル アミノ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキル アミノ、ポリアルキルアミノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学 的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す るための基である。Ｒ４は、Ｏ）Ｉ、ＳＨ，ＮＨ，、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキ ル。
ＮＨ−アルキル、０−アルキルへテロシクｏ、Ｓ−アルキルへテロシクロ、Ｎ− アルキルへテロシクロ、または窒素含有複素環である。
Ｒ１およびＲ６は、それぞれ独立的にＣＩ−Ｃｓアルキルまたは０１〜Ｃ６アル コキシである。ただし、Ｒ２がＰ　（０）Ｒ４であり、Ｒ４がＯＨであり、Ｘが ＯＨであり、かつ、Ｂ、がウラシルまたはアデニンであるときは、ＬｌはＯでは なく、またり、、Ｒ２，およびＲ４がＣＨ２であり、ＸがＨまたはＯＨであり、 かつ、ＱがＯであるときは、Ｌ、はＳ、ＳＯ，またはＳ０２ではない。
好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は糖部分を含んでも よい（Ｑが０である場合のように）。他の態様によれば、Ｌ、およびＲ４のそれ ぞれはＣＲ−、Ｒ，である。Ｒ２およびり、は互いに独立的に、ＣＲ，Ｒ２，Ｏ 。
Ｐ　（０）Ｒ４，Ｐ　（ｓ）Ｒ，、またはＮＲ，であるのが好ましく、Ｒ２とＬ ｌの一方がＣＲ，Ｒ，であり、Ｒ２とり、の他方がＰ　（０）Ｒ，またはＰ　（ Ｓ）Ｒ，であるのが特に好ましい。Ｒ２が０であって、Ｌ、がＰ　（０）Ｒ４ま たはＰ　（Ｓ）Ｒ４であるような組み合わせも好ましい。
他の態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、Ｒ２およびＬｌのそ れぞれがＮＲ７であり、ここでＲ９がＨであるのが好ましい。
あるいはまた、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、Ｒ２とり、が−緒になっ て、シクロプロピル、シクロブチル、エチレンオキシ、エチルアジリジン、また は置換エチルアジリジン環の一部を形成しているものでもよい。さらに、Ｒ２と Ｒ３が一緒になって、Ｃ１〜Ｃ６炭素環、または４，５．もしくは６員構成の窒 素複素環を形成してもよい。
オリゴヌクレオチド類似体は、ＸがＨもしくはＯＨ１あるいはまたＦ、Ｏ−アル キル、またはＯ−アルケニルであって、そして特にＱが０であるようなものが好 ましい。基Ｂ１は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−ア ミノアデノシン、または５−メチルシトシンであるのが好ましいが、天然に存在 しない他の化学種も使用することができる。
他の好ましい実施態様は、Ｌ、およびＬ４がそれぞれＣＨ，であって、特にＬ２ およびＬ３がそれぞれＮＨであるようなオリゴヌクレオチド類似体である。ある いはまた、Ｌ２とＬ３の一方（好ましくはＬ３）が０であって、Ｌ２とり、の他 方がＮＨであるようなオリゴヌクレオチド類似体も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、与えられた構造を有するサブユニットを 約５〜５０個含むのが好ましい。オリゴヌクレオチド類似体の実質的にそれぞれ のサブユニットが前記構造を有することができるが、実質的に交互のサブユニッ トが前記構造を有することも望ましい。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、患者への治療投与ができるよう、医薬用 として許容しうるキャリヤー中に製剤するのが好ましい。本発明のオリゴヌクレ オチド類似体は、対応する天然のオリゴヌクレオチドに比べて、改良された耐ヌ クレアーＸセ性を示すと考えられる。
本発明はさらに、生物中における蛋白質の生成と活性を調節する方法に関する。
この方法は、該蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部と特異的にハイブ リッド形成することが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを接触させる ことを含み、ここで前記類似体のサブユニットの少なくともい（つかが前記の構 造を有する。
本発明はさらに、蛋白質の望ましくない生成を特徴とする疾患を有する生物を処 置する方法に関する。この方法は、該蛋白質をコードする核酸配列の少な（とも 一部とハイブリッド形成することが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物と を、単独もしくは医薬用として許容しつるキャリヤー中に製剤した形で接触させ ることを含み、ここで前記類似体のサブユニットの少なくともいくつかが前記の 構造を有する。
本発明はさらに、本発明の治療法の実施に有用なオリゴヌクレオチド類似体も含 めた、オリゴヌクレオチド類似体の合成法を提供する。これらの方法のうちのあ る特定の方法は、次の構造。
を含む第１の部分と、次の構造 を含む第２の部分（ここでＢ、は可変の塩基部分であり、ＱはＯ，ＣＨｌ、ＣＨ Ｆ。
またはＣＦＴ、であり、モしてＥｌおよびＥ２は同一または異なり請求電子反応 基である）を用意すること、および前記第１と第２の部分を、前記求電子反応基 を介して結合基とカップリングして、前記オリゴヌクレオチド類似体を形成させ ること、を含む１．好ましい方法によれば、第１の部分の電子反応基は、ｌ＼ロ メチル、トリフルオロメチル、スルホニルメチル、ｐ−メチル−ベンゼンスルホ ニルメチル、または３’−Ｃ−ホルミルを含み、そして第２の部分の電子反応基 は、／″−ロゲンスルホニルメチル、ｐ−メチル−ベンゼンスルホニルメチル、 またはアルデヒドを含む。結合基は、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンであ るのが好ましい。
本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチド類似体のし２またはＬｌの窒素部分を 保護する方法を提供し、ここでＬ２とり、の一方はＮＲ７であり、Ｒ３はＨであ る。
この方法は、窒素部分をフェノキシアセチルクロライドでブロックすること、オ リゴヌクレオチド類似体をさらに反応させて該オリゴヌクレオチドを修飾するこ と、および水酸化アンモニウムで窒素部分を脱ブロックすること：を含む・本発 明はさらに、二官能のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド類似体を保護する 方法を提供し、ここで二官能価のうちの一つはアルデヒドである。この方法は、 アルデヒドとメトキシアミンとを反応させてアルデヒドのオキシム誘導体を形成 させること、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド類似体をさらに反応させて 該ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド類似体を修飾すること、および該オキ シムをアセトアルデヒドと反応させてアルデヒドを再生させること、を含む。
本発明はさらに上記のオリゴヌクレオチド類似体を合成する方法を提供し、この 方法は、ペントフラノシルヌクレオシドの３′炭素原子においてラジカルを生成 させること、および別のペントフラノシルヌクレオシトの５゛位にペンダント状 態になっているオキシム部分と該ラジカルとを反応させること、を含む。前記オ リゴヌクレオチド頌似体の少なくとも一部を、別のオリゴヌクレオチド化学種に 組み込んで、天然のホスホジエステル結合とそのようにカンプリングされた区域 が実質的に交互に存在する状態の前記別のオリゴヌクレオチド類似体を得る、と いう形で治療用組成物を調製するのが有用である。組み込み（ｉｎｃＣ）ｒｐｃ ＋ｒａｔｉｎｎ）は、所望の配列を有するジヌクレオチドのホスホンエステル結 合によって達成するのが好ましく、このとき前記ジヌクレオチ１−はあらかじめ そのようにカップリングされている。。
を有するヌクレオシド前駆体も本発明によって意図されており、ここでＢ、は可 変の塩基部分であり、ＱはＯ，ＣＨ，、ＣＨＦ、またはＣＦ、であり、モしてＸ はＨ，ＯＨ，ＣＩ−Ｃ，ｏ低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、ア ラルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ１．０ＣＦ１．ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、 Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、０−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニ ル。
５ＯＣＨ１，Ｓｏ、ＣＨｌ、○ＮＯ，，Ｎｏ４．Ｎ１．ＮＨ２，ヘテロシクロア ルキル。
ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、ｌ換 ノリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するため の基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基である。
このような化学種においては、Ｙはヒドロキシ、アミノメチル、ヒドラジノメチ ル、ヒドロキシメチル、Ｃ−ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリー ル置換イミダ１９２人アミノヒドロキシメチル、オルト−メチルアミノヘンセン チオ、メチルホスホネート、またはメチルアルキルホスホネートである。ＺはＨ ，ヒドロキシル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシメチル、Ｃ−ホ ルミル、フタルイドヒドロキシメチル、アリール置換イミダゾリジノ、アミノヒ ドロキシメチル、オルトーメチルアミノヘンゼンチオ、メチルホスホネート、ま たはメチルアルキルホスホネートである。
上記のものはいずれも、ＱがＯであり、Ｙがヒドロキシメチルであり、かつＸが ＨまたはＯＨであるときは、２はＨまたはＣ−ホルミルではないという条件の下 にあり、またＱが０であり、ＸがＨまたはＯＨであり、かつＺがヒドロキシルで あるときは、Ｙはアミノヒドロキシメチル、ヒドラジノメチル、またはアリール 置換イミダゾリジノではないという条件の下にある。ＸがＨまたはＯＨであって 、Ｑが０であるのが好ましい。
修飾された糖結合を有するオリゴヌクレオチド類似体は、本発明の目的を達成す るのに有効であることが見いだされている。オリゴヌクレオチド類似体は、約５ 〜５０個の長さの核酸塩基サブユニットを有するのが好ましい。本発明によるオ リゴヌクレオチド類似体は、−重鎮もしくは二重鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの、あ らかじめ選定されたヌクレオチド配列とハイブリッド形成が可能である。本発明 を構成している核酸塩基は、ピリミジン類（例えば、チミン、ウラシル、または シトシン）でも、プリン類（例えば、グアニンやアデニン）でも、あるいはこれ らの修飾物（例えば５−メチルシトシン）でもよ（、いずれも選定された配列中 に配置されている。糖部分は、リポースタイプでも、デオキシリポースタイプで も、あるいは糖模倣体（ｓｕｇａｒ　ｍ１ｍ１ｃ）　（例えば炭素環）でもよい 。本発明の１つの好ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチド類似体又はオ リゴヌクレオチドは、ｔａｔ蛋白質をコードするＨＩＶ　ｍＲＮＡ、またはＨＩ Ｖ　ｍＲＮＡのＴＡＲ領域に対してハイブリダイズする。他の好ましい実施態様 においては、オリゴヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレオシドは、ＨＩＶ献 ＮＡのＴＡＲ領域の二次構造を模倣して、（、を蛋白質に結合することができる 、他の好ましいア゛〉・チ七ンスオリゴヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレ オ・ント配列（ツ、へ＼ルベスウイルス、乳頭種ウィルスおよび他のウィルスに 対する相補的配列を含む。
本発明の修飾された結合は、天然に存在するホスホジエステル−５°−メチレン 結合を置き換えるために四原子結合基を使用することが好ましい。天然に存在す る結合を本発明の四原子結合体（ｆｏｕｒ　ａｔＯｗＡｌｉｎｋＣｒ）て】き換 えると、こつして得られたオリゴヌクし／オシド類似体には、耐ヌクレアーゼ性 および細胞内取り込みの増大が与えられる。結合した糖の１つの３°−チオ計シ 機能を四原子結合体内に含ませるのが好ましい。この四原子結合体は・−Ｌ　、 −Ｒ２−Ｌ、−Ｌ、−という構造を有し、こ、二でＬｌおよびり、はメチレン炭 素原子または置換炭素原子であり、Ｒ２およびＬｌはメチレオ炭素原子、置換炭 素原子、酸素原子、窒素原子、置換炭素原子、１換りン原子、イオウ原子、置換 イオウ原子、または置換ケイ素原子である１、修飾結合は、実質的にそれぞわの 結合場所において施されるのが好ましい３、あるいはまた、修飾結合は、すべて の結合場所より少ない形で（例えば、交互の結合場所において）施してもよい。
結合は、中性であっても、あるいは正もしくは負に帯電していてもよい、。
本発明はさらに、このようなオリゴヌケＬ・オシドを合成する方法に関する。本 発明は、二原子フラグメントまたは置換二原子フラグメントの付加による、３′ −デオキシ−３°４換（特にメチル置換）ヌクレオシドと５′−デオキシ−５′ −置換ヌクレオシドとのカッブリソゲを提供する。この付加反応は、種々の適切 な電子性化合物に対して個々のヌクレオシドの３°位置および５°位置を活性化 させること、次いで適切な結合基を加えて電子剤と反応させることを含む逐次手 順により行われる。あるいはまた、この手順は並行操作的に行うこともできる。
このような方法では、支持体を手操作することまたは他の方法により、ＤＮＡ合 成器を介して固体支持体を使用することができる。
本発明はさらに、生物による蛋白質の生成を調節する方法に関する。この方法は 、これまでに説明してきた開示内容にしたがって配合した組成物と該生物とを接 触さぜることを含む。調節されるべきＲＮＡ部分またはＤＮＡ部分は、その形成 または活性が調節されるべき蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの部分を 含むようあらかじめ選定するのが好ましい。したがって、使用される組成物の標 的部分は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのあらかじめ選定された部分に対して相補的で あるよう（すなわち、当該部分に対してアンチセンスのオリゴヌクレオチドであ るよう）選定される。
本発明はさらに、蛋白質の望ましくない生成を特徴とする疾患を有する生物を治 療する方法に関する。この方法は、これまでに説明してきた開示内容にしたがう 組成物と該生物とを接触させることを含む。本組成物は、その生成または活性が 調節されるべき蛋白質をフードするメツセンジャーＲＮＡと特異的に結合するよ う設計されたものであるのが好ましい。本発明はさらに、生物または細胞中にお 番ブる異イなＲＮＡ分子の有無、あるいは正常なＲＮＡ分子の異常なもしくは不 適切な発現を検出するための診断法に関する。
本発明はさらに、学術研究用および診断用としてＲＮＡを選択的に結合するため の方法に関する。こうした選択的かつ強力な結合は、分解を引き起こすヌクレア ーゼに対して抵抗性があり、そして公知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド類似体より強力かつ正確にハイブリッド形成する本発明の組成物と、こ のようなＲＮＡまたはＤＮＡとを相互作用させることによって達成される。
図面の簡単な説明 図１は本発明のある特定の実施態様にしたがった概略の合成スキームであり。
図２は本発明の他の実施態様にしたがった概略の合成スキームである。
好ましい実施態様の詳細な説明 従来使用されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的活性は、一般に は、実際上の治療研究や診断での使用に対して充分であるとは言えない。本発明 は、修飾されたオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド類似体やオ リゴヌクレオシド）およびこのような修飾を達成するための方法に関する。これ らの修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、天然に存在す る対応物質に比べて高い安定性を示す。細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレ フ　−セｌｙ！　一般に、本発明の主鎖修飾オリゴヌク！、・オシド類似体やオ リゴヌクレオシドを認識せず、したがってこれらには結合しない。感受性のりン ー酸素結合の欠如のため、ヌクレアーゼＩ；よる主ｉ−１のいかなる結合も、ヌ クレオシド結合の開裂を起６：すことはない。さら１こ、こうして得られる本発 明の新規な中性または正に帯電した主鎖は、蛋白質仲介による複雑なプロセスを 必要とするよりむしろ、１純な受動輸送によ−、て細胞中に取り込まれることが できる。本発明の他の利点は、負に帯電した主鎖がないことにより、標的ＲＮＡ （負に帯電した主鎖を有し、したがって入ってくる同帯電のオリゴヌクレオチド に反発する）に対するオリゴヌクレオシド類似体またはオリゴヌクレオシドの配 列特異的な結合が容易になる、という点である１１本発明のさらζこ他の利点は 、標的ＲＮＡの触媒作用開裂を開始させることのできる官能基を結び付けるだめ の部位がこれらの構造タイプ中に見いだされる、という２点である。
好ましい実施態様によれば、本発明は、糖量リン酸基を２き換えて、下記構造に みられるような結合を有するオリゴヌクし・オシドを生成させることに関する。
上記構造において、 Ｂ、は可変の塩基部分であり、 Ｑは０．ＣＨｚ、Ｃ）（Ｆ、またはｃＦｚであり、ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ，−Ｃ，。
低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ 、ＣＮ、ＣＦ３，０ＣＦ３．ＯＣＮ、Ｏ−アルキル。
Ｓ−アルギル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニ ル、５ＯＣＨ３，５Ｏ２ＣＨ＊、０ＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ：ｌ、ＮＨ２，ヘテロシ クロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ ルアミノ。
置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する ための基、またはオリゴヌク１７オチトの薬力学的特性を改良するための基であ りり、およびＲ４は、互いに独立的にＣＨ２，Ｃ＝０．Ｃ＝Ｓ、Ｃ−ＮＨ２゜Ｃ −ＮＨＲ，、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−５Ｈ，Ｃ−０−Ｒ，、またはＣ−３−Ｒ，であり。
Ｒ２およびり、は、互いに独立的にＣＲ＋　Ｒ２，Ｃ”　ＣＲ＋　Ｒ２，Ｃ＝Ｎ 　Ｒ１゜Ｐ　（０）　Ｒ４，Ｐ　（Ｓ）　Ｒ，、Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ、　０．　Ｓ、 　Ｓｏ、　ｓｏ、、　ＮＲ＊、または５ｉＲ５Ｒｃであるか、あるいは−緒にな ってアルケン、アルキン、芳香環。
炭素環、または複素環を形成し。
Ｌ、、Ｌ、、Ｌｌ、およびＲ４は、−緒になって−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＨ２一部 分。
または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ一部分を構成し。
Ｒ８およびＲ２は、互いに独立的にＨ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ，、Ｃ，−ＣＩＯアル キル。
置換アルキル、アルケニル、アルカリール、アラルキル、アルコキシ、チオアル コキシ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、！換アルキルアミノ、ヘテロシク ロアルキル、ヘテロシクロアルギルアミノ、アミノアルキルアミノ、ポリアルギ ルアミノ、ハロ、ホルミル ナミド、エステル、チオエステル、カルボキサミジン、カルバミル、ウレイド。
グアニジノ、ＲＮＡ開裂基，オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する ための基．またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ．ＮＨ，、低級アルキル、置換低級アルキル、アルコキシ、低 級アルケニル、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキル アミノ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキル アミノ、ポリアルキルアミノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学 的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す るための基であり。
Ｒ４は、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ−アルキル。
Ｏ−アルキル複素環、Ｓ−アルキル複素環、Ｎ−アルキル複素環、または窒素含 有複素環であり、そして Ｒ５およびＲ６は、互いに独立的に０１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ６アルコ キシである： ただし、Ｌ、がＣ＝ＣまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｒ２はＮＲ１ではなく、Ｒ４ がＣ＝０またはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ、はＮＲ７ではな（：Ｒ２またはＬｌの 一方がＣ＝０またはＣ＝Ｓであるときは、Ｒ２またはＲ３の他方はＮＲ１ではな く：Ｌ２がＰ　（０）　Ｆ：；であり、Ｒ４がＯＨであり、ＸがＯＨであり、が っ、Ｂ、がウラシルまたはアデニンであるときは、Ｌ、はＯではなく、またり、 、Ｒ２，およびＲ４がＣＨ，であり、ＸがＨまたはＯＨであり、かつ、Ｑが０で あるときは、ＬｌはＳ。
ＳＯ９またはＳ０２ではない。
本発明の好ましい実施態様によれば、Ｌｌおよびり、はメチレン基である。この ような好ましい実施態様においては、Ｌ、！とＬｌの一方がアミノ基を含んでも よく、また他方がアミノ基または酸素を含んでもよい。したがって特定の好まし い実施態様においては、Ｒ２とＬｌは一緒になってヒドラジノ、アミノヒドロキ シ、またはヒドロキシアミノである。他の好ましい実施態様では、ＬｌまたはＲ ４の一方が、Ｒ２またはＬｌの一方と一緒になってＣＨ＝Ｎ基となり、そしてＲ ２またはＲ３の他方が酸素原子または窒素原子であり、したがってリンカ−はオ キシム基とヒドラゾン基を含む。このようなオキシム結合基またはヒドラゾン結 合基は、上述のアミノヒドロキシ基またはヒドラジン基に還元することができる 。
本発明の他の好ましい実施態様においては、Ｒ２およびり、は置換炭素、アミノ 、置換アミン、酸素、イオウ、イオウ酸化物、リン酸化物、またはケイ素酸化物 である。炭素上の置換基としては、水素、ヒドロキシ、チオ、アミノ、低級アル キル、置換低級アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、低級アルケニル、アラ ルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、ヘテロシク ロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ ルアミノ、ハロゲン、ホルミル、ケト、ベンゾキシ、エステル、チオエステル、 カルボキサミジン、グアニジノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態 学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良 するための基などがある。さらに他の好ましい実施態様では、Ｒ２とＲ３が一緒 になってＣ＝Ｃを形成している。さらに他の好ましい実施態様では、Ｒ２とり、 が−緒になって、炭素環、芳香環、複素芳香環または複素環を含む環構造の、Ｃ −Ｃ。
Ｃ−Ｃ，Ｃ−Ｎ、またはＮ−Ｃ二原子対を形成している。本発明のさらに他の好 ましい実施態様では、ＬｌおよびＲ４は、互いに独立にカルボキシ、チオカルボ キシ、メチルアミノ、メチルヒドロキシ、メチルチオ、エーテル、またはチオエ ーテルである７ 本発明はまた、修飾された糖量結合をもつオリゴヌクレオシドの製造方法をも目 的としている。これらの修飾は、固体支持体を用いて、手で操作することができ るかまたは、ＤＮＡ合成装置技術に習熟した人々には一般的に公知の方法論を用 いてＤＮＡ合成装置を用いて実施することができる。一般に、この手順には、選 択された配列中でお互いに隣接するであろう２つのヌクレオシドの糖部分を官能 化することが含まれる。５′から３′へという意味において、″上流”ヌクレオ シドは、一般に３“糖部位で修飾され、本明細書中でこの後“シンソン（ｓｙｎ ｔｈｏｎ）１”と呼ばれる。本発明の一方法では、アデニン、グアニン、シトシ ン、ウラシル、チミンのリボ−および２°−デオキシ−リボヌクレオシドおよび これらの類似体を修飾してその３°　−デオキシ−３−ヒドロキシメチル類似体 とする。次にこれらの３゛　−ヒドロキシメチル基を種々の型の電子中心に変換 する。これは下記の好ましい反応工程のような種々の方法で達成することができ る。
出発物質の一つである３°　−デオキシ−３°　−ヒドロキシメチルリボヌクレ オシドは、タウンセンド（Ｔ　ｏｗｎ　ｓ　ｅ　ｎ　ｄ）外、テトラヘドロン・ レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、３１：３１０１−３１ ０４（１９９０）。
サマノ・ブイ（Ｓａｍａｎｏ、Ｖ、）およびエム・ソエイ・センス（Ｍ、Ｊ、　 Ｍｏｒｒｉｓ）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリイ　（Ｊｏｕｒ ｎａＩ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５５：５１８６−５１ ８８（１９９０）およびバーゲストロム、ディー・イー（Ｂｅ　ｒｇｓ　ｔ　ｒ ｏｍ、Ｄ。
Ｅ、）、ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオシドズ（Ｎｕｃ　１ｅｏｓ　１ｄｅ ｓａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔ　１ｄｅｓ）８　（８）：１５２９−１５３５　（１ ９８９）によって開示されたようにして製造することができる。これらのヌクレ オシドの適当な公知の選択的糖ヒドロキシル保護とそれに続く標準的な２°　− 脱酸素化手順により、２°、３′　−ジデオキシ−３°−ヒドロキシメチル−リ ボヌクレオシドか得られるであろう。この型のヌクレオシドは選択的に保護して 、３゛　−ヒドロキシメチル成分を官能化して種々の適当な電子部分にすること ができる。本発明の好走しい具体化に従えば、このような電子部分にはハロメチ ル、トリフルオロメチル、スルホニルメチル、ｐ−メチルヘンセンスルホニルメ チル、ヒドラジノメチルまたは３’　−Ｃ−ホルミルがある。
“下流”ヌクレオシドは一般に５°糖部位で修飾され、本明細書中でこの後“シ ノソン（ｓｙｎｔｈｏｎ）２”と呼ばれる。種々の型の電子中心に変換されたそ れらの５°−ヒドロキシメチレン基をもつ、アデニン、グアニン、シトシン、ウ ラシル、チミンのリボおよび２°　−デオキシリボヌクレオシドおよびこれらの 類似体を生成するための修飾は、商業的に入手できるヌクレオシドを用いて種々 の手順によって達成することができる。例えば、５゛　−デオキシ−５’　−／ ％ロヌクレオシド、５゛−デオキシ−５゛−トシルヌクレオシド、および５゛　 −アルデヒド性ヌクレオシドは、ジョーンズ、シー・エイチ（Ｊｏｎｅｓ、Ｇ、 Ｈ，）およびン二イ・シー・モファゾト（１−Ｇ、Ｈｏｆｆａｔｔ）によりジャ ーナル・オブ・シ・アメリカン・ソサエティ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ａｍｅｒｉｅａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）９０：５３３７−５ ３３８（１９６３）において製造された。
一般に、ンフラン１は、構造 より成るものとして表わすことができ、一方シフラン２は一般に構造：（式中Ｂ ｘ可変の塩基成分であり、Ｑは○、ＣＨ２，ＣＩ（ＦまたはＣＦ２であり：そし てＥ＋およびＲ２は同一または異なり請求電子反応基である）より成る。
２つのシンソンは請求電子反応基と反応性の結合基によるかまたは別の方法で結 合される。シンソン１とシンソン２との間の結合は段階的に、あるいは一致して 起こることができ、本発明の修飾された結合により結合したジヌクレオシドを生 ずることができるかまたはヌクレオシドの鎖を生ずることができ、これらは各々 上記の修飾された結合によって次のものに結合させることができる。
一致した作用による結合は、アンモニアまたはアンモニア誘導体の存在における ようなシンソン１およびシンソン２の電子中心の間で起こって、ジヌクレオシド を生成することができる。本発明の好ましい具体化は、ヒドラジンの付加により 公知のブロモメチル型シフランを結合させて、−ＣＨｚＮＨＮＨＣＨ２−に等し い−ＬＩ　Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−を有する好ましい結合を生成させるものである。
本発明のもう一つの好ましい具体化はヒドロキシルアミンの付加によりブロモメ チル型シンンンを結合させて、−ＣＨｚ　Ｎ　ＨＯＣＨｚ−または−ＣＨｚＯＮ ＨＣＨ２−に等しい−Ｌ＋　Ｒ２Ｒ３Ｒ４−を有する結合を生成させるものであ る。
糖量結合を修飾してオ明細隻中に記載さ第１ｒいるシヌクし、・オシド構造を与 えｂこＪができるもう一つの方法は、・ウィツテイヒ反応によるものである。奸 ま［７（は、４−のよ−）な反応の出発物質は、クラン七ンｌ”　（Ｔ　ｏｗｎ 　ｓ　ｅ　ｎ　ｄ）外［テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅａｒｏｎ　 Ｌｅｔｔｅｒｓ）３１：３１ｔ）１−３１０４　（１９９０）］　；ザ７．／・ ヴイ　（Ｓａｍａｒｉｏ、Ｖ、）およびエム・シＬイ・モリス（Ｍ、Ｊ、　Ｍｏ 　ｒ　ｒ　ｉ　ｓ）　［ツヤ−ナル・オブ・オーガニック゛ケミストリイ　（Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）５５　：　５１８ Ｇ−５１８８（１９９０）　およびバーゲストロム・ディー　・４−（Ｂｅ　ｒ 　ｇ　ｓ　ｔ　ｒ　ｏｍ、　Ｄ、Ｅ、　）外［ヌクレオシドス　アンド・ヌクレ オクイズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）８（８ ）１、５２９−１５３５　（］、、　９８９　）コにより開示されたようｊ；ｉ −３’　−ケトヌクレオシド、または、ンッーンズ・シー・エイチ（Ｊ　ｏｎｅ 　ｓ、　Ｇ、　Ｈ）およびシエイ・シー　・モファット（Ｊ、Ｇ、Ｍｏｆｆａｔ ｔ）［ジャーナル・オブ・シ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ　（Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ ｙ）９０：５３３７−５３３８（１９６８）］によって開示されたような５゛− アルデヒド性ヌクレオシドである。出発物質は好ましくは、ペンシルまたはその 他の保護基を有するリンイリドと反応させる。本発明に有用な一つの好ましいイ リドはトリフェニルホスホラン−ベンジルオキシメチリジンである。本発明用に 好ましく使用されるもう−っのイリドは、トリフェニルホスホランーベンジルオ キシエチリジンである。ビニル基の還元およびベンジル保護基の水添分解は、グ アニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシルの所望のヌクレオシドまたはこ れらのヌクレオシドの類似体の５′　または３゛位に各々ヒドロキシメチルおよ びヒドロキシエチル部分を与える。
さらにウィツテイヒ反応を使用して炭素環ヌクレオシドの５′および３′　ヒド ロキシアルキル部分を得ることができる。
求電子中心を与えるためのヒドロキシル基の変換およびそれに続＜３゛求電子中 心の請求核中心との結合により、本発明のジヌクレオシドが得られるであろう。
本発明の一具体化においては、ヒドロキシル基を変換してブロマイド、トリフレ ー！・、およびドア／レートのよう請求電子中心を与える。結合により、１また は２個のへテロ原子を有する炭素鎖によって連結させられたジヌクレオシドが得 られる。好ましくはこのようなヘテロ原子は、先に示した一般式に示されるよう にＯ，ＮＨ，ＮＲ３−Ｓ、Ｓｏ、ＳＯ２，Ｐ　（０）Ｒ４，Ｐ　（Ｓ）Ｒ４また は５ｉＲｓＲ６である。
３゛　または５°カルボニルヌクレオシドおよびトリフェニルホスホリンメチリ ジンジフェニルホスホネートを包含するウィツテイヒ反応から誘導することがで きると思われるその他の有用なジヌクレオシドは、ホスホネートジヌクレオシド である。この反応は、相当する５゛　−または３°　ヒドロキシ基と縮合して３ ゛−または５゛　−ホスホネート結合したオリゴヌクレオシドを与えることがで きるホスホン酸メチルまたはエチルを与える。この型の化学はモファット、ジエ イ・ジー（Ｍｏｆ−ｆａｔｔ　Ｊ、Ｇ、）外、ジャーナル・オブ・アメリカン・ ケミカル・ソサエティ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌＳａｃ　ｉｅ　ｔｙ）９２　：　５５１０−５５１３　（１９７０）お よびマズール、エイ（Ｍａｚｕｒ、Ａ、）、ビー・イーートｏ７プ（Ｂ、Ｅ、Ｔ ｒｏｐｐ）、およびアール・エンゲル（Ｒ，Ｅｎｒｅ　Ｌ）　、テトラヘドロン （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ。
ｎ）４０　：　３９４９−３９５６　（１９８４）の生化学的方法の研究のため のジヌクレオシドのホスホネートの製法中に開示された。このタイプの結合を使 用して、対称なビス（メチルトリフェニルホスファン）フェニルホスフェートを 用いて３°　−ケトヌクレオシドを５゛−ヌクレオシドに結合させて、３’、５ ’　−ジメチルホスホネート結合したオリゴヌクレオチドとすることによって、 好ましい具体化か製造される。
ウィツテイヒ反応に加えて、３°　−ヒドロキシメチルヌクレオシドはまた、ア ルファ炭素環ヌクレオシドの転化によって製造することもできる。これにより“ 下“またはアルファ面上に所望の３′　ヒドロキシメチル基が得られるであろう 。
この基は、保護することができる。３″−ヒドロキシル基（糖の３゛位に結合し た環外メチルを３”メチルと認定する）は、ヒドロキシメチル基またはより長い アルキル基に変換することができる。３”基を変換する一方法には、ケト基への 酸什とそれに続くトリフェニルホスホリンメチリジンジフェニルホスホネートを 用いるウィツテイヒ反応および還元が包含される。より長いヒドロキシアルキル 基は、こうして３”−位に配置することができる。この具体化はまた、４°　− デスメチル−３゛−ヒトロキシメチルヌクレオシドシフランをも与える。２原子 結合剤を用いるこの４°　−デスメチルヌクレオシドおよび普通の３“　−ヒド ロキシ−ヌクレオシドの間の結合により、先に出願中の１９９０年８月１３日出 願の出ａＮｏ、５６６．８３６　にの出願は、本出願の譲受人に譲渡されている ）中に開示されたようなシヌクレオシトシフランが得られるであろう。４゛　− デスメチルヒドロキシル基を適当な上記の３′　−シンランと結合させると、数 多くの他の型の新規シヌクレオシドシフランが得られるであろう。
さらにもう一つの３′　−デオキシ−３′　−メチルヌクレオシドのメチル基を 官能化するだめの方法は、３″−デオキシ−３°　〜シアノヌクレオシドから作 り出すことかできる。バークス・ケイ・イー・ビー（Ｐａｒｋｅｓ、に、Ｅ、Ｂ 、）、およびケイ・ティラー（Ｋ、Ｔａｙｌｏｒ）、　テトラヘドロン・レター ズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２９：２９９５−２９９６（１ ９８８）には、３゛−シアノヌクレオシド類の一般的な合成法が記載されている 。この方法では、５゛−トリチル保護された２゛　−デオキシヌクレオシドをヨ ウ化メチルトリフェニルホスホニウムで３′　−ヨウ素化する。次にこの物質を ヘキサメチルニヌズ、ｔ−ブチル−イソニトリル、および２．２′　−アゾ−ビ スイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）で処理して、３′　−位にシアノ基のラジカ ル付加を起こさせろ。シアノ基のアルデヒドへの変換は、高収率で達成される。
続いて、この中間体をヒドロキシメチル官能基に変換するが、これは電子シンラ ン１への有用な前駆体である。
糖量結合を修飾し、でシヌ９　＋、／オシドを与えることができる別の方法は、 シンラン】としての３’　−Ｃ−ホルミル誘導されたヌクレオシドおよびシンラ ン２としての５′−アミノヒドロキシ誘導されたヌクレオシドを使用する。シン ラン１および２を直接結合させると、オキシム結合によって結合したジヌクレオ シドが得られる。この場合には、オキシムはＥ／Ｚ異性体として存在する。これ らの異性体化合物は、ＨＰＬＣを用いて分離される。さらにこの場合に、オキシ ム窒素原子は、上流ヌクレオシドの３゛　−末端の炭素原子に隣接している。５ ゛　または下流ヌクレオシドの炭素原子に隣接するオキシム窒素を有するジヌク レオシドは、シンラン２としての５°　−Ｃ−ホルミル誘導ヌクレオシドおよび シンラン１としての３°　−デオキシ−３°　−アミノヒドロキシメチル誘導ヌ クレオシドを使用して合成される。この場合には、オキシムＥ／Ｚ異性体も得ら れる。両方の場合に、オキシム結合した二量体は、オリゴマーへの直接組み入れ に有用であるがまたは、次に還元して相当するヒドロキシアミノ結合ジヌクレオ シドとすることができる。
オリゴマー中のジヌクレオシドとしてのまたはジヌクレオシド部分としてのオキ シム結合ジヌクレオシドの、水素化シアノホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｃ ｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）を用いる還元により、相当するアミノヒドロ キシル結合化合物が得られる。ヒドロキシアミノ結合ジヌクレオシドまたは大オ リゴマーは、アミノヒドロキシル結合のアミノ部分でアルキル化して、相当する Ｎ−アルキルアミノ結合を得ることができるであろう。
３°　−Ｃ−ホルミル誘導されたシンラン１は、いくつかの合成法によって形成 することができる。現行の好ましい方法では、相当する３′−デオキシ−３゛− ヨードヌクレオシドのラジカルカルボニル化を使用する。このヨード化合物をＣ ｏ、ＡＩＢＮ、すなわち２．２′　−アゾビスイソブトリロニトリル、およびＴ ＴＭＳ、すなわちトリス（トリメチルシリル）シランで処理する。別法として、 このものは３°　−デオキシ−３゛　−シアノ糖またはヌクレオシドから合成す ることができる。５゛−Ｃ−ホルミル（または５°　−アルデヒドとしても認定 される）および３°　−Ｃ−ホルミル基の両方を、ブロック基として０−メチル アミノベンゼンチオールを使用して容易にブロックすることができる。この５゛ および３°　−Ｃ−ホルミル基の両者は、硝酸銀醒化により脱ブロックすること ができる。
３”　−〇−ホルミルヌクレオシド合成の別法においては、その製造のために１ −〇−メチルー３′　−デオキシ−３’　−０−メチルアミノベンゼンチオール −５’　−０−トリチル−β−り一エリトローベントフラノシドを使用すること ができる。このとき、この化合物はすべての３°　−デオキシ−３’　−Ｃ−ポ ルミルヌりしノオシドのための前駆体としてはたらく。この１−０−メチル−３ ゛　−デオキシ−３゛−〇−メチルアミノベンゼンチオール−５’　−０−トリ チル−β−Ｄ−エリトロ−ベントフラノシドを標準的なグリコジル化条件を用い て適当な塩基と反応させ、続いて脱ブロックしてヌクレオシドを得る。さらにも う一つの別法においても、３°　−デオキシ−３゛　−シアノヌクレオシドは相 当する３°　−デオキシ−３゛　−ヨードヌクレオシドからか、または１−０− メチル−３゛　−デオキシ−３’　−〇−シアノー５°　−０−トリチル−β− り一エリトローベントフラノシドとのグリコジル化反応によって製造される。
３”−〇−アミノー３”−ヒドロキシメチルヌクレオシドおよび相当する５゛− Ｏ−アミノヌクレオシドは、好都合には、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、トリフ ェニルホスフィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレートを用いるミツノ ブ（ＭｉＪｓｕｎｏｂｕ）条件により、保護されたフタルイミド中間体を経て製 造することかできる。この中間体は、ヌクレオシドの未保護ヒドロキシル基のミ ツノブ反応によって製造される。３”−〇−アミノー３”−ヒドロキシメチルヌ クレオシドを形成する際には、トリチルは、ヌクレオシドの５′　−ヒドロキシ ル基のためのブロック基としてはたらく。プリンおよびピリミジンヌクレオシド の両方について、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドと反応させる前に３゛　−ヒドロ キシ基をＴＢＤＰＳで保護する。ピリミジン塩基については５゛−〇−アミノヌ クレオシドを形成する際に、５゛位へのフタルイミドの導入後に、３′　−ヒド ロキシルをＴＢＤＰＳブロック基で保護することができる。
糖量結合を修飾してホスホネート結合したジヌクレオチドを与えるための別の方 法は、３°−Ｃ−ホスホネートニ量体の形成のためのマズール（Ｍａｚｕｒ）外 、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、２０：３９４９　（１９８４） のミカエリスーアルブゾフ（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ａｒｂｕｚｏｖ）法を使用す するであろう。これをＮ−ブロモスクシンイミドで処理して相当する３”−プロ セメチル誘導体を得る。シンラン２は５”−ホスファイトとして選択される。シ ンラン１および２の結合により、３゛−Ｃ−ホスホネート結合により結合したジ ヌクレオシドか得られる。相当する５°　−Ｃ−ホスホネートニ量体は、最初に 適当なブロックされたホスファイトをシンランｌと反応させ、次に脱ブロックし て３’　ＣＨ２−ホスファイト中間体を得ることによって得ることができる。シ ンラン２は、５゛　−ブロモヌクレオシドとして選択される。次に３’　−ＣＨ ２−ホスファイト中間体をシンラン２と反応させて５“−〇−ホスフエートニ量 体を得る。シンラン１への結合後にブロックされた亜リン酸エステルとして亜リ ン酸トリペンシルを選択することにより、ベンジル基を水添分解により除去する ことができる。別法として５′　−デオキシ−５゛−ブロモヌクレオシドを亜リ ン酸エステルと反応させて５°−ホスホネートとする。このものを次に、３゛　 −ヒドロキシメチルヌクレオシドと反応させて、５′−〇−ホスホネート結合し た二量体を得る。
ヒドラジノ、ヒドロキシルアミンおよび本発明のその他の結合基によって結合し た上記の方法のいずれかから得られるジヌクレオシドは、５°　−ヒドロキシル でジメトキシトリチル基によって保護され、３゛　−ヒドロキシルでシアノエチ ルジイソプロビルホスファイト部分と結合させるために活性化されることができ る。
これらの二量体は、ホスホアミダイト結合化学を用いる標準的な面相自動ＤＮＡ 合成によって、あらゆる所望の配列内に挿入されることができる。このため、保 護されたジヌクレオシドは、通常のホスホジエステル結合を用いて特定のＤＮＡ 配列の単位と結合される。得られるオリゴヌクレオチド類似体またはオリゴマー は、混合主、１！　（一部分は普通のホスホジエステル結合であり、一部分は本 発明の新規四側子結合）を有している。このようにして、７つのヒドロキシルア ミン、ヒドラジンまたはその他の型の結合を有するジヌクレオシドを含むような １５量体の配列特異的オリゴヌクレオチドを容易に合成することができる。この ような構造は、天然のホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドに比べて増 大した水溶性を与えるであろう。
均一な主鎖結合を含むオリゴヌクレオチドは、ＣＰＧ−固体支持体および標準的 な核酸合成装置、すなわちアプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｅ、）３８０Ｂおよび３９４およびミリゲン／ノ（イ オザーチ（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｉｇｃｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）７５００および８８ ００゜の使用によって合成することかできる。最初のヌクレオシド（３゛　〜末 端の１番）を制御された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐａｒｅ　ｇｌａ ｓｓ）のような固体支持体にとりつけ、各々の新規なヌクレオシドを、配列特異 性順序に手操作または自動合成装百システムによって結合させる。メチレンヒド ラジン結合の場合には、反復ヌクレオシド単位は２つの一般的な型のもの、例え ば、５゛−保護されたアルデヒド官能基および３゛　−デオキシ−３’　−Ｃ− ヒドラジノメチル基をもつヌクレオシド、または機工安定性基によって保護され た５′　−デオキシ−５゛　−ヒドラジノ基および３°　−デオキシ−３°　− Ｃ−ホルミル基を有するヌクレオシドであることかできる。各々の場合に、次に 続く配列が必要とする塩基を加えるために各サイクルについてくり返される条件 には次のものがある　５゛　−アルデヒド保護基を除去するための酸洗浄、各々 のヒドラジン塩結を形成するための３゛　−メチレンとドラジノ基をもつ次のヌ クレオシドの付加、および所望のメチレンヒドラジン結合したＣＰＧ−結合オリ ゴヌクレオシトを得るための種々の藁剤のいずれかを用いる還元。このような有 用な還元剤の一〇は、水素化シアノホウ素ナトリウムである。
奸ましい方法は図１に示されている。この方法には、保護された５゛部位をもつ シンラン２か結合している固体支持体を用いる。好ましくは、上記のシンランの ５゛部位はＤＭＴで保護することができる。その後、シンラン２の５゛部位を緩 機で遊離させ、洗浄し、そして酸化して中間体生成物を生成する。一つの好まし い方法では、アルデヒド誘導体をＮ、　Ｎ〜ジフェニルエチレンジアミンと反応 させて、中間体生成物５゛　−ジフェニルイミダゾリジノ保護されたシンラン２ を生成する。より好ましい方法では、５゛　−ジフェニルイミダゾリジノ保護さ れたシンラン２を直接支持体上に載せる。どちらの方法についても、中間生成物 は次に脱ブロックされて請求核性の５゛位をもつシンラン２を与える。次に５゛ 　−ジフェニルイミダゾリジノ保護された３゛　−デオキシ−３°　−Ｃ−ヒド ラジン塩基のような保護された５゛−、アルデヒド基をもつシンラン１を添ｎ口 して、水素化シアノホウ素ナトリウムの添加等によって、結合したシンラン２と 反応させることができる。洗浄した後で、ヒドラジノ部分により結合したジヌク レオシドが形成される。その後で、このサイクルを所望に応じて、シンラン１の 化学種の付加とそれに続く酸／塩基脱保護によりくり返して、修飾された糖量結 合により結合したポリシンラン（結果として得られる所望の配列のオリゴマー） を生成することかできる。本発明のいくつかの好ましい具体化においては、シン ラン１の化学種は５°　−ＤＭＴ保護された３”　−Ｃ−ヒドラジン塩基である ことができる。
この段階法の一つの好ましい具体化では、固体支持体への結合中、シンラン２の 電子中心を保護するためにジフェニルエチルシアミン付加物（１，３−ジ置換イ ミダゾリジノ）を使用する［モファット・シエイ・ジー（Ｍｏｆｆａｔｔ。
Ｊ、　Ｇ、　）外、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ンサエティ（Ｊ ｏｕｒｎｓｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ） ９０５３３７．５３３８　（１，９６８）］。シンソランは好ましくは、制御さ れた細孔ガラス支持体または当技術分野に習熟した人々には公知のその他の適当 な支持体のような固体支持体に結合させることができる。結合は標準法によって 行うことができる［ガイド・エム・ジェイ（Ｇａ　ｉ　ｔ、　Ｍ、Ｊ、　）著、 オリゴヌクレオタイド・シンセシス、ア・プラクティカル・アプローチ（Ｏｆ　 ｉｇｏｎｕｃ　ｌｅ。
ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ） 。
アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）１９８４］。別法として、 製造は、保護された結合ヌクレオシドを種々の標準的な酸化法で直接酸化するこ とによって行うことができる。結合シンラン２は、好ましくは、ヒドラジンと反 応させて、シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ’　ｓ）塩基を生成させ、これを続いて還元す ることができる。ヒドロキシルアミンもまたこの方法に有用な好ましい反応体で ある。
均一な主鎖結合オリゴヌクレオシドを合成する別の方法が図２に示されている。
この方法もまた、保護された５゛部位をもつシンラン２が結合されている固体支 持体を使用する。この場合には、シンランの５゛部位はフタルイミド基で保護さ れる。その後、シンンン２の５゛部位をＤＣＭ中のメチルヒドラジンで遊離させ て、ＤＣＭ　メタノールで洗浄する。シンラン１の５゛位のアミノヒドロキシル 基もまた、フタルイミド基で保護される。このようなシンラン１は５°　−フタ ルイミド保護された３°　−デオキシ−３°−Ｃ−ホルミルヌクレオシドである 。シンラン１をシンラン２と反応させ、続いて５゛位を脱保護し、洗浄して次の ５゜−アミノヒドロキシ反応部位を遊離させる。このサイクルを、シンラン１の 別の付加について所望の配列か構成されるまで十分な回数くり返す。この配列の 各ヌクレオシドをオキシム結合で結合させる。所望のオリゴヌクレオシドの末端 ヌク１ノオシドを、５°　−ＤＭＴブロックされた３′−デオキシ−３゛−Ｃ− ホルミルヌクレオシドとして配列に加える。オキシム結合したオリゴヌクレオシ ドは、支持体から除去することができる。もしアミノヒドロキシル結合したオリ ゴヌクレオシドか望ましいならば、オキシム結合を水素化シアノホウ素ナトリウ ムで還元オろ。別法として、オキシム結合したオリゴヌクレオシドがまだ支持体 に結合している間に還元を行なうことができる。
また、大発明に従えば、構造 （式中、Ｂｘｌｉ、可変の塩基成分でＪ５す；ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦまたはＣ Ｆ２であり：ＸはＨ；ＯＨ；Ｃ，〜ＣＩＯ低級アルキル、置換低級アルキル、ア ルカリールまたはアラルキル；Ｆ　：Ｃ１；Ｂｒ　；ＣＮ；ＣＦｓ；０ＣＦｓ： ＯＣＮ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル、Ｏ−アルケニル、 Ｓ−アルケニル。
またはＮ−アルケニル；　５ＯＣＨ３：　ＳＯｚＣＨｇ：０ＮＯ２：ＮＣ）ｚ： Ｎｓ；ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアル キルアミノ：ポリアルキルアミノ、ｉｌ！換シリル；ＲＮＡ開裂基；オリゴヌク レオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの 薬力学特性を改良するための基、である） を有するヌクレオシドか提供される。
このような種では、Ｙはヒドロキシル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒド ロキシメチル、Ｃ−ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置換イ ミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、メチルアミノベンゼンチオ、メチルホ スホネートおよびメチルアルキルホスホネートであり、そしてＺはＨ，ヒドロキ シル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシルメチル、Ｃ−ホルミル、 フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキ シメチル、オルト−メチルアミノベンゼンチオ、メチルホスホネートまたはメチ ルアルキルホスホネート、である。
上述の基はすべて、ＱかＯであり、Ｙがヒドロキシメチルであり、かつ、ＸがＨ またはＯＨであるときは、ＺはＨまたはＣ−ホルミルではなく、またＱがＯであ り、ＸがＨまたはＯＨであり、かつ、Ｚがヒドロキシルであるときは、Ｙはアミ ノヒドロキシメチル、ヒドラジノメチルまたはアリール置換イミダブリジノでは ないという条件付きである。
本発明のオリゴヌクレオシド類似体は、診断、治療に、そして研究試薬およびキ ットとして使用することができる。治療用には、このオリゴヌクレオシド類似体 を、何らかの蛋白質によって調節される疾患を有する動物に投与される。このよ うな疾患を有すると思われる患者に、その病気の症状を弱めるために有効である 量のオリゴヌクレオシド類似体を投与するのが好ましい。当技術分野に習熟した 人は、このような治療養生のための最適用量および治療スケジュールを決定する ことができる。
本発明に従う治療薬を経口、静脈内、または筋肉内のように内部に投与するのが 一般に好ましい。経皮、局所、または病変内のようなその他の投与形も有用であ る。生薬内の封入も有用である。薬理学的に受容できるキャリヤーの使用も、い くつかの具体化のためには有用である。
実施例 下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであるが、制限するものではな い。これらの実施例においては、二量体およびその他のより高級なオリゴヌクレ オシドのＮＭＲのために、二量体およびその他の高級オリゴヌクレオシドの単量 体単位に番号をつける。すなわち、５°末端ヌクレオシドから３′末端ヌクレオ シドに向かって、ＴＩ、Ｔ２−シたがってＴ−Ｔ二量体の５゛　ヌクレオシドは Ｔ、てあり、３゛　ヌクレオシドはＴ２である。
実施例１　メチレンヒドラジン、すなわち（３’　ＣＨｚ　−Ｎ　Ｈ−Ｎ　Ｈ− ＣＨ２−５°）結合したオリゴヌクレオシドのためのＣＰＧ−結合ヌクレオシド の合成ジフェニルイミダゾリジン保護された５゛　−アルデヒド性チミジンＣＰ Ｇ−結合したヌクレオシド、ジフェニルイミダゾリジノ保護された５°　−アル デヒド性チミジンおよび５°　−デオキシ−５゛−ヒドラジノ−チミジンの含１ １ｉｊｊ　ＣＰＧ−結合したチミジン［カリホルニア州、フォスター（Ｆｏｓｔ ｅｒ）市、ＡＢｌ、ＣＰＧ支持体１グラム上のチミジン３０マイクログラム）を 、周囲温度で、ＤＭ　Ｓ　Ｏ，ベンセン、ＤＣＣ，ピリジン、およびトリフルオ ロ酢酸［１５ｍ１／１５ｍ１／２．４８ｇ１０．４ｍ１１０．２ｍ１）の混合物 で、フィー／ツアー、ケイ・イー（Ｐｆｉｔｚｅｒ、に、Ｅ、）およびジエイ・ ジー・モファットＤ、Ｇ、Ｍｏｆｆａｔｔ）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ ケミカル・ソサエティ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｓ。
ｃ　ｉｅ　ｔｙ）８５　：　３０２７　（１９６３）の酸化手順と同様に処理し て、５゛−アルデヒド性ヌクレオシドを得る。混合物を一晩貯蔵した後、濾過す る。支持体を蓚酸（ベンゼン／ＤＭ５０．１対１．５ｍｌ中１．３ｇ）で洗浄し て、１．２−ジアニリノエチレン（３，０ｇ）で１時間処理し、濾過し、モして アセトニトリルで洗浄して、５゛　−ジフェニルイミダゾリジノ保護された５° 　−アルデヒド性チミジンを得る。
５°　−デオキシ−５゛　−ヒドラジノ−チミジン支持体と結合した５゛　−ア ルデヒドチミジンの、アセトニトリル中のヒドラジン水和物／水素化シアノホウ 素ナトリウムの溶液による処理により、ＣＰＧ−３“　−結合した５°　−デオ キシ−５゛−ヒドラジノチミジンが得られ、このものをその塩酸塩として貯蔵す る。
５゛　−ジフェニルイミダブリジノ保護された３′−デオキシ−３゛−Ｃ−ヒド ラジノメチルチミジン 商業的に入手可能な３′　−Ｏ−アセチルチミジンを酸化して、次にそのＮ、　 Ｎ−ジフェニルエチレンジアミン誘導体（１，３−ジフェニルイミダゾリジノ） として保護した。これにより、公知の５゛　−デオキシ−５゛　−ジフェニルイ ミダゾリシノー３゛−０−アセチルチミジンが得られる。フィッツアー、ケイ・ イー（Ｐｆｉｔｚｅｒ、に、Ｅ、）およびジエイ・シー・モア７７トＤ、　Ｇ、 　Ｍｏ　ｆ　ｆａｔｔ）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ ィ　（Ｊ　ｏ　ｕ　ｒ　ｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａ　５ ｏｃｉｅｔｙ）８５：３０２７　（１９６３）。この物質の加水分解を、周囲温 度で１５時間、メタノール性アンモニア処理をすることによって達成した。５° 　−デオキシ−５゛　−ジフェニルイミダゾリジノチミシン（４，５ｇ）をＤＭ Ｆ　（１００ｍｌ）に溶解させ、室温で１５時間、沃化トリフェニルメチルホス ホニウムで処理した。溶媒を減圧下で除去し、得られる残留物をメタノールから 再結晶させて３°　−デオキシ−３゛−ヨード誘導体を得た。３′　−デオキシ −３°　−ヨード−５°　−ジフェニルイミダゾリジノチミシンをトルエンに溶 解させて、ヘキサメチルニスズ、ｔ−ブチルイソニトリル、およびＡＩＢＮで処 理した。このラジカル反応により、３°　−デオキシ−３゛−シアノ誘導体を得 て、次にこのものを０℃でトルエン／ＴＨＦ中の水素化ジイソブチルアルミニウ ム（Ｄ　Ｉ　ＢＡＬ−Ｈ）で還元して、３゛　−デオキシ−３′−〇−ホルミル ー５゛　−ジフェニルイミダブリジノチミジンを得た。
この物質を、アセトニトリル中のヒドラジン水和物及び水素化シアノホウ素ナト リウムで処理して、５゛　−ジフェニルイミダゾリジノ保護された３°　−デオ キシ−３’−Ｃ−ヒドラジノメチルチミジンを得た。この物質は酢酸塩として都 合よく貯蔵される。
実施例２　ＤＮＡ合成装置上での均一な（３”　−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ２ −５゛）、すなわち、メチレンヒドラジン結合したオリゴヌクレオシドの合成３ ′　−末端ヌクレオシドになるであろう実施例１からのジフェニルイミダゾリジ ノ保護された５゛　−アルデヒドをもつＣＰＧ−結合したチミジンを、アプライ ド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ）（ ＡＢｉ）のカラムに入れ（２５０ｍｇ、１０マイクロモルの結合ヌクレオシド） ＡＢＩ　３８０Ｂ自動ＤＮＡ合５５．装置にとりつける。デスメチルヌクレオシ ド単位を成長する鎖に結合させるために必要とされるサイクルの自動化（コンピ ューターへ制御された）段階は、下記の通りである。
段階　試薬または溶ｋｘ混合物　時間（分　秒〕１　３％ジクロロエタン中のＤ ＣＡ　３　：　００２　ジクロロエタン洗浄　１００ ３５°　−デオキシ−５°−，（１，３−ジフェニルイミダゾリジノ）−３゛　 −デオキシ−３’　−Ｃ−メチレンヒドランンヌクレオシド（第２のヌクレオシ ド）。
アセトニトリル３０　ｍ　ｌ中　２０マイクロモル　２５０４　水素化ホウ素す トリウム（１：Ｉ　ＴＨＦ／ＥｔＯＨ中５０マイクロモル、５０ｍ１）　３°０ ０５　ジクロロエタン洗浄　２００ ６　段階１で始まるリサイクル（酸洗浄）　３：００この手順で、その生成物ヌ クレオシドとして５°　−ジメチルオキシトリチル置換されたヌクレオシド単位 を得る。
合成が完了したら、標準法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓ ｉｓ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒ。
ａｃｈ、　Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８４）により、塩 基脱保護および支持体からのオリゴマーの除去を行う。ＨＰＬＣ上のトリチル精 製に続く酢酸脱保護および沈殿により、オリゴヌクレオシドが酢酸塩として得ら れる。
実施例３５′　−デオキシ−５゛　−ヒドラジノヌクレオシドの合成５゛　−デ オキシ−５゛　−ヒドラジノチミジン塩酸塩５゛　−ベンジルカルバシル−５° −デオキシチミジンを得るために、５“　−〇、−トシルチミジン（Ｎｕｃｌｅ ｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　９：８９　（１９９０）、１　９ ８　ｇ、５ｒ！１１ｍｏｌ）、ペンシルカルバジド（４，１５ｇ、２５ｍｍｏ　 ｌ）　、活性分子ふるい（３Ａ、２ｇ）、および無水ジメチルアセトアミド（１ ００ｍｌ）を、１１０’Ｃ（浴温）で１６時間、水分を排除しながら一緒に撹拌 した。生成物を冷却し、減圧下で濃縮した（浴温く５０℃）。残留物を、溶媒と してＣＨ２Ｃ１２／ＭｅＯＨ（９・１．ｖ／ｖ）を用いてシリカゲルカラム（５ ｘ４５ｃｍ）上で精製した。
均質な分画をプールして、蒸発乾燥させ、泡沫をＥｔＯＨから再結晶させて、０ ゜７ｇ（３６％）の５°　−ベンジルカルバジル−５゛　−デオキシチミジンを 得た。
融点２０１℃。
’　ＨＮＭＲ（Ｍ　ｅ　２　Ｓ　Ｏｄ　６）δ　１．　７９　（ｓ、３．　ＣＨ ３）、２．０Ｏ−０２Ｎ旦）、５．　０３　（ｓ、２．　ＰｈＣＨ２）、５゜２ 　（ｄ、１．　Ｃ１旦）。
吸湿性粉末としての５゛　−デオキシ−５゛　−ヒドラジノチミジンの塩酸塩を 得るために、無水ＭｅＯＨ／ＨＣ１（３０ｍ１．重量で２％ＨＣｌ）中の上記カ ルバゼート（ｃａｒｂａｚａｔｅ）（０，７８ｇ、２ミリモル）および木炭上の パラジウム（１０％、１５０ｍｇ）の混合物を、水素雰囲気下で室温で１．５時 間撹拌した。メタノール溶液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）を通して濾過して、触 媒を除去した。フィルターケーキをＥｔＯＨ（２Ｘ２５ｍｌ）で洗浄した。濾液 を真空下で濃縮して、残留物を一晩乾燥させて痕跡のＨＣＩを除去した。黄色残 留物をメタノール（３ｍｌ）に溶解させて迅速に撹拌している酢酸エチルの溶液 （１５０ｍｌ）に滴加した。濾過した沈殿を酢酸エチル（３Ｘ１００ｍｌ）で洗 浄し、淡黄色の固体を真空乾燥させて、０．５１ｇ　（８８％）の５°　−デオ キシ−５゜−ヒドラジノチミジン塩酸塩（吸湿性粉末）を得た：ＩＨＮＭＲ（Ｍ ｅ２ＳＯ−ｄａ）δ　１．　８１　（ｓ、３．　ＣＨり、２．０２−ヒＩ・ラン ノおよび３’　−ＯＨは、Ｈ２０によってマスクされた。
実施例４５゛　−川・リナルー１−［２，３−シチオキシー３．−Ｃｉホルミル −β−１）　−ｘｌＪｚ，ｏ−ベントフラノシル］ーチミンおよび一ウラシルの 合成方法Ａ ３゛−Ｃ−シアツー：３゛　−チオギシー５°　−０−トリチルチミジン［以下 の調製はツー１−の中で行い、試薬の蒸気を吸入し５ないように注意しなさい。
−］３°　−デオキシ−３′　−ヨード−５°　−〇ートリチルチミジン（フエ ルノーイデン．Ｊ．Ｐ．Ｈ．　（Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ．Ｊ．Ｐ．Ｈ．）；モフｙ ・ｙｌ□．ＪＧ．　（Ｍｏｆ　ｆａｔｔ．Ｊ．Ｇ．）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ３５：２８６８　（１９７０））（６０ｇ．０．１モル）、ヘキサメチルシチン （３６ｇ．２２．７ｍ１、０．　１１モル）、ｔ−ブチルイソシアニド（１６　 ６　ｇ、２２５ｍ１．２モル）、およびＣＮａ／ヘンノフエエフエニン上したば かりの、２す・ントルの）トルエンに溶かした（ＡＩＢＮ　（１．６ｇ．ＩＯこ リモル）の＠濁液に３０分間アルゴンを送り込むことによって徹底的に酸素を除 去して、次に３８°Ｃで１３時間加熱した。この反応混合物を６０°Ｃに冷却し て、ＡＩＢＮ　（１．６ｇ，ＩＯミ’Ｊモル）を加えて、そして２４時間加熱を 続けた。この明間に３回同じ方法でＡＩＢＮの添加を繰り返した。反応混合物を 室温にまで冷却して、ブレツクツクのシリカゲルカラムの丘に移しく１．　５に ．ｇ．ヘキサンに懸濁しである）、ヘキサン類　Ｅｔ２０を用いて溶出した（各 回ごとに１リツトルの溶出液を用いて１０％の勾配の変化を作り、１００％ヘキ サン類−１００％ＥｔｚＯ）。不純物の大部分は非極性化合物として勾配をかけ た溶出の間に除去した。Ｅｔｚｏ（２リツトル）を用いて最後に溶出させて、適 当なフラクションを合わせて蒸発させて、集めた順に２つの化合物を得た。
（ｉ）３°　−Ｃ−シアノ−３゛　−デオキシ−５”　−０−トリチルチミジン １２。
９３ｇ（２５％）、白色粉末（トルエン／ＥｔｚＯから結晶化させた、ｍｐ１５ ３−１５７℃）。
’Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣ　１３）６　８．　８３　（ｓ．　１．　ＮＭ）、７． ０４−７。４（ｍ．　１８．　５．　トルエン由来のＴｒ旦．Ｃ６旦．および　 領　５Ａｒ旦）。
６、　１０（ｄａ．　１，　Ｈｌ，、Ｊ＋，、２，＝４．　１Ｈｚ．　Ｊ＋，、 ｚ−＝７．　１Ｈｚ）　。
３、３３　３．　６０　（ｍ，　３．　Ｈｓ＝　、ｓ−、ｓ−　）、２．　６８ 　（ｍ．　１，　Ｈｔ−Ｊｚ．、ｚ−　＝１３．　８Ｈｚ）　、　２．　５２　 （ｍ．　、１，旦ｚ−　）　、　２．　２８　（ｓ．　１。
５、０．５１−ルエン由来のＣＨ．）、および１．　５０　（ｓ，　３，　ＣＨ ，）。
ＣｓｏＨｚｔＮｓＯ４０・５　Ｃ，Ｈ．（）ルエンから結晶化させた）に対する 計算値：Ｃ，７４、５６；Ｈ．５．７９；Ｎ，７．７８。実測値：Ｃ，　７４． 　２７：Ｈ。
５、７８；Ｎ．７．６６。
（１０％）も得られた： ’Ｈ　ＮＭ−Ｒ　（ＣＤＣＩｇ）δ　８．　７２　（ｓ．　１，　ＮＭ）、７． 　０３−７．　４４　（ｍ．　１８．　５，　Ｔｒ旦，Ｃ．旦．およびトルエン 由来のＱ，５Ａｒ旦）３６、１３（擬似のｔ、１．、Ｈｔ−　Ｊ＋、、ト＝６． 　７Ｈｚ，　Ｊ＋，、ｆｉ＋　＝５．　７Ｈｚ）　、　４．　０９　（ｍ、１， Ｈａ，Ｊｓ，、ｒ　＝６．　７Ｈｚ．　Ｊ４，＋Ｓ’　＝４、９Ｈｚ）、３．５ ６（ｍ、２．　８ｓ，ｓ，、３．　２８　（ｍ．　１．　Ｈｓ−　Ｊｓ−　、！ ー＝８．２Ｈｚ，Ｊｓ−　、ｘ−　＝５．２Ｈｚ）、２．７０（ｍ，１．Ｈｌ、 Ｊ！，＋！−＝１４Ｈｚ）、２．　２８　（ｓ．　１．　５．　トルエン由来の ＣＨ３）および１．６０（ｓ．　３，　ＣＨ３）。
Ｃ，。Ｈ　２　７　Ｎ　ｓ　Ｏ　ａ　０．　５　Ｃ　、　Ｈ　ａに対する計算値 （トルエンから結晶化させた）：Ｃ，７４．５６；Ｈ，ｓ．７９：Ｎ．７．７８ 。実測値＋Ｃ．７４．１０；Ｈ．　５．　７４；Ｎ，　７．　５２。
エピマー化：　メタノール（２　０ｍ　１　）に懸濁させた１−　（３’　−Ｃ −シアノ−２’　、３’−ジデオキシ−５’−０−トリチル−β−見一スレオ− ペントフラノシル）チミン（０．３０ｇ．０．６１ミリモル）の懸濁液に、溶液 のｐＨがおよそ９に到達するまでＩＮのＮａＯＭｅの溶液を１滴づつ加えた。得 られた混合物を加熱して２０時間還流した。その溶液を（０℃に）冷却して、Ｉ Ｎ　ＨＣＩ／ＭｅＯＨを用いて中和して、減圧下で蒸発させた。残渣を上述のよ ．うに精製して、（６２％）を得た。（３゛　−デオキシ−３’−Ｃ−シフ／− ５’　−０−ト’）ｆｋチミジン合成はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　２９：２９９５（１９８ｇ）に報告されていた。この報告は、３′　−デオ キシ−３’　−Ｃ−シアノ−５’　−０−トリチルチミンは唯一の生成物として 形成されることを示唆したが、しかし、私達は混合物が生成することを見い出し た。上のエピマー化によって、この混合物のキシロの成分を、興味のある３゛− デオキシ−３’−Ｃ−シアノ−５°−０−トリチルチミジの化合物へ変換する。
）３゛−デオキシ−３′−Ｃ−ホルミル−５’−０−トリチルチミンＤ　Ｉ　Ｂ ＡＬ−Ｈ（トルエン中でＬＭ、５０ｍ１，５時間の期間に５回に分けて）を、乾 燥ＴＨＦ　（１０ｍｌ）中の３゛一旦−シアノ−３′−デオキシ−５゛−０−ト リチルチミジン（９，９２ｇ、２０ミリモル）の撹拌した溶液へアルゴン下で０ ℃で加えた。この溶液を室温で１時間撹拌して、再び０℃に冷却した。撹拌中に ＭｅＯＨ（２５ｍｌ）を１滴づつ冷却した溶液に加えて、完全に添加が終わって から溶液を室温にする。飽和させた水性のＮａ１ＳＯ，溶液（１１ｍｌ）を反応 混合物へ加えて、１２時間撹拌した。粉末の無水ＮａｔＳＯ４（３０ｇ）を反応 混合物へ加えて、懸濁液を３０分間撹拌した。懸濁液を濾過して、全ての生成物 を洗浄するまで残渣を徹底的にＭｅＯＨ：　ＣＨ４Ｃ１！　（１：　９ｖ／ｖ） を用いて洗浄した。濾液を合わせて真空下で濃縮して、粘着性の残渣を得た。残 渣を溶出のためにＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（１００％ＣＨ，Ｃｌ　、−＋９　： 　１．　ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、５ ．４５ｇ　（５５％）の３′−デオキシ−３’−Ｃ−ホルミル−５’　−０−１ −リチルチミンを白色の泡として得た。
Ｊ＋−ｘ−＝５．３　Ｈｚ、Ｊｌ、　、！、−６．６　Ｈｚ）、　４．３１　（ ｍ、１゜旦４−　Ｌ□　＋Ｅ　＝３．　３Ｈｚ、Ｊｓｌ、４、＝７Ｈｚ）、３． ２８−３．５５（ｍ、　３．旦５・＋５−　、ｓ、）　、　２．６９　（ｍ、　 １．旦ｚ−）　、　２．２８　（ｍ、　１゜旦２−　）　、　１．４８　（Ｓ、 　３．　ＣＨｓ）。
Ｃ５ｏＨｚａＮｚＯｓ−ＨｚＯに対する計算値：Ｃ，７０，０３；Ｈ，５，８８ ；Ｎ。
５．４４゜実測値：Ｃ，７０，４０：Ｈ，６，００；Ｎ、５．３３゜１−［３− デオキシ−３−Ｃ−（ホルミル）−５−０−トリチル−β−り一エリスローベン トフラノシル］ウラシル 乾燥ＴＨＦ　（２０ｍｌ）中の３′−シアノ−２’　、３’−ジデオキシ−５゛ −ｐ−トリチルウリジン（０，９６ｇ、２ミリモル）（上記のチアジンのアナロ グの調製と同じ方法で調製する）の撹拌した溶液へアルゴン下で一１０℃で１０ 分間以上の時間をかけてトルエン（アルドリッチ（Ａｌｄｒ　ｉ　ｃｈ））中の ＤＩＢＡＬ−Ｈの溶液を加えた。３０分後に一１０℃のＭｅＯＨ（５ｍｌ）を用 いて反応を停止させた。さらにこの混合物を周囲の温度で３０分間撹拌して、真 空で濃縮する前にＣＨ，Ｃ１ｉＣ１１（２５を用いて希釈した。残っているＴＨ Ｆを除去するためにＣｌ［ｉＣ１！　（３Ｘ２５ｍｌ）を用いてこの過程を繰り 返した。残渣をシリカゲル（２５ｇ）のフラッシュクロマトグラフィーによって 精製した。ｃＨＩＣＩ　！　（９：　１．　ｖ／ｖ）を用いた溶出およびＣＨｚ Ｃ１ｚ／ＭｅＯＨからの結晶によって５’−０−）ジチル−３′−ｐ−ホルミル −２°、３゛　−ジデオキシウリジル（０，５３ｇ、５３％）を得た；ｍｐｌｏ ｏ℃；’ＨＮＭＲ（ＣＤ０１ｓ）δ　２．　２５　２．　８　（ｍ、２．　ＣＨ Ｊ　、３．　４（ｍ、１．　Ｃ３，旦）　、　３．４５−３．６　（ｍ、　２． 　Ｃ５２Ｃ旦り、４．３７（ｍ、　１．　Ｃ４一旦）、　５．４（ｄ、　１．　 ｃｏ旦）、　６．１（ｍ、　１．　Ｃｒ、旦）、７．２７、４　（ｍ、　１５． 　Ｃｓ旦Ｓ）、　７．８１　（ｄ、　１．　ｃｏ旦）、７．９５（ｂｒ　ｓ、　 １．　ＮＨ）、　９．６１　（ｓ、　１．旦Ｃ＝０）。
方法Ｂ １−［３−デオキシ−３−Ｃ−（ポルミル）−５−０−トリチル−β−Ｄ−エリ スローペントフラノシル］チミン １−メチノド５−０−　（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−２，３−ジデオキシ −３−Ｃ−（ホルミル）一旦一エリスローベントフラノースは、Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ、４４：６２５　（１９８８）に記述したように１−メチル−５−（ｔ −ブチルジフェニルシリル）−２，３−ジデオキシ−３−Ｃ−シアノ−Ｄ−エリ ス三ペントフラノースのＤＩＢＡＬ−Ｈ還元を用いて９０％の収量でオイルとじ て得た。３一旦−ホルミル基はメトキシアミンを用いてオキシムへ誘導する。オ キシムで保護した中間体はシリル化したチミンを用いて配糖化して、標題の化合 物のαおよびβの混合物を得た。保護基をはずした後に、βアノマーを方法Ａで 調製したそれと比較する。
方法Ｃ １−［３−デオキシ−３−Ｃ−（ｔルミル）　−５−０−トリチル−β−ｆ）　 −ｘ　＋）スローペントフラノシル］−ウラシルおよび一チミン３′　−デオキ シ−３′−ヨード−５’　−０−１−リチルチミシン（０，５９ｇ。
４ミリモル）、トリス（トリメチルシリル）シラン（２，８７ｇ、１．　２ミリ モル）、ＡＩＢＮ　（１２ｍｇ、０．０７２ミリモル）、およびトルエン（２０ ｍｌ）の混合物をガラスの容器の中で混合して、（室温で送り込んで）アルゴン で飽和させた。ガーラスの容器をステンレススチールの圧力反応器の中へ挿入し て、−酸化炭素を用いて圧力をかけて（８０ｐｓ　ｉ）　、閉じてそして２６時 間加熱した（９０℃、熱浴）。この反応混合物を冷却して（０℃）、ｃｏを注意 深く逃がした（有ガス用フードの中で）。生成物１フ７シリカゲル（２０ｇ）上 のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサ ン類（２二１．゛Ｖ　／　Ｖ　）を用いて溶出させて適当なフラクションを混合 して、泡沫として標題の化合物を０．３０ｇ　（６１％）を得た。
２’　、３’−ジデオキシ−３−ヨード−５゛−トリチルウリジンに同様な方法 でラジカルによりカルボニル基を導入して３’−Ｃ−ホルミルウリジン誘導体を 得る。
実施例５　メチレンヒドラゾンが連結する（３’　−ＣＨ＝ＮＨ−ＮＨ−ＣＨＩ −５’）、メチレンヒドラジンが連結する（３’　ＣＨｒ−ＮＨＮＨ−ＣＨ２− ５゛）およびメチ１ノン（ジメチルヒドラゾ）が連結する（３’　−ＣＨｔ　Ｎ 　（Ｃ）（ｓ）　Ｎ　（ＣＨｓ）　ＣＨ２−５’　）ジヌクレオチド類３’−テ （オキシホスフイニ））−３’ニエ況シぞ仁■下、えＹと）］−１５’　−ｏ− ｈリチルチミジリル−（３′→５”）　−５’　−デオキシチミジン乾燥ＣＨｚ Ｃ１！／ＭｅＯＨ／ＡｅＯＨ（２０ｍｌ／１０ｍ１１０．５ｍ１）中４５ｇ、１ ．３０ミリモル）、５′　−デオキシ−５°−ヒドラジノチミジン塩酸塩（０， ３９７ｇ、１．３６ミリモル）の混合物を３０分間室温で撹拌した。溶媒を真空 下で蒸発させて、ヒドラゾン中間体を’Ｈ−ＮＭＲによって分析した。
６、　８　（ｌｄ、Ｉｔ、１．旦Ｃ＝Ｎ、２つの異性体）、６．　０−６．　１ 　（２ｍ。
２、旦＋−）、　５．３０　（ｂｒ　ｔ、１．０旦）　、　３．８−４．　２　 （３ｍ、　３゜３゛　−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−［メチレン（ジ メチルヒドラゾ）］−５’−０−トリチルチミジリルー（３゛→５°）−５′　 −デオキシチミジン上のヒドラゾンの二量体をＡｃＯＨ（１０ｍｌ）へ溶解させ て、これへ室温で３０分間撹拌りながら少量（７）ＮａＢＨｓＣＮ　（４ＸＯ， １２ｇ、７．７４ミリモル）を加えた。水性ＨＣＨＯ（２０％、３．９ｍ１．２ ６ミ！Ｊモル）　、ＮａＢＨｓＣＮ（３，９ミリモル）、およびＡｃＯＨ（１０ ｍｌ）を添加する前に、この溶液をさらに１５分間撹拌した。懸濁液をさらに１ ５分間撹拌して、溶液を真空下で蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ（３Ｘ２５ｍｌ） と−緒に蒸発させてメチレンヒドラゾの二量体を得た； ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ　６．８　７．８　（ｍ、　１５．　ＴｒＨ，２Ｃ ａ旦）、　６．１２　（ｍ、　２．２旦ｒ、）　、　４．２０　（ｍ、　１．　 Ｔ２　旦ｓ、）、４゜０５　（ｍ、　１．　Ｔ２　旦４．）　、　３．８９　（ ｒｎ、　１．　ＴＩ　旦、、　）、　３．８０（Ｓ、　６．２　ＱＣＣａ）、　 ３．２１　３．５３　（ｍ、　２．　ＴＩ　Ｈｓ−、ｓ−）。
２、１１−２．７５　（ｍ、　１０．　Ｔ２　旦５’＋ｌ＋一旦、Ｔｌ　旦ｓ− 、Ｔｌ旦３・・３°−デ（オキシホスフィニコ）−３°−［メチレン（ジメチル ヒドラゾ）コーチミジリル−（３′→５’　）　−５’　−デオキシチミジン次 に上のヒドラジンの二量体をＭｅＯＨ（２５ｍｌ）中の３７％水性ＨＣＩ（１ｍ ｌ）とともに室温で２４時間撹拌しまた。得られた混合物をＮＨ，ＯＨを用いて 中和して（ｐＨ：　８）乾燥するまで蒸発させた。残渣は逆相ＨＰＬＣ（スペル コシルＬＣ１８，５ｍｌ、ＨｔＯ：ＣＨｘＣＮ勾配）によって精製して、標題の メチレン（ジメチルヒドラジン）が連結するダイマー０．６１ｇ　（８９％）を 得た。
ＩＨＮＭＲ（９Ｑ°Ｃ，ＤＭＳＯ−ｄ、＋１滴のり、０）６７．６６および７、 　４３　（２ｓ、２．　２　Ｃ１Ｈ）　、６．　０２　（擬似ｔ、１．　Ｔ２　 Ｈｌ、　。
ＪＩｌ、ｘ−＝７．　２Ｈｚ、ＪＩ−＋！”　＝７．　７Ｈｚ）　、５．　９６ 　（擬似ｔ、１゜Ｔ１　旦１１．　ＪＩ−、！−＝５．６Ｈｚ、　Ｊｌｌ、ｚ− ＝６．２Ｈｚ）、　４．１２（ｍ、　１．７２　旦ｓ、）　、　３．９０　（ｍ 、　１、Ｔ２　旦、、）、３．７１（ｍ。
Ｃ雪５ＨｓａＮａα１Ｈ，Ｏに対する計算値：Ｃ，５１，１０，Ｈ１６，７１， ；Ｎ。
１５．５４゜実測値：Ｃ，５１，０５；Ｈ，６，６８；Ｎ、１５．５４゜ＭＳＦ ＡＢ　ｍ／ｚ５２３　（Ｍ＋Ｈ）”。
実施例６　メチレン（ジメチルヒドラジン）が結合する（３’　ＣＨｔ　Ｎ（Ｃ Ｈｓ）　ＣＨｓ−５’　）５°　−ジメトキシトリチル−３′　−β−シアノー エトキシジイソブロピルホスホラミジトジヌクレオシド３°　−デ（オキシホス フィニコ）　−３’　−［メチレン（ジメチルヒドラゾ）］−］チミジルルー５ ’−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）　−（３’→５”）−３”　−０− （β−シアノエチル−Ｎ−ジイソプロビルアミノホスフィリル）ラミｚ 実施例５のメチレン（ジメチルヒドラジン）二量体を、オリゴヌクレオチドの合 成：実用的な方法、Ｍ、Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版、１９８４年（Ｏｌｉｇ。
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐ ｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８４）にした がってジメトキシトリチル化して、均一な泡沫を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）６６．　８−７．　８（ｍ、２０．　ＤＭＴｒ、２旦 ６）。
６、　１２　（ｍ、２．　２Ｈ＋−）　、４．　２０　（ｍ、１．７２　Ｈｓ、 ）、４．０５（ｍ、１．　Ｔ２　Ｈ４−）、３．　８９（ｍ、１．　ＴＩ　Ｈ４ ，）、３．　８０（８゜６．２　ＤＭＴｒのＯＣＣＨｓ　、３．２１−３．５３ （ｍ、　２．　Ｔｌ　旦ｓ、ｓ−）。
２．１１−２．７５（ｍ、　９．　ＴＩ　旦Ｓ’　ｍ”　ｒＨｓ−、Ｔ１　旦８ ・、２旦ｚ□　ｚ・）　＊これをオリゴヌクレオチド合成：実用的な方法、Ｍ、 Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版、１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、 Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬｐｒｅｓｓ、１９８４）に記述された手順でホスフィチル 化することによって６５％の収量で標題の化合物を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩりδ　６．　１４　（ｍ、１．　Ｔ２　Ｈ＋−）　、　６ ．０１（ｍ、　１．　Ｔｌ　旦＋、）、　３．８０（ｓ、　６．２　０　ＣＨ３ ）、２．２３（ｍ、　６．２　Ｎ−ＣＨｓ）、１．　７８および１．４５　（２ ｓ、　６．２　ＣＨ，）、および他のプロトン　”　Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤ　Ｃ１ｓ ）δ　１４９．４３および１４８．８５ｐｐｍ０ 実施例７　断続するメチレン（ジメチルヒドラジン）（３’　−ＣＨ，−ＮＣＨ 。
−ＮＣＨｓ　ＣＨｚ７５’　）が連結するオリゴヌクレオシドの合成ＣＰＧに結 合したチミジン（または３′末端の塩基になる任意の他のヌクレオシド）をアプ ライド　バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ 、）（ＡＢＩ）カラム（２５０ｍｇ、結合したヌクレオシド１０マイクロモル） の中に置いて、ＡＢＩ　３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成機に取り付けた。
メチレンヒドラジンチミジンニ量体を任意の希望の位置で配列へ導入するために 、ホスホラミダイト化学を用いる標準的な自動の（コンピューターが制御する） 段階を使用する。
実施例８　（３’　−ＣＨ，−ＮＨ−８−ＣＨ２−５”）の合成３′−デ（オキ シホスフィニコ）−３’　−［メチレン（メチルサルフェニル）］−］チミジリ ルー３゛→５”）　−５’　−デオキシチミジン２つの中間体のヌクレオシドか ら標題の化合物は調製されるだろう。最初のヌクレオシドである３’　−０−ベ ンジル−５°　−デオキシ−５′　−メルカプトチミジンは、Ｊ、　Ｈ，７リオ ツト（Ｊ、Ｈ，Ｍａｒｒｉｏｔｔ）ら、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔｓ、、３１　ニア３８ ５　（１９８０）の手順に従って３段階で３°−Ω−ベンゾイルチミジンから、 ５’　−Ｓ−［９−（４−メトキシフェニル）キサンチン−９−−イル］基の形 成およびその後の保護基の除去による５’　−ＮＨ基の生成を介して調製される だろ。２つ目のヌクレオシドである３°　一旦−メチルアミノ−５゜ミル基のＮ ａＢＨ４還元、その後のＬｉＮ５／ＤＭＦを用いたアジド基への変換および３° 　ＣＣＨ２ＮＨ２基を得るためのＴＢＴＨ／トルエンを用いたその後の還元が含 まれる。３’　−Ｃ−メチルアミノ−５°−０−トリチルチミジンヌクレオシド （１−ミリモル）を水性次亜塩素酸（４ミリモル）溶液へ加えてクロルアミド中 間体を生成し、これを冷却して（０℃）　、３’　−０−ベンジル−５゛−デオ キシ−５°−メルカプトチミジンヌクレオシド（０，９ミリモル）と１５分間反 応させて、その後に通常の操作およびクロマトグラフィーによる精製を行い、標 題の化合物を得るだろう。
実施例９５’−０−フタルイミドヌクレオシドの合成５゛−０−フタルイミドチ ミジン 乾燥ＤＭＦ　（４００ｍｌ）中のチミジン（２４，２２ｇ、０．１モル）、Ｎ− ヒドロキシフタルイミド（２１，７５ｇ、０．１３モル）、トリフェニルホスフ ィン（３４ｇ、０．１３モル）の撹拌した溶液に３時間以上の時間をかけて０℃ でアゾニカルボン酸ニイソプロピル（３０ｍ１．０．１５モル）を加えた。完全 に加えた後で反応混合物を室温まで暖めて、１２時間撹拌した。溶液を真空下で 濃縮して（０，１ｍｍ、＜４０℃）、オレンジ−赤の残渣を得た。ゴム性の残渣 をＥｔ＊ｏで数回洗浄し・て、洗浄液を捨てた。半固体の残渣をＥｔＯＨ（５０ ０ｍｌ）に懸濁して、加熱して（９０℃）、生成物を溶解させた。冷却して３０ ．９８ｇ（８０％）の５′−〇−フタルイミドチミジンをｍｐ２３３−２３５℃ （分解）の白色の結晶性の物質として３つに集めた：’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄｓ ）　６　１１．２９　（ｓ、　１．　ＮＨ）、７．８５（ｍ。
４、ＡｒＨ）、　７．５８　（ｓ、１．　Ｃａ旦）、　６．２０（ｔ、１．旦１ −　、　Ｊｌ、＋２”＝７．８Ｈｚ、　ＪＩ、＋２”　＝６．５Ｈｚ）　、　５ ．４８　（ｄ、　１．　ＣＨ３・）。
Ｃ＋ａＨｉｔＯｔＮｓ　０．７　Ｈ４０に対する計算値：Ｃ，５４，０５；Ｈ， ４゜６４；Ｎ、１０．５１゜実測値：Ｃ，５３，８１；Ｈ０４，２５：Ｎ、１０ ゜３９゜ ２′−デオキシ−５’−０−フタルイミドウリジン２′−デオキシウリジンを用 いて類似の反応を行って、対応する２′−チオキ（ｔ−ブチルジフェニルシリル ）ウリジンの合成３’−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５′−〇−フタ ルイミドチミジン５°−ｐ−フタルイミドチミジン（８，５４ｇ、２２ミリモル ）、塩化ｔ−ブチルジフェニルシリル（６，９ｍ１．２６．５ミリモル）、イミ ダゾール（３，９ｇ、５７．　３ミリモル）および乾燥ＤＭＦ　（１３０ｍｌ） の混合物を室温で１６時間アルゴン下で撹拌した。反応混合物を氷水（６００ｍ ｌ）中に注ぎ、溶液をＣＨ＊Ｃ１ｚ　（２Ｘ４００ｍｌ）を用いて抽出した。有 機層を水（２Ｘ２５０ｒｎｌ）で洗浄して乾燥した（　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）。Ｃ ＨｚＣＩ２層を濃縮してゴム性の残渣を得て、これをシリカゲルカラムクロマト グラフィー（ＥｔＯＡｅ：ヘキサン類；１：ｌ、ｖ／ｖを用いて溶出させた）に よって精製して１２．６５ｇ　（９２％）の３’　−０−Ｃｔ−ブチルジフェニ ルシリル）　−５’　−０−フタルイミドチミジンを結晶性の物質（ｍｐ１７２ −１７３．５℃）として得た。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄａ）δ　１１．　３１．　（ｓ、１．　ＮＨ）　、７． 　８３（ｍ、４．ＡｒＨ）、７．５９　（ｍ、４．７ＢＤＰｈ旦）、７．　５１ 　（ｓ、１゜Ｃ６旦）、７．３７−７．４５　（ｍ、６．ＴＢＤＰｈ旦）、６． 　３０　（ｄｄ。
旦トｓ−）　、　２．０６　２．　１３　（ｍ、２．旦２、＋２”　）　、１． ９７　（ｓ、　３゜ＣＨｘ）　、　１．０３　（Ｓ、　９．　Ｃ（ＣＨｓ）　ｓ ）。
Ｃｓ４ＨｓｓＯｔＮ３Ｓｉに対する計算値：Ｃ，６５，２６：Ｈ，５，６４；Ｎ 、　６゜７１゜実測値：Ｃ，６５，００；Ｈ，５，６０；Ｎ、６，４２゜３’− ０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−２′　−デオキシ−５′−〇−フタルイ ミドーウリジン ２′−デオキシ−５’　−０−フタルイミド−ウリジンを用いた類似の反応を行 って、対応する３’−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−２゛　−デオキシ −５゛　−９−フタルイミド−ウリジンを得るだろう。
実施例１１　５’−０−アミノヌクレオシドの合成５′−〇−アミノー３’−０ −（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チ２ジン乾燥ＣＨ−ｆ　ｌ　！　（１００ｍ 　ｌ　）中の３′−９−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５゛　−９−フタル イミドチミジン（１０ｇ、１６ミリモル）の撹拌した溶液へアルゴン下で室温で メチルヒドラジン（１，３ｍｌ、２４ミリモル）を加えて、溶液を１２時間撹拌 した。溶液を冷却して（０℃）、濾過した。白色の残渣をＣＨｚＣｌｘ　（２Ｘ ２５ｍｌ）を用いて洗浄して、濾液を合わせて蒸発させてゴム性の残渣を得た。
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃ１ｔ　：　Ｍｅ　ＯＨ。
９８　：　２．ｖ／ｖを用いて溶出）による精製から得た残渣から７．０３ｇ（ ８９％）のＣＨ，Ｃ１ｔ／ＭｅＯＨから結晶化させた、５′−〇−アミノー３° −０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン、ｍｐ１４１−１４３℃を得た 。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄａ）δ　１１．　２９　（ｓ、１．　ＮＨ）　、７．　 ４２−７．６２　（ｍ、１１．ＴＢＤＰｈ旦、Ｃ６旦）、　６．２５　（ｄｄ、 １．旦１．。
Ｌｌ、ｔ、＝８．　４　Ｈｚ、Ｌｌ、ｚ−＝６．　３Ｈｚ）、６．　０２　（Ｓ 、２．　Ｎ旦り、４゜３５　（ｍ、　１．旦４．）　、　４．０４　（ｍ、　１ ．旦ｓ、　）、　３．３４−３．　５１　（ｍ、２．旦ｓ２．ｓ−）　、２．　 ０４　（ｍ、２．旦ｚ１．！−）、１．　７３　（ｓ、　３．　ＣＨｓ）、１． ０３　（ｓ、　９．　Ｃ（ＣＨ，）Ｓ）。
ＣｚｓＨｓｓＯｓＮｓＳ　ｉ　ｌ：対ｔル計算（１：　Ｃ，６３，００；　Ｈ， ６，７１；　Ｎ、８゜４８゜実測値Ｃ，６２，８５；Ｈ，６，６７；Ｎ、ｓ、３ ２゜実施例１２　（３’　−ＣＨ＝Ｎ−０−ＣＨｚ−５’　）　が連結する。ｔ ！ｊゴ、ｉ＋りＬｚオシド（オキシムが連結する二量体） ３゛−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−（メチルイジンニトリロ）チミジ リル（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン（０，９９ｇ、２ミリモル）およ びＡｃ０Ｈ（０，３ｍ１）の混合物を１時間室温で撹拌した。溶媒を真空下で蒸 発させて、粗製の保護基をつけた３′−デ（オキシホスフィニコ’）　−３’　 −（メチルイジンニトリロ）チミジリルー（３゛→５’　）　−３’　−（ｔ− ブチルジフェニルシリル）チミジンの生成物をＴＨＦ　（２０ｍｌ）に溶解した 。ｎＢｕ４ＮＦ　（ＩＭ、５ｍ１）のＴＨＦ溶液を撹拌したこの反応混合物に室 温で加えた。１時間後に溶液をシーリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ， Ｃ１□：ＭｅＯＨ：９９：４ｖ／ｖを用いた溶出）で精製して、３′の保護基の はずれた二量体を得た。この二量体を無水ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）に溶解して、こ れにＭｅＯＨ／ＭＣＩ溶液（０，１４Ｍ、２．５ｍ１）を加えた。この反応混合 物を室温で１５時間撹拌した。無水ピリジン（ｉｏｍｌ）を上の溶液へ加えて、 溶媒を蒸発させて乾燥させて、粗製のオキシムの二量体を得た。粗製の生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィ　（ＣＨｚＣｌｚ：ＭｅＯＨ；９２：８．ｖ ／ｖ）によって精製して、標題の化合物である、３°−デ（オキシホスフィニコ ）−３’　−（メチルイジンニトリロ）チミジリルー（３′→５′）−チミジン （０，８７ｇ、８９％）をＥ／Ｚ異性体の混合物として得た。２つの幾何異性体 は逆層ＨＰＬＣ（スペルコシルＬＣ１８（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ　ＬＣ１８）、 ５ａ　ＨｚＯ：ＣＨｓ勾配）によって分離した。（標題の化合物のＺ−異性体） ’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄｓ）６１１．　２８　（ｂｒ　ｓ、２．　２ＮＨ）、７ ゜３９および７．７８（２ｓ、２，２ＣｓＨ）、６．９２　（ｄ、１．ＴＩ　Ｈ ３−。
Ｊｌｌ、ｓ−＝６．　７Ｈｚ）　、６．　１５　（擬似ｔ、ｉ、　Ｔ２　Ｈ＋− 、Ｊｌ−、ｚ・＝７、７８Ｈｚ、　Ｊｌ、、！−＝６．　３Ｈｚ）　、　６．　 ０４　（ｄｄ、　１．　ＴＩ　Ｈ＋・　。
ＪＰ、！−＝７．１Ｈｚ、Ｊｔ−、！−＝６．３Ｈｚ）　、　５．３４　（ｄ、 　１．　Ｔ２Ｈ，、、ｆｉ＋　）　、１．　７３　（ｓ、６．　２ＣＨ３）。
Ｃｚ＋ＨｚｔＮｓＯｅ・Ｈ２Ｏに対する計算値：Ｃ，４９，３１：Ｈ，５，７２ ；Ｎ。
１３．６９゜実測値：Ｃ，４９，３２；Ｈ，５，５７；Ｎ、１３．５９゜（標題 の化合物のＥ−異性体） 旦＋−、Ｊ＋□　、ｚ−＝７．６Ｈｚ、Ｊ＋−＋２”　＝５．４Ｈｚ）、６．０ ４　（ｄｄ。
ＭＳ　ＦＡＢ　＋Ｍ／Ｚ　４９４　（Ｍ＋Ｈ）”。
実施例１３　（３’　−ＣＨ＝Ｎ−０−Ｃ４−５”）を含むホスホラミディトが 連結するオリゴヌクレオシドの合成 オリゴヌクレオシドの合成二実用的な方法、Ｍ、Ｊ、　Ｇａ　ｉ　を編集、ＩＲ Ｌ出版、１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｆｓ： ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬＰ ｒｅｓｓ、１９８４）に記述された手順にしたがって実施例１２の異性体の二量 体を５′末端のヌクレオシドの水酸基においてさらにジメトキシトリチル化しシ アノエチルジイソプロピルホスホラミダイト誘導体へ変換して、標題の化合物Ｔ Ｉ　Ｃ旦＋２．Ｚ−異性体）、１．８０および１．５０　（２ｓ、　６．　２　 ＣＨ３）、および他のプロトン。
”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）１５０．７７および１５０．３８　（Ｚ−異性体） 。
１５０．５７および１５０．３８　（Ｅ−異性体）。
保護基をつけたこ量体は便利に保管できて、治療上の価値のあるオリゴマーの中 へ特異的４；導入する要求があるかぎり、自動ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ　３８０Ｂ ）を使用して結合させるために使用できる。さらに明細書の後の実施例により、 オキシムが連結する二量体を対応するヒドロキシルアミンの結合をもっ二量体へ 還元してこれを次にアルキル化してヒドロキシメチルアミンまたは他のヒドロキ シアルキルアミンの結合にすることができる。
実施例１４　（３′−ＣＨ２ＮＨ−ＯＣＨｚ　５’　）が連結するオリゴヌクレ オシドの合成 氷ＡｃＯＨ（５ｍｌ）中の保護基をつけた二量体３′−デ（オキシホスフィニコ ）−３’　−（メチルイジンニトリロ）チミジリルー（３゛　→５’　”）　− ３’　−０−（１−ブチルジフェニルシリル）チミジン（０，４９ｇ、１ミリモ ル）の撹拌した溶液へ３回に分けてＮ　ａ　Ｂ　Ｈｓ　ＣＮ　（０、１９ｇ　、 ３ミリモル）をアルゴン下で室温で加えた。溶液の泡立ちが終わるまで、懸濁液 を１時間撹拌した。同様な方法で追加のＮａＢＨ３ＣＮ　（０，１９ｇ、３ミリ モル）を加えて、撹拌を１時間続けた。減圧下でＡｃＯＨを除去して、３′−デ （オキシホスフィニコ）−３゛　−（メチレンイミノ）チミジリルー（３゛　→ ５’　＞−３’　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジンを得た。以前 に記述したようにｎＢｕ、ＮＦ／ＴＨＦおよびＨＣＩ／ＭｅＯＨを用いてこの二 量体の保護基を除去して、標題の化合物である、３゛　−デ（オキシホスフィニ コ）　−３’　−（メチレンイミノ）−チミジリル−（３゛→５′）−チミジン 、（０，４４ｇ、９０％）を白色の粉末として得た。分析的に純粋なサンプルを 得るために（実施例１２の３′−デ（オキシホスフィニコ）−３’−Ｌ（メチル イジンニトリロ）チミジリル−（３°→５“）−チミジンニ量体について記述し たように）この二量体をさらにＨＰＬＣで精製した。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄｓ）δ　１１．２３　（ｂｒ　ｓ、　２．２Ｎ旦）、７ ゜８３および７．４９　（２ｓ、２，２Ｃｓ旦）、　６．８２　（ｔ、１．　Ｎ ＨＯ）。
Ｊｌ５．ｘ−＝４．３Ｈｚ）、　５．２８　（ｓ、　１．　Ｔ２０旦）、５．０ ８　（ｓ。
１、ＴＩＯ旦）、　４．１８　（ｍ、　１．　Ｔ２　Ｈｓ、）、　３．８９（ｍ 、　１゜Ｔ１旦４−　）、　３．５４　３．７８　（ｍ、　５．　ＴＩ　Ｔ２　 Ｈｓｌ、ａ−、Ｔ２旦４．）、　２．７６　２．９４（ｍ、　２．　ＴＩ　Ｈｓ −）、　２．４２（ｍ、　１゜Ｔ１　旦ｓ−）　、　２．０　２．１７　（ｍ、 　４．　ＴＩ、７２　Ｈｚ、＋？　）　。
１．７７および１．７４　（２ｓ、　６．２　ＣＨＩ）。
ＭＳ　ＦＡＢ：Ｍ／Ｚ　４９６（Ｍ＋Ｈ）”。
Ｃ１１ＨＣ１１Ｈｚ＊　・ＨｓＯｉ：対する計算値：ｃ、４９．　１２；Ｈ，ａ 、０９；Ｎ。
１３．６４゜実測値：Ｃ，４８，９９：Ｉ−１，５，９６；Ｎ、１３．４９゜実 施例１．５　１千に化した［３’　ＣＨｘ　Ｎ　（ＣＨｓ）−０ＣＨＩ−５’コ が連結するオリゴヌクレオシドの合成 ３゛−デ（オキシホスフィニコ）−３’　−［メチレン（メチルイミノ）］］チ ミジリルー３′→５′）チミジン 氷ＡｃＯＨ（１０ｍｌ）中の３′−デ（オキシホスフィニコ’）　−３’　−（ メチレンイミノ）チミジリルー（３゛→５°）−３’　−０−（ｔ−ブチルジフ ェニルシリル）−チミジンの二量体（０，９９ｇ、１ミリモル）の撹拌した溶液 へ水性ＨＣＨＯ（２０％、３ｍ１）を加えた。溶液を室温で５分間撹拌して、こ れにアルゴン下で室温で３回に分けてＮａＢＨｓＣＮ　（０，１９ｇ、３ミリモ ル）を加えた。ＮａＢＨ３ＣＮ　（０，１９ｇ）の添加をもう１度繰り返して、 溶液をさらに１時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗製の３°−デ（オキシホ スフィニコ）−３’　−［メチレン（メチルイミノ）コチミジリル−（３゛→５ ’　）　−３’　−０−（１−ブチルジフェニルシリル）チミジンの二量体を得 て、これの保護基を除去して（ｎＢｕｎＮＦ／ＴＨＦ、ＨＣＩ／ＭｅＯＨ）　、 標題の化合物である、３゜−デ（オキシホスフィニコ）−３’　−［メチレン（ メチルイミノ）コチミジリル−（３′→５゛）チミジン、（０，４４ｇ、８７％ ）を白色の固体として得た。
分取用Ｉ（ＰＬＯによって、３゛　−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−Ｅ メチレン（メチルイミノ）］チミジリルー（３′→５゛）チミジンの二量体をさ らに精製して、分析的に純粋なサンプルを得た。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｇ）δ　１１．３０および１１．２４　（２ｓ、　２ ゜６．００（擬似ｔ、１．　Ｔｌ　旦ｒ１．　Ｊ＋１．ｚ−＝４．　２Ｈｚ、Ｊ （、＋ｇ＋　＝６、１Ｈｚ）、　５．３１　（ｍ、　１．　Ｔ２　０旦）、　５ ．０８　（ｍ、　１．７ＩＯ旦）　、　４．１７　（ｍ、　１．　Ｔ２　旦ｓ− ）　、　３．８８　（ｍ、　１．　Ｔ２　旦４・）。
３、５７−３．８３　（ｍ、　５．　ＴＩ　Ｔ２　旦５１１８８．ＴＩ　旦、、 ）、２゜６９（ｍ、　２．７Ｉ　Ｈｓ−）、　２．５７（ｓ、　３．　Ｎ−ＣＨ ５＞、　２．５゜（ｍ、　１．　ＴＩ　Ｈｓ−ン、２．０５−２．１４（ｍ、　 ４．ＴＩ　Ｔ２　旦ｚ、　、ｘ−）。
１．７９および１．　７６　（２ｓ、６．　２　ＣＨｓ）。
ＭＳ　ＦＡＢ：Ｍ／Ｚ　５１０（Ｍ＋Ｈ）”。
ＣｚｓＨｓ＋Ｎ５Ｏｓ　ＨｘＯに対する計算値：Ｃ，５０，０９；Ｈ，６，３１ ；Ｎ。
１３．２＆。実測値：Ｃ，５０，０５；Ｈ，６，２１；Ｎ、１３．０８゜実施例 １６　［３’−ＣＨｚ−Ｎ（ＣＨ３）−０−ＣＨＩ−５’　］を含むホスホラミ ディトが連結するオリゴヌクレオシドの合成３゛−デ（オキシホスフィニコ）− ３’　−［メチレン（メチルイミノ）］−５’−Ｏ−（ジメトキシトリフェニル メチル）チミジリル−（３′→５’　）　−３°　−１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｅａｌ　ａｐｐｒ ｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８４）に記述さ れているように、実施例】５の３“−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−（ メチレン（メチルイミノ）］−］チミジリルー３°→５゛）チミジンの二量体の トリチル化およびホスフィル化を全体の収量８２％で行った。
保護基をつけた二量体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨｚＣＩ２： ＭｅＯＨ：　ＥｔｓＮ：　９　：　１　：　０．１．ｖ／ｖ）によって精製して 、均一なフラクションを合わせて蒸発させて、純粋な３゛−デ（オキシホスフィ ニコ）−３’−［メチレン（メチルイミノ）コーチミジリル−５’　−０−（ジ メトキシトリフェニルメチル）　−（３’→５’　）　−３’　−０−（β−シ アノエチルジイソプロビルアミノホスフィリル）チミジンを白色の泡沫として得 た（ＤＮＡ合成のようなものに使用する）。生成物はジアステレオマーの混合物 として単離した。
”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ　１４９．６２および１４９．００　ｐｐｍ：’ 　ＨＮＭＲ（ＣＤ　ＣＩ　ｇ）δ　６．２２（擬似ｔ、１．Ｔ２　旦１’　−Ｊ ＋’　＋２’　＝Ｊ＋−＋１−　＝６．７Ｈｚ）、６．１６　（擬似ｔ、１．　 Ｔｌ　旦１’　＋　Ｊ　＝１’　、Ｚ’＝５．　８Ｈｚ）　、２．　５８．　２ ．　５６　（２ｓ、３．　Ｎ−ＣＨ５）　、１．　８２゜１、　４９　（２ｓ、 ６．　２　Ｃ旦、）、及び他のプロトン。
上記の保護基をつけたホスホラミディトをもつ二量体は便利に保管することがで きて、治療上の価値あるオリゴマーの中へ特異的に導入する要求があるかぎり、 自動ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ　３８０Ｂ）を使用して結合させるために使用できる 。
上で言及したメチルイジンニトリロ、すなわちオキシム、およびメチレンイミノ 、すなわちアミノヒドロキシは本発明の他の二量体の例として挙げたものであっ て、これらに限定するわけではないが、これらの二量体をこの実施例と同じ方法 で対応するホスホラミディトの誘導体へ変換して、以下に言及するような標準的 な方法でオリゴヌクレオシドの中へ導入する。ヌクレオシドの二量体を連結する オキシムをもつオリゴマーを還元して、ヌクレオシドの二量体を連結する対応す るヒドロキシアミンをもつオリゴマーへ変換する。他の実施例で言及したように 、ＣＰＧに結合したオリゴマーへの変換を伴って、またはＣＰＧからの除去の後 に還元が行われる。
実施例１７　断続する（３　’　−ＣＨ＝　Ｎ　−０−ＣＨ１５°）、すなわち オキシム；　（３’　ＣＨ２−ＮＨＯＣＨ２５’　）　、すなわちアミノヒドロ キシ；（３’　−ＣＨｚ−Ｎ　（ＣＨｓ）−０ＣＨＩ　５’　）　、すなわちＮ −メチル−アミノヒドロキシ；　（３’　−ＣＨｚ−０−Ｎ　（ＣＨ３）−ＣＨ ２−５°）、すなわちＮ−メチル−ヒドロキシアミノ：または（３’　ＣＨｚ　 Ｎ　（ＣＨｓ）−Ｎ　（ＣＨｓ）−ＣＨｚ−５’　）　、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ヒ ドラジノが連結するオリゴヌクレオシドの合成 オリゴヌクレオシドの３′　−末端のヌクレオシドにするつもりの適当な２′− デオキシヌクレオシドを、ＡＢｌ　３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成機を使用するために ＣＰＧカラムに結合させる。（３’　ＣＨ−Ｎ−０−ＣＨｚ　５’　）　、すな わちオキシム；　（３’　−ＣＨ５ＮＨ０−ＣＨ２５’　）　、すなわちアミノ ヒドロキシ；　（３’　−ＣＨｚ−Ｎ　（ＣＨｓ）　ＯＣＨＩ　５’　）　、す なわちＮ−メチル−アミノヒドロキシ：　（３’　−ＣＨｚ　Ｏ−Ｎ　（ＣＨｓ ）−ＣＨｚ　５’　）　、すなわちＮ−メチル−ヒドロキシアミノ：または（３ ’　ＣＨｚ−Ｎ　（ＣＨｓ）　Ｎ　（ＣＨｓ）　ＣＨｔ　５’　）、すなわちＮ 、　Ｎ”−ジメチルヒドラジノ結合をもつ二量体を配列中の希望した位置または 選択した位置へ導入するために、標準的なホスホラミダイト化学のプログラムの 段階を用いた。
実施例１８　３つのヌクレオシドのサブユニットを使用した、ＡＢＩ　３ｇ０Ｂ 　ＤＮＡ合成機による、同一の（３’　−ＣＨ−Ｎ−０−ＣＨｔ　５’　）また は（３’　−ＣＨＩ−ＮＨ−０−ＣＨ，−５’　”）が連結するオリゴヌクレオ シドの合成サブユニット１：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、１８：３８１３　（１９９０）の手順にしたがって調製して、オリゴヌクレオ シドの合成のために３′−末端の単位として使用した、ＣＰＧに結合した５′− 〇−フタルイミドチミジン。
サブユニット２：　適当な塩基を用いた、メチル−３−デオキシ−３−Ｃ−シア ノ−５−０−（フタルイミド）−β一旦一エリスローベントフラノシドの標準的 な配着化およびヌクレオシド生成物のＤＩＢＡＬ−Ｈ還元によって誘導した、２ つの官能基をもつ（３’　−Ｃ−ホルミルおよび５’　−０−）、タルイミドデ オキシリボヌクレオシド）。
サブユニット３：　５’　−０−ＤＭＴ−３’−Ｃ２−ホルミルチミジン、これ は最後の（オリゴヌクレオシドの５′−末端）のヌクレオシドの導入のために使 用した。
同一の結合（１０ｇＭスケールで：ＣＰＧ上のユニット１をロードする）を合成 するために必要なサイクルの自動化した段階は以下の通りである：段階　試薬／ 溶媒　時間７分 Ｉ　ＤＣＭ中の５％メチルヒドラジン　１０２　ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１．ｖ ／ｖ）　５３　ＤＣＭによる洗浄　２ ４３’−Ｃ−ホルミル−５゛−〇−フタルイミドーデオキシ　３リポヌクレオシ ド（ユニット２．２０ｍ１のＤＣＭ中の２０ｇＭ） ５　ＤＣＭ０Ｍニアセトニ（９：　１、ｖ／ｖ）：キャップをする　２６　０Ｃ Ｍによる洗浄　３ 希望の配列および長さにしたがって、ヌクレオシドのユニットの添加ごとに前記 の１から６までの段階を繰り返す。次に最後のユニットを加える＝８　最後のヌ クレオシド（２０ｍｌのＤＣＭ中の２０ｇＭ）　５すなわちユニット３ 実施例１９　（３’　ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨＩ−５’　）結合の（３°−ＣＨＩ　Ｎ Ｈ−０−ＣＨＩ−５’　）への変換のための一般的なおよび特異的なＮ　ａ　Ｂ 　Ｈｓ　ＣＮ還元 二量体の還元 氷酢酸（ＡｃＯＨ）（５ｍｌ）中の二量体（０，４９ｇ、１ミリモル）の溶液へ 、ＡｃＯＨ（１ｍｌ）中のシアノボロハイドライドナトリウム（０，１９ｇ。
３ミリモル）をアルゴンのガスの下で、室温で加えた。懸濁液を１時間撹拌して 、ＡｃＯＨ（１ｍｌ）中のＮａＢＨ，ＣＮを追加して、撹拌を１時間続けた。過 剰のＡｃＯＨを減圧下で室温で除去した。残渣をトルエン（２Ｘ５０ｍｌ）とと もに蒸発させて、シリカゲル（２５ｇ）カラムクロマトグラフィーによって精製 した。ＣＨｚｌＣ１２：ＭｅＯＨ（９：　１．ｖ／ｖ）を用いて溶出させて、適 当なフラクションを合わせて、その後に蒸発させて０．３６ｇ　（７５％）の固 体の二量体を得た。
オリゴヌクレオシドの還元 ＣＰＧに結合したオリゴヌクレオシド（１μＭ）は１つ（またはそれ以上の）の 修飾された結合の骨格をもっており、これを合成のサイクルの完了後にＤＮＡ合 成機から取りはずす。ＴＨＦ：ＡｃＯＨ（１０ｍｌ、１　：　ｌｖ／ｖ）中の１ ゜０Ｍ　ＮａＢＨｓＣＮの溶液をＣＰＧに結合した物質から、３０分間で注射器 の技術を用いた標準的な方法で汲み出す。ＴＨＦ　（５０ｍｌ）を用いてカラム を洗浄して、還元したオリゴヌクレオシドを標準的な方法で支持体のカラムから 放出上記の還元に代わるものとして、ＣＰＧの支持体から除去した後に還元を行 うこともできる。合成が完了したときに、オリゴヌクレオシドを標準的な手順で ＣＰＧの支持体から除去する。５°−ｏ−トリチル−オン　オリゴヌクレオシド をＨＰＬＣによって精製して、次に上に記述したようにＮａＢＨ３ＣＮ／ＡｃＯ Ｈ／ＴＨＦの方法によって還元する。
実施例２０　５゛末端のヌクレオシドとして２°、３゛　−ジデヒドロヌクレオ シドをもち、（３’　ＣＨｔ＝Ｎ　（ＣＨｓ）−０ＣＨｚ　５°）が連結するオ リゴヌクレオシドの合成 ３゛−デ（オキシホスフィニコ）−２’　、３°−ジデヒドロ−３°−しメチレ ン（メチルイミノ）］チミジリルー（３°→５゛）チミジン１−　［５’　−０ −（ＭＭＴｒ）−β−ニーグリセロベントフラン−３°　−ウロシル］チミン（ ０，１３ミリモル；’ｒ、−ｃ、ウー（Ｔ、　−Ｃ，Ｗｕ）ら、Ｔｅｔ　ｒａｈ ｅｄｒｏｎ、４５　：　８５５　（１９８９）の手順にしたがって調製した）、 ５’　−０−（メチレンアミノ’）−３’　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリ ル）チミジン（０，１３ミリモル：Ｆ、デパート（Ｆ、Ｄｅｂａｒｔ）ら、Ｔｅ ｔ。
Ｌｅｔｔｅｒｓ、３３．印刷中、（１９９２）の手順にしたがって調製した）、 エチレングリコール（０，５ミリモル）、およびＨＭＰＡ　（０，５ｍ１）の撹 拌した溶液へＴＨＦ　（Ｑ、１モル、３ｍｌ、３ミリモル）中のＳｍＩｚを室温 で加えた。反応が進行するにつれて、Ｓｍ１２の色が消えて、希望する付加物を 生成する。出発原料が完全になくなった後に、反応混合物を通常の方法で後処理 する。
（生成物は同定のためにンリカカラムクロマトグラフィーによって精製すること ができるだろう）。これらの実施例の他の所で記述したように、３゛　−エピマ ーの付加物の粗製の混合物を次にアルキル化した（ＨＣＨＯ／ＮａＣＮＢＨ３／ Ａｃ０Ｈ）、次にメチル化した生成物をピリジン中の塩化メチルスルホニルで処 理して、３°　−エピマーのメシレートを得て、これを塩基で処理すると標題の 化合物を得るだろう。
実施例２１　（３’　−ＣＨｚ　ＣＨ２ＮＨＣＨ２５’　）が連結するオリゴヌ クレオシドの合成 ３′　−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−（１，２−エタンジイルイミノ ）−チミジリル−５′−〇−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−（３’→５°）− ３’　−０−（ｔ−プチルジフェニルンリル）−５゛　−デオキシチミジンアル デビト［２，５ｇ、６．　５ミリモル、フィアンダー、Ｊ、（Ｆｉａｎｄ。
ｒ、Ｊ、）およびタム、Ｓ、Ｙ、（Ｔａｍ、Ｓ、Ｙ、）、Ｔｅｔｒａ、ｈｅｄｒ 。
ｎ　Ｌｅｔｔｓ、、３３：５９７　（１９９０）に記述されている手順にしたが って新しく調製した］、５°−アミノ−３’−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリ ル）−５゛−デオキシチミジン［３，１３ｇ、６．　５ミリモル、はた（Ｈａｔ ａ）ら。
Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔ、ｐ、３０６　（１９８０）の方法に よる５゛　−アジド−５′　−デオキシチミジンの３’　−０−シリル化および 、ブーパイ］　（Ｐｏｏｐｅｉｋｏ）ら、Ｓｙｎ、Ｌｅｔｔ、、　ｐ、３４２　 （１９９１）の方法による、生成物の後の還元を介した２段階で調製した］の撹 拌した溶液に、ジクｏ口ｚタン（６５ｍｌ）中のＡｃＯＨ（０，３９ｇ、および ６．５ミリモル）を加えて、その後にアルゴン下でＮａＢＨ（ＯＡｃ）ｓ　（２ ，７５９ｇ、１３゜０８ミリモル）を加えた。懸濁液を３時間室温で撹拌した。
この反応混合物をＣＨｔＣ１！　（２５０ｍｌ）で希釈して、水（２Ｘ１００ｍ ｌ）で洗浄した。有機層を乾燥させて（ＭｇＳ０４）、濃縮して、シロップとし て粗製の生成物を得た。
生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、白色の泡沫として標 題の化合物を得た（３．５ｇ、６４％）。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ　０−１　［ｓ、　６．　Ｓｉ　（ＣＨｓ）ｚ］、 ０．９お６、　０５　（ｍ、１．　１°旦）、　６．　２８　（ｔ、１．　１’ 旦）、７．１および７．５７　（２ｓ、２．Ｃａ旦）、７．　３５−７．　７　 ［２ｍ、１２．　Ｓｉ　Ａｒ旦）２］、および他の糖のプロトン。
３′　−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−（１，２−エタンジイルイミノ ）チミジリル−（３゛→５’　）　−５°−デオキシチミジンＴＨＦ中の（Ｂｕ ）４ＮＦを用いた標準的な手順にしたがって、保護基をつけた二量体から８１％ の収量で保護基をはずした。分析のために保護基をはずした二量体をＨＰＬＣに よって精製した。
ＬＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）δ　１．７６および１．　７８（２ｓ、　６．　 ＣＨｓ）。
２、０−２．２　（３ｍ、　４．２’　ＣＨｓ）　、　３．１５　（ｍ、　２． 　ＮＣＣ２０゜３、５６（ｍ、　２．４’旦、５゛Ｃ旦ｚ）、　４．１８　（ｂ ｒ　ｓ、　１，３’旦）。
５．１７および５．２２（２ｂｒ　ｓ、　２．２　０Ｈ）、　５．９５（ｔ、１ ゜１′旦）、　６．　１　（ｔ、１．　１’旦）、７．６および７．８５　（２ ｓ、　２□　２（Ｃａ旦））、１１．　２５　（ｂｒ　ｓ、２　２Ｎ旦）および 他のプロトン。
実施例２２　２つの官能基をもつヌクレオシドの合成実施例１８のサブユニット ２の方法に代わる方法３°−デオキシ−３’−Ｃ−［（メトキシイミノ）メチル コーチミジン３゛−デオキシ−３゛−９−ホルミル−５’−０−トリチルチミジ ン（０，５９ｇ、１ミリモル、実施例４により、ＣＨｚＣｌｚ：ＭｅＯＨ（２： 　２．３０体積）中で調製した）の撹拌した溶液へＡｅＯＨ（０，５ｍ１）およ びメトキシアミン塩酸’ｊ（０，１８９ｇ、２．２ｍ１）を室温で加えた。混合 物を３０分間撹拌して、真空下で濃縮して、残渣をＭｅＯＨ（２０ｍｌ）に溶解 した。この溶液へ濃縮したＨＣＩ　（０，１ｒｎｌ）を加えて１時間撹拌した。
この溶液をＮＨ，ＯＨ（：：２ｍ１）で中和して、真空下で濃縮して、チミジン の３’　−Ｃ−［（メトキシイミド）メチル］誘導体を得た。
ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）６９．　６７　（Ｓ、１．　ＮＨ）、７．　６７　（ ｓ、１゜上記のチミジンと同様の方法で５−メチルシチジンのアナログを調製し た。
３”　Ｅ　異性体、Ｊｓ２．ｓ−＝６．　６３Ｈｚ）　、６．　６４　（ｄ、領 　３４゜Ｐｈ、Ｐ、Ｎ−ヒドロキシ７タルイミドおよびＤＥＡＤ　（光延条件） を用いて’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｇ）６８．　４５　（ｂｒ　ｓ、１．　ＮＨ）、 ７．　４−８（ｄ、　０．　３６．旦−３”　Ｚ異性体）　、　６．　１５　（ ｍ、１．旦−１′）。
３６、旦−３’　Ｚ異性体）、３．　９２　（ｓ、１．　０８．　ＱＣ旦、オキ シム３°　−デオキシ−３’　−Ｃ−（ホルメルメチルオキシム）−５′　−フ タルイミド−５−メチルシチジン 上記のチミジンと同様の方法で５−メチルシチジンのオナログを調製した。
体）。
ルイミドチミジンをＭｅＯＨ中のＣＨ，ＣＨＯで処理して、３’　−Ｃ−ホルミ ル基を再生した。シノ力ゲル力ラムクロマトグラフィーによって精製して生成物 から、３段階の全体の収量８１％で、均一な物質として標題の化合物を得た。
実施例２３　溶液相化学を用いた、同一の３’　−ＣＨ＝Ｎ　ＯＣＨｚ　５’ま たは３°　（ＣＨｘ　−Ｎ　ＨＯ−ＣＨｚ　−５’　または３’　ＣＨｓ　Ｎ　 （ＣＨｓ）−０−ＣＨ，−５’が連結する四量体の合成施ｆ！’！１１２に記述 したような）標準的な結合によって、３’　＝ｙ”（オキシホスフィニコ）−３ “　−（メチルイジンニトリロ）−チミジリルー５′−〇−フタルイミド−（３ ゛→５’　）　−３”　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジンを得た 。メチルヒドラジンで処理したときの後半の生成物から（実施例１１で記述し３ ’　−ＣＨ＝Ｎ　ＯＣＨ２〜５’　−Ｔ＝３’　ＣＨ＝Ｎ−０＝ＣＨｘ−５’　 −ＴＮ　Ｈ−０−ＣＨ、−５’　−Ｔ　−３’　−ＣＨ２−Ｎ　Ｈ−０−ＣＨ＊ 　−５’　−Ｔ　３　’−ＣＨｚ　ＮＨＯＣＨ２〜５’　−Ｔ−０−３’−ＴＢ ＤＰＳｉを得た。Ｈσ■０／ＮａＢＨｓＣＮ／ＡｃＯＨを用いて、還元した四量 体をさらに還元的にアルキル化して、５’　０−Ｔｒ　Ｔ　３’　ＣＨｚ　Ｎ（ ＣＨｓ）　ＯＣＨｚ−５゛−Ｔ〜３°　−ＣＨｚ　Ｎ　（ＣＨｓ）　０−ＣＨ２ ５’　−Ｔ−３’　ＣＨ２Ｎ（ＣＨｓ）−０−ＣＨＩ−５’　Ｔ−３”　−０− ＴＢＤＰＳ　ｉを得た。メチル化した四量体から、ＨＣＩを用いて最後に保護基 を除去して、ｎ　（Ｂｕ）４ＮＦ処理を行って全体の収量７９％でフリーの四量 体である５°−０Ｈ−Ｔ−３’　−ＣＨ２−Ｎ　（ＣＨｓ）−０−ＣＨｇ−５’ 　−Ｔ−３’　−ＣＬ−Ｎ　（ＣＨｓ）　０−ＣＨ２５’　Ｔ　３’　ＣＨ２Ｎ 　（ＣＨｓ）−−ＯＣＨＩ−５°　−Ｔ−３’　−ＯＨを得た。逆層カラム（ス ペルコシルＬＣ１８５ｕ　（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉ　Ｉ　ＬＣ１８５μ）、１５ｃ ｒｎＸ４．５ｃｍ）およびＨｚＣ）→ＣＨｓＣＮ　（Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ、９５ ：５．１分；８：２．２０分；７二３，３０分：２：８；４０分／ｍ　ｌ　）勾 配を用いた溶出を使用したＨＰＬＣによって四量体を精製した。溶出した全体の 生成物の８６％に相当する唯一の分離したピークとして、四量体は２６．９６分 後に溶出した。２６−２７．５分のフラクションをまとめて、凍結乾熾して、白 色の粉末を得た。四量体の正確な分子量をＭＳ　ＦＡＢによって決定した：ｍ／ ｚ　１１０４５（＋Ｈ）”。上で言及したように、ＮＭＲデータに関しては５′ 末端から３′末端へ環の番号をつけた。
ＩＨＮＭＲ（０２０，４０℃）ＴＯＳＥＹ（３０，ＬＯＯＭ秒混合）ユニットＴ 、Ｈ−１°　６，２６ 上記の溶液相の反応物を容易にＡＢＩ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機に移して、上述 のように３−ヌクレオシドのサブユニットを使用することができる。
実施例２４　（３’　ＣＨｌ−ＯＮ＝ＣＨ５’　）、（３’　−ＣＨ，−０−Ｎ ＨＣＨｚ　５’　）および（３’　−ＣＨｌ−０−Ｎ　（ＣＨｓ）−ＣＨｘ　５ ’　）結合のための単量体のユニットの合成 １−　［３’　−デオキシ−３’　−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−５°　−０− （）リチル）−β−Ｄ−エリスローペントフラノシル］−チミンＮａＢＨ４（１ ，３６ｇ、９．６ミリモル）の懸濁液を、ＥｔＯＨ：Ｈ，０（２２ｍ１．３　： 　１．ｖ／ｖ）混合液中の３′−９−ホルミルー５’　−０−トリチルチミジン の撹拌した溶液へ１滴づつ室温で加えた。３時間後に、ＥｔＯＡｃ　（３００ｍ ｌ）を加えて、有機層をＨｔＯ（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。乾燥した（Ｍｇ 　Ｓ　０４）　Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ抽出物を減圧下で蒸発して、残渣をシリカゲル カラムクロマトグラフィーによって精製した。ＣＨｚＣＩｔ：ＭｅＯＨ（９：　 １．ｖ／ｖ）（１，１３ｇ、８３％）を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ　８．　２９　（ｂｒ　ｓ、１．　ＮＨ）、７．　 ５９　（ｓ。
（ｍ、１．Ｈ３，）、２．３３−２．２０　（ｍ、２．Ｈｔ、Ｈｔ−）、１．９ １（ｂｒ　ｓ、１．　ＯＨ）　、１．　５３　（ｓ、３．　ＣＨ３）。
１−〔３°　−デオキシ−３’　−Ｃ−［０−（フタルイミドヒドロキシメチル ）］−５°　−〇−トリチルーβ−り一エリスロ〜ペントフラノシル］−チミン アゾニカルポン酸二イソプロピル（０，４７ｍ１，２．４１ミリモル）を、乾燥 ＴＨＦ　（１０ｍｌ）中の３′−デオキシ−３’　−Ｃ−（ヒドロキシメチル） ５′−〇−トリチルーチミジン（０，８ｇ、１．、　６２ミリモル）、Ｎ−ヒド ロキシフタルイミド（０，３５ｇ、２．１５ミリモル）、ｌ・リフェニルホスフ ィン（，０，５６ｇ、２．１５ミリモル）の撹拌した溶液へ室温で加えた。４８ 時間後に、生成物を濃縮して残渣をＣＨ２Ｃ１ｚ　（２Ｘ１００ｍｌ）で抽出し た。ＣＨ。
Ｃ１２抽出物をＮ　ａ　ＨＣＯｓ　（５％、１００ｍ１）Ｔ、次に水（１００ｍ ｌ）で洗浄した。乾燥した（ＭｇＳＯｎ）抽出物を減圧下で蒸発させて、残渣を 短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＥｔＯＡｃ：ヘキ サン類（１：　１．　ｖ／ｖ）で溶出して、適当なグラクシ３ンを合わせて濃縮 して、白色の泡沫として標題の化合物を得た。
ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）６８．２４（ｓ、　１．　ＮＨ）、　７．８５−７． ２０　（ｍ。
２０、Ｔｒ旦、Ａｒ旦、Ｃ６旦）、　６．２０（ｍ、　１．　Ｈ＋−）、　４． ２２−４゜１６（ｍ、　３．旦４１．旦ｓ−）　、　３．６３　３．４０　（ｍ 、　２．旦ｓ−、旦５．）。
Ｃｓ５ＨｓｓＮｓＯＴ・０．５　ＥｔＯＡｃに対する計算値＋Ｃ，６９゜８６； Ｈ。
５．４２；Ｎ、ｅ、１１゜実測値：Ｃ，７０，１９；Ｈ，５，２７；Ｎ。
５．７５゜ １−　［３’　−デオキシ−３’　−Ｃ−［０−（アミノヒドロキシメチル）］ −］５’−〇−トリチルーβ−Ｄ−エリスローペントフラノシル−チミンメチル ヒドラジン（０，１２ｍ１，２．２５ミリモル）を、乾燥ＣＨＩＣＩ　！（９ｍ 、ｌ）中の３゛　−デオキシ−３’　−Ｃ−［０−（フタルイミドヒドロキシメ チル）］　−５’　−０−トリチルチミジン（０，７７ｇ、１．　呼リモル）の 撹拌した溶液へ室温で加えた。１時間後に、沈殿を濾過して、残渣をＣＨｚＣ１ ｇＣ２Ｘ１０ｍｌ）で洗浄した。まとめた濾液を濃縮して、残渣を／す力ゲルカ ラムク０７）グラフィ　ｉ：よッテ精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（９７： 　３．ｖ／ｖ）を用いて溶出して、適当なフラクシロンを合わせて蒸発させて、 白色の粉末として標題の化合物を得た（０．４３ｇ、７０％）。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）６８．５９（ｂｒｓ、１．　ＮＨ）　、　７．６６　 （ｍ。
、　３．６５−３．２０　（ｍ、　４．旦ｓ１．　Ｈｓ−、旦８．）、２．８１ 　（ｍ、　１゜１（ｓ−）、２．　２１−２．　１３　（ｍ、２．　Ｈｚ、、　 Ｈｚ−）、１．　３７　（ｓ、３゜ＣＨ，）。
実施例２５　（３’　−ＣＨ，−０−Ｎ＝ＣＨ−５’　）、（３’　−ＣＨ２− ０−ＮＨ−ＣＨＩ−５”Ｉおよび　（３’　ＣＨｚ　ＯＮ（ＣＨｉ）　ＣＨｚ　 ５’　）が連結するオリゴヌクレオチドの合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−［メチレンオキシ（メチルイミノ ）］チミジリルー（３゛→５’　）　−５’　−デオキシチミジンｌ−［４−９ −ホルミルー３−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−β−り一エリスローベ ントフラノシル］チミン［１ミリモル、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄ　Ｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅｓ、９：５３３（１９９０）の手順にしたがって調整した］、３ ′　−デオキシ−３°　−Ｃ−［（０−（アミノヒドロキシメチル）］−５’　 −０−１−リチルチミジン（１ミリモル）　、ＡｃＯＨＣＯ，１ｍ１）　、およ び乾燥ＣＨ２Ｃｌ！　（２５ｍｌ）の混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸 発させて、残渣を氷ＡｃＯＨ（５ｍｌ）に溶解した。Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈｓ　ＣＮ　 （３ミリモル）を撹拌したＡｃＯＨの反応混合物へ加えた。１時間後に、ＮａＢ ＨｓＣＮ　（３ミリモル）を追加して、混合物を１時間撹拌した。反応物を真空 下で濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、 ５’−０−Ｔｒ−Ｔ−３°　ＣＨｌ　０　ＮＨ−ＣＨｚ　５’　−Ｔ　３’　Ｏ ＴＢＤＰＳｉの二量体を得た。
’　ＨＮＭＲ（ＣＤ　Ｃ１３）δ　８．７３　（ｂｒ、　ｓ、　２．２Ｎ旦）、 ７．６７旦）、　６．９６　（ｓ、１．　Ｃ，旦）、６．２３（擬似ｔ、ｉ、　 Ｔ２　旦褒、）。
ＩＨｓ−）。３．　２３　（ｍ、、１．　ＴＩ　Ｈ５°）　、２．　５５−２． 　７６　（ｍ。
３、ＴＩ　Ｈ３５，Ｔ２　旦ｓ、Ｈｓ−）　、　２．３３−２．２７　（ｍ、　 １．　Ｔ２旦ｘ、）　、　２．２３　２．　１２　（ｍ、　２．　Ｔ２　旦２　 旦、−）、１．９５−１、８５　（ｍ、　１．　Ｔ２　旦ｚ−）、　１．８３　 （ｓ、　３．　ＣＨｉ）、　１．４５（ｓ、　３．　ＣＨｉ）、１．０６　（ｓ 、　９．　（Ｃ旦１）ｓＣ５ｉ）。
ＨＣＨＯ／ＮａＢＨ，ＣＮ／Ａ、ｃＯＨを用いて最後の二量体をメチル化して、 最後に２段階でｎＢｕ４ＮＦ／ＴＨＦおよびＨＦ／ＣＨ，ＣＮを用いて保護基を 除去して、標題の化合物を得た（収量６５％）。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ＠）δ　１１．　２７　（ｔａｒ　Ｓ、２．　ＮＨ）、 ７゜８５　（ｓ、　１．　ＴＩ　Ｃａ旦）、　７．５１　（ｓ、　１．７２　Ｃ ａ旦）、　６．１５４、　５Ｈｚ）、５．３２（ｂｒ　ｓ、１．０Ｈｓ−）、５ ．　０９（ｂｒ　ｓ。
１、　ＯＨｓ、）、４．　１７　（ｍ、１．　Ｔ２　Ｈｓ−）、３．　９０　（ ｍ、１．　Ｔ２旦４）　、　３，７６　３．６６（ｍ、　４．　Ｔｌ　旦４−　 、　ＴＩ　旦５１．Ｃ旦ｚｓ−）＋３、６０−３．５２（ｍ、１．Ｔ１　旦ｓ− ）、　２．８２　（ｒｎ、　２．　Ｔ２　旦５．。
旦ｓ−）　、　２．５７（ｓ、　３．　Ｎ−ＣＨｉ）　、　２．４７　（ｍ、　 １．　ＴＩ　旦３．）。
２、２３−２゜０２（ｍ、４、旦２．旦ｔ−）　、　１．８１　（ｓ、　３．　 ＣｓＣ旦ｓ）。
１、　７８　（ｓ、３．　Ｃｓ　ＣＨｚ）。
Ｃ！ｚＨｓ＋Ｎ５Ｏｅ　・０．５　ＨｚＯに対する計算値：Ｃ，５０９６：Ｈ， ６，２２；Ｎ、１３．５０゜実測値：Ｃ，５１，０１；Ｈ，６，２２；Ｎ、１３ ．　１９゜ＭＳ　（ＦＡＢ十、グリセロール）Ｍ十Ｈ”ｍ／ｚ＝５１０゜実施例 ２６　（３’　−ＣＨｚ−０−Ｎ　（ＣＨｘ）　ＣＨｚ　５’　）を含むホスホ ラミディトが連結するオリゴヌクレオシドの合成３′−デ（オキシホスフィニコ ）　−３’　−［メチレンオキシ（メチルイミノ）］−チミジリル−５’　−０ −（ジメトキシトリフェニルメチル）　−（３’→５°）−３’−（０−β−シ アノエチルジイソブロピルアミノホスフィリル）チミンオリゴヌクレオチドの合 成：実用的な方法、Ｍ、Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版。
１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒ ａｅｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ、１９８４）に記述された手順にしたがって、二量体の５’　−０Ｈ−Ｔ− ３’　−ＣＨ２−０−Ｎ　ＣＨｚ　ＣＨｔ　−５’　Ｔ　−３’　−ＯＨをジメ トキシトリチ（ｍ、１４．旦、、ＤＭＴｒ旦）、６．２０（擬似ｔ、２．旦１． ）、４．３（ｍ、　１．　Ｔ２　旦ｓ−）　、　４．１５　（ｍ、　１．　Ｔ２ 　旦４−　）　、　４．００　（ｍ。
１、　ＴＩ　Ｈ４−）　、３．８０　（ｓ、　６．０Ｃ旦ｓ）、　３．７７　３ ．２３　（ｍ。
４、　Ｔｌ　旦５・旦ｓ−、ＣＨｚ　ｓ−）、　２．８９−２．５０　（ｍ、　 ３．　Ｔ２Ｈ，・旦５・、ＴＩ　旦３’　）　、　２．６２　（ｓ、　３．　Ｎ −ＣＨＩ）、２．４８−２、０８　（ｍ、　４．旦２．旦２−　）　、　１．９ 　（Ｓ、　３．　Ｃ５ＣＨｓ）　、　１．４８（ｓ、３．　ＣＩＣＨ３）。
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、Ｍ、Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版。
１９８４年（Ｏｌｔｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒ ａｃｔ、１ｅａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒ ｅｓｓ、１９８４）に記述された手順にしたがって、上記の化合物をホスフィチ ル化して、２段階に関しては７０％の収量で標題の化合物を白色の粉末として得 た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｇ）６８．２５　（ｂｒ　ｓ、　２．　ＮＨ）、　７．６ ６　（ｓ。
１、Ｃ５Ｈ）、７．１５　７．４５　（ｍ、１．０．ＡｒＨ，ＣｇＨ）、６．８ −６、　９　（ｍ、　４．　ＡｒＨ）　、６．　１２　（ｍ、２．　２Ｃ＋、旦 ）、　３．７９　（ｓ、６、　Ａｒ０ＣＨｓ）　、２．　５６　（ｓ、３、Ｎ− ＯＨ５）　、１．８８．　１．　４４（２ｓ、６．　２　Ｃｓ　ＣＨｓ＞、およ び他のプロトン。
”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）１４９．４２および１４８．７５ｐｐｍ。
実施例２７　その中に位置して薬物動態学および薬力学の性質を含む結合をもつ オリゴヌクレオチドの合成 ３°−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−［メチレン（ベンジルイミノ）］ −］チミジルルー５°−０ジメトキシトリフェニルメチル’）　−（３’→５’ 　）　−３’−〇−β−（シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィリル）チ ミジン実施例１２に記述したように３°　−デオキシ−３’　−Ｃ−ホルミル− ５’　−０−トリチルチミジン（１，５ミリモル）を５′−ｐ−アミノ−３’− ０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン（１，５ミリモル）と還元的に結 合して、５’　０−Ｔｒ−Ｔ−３’　ＣＨｚ　ＮＨＯＣＨＩ　５°−Ｔ−３’　 −０−ＴＢＤＰＳ　ｉの二量体を得た。上述のメチル化と同じ方法でＣｅＨ５Ｃ ＨＯ／ＮａＢＨｓ　ＣＮ　／　Ａ　ｃ　ＯＨを用いて二量体をベンジル化して、 Ｎ−ベンジル化二量体である、５’　−０−Ｔｒ−Ｔ　３’　ＣＨｚ　ＮＢｚ− ＯＣＨＩ　５’　Ｔ−３’　−０−ＴＢＤＰＳｉを得た。上記の実施例で記述し たようにｎ　Ｂ　ｕ　ａ　Ｎ　Ｆ　／　Ｔ　ＨＦおよびＨＣ１／ＭｅＯＨの方法 論を用いて、最後の二量体から保護基を除去して、保護基のはずれた二量体であ る、５　’　ＯＨＴ　−３’　−ＣＨｚ　Ｎ　Ｂ　ｎ　−０−ＣＨｚ　５’　− Ｔ　３’　−ＯＨを得て、オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、Ｍ、Ｊ、 ガイド編集、ＩＲＬ出版、１９８４年（０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙ ｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、 Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８４）に記述された手順にしたがって、こ れをジメトキシトリチル化して、その後にホスフィチル化して、標題の化合物を 得た（全体の収量４５％）。
’　ＨＮＭＲ（ＣＤ　ＣＩ　ｓ）δ　６．１５（擬似ｔ、１．　Ｔ２　ＣＩ一旦 ）、６゜０９　（ｍ、　１．　ＴＩ　ＣＩ一旦）　、　３．７６　（ｓ、　６． ２０Ｃ旦ｓ）、１．７および１．　４８　（２ｓ、６．　２−ＣＨ，）および他 のプロトン。
”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｓ）　１４９．５９および１４９．２３ｐｐｍ。
オリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成の前に、様々な薬物動態学および薬力学の性質 のある修飾基を骨格の結合中へ取り込ませる能力を説明した実施例８の方法で、 自動ＤＮＡ合成機を用いてホスフィチル化した二量体をオリゴマーの中へうま（ 導入した。
実施例２８　（３’　ＣＨ，−ＮＨＣＨｔ　５°）、（３’　ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３ ）　ＣＨＩ−ＣＨＩ−５’　）　、およびホスホラミディト誘導体３′−デ（オ キシホスフィニコ）−３’−［（メチレンイミノ）］−５°　−０−（ジメトキ シトリチル）チミジリルー（３゛→５°）−チミジンＡｃＯＨの存在下で１−［ ６°−アミノ−２’、５’、６’　−トリデオキシ−３’−０−（ｔ−ブチルジ フェニルシリル）−β一旦−エリスローヘキソフラノシル］チミン［１，２ミリ モル、Ｇ、エト　シルト（Ｇ、Ｅｔ　Ｚｏｌｄ）ら。
Ｊ、Ｃ，Ｓ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍ５．．４２２　（１９６８）の手順にしたがっ て調製した］を用いて３゛　−デオキシ−３°一旦−ホルミル−５°　−ｏ−ト リチルチミジン（１ミリモル）を還元的にアミン化して［Ａ、Ｆ、アドベルーマ ジ・ラド（Ａ、Ｆ、Ａｄｂｅｌ−Ｍａｇｉｄ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ ｅｔｔｓ。
３１　：　５５９５　（１９９０）の手順にしたがった］、保護基のついた二量 体であ去して５’　−０Ｈ−Ｔ−３’　−ＣＨｚ−ＮＨ−ＣＨｉ−ＣＨｚ−５° −Ｔ−３’　−０）ｆの二量体を白色の粉末として得た（収量７０％）。
’ＨＮＭＲ（ＤｚＯ，ｐＨ５，６，２０℃）δ　Ｔ１チミジン単位ニア、７８（ Ｓ、１．　ＣｇＨ）、　６．　１７（ｔ、　１．　Ｃｓ旦）、　４．４５（ｍ、 １．　Ｃｓ２世。
４．０８　（ｍ、１．０４一旦）　、　４．００．３．７２（ｍ、　２．　Ｃｅ −、ｓ一旦）。
２、９　（ｍ、　２Ｃａ・、ａ一旦）　、　２．３４　（ｍ、　２．　Ｃｓ２． ｚ旦）、１．７７（ｓ、３．　ＣＨ，）、Ｔ２チミジン単位：　７．４７　（ｓ 、１．　ＣｇＨ）、６．０７　（ｔ、１．　Ｃ，、旦）、　３．８９　（ｍ、　 ２．　Ｃｓ、ｓ−）、　３．７９　（ｍ、　１゜Ｃ４−Ｈ）　、２．８９　（ｍ 、１．　Ｃｓ、旦）　、　２．３８　（ｍ、１．　Ｃｚ一旦）。
２、３２　（ｍ、１．　Ｃｓ＝旦）、１．７２　（ｓ、　３．　ＣＨ，）、およ び２．６８骨格のアミ、ンのｐＫａの指標として、前記の二量体のＮ−Ｍｅ基の プロトンのケミカルシフトの、ｐＨの変化に応答した変化への反応性をＮＭＲに よって測定した。アミノ基にプロトンが結合するにつれて、ケミカルシフトは低 磁場へ移動した。５’　−０Ｈ−Ｔ　３’　ＣＨｚ　ＮＣＨｓ　ＣＨｔ　ＣＨｚ −５’　Ｔ−３’−ＯＨの二量体のサンプル４ｍｇを３０ｍＭの重炭酸塩の緩衝 液Ｑ、５ｍｌに溶解した。０．ＩＮ　ＮａＯＨを用いて６段階でｐＨを５，１か ら１０．０の間で変動させた。Ｎ−メチルのプロトンのケミカルシフトは２．２ ６ｐｐｍから２゜９３ｐｐｍの間で変動し、ｐＫａは７．８±０．１であると決 定した。私達は理論に縛られたくないのだが、したがって生理学的なｐＨではこ の骨格にはプロトンが結合していると信じる。
ＡｃＯＨ中のＨＣＨＯ／　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈｓ　ＣＮを用いて前述の二量体をメチ ル化して、５’　ＯＨＴ　３’　−ＣＨｚ−Ｎ（ＣＨｓ）　ＣＨｚ　ＣＨＩ　５ °−Ｔ−３’　−ＯＨを得て、オリゴヌクレオチドの合成二実用的な方法、Ｍ、 Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版、１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、 Ｊ、Ｇａ１ｔ。
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８４）に記述された手順にしたがって、これをジメト キシトリチル化およびホスフィチル化して、泡沫として標題の化合物を得た（６ ８％）。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１ｓ’）δ　６゜１２　（ｍ、　２．２Ｃ＋、旦）、　２． 　１５．２゜１４　（２ｓ、　３．　Ｎ−ＣＨＩ）、　１．８８．１．４５　（ ２ｓ、　６．２　ＣｓＣ旦、）および他のプロトン。
”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　１４９．４９および１４８．９６ｐｐｍ。
実施例２９　（３’　−ＣＨＩ−ＮＨ−０−ＣＨＩ−５’　）結合の再生のため の不安定なＮ−保護基をもつ３゛　−デ（オキシホスフィニコ）　−３’　−（ メチレンイミノ）　−（３’→５′）結合を含んだ、（３’　−ＣＨＩ−Ｎ　（ 不安定な保護基）−〇−ＣＨ！−５°）の二量体およびホスホラミディト誘導体 −二量体０−ＣＨ２−５’　−Ｔ−３’　−〇−ＴＢＤＰＳ　ｉ　（１ミリモル 、Ｆ、デノく一ト（Ｆ、Ｄｅｂａｒｔ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ ｓ、、３３：印刷中、１９９２年の手順にしたがって調製した）撹拌した溶液へ 塩化フェノキシアセチル（１，２ミリモル）を加えた。１２時間後に、生成物を ＣＨＩＣＩ　！　（２００ｍ１）で希釈して、飽和ＮａＨＣＯｓ　（２Ｘ５００ ｍｌ）　、水（２Ｘ５０ｍｌ）で洗浄して、乾燥させた（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）。
ＣＨ，ＣＩ　、抽出物を濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー によって精製した。ＣＨｚＣｌｚ：ＭｅＯＨ（９：　１．　ｖ／ｖ）を用いて溶 出して、適当なフラクションを合わせて蒸発させ宜ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ） 　δ　１１．　３５　（ｂｒ　ｓ、２．　ＮＨ）、７゜トリチル基を除去するた めにＨＦ　（４８％）／ＣＨｓＣＮ　（５：　９５．ｖ／ｖ）処理によって前記 の二量体から連続して保護基を除き、ｎ　Ｂ　ｕ　４　Ｎ　Ｆ　／　Ｔ　ＨＦを 用いた処理の生成物からシリル基を除去して、白色の粉末として標題の化合物を 得た（３段階で７０％）。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）δ　１１．３５　（ｂｒ　ｓ、１．　ＮＨ）、１ １゜２５（ｂｒｓ、１．　ＮＨ）　、７．９２　（ｓ、　１．　Ｃｍ旦）、　７ ．５　（Ｓ、１゜Ｃ，Ｈ）、７．２−６．８（ｍ、５．ＡｒＨ）、６．２３（擬 似ｔ、１．旦１．）。
Ｈ，、、旦４・、旦ｓ−Ｈｓ−、Ｃ旦ｚｓ−）　、　２．６　（ｍ、　１．　Ｔ ｌ　旦３．）。
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、Ｍ、Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版。
１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ、１９８４）に記述された手順によって、最後の二量体をジメトキシトリチ ル化して、薄い黄色く色のついた泡沫として５’　−ＯＤＭＴ　３’　ＣＨｚ− Ｎ　（ＣＯＣＨｘＯＰｈ）　０−ＣＨｚ−５°−Ｔ−３’　−ＯＨを得た。
ＩＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｉ）６１１．　３　（ｂｒ　ｓ、２．　ＮＨ）、７． ５５　（ｓ、１．０ｔ旦）　、７．４５　（ｓ、１．　Ｃｍ旦）　、　７．３８ −６．７５　（ｍ。
２、　ＣＨり　、　４．２５　（ｍ、　１．　Ｔ２　旦ｓ−）　、　４．１８　 （ｍ、　１．　Ｔ２旦ｓ−）　、　４．０５　（ｍ、　１．　Ｔ２　旦ｓ−）　 、　３．９　（ｍ、　２．　Ｈａ、）　。
３、８−３．６　（ｍ、　２．　Ｃ旦ｔ　３−　）　、　３．６５　（ｓ、　６ ．２０Ｃ旦、）。
３、２　（ｍ、　２．　ＴＩ、旦５．旦５．）、２．８２　（ｍ、　１．　Ｔｌ 　旦３．）。
２．３−２．０５（ｍ、　４．旦、２旦ｘ、）、　１．６　（ｓ、　３．　Ｔ２ 　ＣＨＣＨ３）　。
１、３８　（ｓ、　３．　ＴＩ　ＣＨ，）。
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、Ｍ、Ｊ、ガイド編集、ＩＲＬ出版。
１９８４年（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｄ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、ＩＲＬ　Ｐｒｅ ＳＳ、１９８４）に記述されている手順にしたがって上記の二量体をホスフィチ ル化してホスホラミディトの誘導体の二量体（ＤＮＡ合成機の使用に適当である ）を泡沫として得た（２段階で７５％）。
ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣｉｌ）６７．６２　（ｓ、　１．　Ｃｍ旦）、　７．２−７ ．４５（２ｍ、１２．ＡｒＨ）　、　６．７７　７．０５　（３ｍ、　７．　Ａ ｒＨ，Ｃｍ旦）。
６．１５（擬似ｔ、ｉ、　ＣＩ、旦）、６．　０５　（ｔ、１．　ＣＩ・旦）、 ４．７”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣＩり　１４９．７６および１４９．５６ｐｐｍ。
実施例３０　オリゴヌクレオチド中の（３’　−ＣＨ，−Ｎ　（不安定な保護基 ）ＣＨ２ＣＨ２５’　）結合からの（３’　ＣＨ２Ｎ　Ｈ−０−ＣＨ２−５°） の結合の再生 実施例２９のホスフィチル化した二量体を実施例８の手順によってオリゴヌクレ オチド中に導入するだろう。支持体上のオリゴヌクレオチドが完成した後に、標 準的な水酸化アンモニウムの条件を使用してオリゴヌクレオチドを支持体から切 断する。水酸化アンモニウム処理によって、支持体からの切断とともにさらに、 導入された（３’　ＣＨ２Ｎ　（ＣＯＣＨｚＯＰｈ）−０−ＣＨ２−５’　）オ リゴヌクレオチドの二量体のイミノ窒素からフェノキシアセチル保護基も切断さ れて、オリゴヌクレオチドの構造中で（３’　−ＣＨｚ　ＮＨ−０−ＣＨ２−５ ’　）が連結するオリゴヌクレオチドの二量体を得るだろう。
実施例３１　（３’　ＣＨ２Ｐ　（０）　２　０　ＣＨｚ−５’　）および（３ ゛−Ｃ８２０Ｐ　（ＯＨ）　２　ＣＨｚ　５°）が連結するオリゴヌクレオシド の合成３°　−Ｃ−ホスホネートニ量体の合成３′−ヒドロキシメチル−５’　 −０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジンをＮＢＳを用いた処理によって それの臭化物へ変換するだろう。この臭化物でアルブゾフ反応（Ａｒｂｕｚｏｖ 　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ホスホネートジエステルを得る。トリメチルブロ モシランを用いたホスホネートジエステルの切断によってフリーの酸を得て、ピ リジン中の３°−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジンおよびＤＣＣを 用いてこれを処理してその二量体を得る。
３’　−Ｃ−ホスホネートが連結するオリゴヌクレオシドの合成標準的なりＮＡ 合成機の化学によってオリゴヌクレオシド中の希望する位置へ挿入するための５ ’−０−ＤＭＴおよび３′−〇−ホスホラマイトの誘導体として、二量体に適当 に保護基をつけてそれを活性化することによって、上記の二量体をオリゴヌクレ オシドの中へ導入するだろう。
５′−Ｃ−ホスホネートが連結するオリゴヌクレオシドの合成５°　−デオキシ −５゛　−ブロモヌクレオシドを亜リン酸エステルと反応させて５′−ホスホネ ートが得られるので、対応する５゛−〇−ホスホネートの二量体を得るだろう。
これを順に３゛　−ヒドロキシメチルヌクレオシドと反応させて、評価 方法１　オリゴヌクレオチドの構造および完全性Ａ、オリゴヌクレオチドの消化 オリゴヌクレオチドの酵素的消化 種々のアンチセンス・オリゴヌクレオチドにおける主鎖修飾の取り込みを、以下 の方法を用いて酵素的加水分解により確認した。この方法の配列リストにおいて は、「＊」は配列中の本発明の結合の位置を示すために用い、同様にｒｐＪは正 常なホスホジエステル結合の位置を示すために用いている。
修飾オリゴヌクレオチド （５°−ＧｐＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ＊ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＧ− ３’）（０，２０Ｄ、　Ａｚｓｏｎｓ）を、０．１Ｍｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝Ｍ（ ｐＨ８，３，２００μｌ）に溶解し、ヘビ毒ホスホジェステラーゼ（０，４Ｈｇ Ｌアルカリホスファターゼ（０，４μｇ）、および子ウシ牌臓ホスホジェステラ ーゼ（０゜４μｇ）で３７℃において２４−６０時間処理した。得られた混合物 を希釈し、ＨＰＬＣで分析した。カラム　Ｃ−１８ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏ ｓｉｌ）　（５ｉｔ　）、流速・１ｍｌ／ｍｉ　ｎ、溶ＨＡ：　１０ｍＭ酢酸ト リエチルアンモニウム、溶液Ｂアセトニトリル／水（１：１）、Ｏ％Ｂから５０ ％Ｂまで２０分間の直線勾配。
ヌクレオシド成分の吸光係数に従い、ピーク面積に基づいてこの物質を定量化し た。ダイマーを含むそれぞれの修飾主鎖の間−性は、合成試料を完全に消化され たオリゴヌクレオチドと同時に注入することにより確認した。すべての場合にお いて、ＨＰＬＣ分析のピークの積分は、消化されたオリゴヌクレオチドの組成が 正しいことを示した。
Ｂ、主鎖結合の完全性 さらに、それぞれの修飾主鎖の取り込みの完全性は、同一のＤＮＡ合成器（ＡＢ Ｉ　３８０Ｂ）で製造されたｃｐＴ＊”ｒｐｃｙテトラマーの１Ｈおよび３ＩＰ 　ＮＭＲ分析によっても支持された。これは、合成器のコンピュータ・プログラ ムの間接的な確認である。
方法２　ハイブリダイゼーショノ分析 本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはオリゴヌクレ オシドの、相補的核酸に結合する相対的能力は、特定のハイブリダイゼーション 複合体の融点を決定することにより比較することができる。融点（Ｔｍ）は、互 いに相補的な核酸の物理的性質であり、５０％の２本鎖ヘリγクス形対コイル（ ハイブリダイゼーションしていない）形が存在する温度を００で表わしたもので ある。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いて、ハイブリダイゼーションの形成と分解 （溶融）を決定することにより測定する。ハイブリダイゼーションの間に生ずる ベーススタッキングは、ＵＶ吸収の減少を伴う（淡色性（ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｉ ｃｉｔｙ））、したがって、ＵＶ吸収の減少は、より高いＴｍを示す。Ｔｍが高 いほど、鎖の結合強度が大きくなる。非ワトラン・クリック塩基対は、Ｔｍに対 して強い不安定化効果を有している。したがって、標的ＲＮＡに対するアンチセ ンス・オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドの最適な結合を得るために は、塩基対の絶対的正確性が必要である。
Ａ、オリゴヌクレオチド類似体のハイブリダイゼーションの熱力学の評価本発明 の選択されたオリゴヌクレオチド類似体が、これらに相補的なＲＮＡまたはＤＮ Ａ配列にハイブリダイズする能力を、熱溶融分析により決定した。ＲＮＡ相補鎖 は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび、核酸合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）により合成されたテンプレート・プロモータＤＮＡか ら合成した。ＲＮＡ種は、ＦＰＬＣ（ＬＫＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
Ｉｎｃ）を用いてイオン交換により精製する。アンチセンス・オリゴヌクレオチ ド類似体を化学量論的濃度でＲＮＡまたはＤＮＡ相補鎖に加え、２本鎖からラン ダムコイルへの転移における吸収（２６０ｎｍ）深色性（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍ ｉｃｉｔｙ）を、分光光度計（Ｇｉｌｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｎ）を用い てモニターする。これらの測定は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、 ０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、およびＯ，１Ｍまたは０．１Ｍのイオン強度を得るため のＮａＣ１の緩衝液中で実施する。データは、１／Ｔｍ対Ｉｎ［Ｃｔ］（ここで Ｃｔは全オリゴヌクレオチド濃度）を表すグラフにより分析することができる。
本発明の選択されたオリゴヌクレオチド類似体のノ・イブリダイセーシジノの熱 力学的分析の結果を表１に示す。この表の配列リストにおいては、「＊」は配列 中の本発明の結合の位置を示すために用い、同様に「ｐ」は正常なホスホジエス テル結合の位置を示すために用いている。さらに、この表および後述の表におい ては、本発明の種々の主鎖結合についての一般化学名と構造の略記の間の相互参 照は以下のとおりである。オキシム、（３°　−ＣＨ＝　Ｎ　−ＯＣＨ２５°） 、アミノヒドロキシ６（３°　ＣＨ２ＮＨ−ＯＣＨ２５’　）、Ｎ−メチル−ア ミノヒドロキシ：　（３’　−ＣＨ２Ｎ　（ＣＨ３）−０−ＣＨ２−５’　）　 、Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　（３’　−ＣＨ２−０−Ｎ　（ＣＨ３）−Ｃ Ｈ２−５°）、およびＮ、Ｎ’　−ジメチルヒドラジノ−（３°　−ＣＨｚ　Ｎ 　（ＣＨＡ）　Ｎ　（ＣＨｓ）−ＣＨ２−５°）。
表１ ２本鎖の安定性（ＤＮＡ−ＲＮＡ） 配列　５°−ＧｐＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ＊ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐ Ｇ−３゜Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　４８．　９　−１．　３Ｎ−メチル− アミノヒドロキシ　４９．４　−０．８Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラジノ　４ ８．　３　−１．　９アミノヒドロキシ　４７．　８　−２．　４配列　５’− ＧｐＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＧ−３’＊主 鎖　Ｔｍ　（”Ｃ）　６７ｍ　（’Ｃ）天然　５０２ Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　４７．５　−２．７Ｎ−メチル−アミノヒドロ キシ　４９．７　−０．５Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラジノ　４８．６　−１ ．６アミノヒドロキシ　４３．　７　−６．　４配列　５’−ＧｐＣｐＧｐＴｐ ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＧ−３’＊主ｍ　Ｔｍ　（’Ｃ ）　６７ｍ（’Ｃ）天然　５０，２ Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　４４．２　−６．ＯＮ−メチル−アミノヒドロ キシ　４８．２　−１．９Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラジノ　４９．０　−１ ．２アミノヒドロキシ　４５．　３　−４．　９配列：　５’−ＧｐＣｐＧｐＴ ＊ＴｐＴｐＴｐＴ＊ＴｐＴｐＴｐＴ＊ＴｐＧｐＣｐＧ−３’＊主鎖　Ｔｍ　（’ Ｃ）　６７ｍ（’Ｃ）天然　５０．２ Ｎ−メチル−アミノヒドロキシ　４７．　８　−２．　４配列　５°−ＧｐＣｐ ＧｐＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴｐＧｐＣｐＧ−３’Ｎ−メチル− ヒドロキシアミノ　４２．　３　−７．　９アミノヒドロキシ　４５．５　−４ ．７配列、５°−ＧｐＣｐＧｐＴ＊ＴｐＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴｐＴ＊ＴｐＧｐ ＣｐＧ−３゜Ｎ−メチル−アミノヒドロキシ　４７．９　−２．３Ｎ、Ｎ’　− ジメチル−ヒドラジノ　４７．３　−２．８アミノヒドロキシ　４３．９　−６ ．３配列：５°−ＧｐＣｐＧｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＧｐ ＣｐＧ−３’Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　４０．０　−１０．２Ｎ−メチル −アミノヒドロキシ　５０．　８　＋０．　６４Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラ ジノ　５１．３　＋１．１アミノヒドロキシ　４４．２　−６．０配列、５°− ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＣｐＴ＊ＴｐＴｐＣｐＣｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣ− ３’＊主ｔａ　Ｔｍ　（”Ｃ）　ΔＴｍ（’Ｃ）天然　６３．４ オキシム　６０．２　−３．２ Ｎ−メチル−アミノヒドロキシ　６４．　９　＋１．　５Ｎ、Ｎ’　−ジメチル −ヒドラジノ　６４．　９　＋−１，５アミノヒドロキシ　６２．９　−０．５ 配列　５’−ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴ＊ＴｐＴ＊ＴｐＣｐＣｐＧｐＧｐ ＴｐＣｐＣ−３’＊主鎖　Ｔｍ（’Ｃ）　ΔＴｍ（’Ｃ）天然　５６．７ Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　５４．　３　−２．　４Ｎ−メチル−アミノヒ ドロキシ　５７．４　＋０．７Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラジノ　５７．０　 ＋０．３アミノヒドロキシ　５６．０　−０．７配列：　５’−ＣｐＧｐＡｐＣ ｐＴｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴ＊ＴｐＣ−３゜＊主１１　Ｔｍ　（’Ｃ ）　ΔＴｍ　（’Ｃ）天然　４４．１ オキシム　４１．　６　−２．　５ Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　４３．８　−０．３Ｎ−メチル−アミノヒドロ キシ　４３．　６　−０．　５Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラジノ　４２．　８ 　−１．　３アミノヒドロキシ　４３．　４　−０．　７さらに、本発明の修飾 結合を有するオリゴヌクレオチドの塩基対特異性について調べた。この研究にお いては、配列（５°−ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＣｐＴ＊ＴｐＴｐＣｐＣｐ ＧｐＧｐＴｐＣｐＣ−３°）中のＴＩＴダイマーの５°−Ｔの、ＲＮＡ相補鎖の Ａにマツチした時の結合（Ｔ：ｒＡ対）を、Ｃ，ＧまたはＵとのミスマツチと比 較して測定した。すべての塩基対のミスマツチの平均を表２に示す。表２は、本 発明の主鎖結合の、相補鎖に対する本質的ワトランークリック塩基対特異性が弱 められていないことを示している。
表２ 塩基対特異性 配列　５’−ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＣｐＴ＊ＴｐＴｐＣｐＣｐＧｐＧｐ ＴｐＣｐＣ−３’Ｎ−メチル−アミノヒドロキシ　−７，３２Ｎ、　Ｎ’　−ジ メチル−ヒドラジノ　−７，４１アミノヒドロキシ　−６，８９ Ｂ、オリゴヌクレオチド類似体のハイブリダイゼーシヨンの正確性本発明のアン チセンス・オリゴヌクレオチド類似体の、絶対的特異性をもって標的ｍＲＮＡと ハイブリダイズする能力は、全細胞ＲＮＡの存在下における精製標的ｍＲＮＡの ノーザンプロット分析により示すことができる。標的ｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポ リメラーゼプロモーターの下流に配置された標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡを含むベク ターから合成する。合成したｍＲＮＡをアガロースゲル中で電気泳動し、適当な 支持膜にトロセルロース等）に転移させる。この支持膜をブロッキングして、” Ｐ−標１ｍしたオリゴヌクレオチド類似体をプローブとして用いる。
ストリンジエンシーは、プロットを繰り返し、より高い温度において、またはよ り低いイオン強度の洗浄１ｉｉａにより洗浄することにより決定する。ヘテロ２ 本鎖の形成の存在を評価するためにオートラジオグラフィーを行い、オートラジ オグラムをレーザー密度計（ＬＫＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ｆｎｃ、）により 定量化する。全細胞ＲＮＡを標準的方法により単離し、アガロース電気泳動、膜 転移、および１１５ｍしたオリゴヌクレオチド類似体をプローブとして用いて分 析することにより、ハイブリット形成の特異性を決定する。ストリンジエンシー は修飾していないアンチセンス・オリゴヌクレオチドについてあらかじめ決定し 、特異的に標的とするｍＲＮＡのみかオリゴヌクレオチド類似体とへテロ２本鎖 を形成しうる条件を用いる。
方法３　ヌクレアーゼ耐性 Ａ、血清および細胞質ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド類似体の耐性の 評価 血清ヌクレアーゼに対する本発明のオリゴヌクレオチド類似体の耐性は、このオ リゴヌクレオチド類似体を種々の濃度のウシ胎児血清を含む培養液中でインキュ ベートすることにより評価することができる。標識したオリゴヌクレオチド８体 を種々の時間インキュベートし、プロテアーゼにで処理し、次に２０％ポリアク リルアミド尿素変性ゲルにおける電気泳動、およびそれに続くオートラジオグラ フィーによって分析する。オートラジオグラムをレーザー密度計で定量化する。
修飾結合の位置および既知のオリゴヌクレオチドの長さに基づいて、特定の修飾 かヌクレアーゼ分解に及ぼす影響を決定することができる。細胞質ヌクレアーゼ については、ＨＬ６０細胞株を用いることができる。ポスト・ミトコンドリア上 清を密度差遠心分離により調製し、標識したオリゴヌクレオチド類似体をこの上 清中で種々の時間インキュベートする。インキュベートの後、血清核酸溶解分解 について上述したように、分解についてオリゴヌクレオチド類似体を評価する。
オートラジオグラフィーの結果を、未修飾と本発明のオリゴヌクレオチド類似体 との比較のために定量化する。
表３は、本発明のある種の結合の、１０％ウシ胎児血清に対するヌクレアーゼ耐 性を示す。表３から明らかなように、試験されたすべての結合は、天然のオリゴ ヌクレオチドと比へてウシ胎児血清のヌクレアーゼに対して高い安定性を示した 。表３は、ＮからＮ−１への転移およびＮ−１からＮ−２への転移のＬ１／、を 示す。この表の配列リストにおいては、「水」は配列中の本発明の結合の位置を 示すために用い、同様にｒｐＪは正常なホスホジエステル結合の位置を示すため に用いている。
表３ 配列・５°−ＣｐＧｐＡｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴ＊ＴｐＣ− ３゜Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ　２．０　４．ＯＮ−メチル−アミノヒドロ キシ　５．５　１２．５Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−ヒドラジノ　２０．５　３６． ５アミノヒドロキシ　２．５ 方法４５−リポキシゲナーゼ分析、治療およびアッセイＡ、治療 治療に用いるためには、５−リポキシゲナーゼの過剰なまたは異常な供給により 特徴づけられる疾患を有すると疑われる動物を、本発明に従ってオリゴヌクレオ チド類似体を投与することにより処置する。当業者は、最適な投与量、投与方法 および反復速度を容易に決定することができる。このような処置は一般に、治癒 がなされるかまたは疾患状態の減縮が達成されるまで続けられる。いくつかの疾 患については、同様に長期処置が行われる。
Ｂ、研究試藁 本発明のオリゴヌクレオチド類似体はまた、粗細胞ライセード中、または部分的 にまたは完全に精製されたＲＮＡＦＩ製物中の、５−リポキシゲナーゼｍＲＮＡ を切断あるいは調節するために用いられる場合、研究試薬用としても有用である 。
この本発明の応用は、例えば細胞を標準的方法により溶解し、最適にＲＮＡを抽 出し、次にこれを緩衝液（例えば５０ｍＭＩＪン酸塩、ｐＨ約４〜約１０）中の 、例えば約１００〜約５００ｎｇ／１０ｍｇ全ＲＮＡの濃度の組成物を用いて、 約り０℃〜約５０℃の温度において処理することにより行うことができる。切断 された５−リポキシゲナーゼＲＮＡは、アガロースゲル電気泳動および放射性ｅ ＪされたＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション、あるいはその他の標 準的な方法により分析することができる。
Ｃ９診断 本発明のオリゴヌクレオチド類似体はまた、診断への応用において、特に種々の Ｍｌｌｌにおける特定のｍＲＮＡ種の発現、あるいは異常または変異ＲＮＡ種の 発現の決定にも有用である。この例においては、オリゴヌクレオチド類似体は、 異常な配列に相補的なように設計することによって、仮想の異常ｍＲＮＡを標的 とするが、正常ｍＲＮＡにはハイブリダイズせずこれを切断しない。
ＩＩＩ！Ｉｆｆ本をホモジナイズし、ｔＭ単的な方法に従ってＲＮＡを抽出する ことができる。粗ホモジネートまたは抽出物を処理して、例えば標的ＲＮＡを切 断することができる。次に、この生成物を、切断部位の５°側の傾城に相補的な オリゴヌクレオチドが結合されている固体支持体にハイブリダイズさせることが できる。
正常および異常のｍＲＮＡの５°領域はいずれも固体支持体に結合する。異常Ｒ ＮＡの３゛領域は、本発明の化合物により切断されて、支持体に結合しないため 、正常ＲＮＡから分離される。
調節のための標的ｍＲＮＡ種は、５−リポキシゲナーゼに関係するものである。
しかし、当業者は、本発明がそのように制限されるものではなく、一般的に適用 しうろことを理解するであろう。５−リポキシゲナーゼ酵素の生成の阻害または 調節は、疾患の治療において顕著な治療の利益を有すると予想される。この組成 物の有効性を評価するために、１つまたは一連のアッセイが必要である。
Ｄ、インビトロアッセイ ５−リポキシゲナーゼの細胞性アッセイは、好ましくはヒト前骨髄性白血病細胞 株ＨＬ−６０を用いて行う。これらの細胞は、種々の既知の試薬により誘導して 単球様細胞または好中球様細胞に分化させることができる。細胞を１．３％ジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理することは、細胞の好中球への分化を促進 することが知られている。現在、基底Ｈ−６０細胞が検出可能なレベルの５−リ ポキシゲナーゼ蛋白質を合成しないか、またはロイコトリエン（５−リポキシゲ ナーゼの下流生成物）を分泌しないことが知られている。ＤＭＳＯによる細胞の 分化は、ＤＭＳＯの添加から４８時間後に５−リポキシゲナーゼ蛋白質の出現と ロイコトリエン生合成を引き起こす。したがって、５−リポキシゲナーゼ蛋白質 合成の誘導は、これらの細胞において５−リポキシゲナーゼ合成を阻害するアン チセンス・オリゴヌクレオチド類似体の分析のための試験システムとして利用す ることができる。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの第２の試験システムは、５−リポキシゲナ ーゼが「自殺」酵素である、すなわち、酵素が基質と反応することによってそれ 自身を不活性化するという事実を利用するものである。分化したＨＬ−６０また は５−リポキシゲナーゼを発現するその他の細胞を、１０μＭのＡ２３１８７（ カルシウム・イオノフオア）によって処理することは、５−リポキシゲナーゼの サイドシルから膜への移動およびそれに続く酵素の活性化を促進する。活性化お よび何回かの触媒作用の後、酵素は触媒的に不活性化する。したがって、カルシ ウム・イオノフオアによる細胞の処理は、内因性５−リポキシゲナーゼを不活性 化する。ロイコトリエンＢ、の合成能力により測定したところ、細胞がＡ２３１ ８７処理から回復するためには約２４時間を要する。５−リポキシゲナーゼに対 するオリゴヌクレオチド類似体は、以下の定量的なアッセイを用いて、２つのＨ Ｌ−６０モデル系において活性を測定することができる。これらのアッセイは、 生きた細胞における５−リポキシゲナーゼ活性の測定等の、より下流の事象と比 べて、生きた細胞における５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の阻害の最も直接的 な測定である。
生きた細胞においてオリゴヌクレオチド類似体が及ぼすことができ、容易に定量 化しつる最も直接的な効果は、５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の特異的な阻害 である。この方法を実施するためには、細胞を３５５−メチオニン（５０μＣ１ ／ｍＬ）で３７℃において２時間標識し、新たに合成された蛋白質を標識する。
細胞を抽出して全細胞蛋白質を可溶化し、５−リポキシゲナーゼ抗体で５−リポ キシゲナーゼを免疫沈降させ、次にプロティンＡセファロースビーズから溶出す る。免疫沈降した蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離 し、オートラジオグラフィーのために感光を行う。免疫沈降した５−リポキシゲ ナーゼの量を走査密度計で定量化する。
これらの実験の結果は次のとおりである。対照細胞から免疫沈降された５−リボ キンゲナーゼ蛋白質の量を１００％として標準とする。細胞を１μＭ、１０μＭ および３０μＭの有効なオリゴヌクレオチド類似体によって４８時間処理すると 、免疫沈降された５−リポキシゲナーゼはそれぞれ標準の５％、２５％および７ ５％減少する。
細胞ホモジネートにおける５−リポキシゲナーゼ酵素活性の測定もまた、ロイコ トリエンを合成しうる酵素の存在量を定量化するために用いることができる。
現在、逆相ＨＰＬＣを用いて細胞ホモジネート中の５−リポキシゲナーゼ酵素を 定量化するための放射測定法が開発されている。細胞をプロテアーゼ阻害剤およ びＥＤＴＡを含む緩衝液中で超音波処理により破壊する。細胞ホモジネートを１ ０、ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離し、上清を５−リポキシゲナーゼ活性につい てアッセイする。サイドシル蛋白質を１０μＭの１４０−アラキドン酸、２ｍＭ ＡＴＰ、５０μＭａｌｌＦ！カルシウム、１１００ｕ／ｍｌホスファチジルコリ ン、および５０ｍＭｂ　１ｓ−Ｔｒ　１ｓｌｉ衝液（ｐＨ７，０）とともに３７ ℃において５分間インキュベートする。等量のアセトンを加えることにより反応 を停止させ、酢酸エチルで脂肪酸を抽出する。基質と反応生成物をツババックＣ １８カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ｉｎｃ、、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて逆相 ＨＰＬＣにより分離する。ラジオクロマトグラフィー検出機（Ｂｅｃｋｍａｎ　 ｍｏｄｅ　１１７１）により、放射活性を有するピークを検出する。ジーＨＥＴ Ｅおよびモノ−ＨＥＴＨに転換されたアラキドン酸の量を５−リポキシゲナーゼ 活性の測定値として用いる。
ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞を、有効なオリゴヌクレオチド類似体で１μＭ１１ ０μＭおよび３０μＭの濃度において処理した結果は以下のとおりである。対照 細胞は２００ｐｍｏ１１５分／細胞１０６個のアラキドン酸を酸化する。１μＭ 、１０μＭおよび３０μＭの有効なオリゴヌクレオチド類似体で処理した細胞は 、それぞれ１９５ｐｍｏ　１．．１４０ｐｍｏ　ｌおよび６０ｐｍｏ１１５分／ 細胞１０６個のアラキドン酸を酸化する。
細胞中の全５−リポキシゲナーゼ蛋白質の測定のための定量的競合酵素免疫アッ セイ（ＥＬＩＳＡ）が開発されている。大腸菌で発現させ、抽出、Ｑ−セファロ ース、ヒドロキシアパタイトおよび逆相ＨＰＬＣにより精製したヒト５−リポキ シゲナーゼを標準として、およびマイクロタイタープレートの被覆のための第１ 抗体として用いる。２５ｎｇの精製５−リポキシゲナーゼを４℃で一晩マイクロ タイタープレートに結合させる。ウェルを２０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１緩衝液 （ｐＨ７，４）および１５０ｍＭＮａＣ！　（ＴＢＳ）で希釈した５％ヤギ血清 で９０分間被覆する。細胞抽出物（０，２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−４００，１２， ０００Ｘｇ、３０分間）または精１１１１５−リポキシゲナーゼを、全量１．０ ＯａＬの１：４０００希釈抗５−リポキシゲナーゼポリクローナル抗体とともに 、マイクロタイターのウェル中で９０分間インキュベートする。抗体は、精製ヒ ト組み換え５−リポキシゲナーゼでウサギを免疫して調製する。ウェルを０．０ ５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ　（ＴＢＳＴ）で洗浄し、次に１００μＬの１ 　：　１０００希釈ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅ ｌ　Ｌａｂｏｒａｔ。
ｒｉｅｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ）とともに２５℃において６０分間インキュ ベートする。ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、テトラメチルベンジジンで発色させて ペルオキシダーゼ標識第２抗体の量を決定する。
１μＭ１１０μＭおよび３０μＭの３０塩基のオリゴヌクレオチド類似体を用い たそのようなアッセイの結果は、それぞれ細胞１０６個につき５−リポキシゲナ ーゼが３０ｎｇ、１８ｎｇおよび５ｎｇであり、処理していない細胞は約３４ｎ ｇの５−リポキシゲナーゼを含む。
５−リポキシゲナーセ生合成の阻害の正味の効果は、刺激された細胞から放出さ れたロイコトリエンの量の減少である。ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞は、カルシ ウム・イオノフオアＡ２３１８７による刺激によりロイコトリエンＢ４を放出す る。細胞培養液に放出されたロイコトリエンは、商業的に入手可能な診断キット （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて 、ラジオイムノア７セイにより定量することができる。ＨＬ−６０細胞における ロイコトリエンＢ４の産生は、ＤＭＳＯを添加して細胞を好中球様細胞に分化さ せてから４８時間後に検出することかできる。細胞（２×１０５個／ｍＬ）を１ ．３％のＤＭＳＯの存在下で、増加する濃度のオリゴヌクレオチドｉ似体で４８ −７２時間処理する。細胞を洗浄し、１％脱脂ウシ血清アルブミンを含むダルヘ コリン酸緩衝液生理食塩水中に、２　ｘ　１０’＠／ｍＬの濃度で再懸濁する。
細胞を１０μＭカルシウム・イオノフオアＡ２３１８７で１５分間刺激し、５× １０５個の細胞から産生されたＬＴＢ４の量を、製造者の記述にしたがってラジ オイムノア７セイにより決定する。
このアッセイを用いて、５−ＬＯｍＲＮＡに対する、修飾された結合を含む１５ 塩基のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧ） について得られる結果は以下のとおりである。細胞を１μＭ、１０μＭまたは３ ０μＭのオリゴヌクレオチド類似体とともに、１．３％ＤＭＳＯの存在下で７２ 時間処理する。５ＸＬＯ’個の細胞から産生されるＬＴＢ４の量は、それぞれ約 ７５ｐｇ、ｓｏｐｇおよび３５ｐｇてあり、未処理の分化細胞は７５ｐｇのＬＴ Ｂ４を産生する。
Ｅ、インビボアッセイ マウスにおける５−リポキシゲナーゼ産生の阻害は、以下の方法にしたがって示 すことができる。アラキドン酸を局所投与することにより、ロイコトリエンＢ４ 、ロイコトリエンＣ４およびプロスタグランジンＥ２が皮膚において速やかに生 成し、続いて浮腫および細胞性？＆潤が生しる。５−リポキシゲナーゼのある種 の阻害剤がこのアッセイにおいて活性を示すことが知られている。このアッセイ のために、２ｍｇのアラキドン酸をマウスの耳に適用し、反対側の耳を対照とす る。
アラキドン酸投与から１時間後の生検試料から得たホモジネート中のミエロペル ３％、５８％および９０％であり、これに対しロイコトリエンＢ、の生成の阻害 はそれぞれ約１５％、７９％および９９％である。
ｈ ＦＩＧ、！ ＦＩＧ、２ 手続補正書 平成５年／−月７　日。

Claims (96)

    【特許請求の範囲】
  1. １．オリゴヌクレオチド類似体であって、該類似体の少なくとも−部のサブユニ ットが次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１およびＬ４は 互いに独立的に、ＣＨ２，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ，Ｃ−ＮＨ２，Ｃ−ＮＨＲ３，Ｃ−Ｏ Ｈ，Ｃ−ＳＨ，Ｃ−Ｏ−Ｒ１，またはＣ−Ｓ−Ｒ１であり；Ｌ２およびＬ３は互 いに独立的に、ＣＲ１Ｒ２，Ｃ＝ＣＲ１Ｒ２，Ｃ＝ＮＲ３，Ｐ（Ｏ）Ｒ４，Ｐ（ Ｓ）Ｒ４，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ，ＳＯ２，ＮＲ３，もしくはＳｉＲ５ Ｒ６であるか、あるいは一緒になってアルケン、アルキン、芳香環、炭素環、も しくは複素環の一部を形成するか、あるいは、Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，およびＬ１は 、一緒になって−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＨ２−部分，または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝Ｃ Ｈ−部分を構成し；Ｒ１よびＲ２は互いに独立的に、Ｈ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２， Ｃ１〜Ｃ１０アルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，アラルキル ，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルアミノ，アラルキルアミノ，置換アル キルアミノ，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノアル キルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミル，ケト，ベンゾキシ，カルボ キサミド，チオカルボキサミド，エステル，チオエステル，カルボキサミジン， カルバミル，ウレイド，グアニジノ，ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物 動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を 改良するための基であり； Ｒ３は、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ２，低級アルキル，置換低級アルキル，アルコキシ，低 級アルケニル，アラルキル，アルキルアミノ，アラルキルアミノ，置換アルキル アミノ，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノアルキル アミノ，ポリアルキルアミノ，ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学 的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す るための基であり； Ｒ４は、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，ＮＨ−アルキル， Ｏ−アルキルヘテロシクロ，Ｓ−アルキルヘテロシクロ，Ｎ−アルキルヘテロシ クロ，または窒素含有複素環であり； Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立的にＣ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アル コキシである； ただし、Ｌ１がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ２はＮＲ３ではなく；Ｌ４ がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ３はＮＲ３ではなく：Ｌ２またはＬ３の 一方がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ２またはＬ３の他方はＮＲ３ではな く；Ｌ２がＰ（Ｏ）Ｒ４であり，Ｒ４がＯＨであり，ＸがＯＨであり，かつ、Ｂ ｘがウラシルまたはアデニンであるときは，Ｌ３はＯではなく；またＬ１，Ｌ２ ．およびＬ１がＣＨ２であり，ＸがＨまたはＯＨであり，かつ、ＱがＯであると きは，Ｌ３はＳ，ＳＯ，またはＳＯ２ではない］ を有する、オリゴヌクレオチド類似体。
  2. ２．ＱがＯである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  3. ３．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＲ１Ｒ２である、請求項１記載のオリゴヌクレ オチド類似体。
  4. ４．Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨである、請求項３記載のオリゴヌクレオチド類 似体。
  5. ５．ＱがＯである、請求項４記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  6. ６．Ｌ２およびＬ３か互いに独立的に、ＣＲ１Ｒ２，Ｏ，Ｐ（Ｏ）Ｒ４，Ｐ（Ｓ ）Ｒ４，またはＮＲ３である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  7. ７．Ｌ２とＬ３の一方がＣＲ１Ｒ２であり、Ｌ２とＬ３の他方がＰ（Ｏ）Ｒ４ま たはＰ（Ｓ）Ｒ４である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  8. ８．Ｌ２がＯであり、Ｌ３がＰ（Ｏ）Ｒ４またはＰ（Ｓ）Ｒ４である、請求項６ 記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  9. ９．Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＲ３である、請求項１記載のオリゴヌクレオチ ド類似体。
  10. １０．Ｒ３がＨである、請求項９記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  11. １１．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＨ２であり、Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＲ ３である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  12. １２．Ｌ２とＬ３が一緒になって、シクロプロピル、シクロブチル、エチレンオ キシ、エチルアジリジン、または置換エチルアジリジン環の一部を形成している 、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  13. １３．Ｌ２とＬ３が一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６炭素環、または４，５，もしくは ６員構成の窒素複素環を形成している、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似 体。
  14. １４．ＸがＨである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  15. １５．ＸがＯＨである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  16. １６．ＸがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、またはＯ−アルケニルであり、かつ、 ＱがＯである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  17. １７．Ｂｘが、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノ アデノシン、または５−メチルシトシンである、請求項１記載のオリゴヌクレオ チド類似体。
  18. １８．ＱがＯである、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  19. １９．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＨ２である、請求項２１記載のオリゴヌクレ オチド類似体。
  20. ２０．Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＨである、請求項１９記載のオリゴヌクレオ チド類似体。
  21. ２１．Ｌ２とＬ３の一方がＯであり、Ｌ２とＬ３の他方がＮＨである、請求項１ ９記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  22. ２２．Ｌ２がＮＨであり、Ｌ３がＯである、請求項１９記載のオリゴヌクレオチ ド類似体。
  23. ２３．Ｌ２がＯであり、Ｌ３がＮＨである、請求項２１記載のオリゴヌクレオチ ド類似体。
  24. ２４．前記の横這を有するサブユニットを約５〜５０個含む、請求項１記載のオ リゴヌクレオチド類似体。
  25. ２５．実質的にすべてのサブユニットが前記の構造を有する、請求項１記載のオ リゴヌクレオチド類似体。
  26. ２６．実質的に交互のサブユニットが前記の構造を有する、請求項１記載のオリ ゴヌクレオチド類似体。
  27. ２７．医薬用として許容しうるキャリヤー中に含まれる、請求項１記載のオリゴ ヌクレオチド類似体。
  28. ２８．対応する天然のオリゴヌクレオチドに比べて、改良された耐ヌクレアーゼ 性を示す、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  29. ２９．生物中における蛋白質の生成と活性を調節する方法であって、該蛋白質を コードする核酸配列の少なくとも一部と特異的にハイブリッド形成することが可 能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを接触させることを含み、ここで類似 体のサブユニットの少なくともいくつかが次の構造：▲数式、化学式、表等があ ります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１およびＬ４は 互いに独立的に、ＣＨ２，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ，Ｃ−ＮＨ２，Ｃ−ＮＨＲ３，Ｃ−Ｏ Ｈ，Ｃ−ＳＨ，Ｃ−Ｏ−Ｒ１，またはＣ−Ｓ−Ｒ１であり；Ｌ２およびＬ３は互 いに独立的に、ＣＲ１Ｒ２，Ｃ＝ＣＲ１Ｒ２，Ｃ＝ＮＲ３，Ｐ（Ｏ）Ｒ４，Ｐ（ Ｓ）Ｒ４，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ，ＳＯ２，ＮＲ３，もしくはＳｉＲ５ Ｒ６であるか、あるいは一緒になってアルケン、アルキン、芳香環、炭素環、も しくは複素環の一部を形成するか、あるいは、Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，およびＬ４は 、一緒になって−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＨ２−部分，または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝Ｃ Ｈ−部分を構成し；Ｒ１およびＲ２は互いに独立的に、Ｈ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２ ，Ｃ１〜Ｃ１０アルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，アラルキ ル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルアミノ，アラルキルアミノ，置換ア ルキルアミノ，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア ルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミル，ケト，ベンゾキシ，カル ボキサミド，チオカルボキサミド，エステル，チオエステル，カルボキサミジン ，カルバミル，ウレイド，グアニジノ，ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬 物動態学的特性を改良すうための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性 を改良するための基であり； Ｒ３は、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ２，低級アルキル，置換低級アルキル，アルコキシ，低 級アルケニル，アラルキル，アルキルアミノ，アラルキルアミノ，置換アルキル アミノ，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノアルキル アミノ，ポリアルキルアミノ，ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学 的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す るための基であり； Ｒ４は、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，ＮＨ−アルキル， Ｏ−アルキル複素瑛，Ｓ−アルキル複素環，Ｎ−アルキル複素環，または窒素含 有複素環であり； Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立的にＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アル コキシである； ただし、Ｌ１がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ２はＮＲ３ではなく；Ｌ４ がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ３はＮＲ３ではなく；Ｌ２またはＬ３の 一方がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ２またはＬ３の他方はＮＲ３ではな く；Ｌ２がＰ（Ｏ）Ｒ４であり，Ｒ４がＯＨであり，ＸがＯＨであり，かつ、Ｂ ｘがウラシルまたはアデニンであるときは，Ｌ３はＯではなく；またＬ１，Ｌ２ ，およびＬ４がＣＨ２であり，ＸがＨまたはＯＨであり，かつ、ＱがＯであると きは，Ｌ３はＳ，ＳＯ，またはＳＯ２ではない］ を有することを特徴とする方法。
  30. ３０．ＱがＯである、請求項２９記載の方法。
  31. ３１．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＲ１Ｒ２である、請求項２９記載の方法。
  32. ３２．Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨである、請求項３１記載の方法。
  33. ３３．ＱがＯである、請求項３２記載の方法。
  34. ３４．Ｌ２およびＬ３が互いに独立的に、ＣＲ１Ｒ２，Ｏ，Ｐ（Ｏ）Ｒ４，Ｐ（ Ｓ）Ｒ４，またはＮＲ３である、請求項２９記載の方法。
  35. ３５．Ｌ２とＬ３の一方がＣＲ１Ｒ２であり、Ｌ２とＬ３の他方がＰ（Ｏ）Ｒ４ またはＰ（Ｓ）Ｒ４である、請求項３４記載の方法。
  36. ３６．Ｌ２がＯであり、Ｌ３がＰ（Ｏ）Ｒ４またはＰ（Ｓ）Ｒ４である、請求項 ３４記載の方法。
  37. ３７．Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＲ３である、請求項２９記載の方法。
  38. ３８．Ｒ３がＨである、請求項３７記載のオリゴヌクレオチド類似体。
  39. ３９．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＨ２であり、Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＲ ３である、請求項２９記載の方法。
  40. ４０．Ｌ２とＬ３が一緒になって、シクロプロピル、シクロブチル、エチレンオ キシ、エチルアジリジン、または置換エチルアジリジン環の一部を形成している 、請求項２９記載の方法。
  41. ４１．Ｌ２とＬ３が一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６炭素環、または４，５，もしくは ６員構成の窒素複素環を形成している、請求項２９記載の方法。
  42. ４２．ＸがＨである、請求項２９記載の方法。
  43. ４３．ＸがＯＨである、請求項２９記載の方法。
  44. ４４．ＸがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、またはＯ−アルケニルであり、かつ、 ＱがＯである、請求項２９記載の方法。
  45. ４５．Ｂｘが、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノ アデノシン、または５−メチルシトシンである、請求項２９記載の方法。
  46. ４６．ＱがＯである、請求項４５記載の方法。
  47. ４７．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＨ２である、請求項４６記載の方法。
  48. ４８．Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＨである、請求項４７記載の方法。
  49. ４９．Ｌ２とＬ３の一方がＯであり、Ｌ２とＬ３の他方がＮＨである、請求項４ ７記載の方法。
  50. ５０．Ｌ２がＮＨであり、Ｌ３がＯである、請求項４７記載の方法。
  51. ５１．Ｌ２がＯであり、Ｌ３がＮＨである、請求項４７記載の方法。
  52. ５２．オリゴヌクレオチド類似体が前記の構造を有するサブユニットを約５〜５ ０個含む、請求項２９記載の方法。
  53. ５３．オリゴヌクレオチド類似体の実質的にすべてのサブユニットが前記の構造 を有する、請求項２９記載の方法。
  54. ５４．オリゴヌクレオチド類似体の実質的に交互のサブユニットが前記の構造を 有する、請求項２９記載の方法。
  55. ５５．オリゴヌクレオチド類似体が医薬用として許容しうるキャリヤー中に含ま れる、請求項２９記載の方法。
  56. ５６．オリゴヌクレオチド類似体が対応する天然のオリゴヌクレオチドに比べて 、改良された耐ヌクレアーゼ性を示す、請求項２９記載の方法。
  57. ５７．蛋白質の望ましくない生成を特徴とする疾患を有する生物を処置する方法 であって、該蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリッド形成 することが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを、単独もしくは医薬用 として許容しうるキャリやー中に製剤した形で接触させることを含み、ここで前 記類似体のサブユニットの少なくともいくつかが次の構造：▲数式、化学式、表 等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮ０２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１およびＬ４は 互いに独立的に、ＣＨ２，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ，Ｃ−ＮＨ２，Ｃ−ＮＨＲ３，Ｃ−Ｏ Ｈ，Ｃ−ＳＨ，Ｃ−Ｏ−Ｒ１，またはＣ−Ｓ−Ｒ１であり；Ｌ２およびＬ３は互 いに独立的に、ＣＲ１Ｒ２，Ｃ＝ＣＲ１Ｒ２，Ｃ＝ＮＲ３，Ｐ（Ｏ）Ｒ４，Ｐ（ Ｓ）Ｒ４，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ，ＳＯ２，ＮＲ３，もしくはＳｉＲ５ Ｒ６であるか、あるいは一緒になってアルケン、アルキン、芳香環、炭素環、も しくは複素環の一部を形成するか、あるいは、Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，およびＬ４は 、一緒になって−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＨ２−部分，または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝Ｃ Ｈ−部分を構成し：Ｒ１およびＲ２は互いに独立的に、Ｈ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２ ，Ｃ１〜Ｃ１０アルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，アラルキ ル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルアミノ，アラルキルアミノ，置換ア ルキルアミノ，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア ルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミル，ケト，ベンゾキシ，カル ボキサミド，チオカルボキサミド，エステル，チオエステル，カルボキサミジン ，カルバミル，ウレイド，グアニジノ，ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬 物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性 を改良するための基であり； Ｒ３は、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ２，低級アルキル，置換低級アルキル，アルコキシ，低 級アルケニル，アラルキル，アルキルアミノ，アラルキルアミノ，置換アルキル アミノ，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノアルキル アミノ，ポリアルキルアミノ，ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学 的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す るための基であり： Ｒ４は、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，ＮＨ−アルキル， Ｏ−アルキル複素環，Ｓ−アルキル複素環，Ｎ−アルキル複素環，または窒素含 有複素環であり； Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立的にＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アル コキシである； ただし、Ｌ１がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ２はＮＲ３ではなく；Ｌ４ がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ３はＮＲ３ではなく；Ｌ２またはＬ３の 一方がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、Ｌ２またはＬ３の他方はＮＲ３ではな く；Ｌ２がＰ（Ｏ）Ｒ４であり，Ｒ４がＯＨであり，ＸがＯＨであり，かつ、Ｂ ２がウラシルまたはアデニンであるときは，Ｌ３はＯではなく；またＬ１，Ｌ２ ，およびＬ４がＣＨ２であり，ＸがＨまたはＯＨであり，かつ、ＱがＯであると きは，Ｌ３はＳ，ＳＯ，またはＳＯ２ではない］ を有することを特徴とする方法。
  58. ５８．ＱがＯである、請求項５７記載の方法。
  59. ５９．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＲ１Ｒ２である、請求項５７記載の方法。
  60. ６０．Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨである、請求項５９記載の方法。
  61. ６１．ＱがＯである、請求項６０記載の方法。
  62. ６２．Ｌ２およびＬ３が互いに独立的に、ＣＲ１Ｒ２，Ｏ，Ｐ（Ｏ）Ｒ４，Ｐ（ Ｓ）Ｒ４，またはＮＲ３である、請求項５７記載の方法。
  63. ６３．Ｌ２とＬ３の一方がＣＲ１Ｒ２であり、Ｌ２とＬ３の他方がＰ（Ｏ）Ｒ４ またはＰ（Ｓ）Ｒ４である、請求項６２記載の方法。
  64. ６４．Ｌ２がＯであり、Ｌ３がＰ（Ｏ）Ｒ４またはＰ（Ｓ）Ｒ４である、請求項 ６２記載の方法。
  65. ６５．Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＲ３である、請求項５７記載の方法。
  66. ６６．Ｒ３がＨである、請求項６５記載の方法。
  67. ６７．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＨ２であり、Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＲ ３である、請求項５７記載の方法。
  68. ６８．Ｌ２とＬ３が一緒になって、シクロプロピル、シクロブチル、エチレンオ キシ、エチルアジリジン、または置換エチルアジリジン環の一部を形成している 、請求項５７記載の方法。
  69. ６９．Ｌ２とＬ３が一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６炭素環、または４，５，もしくは ６員構成の窒素複素環を形成している、請求項５７記載の方法。
  70. ７０．ＸがＨである、請求項５７記載の方法。
  71. ７１．ＸがＯＨである、請求項５７記載の方法。
  72. ７２．ＸがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、またはＯ−アルケニルであり、かつ、 ＱがＯである、請求項５７記載の方法。
  73. ７３．Ｂｘが、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノ アデノシン、または５−メチルシトシンである、請求項５７記載の方法。
  74. ７４．ＱがＯである、請求項７３記載の方法。
  75. ７５．Ｌ１およびＬ４がそれぞれＣＨ２である、請求項７４記載の方法。
  76. ７６．Ｌ２およびＬ３がそれぞれＮＨである、請求項７５記載の方法。
  77. ７７．Ｌ２とＬ３の一方がＯであり、Ｌ２とＬ３３の他方がＮＨである、請求項 ７５記載の方法。
  78. ７８．Ｌ２がＮＨであり、Ｌ３がＯである、請求項７５記載の方法。
  79. ７９．Ｌ２がＯであり、Ｌ３がＮＨである、請求項７５記載の方法。
  80. ８０．オリゴヌクレオチド類似体が前記の構造を有するサブユニットを約５〜５ ０個含む、請求項５７記載の方法。
  81. ８１．オリゴヌクレオチド類似体の実質的にすべてのサブユニットが前記の構造 を有する、請求項５７記載の方法。
  82. ８２．オリゴヌクレオチド類似体の実質的に交互のサブユニットが前記の構造を 有する、請求項５７記載の方法。
  83. ８３．オリゴヌクレオチド類似体が医薬用として許容しうるキャリヤー中に含ま れる、請求項５７記載の方法。
  84. ８４．オリゴヌクレオチド類似体が対応する天然のオリゴヌクレオチドに比べて 、改良された耐ヌクレアーゼ性を示す、請求項５７記載の方法。
  85. ８５．請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体を合成する方法であって、次の 構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を含む第１の部分と、次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を含む第２の部分［式中、Ｂｘは可変の塩基部分であり、ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨ Ｆ，またはＣＦ２であり、そしてＥ１およびＥ２は同一または異なり、求電子反 応基である］を用意すること：および 前記第１と第２の部分を、前記求電子反応基を介して結合基とカップリングして 、前記オリゴヌクレオチド類似体を形成させること；を含む方法。
  86. ８６．第１の部分の求電子反応基が、ハロメチル、トリフルオロメチル、スルホ ニルメチル、ｐ−メチル−ベンゼンスルホニルメチルまたは３′−Ｃ−ホルミル を含む、請求項８５記載の方法。
  87. ８７．第２の部分の求電子反応基が、ハロゲン、スルホニルメチル、ｐ−メチル ーベンゼンスルホニルメチルまたはアルデヒドを含む、請求項８５記載の方法。
  88. ８８．結合基が、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンである、請求項８５記載 の方法。
  89. ８９．前記オリゴヌクレオチド類似体の少なくとも−部を、別のオリゴヌクレオ チド化学種に組み込んで、天然のホスホジエステル結合とそのようにカップリン グされた区域が実質的に交互に存在する状態の前記別のオリゴヌクレオチド類似 体を得る、請求項８５記載の方法。
  90. ９０．該組み込みが、所望の配列を有するジヌクレオチドのホスホジエステル結 合によって達成され、ここで前記ジヌクレオチドはあらかじめそのようにカップ リングされている、請求項８５記載の方法。
  91. ９１．次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり： ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基，オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基，またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｙはヒドロキシ、 アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシメチル、Ｃ−ホルミル、フタルイ ミドヒドロキシメチル、アリール置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル 、オルト−メチルアミノベンゼンチオ、メチルホスホネート、またはメチルアル キルホスホネートであり；ＺはＨ、ヒドロキシル、アミノメチル、ヒドラジノメ チル、ヒドロキシメチル、Ｃ−ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリ ール置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、オルト−メチルアミノベン ゼンチオ、メチルホスホネート、またはメチルアルキルホスホネートであり；た だし、ＱがＯであり、Ｙがヒドロキシメチルであり、かつＸがＨまたはＯＨであ るときは、ＺはＨまたはＣ−ホルミルではなく；またＱがＯであり、ＸがＨまた はＯＨであり、かつＺがヒドロキシルであるときは、Ｙはアミノヒドロキシメチ ル、ヒドラジノメチル、またはアリール置換イミダゾリジノではない］を有する ヌクレオシド。
  92. ９２．ＸがＨまたはＯＨである、請求項９１記載のヌクレオシド。
  93. ９３．ＱがＯである、請求項９１記載のヌクレオシド。
  94. ９４．請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体を合成する方法であって、ペン トフラノシルヌクレオシドの３′炭素原子においてラジカルを生成させること； および 別のペントフラノシルヌクレオシドの５′位にペンダント状態になっているオキ シム部分と該ラジカルとを反応させること；を含む方法。
  95. ９５．請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体のＬ２またはＬ３の窒素部分を 保護する方法であって、ここでＬ２とＬ３の一方はＮＲ３であり、Ｒ３はＨであ り、窒素部分をフェノキシアセチルクロライドでブロックすること；オリゴヌク レオチド類似体をさらに反応させて該オリゴヌクレオチドを変性すること； および水酸化アンモニウムで窒素部分を脱ブロックすること；を含む方法。
  96. ９６．二官能のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド類似体を保護する方法で あって、ここで二官能価のうちの一つはアルデヒドであり、アルデヒドとメトキ シアミンとを反応させてアルデヒドのオキシム誘導体を形成させること； ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド類似体をさらに反応させて該ヌクレオシ ドまたはオリゴヌクレオチド類似体を修飾すること；および該オキシムをアセト アルデヒドと反応させてアルデヒドを再生させること；を含む方法。
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