JPH06503838A - 主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体皿浬拉肚坦却 本特許出願は、１９９１年５月２１日提出の米国特許出願第７０３．６１９号の 一部継続出願であり、米国特許出願第７０３．６１９号は、１９９０年８月１３ 日提出の米国特許出願第５６６、８３６号および１９９０年７月２７日提出の米 国特許出願第５５８．６８３号の一部継続出願である。これらの特許文献を参照 文献としてここに引用する。

発明の分野 本発明は、治療や診断用に適した、また学術研究用の試薬として適した耐ヌクレ アーゼ性のオリゴヌクレオチド類似体の設計、合成、および応用に関する。本発 明のオリゴヌクレオチド類似体は、野生型の核酸における糖量結合（ｉｎｔｅｒ −ｓｕｇａｒ　ｌｉｎｋａｇｅ）として通常作用するホスホロジエステル結合（ ｐｈｎｓｐｈｎｒｎｄｉｅｓｔｅｒｂｎｎｄ）の代わりに修飾された結合を有す る。本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性が あり、ＤＮＡとＲＮＡの活性を調節することができる。さらに、これらのオリゴ ヌクレオチド類似体を合成する方法、および本発明のオリゴヌクレオチド類似体 を使用して蛋白質の生成を調節する方法もまた提供される。

発明の背景 よく知られているように、哺乳動物における肉体状態（疾病状態も含めて）の殆 どは蛋白質によって作用を受ける。こうした蛋白質は、直接作用する場合でも、 あるいは酵素機能を介して作用する場合でも、動物や人間に種々の疾病を引き起 こす一因となることが多い。

従来からの治療学は一般に、疾病を引き起こす作用または疾病を重くする作用を 和らげるよう検討を進めていく上で、蛋白質との相互作用を調べることに重点を 置いている。しかしながら最近では、蛋白質の合成を方向づける分子（すなわち 細胞内ＲＮＡ）との相互作用によって、こうした蛋白質の実際の生成を和らげよ うとする検討がなされている。、これらの相互作用には、相補的“アンチセンス “オリゴヌクレオチドまたはそれらの特定の類似体の、ＲＮＡに対するハイブリ ット形成が含まれている。ハイブリット形成は、オリゴヌクレオチドまたはオリ ゴヌクレオチド類似体の、ＲＮＡまたは一重鎖ＤＮＡに対する配列特異的水素結 合である。蛋白質の生成を妨げることによって、できるだけ高い効能とできるだ け少ない副作用を示す治療学的結果が得られるものと期待される。オリゴヌクレ オチド類似体はさらに、類似のメカニズムによって生物による蛋白質の生成を調 節することができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体 の薬理学的活性は、他の治療の場合と同様、特定の細胞内標的においてこれらの 薬剤の有効濃度に影響を及ぼす種々の因子に依存する。オリゴヌクレオチドに関 する１つの重要な因子は、ヌクレアーゼの存在下における安定性である。未修飾 のオリゴヌクレオチドが有用な治療用薬剤になるとは考えられない１、なぜなら 、未修飾のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによって速やかに分解されるから である。、シたがって、オリゴヌクレオチドを耐ヌクレアーゼ性にするようこれ に修飾を施すことが必要となる１、 耐ヌクレアーゼ性を高めるためのオリゴヌクレオチドの修飾は、一般には糖−リ ン酸主鎖のリン原子上で行われる。ホスホロチオエート、メチルホスホネ−１・ 、ホスホルアミデート、およびホスホロトリエステルが、種々のレベルの耐ヌク レアーゼ性を付与することが報告されている１、しかしながら、一般にこのタイ プのリン酸修飾オリゴヌクレオチドはハイブリッド形成特性がよ（ない［Ｃｏｈ ｅ口、　Ｊ、Ｓ。

他の重要な因子は、疾病プロセスに関与している特定の細胞の形質膜をアンチセ ンス化合物が横切る能力である１、細胞膜は、脂質−蛋白質二層体からなり、小 さな非イオン性の親油性化合物は自由に透過できるが、殆どの天然代謝産物や治 療用薬剤にとっては不透過性である［ｆｉｌｓｏｎ、　Ｄ、Ｂ、　Ａｎｎ、　Ｒ ｅｖ、　Ｂｉｎｃｈｅｍ、　４７：９３３−９６５（１９７８））、培養した闘 乳類細胞における天然オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチｉ・の生 物学的効果と抗ウイルス効果が、文献により立証されている。したがって、これ らの薬剤は膜を透過して細胞内の標的に達することができると考えられる。天然 オリゴヌクレオチドおよびある特定の耐ヌクレアーゼ性類似体（例えばアルキル トリエステル類）を使用して、種々の哺乳類細胞（ＨＬ−６０、コ−に−Ｆンハ ム７．９−（１）繊維芽ｍ胞、Ｕ９３７、Ｌ９２９、ＣＶ−１、およびＡＴＨ８ 等の細胞）によるアンチセンス化合物の取り込みが研究されている［　Ｍｉｌｌ ｅｒ、　Ｐ、Ｓ、。

Ｂｒａｉｔｅｒｍａｎ、　Ｌ、Ｔ、およびＴｓ’０．　Ｐ、Ｏ，Ｐ、、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６：１９８８（９９６（１９７７）G メチルホスホネート、　Ｍａｒｃｕｓ−３ｅｋｕｒａ、　Ｃ，Ｈ，、Ｗｏｅｒｎ ｅｒ、　Ａ、Ｍ、、５ｈｉｎｏｚｕｋａ、　Ｋ、、　Ｚ（＋ｎ、Ｇ、、およびＱ ｕｉｎｍａｎ、　ＧＪ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃｉ、ｄ　Ｒｅｓ、　１５：５７４９ −５７６３（１９８７）　；　Ｍｉｌｌ■秩B Ｐ、Ｓ、、　ＭｃＰａｒｌａｎｄ、　Ｋ、Ｂ、、　）ｌａｙｅｒｍａｎ、　Ｋ、 およびＴｓ’Ｏ，Ｐ、Ｏ，Ｐ、、　肛匹ヒ艶銭■１６：１９８８−１９９６（１ ９７７）　：ならびにＬｏｋｅ、　Ｓ、に、、　５ｔｅｉｎ、　Ｃ，、Ｚｈａｎ ｇ、　Ｘ、Ｈ，Ａｖｉｇａｎ、　ＭA。

（ｏｈｅｎ、　Ｊ、およびＮｅｃｋｅｒｓ、　Ｌ、Ｍ、　Ｔ（１、Ｍｉｃｒｒ＋ ｂｉｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１：　２８２：２８９i１９ ８８）コ　。

修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド類似体は、対応する天然 オリゴヌクレオチドに比べて簡単には取り込まれにくい場合が多い。このため、 従来より使用されている多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、実際 の治療目的、学術研究目的、または診断目的に対して充分であるとは言えない。

アンチセンス治療挙用に設計された従来技術のオリゴヌクレオチドが有する他の ２つの大きな欠点は、細胞内ＲＮＡに対するハイブリッド形成がよくないこと、 およびＲＮＡの基本的な機能を停止させるための、明確な化学的または酵素仲介 による事象が欠如していることである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を高め、かつ上記の問題点を解消する ための修飾は、これまで多くの形態をとってきている。これらの修飾としては、 塩基環の修飾、糖部分の修飾、および糖−リン酸主鎖の修飾などがある。従来の 糖−リン酸主鎖修飾（特にリン原子上での）によれば、種々のレベルの耐ヌクレ アーゼ性が達成されている。しかしながら、アンチセンス方法論にとっては、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドが特定のＤＮＡまたはＲＮＡと正確に結合する能 力が基本となるが、修飾リンオリゴヌクレオチ）・は一般にハイブリッド形成特 性が劣っている１゜ リン原子の置換は、プロキラルのリン酸部分の修飾に伴う問題点を避けようとす る代替アプローチである。リン原子の置換が達成されたいくつかの修飾が、以下 に記載の文献に開示されている　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｎｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３１：２３８５−２３３８（１９９０）、本文献に よれば、利用可能な方法論によっては、主鎖全体にわたってホルムアセタール結 合の均一な挿入を与えることができないため、リン原子のメチレン基による置換 が制約を受けており、またその不安定性のために、研究用としては不適切なもの となっているＨ　Ｃｎｒｍｉｅｒら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　１６：４５８３−４５９４（１９８８）、本文献によれば、ジイソプ ロピルシリル部分によるリン部分の１換が、方法論、ホモポリマーの溶解性、お よびハイブリッド形成特性によって制約を受けている；　５ｔｉｒｃｈａｋら、 　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　ＣｈｅｍｉＳｔｒｙ　５２：４２０ ２−４２０６（１９８７）、本文献によれば、カルバメート結合またはモルホリ ノ結合を含む短いホモポリマーによるリン結合の置換が、方法論、生成する分子 の溶解性、およびハイブリッド形成特性によって制約を受けているＨ　Ｍａｚｕ ｒら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｎｎ４０：３９４９−３９５６（１９８４）、本文 献によれば、ホスホニック結合によるリン結合の置換は、ホモトリマー分子の合 成以上には実現されていない：および　Ｇ＋ｘｘｌｃｈｉｌｄ、　Ｊ。

、　Ｂｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｌ：１６５−１８７　（ １９９０）、本文献によれば、エステル結合がエステラーゼによって酊素作用的 に分解され、したがってアンチセンスの適用においてリン酸結合を置き換えるに は不適切である１゜リン主鎖に修飾を施すための有効な方法が限定されているこ とから、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる診断、治療、および学術研究を 進めることができるよう、耐ヌクレアーゼ性と満足できるハイブリッド形成特性 を付与する他の修飾法の開発が長年にわたって強く要望されている。。

発明の目的 本発明の目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチ！・による診断、学術研究用試 薬、および治療に使用するためのオリゴヌクレオチド類似体を提供することにあ る。。

本発明の他の目的は、細胞内取り込みを高めたオリゴヌクレオチド類似体を提供 することにある。。

本発明のさらに他の目的は、未修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドより高い 有効性を有するオリゴヌクレオチド類似体を提供すること（こある。

本発明のさらに他の目的は、このようなオリゴヌクレオチド類似体の合成法およ び使用法を提供することにある。

当業者にとっては、上記の目的および他の目的は、本明細書および特許請求の範 囲から明らかとなろう。

発明の要約 本発明にしたがってＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の活性を調節するの（こ有用な 組成物は一般に、修飾された主鎖結合を少なくとも一部有するオリゴヌクレオチ ド類似体を含む。これらの修飾においては、野生型の核酸にみられる糖−リン酸 主鎖のホスホロジエステル結合が、種々の四原子結合基（ｆｏｕｒ　ａｔｏｍ　 ｌｉｎｋｉｎｇｇｒｏｕｐ）で置き換えられる。このような四原子結合基は、あ る糖または糖類似体の３′−炭素とその隣接した糖または糖類似体の４°−炭素 との間に、所望の四原子空間配置を保持している。本発明の教示にしたがって製 造されるオリゴヌクレオチド類似体は、−重鎮または二重鎖のＤＮＡもしくはＲ ＮＡのあらかじめ選定されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリツド形成する ことが可能な選定された配列を含む、１本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、 例えば、公知の固相合成法により合成され、ＲＮＡまたはＤＮＡのあらかじめ選 定されたヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは少なくともその配 列と特異的に／％／Ｉ’ブリッド形成が可能である。核酸合成器は市販されてお り、それらを使用することは、必要とされる妥当な長さをもった殆どすべてのオ リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を生成させる上で有効である ことが、当業者によって一般的に認識されている。

本明細書において使用している“ヌクレオシド”とは、複素環塩基とその糖で構 成された単位を表している１、゛ヌクレオチド゛とは、その３“または５°位の 糖ヒドロキシル基上にリン酸基を有するヌクレオシドを表している９、シたがっ てヌクレオシドは、ヌクレオチドと異なってリン酸基をもたない１、”オリゴヌ クレオチド”とは、天然に産する塩基と活性ホスホジエステル結合によって糖基 を介して結合したペントフラノシル基から、特定の配列にて形成された複数の連 結ヌクレオチド単位を意味している。これらのヌクレオチド単位は、グアニン、 アデニン、シトシン、チミン、またはウラシル等の核酸塩基であってもよい。糖 基は、デオキシリポースまたはリポースのいずれであってもよい。この用語は、 天然産出化学種と天然に産するサブユニットから形成される合成化学種の両方を 表している。

本発明に関して使用されている”オリゴヌクレオチド類似体”とは、オリゴヌク レオチドと類似的に機能するが、天然には産しない部分を有する化合物を意味し ている。オリゴヌクレオチド類似体は、変化させた糖部分、変化させた塩基部分 、あるいは変化させた糖量結合を有することができる。あるいはまた、本発明の 目的のためには、非ホスホジエステル結合（すなわち、変化させた糖量結合）を 有するオリゴヌクレオチド類似体は″オリゴヌクレオシド”とみなすことができ る。したがってこのようなオリゴヌクレオシドは、天然のホスホジエステル結合 基以外の結合基によって連結された、複数の連結ヌクレオシド単位を意味してい る２、さらに、本発明の目的のためには、“オリゴマー”は、オリゴヌクレオチ ！・、オリゴヌクレオチド類似体、またはオリゴヌクレオシドを包含していると 考える、ことができる８、したがって“オリゴマー”について説明する際には、 天然ホスホジエステル結合を介して、または本発明の四原子結合基も含めた他の 結合を介して一緒に連結されている一連のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似 体に対しても言及がなされているものとする１、一般には、結合はある１つのヌ クレオシドの３°炭素から別のヌクレオシドの５°炭素までであるが、　″オリ ゴマー”は他の結合（例えば２°−５°結合）も含むことができる、オリゴヌク レオチド類似体はさらに、本発明の精神と矛盾しない他の修飾、特に、耐ヌクレ アーゼ性を高め、したがっである特定のオリゴヌクレオチドをアンチセンスの治 療用、診断用、または学術研究試薬用として使用するのを容易にするような修飾 も含むことができる４１例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分が炭 素環式化合物や他の化合物で誼き換えられると、もはや糖ではない。

さらに、他の置換（例えば、糖量ホスホジエステル結合に対する置換）がなされ ると、得られる物質はもはや真の核酸化学種ではない。このような置換から得ら れる化合物もすべて類似体とみなす。本明細書の全体にわたって、核酸化学種の 糖部分に言及しているときは、真の糖または野生型核酸の糖の従来の空間配列を もった化学種のいずれかに言及しているものとする。さらに、糖量結合への言及 では、糖部分または糖類似体部分を野生型核酸の態様において一緒に連結するよ う作用する化合物も含んでいるものとする。

本発明によれば、細胞内への取り込み、耐ヌクレアーゼ性、およびハイブリッド 形成特性を高めるように、かつＲＮＡの基本的な機能を停止させるための明確な 化学的または酵素仲介による事象を与えるように修飾された、新規タイプのアン チセンスオリゴヌクレオチド類似体およびオリゴヌクレオシドが提供される。

ある種類のオリゴヌクレオチド類似体組成物が、治療にとって有用であり、かつ 本発明の他の目的に対して有用であることが見いだされた。このようなオリゴヌ クレオチド類似体は、少なくとも一部が以下のような構造式を有するサブユニッ トから形成される。

上記の構造式において、Ｂ、は可変の塩基部分であり、Ｑは０．ＣＨ２，ＣＨＦ 。

またはＣＦ！であり、ＸはＨ，□　Ｈ，、ＣＩ−Ｃ＋。低級アルキル、置換低級 アルキル。

Ｎ−アルケニル、５ＯＣＨＩ、５Ｏ２ＣＨ：１．０ＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ７．ＮＨ ２，ヘテロシクロアルキル、ヘテロンク口アルカリール、アミノアルキルアミノ 、ポリアルキルアミノ、または置換シリルである。さらに、Ｘは、ＲＮＡ開裂基 、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌ クレオチドの薬力学的特性を改良するための基であってもよい。

ＬｌおよびＢ４は互いに独立的に、ＣＨ２，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ、Ｃ−ＮＨ２゜Ｃ− ＮＨＲ，、Ｃ−ＯＨ，Ｃ−５Ｈ，Ｃ−０−Ｒ，、またはＣ−５−Ｒ工である。

Ｌ、ｔおよびＢ３は互いに独立的に、ＣＲ，Ｒ２，Ｃ＝ＣＲ，Ｒ２，Ｃ＝ＮＲ， 。

Ｐ　（０）　Ｒ４，Ｐ　（Ｓ）　Ｒ４，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ、　Ｏ，Ｓ、　Ｓｏ、　 ＳＯ２，ＮＲ３，もしくはＳｉＲ，、Ｒ，であるか、あるいは−緒になってアル ケン、アルキン、芳香環、炭素環、もしくは複素環の一部を形成する。Ｌ、、Ｂ ２．Ｌ、、およびＢ４は、−緒になって−ＣＨ−Ｎ　−Ｎ　ＨＣＨ２一部分、ま たは−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ一部分を構成してもよい。

Ｒ１およびＲ２は互いに独立的に、Ｈ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，Ｃ１〜ＣＩＧアル キル。

置換アルキル、アルケニル、アルカリール、アラルキル、アルコキシ、チオアル コキシ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、ヘテロシク ロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ ルアミノ、ハ町　ホルミル、ケト、ベンゾキシ、カルボキサミド、チオカルボキ サミド、エステル、千オニステル、カルボキサミジン、カルバミル、ウレイド。

またはグアニジノである。さらにＲ１およびＲ２は互いに独立的に、ＲＮＡ開裂 基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴ ヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基を構成してもよい。

Ｒ１は、Ｈ，ＯＨ，ＮＨ，、低級アルキル、ｔ！１換低級アルキル、アルコキシ 、低級アルケニル９アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アル キルアミノ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアル キルアミノ、ポリアルキルアミノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動 態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良するための基である。Ｒ４は、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，０−アルキル、Ｓ−アル キル。

ＮＨ−アルキル、０−アルキルへテロシフｏ、Ｓ−アルキルへテロシクｏ、Ｎ− アルキルへテロシフ町または窒素含有複素環である。

Ｒ％およびＲ６は、それぞれ独立的に０１〜Ｃ６アルキルまたは０１〜Ｃ６アル コキシである。ただし、Ｂ２がＰ　（０）Ｒ，であり、Ｒ４がＯＨであり、Ｘが ＯＨであり、かつ、Ｂ１がウラシルまたはアデニンであるときは、Ｌ、は０では なく：またり、、Ｂ２．およびＢ４がＣＨ２であり、ＸがＨまたはＯＨであり、 かつ、Ｑが０であるときは、Ｂ３はＳ、　ＳＯ，またはＳＯ□ではない。

好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は糖部分を含んでも よい（ＱがＯである場合のように）。他の態様によれば、Ｌ、およびＢ４のそれ ぞれはＣＲ，Ｒ，またはＣ＝０であり、好ましくはＣＲ，Ｒ２である。Ｉ；２お よびＢ３あるのが好ましく、Ｂ２とり、の一方がＣＲ，Ｒ，であり、Ｂ２とり、 の他方がＰ　（Ｏ）Ｒ，またはＰ　（Ｓ）Ｒ，であるのが特に好ましい。Ｂ２が ０であって、Ｂ３がＰ　（０）Ｒ４またはＰ　（Ｓ）Ｒ４であるような組み合わ せも好ましい。

他の態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、Ｂ２およびＬｌのそ れぞれがＮＲ１であり、ここでＲ１がＨであるのが好ましい。本発明のオリゴヌ クレオチド類似体は、以下に記載の式のうちの１つを有するのがさらに好ましい 、。

ＣＨ，！−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選択することができ、ここでＲは、水素 、アルキル、置換アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミノア ルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラルキル 、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの相補ＲＮＡに対する親和性を改良するた めの基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基である。

オリゴヌクレオチドの残りのサブユニットは天然もしくは合成のサブユニットで あり、当業者には容易に理解されるであろう。

オリゴヌクレオチド類似体は、ＸがＨもしくはＯＨ，あるいはまたＦＳＯ−アル キル、または０−アルケニルであって、そして特にＱが０であるようなものが好 ましい。基Ｂ。は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−ア ミノアデノシン、または５−メチルシトシンであるのが好ましいが、天然に存在 しない他の化学種も使用することができる。

他の好ましい実施態様は、ＬｌおよびＢ４がそれぞれＣＨ２であって、特にＢ２ およびり、ｌがそれぞれＮＨであるようなオリゴヌクレオチド類似体である。あ るいはまた、Ｌ、とり、の一方（好ましくはり、υが０であって、ＬｔとＬｌの 他方がＮＨであるようなオリゴヌクレオチド類似体も好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、与えられた構造を有するサブユニットを 約４〜５０個含むのが好ましく、約５〜２０個含むのがさらに好ましい。オリゴ ヌクレオチド響似体の実質的にそれぞれのサブユニットが前記構造を有すること ができるが、実質的に交互のサブユニットが前記構造を有することも望ましい。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、患者への治療投与ができるよう、医薬用 として許容しつるキャリヤー中に製剤するのが好ましい１１本発明のオリゴヌク レオチド類似体は、対応する野生型のオリゴヌクレオチドに比べて、改良された 耐ヌクレアーゼ性を示すと考えられる。本発明はさらに、生物中における蛋白質 の生成と活性を調節する方法に関する３、この方法は、該蛋白質をコードする核 酸配列の少なくとも一部と特異的にハイブリット形成することが可能なオリゴヌ クレオチド類似体と該生物とを接触させることを含み、ここで前記類似体のサブ ユニットの少なくともいくつかが前記の構造を有する１゜本発明はさらに、蛋白 質の望ましくない生成を特徴とする疾患を有する生物を処１する方法に関する。

この方法は、該蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリッド形 成することが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを、単独もしくは医薬 用として許容しつるキャリヤー中に製剤した形で接触させることを含み、ここで 前記類似体のサブユニットの少なくともい（っがが前記の構造を有する。

他の態様においては、本発明は、上記のオリゴヌクレオチド類似体を製造するの に有用な化合物を提供する。ある特定の実施態様においては、これらの化合物は 構造 を有し、ここてＲＩＩＪおよびＲイ、は互いに独立的にＨｌまたはヒドロキシル 保護基である１、ある特定の実施態様においては、これらの化合物は、構造（１ ）を有する第１のシンソンと構造（ＩＩ）を有する第２のシンソン（１）　（エ エ） 〔式中、 （ａ）　ＲＴはＮＨ，であり、かつ、Ｒ１１はＲＡ　ＣＨ２ＣＨ７てあり１（ｂ ）　ＲＴはＣＨ２−ＮＨ！であり、かつ、Ｒ８はＲＡ−ＣＨｌ、であり；（ｃ） 　ＲｒはＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２であり、かつ、Ｒ８はＲＡであり。

（ｄ）　ＲＴはＲＡであり、かつ、Ｒ３はＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２てあり、または（ ｅ）　ＲｔはＣＨ２−ＲＡであり、かっＲ，はＮＨ，−ＣＨ，である。

ここで、ＲＡは、Ｃ（０）　ＯＨ，Ｃ（Ｓ）　ＯＨ，またはこれらの活性化され た誘導体である〕 を用意すること、および 前記第１と第２のシンソンをカップリングして、ＲＴ基とＲ１１基を介したアミ ド結合またはチオアミド結合を形成させること。

によって製造される。。

本発明はさらに、本発明の治療法の実施に有用なオリゴヌクレオチド類似体も含 めた、オリゴヌクレオチド類似体の合成法を提供する。これらの方法のうちのあ る特定の方法は、次の構造 を含む第１の部分と、次の構造 を含む第２の部分（ここでＢ、は可変の塩基部分であり、Ｑは０．ＣＨ２，ＣＨ Ｆ。

またはＣＦ、であり、そしてＥ、およびＥ、は同一または異なり請求電子反応基 である）を用意すること、および前記第１と第２の部分を、前記求電子反応基を 介して結合基とカンプリングして、前記オリゴヌクレオチド類似体を形成させる こと、を含む１．好ましい方法によれば、第１の部分の電子反応基は、ハロメチ ル、トリフルオロメチル、スルホニルメチル、ｐ−メチル−ヘンセンスルホニル メチル、または３′−Ｃ−ホルミルを含み、そして第２の部分の電子反応基は、 ハロゲン、スルホニルメチル、ｐ−メチル−ベンセンスルホニルメチル、または アルデヒドを含む。結合基は、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンであるのが 好ましい。

前記オリゴヌクレオチド類似体の少なくとも一部を、別のオリゴヌクレオチド化 学種に組み込んで、野生型のホスホジエステル結合とそのようにカップリングさ れた区域が実質的に交互に存在する状態の前記別のオリゴヌクレオチド類似体を 得る、という形で治療用組成物を調製するのが有用である。組み込み（ｉｎｃｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、所望の配列を有するジヌクレオチドのホスホジエステ ル結合によって達成するのが好ましく、このとき前記ジヌクレオチドはあらがし めそのようにカンプリングされている９゜ を有するヌクレオシド前駆体も本発明によって意図されており、ここでＢ、は可 変の塩基部分であり、Ｑは０．ＣＨ，、ＣＨＦ、またはＣＦ、であり、そしてＸ はＨ，ＯＨ，Ｃ，〜ＣＩＯ低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、ア ラルキル、Ｆ、ＣＩ　、Ｂ　ｒ、　ＣＮ、ＣＦｌ、　ＯＣＦｌ、　ＯＣＮ、　０ 　フルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、０−アルケニル、Ｓ−アルケニル１ 　Ｎ−アルケニル。

５ＯＣＨ，、ＳＯ，ＣＨ，、ＯＮＯ，、ＮＯ，、Ｎ、、ＮＨ，、ヘテロシクロア ルキル。

ヘテロノクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、ｆａ 換／リル、ＲＮＡ聞裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動態学的特性を改良するた めノ基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改良するための基である。

。 このような化学種においては、Ｙはヒドロキシ、アミノメチル、ヒドラジノメチ ル、ヒドロキシメチル、Ｃ−ホルミル、フタルイミドヒドロキノメチル、アリー ル置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、オルト−メチルアミノヘンセ ンチオ、メチルホスホネート、またはメチルアルキルホスホネートである。Ｚは Ｈ１ヒドロキシル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシメチル、Ｃ− ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置換イミダゾリジノ、アミ ノヒドロキシメチル、オルト−メチルアミノヘンセンチオ、メチルホスホネート 、またはメチルアルキルホスホネ−１・である。上記のものはいずれも、ＱがＯ であり、Ｙがヒドロキシメチルであり、かつＸがＨまたはＯＨであるときは、Ｚ はＣ−ホルミルではないという条件の下にあり：またＱがＯであり、ＸがＨまた はＯＨであり、かつ２がヒドロキシルであるときは、Ｙはアミノヒドロキシメチ ル、ヒドラジノメチル、またはアリール置換イミダゾリジノではないという条件 の下にある。ＸがＨまたはＯＨであって、Ｑが０であるのが好ましい。

修飾された糖結合を有するオリゴヌクレオチド類似体は、本発明の目的を達成す るのに有効であることが見いだされている９、オリゴヌクレオチド類似体は、約 ４〜５０個の長さの核酸塩基サブユニットを有するのが好ましく、約５〜２０個 のサブユニットかさらに好ましい３１本発明によるオリゴヌクレオチド類似体は 、−重鎖もしくは二重鎖のＤＮＡおよびＲ，Ｎ　Ａの、あらかじめ選定されたヌ クレオチド配列とハイブリット形成が可能である１１本発明を構成している核酸 塩基は、ピリミジン類（例えば、チミン、ウラシル、またはシトシン）でも、プ リン類（例えば、グアニンやアデニン）でも、あるいはこれらの修飾物（例えば ５−メチルシトシン）でもよく、いずれも選定された配列中に配置されている１ 、糖部分は、リボースタイプでも、デオキシリポースタイプでも、あるいは糖模 倣体（ｓｕｇａｒｍｉｍｉｃ）　（例えば炭素環）でもよい。本発明の１つの好 ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチド類似体又はオリゴヌクレオシドは 、ｔａＬ蛋白質をコードするＨＩＶ　ｍＲＮＡ、またはＨＩＶ　ｎ＋ＲＮＡのＴ ＡＲ領域に対してハイブリダイズする１、オリゴヌクレオチド類似体またはオリ ゴヌクレオシドは、ＨＩＶ　ｍＲＮＡのＴＡＲ領域の二次構造を模倣してＪ、Ｊ ｔ蛋白質に結合することができる１、他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオ チド類似体またはオリゴヌクレオシド配列は、ヘルペスウィルス、乳頭種ウィル スおよび他のウィルスに対する相補的配列を含む。

本発明の修飾された結合は、天然に存在するホスホジエステル−５°−メチレン 結合を置き換えるために四原子結合基を使用することが好ましい。天然に存在す る結合を本発明の四原子結合体（ｆｏｕｒ　ａｔｏ＋ｎ　ｔｉｎｋｅｒ）で置き 換えると、こうして得られたオリゴヌクレオチド類似体には、耐ヌクレアーゼ性 および細胞内取り込みの増大が与えられる。結合した糖の１つの３′−デオキシ 機能を四原子結合体内に含ませるのが好ましい。この四原子結合体は−Ｌ、−Ｌ ２−Ｌ、−Ｌ４−という構造を有し、ここでＬｌおよびＬ４はメチレン炭素原子 または置換炭素原子であり、Ｌ２およびＬ３はメチレン炭素原子、置換炭素原子 、酸素原子、窒素原子、置換ｌ換原子、置換リン原子、イオウ原子、置換イオウ 原子、またはｌ換ケイ素原子である。修飾結合は、実質的にそれぞれの結合場所 において施されるのが好ましい。あるいはまた、修飾結合は、すべての結合場所 より少ない形で（例えば、交互の結合場所にて、あるいは実質的にランダムに） 施してもよい。結合は、中性であっても、あるいは正もしくは負に帯電していて もよい１、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオシドを合成する方法に関 する。本発明は、二原子フラグメントまたは置換二原子フラグメントの付加によ る、３°−チオキシ−３°−置換（特にメチル置換）ヌクレオシドと５°−デオ キシ−５°　ｆａ換ヌクレオシドとのカップリングを提供する。この付加反応は 、種々の適切な電子性化合物に対して個々のヌクレオシドの３°位置および５° 位厘を活性化させること、次いで適切な結合基を加えて電子剤と反応させること を含む逐次手順により行われる。あるいはまた、この手順は並行操作的に行うこ ともてきる。このような方法では、支持体を手操作することまたは他の方法によ り、ＤＮＡ合成器を介して固体支持体を使用することができる１゜本発明はさら に、生物による蛋白質の生成を調節する方法に関する。この方法は、これまてに 説明してきた開示内容にしたがって配合した組成物と該生物とを接触させること を含む１．調節されるべきＲＮＡ部分またはＤＮＡ部分は、その形成または活性 が調節されるべき蛋白質をコートするＤＮＡもしくはＲＮＡの部分を含むようあ らかじめ選定するのが好ましい。したがって、使用される組成物の標的部分は、 ＤＮＡもしくはＲＮＡのあらかじめ選定された部分に対して相補的であるよう（ すなわち、当該部分に対してアンチセンスのオリゴヌクレオチドであるよう）選 定される。

本発明はさらに、蛋白質の望ましくない生成を特徴とする疾患を有する生物を治 療する方法に間する。この方法は、これまでに説明してきた開示内容にしたがう 組成物と該生物とを接触させることを含む。本組成物は、その生成または活性が 調節されるべき蛋白質をコードするメツセンジャーＲＮＡと特異的に結合するよ う設計されたものであるのが好ましい。本発明はさらに、生物または細胞中にお ける異常なＲＮＡ分子の有無、あるいは正常なＲＮＡ分子の異常なもしくは不適 切な発現を検出するための診断法に関する。

本発明はさらに、学術研究用および診断用としてＲＮＡを選択的に結合するため の方法に関する。こうした選択的かつ強力な結合は、分解を引き起こすヌクレア ーゼに対して抵抗性があり、そして公知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド類似体より強力かつ正確にハイブリッド形成する本発明の組成物と、こ のようなＲＮＡまたはＤＮＡとを相互作用させることによって達成される。

図面の簡単な説明 図１は本発明のある特定の実施態様にしたがった概略の合成スキームであり。

図２は本発明の他の実施態様にしたがった概略の合成スキームである。

好ましい実施態様の詳細な説明 従来使用されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的活性は、一般に は、実際上の治療研究や診断での使用に対して充分であるとは言えない。本発明 は、修飾されたオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド類似体やオ リゴヌクレオシド）および有用な修飾を達成するための方法に関する。これらの 修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、天然に存在する対 応物質に比べて高い安定性を示す。細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアー ゼは一般に、本発明の主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体やオリゴヌクレオシド を認識せず、したがってこれらには結合しない。感受性のリン−酸素結合の欠如 のため、ヌクレアーゼによる主鎖へのいかなる結合も、ヌクレオシド結合の開裂 を起こすことはない。さらに、こうして得られる本発明の新規な中性または正に 帯電した主鎖は、蛋白質仲介による複雑なプロセスを必要とするよりむしろ、単 純な受動輸送によって細胞中に取り込まれることができる。本発明の他の利点は 、負に帯電した主鎖がないことにより、標的ＲＮＡ　（負に帯電した主鎖を有し 、したがって入ってくる同帯電のオリゴヌクレオチドに反発する）に対するオリ ゴヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレオシドの配列特異的な結合が容易にな る、という点である１、本発明のさらに他の利点は、梗的ＲＮＡの触媒作用開裂 を開始させることのできる官能基を結び付けるための部位がこれらの構造タイプ 中に見いだされる、という点である、。

好ましい実施態様によれば、本発明は、糖量リン酸基を置き換えて、下記構造に みられるような結合を有するオリゴヌクレオチドを生成させることに関する。

上記構造において、 Ｂ、は可変の塩基部分てあり。

Ｑは０．ＣＨ２，ＣＨＦ、またはＣＦ、であり。

Ｘは）１．　ＯＨ，Ｃ＋〜ＣＩｌｌ低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリ ール、アラルキル、Ｆ、　ＣＩ、Ｂ　ｒ、ＣＮ、ＣＦ３，０ＣＦｊ、　ＯＣＮ、 　０−アルキル。

Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニ ル、５ＯＣＨ１，５ＯｚＣＨ１，０ＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３＋　ｒｌＪ）（、、ヘ テロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリ アルキルアミノ。

ｌ換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する ための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり ＬｌおよびＬ４は、互いに独立的にＣＨ２，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ、Ｃ−ＮＲ２゜Ｃ− ＮＨＲ３，Ｃ−ＯＨ，Ｃ−５Ｈ，Ｃ−０−Ｒ１，またはＣ−５−Ｒ，であり。

Ｌ２およびＬ３は、互いに独立的にＣＲ＋　Ｒ２、Ｃ＝　ＣＲ＋　Ｒ２、Ｃ＝　 Ｎ　Ｒ３゜Ｐ　（０）　Ｒ４，Ｐ　（Ｓ）　Ｒ４，Ｃ＝Ｏ，Ｃ＝Ｓ、　Ｏ，Ｓ、 　Ｓｏ、　Ｓｏ□；ＮＲユ、またはＳｉＲ，、Ｒ，であるか、あるいは−緒にな ってアルケン、アルキン、芳香環。

炭素環、または複素環を形成し。

Ｌ、、Ｌ２．Ｌ７．およびＬ４は、−緒になって−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＨ２一部 分。

または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ一部分を構成し。

Ｌ、−Ｌ、−Ｌ、、−Ｌ４は、ＮＲＣ（０）−ＣＨ２ＣＨ２゜ＮＲ−Ｃ（Ｓ）− ＣＨ２−ＣＨ２，ＣＨ，−ＮＲ−Ｃ（０）−ＣＨ，。

ＣＨ，−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２，ＣＨ，−ＣＨ，−ＮＲ−Ｃ（０）。

ＣＨ，−ＣＨ，−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）、Ｃ（０）　−ＮＲ−ＣＨ，−ＣＨ，。

Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ，−ＣＨ２，ＣＨ，−Ｃ（０）−ＮＲ−ＣＨ，、およびＣ Ｈ，−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選ばれ、ここでＲは、水素、アルキル、置換 アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミノアルキル、ヒドロキ シアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラルキル、ＲＮＡ開裂基。

オリゴヌクレオチドの相補ＲＮＡに対する親和性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的を改良するための基であり：Ｒ１およびＲ２は、互 いに独立的にＨ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ４，Ｃ＋−Ｃ＋ｏアルキル。

置換アルキル、アルケニル、アルカリール、アラルキル、アルコキシ、チオアル コキシ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、ヘテロシク ロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ ルアミノ、ハＤ、ホルミル、ケト、ヘンゾキシ、カルホキサミト、チオカルボキ サミド、エステル、チオエステル、カルボキサミジン、カルバミル、ウレイド。

グアニジノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する ための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり Ｒ１は、　Ｈ，ＯＨ，ＮＨ２，低級アルキル、置換低級アルキル、アルコキシ、 低級アルケニル、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、ｆａ置換ア ルキルアミノヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアル キルアζノ、ポリアルキルアミノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動 態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良するための基であり、 Ｒ，ｉ；ｉ、　ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２，０−７ＶＬ４ル、Ｓ−フルキル、ＮＨ−７ ＶＬ４ル。

０−アルキル複素環、Ｓ−アルキル複素環、Ｎ−アルキル複素環、または窒素含 有複素環であり、そして Ｒ１およびＲ１，は、互いに独立的に０１〜Ｃ６アルキルまたは０１〜ｃ１．、 アルコキシであるが、ただし、Ｒ２がＰ　（０）Ｒ，であり、Ｒ４がＯＨであり 、ＸがｏＨであり、かつ、Ｂ、がウラシルまたはアデニンであるときは、Ｌ、は ０ではな（；またり、、Ｒ７，およびＲ４がＣＨ，てあり、ＸがＨまたはＯＨで あり、がっ、Ｑが０であるときは、ＬｌはＳ、ＳＯ，またはＳｏ、、ではなイ、 。

本発明の好ましい実施態様によれば、ＬｌおよびＲ４はメチレン基である３、こ のような好ましい実施態様においては、Ｒ２とＬ・、の一方がアミノ基を含んで もよく、まｔ二他方がアミノ基または酸素を含んでもよい３．シたがって特定の 好ましい実施態様においては、Ｒ２とり、は−緒になってヒドラジノ、アミノヒ ドロキシ、またはヒドロキシアミノである。他の好ましい実施態様では、Ｌｌま たはＲ４の一方が、Ｌ、またはＬｌの一方と一緒になってＣＨ＝Ｎ基となり、そ してＲ２またはり、の他方が酸素原子または窒素原子であり、したがってリンカ −はオキシム基とヒドラゾン基を含む１．このようなオキシム結合基またはヒド ラゾン結合基は、上述のアミノヒドロキシ基またはヒドラジン基に還元すること ができる。。

他の好ましい実施態様においては、ＬＩ　Ｒ２Ｒ３Ｒ４系列は、Ｎ−置換もしく はＮ−非置換のアミド官能基またはチオアミド官能基を含む。

本発明のさらに他の好ましい実施態様においては、Ｒ２およびり、は置換炭素、 アミノ、置換アミン、酸素、イオウ、イオウ酸化物、リン酸化物、またはケイ素 酸化物である。炭素上の置換基としては、水素、ヒドロキシ、チオ、アミノ、低 級アルキル、置換低級アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、低級アルケニル 、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、ヘテ ロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ポリ アルキルアミノ、ハロゲン、ホルミル、ケト、ベンゾキシ、カルボキサミド、チ オカルボキサミド、エステル、チオエステル、カルボキサミジン、カルバミル、 ウレイド、グアニジノ、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性 を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するため の基などがある。さらに他の好ましい実施態様では、Ｒ２とＲ３が一緒になって Ｃ＝Ｃを形成している。さらに他の好ましい実施態様では、Ｒ２とＲ３が一緒に なって、炭素環、芳香環、複素芳香環または複素環を含む環構造の、ｃ−ｃ、　 Ｃ＝Ｃ。

Ｃ−Ｎ、またはＮ−Ｃ二原子対を形成している。本発明のさらに他の好ましい実 施態様では、ＬｌおよびＲ４は、互いに独立にカルボキシ、チオカルボキシ、メ チルアミノ、メチルヒドロキシ、メチルチオ、エーテル、またはチオエーテルで ある。

本発明はまた、修飾された糖量結合をもつオリゴヌクレオシドの製造方法をも目 的としている。これらの修飾は、固体支持体を用いて、手で操作することができ るかまたは、ＤＮＡ合成装置技術に習熟した人々には一般的に公知の方法論を用 いてＤＮＡ合成装置を用いて実施することができる。一般に、この手順には、選 択された配列中でお互いに隣接するであろう２つのヌクレオシドの糖部分を官能 化することが含まれる。５′から３′へという意味において、“上流”ヌクレオ シドは、一般に３゛糖部位で修飾され、本明細書中でこの後“シンソン（ｓｙｎ ｔｈｏｎ）１“と呼ばれる。本発明の一方法では、アデニン、グアニン、シトシ ン、ウラシル、チミンのリボ−および２°　−デオキシ−リボヌクレオシドおよ びこれらの類似体を修飾してその３゛　−デオキシ−３−ヒドロキシメチル類似 体とする。次にこれらの３′　−ヒドロキシメチル基を種々の型の電子中心に変 換する。これは下記の好ましい反応工程のような種々の方法で達成することがで きる。

出発物質の一つである３°　−デオキシ−３′　−ヒドロキシメチルリボヌクレ オシドは、タウンセンド（Ｔｏｗｎ　ｓ　ｅ　ｎ　ｄ）外３テトラヘドロン・レ ターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、３１：３１０１−３１０ ４（１９９０）。

サマノ・ブイ（Ｓａｍａｎｏ、Ｖ、）およびエム・シェイ・モリス（Ｍ、Ｊ、　 Ｍｏｒｒｉｓ）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリイ　Ｄｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５５：５１８６−５１８ ８（１９９０）およびバーゲストロム、ディー・イー（Ｂｅ　ｒｇｓ　ｔ　ｒａ ｍ、Ｄ。

Ｅ、）、ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオシドズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）８　（８）：１５２９−１５３５　（１９８９ ）によって開示されたようにして製造することができる。これらのヌクレオシド の適当な公知の選択的糖ヒドロキシル保護とそれに続く標準的な２′−脱酸素化 手順により、２°、３゛　−ジデオキシ−３°　−ヒドロキシメチル−リボヌク レオシドか得られるであろう。この型のヌクレオシドは選択的に保護して、３′ 　−ヒドロキシメチル成分を官能化して種々の適当な電子部分にすることができ る。本発明の好ましい具体化に従えば、このような電子部分にはハロメチル、ト リフルオロメチル、スルホニルメチル、ｐ−メチルベンゼンスルホニルメチル、 ヒドラジノメチルまたは３′−〇−ホルミルがある。

“下流”ヌクレオシドは一般に５゛糖部位で修飾され、本明細書中でこの後“ン ンソン（ｓｙｎｔｈｏｎ）２”と呼ばれる。種々の型の電子中心に変換されたそ れらの５°−ヒドロキシメチレン基をもつ、アデニン、グアニン、シトシン、ウ ラシル、チミンのリボおよび２゛　−デオキシリボヌクレオシドおよびこれらの 類似体を生成するための修飾は、商業的に入手できるヌクレオシドを用いて種々 の手順によって達成することができる。例えば、５゛　−デオキシ−５゛　−ハ ロヌクレオシド、５゛　−デオキシ−５′　−トシルヌクレオシド、および５゛ 　−アルデヒド性ヌクレオシドは、ジョーンズ、シー・エイチ（Ｊｏｎｅｓ、Ｇ 、Ｈ，）およびジエイ・ジー・モファット０．Ｇ、Ｈｏｆ　ｆａｔ　ｔ）により ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサエティ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）９０：５３３７ −５３３８（１９６８）において製造された。

一般に、シンソン１は、構造 より成るものとして表わすことかでき、一方シンソン２は一般に構造（式中Ｂｘ 可変の塩基成分であり、ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦまたはＣＦ２であり。

そしてＥｌおよびＲ２は同一または異なり請求電子反応基である）より成る。

２つのシンソンは請求電子反応基と反応性の結合基によるがまたは別の方法で結 合される。シンソン１とシンソン２との間の結合は段階的に、あるいは一致して 起こることかでき、本発明の修飾された結合により結合したジヌクレオシドを生 ずることができるかまたはヌクレオシドの鎖を生ずることができ、これらは各々 上記の修飾された結合によって次のものに結合させることができる。

一致した作用による結合は、アンモニアまたはアンモニア誘導体の存在における ようなシンソン１およびシンソン２の電子中心の間で起こって、ジヌクレオシド を生成することができる。本発明の好ましい具体化は、ヒドラジンの付加により 公知のブロモメチル型シンソンを結合させて、−ＣＨ２Ｎ　ＨＮ　ＨＣＨ２−に 等しい−Ｌ、＋　Ｌ２　Ｌ！　Ｌ４−を有する好ましい結合を生成させるもので ある。本発明のもう一つの好ましい具体化はヒドロキシルアミンの付加によりブ ロモメチル型シンソンを結合させて、−ＣＨ２ＮＨＯＣＨ２−または−ＣＨ２０ Ｎ　ＨＣＨｚ−に等しい−ＬＩ　Ｌ２　Ｌｓ　Ｌ４−を有する結合を生成させる ものである。

糖量結合を修飾して本明細書中に記載されているジヌクレオシド構造を与えるこ とができるもう一つの方法は、ウィツテイヒ反応によるものである。好ましくは 、このような反応の出発物質は、タウンセンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）外［テトラ ヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒｄｈｅａｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）３１：３１０ １−３１０４　（１９９０）］　；サマノ・ヴイ　（Ｓａｍａｎｏ、Ｖ、）およ びエム・シエイ・モリス（Ｍ、Ｊ、　Ｍｏ　ｒ　ｒ　ｉ　ｓ）　［ジャーナル・ オブ・オーガニック０ケミストリイ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ 　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）５５：５１８６−５１８８　（１９９０）；およびバー ゲストロム・ディー・イー（Ｂｅ　ｒ　ｇｓ　ｔ　ｒ　ｏｍ、　Ｄ、Ｅ、　）外 ［ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオクイズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ 　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）８（８）：１５２９−１５３５　（１９８９）］に より開示されたような３′−ケトヌクレオシド：または、ジョーンズ・シー・エ イチＢｏｎｅｓ、Ｇ、Ｈ）およびジエイ・ジー・モファット（Ｊ、Ｇ、Ｍｏｆｆ ａｔｔ）［ジャーナル・オブ・ジ・ア、％リカン・ケミカル・ソサエティ　（Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃ ｉｅｔｙ）９０：５３３７−５３３８（１９６８）］によって開示されたような ５°　−アルデヒド性ヌクレオシドである。出発物質は好ましくは、ペンシルま たはその他の保護基を有するリンイリドと反応させる。本発明に有用な一つの好 ましいイリドはトリフェニルホスホラン−ベンジルオキシメチリジンである。本 発明用に好ましく使用されるもう一つのイリドは、トリフェニルホスホランーペ ンジルオキシエチリシンである。ビニル基の還元およびペンシル保護基の水添分 解は、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシルの所望のヌクレオシド またはこれらのヌクレオシドの類似体の５゛　または３°位に各々ヒドロキシメ チルおよびヒドロキシエチル部分を与える。

さらにウィツテイヒ反応を使用して炭素環ヌクレオシドの５゛および３゛　ヒド ロキシアルキル部分を得ることができる。

求電子中心を与えるためのヒドロキシル基の変換およびそれに続＜３゛求電子中 心の請求核中心との結合により、本発明のジヌクレオシドが得られるであろう。

本発明の一具体化においては、ヒドロキシル基を変換してブロマイド、トリフレ ート、およびトシレートのような電子中心を与える。結合により、１または２個 のへテロ原子を有する炭素鎖によって連結させられたジヌクレオシドが得られる 。好ましくはこのようなヘテロ原子は、先に示した一般式に示されるようにＯ， ＮＨ，ＮＲｓ、Ｓ、Ｓｏ、Ｓｏ□、Ｐ　（０）Ｒ＜、Ｐ　（Ｓ）Ｒ４または５ｉ ＲｓＬである。

３゛　または５°カルボニルヌクレオシドおよびトリフェニルホスホリンメチリ ジンジフェニルホスホネートを包含するウィツテイヒ反応から誘導することがで きると思われるその他の有用なジヌクレオシドは、ホスホネートジヌクレオシド である。この反応は、相当する５゛−または３°　ヒドロキシ基と縮合して３゛ −または５“　−ホスホネート結合したオリゴヌクレオシドを与えることができ るホスホン酸メチルまたはエチルを与える。この型の化学はモファット、シエイ ・シー　（Ｍｏｆｆａｔｔ　Ｊ、Ｇ、）外、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ ミカル・ソサエティ　Ｄｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌＳｏｃ　１ｅｔｙ）９２　：　５５１０−５５１３　（１９７０）およびマ ズール、エイ（Ｍａｚｕｒ、Ａ、）、ビー・イー・ドロップ（Ｂ、Ｅ、Ｔｒｏｐ ｐ）、およびアール−ｚメチル（Ｒ，Ｅｎｒｅ　１）　、テトラヘドロン（Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒ。

ｎ）４０：３９４９−３９５６　（１９８４）の生化学的方法の研究のためのジ ヌクレオシドのホスホネートの製法中に開示された。このタイプの結合を使用し て、対称なビス（メチルトリフェニルホスファン）フェニルホスフェートを用い て３°　−ケトヌクレオシドを５゛−ヌクレオシドに結合させて、３°、５°　 −ジメチルホスホネート結合したオリゴヌクレオチドとすることによって、好ま しい具体化が製造される。

ウィツテイヒ反応に加えて、３′　−ヒドロキシメチルヌクレオシドはまた、ア ルファ炭素環ヌクレオシドの転化によって製造することもできる。これにより“ 下”またはアルファ面上に所望の３′　ヒドロキシメチル基が得られるであろう 。

この基は、保護することができる。３”−ヒドロキシル基（糖の３°位に結合し た環外メチルを３”メチルと認定する）は、ヒドロキシメチル基またはより長い アルキル基に変換することができる。３”基を変換する一方法には、ケト基への 酸化とそれに続くトリフェニルホスホリンメチリジンジフェニルホスホネートを 用いるウィツテイヒ反応および還元か包含される。より長いヒドロキシアルキル 基は、こうして３”−位に配置することかできる。この具体化はまた、４′　− デスメチル−３゛−ヒドロキシメチルヌクレオシトシンランをも与える。２原子 績合剤を用いてこの４゛　−デスメチルヌクレオシドおよび普通の３゛　−ヒド ロキシ−ヌクレオシドを結合させると、先に出願中の１９９０年８月１３日出願 の出願Ｎｏ、５６６．８３６　（この出願は、本出願の論受入に譲渡されている ）中に開示されたようなシヌクレオシドシンソンが得られるであろう。４′　− デスメチルヒドロキシル基を適当な上記の３°　−シンランと結合させると、数 多くの他の型の新規ジヌクレオシドシンランが得られるであろう。

さらにもう一つの３′　−デオキシ−３′　−メチルヌクレオシドのメチル基を 官能化するための方法は、３゛−デオキシ−３°　−シアノヌクレオシドから作 り出すことができる。バークス・ケイ・イー・ビー（Ｐａｒｋｅｓ、に、Ｅ、Ｂ 、）、およびケイ・ティラー（Ｋ、Ｔａｙｌｏｒ）、テトラヘドロン・レターズ （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２９：２９９５−２９９６　（１ ９８８）には、３°−シアノヌクレオシド類の一般的な合成法が記載されている 。この方法では、５゛−トリチル保護された２°　−デオキシヌクレオシドをヨ ウ化メチルトリフェニルホスホニウムで３°　−ヨウ素化する。次にこの物質を ヘキサメチルニスズ、ｔ−ブチル−イソニトリル、および２．２′　−アゾ−ビ スイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）で処理して、３゛　−位にシアノ基のラジカ ル付加を起こさせる。シアン基のアルデヒドへの変換は、高収率で達成される。

続いて、この中間体をヒドロキシメチル官能基に変換するが、これは電子シンラ ン１への有用な前駆体である。

糖量結合を修飾してジヌクレオシドを与えることができる別の方法は、シンラン １としての３°　−Ｃ−ホルミル誘導されたヌクレオシドおよびシンラン２とし ての５゛−アミノヒドロキシ誘導されたヌクレオシドを使用する。シンラン１お よび２を直接結合させると、オキシム結合によって結合したジヌクレオシドが得 られる。この場合には、オキシムはＥ／Ｚ異性体として存在する。これらの異性 体化合物は、ＨＰＬＣを用いて分離される。さらにこの場合に、オキシム窒素原 子は、上流ヌクレオシドの３゛　−末端の炭素原子に隣接している。５°または 下流ヌクレオシドの炭素原子に隣接するオキシム窒素を有するジヌクレオシドは 、シンラン２としての５゛−Ｃ−ホルミル誘導ヌクレオシドおよびシンラン１と しての３′　−デオキシ−３゛　−アミノヒドロキシメチル誘導ヌクレオシドを 使用して合成される。この場合には、オキシムＥ／Ｚ異性体も得られる。両方の 場合に、オキシム結合したこ量体は、オリゴマーへの直接組み入れに有用である かまたは還元して相当するヒドロキシアミノ結合ジヌクレオシドとすることがで きる。オリゴマー中のジヌクレオシドとしてのまたはジヌクレオシド部分として のオキシム結合ジヌクレオシドの、水素化シアノホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕ ｍ　ａｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）を用いる還元により、相当するアミノ ヒドロキシル結合化合物が得られる。ヒドロキシアミノ結合ジヌクレオシドまた は大オリゴマーは、アミノヒドロキシル結合のアミノ部分でアルキル化して、相 当するＮ−アルキルアミノ結合を得ることができるであろう。

３′−Ｃ−ホルミル誘導されたシンラン１は、いくつかの合成法によって形成す ることができる。現行の好ましい方法では、相当する３′−デオキシ−３′−ヨ ードヌクレオシドのラジカルカルボニル化を使用する。このヨード化合物をＣ○ 、ＡｒＢＮ、すなわち２．２′　−アゾビスイソブトリロニトリル、およびＴＴ ＭＳ、すなわちトリス（トリメチルシリル）シランで処理する。別法として、こ のものは３°　−デオキシ−３゛　−シアノ糖またはヌクレオシドから合成する ことができる。５°　−Ｃ−ホルミル（または５゛　−アルデヒドとしても認定 される）および３゛−Ｃ−ホルミル基の両方を、ブロック基として０−メチルア ミンベンゼンチオールを使用して容易にブロックすることができる。この５′お よび３′　−〇−ホルミル基の両者は、硝酸銀酸化により脱ブロックすることが できる。

３°　−Ｃ−ホルミルヌクレオシド合成の別法においては、その製造のために１ −〇−メチルー３゛−デオキシー３°　−０−メチルアミノベンセンチオール− ５’−Ｏｎリチルーβ−Ｄ−エリトロ−ベントフラノシドを使用することができ る。このとき、この化合物はすべての３゛　−デオキシ−３’　−Ｃ−ホルミル ヌクレオシドのための前駆体としてはたらく。この１−０−メチル−３′　−デ オキシ−３゛−Ｏ−メチルアミノベンセンチオール−５’　−０４リチルーβ− り一エリトローベントフラノシドを標準的なグリコジル化条件を用いて適当な塩 基と反応させ、続いて脱ブロックしてヌクレオシドを得る。さらにもう一つの別 法においても、３°　−デオキシ−３′　−シアノヌクレオシドは相当する３′ 　−デオキシ−３゛　−ヨードヌクレオシドからか、または１−０−メチル−３ °　−デオキシ−３’−０−−シアノ−５’−０−トリチル−β−り一エリトロ ーペントフラノシドとのグリコジル化反応によって製造される。

３“−〇−アミノー３”−ヒドロキシメチルヌクレオシドおよび相当する５゛− ０−−アミノヌクレオシドは、好都合には、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、トリ フェニルホスフィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレートを用いるミツ ノブ（Ｍｉ　ｔ　５ｕｎｏｂｕ）条件により、保護されたフタルイミド中間体を 経て製造することができる。この中間体は、ヌクレオシドの未保護ヒドロキシル 基のミツノブ反応によって製造される。３”−Ｏ−アミノ−３”−ヒドロキシメ チルヌクレオシドを形成する際には、トリチルは、ヌクレオシドの５°　−ヒド ロキシル基のためのブロック基きしてはたらく。プリンおよびピリミジンヌクレ オシドの両方について、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドと反応させる前に３°　− ヒドロキシ基をＴＢＤＰＳで保護する。ピリミジン塩基については５′−０−ア ミノヌクレオシドを形成する際に、５゛位へのフタルイミドの導入後に、３゛　 −ヒドロキシルをＴＢＤＰＳブロック基で保護することができる。

種間結合を修飾してホスホネート結合したジヌクレオチドを与えるための別の方 法は、３°　−ｃ−ホスホネートニ量体の形成のためのマズール（Ｍａｚｕｒ） 外、テトラヘドロン（Ｔｅ　ｔ　ｒａｈｅｄ　ｒａｎ）、２０　：　３９４９　 （１９８４）のミカエリスーアルブゾフ（Ｍｉｅｈａｅ　ｌ　１ｓ−Ａｒｂｕｚ ｏｖ）法を使用する。この方法は、シンラン１として３゛　−ヒドロキシメチル ヌクレオシドを使用するであろう。これをＮ−ブロモスクシンイミドで処理して 相当する３”−ブロモメチル誘導体を得る。シンラン２は５゛−ホスファイトと して選択される。シンラン１および２の結合により、３゛−Ｃ−ホスホネート結 合により結合したジヌクレオシドが得られる。相当する５゛−Ｃ−ホスホネート ニ量体は、最初に適当なブロックされたホスファイトをシンラン１と反応させ、 次に脱ブロックして３°−ＣＨ２−ホスファイト中間体を得ることによって得る ことができる。シンラン２は、５°　−ブロモヌクレオシドとして選択される。

次に３’　Ｃ）ｉｚ−ホスファイト中間体をシンラン２と反応させて５′−〇− ホスフエートニ量体を得る。シンラン１への結合後にブロックされた亜リン酸エ ステルとして亜リン酸トリベンジルを選択することにより、ベンジル基を水添分 解により除去することができる。別法として５゛　−デオキシ−５′　−ブロモ ヌクレオシドを亜リン酸エステルと反応させて５′−ホスホネートとする。この ものを次に、３°　−ヒドロキシメチルヌクレオシドと反応させて、５°　−Ｃ −ホスホネート結合した二量体を得る。

ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよび本発明のその他の結合基によって結合し た上記の方法のいずれかから得られるジヌクレオシドは、５°　−ヒドロキシル でジメトキシトリチル基によって保護され、３°　−ヒドロキシルでシアノエチ ルジイソプロビルホスファイト部分と結合させるために活性化されることができ る。

これらの二量体は、ホスホアミダイト結合化学を用いる標準的な固相自動ＤＮＡ 合成によって、あらゆる所望の配列内に挿入されることができる。このため、保 護されたジヌクレオシドは、通常のホスホジエステル結合を用いて特定のＤＮＡ 配列の単位と結合される。得られるオリゴヌクレオチド類似体またはオリゴマー は、混合主鎖（一部分は普通のホスホジエステル結合であり、一部分は本発明の 新規四環子結合）を有している。このようにして、７つのヒドロキシルアミン、 ヒドラジンまたはその他の型の結合を有するジヌクレオシドを含むような１ｓ量 体の配列特異的オリゴヌクレオチドを容易に合成することができる。このような 構造は、天然のホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドに比べて増大した 水溶性を与えるであろう。

均一な上路結合を含むオリゴヌクレオチドは、ＣＰＧ−固体支持体および標準的 な核酸合成装置、すなわちバイオシステムズ社（ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｅ、 ）３８０Ｂおよび３９４およびミリケン／バイオサーチ（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂ ｉｏｓｅａｒｅｈ）７５００および８８００．の使用によって合成することかで きる。最初の７クレオシド（３°　−末端の１番）を制御された細孔ガラス（ｃ ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐａｒｅ　ｇｌａｓｓ）のような固体支持体にとりつける 。各々の新規なヌクレオシドを、手操作または自動合成装置システムによって、 配列特異性順序に結合させる。メチレンヒドラジン結合の場合には、反復ヌクレ オシド単位は２つの一般的な型のもの、例えば、５゛　−保護されたアルデヒド 官能基および３′　−デオキシ−３°　−Ｃ−ヒドラジノメチル基をもつヌクレ オシド、または酸不安定性基によって保護された５゛　−デオキシ−５゛　−ヒ ドラジノ基および３°　−デオキシ−３°　−Ｃ−ホルミル基を有するヌクレオ シドであることができる。各々の場合に、次に続く配列が必要とする塩基を加え るために各サイクルについてくり返される条件には次のものがある。５′　−ア ルデヒド保護基を除去するための酸洗浄、各々のヒドラゾン連結を形成するため の３゛　−メチレンヒドラジノ基をもつ次のヌクレオシドの付加、および所望の メチレンヒドラジン結合したＣＰＧ−結合オリゴヌクレオシドを得るための種々 の薬剤のいずれかを用いる還元。このような有用な還元剤の一つは、水素化シア ノホウ素ナトリウムである。

好ましい方法は図１に示されている。この方法には、保護された５“部位をもつ シンラン２か結合している固体支持体を用いる。好ましくは、上記のシンランの ５゛部位はＤＭＴで保護することかできる。その後、シンラン２の５゛部位を緩 酸て遊離させ、洗浄し、そして酸化し２て中間体生成物を生成する。一つの好ま しい方法では、アルデヒド誘導体をＮ、Ｎ−ジフェニルエチレンジアミンと反応 させて、中間体生成物５゛−＝ジフェニルイミダゾリジノ保護されたシンラン２ を生成する。より好ましい方法では、５°　−ジフェニルイミダゾリジノ保護さ れたンンラン２を直接支持体上に載せる。どちらの方法についても、中間生成物 は次に脱ブロックされて請求核性の５゛位をもつシンラン２を与える。次に５′ 　−ジフェニルイミダゾリジノ保護された３°　−デオキシ−３°　−Ｃ−ヒト ランン塩基のような保護された５゛　−アルデヒド基をもつンンラン１を添加し て、水素化シアノホウ素ナトリウムの添加等によって、結合したシンラン２と反 応させることができる。洗浄した後で、ヒドラジノ部分により結合したジヌクレ オシドか形成される。その後で、このサイクルを所望に応じて、シンラン１の化 学種の付加とそれに続く酸／塩基脱保護によりくり返して、修飾された種間結合 により結合したポリシンラン（結果として得られる所望の配列のオリゴマー）を 生成することができる。本発明のいくつかの好ましい具体化においては、シンラ ン１の化学種この段階法の一つの好ましい具体化では、固体支持体への結合中、 シンラン２の電子中心を保護するためにジフェニルエチルジアミン付加物（１， ３−ジ置換イミダブリジノ）を使用する［モファット・ジエイ・ジー（Ｍｏｆｆ ａｔｔ。

Ｊ、　Ｇ、　）外、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ ｏｕｒｎｓｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ） ９０５３３７−５３３８　（１９６８）］。シンソランは好ましくは、制御され た細孔ガラス支持体または当技術分野に習熟した人々には公知のその他の適当な 支持体のような固体支持体に結合させることができる。結合は標準法によって行 うことかできる［ガイド・エム・シエイ（Ｇａ　ｉ　ｔ、　Ｍ、Ｊ、　）著、オ リゴヌクレオタイド・シンセシス、ア・プラクティカル・アプローチ（Ｏｆ　ｉ ｇｏｎｕｃ　ｌｅ。

ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ） 。

アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）１９８４］。別法として、 製造は、保護された結合ヌクレオシドを種々の標準的な酸化法で直接酸化するこ とによって行うことができる。結合ンンラン２は、好ましくは、ヒドラジンと反 応させて、シッフ（Ｓｃｈ　ｉ　ｆ　ｆ’　ｓ）塩基を生成させ、これを続いて 還元することかできる。ヒドロキシルアミンもまたこの方法に有用な奸ましい反 応体である。

均一な主鎖結合オリゴヌクレオチドを合成する別の方法か図２に示されている。

この方法もまた、保護された５゛部位をもつンンラン２か結合されている固体支 持体を使用する。この場合には、シンランの５゛部位はフタルイミド基で保護さ れる。その後、シンラン２の５゛部位をＤＣＭ中のメチルヒドラジンで遊離させ て、ＤＣＭ：メタノールで洗浄する。シンラン１の５゛位のアミノヒドロキシル 基もまた、フタルイミド基で保護される。このようなシンラン１は５°　−フタ ルイミド保護された３゛　−デオキシ−３“−Ｃ−ホルミルヌクレオシドである 。シンラン１をシンラン２と反応させ、続いて５゛位を脱保護し、洗浄して次の ５゜−アミノヒドロキシ反応部位をａＳさせる。このサイクルを、シンラン１の 別の付加について所望の配列が構成されるまで十分な回数くり返す。この配列の 各ヌクレオシドをオキシム結合で結合させる。所望のオリゴヌクレオシドの末端 ヌクレオシドを、５’　−ＤＭＴブロックされた３゛　−デオキシ−３°　−Ｃ −ホルミルヌクレオシドとして配列に加える。オキシム結合したオリゴヌクレオ シドは、支持体から除去することができる。もしアミノヒドロキシル結合したオ リゴヌクレオシドが望ましいならば、オキシム結合を水素化シアノホウ素ナトリ ウムで還元する。別法として、オキシム結合したオリゴヌクレオシドがまだ支持 体に結合している間に還元を行なうことができる。

また、本発明に従えば、構造 （式中、Ｂｘは、可変の塩基成分であり、Ｑは○、ＣＨ，，ＣＨＦまたはＣＦ、 であり、ＸはＨ１○Ｈ；Ｃ，〜ＣＩＯ低級アルキル、置換低級アルキル、アルカ リールまたはアラルキル；Ｆ；Ｃ１；Ｂｒ　；ＣＮ；ＣＦ３；０ＣＦｘ；ＯＣＮ ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル、Ｑ−アルケニル、Ｓ−ア ルケニル。

またはＮ−アルケニル：　５ＯＣＨｘ：　５ＣｈＣＨ３：○ＮＯ２；　ＮＯｚ： 　Ｎ、＋：　ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミ ノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌ クレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチド の藁力学特性を改良するための基：である） を有するヌクレオシドが提供される。

このような種では、Ｙはヒドロキシル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒド ロキシメチル、Ｃ−ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置換イ ミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、メチルアミノベンゼンチオ、メチルホ スホネートおよびメチルアルキルホスホネートであり：そしてＺはＨ，ヒドロキ シル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシルメチル、Ｃ−ホルミル、 フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキ シメチル、オルト−メチルアミノベンゼンチオ、メチルホスホネートまたはメチ ルアルキルホスホネート：である。

上述の基はすべて、ＱがＯであり、Ｙがヒドロキシメチルであり、かつ、ＸがＨ またはＯＨであるときは、ＺはＣ−ホルミルではなく：またＱがＯであり、Ｘが ＨまたはＯＨであり、かつ、Ｚがヒドロキシルであるときは、Ｙはアミノヒドロ キシメチル、ヒドラジノメチルまたはアリール置換イミダブリジノではないとい う条件付きである。

本発明のオリゴヌクレオシド類似体は、診断、治療に、そして研究試藁およびキ ットとして使用することができる。治療用には、このオリゴヌクレオシド類似体 を、何らかの蛋白質によって調節される疾患を有する動物に投与される。このよ うな疾患を有すると思われる患者に、その病気の症状を弱めるために有効である 量のオリゴヌクレオチド類似体を投与するのが好ましい。当技術分野に習熟した 人は、このような治療養生のための最適用量および治療スケジュールを決定する ことができる。

本発明に従う治療藁を経口、静脈内、または筋肉内のように内部に投与するのが 一般に好ましい。経皮、局所、または病変内のようなその他の投与形も有用であ る。生薬内の封入も有用である。薬理学的に受容できるキャリヤーの使用も、い くつかの具体化のためには有用である。

実施例 下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであるか、制限するものではな い。

均一メチレンヒトラシン（３’　ＣＨ２ＮＨＮＨＣＨ２５’　）結合オリゴヌク レオシドの合成 実施例Ｉ ＣＰＧ−結合したヌクレオシトジフェニルイミダゾリジノ保護された５°　−ア ルデヒド性チミジンおよび５゛　−デオキシ−５゛　−ヒドラシノーチミジンの 合成ＣＰＧ−結合したチミジン［カリホルニア州、フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ） 市。

ＡＢＩ、ＣＰＧ支持体１グラム上のチミジン３０マイクログラム）を、周囲温度 で、ＤＭ　Ｓ　Ｏ，ベンセン、ＤＣＣ，ピリジン、およびトリフルオロ酢酸［１ ５ｍ１／１５ｍ１／２．４８ｇ１０．４ｍ１１０．２ｍ１）の混合物で、フイッ ツアー、ケイ・イー（Ｐｆｉｔｚｅｒ、に、Ｅ、）およびジエイ・ジー・モファ ット（Ｊ、Ｇ、Ｍｏｆｆａｔ　ｔ）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル ・ソサエティ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　５ｏｃｉｅｔｙ）８５：３０２７　（１９６３）の酸化手順と同様に処理して 、５°　−アルデヒド性ヌクレオシドを得る。混合物を一晩貯蔵した後、濾過す る。支持体を蓚酸（ベンゼン／ＤＭ３０．１対し　５ｍｌ中１．３ｇ）で洗浄し て、１．２−ジアニリノエチレン（３，０ｇ）で１時間処理し、濾過し、モして アセトニトリルで洗浄して、５°　−ジフェニルイミダブリジノ保護された５° 　−アルデヒド性チミジンを得る。支持体と結合した５°　−アルデヒドチミジ ンのアセトニトリル中のヒドラジン水和物／水素化シアノホウ素ナトリウムの溶 液による処理により、ＣＰＧ−３°　−結合した５°　−デオキシ−５°　−ヒ ドランノチミシンか得られ、このものをその塩酸塩として貯蔵する。

実施例２ ５°　−ジフェニルイミダブリジノ保護された３°−デオキシ−３゛−〇−ヒド ラツノーメチルチミジンの合す父 商業的に入手可能な３゛−〇−アセチルチミジンを酸化して、次にそのＮ、Ｎ− ジフェニルエチレンシアミン誘導体（１，３−ジフェニルイミダゾリジノ）とし て保護した。これにより、公知の５°　−デオキシ−５°　−ジフェニルイミダ ゾリシノー３°−アセチルチミジンが得られる。フイツツアー、ケイ・イー（Ｐ ｆｉｔｚｅｒ、に、Ｅ、）およびシエイ・シー・モファットＤ、Ｇ、　Ｍｏ　ｆ 　ｆ　ａｌ　１）　、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ　 （Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａ　５ｏｃｉｅｔｙ ）８５：３０２７　（１９６３）。この物質の加水分解を、周囲温度で１５時間 、メタノール性アンモニア処理をすることによって達成した。５′　−デオキシ −５゛　−ジフェニルイミダゾリシノチミシン（４，５ｇ）をＤＭＦ　（１００ ｍｌ）に溶解させ、室温で１５時間、沃化トリフェニルメチルホスホニウムで処 理した。溶媒を減圧下で除去し、得られる残留物をメタノールから再結晶させて ３゛−デオキシ−３゛−ヨード誘導体を得た。

３゛　−デオキシ−３°　−ヨード−５°　−シフェニルイミダゾリシノチミシ ンをトルエンに溶解させて、ヘキサメチルニスズ、ｔ−ブチルイソニトリル、お よびＡＩＢＮで処理した。このラジカル反応により、３゛　−デオキシ−３”　 −シアノ誘導体を得て、次にこのものをＯｏＣでトルエン／ＴＨＦ中の水素化ジ イソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）で還元して、３°　−デオキシ−３ °　−Ｃ−ホルミル−５“−シフェニルイミダヅリシノチミシンを得た。この物 質を、アセトニトリル中のヒドラジン水和物及び水素化ホウ素ナトリウムで処理 して、５゛　−ジフェニルイミダブリジノ保護された３゛−デオキシ−３゛−Ｃ −ヒドラジノメチルチミジンを得た。この物質は酢酸塩として都合よく貯蔵され る。

実施例３ アプライド・バイオシステムズ辻（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　［ ｎＣ）３８０Ｂ　ＤＮＡ合成装置による均一なメチレンヒドラジン結合したオリ ゴヌクレオシドの合成 ３゛　−末端ヌクレオシドになるであろうジフェニルイミダブリジノ保護された ５゛　−アルデヒドをもつＣＰＧ−結合したチミジンを、アプライド・ｌ〈イオ システムス′ンよ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ｌｌｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ）（ＡＢ Ｉ）のカラムに入れ（２５０ｍｇ、１０マイクロモルの結合ヌクレオシド）ＡＢ ｌ　３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成装百にとりつける。デスメチルヌクレオシド単位を 成長する鎖に結合させるために必要とされるサイクルの自動化（コンピューター へ制御された）段階は、下記の通りである。

段階　バエまたは溶ｂｘ混合物　時間（分−秒）１　３％シンクロロエタン中Ｄ ＣＡ　３　：　００２　ジクロロエタン洗浄　１００ ３５°　−デオキシ−５’　−（１，３−ジフェニルイミダゾリジノ）−３°　 −デオキシ−３“　−Ｃ−メチレンヒドラジンヌクレオシド（第２のヌクレオシ ド）。

アセトニトリル３０ｍ１中　２０マイクロモル　２５０４　水素化ホウ素ナトリ ウム（１：Ｉ　ＴＨＦ／ＥｔＯＨ中５０マイクロモル、５０ｍ１）　３　：　０ ０５　ジクロロエタン洗浄　２００ ６　段階１て始まるリサイクル（酸洗浄）　３・ＯＯこの手順で、その生成物ヌ クレオシドとして５゛　−ジメチルオキシトリチル胃換されたヌクレオシド単位 を得る。

合成が完了したら、標準法により塩基脱保護および支持体からのオリゴマーの除 去を行なう。ＨＰＬＣ上のトリチル精製に続く酢酸脱保護および沈殿により、オ リゴヌクレオシドか酢酸塩として得られる。

断続的なメチレンヒドラジン（３°　−ＣＨ２−Ｎ　Ｈ−Ｎ　ＨＣＨ２５°）結 合したオリゴヌクレオシドの合成 実施例４ ５゛　−デオキシ−５゛　−ヒドラジノチミジン塩酸塩の合成５°　−ヘンシル カルバシル−５“−デオキシチミジンを得るために、５’　−０−トシルチミジ ン、ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオシドズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）９：８９　（１９９０）（１，９８ｇ。

５ミリモル）、ヘンシルカルバジド（４，１５ｇ、２５　ミリモル）、活性分子 ふるい（３Ａ、２ｇ）、および無水ジメチル−アセトアミド（１００ｍｌ）を、 １１０’Ｃ（浴温）で１６時間、水分を排除しながらいっしょに撹拌した。生成 物を冷却し、減圧下で濃縮した（浴温く５０°Ｃ）。残留物を、溶媒としてＣＨ ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：　１．　Ｖｏ　ｌ／Ｖｏ　ｌ）を用いてシリカゲルカ ラム（５ｘ４５ｃｍ）上で精製した。均質な分画をプールして、蒸発乾燥させ、 泡沫をＥｔＯＨから再結晶させて、０．７ｇ　（３６％）の５゛−ベンジルカル バジル−５゛−デオキシチミジンを得た；融点２０１℃： 吸湿性粉末としての５゛−デオキシ−５゛−ヒドラジノチミジンの塩酸塩を得る ために、無水ＭｅＯＨ／ＨＣＩ　（３０ｍ１．重量で２％ＨＣ１）中の上記力ル バゼート（ｃａｒｂａｚａｔｅ）（０，７８ｇ、２ミリモル）および木炭上のパ ラジウム（１０％、１５０ｍｇ）の混合物を、水素雰囲気下で室温で１．５時間 撹拌した。メタノール溶液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）を通して濾過して、触媒 を除去した。フィルターケーキをＥｔＯＨ（２ｘ２５ｍｌ）で洗浄した。濾液を 真空下で濃縮して、残留物を一晩乾燥させて痕跡のＨＣＩを除去した。黄色残留 物をメタノール（３ｍｌ）に溶解させて迅速に撹拌している酢酸エチルの溶液（ １５０ｍｌ）に液加した。濾過した沈殿を酢酸エチル（３Ｘ１００ｍｌ）で洗浄 し、淡黄色の固体を真空乾燥させて、０．５１ｇ　（８８％）の５°−デオキシ −５゛　−ヒドラジノチミジン塩酸塩（吸湿性粉末）を得た；Ｃ＋、Ｈ）　、　 ７．５４（ｓ、　１．　Ｃ声）、　１１．１８（ｂｒｓ、　１．　ＣａＮＨ）。

試料は湿っていたのでヒドラジノおよび３’　−ＯＨは見られなかった。

実施例５ ５′−トリチル−１−［２，３−ジデオキシ−３−Ｃ−（ホルミル）−β−Ｄ− エリトロ−ペントフラノジルコウラシルおよびチミジンの合成アルゴン下で撹拌 した乾燥ＴＩ−ＩＦ　（２０ｍｌ）中の３°−シアノ−２°、３′−ジデオキシ −５’−０−４リチルウリジン（０，９６ｇ、２ミリモル）［チミジン類似体の 合成についてのテトラヘドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅ ｒｓ）２９：２９９５　（１９８８）参照］の溶液に、−１０℃で１０分かけて トルエン中のＤＩＢＡＬ−Ｈの溶液［アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）’１（Ｌ Ｍ、４ｍ１）を加えた。３０分後に反応を一１０℃でＭｅＯＨ（５ｍｌ）を用い て停止させた。この混合物を周囲温度でさらに３０分間撹拌し、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ ｌ２（２５で希釈した後、真空濃縮した。残留するＴＨＦを除去するためにこの 工程をＣＨ２Ｃｌ２　（３ｘ２５ｍｌ）を用いて（り返した。残留物をシリカゲ ル（２５ｇ）上のフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した。ＣＨ２Ｃ ｌ２（９：　１．　ｖ／ｖ）で溶出させ、ＣＨ２Ｃ１ｚ／ＭｅＯＨから結晶させ て、５゛−〇−トリチルー３゛−Ｃ−ホルミル−２′、３°　−ジデオキシウリ ジン（０，５３ｇ、５３％）を得た；融点１００℃： ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）６２．２５−２．８　（ｍ、　２．　ＣＨ２）、３． ４（ｍ、　１．　Ｃｓ＝旦）　、　３．４５　３．６　（ｍ、　２．　Ｃｓ−Ｃ Ｈ２）、４．３７（ｍ、１．　Ｃ４一旦）、５．　４　（ｄ、１．　Ｃａ旦）　 、６．　１　（ｍ、１．　Ｃ１□旦）、　７．２　７．４（ｍ、　１５．　Ｃａ 旦、）、７．８１（ｄ、　１．　Ｃ，旦）、７．９５（ｂｒｓ、１．Ｎ旦）　、 ９．　６１　（ｓ、１．　ＨＣ＝Ｏ）。

実施例６ １−メチル−５−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−２，３−ジデオキシ−３− Ｃ−＜ホルミル）−Ｄ−エリトロベントフラノースの合成上記のテトラヘドロン ・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）４４　：　６２５　（ １９８８）の３′−〇−シアノ糖についてのＤＩＢＡＬ−Ｈ還元を用いて３゛− Ｃ−ホルミル糖前駆体を９０％の収率で油として得た。

実施例７ メチレンヒドラジン結合（３°　−ＣＨｚ−ＮＨＮＨＣＨＩ　５’　）５°　− ジメトキシ−トリチル−３°　−β−シアノエトキシジイソプロピルホスホアミ ダイトジヌクレオシドの合成 アルゴン下で撹拌した５′　−〇−トリチルー１−　［２，３−ジデオキシ−３ −Ｃ−（ホルミル）−β−り一エリトローペントフラノシル］チミン（１ミリモ ル）。

５°　−デオキシ−５゛−ヒドラジノ−チミジン塩酸塩（１ミリモル）、および 乾燥ＴＨＦ　（２５ｍｌ）の溶液に、乾燥した分子ふるい（１ｇ）を加えた。− 晩反応を進行させた後、ブロモクレゾールグリーン（５ｍｌ）で処理した。次に 水素化シアノホウ素ナトリウム（４ミリモル）を加え、続いて反応混合物の黄褐 色の色が保持されるようにＴＨＦ中のｐ−１−ルエンスルホン酸（４ｍｌ中４ミ リモル）をシリンジによって液加した。この添加の後、撹拌を２時間続けた。混 合物を濾過し、固体を乾燥ＭｅＯＨ（３Ｘ１０ｍｌ）で洗浄した。合わせた濾液 をプールして濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、 メチレンヒドラジン結合した（３’　−ＣＨｚ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨｔ−５”）チ ミジン塩酸塩を得た。この物質のヒドラジノ結合をガイド・エム・ジエイ（Ｇａ 　ｉ　ｔ、　Ｍ、Ｊ、　）著、オリゴヌクレオタイド・シンセシス、ア・プラク ティカル・アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ 、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）［アイ・アール−エル・プレス （ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）１９８４］に記載された一時的な方法によってモノベン ゾイル化した。５°　−ヒドロキシルおよび３゛　ヒドロキシルは、標準法に従 って５’　−０−ジメトキシトリチル−３゛　−β−シアノエトキシジイソプロ ピルホスホアミダイトに変換される。

実施例８ 断続的なメチレンヒドラ’）ン（３’　ＣＨ２ＮＨ−ＮＨ＝ＣＨ２５’　）！合 したオリゴヌクレオシドの合成 ＣＰＧ−結合したチミジン（または３゛　−末端塩基になるべきすべてのその他 のヌクレオシド）をアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）（ＡＢＩ）カラムに入れ（２５０ｍｇ、１０マイク ログラムの結合ヌクレオシド）、ＡＢＩ　３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成装置にとりつ ける。ホスホアミダイト化学を使用する標準的な自動化（コンピューター制御） 段階を用いて、メチレンーヒドラジンチミジンニ量体を配列のすべての所望の位 置に入れる。

実施例９ ５°−〇−トリチルー１−［２，３−’）デオキシ−３−Ｃ（ホルミル）−β− Ｄ−エリトローペントフラノシル］−ウラシルおよび一チミンの別法による合成 ３′　〜デオキシー３゛　−ヨード−５’　−０−トリチルチミジン（０，５９ ｇ。

４ミリモル）；テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２９： ２９９５　（１９８８）、ｌ−リス−（トリメチルシリル）シラン（２，８７ｇ 、１゜２ミリモル）、ＡＩＢＮ　（１２ｍｇ、０．０７２ミリモル）、およびト ルエン（２０ｍｌ）の混合物を、ガラス容器中で混合し、アルゴンで飽和させた （室温で泡立たせる）。ガラス容器をステンレス鋼の圧力反応器内にはめこんで 一酸化炭素で加圧しく８０ｐｓｉ）、閉鎖し、そして２６時間加熱した（９０℃ 、浴）、反応混合物を冷却して（０℃）、ＣＯを注意深く脱出させた（ヒユーム フード下で）、生成物をシリカゲル（２０ｇ）上のフラッシュカラムクロマトグ ラフィーによって精製した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２：　１．　ｖ／ｖ）を用 いて溶出させ、適当な分画をプールすると、０．３０ｇ　（６１％）の標題化合 物が泡沫として得られた。

同様に２’　、３’　−ジデオキシ−３°　−ヨード−５’　−０−トリチルウ リジンをラジカルカルボニル化すると、３′　−Ｃ−ホルミルウリジン誘導体が 得られる。

実施例１０ ５′−〇−フタルイミドチミジンおよび２′−デオキシ−５゛−０−フタルイミ ドウリジンの合成 かくはんした乾燥ＤＭＦ（２５ｍｌ）中のチミジン（１，２１ｇ、５ミリモル） 、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１，０９ｇ、６．　６ミリモル）、トリフェニ ルホスフィン（１，７５ｇ、６．　６ミリモル）の混合物に０℃で３０分かけて ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１，５ｍｌ、７．　５ミリモル）を加 えた。室温で１２時間かくはんを続けた。溶媒を真空蒸発させ、残留物をジエチ ルエーテル（２Ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。残留物を熱ＥｔＯＨ（５０ｍｌ）中に 懸濁させ、冷却し、濾過して１．５４ｇ　（８０％）の標題化合物を白色粉末と して得た。

２′−デオキシウリジンに関する同様の反応により、相当する２゛　−デオキシ −５゛−フタルイミドウリジンを得た；融点２４１−２４２℃。

実施例１１ ５゛−０−フタルイミド−３’−Ｑ−ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリルチ ミジンおよび２゛　−デオキシ−５°　−〇−フタルイミドー３’　−０−ｔｅ ｒｔ　−ブチル（ジフェニル）−シリルウリジンの合成５’　−０−フタルイミ ドチミジンまたは２゛　−デオキシ−５°　−Ｏ−フタルイミドウリジンを、ピ リジンおよびイミダゾール中のｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）クロロシランで 標準的に処理して、５’　−ｏ−フタルイミド−３°−０−ｔｅｒｔ−ブチル（ ジフェニル）シリルチミジンおよび２°−デオキシ−５゛−〇−フタルイミドー ３“−０−ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリルウリジンを結晶生成物として 得た。

ＣＤＣｌ！中のチミジン誘導体の　ＩＨＮＭＲ：δ　１．　１０　（ｓ、９．　 Ｃ（ＣＨ３）　３）　、　１．９５　（ｓ、　３．　ＣＨ３）　、　２．２　（ ｍ、　２．　Ｃ，、ＣＨ２）。

３、　６３　４．　１５　（ｍ、３．　Ｃｓ、旦およびＣｓ、、ＣＨ２）　、４ ．　８０　（ｍ。

１、Ｃ４，旦）　、６．　４５　（ｔ、１．　Ｃ，、旦）　、７．４　（ｍ、１ ５．　ＡｒＨ。

Ｃ５Ｈ）、８．２　（ｂｒ　ｓ、１．ＮＨ）。

実施例１２ ５゛−〇−アミノー３’−０−ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリルチミジン の合成 かくはんした乾燥ＣＨ２Ｃ１２（１０ｍｌ）中の５′−〇−フタルイミドー３゜ −０−ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリルチミジンの混合物に、無水条件下 、室温でメチルヒドラジン（３ミリモル）を加えた。この溶液を１２時間かくは んし、冷却しく０℃）濾過した。沈殿をＣＨｚＣｌｚ　（２Ｘ１０ｍｌ）で洗浄 し、合わせた濾液を濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ シリカゲル、２０ｇ）により精製した。ＣＨ２Ｃｌ！＋ＭｅＯＨ（９：　１．ｖ ／ｖ）で溶出させて、所望の５′−〇−アミノー３’−０−ｔｅｒｔ−ブチル（ ジフェニル）シリルチミジンを結晶生成物として得た（６５％）。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ　１．　Ｏ（ｓ、　９．　Ｃ（ＣＨ３）　３）　、 １．８０（ｓ、３．　ＣＨ３）、１．８１および２．　２４　（２ｍ、　２．　 Ｃ２，ＣＨ２）、３゜２５および３．６０　（２ｍ、２．　Ｃｓ＝　ＣＨ２）　 、　４．０　（ｍ、１．　Ｃｓ、旦）。

４、２５　（ｍ、１．　Ｃ４，旦）、　５．４　（ｖｂｒ、ｓ、　ＮＨ２）、６ ．２５（ｔ、１．　ｃｌ、旦）、７．　２　（ｓ、１．　Ｃ６旦）　、　７．２ ５−７．６０　（ｍ。

１０、ＡｒＨ）、８．４　（ｂｒ　ｓ、１．ＮＨ）。

実施例１３ （３’　−ＣＨ＝Ｎ−０−ＣＨ２−５’　）およＵ　（３’　ＣＨ２ＮＨ０−Ｃ Ｈｚ−５°）結合したオリゴヌクレオシドの合成乾燥ＣＨ２Ｃｌ！　（２５ｍｌ ）中の３′−デオキシ−３′−Ｃ−ホルミル−５′−〇−トリチルチミジン（０ ，９９ｇ、２ミリモル）および５′−〇−アミノー３’−Ｑ−ｔｅｒｔ−ブチル （ジフェニル）シリルチミジン（０，９９ｇ、２ミリモル）の混合物を室温で１ 時間かくはんした。溶媒を真空蒸発させて、残留物を乾燥ＴＨＦ　（２０ｍｌ） に溶解させた。フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液（ＩＭ、５ｍ１） をかくはんした反応混合物に加えた。室温で１時間かくはんを続け、溶媒を蒸発 させてガム状残留物を得た。残留物を短かいシリカゲル（２０ｇ）カラムクロマ トグラフィーによって精製し、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（９９：　４．ｖ／ｖ） で溶出させると、所望の二量体が泡沫として得られた。生成物を無水ＭｅＯＨ（ ５０ｍｌ）に溶解させ、このものに飽和メタノール性ＨＣ１溶液（２，５ｍ１） を加えた。反応混合物を室温で１５時間か（はんした。無水ピリジン（１０ｍｌ ）を、上記の溶液に加え、溶媒を蒸発させて、粗製のオキシム結合したジヌクレ オシドを得た。オキシムを、シリカゲル（２０ｇ）カラムクロマトグラフィーに よって精製した。ＣＨ２Ｃｌ２・ＭｅＯＨ（９２：　８．ｖ／Ｖ）で溶出させて 、０．６９ｇ　（７０％）のオキシム結合した二量体をＥ／Ｚ異性体の混合物と して得た。

’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄｓ）δ　１．７８および１．８０　（２ｓ、　６Ｈ。

２５　（２ｂｒ　ｓ、　２．　ＮＨ）。

２つの幾何異性体（Ｅ／Ｚ）を逆相ＨＰＬＣによって分離し、種々の分析技術に よって十分に特性決定した。異性体の二量体をさらに、標準的な化学を使用して 、二量体の５′−ヒドロキシル基でその５’　−０−ジメトキシメチルトリチル 誘導体および二量体の３′−ヒドロキシル基でのその３’　−〇−β−シアノエ トキシジイソブロピルホスホアミダイト誘導体に変換した。この誘導された二量 体のＤＭＳＯ−ｄａ中の”Ｐ　ＮＭＲはδ１５０．４，１５０．７および１５０ ．８ｐｐｍで共鳴した。この保護された二量体は、−合よく貯蔵することができ て、治療価値のあるオリゴマーへ干特異的組み入れのために必要ときれるので、 そしてこれが必要とされるとき、自動ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ　３８０Ｂ）を用 いる結合に、使用することができる。下に示すように、オキシム結合したヌクレ オシド二量体をもつオリゴマーを還元して、相当するヒドロキシアミン結合した ヌクレオシド二量体をもつオリゴマーとする。

実施例１４ 断続的な（３’　ＣＨ＝Ｎ　ＯＣＨ２５°）または（３°−ＣＨＩ−ＮＨ−ＯＣ Ｈｔ　５°）結合したオリゴヌクレオシドの合成オリゴヌクレオシドの３′末端 ヌクレオシドになるであろう適当な２′−デオキシヌクレオシドを、ＡＢＩ　３ ８０Ｂ自動ＤＮＡ合成装置に使用するためのＣＰＧカラムに結合させる。標準的 なホスホアミダイト化学プログラムの段階を使用して（３’　ＣＨ＝Ｎ　ＯＣＨ ｚ　５°）または（３’　−ＣＨ２ＮＨ０−ＣＨｚ　５°）結合をもつ二量体を 配列内の所望の位置または選りぬきの位置に入れる。

実施例１５ ３′ヌクレオシド　サブユニットを用いる、ＡＢＩ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成装置 による均一な（３’　ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨＩ　５’　）または（３°−ＣＨ，−Ｎ Ｈ−Ｏ−ＣＨ２−５°）結合したオリゴヌクレオシドの合成サブユニットｌ：　 ｃｐｃ−結合した５°　−０−フタルイミドチミジンをヌクレイツク・アンッズ ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１８：３８１ ３　（１９９０）の手順に従って製造して、オリゴヌクレオシド合成用の３゛− 末端単位として使用した。

サブユニット２：　適当な塩基によるメチル２．３−ジチオキシ−３−シアノ− ５−０−（フタルイミド）−β−り一エリトローペントフラノシドの標準的なグ リコリル化およびヌクレオシド生成物のＤＩＢＡＬ−Ｈ還元により、２官能性（ ３°　−Ｃ−ホルミルおよび５゛−〇−フタルイミドデオキシリポヌクレオシド ）を誘導する。

サブユニット３：　最終（オリゴヌクレオシドの５°　−末端）ヌクレオシドの 組み入れのために５’　−０−ＤＭＴ−３’　−Ｃ−ホルミルチミジンを使用す る。

均一な結合を生成する（１０ｇＭの規模で：ＣＰＧに単位１を載せる）ために必 要とされるサイクルの自動化段階は、次の通りである：段階　試薬／溶媒　時間 ７分 １　５％ＤＣＭ中のメチルヒドラジン　１０２　ＤＣＭ＋ＭｅＯＨ（９：１．ｖ ／ｖ）　５３　ＤＣＭ洗浄　２ ４３’　−Ｃ−ホルミル−５゛−〇−フタルイミドーデオキシーリボヌクレオシ ド（単位２．ＤＣＭ２０ｍｌ中２０μＭ）　、　３ ５　ＤＣＭ：アセトン（９：　１．　ｖ／ｖ）　：キャー／ピング　２６　ＤＣ Ｍ洗浄　３ 所望の配列および長さに依って、ヌクレオシド単位の各々の付加のために、先述 の段階１ないし６をくり返す。次に最終単位を付加する。

８　最終ヌクレオシド（２０ｍｌ　ＤＣＭ中２０μＭ）または単位３５ オリゴヌクレオシドの二量体結合または複数の結合における（３°−ＬＣＨ＝Ｎ −ＯＣＨｚ−５’　）結合の（３°　−ＣＨ２−Ｎ　Ｈ−ＯＣＨ２５’　）への 変換のためのＮａＣＮＢＨ，還元段階 実施例１６ 二量体の還元 氷酢酸（ＡｃＯＨ）（５ｍｌ）中の二量体（０，４９ｇ、１ミリモル）の溶液に 、ＡｃＯＨ（１ｍｌ）中の水素化シアノホウ素ナトリウム（領　１９，３ミリモ ル）を、アルゴン雰囲気下、室温で加えた。懸濁液を１時間か（はんし、追加量 のＡｃＯＨ中のＮａＢＨ３ＣＮ　（１ｍｌ）を加えて、かくはんを１時間続けた 。

過剰のＡｃＯＨを室温で減圧除去した。残留物をトルエン（２Ｘ５０ｍｌ）と共 同蒸発（ｃｏｅｖａｐｏｒａｔｅ）させて、シリカゲル（２５ｇ）カラムクロマ トグラフィーによって精製した。ＣＨ２ＣＩ　２　：　Ｍｅ　ＯＨ（９：　１． 　ｖ／　ｖ）による溶出および適当な分画のプールに続いて蒸発させると０．３ ６ｇ　（７５％）の結晶二量体が得られた。

実施例１７ オリゴヌクレオシドの還元 １（または２以上）のバックボーン修飾結合を含むＣＰＧ−結合したオリゴヌク レオシド（１μＭ）を、その合成サイクルの完了後にＤＮＡ合成装置からとり出 す。ＴＨＦ　：ＡｃＯＨ（１０ｍｌ、１　：　ｌｖ／ｖ）中の１．０Ｍ　ＮａＢ Ｈ３ＣＮ溶液を３０分間シリンジ技術を用いる標準法によってＣＰＧ−結合物質 中に供給する。カラムをＴＨＦ　（５０ｍｌ）で洗浄し、還元したオリゴヌクレ オシドを標準法で支持カラムから生じさせる。

実施例１８ 別法によるオリゴヌクレオシドの還元 上記の還元に対する別法として、還元を、ＣＰＧ支持体からの除去後に行なうこ ともできる。合成の完了時に、オリゴヌクレオシドを標準的手順によってＣＰＧ −支持体から除去する。５’　−０−トリチルのついたオリゴヌクレオシドを、 ＨＰＬＣによって精製した後、上記のようなＮａＢＨｓＣＮ／ＡｃＯＨ／ＴＨＦ 法によって還元する。

実施例１９ （３’　−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−５’　）および（３’　ＣＨ２０−Ｎ　ＨＣ Ｈ２−５′）結合したオリゴヌクレオシドの合成３゛−Ｃ−ホルミル−５°　− ０−トリチルチミジンを、過剰のＮａＢＨ４で還元して３°−ヒドロキシメチル チミジンを得て、これをＴＨＦ中のトリフェニルホスフィン、Ｎ−ヒドロキシフ タルイミドおよびジイソプロピルジカルボキシレートで処理すると、３°−フタ ルイミドメチル類似体が得られ、これを、メチルヒドラジンを用いてヒドラジン 分解すると３′−ヒドロキシメチル−（０−アミノ）−５’　−０−トリチルチ ミジンが総合収率６４％で得られた。

ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオサイズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄＮ ｕｃ　ｌ　ｅｏ　ｔ　１ｄｅｓ）９　：　５３３　（１９９０）の手順により、 １−　（４−Ｃ−ホルミル−３−〇−ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）−シリル −２−デオキシ−β−り一エリトローペントフラノシル）チミジンを製造した。

上記した通りのＤＣＮ中のこのヌクレオシドと３゛　−ヒドロキシメチル−（０ −アミノ）−５′−Ｏ−トリチルチミジンとの結合によりオキシムが得られこれ をＮ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ３ＣＮ還元すると二量体が得られた。二量体を適当に保 護し、そして標準ＤＮＡ合成装置化学によりオリゴヌクレオシドの所望の位置に 挿入するために５°Ｏ−ＤＭＴおよび３′−Ｏ−ホスホルアミド誘導体として活 性化した。

実施例２０ （３’　ＣＨ２Ｐ　（０）　２　０　ＣＨｚ　５’　）お、Ｊ−ヒ（３’　ＣＨ ２０Ｐ（０）２　ＣＨ２−’５’　）結合したオリゴヌクレオシドの合成Ａ、３ °−Ｃ−ホスホネート結合体の合成３°　−ヒドロキシメチル−５’　−０−（ ０−ｔ　ｅ　ｒ　ｔ−ブチル（ジフェニル）シリル）チミジンを、ＮＢＳによる 処理によって臭化物に変換する。この臭化物にアルブゾフ（Ａｒｂｕｚｏｖ）反 応を行なってホスホン酸ジエステルを得る。

ホスホン酸ジエステルをトリメチルブロモシランで開裂すると、遊離酸が得られ 、これをピリジン中の３’　−（０−ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリル） チミジンおよびＤＣＣで処理して二量体を得る。

８、　３’　−Ｃ−ホスホネート結合したオリゴヌクレオシドの合成標準ＤＮＡ 合成装置化学により、オリゴヌクレオシド中の所望の位置に挿入するために適当 に保護し、そしてこの二量体を５’　−０−ＤＭＴおよび３’　−０−ホスホル アミド誘導体として活性化することによって、上記の二量体をオリゴヌクレオシ ド中に組み入れることができる。

Ｃ，５°−Ｃ−ホスホネート結合したオリゴヌクレオシドの合成５゛　−デオキ シ−５゛　−ブロモヌクレオシドを亜リン酸エステルと反応させて５°−ホスホ ネートとすることにより、相当する５゛−〇−ホスホネートニ量体を得ることが できた。これをこんどは３′　−ヒドロキシメチルヌクレオシドと反応させて５ °　−Ｃ−ホスホネート結合した二量体を得る。

実施例２１ 化合物（１３）の合成、ＲｅｌがＯ−（ジメトキシトリチル）、Ｒε２がＯ−（ ２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、Ｎ’−テトライソプロピルホスホジア ミシル）、モしてＲｏがＨである構造（Ｉ［Ｉ）。

（Ｘ１工） Ａ、化合物（２）　、ＲＪ’Ｏ−（ｔ−ブ＋ルシ７工：ルシ’Ｊ／ｌｚ）　、Ｒ ｃｚが０−（ｐ−トルエンチオホルミル）、モしてＲｘ３がＨである構造（ｒＶ ）。

ＲＨ （工Ｖ） 化合物（１）［ＲＰ１＝Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル、Ｒ１４２＝Ｏ−（１ ）−トルエンチオホルミル）、そしてＲＨ＝Ｈである構造（ＩＶ）；１１．４５ ｇ；２３゜８２　Ｘ　Ｌ　Ｏ−３モル］をアルゴンの下でＣＨｚＣ１２（１００ ｍｌ）に溶解する。この溶液にＮＥｔｓ　（２，４１ｇ　；　２３．８２・１０ −３モル］　、ＤＭＡＰ　（４−Ｎ。

Ｎ−’）メチルアミノピリジン；２．９１１ｇ：２３．８２Ｘ１０−３モル）お よびｐ−トルエンチオクロロホルメート（４，４４６ｇ；２３．８２・１０−３ モル）を加える。室温で２０時間撹拌後、混合物をＣＨ２ＣＩｔ　（５０ｍｌ） で希釈し、水性ＮａＨｚＰＯ＜　（２Ｘ５０ｍｌ）で、次いでブライン（２Ｘ５ ０ｍｌ）で洗浄し、そしてＮａｚｓｏ＜で乾燥する。溶剤を蒸発させた後、残留 物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン：Ａｃ０Ｅｔ、４：１）。

化合物（２）は淡黄色固体（１３，０７４ｇ　；　２０．　７２ｘｌＯ−”モル 、　８７％）　トＬテＨ１ｉ１ｔｉすｔＬる。　’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌｓ、５ ００ＭＨｚ、６　（ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ））：２、　４１　（Ｈｚ’、ｄｄ ｄ、　”Ｊ＝１３．　５．３１１−１−５．　９．　”Ｊ２’−「＝９．　３） 　；２、　７３　（Ｈ２’、ｄｄ、”Ｉ（イー５．０）；　４．３６　（Ｈ／、 ｄｄｄ、”Ｊ３’イー０゜９）；　５．９４　ＣＨｌ、ｄｄ）；　６．５１　（ Ｈｌ、ｄｄ）　；　７．　５８　（Ｈａ、ｑ。

’Ｊ−１，０）、ＭＳ　（ＦＤ：ｍ／ｅ）：　６３１　（Ｍ”）。

Ｂ、　化合物（３）　、ＲＨが０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ２□が アリル、そしてＲｘ３がＨである構造（ｒＶ）。

化合物（２）（５，０ｇ；７．９２６Ｘ１０−３モル）をアルゴンの下でガス抜 きしたベンゼン（７９ｍｌ　；　０．１Ｍ；アルゴン流で３０分間ガス抜きした ）に溶解する。アリルトリーｎ−ブチルスズ（１３，１２ｇ；３９．６３ｘｌＯ −３モル）およびＡＩＢＮ（アゾ−ビスイソブチロニトリル；０．６５ｇ；３． ９６３Ｘ　１０−’モル）を加えた後、混合物を還流加熱する。４時間後、ＡＩ ＢＮ（０゜２６ｇ；１．５８’ｘｌＯ−３モル）を再び加える。薄層クロマトグ ラフィー（シリカゲル：ヘキサン・Ａｃ０Ｅｔ、１・１）分析によると、出発物 質は２０時間後に検出されない。溶剤を減圧下で蒸発させ、残留物をシリカゲル でクロマトグラフィーする（ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ、勾配６：１−２：１）、化 合物（３）は白色固体（３，１２ｇ；６．１８ｘｌＯ−３モルニア８％）として 単離される。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌｘ、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）　、Ｊ　 （Ｈｚ））：　２．１５−２．１９　（２Ｈ２’、ｍ）；　２．４６　（Ｈｌ、 ｍ）；　５．７０　（ＣＨ＝ＣＨ２；ｍ）；　６．　１１（ＨＩ’、ｄｄ、　３ Ｊ　ｌ’−２・＝５．１および６．　１）　；　７．　５１　（Ｈｓ、Ｑ。

４Ｊ＝１．１）、ＭＳ　（ＦＤ；ｍ／ｅ）：　５０５　（Ｍ″″）。

Ｃ０化合物（４）　、Ｒ，、が０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ−２が ＣＨ２Ｃ（○）ＨｌそしてＲｘ３がＨである構造（ＩＶ）。

オレフィン誘導体（３）（３，ｌ１ｇ；６．１６２Ｘ１０−３モル）を２１のジ オキサン−Ｒ２０（６０ｍｌ）混合物に溶解する。０５０４　（０，１５７ｇ　 ；　０゜６１６Ｘ１０−３モル）を加え、その後、Ｒ２０（２５ｍｌ）中のＮａ 　ＩＯ４（２゜８９ｇ；１３．５５ｘｌＯ−’モル）の溶液を加える。この懸濁 液を室温で４時間撹拌する。次に、ＣＨ２Ｃ１２（１００ｍｌ）を加える。有機 相をブライン（２Ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、モしてＮ　ａ　ｚ　Ｓ　Ｏ４で乾燥す る。溶剤を蒸発させた後、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキ サン　Ａｃ０Ｅｔ、１・１）。

化合物（４）が淡黄色固体（１，５６１ｇ；３．０８ｘｌＯ”’モル２５０％） として得られる。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌｓ、５００ＭＨｚ、６　（ｐｐｍ）　 、Ｊ　（Ｈｚ））　・２．０７　（Ｈ（、ｄｄｄ、”Ｊ＝１４．９．”Ｉｆイー ７、　０．　”ｌ（イー７゜９）　；　２．　３９　（Ｈ２Ｓ　ｄｄｄ、”Ｊ　 メイ＝４．　９．　３１ｔ’−ｓ’−８，３）　；　２．　８４ＣＨｆ、ｍ）； 　３．７２　（Ｈ４・、ｄｄｄ、’Ｊ３’−４’−７，５）　；　６．　１４　 （Ｈ＋’、ｄｄ）＋９．７２　（ＣＨＯ，ｄｄ）。

Ｄ、　化合物（５）　、ＲＨが０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒｔｚが ＣＨ２Ｃ（０）○ＣＨ３、そしてＲｅ３がＨである構造（ＩＶ）。

アルデヒド（４）（２，２３ｇ；４．４０１ｘｌＯ”３モル）をＤＭＦ（２０ｍ １）に溶解する。ＭｅＯＨ（０，８４６ｇ；２６．４０ｘｌＯ”モル）およびＰ ＤＣ（ピリジニウムシクロメート；１０．１３７ｇ；２６．４０ｘｌＯづモル） を加える。得られた暗褐色溶液を室温で２０時間撹拌し、次にＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ ２（６０で希釈し、そしてＮａＨｚＰＯｎ　（２Ｘ５０ｍｌ）でおよびブライン （２Ｘ５０ｍ１）で洗浄する。Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥した後、溶剤を蒸発 させ、そして残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン：Ａｃ０ Ｅｔ、２１）。

化合物（５）（Ｌ、５３１ｇ；２．８６９ｘｌＯ−３モル、６５％）が白色固体 として１１離される。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ） 　、Ｊ　（Ｈｚ））：　２．１７　（Ｒ７，ｄｄｄ、　２Ｊ＝１４．３．、３Ｊ ２’イ＝７．　０．３Ｉｌイ＝７、　２）　；　２．　３３　（Ｈ２’、ｄｄｄ 、　３Ｉｆ−（＝５．０．　！Ｊｖイ＝８．　３）　；２゜８２　ＣＨ３′、ｍ ）；３．６８　（ＣＯＯＭｅ、ｓ）；６．１５　（Ｈｌ、ｄｄ）。

Ｅ、　化合物（６）　、Ｒ，ｌか０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒと２ がＣＨ２Ｃ（０）ＯＨ，そしてＲｘ３がＨである構造（ＩＶ）。

エステル誘導体（５）（７，１９７ｇ；１３．４ｘｌＯ−３モル）をＴＨＦ−Ｈ ２０の１１混合物（５０ｍｌ）に溶解する。０．ｌＮ−ＮａＯＨの溶液（２６， ８ｍｌ　：２６．８１Ｘ１０−’モル）を加える。室温で１８時間撹拌した後、 追加量のＯ，ｌＮ−ＮａＯＨ（１３，４ｍｌ　：１３．４Ｘ１０−３モル）を導 入し、そして混合物を２時間撹拌し、ＩＮ−ＨＣｌで中和し、ＣＨ２Ｃ１２（２ Ｘ５０ｍｌ）で抽出する。有機相をブライン（２Ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ　ａ 　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。溶剤を蒸発させた後、化合物（６）が白色固体（６ ，３８ｇ；１６．０３Ｘ１０−３モル１９１％）として得られる。’Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌｓ、２５０ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：　６．１４　（Ｈ＋’、ｄｄ） 。

Ｆ、５′−アジド−２’、５’　−ジデオキシ−チミジン（７）　、Ｒ，ｌがア ジド、Ｒｅ２がヒドロキシル、そしてＲｏがＨである構造（ＩＶ）。

化合物（７）の合成は、市販のピリミジンチミジン（アルドリッチ・ケミカル社 、アイオワ州ミルウォーキー）からＴ、Ｌｉｎ、Ｗ、Ｐｒｕｓｏｆ　ｆ、Ｊ、Ｍ ｅｄ、Ｃｈｅｍ、　、２１．１０９　（１９７８）に記載の手順に従って行った 。

Ｇ、　化合物（８）　、Ｒ，、がアジド、Ｒｅ２か０−（ｔ−ブチルジフェニル シリル）、モしてＲ１！３がＨである構造（ＩＶ）。

化合物（７）　（３，０ｇ；１１．２２ｘｌＯ−３モル）をアルゴンの下でＤＭ Ｆ（２０ｍｌ）に溶解する。イミダゾール（１，３ｇ：１９．０８ｘｌＯ”モル ）およびｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（４，６２７ｇ：１６．８３Ｘ１０ −３モル）を加える。混合物を室温で４８時間撹拌する。ＤＭＦを減圧下で蒸発 させ、残留物をＣＨ２Ｃ１２（６０ｍｌ）およびＮａＨ２Ｐ○４ａＱ、（６０ｍ ｌ）に溶解する。有機相をＮａＨｚＰＯ＜ａＱ、（５０ｍｌ）でおよびブライン （５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ、ｓｏ、で乾燥する。溶剤を蒸発させた後、残留物 質をシリカゲルでり０７トグラフイーする（ＣＨＣｌｘ：ＭｅＯＨ２０：１）、 化合物（８）が淡黄急曲（５，３９ｇ；１０．６６Ｘ１０−’モル：９５％）と して得られる。

’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｓ、２５０ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ））： 　１．９５　ＣＨｉ、ｄｄｄ）　；２．　３６　（ＨｚＣｄｄｄ）　；６．　３ ８　（Ｈ＋’、ｄｄ）　。

Ｈｌ　化合物（９）　、Ｒｔ、がアミ人Ｒｅｚが０−（ｔ−ブチルジフェニルシ リル）、そしてＲｔ３がＨである構造（ｒＶ）。

化合物（８）（７，３ｇ、Ｅｌ、４３Ｘ１０−”モル）をガス抜きしたベンゼン （１４４ｍｌ　；０．ＬＭ；アルゴン流で３０分間ガス抜きした）に溶解する。

ＡＩＢＮ（０，２３７ｇ；１．４４Ｘ１０づモル）および水素化ｎ−トリブチル スズ（９，２４４ｇ；３１．７６ｘｌＯ−３モル）を加えた後、溶液を８０℃で １５時間加熱する。追加量（７）ＡＩＢＮ　（０，２３７ｇ　；　Ｌ　４４ｘＬ Ｏ−３モル）　を導入し、そして５時間加熱を続ける。溶剤を蒸発させ、残留物 をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ　１・２）。化 合物（９）が淡黄色固体（４，６０５ｇ；９．６ｘｌＯ−３モル：８５％）とし て得られる。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）　、Ｊ　 （Ｈｚ））：　１．９３　（Ｈ２’。

ｄｄｄ、　”Ｊ−１３，５，”Ｊｚ’−＋’−６，８，３Ｊ２Ｌ−ｆ−６，８） 　；　２．　３５　（Ｈｌ。

ｄｄｄ、　’ＪＶ−＋・＝６．　２．３Ｊ２・イー４．　２）　；　３．　８７ 　（Ｈ４／、ｄｄｄ、　３Ｊ！’−４’＝３．７）：　４．２５　（Ｈ！’、ｄ ｄｄ）；　６．３１　（Ｈ乙　ｄｄ）。

■、　化合物（１０）　、Ｒ，、が０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ， ２が０−　（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、そしてＲｏがＨである構造（ＩＩ ）。

化合物（６）（０，４６’８ｇ；０．８９６−１（Ｉ”モル）をＭｅＣＮ（３０ ｍＩ）に溶解する。この無色溶液にＮ−メチルモルホリン（０，０９９ｇ；０． ９８６・１０１モル）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０，０６ｇ；０． 　４４８・１０−３そル）　、０−（ＩＨ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール −１−イル）　−Ｎ、Ｎ、　Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチルウロニウムテトラフ ルオロボーレート（０，３１７ｇ；０．９８６・１０−３モル）を加える。混合 物を３０分間室温で撹拌する。次に、化合物（９）（０，４３ｇ；０．８９６ｘ ｌＯ−’モル）をＭｅＣＮ　（５ｍｌ）に溶解し、モしてＮ−メチルモルホリン （領　１３６ｇ；１．３４４Ｘ１０−”モル）と共に加える。室温で２０時間後 、アセトニトリルを減圧下で蒸発させる。残留物をＣＨｚＣｌｚ　（６０ｍｌ） およびＮａＨｚＰＯ＜　（３０ｍｌ）に溶解する。有機相をＮａＨｚＰＯｌ（２ ｘ３０ｍｌ）でおよびブライン（２×３０ｍ１）で洗浄する。Ｎａ２ｓｏ、で乾 燥した後、溶剤を蒸発させる。残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ ヘキサン：Ａｃ０Ｅｔ　１　：　１）。化合物（１０）が淡黄色固体（０，６９ ２ｇ；０．７０３・１０−’モルニア９％）として得られる。’Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ ＤＣＩｓ、５００ＭＨｚ％Ｊ　（ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ））　・　５．７９（ Ｈｌ、　ｄｄ、３Ｊｐ−２’ｘ７．　０）　：　６．　２０　（Ｈど、　ｄｄ、 ３Ｊ（イ＝６、　４；６．　９５　（Ｈ６−Ｑ、　’Ｊ−Ｌ　Ｏ）　；　７．　 ２７　（Ｈａ、ｑ、　’Ｊ＝１゜０）、−ＭＳ　（Ｅｌ　；ｒｎ／ｅ）：　９８ ４　（Ｍ”）。

Ｊ、化合物（１１）、Ｒ１１がヒドロキシル、Ｒｔ２がヒドロキシルそしてＲｅ ３がＨである構造（ＩＩＩ）。

化合物（１０）（０，６８ｇ；０．６９ｘｌＯ−”モル）をアルゴンの下でＴＨ Ｆ　（１０ｍｌ）に溶解する。酢酸（０，１２４ｇ；２．０７ｘｌＯ−３モル） および弗化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムＣＴＨＦ中の１．１Ｍ溶！１．８８ ｍ１；２．０７Ｘ１０−’モノりを加える。室温で２０時間後、混合物を減圧下 でトルエン（３×）と共に蒸発させる。残留物をシリカゲルでクロマトグラフィ ーする（ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ２０：１）、化合物（１１）が白色固体（０，２ ９５ｇｏｏ、５８１ｘｌＯ°３モル；８４％）として単離される。’Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳｏｄｓ、５００ＭＨｚ、Ｊ　（ｐｐｍ）、Ｊ　（Ｈｚ））：５．９５　 （Ｈｌ、ｄｄ。

３Ｊ〆イー６．　２．　’Ｊ、・イー４．　０）　：　６．　２２　（Ｈ＋’、 ｄｄ、　３Ｊ、−イー６．２゜’Ｌ’−ｚ’−７，９）’；　７．　４７　（Ｈ ｓ、Ｑ、　’Ｊ−０，８）　；　７．　８５　（Ｈ，、ｑ。

’Ｊ−０，８）。

Ｋ、　化合物（１２）　、Ｒｕが０−（ジメトキシトリチル）、Ｒ，がヒドロキ シル、モしてＲ２３がＨである構造（ＩＩＩ）。

化合物（１１）（０，２９ｇ；０．５７１ｘｌＯ〜３モル）をアルゴンの下でビ リンン（１０ｍｌ）に溶解する。ＤＭＴＣＩ（塩化４．４′　−ンメトキシトリ フェニルメチル（０，１９４ｇ；０．５７１ｘＬＯ−３モル）を加える。室温で １８時間撹拌した後、追加量のＤＭＴＣＩ　（０，０９７ｇ；０１２８５Ｘ１０ −’モル）を導入する。反応混合物をＭｅＯＨ（１ｍｌ）で急冷し、４０時間後 にＣＨ２ＣＨ２Ｃ１２（５０およびＮａ２ＣＯｓａ　ｑ、（５０ｍｌ）で希釈す る。有機相をブライン（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥 する。溶剤を減圧下でトルエン（３Ｘ）と共に蒸発させる。残留物をシリカゲル でクロマトグラフィーする（ＡｃＯＥｔ　：ＭｅＯＨ，勾配５０：１−１０：１ 　＋　１％Ｎ−メチルモルホリン）。化合物（１２）（０，４２６ｇ；０．５２ ６ｘｌｌ１３モル：９２％）が淡黄色固体として単離される。’Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ ＤＣ１３，５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１．４４　（Ｍｅ、ｄ）；１．８８ 　（Ｍｅ、ｄ）；３．８．０　（２ＸＯＭｅ、ｓ）　；　７．　６６　（Ｈ６， Ｑ）。

Ｌ、　化合物（１３）　、Ｒ＝１がＯ−（ジメトキシトリチル）　、Ｒ，２が〇 −（２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’　−テトライソプロビルホ スホシアミシル）、モしてＲｅ３がＨである構造（ＩＩＩ）。

化合物（１２）（０，４１３ｇ；０．５２ｘｌＯ−３モル）をアルゴンの下でＣ Ｈ２ＣＩ２　（２０ｍｌ）中の２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’ 　−テトライソプロピルホスホシアミダイト（０，１７２ｇ；０．５７２ｘｌＯ ”モル）およびＮ、　Ｎ’−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾライト（０， １０７ｇ、０．６２４Ｘ１０−３モル）の溶液に加える。室温で１６時間後、追 加量の２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトライソプロビルホ スホシアミダイト（０，１７２ｇ；０．５７２Ｘ１０−３モル）を導入する。室 温で２４時間後、混合物をＮａ２ＣＯｓａＱ、（２０ｍｌ）で急冷する。有機相 をブライン（２Ｘ３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２Ｓ○、て乾燥する。溶剤を蒸発さ せた後、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（トルエン　Ａｃ０Ｅｔ 、１：１　＋　１％Ｎ−メチルモルホリン）、、化合物（１３）（０，２９９ｇ ：０．２９６ｘｌＯ−’モル、５７％）か白色固体として単離される。’Ｈ−Ｎ ＭＲ（ＣＤＣＨ３，１０１ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１４８．８９および１４９ ．３１゜実施例２２ 化合物（１７）の合成、Ｒ１１か０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ，□ かＣ（０）ＯＨ，そし７：　Ｒｔ　ｓがＨである構造（ＩＶ）。

Ａ、　化合物（１４）　、Ｒ＝＋が０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、ＲＩ ！２がスチリル、モしてＲｅ３がＨである構造（ｒＶ）。

実施例２１Ａのように製造した化合物（２）（３，５５８ｇ＋５．５６９ｘＬＯ −３モル）をアルゴンの下でガス抜きしたベンゼン（１９ｍｌ；０１３Ｍ、アル ゴン流で３０分間ガス抜きした）に溶解する。ＡＩＢＮ（０，１８３ｇ；１．１ １３Ｘ１０°３モル）および１−フェニル　２−ｎ−トリブチルスズエチレン（ ２１，９０ｇ；５５．６９ｘｌＯ”モル）を加えた後、溶液を８０°Ｃで加熱す る。

ＡＩＢＮ（０，１８３ｇ；１．１１３ｘｌＯ−３モル）を１０時間ごとに合計０ ゜９１５ｇ　（５，５６６ｘｌＯ”モル）加える。出発物質が残っていなければ （シリカゲルを用いる薄層クロマトグラフィーにより測定、ヘキサン：Ａｃ０Ｅ ｔ。

１　：　１）　、溶剤を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーす る（勾配　ヘキサン：Ａｃ０Ｅｔ、１０　：　１−４　：　１）、化合物（１４ ）が白色固体（２，３６７ｇ；４．１７７Ｘ１０−３モルニア５％）として単離 される。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈ ｚ））：　２．３４　（Ｈ２’。

ｄｄｄ、　”Ｊ＝１４．　０．　”Ｊ２’−ｆ−３，０，３Ｊ２’−３・−８， ２）　：　２．　４６　（Ｈｌ。

ｄｄｄ、　３Ｊ２’−１’＝７．　１．３Ｊｚ’−１’＝１０．　２）　；　３ ．　２８　（Ｈ３’、　ｍ）　；　３．　８８　（Ｈ，’、ｄｄｄ、　３Ｊ３・ −４’＝９．　１）　；　６．　２１　（Ｈ＋’、ｄｄ）　；　７．　５８　（ Ｈａ。

ｑ、　’Ｊ−１，０）。

Ｂ、　化合物（１５）　、Ｒ１，が０−１−ブチルジフェニルシリル、Ｒ１２が ホルミル、そしてＲ４がＨである構造（ＩＶ）。

誘導体（１４）’（２，１９３ｇ；　３．８６９ｘｌＯ−’モル）をジオキサン Ｈ，Ｏの２１混合物（３０ｍｌ）に溶解するＯｓＯ４（０，０９８ｇ：０．３８ ６　Ｘ　１０−３モル）を加え、次に、ＨｚＯ（８ｍｌ）中のＮａ　ＩＯ４（１ ，８２ｇ　：８．５１２Ｘ１０＝モル）の溶液を加える。得られた懸濁液を３時 間室温で撹拌し、ＣＨ２Ｃ１２（３Ｘ５０ｍｌ）で抽出する。有機相をブライン （２Ｘ３０ｍｌ）で洗浄し、そしてＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。溶剤を蒸 発させた後、残留物をシリヵゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン　Ａｃ０ Ｅｔ、１　：　１）。アルデヒド（１５）が白色固体（１，３３４ｇ；２．７０ ８ｘｌＯ−’モル、７０％）として単離される。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣｔ、、２ ５０ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ））・２゜２６　（Ｈｌ、ｄｄｄ、” Ｊ＝１５．３、’Ｊｚ’−＋′＝６．　１．　’１１イ＝９．　４）；　２．　 ７７　（Ｈｆ、ｄｄｄ、　’Ｊ２・イ＝３１ｉ−ｆ−６，２）　：　３．　３６ 　（Ｒ３＜　ｍ）　；６ｘｌＯ（Ｈｒ、ｄｄ）。

Ｃ化合物（１６）　、Ｒ１＋がＯ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒｅｚが Ｃ（０）ＯＣＨ３、そしてＲ１３かＨである構造（ＩＶ）。

アルデヒド（１５）（１，０９１ｇ；２．２１４ｘｌＯ−３モル）をＤＭＦ　（ １０ｍｌ）に溶解する。ＭｅＯＨ（０，４２５ｇ；１３．２８７Ｘ１０−３モル ）およびＰＤＣ（ピリジニウムジクロメート；４．９９８ｇ；１３．２８７ｘｌ Ｏ−３モル）を加える。得られた暗褐色溶液を２０時間室温で撹拌し、ＣＨ２Ｃ ｈ　（５０ｍｌ）で希釈し、ＮａＨｚＰＯ４（２×１０ｍｌ）でそしてブライン （２Ｘ　５０ｍ１）で洗浄する。Ｎａ２５Ｏ＜で乾燥した後、溶剤を蒸発させ、 残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン：Ａｃ０Ｅｔ、１　： 　１）。化合物（１６）（０，６６１ｇ：１．２６４ｘｌＯ−３モル：５７％） が白色固体として得られる。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬｓ、５００ＭＨｚ、Ｊ　（ ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ））：２、　２８　（Ｈｚｓ　ｄｄｄ、　２Ｊ＝１４． 　５．３Ｊｚ’−＋′−５，６，’Ｊ２・イ＝９．　１）　；２、　７６　（Ｒ ２二　ｄｄｄ、３Ｊ２’イ＝３Ｊ／−ゴー６．９）：３．４２　（Ｈｌ　ｄｄｄ ）；　４．　２８　（Ｈ＜１　ｃｔａｃｔ、３Ｊ３’−４’−７，０）　：　６ ．　２１　（Ｈ１’、ｄｄ）　。

Ｄ、　化合物（１７）　、Ｒ，ｌがＯ−（ｔ−ブチルジフェニルシリノリ、Ｈｒ ２がＣ（○）ＯＨ，そしＴＲＫ３がＨである構造（ＩＶ）。

エステル誘導体（１６）（２，２ｇ；４．２０９ｘｌＯ−”モル）を　Ｔ）（Ｆ −Ｈ，Ｏの１１混合物（５０ｍｌ）に溶解する。０．ｌＮ−ＮａＯＨの溶液（１ ２６，３ｍｌ；１２゜６２７ＸＬＯ−３モル）を加える。室温で１６時間撹拌し た後、混合物をｌＮ−ＨＣｌで中和し、ＣＨ，Ｃ１，（２×５０ｍ、Ｉ）で抽出 する。

有機相をブライン（２×１０ｍｌ）で洗浄し、ＮａｚＳＯ４で乾燥する。溶剤を 蒸発させた後、化合物（１７）か白色固体として得られる（２．０１５ｇ：３． ９８５×１０−３モル、９４％）。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，２５０ＭＨｚ、 δ（ｐｐｍ））：　６．２２　（Ｈ＋’、ｄｄ）。

実施例２３ 化合物（２６）の合成、ＲＨがＯ−（ジメトキシトリチル）、ＲＦ２がＯ−（２ −シアノエチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトライソプロピルホスホジアミシ ル）、そしてＲｇｓがＨである構造（Ｖ）。

Ａ　化合物（１８）　、ＲＨが０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒｅ２か ヒドロキシエチル、そしてＲ■がＨである構造（ＩＶ）。

実施例２１Ｃのように製造した化合物（４）（５，３２３ｇ；　１０．５ｘｌＯ −３モル）をＭｅＯＨ（６０ｍｌ）に溶解する。ＮａＢＨ＜　（１，１９２ｇ　 ；　３１．５１ＸｌＯ”モル）を０℃で分けて加える。水素の発生が止まったら 、反応混合物を室温で２時間撹拌しする。ＮａＨｚＰＯ４ａｑ、（２０ｍｌ）を 注意深く加える。ＭｅＯＨを蒸発させ、残留物をＣＨｚＣ１２（２×１０ｍｌ） で抽出する。

有機相をブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。溶 剤を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン−Ａｃ ＯＥｔ　１１）。化合物（１８）が白色固体として得られる（５．Ｏｌｇ；　９ ゜８４×１０−１モル、９４％）　。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＲ３，５００ＭＨｚ 、δ（ｐｐｍ）。

Ｊ　（Ｈｚ））：　２．、Ｒ５（Ｈ２’、ｄｄｄ、　”Ｊ＝１３．５．　３Ｊｆ −（＝７．０゜３Ｊ、、？＝９．　０）　：　２．　２７　（ＨｚＣｄｄｄ、３ Ｊ２’イ＝４．　０．　３Ｊ２’−３′＝８．　０）、２．４９（Ｈｒ、ｍ）、 ３．７７（Ｈ４’：　ｄｄｄ、）；６．１１（Ｈ，−ｄｄ）。

Ｂ、　化合物（１９）　、Ｒ＝１がＯ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ２ □がエトキシｐ−トルエンスルホニル、そしてＲｅ３がＨである構造（ＩＶ）。

化合物（１８）（０，３３４ｇ；０．６５６ｘｌＯ−’モル）をアルゴンの下で ＣＨ２Ｃ１２（１５ｍｌ）に溶解する。ＤＭＡＰ　（０，２４１ｇ；１．９６９ ｘｌＯ−３モル）、ピリジン（０，２０８ｇ：２．６２６ｘｌＯ−”モル）およ びトシルクロリド（０，３７５ｇ；１．９６９ｘｌＯ−３モル）を順次加える。

室温で２４時間撹拌した後、追加量のバエを導入する　ＤＭＡＰ　（０，１２ｇ ；０．９８４ＸｉＯ”モル）、ピリジン（０，１０２ｇ；１．３１３ｘｌＯ−” モル）；塩化トシル（０，１８７ｇ；０．９８４ｘｌＯ−’モル）。４０時間後 に反応混合物をＣＨ２Ｃ１２（６０ｍｌ）で希釈し、ＮａＨ２ＰＯ１ａｃｉ、（ ２×５０ｍｌ）でそしてブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄する。有機相をＮ　ａ 　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。溶剤を蒸発させた後、残留物をシリカゲルでクロマ トグラフィーする（ヘキサン−ＡｃＯＥｔ　２°１）。化合物（１９）（０，３ ６９ｇ；０．５５６ｘｌＯづモル。

８４％）か淡黄色固体として単離される。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＲ３，２５０Ｍ Ｈ２，６（ｐｐｍ））：　２．４４　（ｐＭｅ−Ｐｈ−ＳＯ３−、Ｓ）。

Ｃ化合物（２０）　、Ｒ，、がＯ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）　、ＲＦ２ がアシドエチル、モしてＲＨがＨである構造（ＩＶ）。

化合物（１９）（０，３６５ｇ；０．５５ｘｌＯ”モル）を乾燥アルゴン雰囲気 の下でＤＭＦ　（１０ｍｌ）に溶解する。この溶液にＬｉＮ　（０，１３５ｇ； 　２゜７５　Ｘ　１０−１モル）およびＮａ　Ｉ　（０，１６５ｇ　；　Ｌ　ｌ Ｘｌ０−”モル）を加える。混合物を１００℃で１７時間加熱し、次いで室温に 冷却する。エーテル（１００ｍｌ）を、次にブライン（５０ｍｌ）を加える。有 機相をブライン（２×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。

減圧下で溶剤を蒸発させた後、残留物をノリカケルでクロマトグラフィーする（ ヘキサン−ＡｃＯＥｔ　３：１）。

化合物（２０）が淡黄色油として単離される（０．２５９ｇ：　０．４８５ｘｌ Ｏ−３モル、８８％）、’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ ）。

Ｊ　（Ｈｚ））：　２．１３　（ＨｚＣｄｄｄ、　”Ｊ＝１３．５、　３Ｊ２’ −３’＝８．　７゜３Ｊ２・イ＝７．０）：　２．２６　（Ｈｚｓ　ａｄｃｌ、 ３Ｊ２・−３・−７，９，３Ｊ２’イ＝４．０）：　２．　４７　（Ｒ７，ｍ） 　；　３．　７３　（Ｈ４’、ｄｄｄ、　”Ｊｉ−；＝８．　０）　：　６．　 １１（Ｈｌ、ｄｄ）。

Ｄ、　化合物（２１）　、Ｒ１＋か０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｈｒ ２がアミノエチル、モしてＲ１，がＨである構造（ＴＶ）。

化合物（２０）（０，２５５ｇ；０．４７７ｘｌＯ″３モル）をアルゴンの下で ベンゼンのガス抜きした溶液（０，１Ｍ；アルゴン流で３０分間ガス抜きした。

５ｍ１）に溶解する。ＡＩＢＮ　（０，００８ｇ：０．０４７ｘｌＯ−３モル） および水素化ｎ−トリブチルスズ（０，３４７ｇ＋１．１９ｘｌＯ−３モル）を 室温で加える。混合物を８０℃で５時間加熱する。溶剤を減圧下で蒸発させる。

残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（勾配　ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ５ ０１−１０・１）。化合物（２１）が淡黄色油として単離される（０．２３ｇ； ０゜４５２　Ｘ　１０”モル：９５％）、’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬｓ、５００Ｍ Ｈｚ、δ（ｐｐｍ）、Ｊ　（Ｈｚ））：２．１２　ＣＨｌ、ｄｄｄ、　３Ｊｚ’ イ＝６．９）、２．２４（Ｈｌイ　ｄｄｄ、３Ｊ２’−／−４，０）　；　２． 　３８　（Ｈ３Ｃｍ）　；　３．　７４　（ＨｎＣｄｄ　ｄ、　’Ｊｆ−／−８ ．　０）　；　６．　０９　（Ｈ＋□、ｄ　ｄ）　−ＭＳ　（ＦＤ、　ｍ、／　 ｅ）　＋　５０８　（Ｍつ。

Ｅ、　化合物（２２）、Ｒ１１がＣ（０）ＯＨ，Ｒ乳２が０−（ｔ−ブチルジフ ェニルシリル）、モしてＲｘ３がＨである構造（ＩＶ）。

化合物（２２）をほぼＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０　（３７ ）４９６９−４９７２　（１９８９）に記載の手順に従って製造した。

Ｆ、　化合物（２３）　、Ｒ＝ｔが０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒヒ ２が０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、そしてＲＦ、３がＨである構造（ｖ ）。

化合物（２２）（２，２０５ｇ；４．４５９ｘｌＯ−３モル）をＭｅＣＮ（８０ ｍｌ）およびＴＨＦ　（１０ｍｌ）に溶解する。この溶液にＮ−メチルモルホリ ン（０，４９６ｇ；４．９０５ｘｌＯ−３モル）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリア ゾール（０，３０１ｇ：２．２２９ｘｌＯ−３モル）および０−（ＩＨ−Ｎ−ヒ ドロキシベンゾトリアゾール−１−イル）　−Ｎ、Ｎ、　Ｎ’　、Ｎ’　−テト ラメチルウロニウムテトラフルホロボーレート（１，５７５ｇ；４．９ｘｌＯ〜 ３モル）を加える。混合物を室温で３０分間撹拌する。ＭｅＣＮ　（２０ｍｌ） に溶解した化合物（２１）（２，２６４ｇ＋４．４５ｘｌＯ−３モル）をＮ−メ チルモルホリン（０，６７６ｇ＋６．６８８ｘｌＯ−３モル）と共に加える。室 温で２０時間後、溶剤を減圧下で蒸発させる。残留物をＣＨ２Ｃ１２（１００ｍ ｌ）およびＮａＨ２ＰＯ＊ａＱ、　（５０ｍｌ）に溶解する。有機相をＮａＨｚ ＰＯ＜　（２×５０ｍｌ）でおよびブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄し、モして Ｎ　ａ　２　ＳＣ２で乾燥する。溶剤を蒸発させ、残留物をシリカゲルでクロマ トグラフィーする（ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ、１：２）。化合物（２３）が白色固 体として単離される（４．１１ｇ；４．１７５Ｘ１０−　”　モル：　９３％） 、’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ！　、５００ＭＨ７、δ（ｐｐｍ）、Ｊ　（Ｈｚ） ）：　２．３４　（Ｈ２−、ｄｄｄ、”Ｊ−１４，３゜３Ｊ２’−３’−４，３ ，３Ｊｚ’−＋’−９，９）　、　４．　０１　（Ｈｓ：　ｍ）　；　４．　２ ８　（Ｈ４Ｃｓ）；４゜５５　（Ｈ３’、ｄ）　：　６．　０７　（Ｈ１’、ｄ ｄ、　’Ｊｌ’−１ｘ５．　５．　’Ｌ’−ｚ’−３゜８）　；　６．　１７　 （Ｈ＋□、ｄｄ、　”Ｊ（−ｆ−５，０）　、　ＭＳ　（ＣＩ、　ｍ／ｅ）　： 　９８４（Ｍ”）。

Ｇ、化合物（２４）、Ｒ□がヒドロキシル、Ｒε２がヒドロキシルモしてＨｚ３ がＨである構造（■）。

化合物（２３）（１，２９２ｇ；１．３１２ｘｌＯ”モル）をアルゴンの下でＴ ＨＦ　（３０ｍｌ）に溶解する。酢酸（０，２３６ｇ；３．９３７ｘｌＯ−３モ ル）および弗化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＨＦ中の１．１Ｍ溶Ｍ３． 　５８ｍ１　；３．９３７Ｘ１０−　’モル）を加える。室温で２４時間後、混 合物を減圧下、トルエン（３×）と共に蒸発させる。残留物をシリカゲルでクロ マトグラフィーする（ＡｃＯＥｔ　：ＭｅＯＨ１２０：１）、化合物（２４）が 白色固体としてｍ離される（０．６４７ｇ；１．２７ＸＬＯ−’モル、９７％） 。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）、Ｊ　（Ｈｚ）） ：　４．２５　（Ｈ＜？　ｄ。

３Ｊ４’−３’＝１．　９）　：　６．　０５　（Ｈ／、ｄｄ、　３Ｌ’−２’ ＝２．　１．３Ｊ　／−２’＝７．　８）　。

６．２１（Ｈ〆、　ｄｄ、　３Ｊ、・−ｚ’＝５．９．　”Ｌ’−ｚ’＝８．４ ）　：　７．８８　（Ｈｓ、　Ｑ）：８．０３　（Ｈ６，ｑ）。

Ｈ８化合物（２５）　、Ｒｅ＋かＯ−（ジメトキシトリチル）、Ｒ８□がヒドロ キシル、モしてＲｅｓがＨである構造ｆｆ）。

化合物（２４）（０，６４ｇ；Ｌ　２６ＬｘＬＯ−’モル〕をアルゴンの下でピ リジン（１０ｍｌ）に溶解する。ＤＭＴＣＩ（塩化４．４′　−ジメトキシトリ フェニルメチル；０．４２８ｇ；１．２６３ｘｌＯ−３モル）を加える。室温で １７時間撹拌した後、追加量のＤＭＴＣｌ　（領　４２８ｇ＋１．２６３ｘｌＯ −３モル）を導入する。４０時間後、反応混合物をＭｅＯＨ（１ｍｌ）で急冷、 し、ＣＨ２Ｃｈ（６０ｍｌ）およびＮａｚＣＯｘａｑ、（５０ｍｌ）で希釈する 。有機相をブライン（２×３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２５Ｏ＜で乾燥する。溶剤 を減圧下、トルエン（３×）と共に蒸発させる。残留物をシリカゲルでクロマト グラフィーする（ＡｃＯＥｔ　：ＭｅＯＨ，勾配５０　：　１４０　：　１）、 化合物（２５）（０，９０２ｇ；１．ｌｌＸｌ０−３モル：８８％）が白色固体 として単離される。’　ＴＩ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ ）、Ｊ　（Ｈｚ））：　４．２３（Ｈ４’、　ｄ、　３１＜’−ｓ’−Ｌ、８） 　；　６．　０６　ＣＨ＋’、　ｄｄ、　３Ｌ’イー２．　４．３Ｊ、・イ＝７ ．　５）　、６．　１９　（Ｈ＋’、ｄｄ、、　’Ｊｌ’−２’−５．　９．　 ’Ｊｌ’−２’−９．　０）。ＭＳ（Ｃｌ　：ｍ／ｅ）：　８０９　（Ｍ”）。

■、　化合物（２６）　、Ｒｕがｏ−（ジメトキシトリチ／Ｌ／）　、ＲＢがｏ −（２−ジアツエチルーＮ、　Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトライソプロピルホスホ ジアミシル）、モしてＲ１３がＨである構造（Ｖ）。

化合物（２５）’　（０，８９ｇ；Ｌ　１２１ｘｌＯ−’モル）をアルゴンの下 でＣＨ２Ｃｌｚ　（３０ｍｌ）中の２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、Ｎ ’　−テトライソプロビルホスホシアミダイト（０，３７１ｇ；１．２３３ｘｌ Ｏ−３モル）およびＮ、Ｎ’−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾライド（０ ，２３ｇ；Ｌ、３４５Ｘ１０−３モル）の溶液に加える。室温で１８時間後、追 加量の２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ、　Ｎ’　、Ｎ’−テトライソプロピルホスホ シアミダイト（０，３７１ｇ；１．２３３ｘｌＯ−３モル）を導入する。室温で ２４時間後、混合物をＮａＨＣＯ３ａｑ　（２０ｍｌ）で急冷する。有機相をブ ライン（２×３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ　ａ　ｚ　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。溶剤を蒸 発させた後、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン　Ａｃ０ Ｅｔ、１：２　＋　１％Ｎ−メチルモルホリン）。化合物（２６）か淡黄色固体 として単離される（０．６２４ｇ；０．６１７Ｘ１０−　’モル、５５％）、’ 　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ＋３、ＬＯＩＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１４８．１７およ び１５０．５７゜実施例２４ 化合物（３０）の合成、Ｒｉ　（が０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ− ｚかアミノメチル、モしてＲｅ３かＨである構造（ＩＶ）。

Ａ、　化合物（２７）　、Ｒ−＋かＯ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）　、Ｒ −ｚがヒドロキシメチル、モしてＲｅ３かＨである構造（ＩＶ）。

実施例２２Ａ−Ｂに記載のように製造したアルデヒド（１５）（０，７５９ｇ； １．５４１Ｘ１０−’モル）をアルゴンの下でＭｅＯＨ（６ｍｌ）に溶解する。

溶液を０℃に冷却し、ＮａＢＨ＜　（０，２９１ｇ　；　７．７０８ｘｌＯ−３ モル）を加える。この温度で３０分後、混合物を２５℃で２０時間撹拌する。こ の溶液にＮａＨｚＰＯｎａｑ　（３０ｍｌ）を加える。ＭｅＯＨを減圧下で蒸発 させ、水性相をＣＨ２Ｃ１２（３×３０ｍｌ）で抽出する。有機相をブライン（ ２×２０ｍｌ）で洗浄し、ＮａｚＳＯｑで乾燥する。溶剤を除去した後、残留物 をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ、１２）。化合 物（２７）が白色固体として単離される（０．３８１ｇ：０．７７ｘｌＯ−’モ ル、５０％）。

’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ＋３．５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ）） ：　２゜１４　（Ｈ１’、ｄｄｄ、”Ｊ＝１４．０．３Ｊ２’−１・＝５．　２ ．３１２’−１−８，８）　；　２゜２　９　（Ｈｚ’、　ｄｄ　ｄ、’Ｌｔ’ ４＝６．　８．　３Ｊｚ’−ｘ’−５，９）　：　２．　６　０　（Ｈｒ’、ｍ ）；３．９４　（Ｈ／、ｄｄｄ）＋６．１３　（Ｈに　ｄｄ）、ＭＳ　（ＦＤ、 ｍ／ｅ）：４９５（Ｍ”）。

Ｂ　化合物（２８）　、Ｒ，、か０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）　、Ｒ＝ ２がメトキノｐ−トルエンスルホニル、モしてＲｇかＨである構造（■）。

化合物（２７）（０，３９７ｇ；０．８０２ｘｌＯ−１モル）をアルゴンの下で ＣＨＣ１３（１５ｍｌ）に溶解する。０℃で冷却したこの溶液にピリジン（０゜ ２５４ｇ：３．２１ｘｌＯ−３モル）；ＤＭＡＰ（領　２９４ｇ＋２．４０７Ｘ １０−３モル）および塩化トシル（０，４５９ｇ；２．４０７ｘｌＯ−’モル） を加える。０℃で１０分後、混合物を室温で撹拌する。薄層クロマトグラフィー （ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ、１　：　１）で分析したところ、いくらかの出発物質 が残っていることを示す。従って、塩化トシル（０，３０６ｇ：１．６ｘｌＯ− ３モル）、ピリジン（０，１２７ｇ：１．６０５ｘｌＯ”’モル）およびＤＭＡ Ｐ　Ｃ０，１９６ｇ：１．６×１０−３モル）を加える。４０時間後、この溶液 をＣＨＣ１３（５０ｍ、ｌ）で希釈し、ＮａＨ２ＰＯ＜ａｑ（２×４０ｍｌ）　 、ＮａＨＣＯ；　（２×４０ｍｌ）、次いでブライン（２×４０ｍｌ）で洗浄し 、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ＜で乾燥する。溶剤を減圧下で蒸発させた後、残留物をシ リカゲルでクロマトグラフィーする（ヘキサン・Ａｃ０Ｅｔ、２　：　１）。化 合物（２８）が無色固体として単離される（０．４２９ｇ；０．６６１ｘｌＯ− ３モル、８２％）。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ！、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ） 　、Ｊ　（Ｈｚ））：　２．１４　（Ｈｚ＜　ｄｄｄ、　２Ｊ−１４，８，３Ｊ ２’イ＝５．６．’Ｊ２’−３’＝９．０）；　２．２２　（Ｈｚ’、ｄｄｄ、 ３Ｊｚ’イ６、　８．　３Ｊ２’−３’＝６．　８）　；　２．　８４　（Ｈ３ Ｃｍ）　：　３．　８５　（Ｈ＜？　ｄｄｄ。

’Ｊ！’−４’−７．０）；　６．０５　（Ｈ＋’：　ｄｄ）、ＭＳ　（ＦＤ、 ｍ／ｅ）：　６４９（Ｍ゛）。

Ｃ９化合物（２９）　、Ｒｇｌが０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ７□ がアシドメチル、モしてＲ１かＨである構造（ｒＶ）。

トシル誘導体（２８）Ｃｏ、４２５ｇ；０．６５５Ｘ１０−’モル）をアルゴン の下でＤＭＦ　（１５ｍｌ）に溶解する。この溶液にＬＩＮｓ　（０，１６ｇ； ３゜２７５Ｘ１０−３モル）およびＭａｒ　（０，１９６ｇ；１．３１Ｘ１０− ’モル）を室温で加える。混合物を１００℃で２０時間撹拌する。反応は薄層ク ロマトグラフィー（ヘキサン　Ａｃ０Ｅ　Ｌ、１３）分析で追跡する。反応が終 わったら、エーテルを加える（１００ｍｌ）。この溶液をブライン（３×５０ｍ ｌ）で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥する。濾過後、残留物をシリカゲル でクロマトグラフイーイーる（ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ、２　：　１）。アシド誘 導体（２９）か無色ガラスとして得られる（０．２６２ｇ；０．５０４ｘｌＯ− ３モル、７７％）。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｈ、　５００ＭＨｚ、δ　（ｐｐｍ ）　、　Ｊ　（Ｈｚ）　）　：　２．　１８　（Ｈｚ’。

ｄｄｄ、”Ｊ＝１４．　３．　”Ｊ２’−３’＝８．　９．　”Ｊ２’イ＝５． 　５）　；　２．　２８　（Ｈ２’。

ｄｄｄ、”Ｊ２′ｉ＝”ｌｚ’−（＝６．５）；　２．６７　ＣＨ（、ｍ）：　 ３．３７　（ＣＨ２−Ｈ５、ｄ、　３Ｊ＝６．３）；　７．４６　（Ｈ６，ｑ、 ’Ｊ＝１．０）、ＭＳ　（ＦＤ、ｍ／ｅ）　：　５２０　（Ｍ”）。

Ｄ、　化合物（３０）　、Ｒ，、か０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、Ｒ２ □がアミノメチル、そしてＲｅ３かＨである構造（ｒＶ）。

アシド誘導体（２９）（０，２４５ｇ；０．４７１Ｘ１０弓モル）をアルゴンの 下でガス抜きしたベンゼン溶液（０，１Ｍ　アルゴン流で３０分間ガス抜きした ）に溶解する。ＡＩＢＮ　（０，００８ｇ；０．０４７１ｘｌＯ−３モル）およ びｎＢｕ３ＳｎＨ（水素化ｎ−トリブチルスズ：０．３４３ｇ：１．１７８Ｘ１ ０−３モル）を室温で加える。混合物を８０℃で７時間加熱する。薄層クロマト グラフィー（ヘキサン　Ａｃ０Ｅｔ、１．：　１）で分析したところ、いくらか の出発物質が反応混合物にまだ存在することを示す。従って、ＡＩＢＮ　（０， ００８ｇ；０．０４７１Ｘ１０′□３モル）を加える。反応混合物をさらに１７ 時間８０℃で加熱する。溶剤を減圧下で蒸発させる。残留物（淡黄色部）をシリ カケルでクロマトグラフィーする（フラッノユークロマトグラフィー、勾配Ａｃ ０Ｅｔ　：ＭｅＯＨ，５０：１−２０：１−１０：１　１％のＮＥｔ３を含有） 。アミン（３０）が無色粉末として単離される（０．１９６ｇ：０．３９７ｘｌ Ｏ−’モル；８４％）、’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐ ｍ）　、Ｊ　（Ｈｚ））２、　２８　（２Ｈ１，ｍ）　；２．　５８　（Ｈ３Ｓ 　ｍ）　；　２．　７０　（Ｃ３’　−ＣＨ、−ＮＲ２，ｄｄ、”Ｊ−４２，２ ，１Ｊ＝８．０）：　２．８２　（Ｃ３′　ＣＨ２−ＮＲ２，ｄｄ、’Ｊ＝５． ４）；６．　１１　（Ｈ，７，ｄｄ、’Ｊ＝５．９）＋７．５４　（Ｈ６，ｑ。

’Ｊ＝１．１）、ＭＳ　（ＦＤ、ｍ／ｅ）：　４９４　（Ｍ”）。

実施例２５ 化合物（４２）の合成、Ｒ，１かＯ−（シメトキノトリチル）、ＲｅノがＯ−（ ２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトライソプロピルホスホアミシ ル）、そしてＲ１，かＨである構造（ＩＶ）。

（Ｖ工） Ａ、　化合物（３ｔ）　、Ｒ，、、ｂ＜ヒトｏ４−シ）１．ｒ、Ｒ１２かＯ−（ ｔ−ブチルジフェニルシリル）、モしてＲ１３がＨである構造（ＩＶ）。

化合物（３１）はほぼＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２３　（２６ ）２６４１−２６４４　（１９８２）に記載の方法に従って製造した。

Ｂ、　化合物（３２）　、Ｒ，、がヒドロキシル、Ｒε２が０−（ｔ−ブチルジ フェニルシリル）、そしてＲｉ３がＣＲ２０ＣＲ２Ｐ　ｈである構造（ｒＶ）。

１５ｍ１の乾燥アセトニトリル中の（３１）　（３，５３ｇ、　７．　４ｍｍｏ ｌ）の撹拌溶液にアルゴンの下で室温にて、ＤＢＵ　（２，２ｍｌ、　１４．　 ８ｍｍｏｌ）　、次いでペンシルクロロメチルエーテル（２，０ｇ、　１２．　 ８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間後、反応混合物を１．５０ｍ１のＣＨ２Ｃ ｌ２で希釈し、そして有機相を２つの２５ｍ１部の１０％水性ＫＨ６ＣＬ、１つ の７０ｍ１部のＲ２０，そして１つの５０ｍ１部のブラインで洗浄した。Ｎ　ａ 　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥した後、有機相を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル でクロマトグラフィーする（勾配へ牛サン　Ａｃ０Ｅ　ｔ）と、保護されたチミ ジン（３２）が白色フオームとして得られた（３゜２１ｇ；７３％）。’　Ｈ− ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，３００ＭＨｚ）　δ　１．０１（９Ｈ，ｓ、３’　−〇’ −５ｉｔＢｕ）、１．７９　（３Ｈ，ｓ、Ｍｅ−５）、４゜６１　（２Ｈ，ｓ、 ０−ＣＨ２Ｐｈ）、５．４０　（２Ｈ，ｓ、−Ｎ−ＣＨ２０）。

Ｃ化合物（３３）　、Ｒ１＋がＣＲ２ＣＨ２（０）ＯＣＨ３、Ｒ６２がＯ−（を −ブチルジフェニルシリル）、そしてＲｏ、がＣＲ２０ＣＲ２Ｐ　ｈである構造 （Ｖ）。

２５ｍ１の乾ｆｉｃＨｚｃｌｚ中の塩化オキサリル（０，６５ｍ１．７．　３ｍ ｍｏｌ）の撹拌溶液にアルゴンの下で一７８°Ｃにて、５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中 の乾燥ＤＭＳ○（１，０５ｍ　ｌ、１４．　６ｍｍｏＬ）の溶液を加えた。添加 は５時間かけて行った。

得られた混合物を一７８°Ｃで１時間撹拌し、２５ｍ１のＣＨ２Ｃｌ□中の化合 物（３２）　（２，９１ｇ、　４．　８４ｍａ＋ｏｌ）を１０分間かけて加えた 。−７８℃で１時間後、乾燥トリエチルアミン（４，１ｍｌ、　２９．　２ｍｍ ｏｌ）を加え、そして反応混合物をＯｏＣに温めた。メトキシカルボニルメチレ ントリフェニルホスホラン（２゜４５ｇ、７　、　２　ｍｍｏｌ）を固体として 加え、そして反応混合物を室温で２時間撹拌した。２００ｍ１のＣＨ，Ｃ１２、 次いで５０ｍ１のＲ２０を加えた。得られた混合物を１０分間撹拌し、そして層 を分離した。有機層を２つの５０ｍ１部のＲ２０、そして１つの５０ｍ１部のブ ラインで洗浄した。有機層をＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、減圧下で濃縮した 。残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（４１ヘキサン　酢酸エチル） と、σ、β−不飽和メチルエステル（３３）（２，９５ｇ１９３％）が得られた 。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，３００ＭＨｚ）δ：０゜８７５　（９Ｈ，ｓ、 ３’　−０５ｉｔＢｕ）、　５．６６　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ−１６Ｈｚ、Ｊ＝１． ５Ｈｚ、Ｈ−６’　）、６．４５　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、Ｈ−１’　）、 ６．４１　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝１６ＨｚおよびＪ−６Ｈｚ）。

Ｄ　化合物（３４）　、Ｒ＝１かＣＨ２ＣＨ２Ｃ（０）ＯＣＨｓ、ＲＢがＯ−（ を−ブチルジフェニルシリル）、そしてＲｗ３かＨである構造（ＩＶ）。

８５ｍ１のＭｅＯＨ中の（３３）　（２，７ｇ、　４．　１ａ＋ａ＋ｏｌ）の激 しく撹拌した溶液を、粉末Ｐ　ｄ／Ｃ１０％（９６０ｍｇ）の存在下、３日間、 室温にて水素の下（大気圧）で水素添加した。反応混合物を５１０２の路に通し て濾過し、フィルターケーキをＭｅＯＨ（〜１００ｍ１）で洗浄した。ｍｇｔを 減圧下で濃縮したところ粗生成物（３４）　（２，１ｇ、９５％）か無色のフオ ームとして得られた。

この物質をさらに精製することなく次の工程に使用した。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ Ｃ１３，３００ＭＨｚ）　δ　Ｌ、８２　（３Ｈ，ｓ、　Ｍｅ−５）、３．　５ ６　（３Ｈ。

ｓ、ＯＭｅ）、６．２５　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、Ｈ−１’　）、６．９２ 　（ＬＨ，ｓ、Ｈ−６）、８．６　（ＬＨ，ｓ　ブロード、Ｎ−Ｈ）。

Ｅ、　化合物（３５）　、Ｒ１，がＣＨ２Ｃ（０）ＯＨ，Ｒ，２かＯ−（ｔ−ブ チルジフェニルシリル）、モしてＲ２３がＨである構造（ＩＶ）。

ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中の粗化合物（３４）　（２，１ｇ、　３．　９ｍｍｏｌ ）の溶液に室温で、ＭｅＯＨ／Ｈ２０（７：　３）中のＫＯＨの２Ｍ溶液４０ｍ １を加えた。

室温で２時間後、溶液をダウエックス５０Ｗｘ５　（Ｆ　１ｕｋａ）でｐＨ４の 酸性にした。次に、懸濁液を濾過し、固体を１５０ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２および５ ０ｍ１のＨ２０で洗浄した。層を分離した。水性層をＣＲ２Ｃ１２で抽出した。

合わせた有機層を５０ｍ１部のＲ２０およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ ２５Ｏ，で乾燥し、減圧下で濃縮して駿（３４）　（１，２７ｇ、８４％）を白 色粉末として得た。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ＋３．３００ＭＨｚ）　δ・１．、 　８２　（３Ｈ，ｓ。

Ｍｅ−５）、３．　９　（ＬＨ，ｍ、　Ｈ−４’　）、６．　２５　（ＬＨ，ｓ 、Ｈ−１，’　）。

６、　９５　（ＩＨ，ｓ、　Ｈ−６）。

Ｆ、　化合物（３６）　、Ｒ，ｌがＯ−（トリチル）、Ｌ２がアジド、そしてＲ ア。

がＨである構造（ｒＶ）。

化合物（３６）をほぼＬｉｎ、ＴおよびＷ、ＰｒｕｓｏｆｆのＪ、　Ｍｅｄ、　 Ｃｈｅｍ、２１　：１０９　（１９７８）に記載の手順に従って製造した。

Ｇ、　化合物（３７）、Ｒ□が０−（トリチル）　、Ｒｅ２がアミノ、そしてＲ ｆ３かＨである構造（■）。

１０．５ｇ　（０，０２モル）部のアシド（３６）を１００ｍ１のジオキサンに 溶解する。０．５ｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加えた後、水素添加を大気圧下、２５℃ で行う。１６時間後濾過し、減圧下で蒸発すると、粗製アミンが得られた。これ をＣＨ２Ｃ１２／ＥｔｚＯで結晶化させた。７．０ｇのアミノ誘導体（３７）が 得られた。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｃＬ）：　１．５０　（ｓ、３Ｈ，ＣＨ ３）、６゜１５　（ｍ、　ＬＨ，Ｈ（Ｌ’　））、　７．５０　（ｓ、　ＬＨ， Ｈ（６））。

Ｈｌ　化合物（３８）　、Ｒ＝＋がｏ−（トリチル）　、Ｒｕが０−（ｔ−ブチ ルジフェニルシリル）、モしてＲｅ３がＨである構造（Ｖｌ）。

乾燥ＣＨｚＣ１ｚ５ｍｌ中の（３５）（３１３ｍｇ、０．６ｍｍｏＬ）およびア ミン（３７）（２８９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物にアルゴンの下で室 温にて、Ｎ、　Ｎ’−ジクロロへキシルカルボジイミド（１４４ｍｇ、０．７ｍ ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ　（３０ｍｇ、０．２５ａｎｏｌ）を加えた。室温で１ ２時間後、混合物を１００ｍ１（７）ＣＨ２Ｃ１ｚで希釈し、２０ｍ１（７）Ｏ ，ＩＮ−ＨＣＬ　３Ｘ２０ｍｌ（７）Ｒ２０および２Ｘ２０ｍｌのブラインで洗 浄した。有機層をＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、減圧下で濃縮して油を得た（ ０．　９５　ｇ）。これをシリカゲルでクロマトグラフィーする（９８２　クロ ロホルム、メタノール）と、二量体（３８）（０，４６ｇ、７８％）が白色フオ ームとして得られた。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ！、３゜ＯＭＨｚ）δ：１．３ ２および１．　８０　（３Ｈ，ｓ、　Ｍｅ−５）　、５．　９６および６．２５ 　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝６Ｈｚ、　Ｈ−１’　）　、　６．５２　（ＬＨ，ｄ、 　Ｊ　−６Ｈｚ、Ｎ−Ｈ（鎖））、６．　９および７．　５　（ＬＨ，ｓ、　Ｈ −６）、９．　１８および９．　３７　（ＩＨ，ｓ　ブロード、Ｎａ−Ｈ）。

■、　化合物（３９）　、Ｒ１，がヒドロキシル、Ｒａ２が。−（ｔ−ブチルジ フェニルシリル）、モしてＲｅ３がＨである構造（ＶＴ）。

酢酸（１，６ｍ１）および水（０，４ｍ１）の混合物中の（３８）（１，０１ｇ 、１．　０２ｍａ＋ｏｌ）の溶液を８０℃で１時間３０分加熱した。次に、溶剤 を減圧下で除去し、残留物をシリカゲルでクロマトグラフィーする（ＣＨ２Ｃ１ □／ＭｅＯＨ／ＥｔｓＮ、９５　：　４　：　１）と、　（３９）　（５９１ｍ ｇ、７８％）が白色フォームトシテ得うレタ。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＨ３，３ ００ＭＨｚ）６　：　１．７６および１．　８２　（３Ｈ，ｓ、　Ｍｅ−５）　 、６．　０２および６．　１０　（１）（、ｄｄ。

Ｊ−６Ｈｚ、　Ｈ−１’　）、６．　９および７．　６　（ＬＨ，ｉｓ、　Ｈ− ６）、７．　０５　（ＬＨ，ｄ　ブロード、ＮＨ（鎖））、９．８２および９． 　９２　（ＬＨ，ｓブロード、Ｎａ−Ｈ）。

Ｊ、　化合物（４０）　、Ｒ５ｂ＜Ｏ−＜シｌ　１４シト＋Ｊｆｔｌｉ）　、Ｒ ｐｚ、６（０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）、そしてＲａ３がＨである横ａ （Ｖｌ）。

ＣＨｚＣ１ｚ２０ｍｌ中の（３９）（８６０ｍｇ、１．１５ａｎｏｌ）の溶液に アルゴンの下で室温にて、ＤＭＡＰ　（２１０ｍｇ、１．７＋ｕｏｌ）およびＥ ｔ３Ｎ（０゜５ｍｌ、３．　５ｍｍｏｌ）　、次いで塩化ジメトキシトリチル（ ５７５ｉｎｇ、１．７ｍｍｏ１）を加えた。１２時間室温で撹拌した後、さらに 塩化ジメトキシトリチル（３００ｍｇ、８．８ｍ＋＋＋ｏＬ）を加えた。室温で ２４時間後、反応混合物をＣＨ２ＣＩ。

（〜１００ｍ１）で希釈し、ブラインで洗浄した。有機層をＮ　ａ　２　Ｓ　０ ４で乾燥し、減圧下で濃縮して油を得た。これをシリカゲルでのクロマトグラフ ィ　（ＣＨ２Ｃ１２／ＭｅＯＨ／ＥｔｓＮ、９４　：　５　：　１）で精製して （４０）（５７５ｍｇ、４８％）を得た。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｉｓ、３００ ＭＨｚ）６　：　１．．４６および１、９２　（３Ｈ，ｓ、　Ｍｅ−５）　、　 ３．８８　（６Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）　、６．１３および６．　４　（ＩＨ，ｓ、 　Ｈ−１’　）、７．　０７　（ＬＨ，ｓ、　Ｈ６）　、９．　５および９．　 ６　（ＬＨ，ｓ　ブロード、Ｎｓ　Ｈ）。

Ｋ、　化合物（４１）、Ｒ１，ｌがＯ−（ジメトキシトリチル）、Ｒ７□がヒド ロキシル、そしてＲｅ３がＨである構造（Ｖｌ）。

３ｍ１ｃ７）ＴＨＦ中（７）（４０）（４０５ｍｇＳ０．３９ａｎｏｌ）（Ｄ溶 液に室ａ−Ｃ−１弗化テトラーｎ−ブチルアンモニウム（１４１ｍｇｓ　ｏ、５ ｍｍｏｌ）を固体として一度に加えた。室温で３時間後、溶剤を減圧下で除去し 、残留物をシリカゲルでのクロマトグラフィー（（Ｒ２Ｃ１ｔ／　Ｅ　ｔ　ｓＮ ／メタノール、９３：１：６）で精製して（４１）（３１０ｍｇ、１００％）を 白色７１−４として得た。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，３００ＭＨｚ）δ・１． ２１および１．　７３　（３Ｈ，ｓ。

Ｍｅ−５）、３．６４　（６Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）　、６．００および６．　２２　 （３Ｈ。

ｄｄ、Ｊ−６Ｈｚ、　Ｈ−１’　）、７．　２５および７．　５５　（ＬＨ，ｓ 、　Ｈ−６）。

Ｌ、　化合物（４２）　、Ｒ，、ｂ＜Ｏ−（ジメトキシトリチ／Ｌ／）　、　Ｒ ＰＺが。−（２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’　−テトライソプ ロピルホスホアミシル）、そしてＲ６がＨである構造（■）。

シイソプロビルアンモニウムテトラプライド含有乾燥Ｃ）（２ＣＩ□５ｍｌ中の （４１）（３１０ｍｇ、０．３９關ｏ１）の撹拌溶液にアルゴンの下で室温にて 、２−ノアノエチルーＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトライソプロビルホスホアン アミダイト（０，１８０ｍ１．０　、　６　ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１３時 間後、反応混合物を１００ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ＮａＨＣＯ３の５％水 溶液、Ｒ２０およびブラインで洗浄した。Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥した後、 溶剤を減圧下で除去した。粗製油をシリカケルでのクロマトグラフィー（ＣＨ２ Ｃ１ｚ／Ｎ〜メチルモルポリン／メタノール、９８：１：１）で精製して（４２ ）（２８５ｍｇ１７４％）を得た［これを１５０ｍ１の乾燥ベンセンと共に３回 蒸発させると白色フオームが得られた］。

’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，１００ＭＨｚ）６　：１４８．６５８および１４ ８゜化合物（４８）の合成、Ｒ！１がＣ（０）ＯＨ，Ｒヒノが。−（ｔ−ブチル ジメチルシリル）、そしてＲａ３がＨである構造（ＩＶ）。

Ａ、　化合物（４３）、Ｒ１１がアミノメチル、Ｒと２がヒドロキシルそしてＲ Ｉ！３かＨである構造（ＩＶ）。

化合物（４３）はほぼＣｈｅｍ、Ｃｏｍｍ、　、ｐ、４２２　（１９６８）に記 載の手順に従って製造した。

Ｂ、　化合物（４４）　、Ｒ＝＋がアミノメチル、Ｒ１２が。−（ｔ−ブチルジ メチルシリル）、モしてＲｏがＨである構造（ＩＶ）。

乾燥ＤＭＦ１０ｍｌおよび乾燥ＣＨ２Ｃｌ□５ｍｌ中の粗製アミノアルコール（ ４３）　（１，４０ｇ、　５．　５ａｕ＋＋ｏｌ）の混合物にアルゴンの下で室 温にて、イミダゾール（５２０ｍｇ、７．６ｍｍｏｌ）およびｔ−プチルシメチ ルクｏｏシラ：ｚ　（１゜０８ｇ、７．　２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合 物を室温で８時間撹拌し、さらに試薬を加えた　イミダゾール（２１０ｍｇ、　 ３．　１ａ１１１１０１）　；　ｔ−プチルシメチルクＤｏシラン（４２０ｍｇ 、２．　８ａ＋ｍｏｌ）　、　３２時間後、溶剤を高真空（−１０−２ｍｍＨｇ 、４５°Ｃ）下で除去した。ｍ製固体をシリカゲルで精製して（ＣＨ２Ｃｌ　２ ／Ｍ　ｅ　ＯＨ／　Ｅ　ｔ　ｓ　Ｎ）でＭ製して（４４）（１，７０ｇ、８３％ ）を淡黄色フオームとシテ得た。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，３００ＭＨｚ） ６　：　０．００　（６Ｈ，ｓ、３’　−Ｏ５ｉＭｅ、）　；０．　８１　（９ Ｈ，ｓ、３’　−０’　５ｉｔＢｕｔｙｌ）；１．７５　（２Ｈ，ｍ、Ｈ−５’ 　）；１．９７　（３Ｈ，ｓ、Ｍｅ−Ｔ）；２．１５　（２Ｈ，ｍ、Ｈ−２’） ；３．４０（２Ｈ，ｍ、Ｈ−６’）：３゜７４　（ＬＨ，ｍ、Ｈ−４’　）；　 ４．０５　（ＬＨ，ｍ、Ｈ−３’　）；　６．０７　（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝６．５Ｈ ｚ、Ｈ−４’　）；　７．０６　（ＬＨ，ｓ、Ｈ−６）；　８．ＬＯ（ＬＨ，ｓ 、Ｎ−Ｈ）。

Ｃ０化合物（４５）、Ｒａ１がＣＨ＝ＣＨ２、Ｒａ２か０−（ｔ−ブチルジメチ ルシリル）、そしてＲｅ３がＣＨｚＯＣＨｚＰｈである構造（ＩＶ）。

乾燥ＣＨ２Ｃ１２４５ｍ１中の塩化オキサリル（２，２ｍｌ、２５ａｎｏｌ）の 撹拌溶液に、アルゴンの下で一７８℃にてＣＨ２ＣｌｚｌＳｍｌ中の乾燥ＤＭＳ Ｏ（３゜６ｍｌ、５０ｍｔｒｏＬンの溶液を５分かけて加えた。−７８℃で１時 間撹拌した後、５０ｍ１のＣＨ２Ｃ１Ｚ中の実施例２５Ａ−Ｂに従って製造した 化合物（３２）（１０ｇ１１０．６４關ｏｆ）の溶液を加えた。−７８℃で４５ 分後、乾燥トリエチルアミン（１４，８ｍｌ、０．　１　ｍｏｌ）を５分かけて 加え、そして反応混合物を１時間かけて一３０℃に温めた。この溶液に一７８° Ｃでメチレントリフェニルホスホランの溶液を加えた。このメチレントリフェニ ルホスホランの溶液は、ヘキサン（６２，５ｍｌ　０．　１ｍｏＬ）中の１．６ Ｎのｎ−ブチルリチウムを１５０ｍ１中の乾燥ＴＨＦ中の臭化メチルトリフェニ ルホスホニウム（３５，７ｇ、０゜１　ｍｏｌ）の撹拌スラリー溶液に一７８° Ｃで加え、続いて室温で２時間撹拌することによって製造したものである。得ら れた混合物を室温に温め、２時間撹拌した。

次に、１００ｍ１のＲ２０を加え、混合物を減圧下で約１５０ｍ１に濃縮し、３ ００ｍ１のエーテルで希釈した。有機層を水およびブラインで洗浄し、硫酸ナト リウムで乾燥した。溶剤を除去すると油が得られた。これをシリカでクロマトグ ラフィーする（ヘキサン−酢酸エチル　４１）ことによって精製すると化合物（ ４５）（３，５５ｇ、３５％）が得られた。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，３０ ０ＭＨｚ）δ　１．　０２　（９Ｈ，ｓ、３’　−０５ｉ　ｔＢｕ）　；　１． 　８０　（３１−Ｉ。

ｓ、　Ｍｅ−５）　：　４．　６２　（２Ｈ，ｓ、Ｐｈ−ＣＨｚ−ＯＨ）　：　 ５．　５　（ＬＨ。

ｍ、Ｈ−５’）　；６．　３２　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝６．　０　Ｈｚ、Ｈ−１’ 　）　；６゜９５　（１ト１．ｓ、Ｈ−８）　。

Ｄ　化合物（４６）　、Ｒｐｌかヒドロキシメチル、ＲＦ２が０−（ｔ−ブチル ジメチルシリル）、そしてＲ１かＣＨ２０ＣＨ２Ｐｈである構造（ＩＶ）。

アルゴン雰囲気の下で０°Ｃに冷却した乾燥ＴＨＦＳｍｌ中の化合物（４５）（ ２５２ｍｇ、０．４２ｍｍｏ１．）の撹拌溶液に、ＴＨＦ中の０．　２５ｍ　１ ．　（２，５ｍａ＋ｏｌ）のＩＯＭボランンメチルスルフィド複合体を加えた。

０℃で２時間後、４ｍｌの２Ｎ−ＮａＱ）（水溶液および１ｍｌの３０％Ｈ２０ □水溶液を徐々に連続的に同時添加することによって混合物を急冷した。反応混 合物を１０分間室温に温め、５０ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２て希釈し、そしてＲ２０お よびブラインで洗浄した。乾燥（ＭｇｓＯＪ後、有機相を減圧下で濃縮した。残 留物をシリカゲルでクロマトグラフィーすると（ヘキサン−酢酸エチル、２１な いし１１〕化合物（４６）（１８６ｍｇ、７２％）か無色の油として得られた。

’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３．３００ＭＨｚ　）δ　］−，０１（９Ｈ，ｓ、３ ’　−０３ｉ　ｔＢｕ）、１．８０　（３Ｈ。

ｓ、　Ｍｅ−５）　、３．　５１　（２Ｈ，ｍ、ＣＨ２−６’　）、５．　４１ 　（２Ｈ，ｓ。

０−ＣＨ２Ｎ）　、６．　２７　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、　ＨＬ’　）、６ ．　８７（ＬＨ，ｓ、　Ｈ−６）。

Ｅ、　化合物（４６）　、Ｒ，ｌかヒドロキシメチル、Ｒｅ２がＯ−（ｔ−ブチ ルジメチルシリル）、モしてＲｉ　３かＨである構造（ＩＶ）。

３７ｍ１のＭｅＯＨ中の化合物（４６）（１，０３ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）の激 しく撹拌した溶液を粉末Ｐｄ／Ｃ１０％（５２０ｍｇ）の存在下で３日間、室温 にて水素添加した（大気圧）。反応混合物をシリカケルの路に通して濾過した。

固体をＭｅＯＨ（１００ｍｌ）で洗浄した。濾液にＫＯＨ（〜２００ｍｇ、３． ６ｍｍｏ１．）を加え、得られた溶液を１時間室温で撹拌した。溶液を減圧下で 約２０ｍ１に１縮し、ＣＨ７Ｃ１２（１００ｍｌ）で希釈し、有機相をＲ７０お よびブラインで洗浄した。乾燥（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＋　）後、溶剤を減圧下で除去 して化合物（４７）（７４２ｍｇ、９０％）を得た。この物置をさらに精製する ことなく次の工程に使用した。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ＋、３００ＭＨｚ）　 δ　０．　９４　（９Ｈ，ｓ。

３’−０５ｉｔＢｕ）、Ｌ、７３　（ｓ、３Ｈ，Ｍｅ−５）、３．４５　（２Ｈ ，ｍ。

ＣＨ７６’　）、６．　１７　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝６．　５１（ｚ、ＨＬ’　） 、６．　８５　（ＬＨ，ｓ、Ｈ−６）。

Ｆ、　化合物（４８）　、Ｒ，、かＣ（０）ＯＨ，Ｒ１２か０−（ｔ−ブチルジ メチルシリル）、そしてＲ１３かＨである構造（ｒＶ）。

５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の化合物（４７）（７１，０ｍｇ、１．　５０１１１０１ ）の激しく撹拌した溶液にアルゴンの下、室温でピリジニウムシクロメート（Ｐ ＤＣ）（１゜５　ｇ　ｓ　４　ｍｍｏｌ）を加えた。１４時間後、褐色溶液を３ ５ｍ１のＥｔＯＡｃで希釈し、５分間撹拌した。懸濁液をシリカゲルの路に通し て濾過し、固体を７５ｍ１のＥｔＯＡｃで洗浄した。溶剤を除去し、残留物をシ リカゲルでクロマトグラフィーする（酢酸エチル−メタノール　９５５）と酸（ ４８）が得られた。ｌ）（−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ！、３００ＭＨｚ）δ：１．０９ 　（９Ｈ，ｓ、３’、−０３ｉｔＢｕ）、１．　８３　（３Ｈ，ｓ、　Ｍｅ−５ ）、２．　３８　（２Ｈ，ｍ、ＣＨｚ−５’　）、６．　３２　（ＬＨ，ｄｄ、 Ｊ＝６．　５Ｈｚ、　Ｈ−１’　）、７．　２３　（ＬＨ，ｓ。

Ｈ−６）。

実施例２７ （５０）の合成、ＲＨがＣＨ２Ｃ（０）ＣＨ３、ＲｅｚがＯ−（ｔ−−ｊ−ｆ− ルシ）ｆルシリル）、そしてＲｅ３かＣＲ２０ＣＲ２Ｐ　ｈである構造（ＩＶ） 。

Ａ、　化合物（４９）　、Ｒ，ｌがＣＨ−（Ｌ　３−ジチアン−２−イル）、Ｒ ８□が０−（ｔ−ブチルメチルシリル）、そしてＲＨ３がＣＲ２０ＣＲ２Ｐ　ｈ である構造（ＩＶ）。

４５ｍ１の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の塩化オキサリル（２，２ｍｌ、　２５ａ＋ｍｏ ｌ）の撹拌溶液にアルゴンの下、−７８℃で、１５ｍ１のＣＨ２Ｃ１Ｚ中の乾燥 ＤＭＳＯ（３、６ｍＬ　５０＋ｕｏｌ）の溶液を５分かけて加えた。−７８℃で １時間撹拌した後、５０ｍ１のＣＨ２Ｃ：１２中の化合物（３２）（１０ｇ、１ ０．６４ａ＋＠ｏｌ）の溶液を２０分かけて加えた。−７８℃で４５分後、乾燥 トリエチルアミン（１４，８ｍ１、　０．　１＋ｏｌ）を５分かけて加え、反応 混合物を１時間かけて一３０℃に温めた。この溶液に一７８℃で、ホスホニウム イリドの溶液［トルエン（８５ｍｌ。

４２、　２ｍｍｏｌ）中の０．５Ｎカリウムビス（トリメチルシリル）アミドを 、１３ニウム（１６ｇ、３８．　４ｍｍｏｌ）の撹拌スラリー溶液を加え、次い で３時間室温で撹拌することによって製造した］を加えた。得られた混合物を室 温に温め、２時間撹拌した。その後、３００ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２および１００ｍ １のＲ２０を加えた。混合物を１０分間撹拌し、そして層を分離した。水性層を ２００ｍ１部のＣＨ２Ｃｌ２で１回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄 し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカケルでクロマトグ ラフィーする（ヘキサン−ＥｔＯＡＣ）ことによって精製して化合物（４９）（ １０，１ｇ、８７％）を得た。ＭＳ　（ＦＤ：ｍ／ｅ）：　７０１　（Ｍ”）。

Ｂ、　化合物（５０）、Ｒ８１がＣＨ２Ｃ（０）○ＣＨ３、Ｒ９２がＯ−（ｔ− ブチルメチルシリル）、そしてＲｅ３がＣＨ２０ＣＨ２Ｐ　ｈである構造（ＩＶ ）。

（ＭｅＯＨ：　Ｒ２０）（９：　１　：　５０ｍ１）中の（４９）（１，３ｇ、 １．８５１１１ｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴンの下での還流下で塩化第二水銀 （２，９ｇ、　１０、　７ｍｍｏｌ）を加えた。４０分後、反応混合物を室温に 冷却し、塩を濾過し、母液を減圧下で濃縮し、残留物を１００ｍ１のＣＨ２Ｃ１ ２で希釈した。有機層を各３０ｍ１部のＲ２０で２回および３０ｍ１部のブライ ンで１回洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥した後、溶剤を除去し、残留物をシリカゲ ルでクロマトグラフィーする（ヘキサン−酢酸エチル、７３）ことによって精製 して化合物（５０）を得た。’　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，３００ＭＨｚ）６１ ．　０２　（９Ｈ，ｓ、３’−０３ｉｔＢｕ）、１．８０　（３Ｈ，ｓ、Ｍｅ− ５）、２．２８　（２Ｈ，ｍ、ＣＨ２−５’　）、３．　５２　（３Ｈ，ｓ、　 Ｍｅ−５）　、５．　４１　（２Ｈ，ｓ、　０−ＣＨ２Ｎ）、６．　２９　（Ｉ Ｈ，ｄｄ、Ｊ−６，５Ｈｚ、　Ｈ１’　）、７．　０３　（ＬＨ，Ｈ−６）。

評価 方法１　ハイブリダイゼーション分析 本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはオリゴヌクレ オシドの、相補的核酸に結合する相対的能力は、特定のハイブリダイゼーション 複合体の融点を決定することにより比較することができる。融点（Ｔｍ）は、２ 本鎖ＲＮＡの物理的性質であり、５０％のヘリックス形対コイル（ハイブリダイ ゼーションしていない）形が存在する温度を℃で表わしたものである。Ｔｍは、 ＵＶスペクトルを用いて、ハイブリダイゼーションの形成と分解（溶融）を決定 することにより測定する。ハイブリダイゼーションの間に生ずるベーススタッキ ングは、ＵＶ吸収の減少を伴う（淡色性（ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ））。

したがって、ＵＶ吸収の減少は、より高いＴｍを示す。Ｔｍが高いほど、鎖の結 合強度が大きくなる。非ワトラン・クリック塩基対は、Ｔｍに対して強い不安定 化効果を有している。したがって、標的ＲＮＡに対するアンチセンス・オリゴヌ クレオチドまたはオリゴヌクレオシドの最適な結合を得るためには、塩基対の絶 対的正確性が必要である。

Ａ、オリゴヌクレオチド類似体のハイブリダイゼーションの熱力学の評価本発明 のオリゴヌクレオチド類似体が、これらに相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ配列にハ イブリダイズする能力は、熱溶融分析により決定することができる。ＲＮＡ相補 鎖は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび、核酸合成器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）により合成されたテンプレート・プロモータＤＮＡか ら合成する。ＲＮＡ種は、ＦＰＬＣ（ＬＫＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｉｎｃ）を用いてイオン交換により精製する。アンチセンス・オリゴヌクレオチ ド類似体を化学量論的濃度でＲＮＡまたはＤＮＡ相補鎖に加え、２本鎖からラン ダムコイルへの転移における吸収（２６０ｎｍ）深色性（ｈｙｐｅ　ｒ　ｃｈ　 ｒ。

ｍ１ｃｉｔｙ）を、分光光度計（Ｇｉ　ｌ　ｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ＩＩ ）を用いてモニターする。これらの測定は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７ ，４）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．１Ｍまたは０．１Ｍのイオン強度を 得るためのＮａＣ１の緩衝液中で実施する。データは、Ｌ／Ｔｍ対Ｉｎ［Ｃｔ］ （ここでＣｔは全オリゴヌクレオチド濃度）を表わすグラフにより分析すること ができる。

この分析から熱力学パラメータを決定する。形成されたヘテロ２本鎖の２本鎖の 安定性に関して得られた情報に基づき、オリゴヌクレオチド類似体中への修飾結 合の配置を、その螺旋安定性に対する効果について評価する。ハイブリッドの安 定性を著しく変化させる修飾は、自由エネルギー（デルタＧ）の減少を示し、こ れらの修飾の、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとしての有用性に関する決定 を行う。

Ｂ６　オリゴヌクレオチド類似体のハイブリダイゼーションの正確性本発明のア ンチセンス・オリゴヌクレオチド類似体の、絶対的特異性をもって標的ｍＲＮＡ とハイブリダイズする能力は、全細胞ＲＮＡの存在下における精製標的ｍＲＮＡ のノーザンプロット分析により示すことができる。標的ｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼプロモーターの下流に配置された標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡを含むベ クターから合成する。合成したｍＲＮＡをアガロースゲル中で電気泳動し、適当 な支持膜にトロセルロース等）に転移させる。この支持膜をブロッキングして、 ３２ｐ−標識したオリゴヌクレオチド類似体をプローブとして用いる。

ストリンジエンシーは、プロットを繰り返し、より高い温度において、またはよ り低いイオン強度の洗浄緩衝液により洗浄することにより決定する。ヘテロ２本 鎖の形成の存在を評価するためにオートラジオグラフィーを行い、オートラジオ グラムをレーザー密度計（ＬＫＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、）により定 量化する。全細胞ＲＮＡを標準的方法により単離し、アガロース電気泳動、膜転 移、および標識したオリゴヌクレオチド類似体をプローブとして用いて分析する ことにより、ハイブリッド形成の特異性を決定する。ストリンジエンシーは修飾 していないアンチセンス・オリゴヌクレオチドについてあらかじめ決定し、特異 的に標的とするｍＲＮＡのみがオリゴヌクレオチド類似体とへテロ２本鎖を形成 しうる条件を用いる。

方法２　ヌクレアーゼ耐性 Ａ、血清および細胞質ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド類似体の耐性の 評価 血清ヌクレアーゼに対する本発明のオリゴヌクレオチド類似体の耐性は、このオ リゴヌクレオチド類似体を種々の濃度のウシ胎児血清またはヒト成人血清を含む 培養液中でインキュベートすることにより評価することかできる。！したオリゴ ヌクレオチド類似体を種々の時間インキュへ−１−Ｌ、プロテアーゼにで処理し 、次に２０％ポリアクリルアミド尿素変性ゲルにおける電気泳動、およびそれに 続くオートラジオグラフィーによって分析する。オートラジオグラムをレーザー 密度計で定量化する。修飾結合の位置および既知のオリゴヌクレオチドの長さに 基づいて、特定の修飾がヌクレアーゼ分解に及ぼす影響を決定することができる 。細胞質ヌクレアーゼについては、ＨＬ６０細胞株を用いることができる。ポス ト・ミトコンドリア上清を密度差遠心分離により調製し、ａ！したオリゴヌクレ オチド類似体をこの上清中で種々の時間インキュベートする。インキュベ−！・ の後、血清核酸溶解分解について上述したように、分解についてオリゴヌクレオ チド類似体を評価する。オートラジオグラフィーの結果を、未修飾と本発明のオ リゴヌクレオチド類似体との比較のために定量化する。

Ｂ、特定のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレ オチド類似体の耐性の評価 天然のオリゴヌクレオチドおよび本発明のオリゴヌクレオチド類似体の、特定の ヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ、３′、５°−エキソヌクレアーゼおよび５ °、３°−エキソヌクレアーゼ）に対する耐性の評価を行い、修飾結合の分解に 対する実際の効果を決定することができる。オリゴヌクレオチド類似体を、種々 の選択されたヌクレアーゼに特異的な限定された反応緩衝液中でインキュベート する。生成物をプロテアーゼにて処理した後、尿素を加え、尿素を含む２０％ポ リアクリルアミドゲルによる分析を実施する。ゲル生成物をステインズオール試 薬（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ　ｌ　Ｃｏ、）で染色して可視化する。レー ザー密度計を用いて分解の程度を定量化する。特定のヌクレアーゼについて、修 飾結合の効果を決定し、血清および細胞貫系から得られた結果と比較する。

方法３５−リポキシゲナーセ分析、治療およびアッセイＡ、治療 治療に用いるためには、５−リポキシゲナーゼの過剰なまたは異常な供給により 特徴づけられる疾患を有すると疑われる動物を、本発明に従ってオリゴヌクレオ チド類似体を投与することにより処置する。当業者は、最適な投与量、投与方法 および反復速魔を容易に決定することかできる。このような処置は一般に、治癒 がなされるかまたは疾患状態の減縮が達成されるまで続けられる。いくつかの疾 壱については、同様に長期処！か行われる。

Ｂ、研究バエ 本発明のオリゴヌクレオチド類似体はまた、粗細胞ライセード中、または部分的 にまたは完全に精製されたＲＮＡ調製物中の、５−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを 切断あるいは調節するために用いられる場合、研究バエ用としても有用である。

この本発明の応用は、例えば細胞を標準的方法により溶解し、最適にＲＮＡを抽 出し、次にこれを緩衝液（例えば５０ｍＭＩＪン酸塩、ｐＨ約４〜約１０）中の 、例えば約１００〜約５００ｎｇ／１０ｍｇ全ＲＮＡの濃度の組成物を用いて、 約り０℃〜約５０°Ｃの温度において処理することにより行うことができる。切 断された５−リポキシゲナーゼＲＮＡは、アガロースゲル電気泳動および放射性 標識されたＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション、あるいはその他の 標準的な方法により分析することができる。

Ｃ診断 本発明のオリゴヌクレオチド類似体はまた、診断への応用において、特に種々の 組織における特定のｍＲＮＡ種の発現、あるいは異常または変異ＲＮＡ種の発現 の決定にも有用である。この例においては、オリゴヌクレオチド類似体は、異常 ム配列に相補的なように設計することによって、仮想の異常ｍＲＮＡを標的とす るか、正常ｍＲＮＡにはハイブリダイズせずこれを切断しない。

ＩＩＩ織標本をホモジナイズし、標準的な方法に従ってＲＮＡを抽出することか できる。粗ホモジネートまたは抽出物を処理して、例えば標的ＲＮＡを切断する ことかできる。次に、この生成物を、切断部位の５′側の領域に相補的なオリゴ ヌクレオチドか結合されている固体支持体にハイブリダイズさせることかできる 。

正常および異常のｍＲＮＡの５゛領域はいずれも固体支持体に結合する。異常Ｒ ＮＡの３°領域は、本発明の化合物により切断されて、支持体に結合しないため 、正常ＲＮＡから分離される。

調節のための標的ｍＲＮＡ種は、５−リポキシゲナーゼに関係するものである。

しかし、当業者は、本発明がそのように制限されるものではなく、一般的に適用 しうろことを理解するであろう。５−リポキシゲナーゼ酵素の生成の阻害または 調節は、疾患の治療において顕著な治療の利益を有すると予想される。この組成 物の有効性を評価するために、１つまたは一連のアッセイが必要である。

Ｄ、インビトロアッセイ ５−リポキシゲナーゼの細胞性アッセイは、好ましくはヒト前骨髄性白血病細胞 株ＨＬ−６０を用いて行う。これらの細胞は、種々の既知の試薬により誘導して 単球様細胞または好中球様細胞に分化させることができる。細胞を１．３％ジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理することは、細胞の好中球への分化を促進 することが知られている。現在、基底Ｈ−６０細胞が検出可能なレベルの５−リ ポキシゲナーゼ蛋白質を合成しないか、またはロイコトリエン（５−リポキシゲ ナーゼの下流生成物）を分泌しないことが知られている。ＤＭＳＯによる細胞の 分化は、ＤＭＳＯの添加から４８時間後に５−リポキシゲナーゼ蛋白質の出現と ロイコトリエン生合成を引き起こす。したがって、５−リポキシゲナーゼ蛋白質 合成の誘導は、これらの細胞において５−リポキシゲナーゼ合成を阻害するアン チセンス・オリゴヌクレオチド類似体の分析のための試験システムとして利用す ることができる。

アンチセンス・オリゴヌクレオチドの第２の試験システムは、５−リポキシゲナ ーゼが「自殺」酵素である、すなわち、酵素が基質と反応することによってそれ 自身を不活性化するという事実を利用するものである。分化したＨＬ−６０また は５−リポキシゲナーゼを発現するその他の細胞を、１０ｐＭのＡ２３１８７（ カルシウム・イオノフオア）によって処理することは、５−リポキシゲナーゼの サイドシルから膜への移動およびそれに続く酵素の活性化を促進する。活性化お よび何回かのｌ！！ｌ！媒作用の優、酵素は釉媒的に不活性化する。したがって 、カル／ラム・イオノフオアによる細胞の処理は、内因性５−リポキシゲナーゼ を不活性化する。ロイコトリエンＢ、の合成能力により測定したところ、細胞が Ａ２３ｌ−８７処理から回復するためには約２４時間を要する。５−リポキシゲ ナーゼに対するオリゴヌクレオチド類似体は、以下の定量的なアッセイを用いて 、２つのＨＬ−６０モデル系において活性を測定することかできる。これらのア ッセイは、生きた細胞における５−リポキシゲナーゼ活性の測定等の、より下流 の事象と比へて、生きた細胞における５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の阻害の 最も直接的な測定である。

生きた細胞においてオリゴヌクレオチド類似体が及ぼすことができ、容易に定量 化しうる最も直接的な効果は、５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の特異的な阻害 である。この方法を実施するためには、細胞を３５Ｓ−メチオニン（５０μＣｉ ／　ｍ　Ｌ　）で３７℃において２時間標識し、新たに合成された蛋白質を標識 する。

細胞を抽出して全細胞蛋白質を可溶化し、５−リポキシゲナーゼ抗体で５−リポ キシゲナーゼを免疫沈降させ、次にプロティンＡセファロースビーズから溶出す る。免疫沈降した蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離 し、オートラジオグラフィーのために感光を行う。免疫沈降した５−リポキシゲ ナーゼの量を走査密廖計で定量化する。

これらの実験の結果は次のとおりである。対照細胞から免疫沈降された５−リポ キシゲナーゼ蛋白質の量を１００％として標準とする。細胞を１μＭ、１０μＭ および３０μＭの有効なオリゴヌクレオチド類似体によって４８時間処理すると 、免疫沈降された５−リポキシゲナーゼはそれぞれ標準の５％、２５％および７ ５％減少する。

細胞ホモジネートにおける５−リポキシゲナーゼ酵素活性の測定もまた、ロイコ トリエンを合成しうる酵素の存在量を定量化するために用いることができる。

現在、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて細胞ホモジネート中の５−リポキシゲナーゼ酵 素を定量化するための放射測定法が開発されている。細胞をプロテアーゼ阻害剤 およびＥＤＴＡを含む緩衝液中で超音波処理により破壊する。細胞ホモジネート を１０．０００ｘｇで３０分間遠心分離し、上清を５−リポキシゲナーゼ活性に つぃ特表十６−５０３８３８　（２４） でアッセイする。サイドシル蛋白質を１０μＭのｌ＋ｃ−アラキドン酸、２ｍＭ ＡＴＰ、５０μＭ遊離カルシウム、１００μｇ；７ｍｌホスファチジルコリン、 および５０ｍＭｂ　ｉ　５−Ｔｒ　ｉ　ｓ緩衝Ｍ（ｐＨ７，０）とともに３７℃ において５分間インキュベートする。等量のアセトンを加えることにより反応を 停止させ、酢酸エチルで脂肪酸を抽出する。基質と反応生成物をツバパックＣ１ ８カラム（Ｗａｔｅｒｓ　ｆｎｃ、、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて逆相Ｈ ＰＬＣにより分離する。ラジオクロマトグラフィー検出機（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｍ ｏｄｅ　１１７１）により、放射活性を有するピークを検出する。シーＨＥＴＥ およびモノ−ＨＥＴＥに転換されたアラキドン酸の量を５−リポキシゲナーゼ活 性の測定値として用いる。

ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞を、有効なオリゴヌクレオチド類似体で１μＭ１１ ０μＭおよび３０μＭの濃度において処理した結果は以下のとおりである。対照 細胞は２００μｍｏ１１５分／細胞１０６個のアラキドン酸を酸化する。１μＭ 、１０μＭおよび３０μＭの有効なオリゴヌクレオチド類似体で処理した細胞は 、それぞれ１９５μｍｏ　ｌ、１４０μｍｏ　ｌおよび６０ｐｍｏ１１５分／細 胞１０６個のアラキドン酸を酸化する。

細胞中の全５一リポキシゲナーゼ蛋白貫の測定のための定量的競合酵素免疫アッ セイ（ＥＬＩＳＡ）が開発されている。大腸菌で発現させ、抽出、Ｑ−セファロ ース、ヒドロキシアパタイトおよび逆相ＨＰＬＣにより精製したヒト５−リポキ シゲナーゼを標準として、およびマイクロタイタープレートの被国のための第１ 抗体として用いる。２５％ｇの精製５−リポキシゲナーゼを４°Ｃで一晩マイク ロタイタープレートに結合させる。ウェルを２０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ緩衝 液（ｐＨ７４）および１５０ｍＭＮａＣｌ　（ＴＢＳ）で希釈した５％ヤギ血清 で９０分間彼フナる。細胞抽出物（０，２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１２， ０００×ｇ、３０分間）または精製５−リポキシゲナーゼを、全量１００μＬの １４０００希釈抗５−リポキシゲナーゼポリクローナル抗体とともに、マイクロ タイターのウェル中で９０分間インキュベートする。抗体は、精製ヒト組み換え ５−リポキンゲナーセでウサギを免疫して調製する。ウェルを０．０５％ｔｗｅ ｅｎ２０を含むＴＢＳ　（ＴＢＳＴ）で洗浄し、次に１００μＬのｔ　：　ｔｏ ｏｏ希釈ベルオキシダーセ結合抗ウサギつｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ ｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ）とともに２５°Ｃにおいて６０分間インキ ュベートする。ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、テトラメチルベンジジンで発色させ てベルオキシダー上ｆｆ１ｍ第２抗体の量を決定する。

１μＭ、１０μＭおよび３０μＭの３０塩基のオリゴヌクレオチド類似体を用い たそのようなアッセイの結果は、それぞれ細胞１０６個につき５−リポキシゲナ ーゼか３０％ｇ、１８％ｇおよび５ｎｇであり、処理していない細胞は約３４ｎ ｇの５−リポキシゲナーゼを含む。

５−リポキシゲナーセ生合成の阻害の正味の効果は、刺激された細胞から放出さ れたロイコｌ−’ＩＪエンの量の減少である。ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞は、 カルシウム・イオノフオアＡ２３１８７による刺激によりロイコトリエンＢ４を 放出する。細胞培養液に放出されたロイコトリエンは、商業的に入手可能な診断 キット（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を 用いて、ラジオイムノアッセイにより定量することができる。ＨＬ−６０細胞に おけるロイコトリエンＢ４の産生は、ＤＭＳＯを添加して細胞を好中球様細胞に 分化させてから４８時間後に検出することができる。細胞（２Ｘ　１０５１１１ ／ｍ　Ｌ）を１３％のＤＭＳＯの存在下で、増加する濃度のオリゴヌクレオチド 類似体で４８−７２時間処理する。細胞を洗浄し、１％脱脂ウシ血清アルブミン を含むダルベコリン酸緩衝液生理食塩水中に、２Ｘ１０’個／ｍＬの濃度で再懸 濁する。

細胞を１０μＭカルシウム・イオノフオアＡ２３１８７で１５分間刺激し、５Ｘ １０５個の細胞から産生されたＬＴＢ４の量を、製造者の記述にしたがってラジ オイムノアッセイにより決定する。

このアッセイを用いて、５−ＬＯｍＲＮＡに対する、修飾された結合を含む１５ 塩基のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧ） について得られる結果は以下のとおりである。細胞を１μＭ、１０μＭまたは３ ０μＭのオリゴヌクレオチド類似体とともに、１．３％ＤＭＳＯの存在下で７２ 時間処理する。５ｘｔｏ５ａの細胞から産生されるＬ　Ｔ　Ｂ　４の量は、それ ぞれ約７５ｐｇ、５０ｐｇおよび３５ｐｇであり、未処理の分化細胞は７５ｐｇ のＬ　Ｔ　Ｂ、を産生する。

Ｅ、インビボアッセイ マウスにおける５−リポキシゲナーセ産生の阻害は、以下の方法にしたがって示 すことかできる。アラキドン酸を局所投与することにより、ロイコトリエンＢ４ 、ロイコトリエンＣ１およびプロスタグランジンＥ２が皮膚において速やかに生 成し、続いて浮腫および細胞性浸潤が生じる。５−リポキシゲナーゼのある種の 阻害剤かこのアッセイにおいて活性を示すことが知られている。このアッセイの ために、２ｍｇのアラキドン酸をマウスの耳に適用し、反対側の耳を対照とする 。

アラキドン酸投与から１時間後の生検試料から得たホモジネート中のミエロペル オキシダーゼ活性により多形核細胞浸潤をアッセイする。浮腫性の反応は、耳の 厚さおよびパンチした生検試料の重量を測定することにより定量化する。組織中 の５−リポキシゲナーゼ活性の直接的測定として、生検試料において産生された ロイコトリエンＢ４の測定を実施する。化合物の最適な活性を得るために、オリ ゴヌクレオチド類似体をアラキドン酸の投与の１２〜２４時間前に両方の耳に局 所的に適用する。アラキドン酸の投与の前に両方の耳を、０．１μｍｏｌ、０゜ ３μｍａｔまたは１．０μｍｏｌのオリゴヌクレオチド類似体で２４時間前処理 する。値は、１つの濃度につき３匹の動物の平均で表わす。０．１μｍｏｌ、０ ゜３μｍｏｌおよび１．　Ｏμｍｏｌについての多形核細胞浸潤の阻害は、それ ぞれ対照の活性の約１０％、７５％および９２％である。浮腫の阻害は、それぞ れ約３％、５８％および９０％であり、これに対しロイコトリエンＢ４の生成の 阻害はそれぞれ約１５％、７９％および９９％である。

手続補正帯 平成　５年１．１月２２日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．オリゴヌクレオチド類似体であって、該類似体の少なくとも一部が以下の構 造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３ −Ｌ４は、ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２，ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２−ＣＨ２ ，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２，ＣＨ２ −ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ），ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２−ＣＨ２，Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２−ＣＨ２，ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２，およびＣＨ２−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選択され、ここでＲは、 水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミ ノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラル キル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの相補ＲＮＡに対する親和性を改良す るための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であ り；そして残りのサブユニットは天然もしくは合成のサブユニットである］を有 するオリゴヌクレオチド類似体。
2. ２．ＱがＯである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
3. ３．ＸがＨである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
4. ４．ＸがＯＨである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
5. ５．ＸがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、またはＯ−アルケニルであり、かつＱが Ｏである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
6. ６．Ｂｘがアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノアデ ノシン、または５−メチルシトシンである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド 類似体。
7. ７．前記の構造を有するサブユニットを約４〜約５０個含む、請求項１記載のオ リゴヌクレオチド類似体。
8. ８．実質的にすべてのサブユニットが前記の構造を有する、請求項１記載のオリ ゴヌクレオチド類似体。
9. ９．実質的に交互のサブユニットが前記の構造を有する、請求項１記載のオリゴ ヌクレオチド類似体。
10. １０．実質的にランダムなサブユニットが前記の構造を有する、請求項１記載の オリゴヌクレオチド類似体。
11. １１．医薬用として許容しうるキャリヤー中に含まれる、請求項１記載のオリゴ ヌクレオチド類似体。
12. １２．対応する野生型のオリゴヌクレオチドに比べて、改良された耐ヌクレアー ゼ性を示す、請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
13. １３．以下の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬方学的特性を改良するための基であり；Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３ −Ｌ４は、ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２，ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２−ＣＨ２ ，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２，ＣＨ２ −ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ），ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２−ＣＨ２，Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２−ＣＨ２，ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２，およびＣＨ２−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選択され、ここでＲは、 水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミ ノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラル キル、ＲＮＡ開裂基、このような構造を有するオリゴヌクレオチドの相補ＲＮＡ に対する親和性を改良するための基、またはこのような構造を有するオリゴヌク レオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；そして ＲＨＰＩおよびＨＰＺは互いに独立的にＨ、またはヒドロキシル保護基である］ を有する化合物。
14. １４．ＱがＯである、請求項１３記載の化合物。
15. １５．ＸがＨである、請求項１３記載の化合物。
16. １６．ＸがＯＨである、請求項１３記載の化合物。
17. １７．ＸがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、またはＯ−アルケニルであり、かつＱ がＯである、請求項１３記載の化合物。
18. １８．Ｂｘがアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノア デノシン、または５−メチルシトシンである、請求項１３記載の化合物。
19. １９．以下の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルヶニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３ −Ｌ４は、ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２，ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２−ＣＨ２ ，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２，ＣＨ２ −ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ），ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２−ＣＨ２，Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２−ＣＨ２，ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２，およびＣＨ２−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選択され、ここでＲは、 水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミ ノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラル キル、ＲＮＡ開裂基、この化合物を含むオリゴヌクレオチドの相補ＲＮＡに対す る親和性を改良するための基、またはこの化合物を含むオリゴヌクレオチドの薬 力学的特性を改良するための基であり；そして ＲＨＰＩおよびＲＨＰＺは互いに独立的にＨ、またはヒドロキシル保護基である ］を有する化合物を製造する方法であって、構造（Ｉ）を有する第１のシンソン と構造（ＩＩ）を有する第２のシンソン：▲数式、化学式、表等があります▼（ Ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、 （ａ）　ＲＴはＮＨ２であり、かつ、ＲＢはＲＡ−ＣＨ２−ＣＨ２であり；（ｂ ）　ＲＴはＣＨ２−ＮＨ２であり、かつ、ＲＢはＲＡ−ＣＨ２であり；（ｃ）　 ＲＴはＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２であり、かつ、ＲＢはＲＡであり；（ｄ）　ＲＴ はＲＡであり、かつ、ＲＢはＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２であり；または（ｅ）ＲＴ はＣＨ２−ＲＡであり、かつＲａはＮＨ２−ＣＨ２である；ここで、ＲＡは、Ｃ （Ｏ）ＯＨ，Ｃ（Ｓ）ＯＨ，またはこれらの活性化された誘導体である〕 を用意すること；および 前記第１と第２のシンソンをカップリングして、ＲＴ基とＲＢ基を介したアミド 結合またはチオアミド結合を形成させること；からなる方法。
20. ２０．生物中における蛋白質の生成と活性を調節する方法であって、該蛋白質を コードする核酸配列の少なくとも一部と特異的にハイブリッド形成することが可 能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを接触させることを含み、ここで前記 類似体のサブユニットの少なくともいくつかが次の構造：▲数式、化学式、表等 があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３ −Ｌ４は、ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２，ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２−ＣＨ２ ，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２，ＣＨ２ −ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ），ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２−ＣＨ２，Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２−ＣＨ２，ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２，およびＣＨ２−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選択され、ここでＲは、 水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミ ノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラル キル、ＲＮＡ開裂基、前記オリサヌクレオチドの相補ＲＮＡに対する親和性を改 良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基 であり；そして残りのサブユニットは天然もしくは合成のサブユニットである］ を有することを特徴とする方法。
21. ２１．蛋白質の望ましくない生成を特徴とする疾患を有する生物を処置する方法 であって、該蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリッド形成 することが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを、単独もしくは医薬用 として許容しうるキャリヤー中に製剤した形で接触させることを含み、ここで前 記類似体のサブユニットの少なくともいくつかが次の構造：▲数式、化学式、表 等があります▼ ［式中、 Ｂｘは可変の塩基部分であり； ＱはＯ，ＣＨ２，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり；ＸはＨ，ＯＨ，Ｃ１〜Ｃ１０低 級アルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ， ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル ，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯＣＨ３，ＳＯ２ＣＨ ３，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロア ルカリール，アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ，置換シリル，ＲＮＡ 開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３ −Ｌ４は、ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２，ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２−ＣＨ２ ，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２，ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＣＨ２，ＣＨ２ −ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｏ），ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（Ｓ），Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２−ＣＨ２，Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２−ＣＨ２，ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −ＣＨ２，およびＣＨ２−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−ＣＨ２から選択され、ここでＲは、 水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、アルケニル、アルカリール、アミ ノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアラル キル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの相補ＲＮＡに対する親和性を改良す るための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であ り；そして残りのサブユニットは天然もしくは合成のサブユニットである］を有 することを特徴とする方法。