BR112014022195A2

BR112014022195A2 - Produção de peptídeo tóxico, expressão de peptídeo em plantas e combinações de peptídeos ricos em cisteína

Info

Publication number: BR112014022195A2
Application number: BR112014022195-2A
Authority: BR
Inventors: M. Kennedy Robert; Tedford William; Hendrickson Christopher; Venable Robert; Foune Catherine; Mcintyre John; Carlson Alvar; Bao Lin
Original assignee: Vestaron Corporation
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2020-05-12
Also published as: US10669319B2; CN104411714A; AU2018200652A1; AU2013229777A1; NZ727213A; WO2013134734A2; KR20240116574A; KR20220047395A; CA2866166C; EP2822963A2; CN112400900A; AU2013229777B2; US11472854B2; IL313167A; KR102195193B1; WO2013134734A3; IL272522A; AU2018200652B9; MX2020012620A; US20200277345A1

Abstract

polipeptídeo compreendendo um peptídeo sinal ligado a uma proteína inseticia, peptídeo inseticida, composição contendo o mesmo e seu uso novas proteínas inseticidas, nucleotídeos, peptídeos, sua expressão em plantas, métodos para produzir os peptídeos, novos processos, técnicas de produção, novos peptídeos, novas formulações e novos organismos, um processo o qual aumenta o rendimento de produção de peptídeo inseticida de sistemas de expressão de levedura. a presente invenção também está relacionada e divulga endotoxinas selecionadas que nós chamamos peptídeos inseticidas ricos em cisteína (crips) os quais são peptídeo derivados de bacillus thuringiensis (bt) e seus genes e endotoxinas em combinação com peptídeos tóxicos conhecidos como genes e peptídeos de nó de cisteína inibidor (ick), assim como com outros tipos de peptídeos inseticidas, tal como sequências de peptídeo de fator oostático de modulação de tripsina (tmof), usados em várias formulações e combinações; de ambos genes e peptídeos úteis para o controle de insetos.

Description

POLIPEPTÍDEO COMPREENDENDO UM PEPTÍDEO SINAL LIGADO A UMA PROTEÍNA INSETICIA, PEPTÍDEO INSETICIDA, COMPOSIÇÃO CONTENDO O MESMO E SEU USO

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

[1] Este pedido é um Pedido PCT o qual reivindica o beneficio do Pedido Provisional dos Estados Unidos anteriormente depositado N° de Série 61/608.921, depositado em 9 de março de 2012, Pedido Provisional dos Estados Unidos N° de Série 61/644.212, depositado em 8 de maio de 2012, Pedido Provisional dos Estados Unidos N° de Série 61/698.261, depositado em 7 de setembro de 2012, e Pedido Provisional dos Estados Unidos N° de Série 61/729.905, depositado em 26 de novembro de 2012, o conteúdo total dos quais é incorporado neste documento por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[2] Novas proteínas inseticidas, nucleotídeos, peptídeos, sua expressão em plantas, métodos para produzir os peptídeos, novos processos, técnicas de produção, novos peptídeos, novas formulações e combinações de novos e cohecidos organismos que produzem rendimentos maiores do que seria esperado de peptídeos relacionados para o controle de insetos são divulgados e reivindicados.

FUNDAMENTOS

[7] A segurança global de alimentos produzidos pela agricultura e horticultura modernas é desafiada por pragas de insetos. Fazendeiros dependem de inseticidas para suprimir danos por inseto, embora opções comerciais para inseticidas seguros e funcionais disponíveis para os fazendeiros estejam diminuindo pela remoção de produtos químicos perigosos do mercado e a evolução das cepas de insetos que são resistentes a todas as classes principais de inseticidas químicos e biológicos. Novos

Petição 870190138006, de 20/12/2019, pág. 18/30 inseticidas são necessários para fazendeiros manterem a proteção da colheita.

[8] Peptídeos inseticidas são peptídeos que são tóxicos para seus alvos., geralmente insetos ou aracnoides de algum tipo, e frequentemente os peptídeos podem ter origens de artrópode, tal como de escorpiões ou aranhas. Eles podem ser distribuídos internamente, por exemplo, distribuindo a toxina diretamente para o intestino ou os órgãos internos do inseto por injeção ou por indução do inseto a consumir a toxina de seu alimento, por exemplo alimentação de un inseto sobre uma planta transgénica e/ou eles podem ter a capacidade para inibir o cz'escimento, prejudicar o movimente ou mesmo matar um inseto quando a toxina é distribuída para o inseto espalhando a toxina para o locus habitado pelo inseto eu para o ambiente do inseto por pulverização, ou outros meios, e, então, o inseto entra em alguma forma de contato com o peptídeo.

[8] Peptídeos inseticidas, no entanto, têm enormes problemas em atingir o mercado comercial e até hoje houve poucos se algum, peptídeos inseticidas aprovados e comercializados para o mercado comercial, com uma notável exceção, peptídeos derivados de Bacillis thuringiensis ou Bt. E agora há uma preocupação sobre a crescente resistência dos insetos a proteínas de Bt >

[10] Proteínas de Bt, ou peptídeos de Bt, são inseticidas eficazes usados para proteção de colheita na forma de ambos protetores incorporados na planta e sprays foliares. Formulações comerciais de proteínas de Bt são amplamente usadas para controlar insetos no estágio de larva. Peptídeos de ICK incluem muitas moléculas que tem atividade inseticida. Esses peptídeos de ICR são frequentemente tóxicos a espécies alvo biológicas ocorrendo naturalmente, geralmente insetos ou aracnídeos de algum tipo. Frequentemente peptídeos de XCK podem, ter origens de artrópodes, tal como os venenos de escorpiões ou aranhas. Bt é um e o único organismo fonte de peptídeos inseticidas úteis comercialmente. Outras classes e tipos de peptídeos potenciais foram identificados, tal como peptídeos de fator oostãtico de modulação de Tripsina {TMOF). Peptídeos de TMOF têm que ser distribuídos para seu sítio fisiológico de ação de várias maneiras e peptídeos de TMOF foram identificados como larvicidas potenciais com grande potencial, ver D. Borovsky, Journal of Experimental Biology 206, 3869-3875, mas como quase todos os outros peptídeos inseticidas, TMOF não foi comercializado ou amplamente usado por fazendeiras e há razões para isto.

[11] A capacidade de produzir com sucesso peptídeos insecticidas em uma escala comercial, com formação e dóbramento de peptídeo reprodutível, a um preço razoável e econômica, pode ser desafiadora. A ampla variedade, propriedades únicas e natureza especial de peptídeos inseticidas combinadas com a imensa variedade de possíveis técnicas de produção podem apresentai um número esmagadoi de enfoques para aplicação e produção de peptídeos, mas alguns, se algum, são comercialmente bem sucedidos.

[12] Rã várias razões para tão poucos da multiplicidade de peptídeos inseticidas que foram identífiçados jamais terem ido para o mercado. Primeiro, a maioria dos peptídeos inseticidas ê ou delicada ou não tóxica, o suficiente pat*a ser usada comercialmente. Segundo, os peptídeos inseticidas são difíceis e caros para produzir comercialmente. Terceiro, muitos peptídeos inseticidas degradam rapidamente e têm uma meia vida

4/273 curta. Quarto, muito poucos peptídeos inseticidas dobram adequadamente quando eles são expressos por uma planta, assim eles perdem sua toxicidade em organismos geneticamente modificados (GMOs)< Quinto, a maioria dos peptídeos inseticidas identificados é bloqueada da. distribuição sistêmica no inseto e/ou perde sua natureza tóxica quando consumida pelos insetos. Proteínas de Bt são uma exceção a este último problema e como elas interrompem a alimentação do inseto elas são amplamente usadas»

[13] Aqui apresentamos várias soluções para estes problemas principais os quais têm evitado a comercialização e o uso amplo espalhado de peptídeos inseticidas. Na primeira seção, descrevemos como criar cassetes a sistemas de expressão especiais que permitem às planta gerarem e expressarem peptídeos inseticidas devidamente dobrados que retêm sua toxicidade a insetos.

[14] Na segunda seção, descrevemos como fazer uma mudança relativamente pequena na composição de um peptídeo e, ao fazê-lo, aumentar dramaticamente a taxa e a quantidade que pode ser feita por fermentação. Este, processo também abaixa simultaneamente o custo de produção de peptídeo industrial comercial. Esta seção ensina como uma proteína pode ser * convert ida” em um peptídeo diferente, mais rentável, que pode ser produzido em rendimentos mais altos e ainda o qual é surpreendentemente tão tóxico como antes dele ser convertido» Na terceira e última seção, descrevemos como combinar* diferentes classes de peptídeos inseticidas, de modo que eles possam operar juntos de uma maneira sinêrgica para mudar e elevar dramaticamente a toxicidade e atividade dos peptídeos componentes quando comparados com seus componentes individuais. Esta seção também fornece detalhes e dados para suportar nosso sistem, métodos e combinações e formulações de peptídeo para lidar com uma ameaça iminente do desenvolvimento e da distribuição de insetos resistentes a Bt. Insetos resistentes a Bt representam a próxima grande ameaça para o suprimento global de alimentos e nós ensinamos aqueles versados na técnica como enfrentar e derrotar esta ameaça.

[15] BUMÃRIO ΠΑ XWWÇlO

[15] Esta invenção descreve como produzir peptídeos inseticidas tóxicos em plantas, de modo que eles dobrem adequadamente quando expressos pelas plantas. Ela descreve como produzir peptídeos em altos rendimentos em ambientes de produção de laboratório e comerciais usando vários vetores< Ela descreve uma classe de peptídeos inseticidas tóxicos que nós chamamos CRIPS, o que significa Peptídeos Inseticidas Ricos em cisteína (CRIPS). Ela descreve outra classe de peptídeos inseticidas tóxicos que nós chamamos PFIPS, o que significa Proteínas Inseticidas Formadoras de Poro (PFIPS). E ela descreve como combinações novas e sinêrgicas de CRIPS e PFIPS podem ser modeladas juntas e usadas para uma variedade propósitos, incluindo a proteção de colheitas contra insetos resistentes a peptídeo de Bt ou Bacillus thuringiensis. Nós divulgamos como fazer e usar combinações de CRIPS e PFIPS para matar e controlar' insetos, mesmo insetos resistentes a Bt, em doses muitos baixas. Sem estar vinculado a teoria, nosso entendimento de peptídeos e proteínas de Bt ou Bacillus thuríngiensis nos permite ensinar aqueles versados na técnica a criar novos métodos, composições e composto (proteínas e peptídeos) e procedimentos para proteger plantas e controlar insetos.

[171 Nós descrevemos e reivindicamos uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Reticula Endoplasmátiao (ERSP) operavelmente ligada a uma Proteína Inseticida Rica em Cisteina (CRIP), tal como uma proteína de motif de Nô de Cisteina Inibidor (ICK) em que o referido ERSF é o d-terminal da referida proteína (ERSP-XCK). Um peptídeo em que o referido ERSP é qualquer peptídeo sinal o qual dirige o CRXP expresso para o retículo endoplasmático de células de planta. Vm. peptídeo em que o referido CRIP é uma proteína do Nó de Cisteina Inibidor (ICK) . Um peptídeo em que o referido CRIP é uma proteína Não ICK. um peptídeo em que o referido ERSP é um. peptídeo entre S a 50 aminoácidos de comprimento se originando de uma planta. Üm peptídeo qper ave .Imente ligado a uma Proteína de Estabilização Trans lac i ona 1 (STA) , em que o referido ERSP é o ^-terminal da referida proteína e uma Proteína de Estabilização Translacional (STA) pode estar ou no lado N-terminal do CRXP o qual e opcionalmente uma proteína de metif XCK (ERSP-STA-XCK) ; ou proteína de motif Não-ICK (SRSP-STA- Nãa-ICK) ou no lado exterminai do XCK ou proteína de motif Não-XCK (ERS.P~XCK~STA) ou (ERSP- Não-XCK -STA)<

[18] sós descrevemos e reivindicamos um peptídeo com um dipeptídeo N-terminal o qual é adicionado a e operavelmente ligado a um peptídeo conhecido, em que o referido dipeptídeo Rterminal é compreendido de um aminoácido não polar no M- terminal, do dipeptídeo e um aminoácido polar no C-terminal do dipeptídeo, em que o referida peptídeo é selecionado de um CRXP (Peptídeo Inseticida Rico em Cisteina), tal como de um peptídeo ICK, ou um peptídeo Não-ICK. Um peptídeo com um dipeptídeo N~terminal que ê adicionada a e operavelmente ligado a um peptídeo conhecido, em que o dipeptídeo N~terminal é compreendido de um aminoácido não polar no N~ terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no

C~terminal do dipeptideo. Um peptídeo em que o referido aminodcido não polar do aminoãcido N~terminal do dipeptideo Nterminal é selecionado de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, iscleucina, fenilalanina e metionina. üm peptídeo em qae o referido aminodcido polar do aminodcido C-terminal do peptídeo N-terminai ê selecionado de serina, treonina, cisteina, asparagina, glutamina, histidina, triptofano, tirosina. Um peptídeo em que o aminodcido nlo polar do aminoãcido M- terminal do dipeptideo N~terminal ê selecionado de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e met Ionina, e o referido aminoãcido polar do aminodcido C-terminal do peptídeo H-terminal é selecionado de serina, treonina, cisteina, asparagine,, glutamina, histidina, triptofano, tirosina. Um peptídeo em que o dipeptideo é compreendido de glicina-serina.

[19] Noe descrevemos uma composição que compreende pelo menos dois tipos de proteína ou peptídeos inseticidas, em que um tipo é uma Proteína Inseticida Formadora. de Poro (PFIP) e o outro tipo d um Peptídeo Inseticida Rico em Cisteina (CRIP). Uma composição em que o referido CRIP é um ICK e, opcionalmente, o referido ICK é derivado de ou ae origina de ,· Sadronyche versuta, cu da aranha teia de funil Blue .Mountain, âtrax robustus, Atrax formidabXüs, Atrax infensus, incluindo toxinas conhecidas como polipeptídeos U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU~ACTX~Hvla, rU~ACTXHvlb, ou mutantes ou variantes.Uma composição em que o CRIP é um CRIP Não-XCK e, opcionalmente, o referido CRIP Não-XCK é derivado de, ou se origina de, animais tendo CRIPB Não-ICK, tal como anêmonas do mar, ouriços do mar e lesmas do mar, opcionalmente incluindo a anêmona do mar denominada Anemonía virídi, opcionalmente incluindo os peptídeos denominados Av2 e Av3 especialmente peptídeos similares a Av2 e Av3 incluindo esses peptídeos listados na listagem de sequências ou mutant.es ou variantes.

[20] Rôs descrevemos um método para usar a composição da reivindicação 13 para controlar insetos resistentes a Bt, criar composição de pelo menos dois tipos de peptídeos em que um tipo de peptídeo é uma proteína inseticida formadora de poro (PFXR) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRXP) e as proteínas FFXP e CRIP são selecionadas de qualquer uma das composições descritas na reivindicação 1 e neste documento e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem de sequências e, então, aplicar a referida composição ao locus do inseto. Um método para controlar insetos resistentes a Bt compreendendo proteger uma planta de insetos resistentes a Bt, criar uma planta que expressa uma combinação de pelo menos dois peptídeos dobrados devidamente em que um tipo de peptídeo é uma proteína inseticida formadora de poro (PFXP) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRIP) e as proteínas PFIP e CRXP são selecionadas de qualquer uma das composições descritas neste documento e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem de sequências. Um método em que o CRIP é administrado a qualquer momento durante o qual a PFIP está afetando o revestimento do intestino do inseto» Um método em que o CRIP é administrado em seguida ao teste do inseto para resistência a Bt e em que c referido inseto testou positivo para resistência a Bt. $Ós descrevemos a aplicação de qualquer um dos compostos descritos neste documento em forma sólida ou líquida seja ao inseto, ao locus do inseto ou como um Protetor Incorporado na Planta.

[21] BREVE DESCRXÇÃU DOS DESBNHUS

[22] Fig. 1 é um diagrama, da invenção de fusão -terminal de ,θ/273

ERSP (Peptídeo Sinal de Reticula endoplasmãtico em listras diagonais} a uma CRXP (Proteína Inseticida Rica em Cisteína), tal como motif XCK (Nó de Cisteína Inibidor) em listras verticais)..

[23] Fig. 2 é um diagrama da invenção de fusão N-terminal de ERSP (listras diagonais) a uma proteína inseticida de motif CRIP (listras verticais) que é fundida com uma STA (Proteína de

Estabilização Translational em listras horizontais)< Hã duas orientações possíveis na Pig. 2.

[24] Fig. 3 é um diagrama da invenção de fusão N~ terminal de ERSP (listras diagonais) fundido a um motif CRI? (listras verticais) que é fundido com uma proteína de estabilização translacional (STA) mostrada em listras horizontais). A STA ê separada da motif CRIP par uma sequência interveniente denominada um peptídeo ligante interveniente (LINKER) mostrado em quadriculado. Duas orientações possíveis são mostradas na Fig. 3.

[25] Fig. 4 ê um diagrama similar à Fig. 3 com a motif (LINKER-CRIP) com a letra subscrita N para mostrar que o motif LINKER-CRIP pode ser usado uma vez ou repetida vãrias vezes, preferivelmente de l-io repetições e mesma mais até 15, 20 ou 25 vezes são possíveis.

[28] Fig. 5 é um diagrama que mostra que o grupo CRIPLXGANTE ou XCK - LIGANTE também pode funcionar como um grupo STA-LIGANTE. Em outras palavx^xas_f a combinação de CRrP~ LIGANTE ou XCK - LIGANTE pude funcionar como um STA-LIGANTE. Em outras palavras podemos usar dois motifs ICK com um LIGANTE e dispensar a necessidade de uma Proteína de Estabilização Translacional ou

Fig« 8 é um diagrama de uma reticulação covalente das cisteínas em u»a proteína de motif de nd de cisteína inibidor (ICK), As setas no diagrama representam β folhas; os números representam os aminoácidos de cistina formadores de motif ICK, numerados na ordem de sua ocorrência na estrutura primária do N para C terminal» A linha curva espessa representa a estrutura primária da proteína; as linhas retas finas representam a reticulação covalente das cisteínas específicas para criar um motif ICK. Algumas vezes a β folha englobando número de cisteína 2 não está presente.

[28} Fig» 7 é um gráfico dos níveis detectados de ELISA de ACTX (como uma percentagem de Proteína Solúvel Total (%TSP) resultante de expressão de transgenes de planta codificando ACTX como uma fusão trans lational com os vários outros elementos estruturais,

[29] Fig, 8 ê um gráfico de fcTSPs detectada de íELISA de U~ ACTX-Hvla fundido a GFP transientemente expressa de tabaco com localização de acumulação diferente. APO; localização de apoplasto; CYTO: localização de citop1asma; ER: localização de reticulo de endoplasma<

[30] Fig* F ê um gráfica de %TSPs detectada de iELISA de U~ ACTX-Hvla fundido a GFP transientemente expressa de folhas de tabaco usando os vetores de expressão FECT codificando fusões translacionais com trás diferentes sequências ER3P; BAAE peptídeo sinal (BGIH), peptídeo sinal de Extensina (egih) e peptídeo sinal de Extensina modificado (E*GIH).

[31] Fig. 10 é um diagrama do processo de concentração de proteína Omega~ACTX~Hvla fundida a Jun a 3 tratada com tripsina e não tratada oom tripsina extraída das folhas da tabaco transformadas transientemente♦

[32] Fíg. 11 são cromatografias de HPLC para as amostras contendo omega-ACTX-Hvla. Amostras carregadas no sistema HFLC para produzir as cromatografias foram as seguintes; A. 25 pg de omega-ACTX-Hvla sintético; B. 500 pL de retentado de filtração de 1 kD da Amostra S; c. 500 pl« de retentado de filtração de 1 kD da Amostra A,

[33] Fig. 12 é uma representação gráfica da distribuição dos rendimentos de peptídeo normalizados de ambos u+2-ACTX-Hvla (algumas vezes denominado aqui como e U-ACTX-Hvla nativo (algumas vezes denominado aqui como nativo**) , produzidos em cepas Kluyveromyces lactís (K. lactis). Os dados U+2 são mostrados em preto e os dados de U nativo estão- em cinza. O eixo x mostra o rendimento normalizado em unidades de miligramas por litro por unidade de absorbância de luz no comprimento de onda de 600 nm (mg/L.A.) A escala y ã esquerda mostra a fração de cepas U-f2 > A escala y ã direita mostra a fração de cepas u nativas.

[34] Fig. 13 é outra representação gráfica da distribuição dos rendimentos de peptídeo normalizados de cepas K. lactis U*2 e ü~ACTX»Hvla. Aqui, o eixo y mostra o rendimento normalizado (normalizado para densidade de célula nas respectivas culturas como descrito abaixo) em miligramas por litro por unidade de absorbância de luz no comprimento de onda de 600 nm (mg/'l».A.) para cepas individuais, e o eixo x corresponde à classificação de percentil do rendimento observado para cada cepa em relação ao rendimento observado para todas as outras cepas K. lactfs engenheiradas para produzir a mesma isoforma de peptídeo.

[35] Fig. 14 ê uma representação gráfica da dose-resposta de bioensaios de injeção horários com U*2 e V-ACTX-Hvla nativo. Os dados 5U2 são marcados com pontos redondos pretos e os dados de U nativo são marcados com triângulos cinzas. A escala x mostra a dosa em unidades de picomoles por grama de mosca. A escala y mostra a percentagem de mortalidade.

[36] Fig. 15 ê uma representação gráfica da distribuição dos rendimentos de peptídeo de LU2 e ü-ACTX-Hvia nativo produzidos de cepas Plohia pastoris (P. pastoris). Qs dados ü*2 são mostrados em preto e os dados de U nativo estão em cinza. 0 eixo x mostra o rendimento em miligramas por litro e a escala y mostra a fração de produção de ü*2 ou u nativo total de cepas P. pastoris.

[37] Fig. 16 é cutra representação gráfica da distribuição dos rendimentos de peptídeo de ü*2 e U-ACTX-Hvla nativo produzidos de cepas P. pastoris. Aqui., o eixo y mostra o rendimento em miligramas por litro para cepas individuais, e o eixo X corresponde à classificação de percent.il do rendimento observado para cada cepa (em relação aos rendimentos observados para todas as outras cepas de P. pastoris engenhe iradas para produzir a mesma isoforma de peptídeo)·

[38] Fig. 17 é uma representação gráfica da distribuição dos rendimentos de peptídeo de toxina de anêmona do mar, Av3 e Av3*2, produzido de cepas da expressão de K.lactis. A toxina nativa é denominada Av3 da anêmona do mar denominada Anemonia vlrídis. A toxina modificada aqui ê marcada Av3 * 2. Como o exemplo acima nós produzimos os peptídeos tóxicos em cepas de Kluyveromyces iactls ou K. lactís. 0 eixo x mostra o rendimento de peptídeo em mAu.sec/A para cepas individuais e o eixo y mostra a fração das cepas. Na Fig. 17 a cepa Av3 nativa é mostrada em cinza claro, a cepa de alta produção modificada Av3 *2 é mostrada em preto.

[39] Fig« 18 mostra a diferença nos rendimentos de peptídeo de Av3+2 e Av3 nativa produzidos das cepas de R'. lactís / 2 7 ^A<<

correspondentes plotando os rendimentos de peptídeo em função da classificação de percent11 dos transformantes os quais produzem o mesmo peptídeo. Aqui, o eixo y mostra o rendimento normalizado em mAu.sec,^zA para cepas individuais, e o eixo x corresponde ã classificação de percentil do rendimento observado para cada cepa, em relação ao rendimento observado para todas as outras cepas de K. iactis engenheiradas para produzir a mesma isoforma de peptídeo.

[40] Fig, 19 Gráfico de um bioensaio foliar de mortalidade percentual de 24 horas vs. idade após aplicação e exposição a peptídeos de ICK ou proteínas de Bt.

[41] Fig, 20 Gráfico de um bioensaio foliar medindo mortalidade percentual em 18, 24 e 48 horas após aplicação usando proteínas de Bt ou peptídeos de ICK ou combinação de peptídeos Bt * ICK em larvas de 72 horas,

[42] Fig. 21 Gráfico de um bioensaio de alimentação foliar medindo dano foliar por insetos resistentes a Bt, em 24h e 48h após exposição a proteínas Bt ou CRIP Não-XCK ou suas combinações,

[43] Fig, 22 Gráfico de um bioensaio de alimentação foliar medindo mortalidade percentual em 24 a 48 horas apôs aplicação usando proteínas de Bt ou peptídeos de ICK ou sua combinação em larvas de P. xylostella resistentes a proteína de Bt,

[44] brsvs descriqãq da listagem de sequências

[45] Esta invenção inclui uma listagem de sequências listando 1593 sequências.

[46] SEQ ID MOs; 1-28, 1553-1570, e 1593 são mencionadas or referenciadas na Parte 1.

[47] SEQ ID ROst 22-32, and 1571-1592 são mencionadas or referenciadas na Parte 2.

[48] SEQ ID NQs:. 33- 1042 mencionadas or referenciadas na

Parte 3.

[49] SEQ ID EOs: 1043- 1221

tendo	uma	origem	de	ar	anha.
	[50]	SEQ 15	? NOs;	1222- 1262
tendo	uma	origem	de		âmona.
	[51]	EEQ ID B	ÓS;	1263- 1336
tendo	uma	origem			corpião.
	[52]	SEQ I£		30:	1337- 1365
tendo	uma	origem	V.-frXÍ	es	oerpião <
	[631	SEQ II	ϊ Ni		1366- 1446

tendo uma origem de Cry ou Cyt.

[54j SEQ ID EOs: 1.447- 1552 tendo uma erigem de VIP.

[55] DESCRIÇÃO DETALHADA DA

[55] DEFINIÇÕES

são	sequências	derivadas	de	ou
são	sequências	derivadas	de	ou
são	sequências	derivadas	de	ou
São	sequências	derivadas	de	ou
sao	sequências	derivadas	de	ou
são	sequências	derivadas	de	ou

INVEEÇÃO

[57] ACTX ou peptídeo ACTX significa uma Familia de peptídeos ICK inseticidas que foram isolados de aranhas teia de funil australiana pertencentes à subfamília Atracinae. Dma dessas aranhas é conhecida como a Aranha Tela de Funil das Montanhas Azuis da Austrália a qual tem o nome científico

Hydronyohe versuta. Dois exemplos de pep 11 de o s ACTX de s t a espécie são os peptídeos ômega e D.

[58] «Agroinf acção'·' significa um método de transfermação de planta onde D«A ê introduzido em uma célula de planta usando

Agrobacteria A. tumefacíens ou A. rhixogenes.

[59] BAAS significa peptídeo sinal de alfa~amilase de cevada. Ele é um exemplo de um ERSP.

[60] Vetor binário ou vetor de expressão binário significa um vetor de expressão o qual pode se replicar em ambas as cepas de E. coll e cepas de Agrcbacterium. Além disso, ο vetor contém uma região de DNA (frequentemente denominada oomo t-DNA) suportada por sequências de margem esquerda e direita que é reconhecida por genes de virulência a serem copiados e distribuídos para uma célula de planta por Agrobacterium.

[61] 'Bt,* também conhecida como Bacillus thuringiensís ou B. thuringiensis, significa uma bactéria do solo gram-positiva que é usada mundialmente por mais de sessenta anos para controlar pragas de insetos agrícolas, de floresta e de saúde pública»

[61] Proteínas de Bt e Peptídeos de Bt se referem à mesma coisa aqui e estes são peptídeos produzidos per Bt. Esses peptídeos são frequentemente escritos como proteínas cry, oyt‘ ou VIP codificadas pelos genes cry, cyt e vip. Proteínas Bt são mais comumente atribuídas a proteínas de cristal inseticidas codificadas pelos genes cry. Proteínas Bt são exemplos de PFIPS (Proteínas Inseticidas Formadoras de Poro], ver definição abaixo Exemplos de PFIPS e outras proteínas de Bt são fornecidos na listagem de sequências.

[63] Gene quimérico significa uma sequência de DNA que codifica um gene derivado de porções de uma ou mais sequências de codificação para produzir um novo gene.

[64] Ligante clivãvel significa uma curta sequência de peptídeo na proteína gue é o sítio alvo de proteases que. pode clivar e separar a proteína em duas partes ou uma curta sequência de DNA que ê colocada na estrutura de leitura no ORF e codificando uma curta sequência de peptídeo na proteína que é o sítio alvo de protease gue pode clivar e separar a proteína em duas partes.

[65.] Meio condicionado significa o meio de cultura de célula α qual é usado por células e é enriquecido com materiais derivados de célula, mas não contém células.

[66] Conversão ou convertido se refere ao processo para fazer um peptídeo HP.

[671 CRXP e ”CRIPS é uma abreviação para Proteína ou Proteínas Inseticidas Ricas em Cisteína» Peptídeos inseticidas ricos em cisteína (CRXPS) são peptídeos ricos em cisteína cs quais formam ligações dissulfeto. CRIPS contêm pelo menos quatro (4) algumas vezes seis (6) e algumas vezes oito (8) aminoácidos de cisteína dentre proteínas ou peptídeos tendo pelo menos 10 aminoácidos onde as cisteínas formam duas (2), três (3) ou quatro (4) ligações dissulfeto. As ligações dissulfeto contribuem para o dobramento, a estrutura tridimensional e a atividade da peptídeo inseticida. ás ligações dissulfeto cisteína-císteína e a estrutura tridimensional que elas formam desempenham um papel significativo na toxicidade destes peptídeos inseticidas. Um CRIP ê exemplificado por ambos os peptídeos de nó de cisteína inibidor ou ICK (geralmente tendo 6 a 8 cisteínas) e por exemplos de peptídeos tóxicos tendo ligações dissulfeto, mas que não são considez^ados peptídeos ICK (CRIPS não ICK) . Exemplo de um ICK seria um peptídeo ACTX de uma aranha e definido acima » Exemplos de um CRIP não ICK seriam um peptídeo como Av2 e Av3 os quais são peptídeos primeiramente idsntifiçados de anêmona do mar. Estes peptídeos são exemplos de uma classe de compostos que modulam canais de sódio no sistema nervoso periférico (PNS) do inseto. CRXPS não ICK podem ter 4 a 8 cisteínas as quais formam 2 a 4 .ligações dissulfeto. Estes peptídeos tóxicos estabilizados por ligações dissulfeto cisteína-cisteína (CRIPE) podem ter estabilidade notável quando expostos ao ambiente. Muitos CRIPS são isolados de animais venenosos, tal como aranhas, escorpiões, cobras e caramujos marinhes e anémonas do mar e eles são tóxicos para insetos. Descrição adicional é fornecida abaixo.

[68] Meio definido significa um meio que é composto de componentes químicos conhecidos, mas não contém extratos protainãneos brutos ou subprodutos, tal como extrato de levedura ou peptona,

[69] Ligação dissulfeto significa uma ligação covalente entre dois aminoácidos cisteína derivados pelo acoplamento de dois grupos tiol em suas cadeias lateral®.

[70] Vetor de expressão de peptídeo transgene duplo* ou vetor de expressão transgene duplo significa um vetor de expressão de levedura o qual, contém duas cópias do cassete de expressão de peptídeo inseticida.

[71] ELISA ou iELISA significam um protocolo de biologia molecular no qual as amostras são fixadas ã superfície de uma placa e, então, detectadas como a seguir; um anticorpo primário é aplicado seguido por um segundo anticorpo conjugado a uma ensíma a qual converte um substrato incolor em substrato colorido o qual pode ser detectado e quantificado através da amostras. Durante o protocolo, os anticorpos são lavados de modo que apenas aqueles que ligam a seus epítopos permanecem para detecção. As amostras, em nossas mãos, são proteínas isoladas de plantas e ELISA permite a quantífinação da quantidade de proteína transgénica expressa recuperada.

[72] ORE de expressão significa um nucleotides

codifi	cando um complexo de proteína e	ê definido	como os
núcleo	tideos na ORF.
	73] ER ou Retíoulo endoplasmãtl	.co c ztma	organs1a

subcelular comum a todos os eucariotas onde algune processos de modificação de tradução ocorrem.

[74] ERSP ou *Peptídeo sinal de retículo endoplasmático é uma sequência N-terminal de aminoécidos que durante a tradução da proteína da molécula de mRNA transgênioo é reconhecida e ligada por uma partícula de reconhecimento de sinal de célula hospedeira a qual move o com ribossoma/mRNA de tradução da proteína para o SR no eitoplasma. O resultado é que a tradução da proteína é pausada até ela alojar com o SR. onde ela continua e a proteína resultante é injetada no RR.

[75] ersp* significa um nuclectídeo codificando o peptídeo, ERSP.

[76] Tráfico de ER significa transporte de uma proteína expressa em célula para o ER para modificação pós-translacional > seleção e transporte.

[77] FECT significa um sistema de expressão de planta transients usando vírus mosaico capim rabo de raposa com eliminação de gene de proteína de cobertura e triplo bloco de gene.

[78] GFP* significa uma proteína fluorescente verde da medusa Aequorea victoria. Ela é um exemplo de uma proteína de estabi1ização translacional.

[79] Peptídeo de Alta Produção* ou Peptídeo HP* significa um peptídeo o qual é capaz de ser feito, ou é convertido*, de acordo com os procedimentos descritos neste documento e o qual uma vez convertido pode ser produzido em rendimentos elevados, ou taxas de produção mais altas, ou em quantidades maiores que as normais, em um sistema biológico. As taxas de produção mais altas podem, ser de 20 a 420% ou maiores do que pode ser atingido oom um peptídeo antes da conversão usando os mesmos métodos ou métodos de produção similares que foram usados para produzir o peptídeo antes da conversão.

[80] Peptídeo híbrido, também conhecido como toxina .híbrida, também conhecido como ACTX-Hvla .híbrido, também conhecido como ACTX-Hvia híbrido nativo, assim como peptídeo ü, também conhecido como toxina U, também conhecido como U .nativa, também, conhecido como ü~ACTX~HvXa, também conhecido como U-ACTX-Hvía nativo, todos se referem a um peptídeo ACTX o qual foi descoberto de uma aranha conhecida como a Aranha Teia de Funil da Montanhas Azuis da Austrália, Hydronyche versuta, e é um duplo antagonista para canais de Ca’⁴* regulados por voltagem de inseto e canais de K* regulados por voltagem.

[81] XGER significa um nome para um peptídeo curto com base em sua sequência real de códigos de uma letra. Ele é um exemplo de um. ligante interveníente.

[83] Motif XCK, proteína e motif XCK , motif, de nó de cístina inibidor, peptídeos XCK de inseto tóxicos, peptídeos ICK, peptídeos CE”, motif de nó de cístinaou peptídeos de nó de cístina significam um peptídeo de 16 a 60 aminoácidos com pelo menos 6 aminoácidos de núcleo de meia cístina tendo três pontes dissulfeto, em que as 3 pontes dissulfeto são ligações covalentes e dos seis resíduos de meia cístina as ligações dissulfeto covalentes estão entre a primeira e a quarta, a segunda e a quinta e a terceira e a sexta meias cistinas, dos seis aminoácidos de meia cístina de núcleo começando do aminoácido N-terminal. Em geral este tipo de peptídeo compreende uma estrutura secundária beta-hairpin, normalmente composta de resíduos situados entre a quarta e a sexta meias cistinas de núcleo do motif, o hairpin sendo estabilizada pela reticulação estrutural fornecida pelas três ligações dissulfeto do motif. Notem que aminoácidos cisteína/cistina ou meia cístina adicionais podem estar presentes dentro do motif de nó de cistína inibidor. Exemplos são fornecidos na listagem, de sequências >

[83] “ick* significa um nucleotidea codificando uma proteína de motif ICK.

[84] “ORF de expressão de proteína de motif ICK* ou ”ORF de expressão” significa um nucleotídeo codificando um complexo de proteína de motif XCK e é definido como os nucleotídeos na ORF,

[85] “Vetor de expressão de proteína de motif ICK“ ou ’’vetor de expressão XCK.” ou “vetor de expressão de motif XCK” significa um vetor binário o qual contêm uma ORF de expressão. O vetor binário também contém o promotor de transcrição necessário e a sequência terminadora circundando a ORF de expressão para promover a expressão da ORF e da proteína que ela codifica.

[88] Inseto* significa qualquer artrópode e nematódeo, incluindo ácaros e insetos conhecidos por infestarem colheitas, vegetais e árvores e inclui insetos que são considerados pragas nos campos de floresta, horticultura e agricultura. Exemplos de colheitas específicas que poderíam ser protegidas com os métodos divulgados neste documento são soja, milho, algodão, alfafa e as colheitas vegetais. Uma lista de colheitas e insetos específicas aparece em direção ao final deste documento.

[87] “Ambiente do intestino do inseto* ou “ambiente do intestino* significa que o pH específico e as condições de proteinase encontradas dentro do intestino anterior, médio ou posterior de um inseto ou larva de inseto.

[88] “Ambiente de .hemolinfa de inseto* significa o pH específico e as condições de proteinase encontradas dentro de um inseto ou larva de inseto.

[89] “Atividade inseticida significa que na ou após a exposição do inseto a compostos ou peptídeos, o inseto ou morre, paralisa ou desacelera seu movimento ou sua alimentação paralisa ou desacelera seu crescimento, deixa de entrar em pupa, não pode reproduzir ou não pode produzir prole fértil.

[90] Peptídeo inseticida' ou proteína inseticida ou peptídeo tóxico ou proteína tóxica significa uma proteína tendo atividade inseticida quando ingerida por, em contato com, ou injetada em um inseto.

[91] Triagem de cepa de produção de peptídeo inseticida significa um processo de triagem que identifica as cepas de levedura de produção de peptídeo inseticida de rendimento mais alto das cepas de rendimento mais baixo» Hos métodos descritos neste documento, ela se refere a triagens que usam HPLC de fase reversa ou o bioensaío de injeção de mosca doméstica.

[92] ’Vetor de expressão integrativo ou vetor integrativo significa um vetor de expressão de levedura o qual pode se inserir em um locus específico do genoma de célula de levedura e se torna estavelmente uma parte do genoma da levedura.

[93] Ligante interveniente significa uma curta sequência de peptídeo na proteína separando partes diferentes da proteína ou uma curta sequência de DHA que é colocada na estrutura de leitura na ORF para separar as sequências de D.XA a monante e a jusante, de modo que durante a tradução da proteína as proteínas codificadas no DNA podem atingir sua formação de estrutura secundária e terciária independente. O ligante interveniente pode ser ou resistente ou suscetível a c li vagem em ambientes celulares de planta, no ambiente de intestino de inseto e/ou lepidôptero e na hemolinfa do inseto e ambiente de hemolinfa do lepidóptero.

[94] Peptídeo conhecido sign.if.i.ca. um peptídeo conhecido por ter atividade biológica a pode ser um peptídeo maduro ou qualquer versão ou fragmento do mesmo incluindo pre e pró peptídeos e conjugados de peptídeos ativos. Üm peptídeo conhecido preferido é um com atividade inseticida.

[95] L® no contexto próprio significa um peptídeo ligante

i n t srve nie nte	o	qual	1 iga urna	proteína de	estabilização
translac ional	com	uma	proteína, de	motif ICK ou	um domínio de
proteína da	motif	ÍCK	múltiplo, e	liga a mesma	ou diferente

proteína de motif ICK múltipla. Quando se referindo a aminoácidos, *1* também pode significar leucina.

[96] Ligante, LIQANTE® ou em alguns contextos ”1?* significa um peptídeo ligante interveniente o qual liga uma proteína de estabilização translational com uma proteína de motif XCK ou um domínio de proteína de motif ICK múltiplo, e liga a mesma ou diferentes proteínas de motif ICK múltiplas. O ligante pode ter um de (pelo menos) três papéis: clivar no ambiente do intestino do inseto, clivar na célula de planta ou ser destinado a não clivar intencíonalmente.

[97] 1® ou ligante'* significa u® nucleotídeo codificando para, um peptídeo de ligante interveniente.

[98] Ambiente do intestino do lepidóptero® significa que o pH especifico e as condições de proteinase encontradas dentro do intestino anterior, médio ou posterior de um inseto lepidóptero ou larva.

[99] Ambiente de hemolinfa de lepidóptero” significa o pH específico e as condições de proteinase encontradas dentro de

inseto lep	•ídóptero on larva.
[1Q0]	Domínio da proteína	de motif ICK	múltiplo®
significa	uma proteína composta de	proteínas de	motif XCK
múltiplas	as quais são ligadas	por peptídeos	lígantes

23/273 interveníentes múltiplos. As proteínas de motif ICK no domínio de proteína, de motif ICK múltipla podem ser as mesmas ou diferentes, e peptídeos ligantes intervenient.es neste domínio também podem ser os mesmos ou diferentes -

[101] CRIPS não ICK podem ter 4 a 8 cisteínas as quais formam 2 a 4 ligações dissulfeto. Peptídeos não ICK incluem peptídeos de nó cistina que não são peptídeos ICK. Peptídeos não ICK podem ter ordens de conexão diferentes das ligações de cistina do que ICKs. Exemplos de um CR1P não ICK são peptídeos como Av2 e Av3 os quais são peptídeos identificados primeiro de anêmonas do mar. Estes peptídeos de anêmonas são exemplos de uma classe de compostos que modulam canais de sódio no sistema nervoso periférico (PN8) do inseto.

[102] Aminoãcido não polar” é um aminoácido que é fracamente hidrofõbico e inclui glicina, alanina, prolina, valína, leucina, ísoleucina, fenilalanina e metionina» Glicina ou gly é c aminoácido não polar mais preferido para os dipeptídeos desta invenção.

[103] Rendimento de peptídeo normalizado significa o rendimento de peptídeo no meio condicionado dividido pela densidade de célula correspondente no ponto em que o rendimento de peptídeo é medido» O rendimento de peptídeo pode ser representado pela massa do peptídeo produzido em uma unidade de volume, por exemplo, mg por litro ou mg/l», ou pela ãrea de pico de absorbãncia w do peptídeo produzido na cromatografia de HPLC, por exemplo, mAu.s. A densidade de célula pode ser representada pela absorbãncia de luz visível da cultura no comprimento de onda de 500 nm (QD0OO}.

[104] Código de uma letra significa a sequência de peptídeo a qual é listada em seu código de uma letra para distinguir os vários amincácides na estrutura primária de uma proteína. alanina*A, arginina»K, asparagina»N, ácido aspárticoeD, asparagina ou ácido aspârtico»B, cisteí.na»C, ácido glutãmico»Fi, glutamína«Q, glutamína ou ácido glutâmico»^, glicína»G, histidi.na«H, isoleucína»!, leuoina-L, lisina«K, metionina»M, fenilalanina®?, prolina»?, serina«S, treonina»·?, tr ipto fano ~ W, t iroa ina»¥, va. 11 na »V.

[1QS] «Peptídeo Omega” também conhecido como ’’toxina ômega⁸, também conhecida como ’’ômega-ACTX-HxtLa* , também conhecida como ômegaACTX-Rvia nativa*, se referem todas a um peptídeo ACTX o qual foi primeiro isolado de uma aranha conhecida como a Aranha Teia de Funil da Montanhas Asuis da Austrália, Hydronyche versuta, e o qual ê um antagonista para canal de Ca·*·*' regulado por voltagem de inseto.

[106] ORF* ou Bstrutura de leitura aberta* ou ORF de expressão de peptídeo* significa que a sequência de DNA codificando uma proteína a qual começa com um códon de partida

ATG e termina com um oôdon de parada TGA, TAA ou TAG. ORF também pode significar a proteína tradusida que o DNA codifica.

[107] Operavelmente ligado significa que duas sequências de DNA adjacentes são colocadas juntas de modo que a ativação transcricional de uma pode agir na outra.

[100] PSP* significa Peptídeo Sxpresso em Planta.

ilQãi Cassete de expressão de peptídeo*, ou cassete de expressão* significa uma sequência de DNA a qual é composta de todos os elementos de DNA necessários para completar a transcrição de um peptídeo inseticida em um sistema de expressão biológico. Nbs métodos descritos neste documento, ele inclui um promotor de transcrição, um sequência de DNA para codificar uma sequência de sinal de fator de combinação α e um sítio de divagem Kex 2, um transgene de peptídeo inseticida, um códon de parada e um terminador de transcrição.

[11Ô] Vetor de expressão de peptídeo significa um vetor de expressão de organismo hospedeiro o qual contém um transgene de peptídeo inseticida heterólogo.

[111] Cepa de levedura de expressão de peptídeo, cepa de expressão de peptídeo ou. cepa de produção de peptídeo significa uma cepa de levedura a qual pode produzir um peptídeo inseticida heterôlogo.

[112] Peptídeo feito especial significa um peptídeo anteriormente, tendo baixo rendimento de peptídeo de um sistema de expressão biológica que se torna, um peptídeo HP por causa dos métodos descritos neste documento usados para elevar seu rendimento.

[113] Transgene de peptídeo ou transgene de peptídeo inseticida significa uma sequência de DNA que codifica um peptídeo inseticida e pode ser traduzida em um sistema de expressão bio1õgico.

[114] Rendimento de peptídeo significa a concentração de peptídeo inseticida no meio condicionado o qual é produzido das células de uma cepa de levedura de expressão de peptídeo. Ele pode ser representado pela massa do peptídeo produzido em uma unidade de volume, por exemplo, mg por litro ou mg/í,, ou pela ãrea de pico de absorbãncía W do peptídeo produzido na cromatografia de HRLC, por exemplo, máu.sec»

[115] Membrana peritrófica significa um revestimento dentro do intestino do inseto que captura grandes partículas de alimento pode ajudar em seu movimento pelo intestino enquanto permitindo digestão, mas também protegendo a parede do intestino

[116] PFIP significa uma proteína que pode formar um poro ou canal nas células que reveste o intestino de um inseto, tal como células do epitélio do intestino. Exemplos de PFXPS

são proteínas de Et,	tal como cry.	crt	e VIP, outr«	ss exemplos de
PFXP podem ser encont:	rados na listac	fsm	de sequência-	s.
[117] *PIP	ou Protetor	incorporado	cm	planta
significa uma prot	.eína insetici	.da	produzida	por	plantas
transgênicas, o o m<	iterial genétii		necessário j	sara a	planta
produzir a proteína.
[118] Ligante clivávei	por planta	sianif	sX.

peptídeo ligante clivável, ou um nucleotídeo codificando um peptídeo ligante clivávei o qual contém um sitio de reconhecimento de protease de planta e pode ser clivávei durante o processo de expressão de proteína, na célula de planta.

[119] “Meio de regeneração de planta' significa qualquer meio que contém as elementos e as vitaminas necessárias para crescimento de planta e hormônios de planta necessários para promover regeneração de uma célula em um embrião o qual pode germinar e gerar uma plântula derivada de cultura de tecido Frequentemente o meio contém um agente selecionável ao qual as células transgênicas expressam um gene de seleção que confere insistência ao agente.

[120] Proteína transgênica de planta· significa uma proteína de uma espécie heterõloga que é expressa em uma planta depois que o DNA ou RNA codificando-a foi distribuído para uma ou mais das células de planta.

[121] Aminoácido polar é um aminoácido que é polar e inclui serina, treonína, cisteína, asparagína, glutamina, histidina, triptofano e tirosina; aminoácidos polares preferidos são serina, treonína, cisteína, asparagína e glutamina; com. serina sendo mais altamente preferida.

27/273

[122] Silenolamento de gene pós-transcricional on *PTGS₍ significa um processo celular dentro de células vivas que suprime a expressão de um gene.

[123] Proteína tem o mesmo significado que Peptídeo ne ste documento>

[124] Vetor recombinants significa um vetor de plasmídeo de Wà no qual DKA estranho fox inserido»

[125] Gene de seleção significa um gene o qual confere uma vantagem para o organismo genomicamante modificado crescer sob a pressão seletiva.»

[126] STA, or Proteína de estabilização translacional, ou proteína de estabilização, ou proteína de fusão significa uma proteína com estrutura terciãria suficiente que ela pode acumular em uma célula sem ser alvo pelo processo celular de degradação de proteína. A proteína pode ser de entre 5 e 50aa (por exemplo, outra proteína de motif ICK), 50 a 250aa (GNA) , 250 a 750aa (por exemplo, quitinase) e 750 a XSOOaa (por exemplo, enhandna). A proteína de estabilização translacional é codificada por uma sequência de DMA. para uma proteína que é fundida na estrutura com uma sequência codificando uma proteína inseticida na ORF. A proteína de fusão pode estar ou a montante, cu a jusante da proteína inseticida e pode ter qualquer sequência interveniente entre as duas sequências contanto que a sequência interveniente não resulte em um desvio de estrutura de cada sequência de DNA» A proteína de estabilização translacional também pode ter uma atividade que aumenta a distribuição da proteína de motif ICK através da parede do intestino e na hemolinfa do inseto» Tal distribuição pode ser obtida traficando ativamente a ORF inteira através da parede do intestino, ou por divagem dentro do ambiente do intestino para separar a proteína de motif ICK enquanto a proteína de estabilização translacíonal danifica a membrana peritrófica e/ou a parede da intestino para elevar a difusão da proteína de motif ICK para a hamolinfa.

[127] ata significa um nucleotídeo codificando uma proteína de estabilização translactonal.

[128] TMOF, motif TMOF ou proteínas TMQF significa sequências de proteína de fator oostãtico de modulação de tripsina. Exemplos são fornecidos na listagem de sequências. Numerosos exemplos e variantes são fornecidos neste documento. SEQ ID NO: 708 é a sequência TROF tipo selvagem. Outras variantes não limitantes são fornecidas na SEQ. XD. NO:s 709 ~ 721. Outros exemples seriam conhecidos ou poderíam ser criados por aqueles versados na técnica.

[129] TSP ou proteína solúvel total significa a quantidade total de proteína que pode ser extraída de uma amostra de tecido de planta e solubilizada no tampão de extração.

[130] Trans gene significa uma sequência de DNA heterôloga codificando uma proteína a qual é transformada em uma planta,

[131] Célula hospedeira transgênica significa uma célula a qual é transformada com um gene e foi selecionada pelo seu estado transgênico via um gene de seleção adicional.

[132]	PIanta transgêni ca* sj	i.gníf	ica uma	planta que foi
derivada de	uma única célula que	foi	transia	rmada com DNA
estranho,, da	modo que toda célula	na	planta	contenha esse
transgene.
[1331	Sistema de expressão	transiente	significa um

sistema ã base de Agrobacteríum tumefaciens o qual distribui DNA codificando um vírus de planta desarmado em uma célula de planta ande ele é expressada. O vírus de planta foi engenhe irado para expressai* uma proteína de interesse em altas concent rações, até

40% da TSP. Na prova técnica, há dois sistemas de expressão trans lentes usados, um sistema TRBO e um FECT e as células de planta são tecido de folha de uma planta de tabaco ’Mcotiana benthamíana.

[134] TRBO* significa um sistema de expressão de planta transients usando vírus mosaico Tabaco com remoção do gene de proteína de revestimento viral.

[135] divagem de tripsina* significa um ensaio in vitro que usa a enzima de protease tripsina (a qual reconhece resíduos de aminoácído lisina e arginina expostos) para separar um ligante olivãvel nesse sítio de divagem. Ela também significa o ato da enzima tripsina clivando esse sitia.

[136] Peptídeo U, ’’Proteína U*, também conhecida como toxina U*, também conhecida como ü nativa*, também conhecida como U~ACTX~Hvla*, também conhecida como U-ACTX-Hvla nativa*, assim como Peptídeo híbrido*, também conhecido como toxina híbrida*, também conhecida como híbrido-ACTX-Hvla*, também conhecido como hí.bridoACTX~Hvla nativo, todos se referem a uma proteína nativa ou toxina nativa que pode ser encontrada na natureza ou é de outro modo conhecida, no caso de U-ACTX~Hvla*, também conhecida como U-ACTX-Hvla nativa*, a proteína é uma toxina de aranha nativa que foi primeiro descoberta de uma aranha cam origens nas Montanhas Azuis da Austrália. e é duplo antagonista contra canais de Ca*’ regulados por voltagem de inseto e canais de K*< A aranha da qual a toxina foi descoberta é conhecida como a Aranha Teia de Funil das Montanhas Azuis da

Austrália a qual tem o nome científico Hydronyche versuta.

[137] Peptídeo V+2, proteína U-í-2, toxina U*2* ou “U-f-2* _f ou U4-2-ACTK-Hvla _f se referem todos a uma toxina a qual tem um dipeptídeo adicional operativamente ligado ao peptídeo nativo e podem se referir à toxina de aranha a qual é às vezes chamada de peptídeo U e outros nomes observados acima. G dipeptídeo adicional que é operativamente ligado a© peptídeo ü e assim, indicado como “*2* ou “mais 2*, pode ser selecionado dentre vários peptídeos, qualquer um dos quais pode resultar em um “peptídeo 042* com propriedades únicas como discutidas neste documento. .Estes também são às vezes chamados de “peptídeos de alta produção*. Quando o termo “U4-2-ACTX-Hvla* é usado, ele se refere a um peptídeo tóxico de alta produção específico compreendendo um peptídeo ocorrendo naturalmente da Aranha Teia de Funil das Montanhas Azuis da Austrália a qual tem o nome científico Hydronyche versuta, (138] Proteínas VIP* foram descobertas triando o sobrenadante de cepas crescidas vegetatívamente de Bt para possível atividade inseticida. Elas têm pouca ou nenhuma similaridade para proteínas cry e eleas foram denominadas Proteínas Inseticidas Vegetativas ou VIP. De uso particular e preferência para uso com este documente são as que foram chamadas de proteínas VIP3, Vip3 ou toxinas Vip as quais têm atividade Lepidõptera·. Elas são consideradas terem um modo de ação similar aos peptídeos cry de Bt. Neste documento proteínas VIP são categorizadas como um tipo de proteína PFXP.

[13.9] “Vetor de expressão de levedura* ou “vetor de expressão, ou “vetor*, significa um plasmídeo o qual pode introduzir um gene heterólogo e/ou cassete de expressão em células de levedura a serem transcritos e traduzidos.

(1481 “Levedura* se refere à produção de um peptídeo e rendimentos elevados podem significar quantidades elevadas de produção, taxas elevadas de produção e um elevado rendimento médio ou mediano e elevada frequência em rendimentos mais altos.

[141] Seção 1, PEPTÍDEOS INCORPORADOS EM PLANTA OU PEPTÍDEOS EXPRESSOS EM PLANTA PIPS E PEPS

[142] Protetores incorporados em planta, ou PXPs, apresentaram uma solução para a pressão de insetos enfrentada por fazendeiros> A agricultura moderna emprega genes da Bacillus thuringiensis expressos como proteínas transgênicas de planta para agirem como PIPs, mas cepas de insetos resistentes naturais foram detectadas no campo e ameaçam esta classe. PXPs adicionais com novos modos de ação precisam ser desenvolvidos para gerenciar o desenvolvimento de i“esistência. 'Uma nova classe de proteínas com atividade inseticida tendo o potencial para se tornar PXPs, é denominada de Proteínas Inseticidas Ricas em Cisteína (CRXPS), estas proteínas têm 4, 6 ou δ cisteínas e 2 3 ou 4 ligações dissulfeto. üm exemplo desta classe, de compostos ê considerado ser do tipo chamado de proteína de motif de nó de cisteína inibidor (XCK). Proteínas de motif XCK que têm atividade inseticida têm potencial para serem proteínas inseticidas e PXPs<

[143] Proteínas de motif XCK são uma classe de proteínas com pelo menos seis resíduos de cisteína que formam uma estrutura terciária de XCK específica.

Reticulação covalente dos resíduos de cisteína nas proteínas de motif ICK forma ligações dissulfeto que resultam em estruturas terciárias que tornam a proteína relativamente resistente a proteases e algumas vezes a condições físicas extremas (pH, temperatura, luz

W, etc.), e confere atividade contra canais de íons, o que pode ser específico para insetos. Muitas proteínas de motif ICK surgiram no veneno de invertebrados e vertebrados que usam as proteínas de motif ICK como uma toxina para imobilizar ou matar seus predadores ou presas. Esses peptídeos inseticidas frequentemente têm origens de escorpião, aranha e ãs vezes cobra

Na natureza, peptídeos tóxicos podem ser dirigidos ao intestino do inseto ou aos órgãos internos por injeção. No caso de um PXP, a distribuição é geralmente via o consumo pelo inseto de proteína transgénica expressa em tecido de planta. Mediante este consumo da toxina de seu alimento, por exemplo, um inseto se alimenando sobre uma planta transgênica, a proteína de motif ICK. pode ter a capacidade de inibir o crescimento, impedir o movimento ou mesmo matar um inseto.

[144] Peptídeos tóxicos, no entanto, frequentemente perdem sua toxicidade quando eles são expressos em plantas. A menos que a proteína de motif XCK seja expressa como uma proteína devidamente dobrada ela não pode proteger com sucesso uma planta ou colheita de danos de inseto. Em alguns casos um peptídeo expresso em planta precisará ser ativado por divagem dentro do inseto ou durante o processo de expressão em uma planta a fim de ser ativo. Há uma necessidade de métodos e peptídeos e ácidos nucléicos modificados que permitam aos peptídeos não apenas ser expressos em uma planta, mas para serem expressos, dobrados devidamente e, em alguns casos, clivados devidamente de modo que o peptídeo retenha sua atividade contra um inseto mesmo apôs expressão em uma planta. Nesta seção apresentamos várias maneiras para produzir peptídeos ativos adaptados para expressão em plantas.

[14 5] Nós descrevemos várias combinações de diferentes peptídeos operavelmente ligados juntos para fazer novos complexos de proteína. Os seguintes complexos de proteína são descritos. Um peptídeo compreendido de um Peptídeo Sinal de

Retículo Endoplasmático {ERSP) operaveImente ligado a Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (CRIP), tal como uma proteína de motif de Nó de Cistina inibidor (ICK) a qual ê designada como ERSP-ICK, em que o referido ERE.P ê o N-terminal do referido peptídeo, e onde o peptídeo ERSP é de entre 3 a 60 aminoácidos de comprimento, entre 5 a SQ aminoác.idos de comprimento, entre 20 a 30 aminoãcidos de comprimento e ou onde o peptídeo ê BAãS, ou peptídeo sinal extensin de tabaco, ou um peptídeo sinal extensin de tabaco modificado, ou um peptídeo sinal Jun a 3 da uunipercs asheí ou J ashsí.

[146] um peptídeo compreendido de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático (ERSP) operavelmente ligado a Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (CRIP) .< tal como uma proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor (ICK) a qual é designada como ERSP-ICK, em que a referida proteína de motif ICK é de entre 16 e 60 aminoácidos de comprimento, entre 26 e 48 aminoácidos de comprimento, entre 30 e 44 aminoácidos de comprimento e ou onde a proteína de motif ICK ê Ü-ACTX-Kvla, ou Ômega-ACTX-Hvla ou Capa-ACTX-Hvlc.

[14.7] um peptídeo compreendido de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico {ERSP) operavelmente ligado a uma proteína de motif de Nô de Cistina Inibidor (ICK), designada como ERSP-ICK, em que a referida ERSP e proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor* (ICK) são combinações de qualquer um dos tamanhos e comprimentos descritos neste documento e/ou são compreendidas de qualquer uma das sequências identificadas ensinadas neste documento,

[148] um nucleotideo que codifica para qualquer um dos peptídeos que são descritos neste documento como Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico (ERSP) e/ou Proteína Inseticida. Rica

34/273 em Cisteína (CRIP), tal como proteínas de motif de Nó de Cistina inibidor (T.CK) . Uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que codificam para estes peptídeos. Uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que codificam para estes peptídeos transformados em um genoma de planta transgêníca. Um peptídeo em que a referida proteína de motif ICK é uma proteína inseticida. Um peptídeo em que a referida proteína inseticida Ó qualquer uma das proteínas ou peptídeo de motif ICK descrito neste documento. Um peptídeo em que o referido peptídeo inseticida é qualquer peptídeo selecionado de qualquer um dos peptídeos ou fontes de peptídeo incluindo Atrax ou Hadronyche. Um peptídeo inseticida selecionado de qualquer um dos peptídeos na Listagem de Sequências e fragmentos dos mesmos incluindo versões de peptídeo maduro, pré e pro dos referidos peptídeos e números de sequência Um peptídeo em que o referido peptídeo inseticida ê qualquer peptídeo selecionado descrito ou selecionado de uma proteína ACTX. Uma proteína TMOF.

[1491 0 uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos neste documento para fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequadamente dobrados em uma planta transformada. O uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritas neste documento para fazer ou transformar uma planta ou genoma. de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequadamente dobrados na planta transformada e provocar o acúmulo dos peptídeos tóxicas expressos e adequadamente dobradas na referida planta e provocar um aumento na resistência da planta a danos por inseto.

[150] Um método para usar os nucleotídeos de qualquer um dos peptídeos ou ORFs de expressão em um CRIP, um ICK um Não xck, ve tores de expressão de proteins de motif para criar plantas transgênicas. Um vetor de expressão de proteína de motif XCK compreendendo qualquer um dos nucleotídeos os quais expressam quaisquer peptídeos descritos neste documento. um vetor de expressão de proteína de motif ICK incorporado em uma planta transformada compreendendo nucleotídeos que codificam para qualquer um dos peptídeos divulgados neste documento ou que poderíam ser feitos por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Um procedimento para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos descritos neste documento. Uma planta feita por qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento.

[151] Uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Sndoplasmático (BRSP) operavelmente ligado a uma proteína de motif de Nô de Cistina Inibidor (ICK) ou peptídeo rico em cisteína cperavelmente ligado a um peptídeo ligante interveniente (L ou Ligante), o qual é designado como .ERSPLigante-XCK, (BRSP-L-ICíO, ou BRSP-XCK-Ligante (BRSP-XCK-L), em que o referido ERSP é o N-terminal da referida proteína e o referido X. ou X^igante pode estar ou no lado terminal (a montante) da proteína de motif ou no lado C-terminal (a jusante) da proteína de motif ICK. uma proteína designada como erSP-l-XCÍC, ou ERSP~ICK~L, compreendendo qualquer um de ERSPs ou proteínas de motif XCK descritas neste documento e em que o referido L pode ser um peptídeo ligante não clivãvel, ou um peptídeo ligante clivãvel o qual pode ser clivãvel em células de uma planta durante o processo de expressão de proteína ou pode ser clivãvel em ambientes de intestino de um inseto e ambientes de hemolinfa e compreendido de qualquer um dos peptídeos ügantes intervenientes (LIGASTE) desor;

ou ensinados oor este documento incluindo as seguintes sequênci (SEQ pep (SEQ e ETMFKHGL

13m nucleotideo qus qualque coma

Sinai

Re de motif de de Cietina todos e quaisquer nucleotídeos qua ualgu' ima transgênioas.

urn nuoleotídeos que codificam para

Peptídeo

Sinai

Ret

Ct de planta mada de mot i f.

F'd de na peptídeo ligante adequadamente ima usa urn das pept nucleatídeos que codificam

Peutídsa Sinal de ulo

Inibidor au peptídeo ligante αβ na resistência

Üm

QUO

Sndop1asmát ico inibidor (XCK) para motif erveniente para fim da expressar adequadamente dobrados na planta transformada imulo na codificam das pept í rs ^m aumento danas par inseta.

t-1 \λ·' s.

ae

a.

de proteína e/ou peptídeo plantas compreendendo quaIquer motif de EÓ de interve :gaete>

uma =u cleat i deas de expressão estão am urn vetor de expressão ICK expressa quaisquer peptídeos descritos neste documento. ERSP, proteína de motif ICK e/ou ligante, Uma GRF de expressão funcional em um vetor de expressão de proteína de motif ICK incorporado em uma planta transformada compreendendo nucleotideas que codificam para qualquer um dos peptídeos divulgados neste documenta que codificam para ERSP, proteína de. motif ICK e/ou LXCANT'E ou que poderíam ser feitas por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neete documento. Um procedimento para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos

descritos	nes te documente	>. ERSP,.	proteína de motif ICK e/	'OU
LIGANTE.	Uma planta fei	ta por	qualquer um dos produtos	e
processos	descritos neste	document:
(3.553	Uma protein	a compre	end ida. de um Peptídeo Sinal	de
Retículo	Endop1asmát ico	(ERSP)	operavelmente ligado a	ima

proteína de motif de Nó de Cíatina Inibidor (ICK) operaveImente ligado a uma Proteína de Estabilização Translacíonal (STA) o qual ê designado aomo EREP-STA-ICK ou ERSP-ICK-STA, em. que o referido ERSP é o N~terminal da referida proteína e a referida STA pode estar no lado N-terminal (a montante) da proteína de motif ICK do lado C-terminal (a jusante) da proteína de motif ICK. Uma proteína designada como ERSP-STA-ICK ou ERSP-ICK-ETA compreendendo qualquer um dos ERSPs ou proteínas de motif ICK descritas neste documento e onde a STA é compreendida de qualquer uma das proteínas de estabilização translacionais descritas ou ensinadas por este documento incluindo GFP (Proteína Fluorescente Verde), GNA (lectina snowdrop), Jun a 3, (Jun.ípetus aahei) e muitas outras proteínas de -motif ICK.

[156] Um nucleotídeo que codifica para qualquer um dos peptídeos descritos como Peptídeo Sinal de Retículo

38/273

Endoplasmático (ERSP), proteína de motif de NÓ de Cistina Inibidor (ICK) e/ou Proteína de Estab.ilisaçUo Translational (STA) e todos e quaisquer nucleotídeos tendo qualquer um destes grupos funcionais que codificam para qualquer uma destas proteínas que são usados para criar plantas transgênicas,

[1371 O uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos que codificam para Peptídeo Sinal de Reticule Rndoplasmático (EREP)> proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor (ICK) e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para fazer ou trans formar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequ-adamente dobradas em uma planta transformada. 0 uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeoe que codificam para Peptídeo Sinal de Reticule Endoplasmático (ERSP)> proteína de motif de NÓ de Cistina Inibidor (ICK) e/ou Proteína de Estabilização TransXacíonal (STA) para fazer ou trans formar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicas adeqaadamente dobrados na planta transformada e provocar o acúmulo dos peptídeos tóxicos expressos e adequ-adamente dobrados na referida planta e provocar um aumenta na resistência da planta a danos por inseto.

[138] um método para usar os nucleotídeos ou ORFs de expressão que codificam para Peptídeo Sinal de Reticula Endoplasmãtica (ERSP), proteína de motif de Nó de Cistina .Inibidor (ICK) e/ou Proteína de Estabilização Translaaional (STA) em um vetor de expressão ICK para criar plantas transgênicas. Uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos

	.prensam ERSP, proteína	motif ICK e/ou STA	.. Uma GRF	de
expressãa :	funcional em um vetor	de expressão de	proteína	de
motif ICK	que ã incorporado	em uma planta	trans form.	ada
compreendeu	do nucleotídeos que cc	díficam para esse	código p.	ara

ERSP, proteína de motif XCK e/ou STA ou que poderíam ser feitos por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Um procedimento para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando ERSP, proteína motif ICK e/ou STA. Uma planta feita por qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento.

[159] Uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtíco (ERSP.) operavelmente ligado a uma proteína de motif de Nõ de Cistina Inibidor' (XCK) operavelmente ligada a uma Proteína de .Estabilização Translacional (STA) operavelmente ligado a um Peptídeo Ligante Xnterveniente (LIGANTE) o qual ê designado como ERSP-STA-LINKER-XCK, ERSP-ICKLXNKBR-STA, ERSP-STA-L-ICK ou ERSP-ICK-L-STA, em que o referido ERSP é o N-terminal da referida proteína e a referida STA podem estar no lado N-terminal (a montante) da proteína de motif ICK do lado C-terminal (a jusante) da proteína de motif XCK. e o referido LXGANTB está entre STA e a proteína de motif ICK. Uma proteína designada como ERSP-STA-LINKER-ICK ou ERSP-ICK-LINKERSTA> compreendendo qualquer um doa SRSPs, proteínas de motif ICK Peptídeos Ligantes Intervenientes e Proteína de Estabilização Translacional descritos neste documento.

[160] Um nucleotídeo que codifica para qualquer um dos peptídeos descritos como Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtíco (ERSP), proteína de motif de Nó de cisteina Inibidor (ICK)_t Peptídeo Ligante Interveniente (LIGANTE) e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) e todos e quaisquer nucleotídeos que codificam para qualquer uma destas proteínas que são usados para criar plantas transgênicas,

[161] 0 uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos que codificam para Peptídeo Sinal de Retículo

4G

Endoplasmático (ERSP), proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor (ICK), Peptídeo Ligante Xnterveniente e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequadamente dobrados em uma planta transformada. O uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos que codificam para Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico (ERSP), proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor (ICK), Peptídeo Ligante Xnterveniente (LXGANTE) e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequadamente dobrados na planta transformada e provocar o acúmulo dos peptídeos tóxicos expressos e adequadamente dobrados na referida planta e provocar um aumento na resistência da planta a danos por inseto,

[162] Nm método para usai- os nucleotídeos ou ORFe de expressão em um vetor de expressão XCK que codificam para Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico (ERER), proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor (ICK), Peptídeo Ligante Xnterveniente e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para criar plantas transgênicas> Uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos em um vetor de expressão XCK os quais expressam ERSP, proteína motif XCK, LIGANTE e/ou STA. Uma ORF de expressão funcional em um vetor de expressão XCK incorporado em uma planta transformada compreendendo nucleotídeos que codificam para esse código para ERSF, proteína de motif ICE, LIGANTE e/ou STA ou que poderíam ser feitos por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Um procedimento para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando ERSP, proteína motif

41/273

XCK, LIGANTE e/ou STA. Uma planta feita por qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento.

[163] uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplaamático (ERSP) operavelmente ligado a domínio de proteína de motif de Nõ de Cistina Inibidor (ICK) múltiplo o qual é operavelmente ligado par Peptídeos Ligantes Intervenientes (LIGANTE) .< operavelmente ligados a uma Proteína de Estabilização Translacional (STA) operavelmente ligada a um Peptídeo Ligante Interveniente o qual é designado como ERSP-STA(LIGANTEf~ICKj)_s ou ERSP- (ICK-j -LICANTE, J^-STA e algumas vezes como ERSP-STA- (Ai-XCKjis; ou ERSP- (lCK_rLO_s-STA, em que o referido ERSP ê o N~terminal da referida proteína e a referida STA podem estar no lado N terminal (a montante) do domínio de proteína de motif ICK múltiplo ((LIGANTEi-lCK-Os) ou lado C«terminal (a jusante) do domínio de proteína de motif ICK múltiplo ((ICKj-LINKER,) ^ & ° referido Peptídeo Interveniente (LINKER>.) estã entre STA e o domínio de proteína de motif ICK múltiplo. Uma proteína designada como ERSP-STA- (LIGAETEí-ICK^_:8 ou ERSP- (ICK^-LIGANTEOj?STA, compreendendo qualquer um dos ERSFs, proteínas de motif ICK Peptídeos Ligantes Intervenientes e Proteínas de Estabilização Translacional descritas neste documento.

[164] Um nucleotídeo que codifica para qualquer um dos •peptídeos descritos como Peptídeo Sinal de .Retículo Endoplasmático (ERSP) , domínio de proteína de motif de Nõ de Cistina Inibidor (ICK) múltiplo, Peptídeo Ligante interveniente (LXGANTE) e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) e todos e quaisquer nucleotideas que codificam para qualquer uma destas proteínas que são usados para criar plantas transgénicas.

(155] O uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos que codificam para Peptídeo Sinal de Retículo

Endoplasmãtico (ERSP), domínio de proteína de motif de N6 de Cistina Inibidor (ICK) múltiplo, Peptídeo Ligante Interveniente,. (LIGANTE) e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequadamente dobrados em uma planta transformada. 0 uso de qualquer um dos peptídeos cu nucleotídeos que codificam para Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico (ERSP), domínio de proteína de motif de Nó de Cistina inibidor (ICK) múltiplo, Peptídeo Ligante Interveniente (LIGANTE) s/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar* peptídeos tóxicos adequadamente dobrados na planta transformada e provocar o acúmulo dos peptídeos tóxicos expressos e adequadamente dobrados na referida planta e provocar um aumento na resistência da planta a danos por inseto.

[166] Um método para usar* os nucleotídeos ou ORFs de expressão que codificam para Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico (ERSP), domínio de proteína de motif de Nó de Cistina inibidor (ICK) múltiplo, Peptídeo Ligante Interveniente (LXGANTE) e/ou Proteína de Estabilização Translacional (STA) para criar plantas transgénicas . U®a QRF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos os quais expressam ERSP, domínio de proteína motif ICK múltiplo, L ou LIGANTE s/ou STA. uma ORF de expressão funcional incorporada em uma planta transformada compreendendo nucleotídeos que codificam para ERSP, domínio de proteína de motif ICK múltiplo, LIGANTE e/ou STA ou que poderíam ser feitos por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Um procedimento para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando ERSP, domínio de proteína motif ICK. múltiplo, LIGANTE e/ou STA. Uma planta feita par qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento.

[167] Um gene químérico compreendendo um promotor ativa em plantas operativamente ligado aos ácidos nucleioos ou ORF de expressão dos núcleotídeos descritos neste documento. Um método para fazer, produzir ou usar estes genes quiméricos que são descritos neste documento. Um vetar recombinante compreendendo os genes quiméricos descritos neste documente. Um método para fazer, produzir ou usar os vetores recombinantes descritos neste documento. Uma célula hospedeira transgênica compreendendo os genes quiméricos descritos neste documento. Um método para fazer produzir ou usar as células hospedeiras transgênícas descritas neste documento. Uma célula hospedeira transgênica como descrita neste documento a qual ê uma célula de planta transgênica. Um método para, fazer, produzir ou usar as células de plantas transgênícas descritas neste documento. Uma planta transgênica compreendendo a célula de planta transgênica descrita neste documento. Um método para fazer, produzir ou usar as plantas transgênícas descritas neste documento, uma planta transgênica como descrita neste documento a qual é feita de um milho, soja, algodão, arroz, triga, sorgo, painço amarelo, cana-de-açúcar, alfafa, batata, tomate, tabaco, qualquer um de vegetais de folhagens verdes ou qualquer uma de árvores frutíferas. Semente de uma planta transgênica como descrita neste documento em que a referida semente compreende um gene quimérico como descrito neste documento. Um método para fazer, produzir ou usar a planta transgênica descrita neste documento. Um método para fazer, produzir ou usar as sementes descritas neste documento.

[168] Proteínas de motif de nô de cisteína inibidor (XCK) expressas em planta de aranhas e escorpiões foram descritas (Khan et al, Transgenic Res., 2006, 15 í 349-357;

Hernández-Campuzano et al, lexicon. 2009 Jan;S3(1);122-8,) . Nós descrevemos como fazer proteínas de motif ICK expressas em planta que são ativas e acumulam em plantas até níveis de dose inseticida. Nós mcstramas que as descrições anteriores de proteínas de motif ICK expressas em planta foram realmente descrições de proteínas inativas que haviam perdido sua toxicidade natural. Nós descrevemos métodos para aumentar a eficácia d.a expressão de planta, aumentar o acúmulo de proteínas expressas em planta e aumentar dramaticamente a atividade inseticida de proteínas expressas em planta. Nós descrevemos como induzir as proteínas de motif ICK expressas em planta a entrar no Retículo Endoplasmático {ER) dirigidas por uma Proteína de Sinalização de Retículo. Endoplasmático (ERSP) em células de planta a fim da correta reticulação de pontes dissulfeto de peptídeo aa quais geram a estrutura de motif ICK terciária essencial requerida para atividade inseticida. Nós ainda descrevemos o complexo de proteína de motif ICK da tráfico de ER expresso em planta com um domínio de proteína de estabilização translacional (STA) adicionado a fim de aumentar o tamanho da proteína de fusão ICK resultante a qual intensifica o acúmulo de peptídeo na planta, NÕa ainda descrevemos a proteína de motif ICK de tráfico de ER expressa em planta com uma proteína de estabilização translacíonal adicionada e com um peptídeo ligante ínterveniente (LIGANTE) adicionado, o último dos quais -pode permitir divagem substancial e a recuperação da forma ativa da proteína de motif ICK tendo atividade inseticida, Nós ainda descrevemos o polipeptídeo expresso em planta o qual contém domínio de proteína de motif ICK de tráfico de ER com múltiplas proteínas de motif ICK separadas por peptídeos

45/2 lígantes interveníentes (LIGASTE) com um peptídeo ligante interveniente adicionado com uma proteína de estabilização da tradução adicionada, o último dos quais permite que a proteína de motif ICE corretamente dobrada, acumule na planta até a dose inseticida.

[169] Esta invenção descreve a proteína de motif XCK com atividade inseticida que é expressa em planta e a qual pode proteger com sucesso uma planta ou colheita de danos de inseto. A QRF de expressão de proteína de motif XCK descrita neste documento é um nucleotideo o qual permitirá aos peptídeos traduzidos na planta não apenas serem expressos em uma planta, mas também serem expressos e dobrados apropriadamente e serem acumuladas até a dose inseticida na planta. Um exemplo de uma qrf de expressão de proteína pode ser uma QRF de expressão de proteína, de motif XCK a qual pode ser descrita abaixa em estilo de equação e é mostrada em estilo de diagrama noa desenhos ou figuras -

A expressão acima é meramente um exemplo e expressões similares poderíam ser escritas para outros tipos de òRFs da expressão de GRIP, por exemplo, uma QRF de expressão XCK podería ser escrita como;

[170] Estas expressões, equações ou diagramas lineares descrevem uma estrutura de leitura aberta de polínucleotídeo (QRF, para um tipo de CRIP, um o qual expressa o complexo de proteína de motif XCK. o qual pode ser descrito como ER5P-STA(LIGAETEj-lCíQd^ OU ERSP-(ICK,_r-LIGANTE; j _:;r-STA... OU COCO ERSP-STA(Lr-ICKjJs ou ERSF- {XCKj-LslsrSTA, contendo quatro componentes de peptídeo possíveis com sinais de traços para separar cada componente, Nos diagramas acima, o componente de nucleotídeo de ersp ê um segmento de polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal de tráfico de retículo endoplasmático de planta (ERSB) . 0 componente de sta ê um segmento de polinucleotídeo codificando uma proteína de estabilização de tradução (STA) a qual ajuda no acúmulo da proteína de motif XCK expressa em plantas, mas pode não ser necessário na ORF de expressão de proteína de motif XCK. 0 componente de iígantei á um segmento de polinucleotídeo codificando um peptídeo ligante interveniente (L OU LXGAHTR) para separai- as proteínas de motif XCK entre si e da proteína de estabilização de tradução e o subscrito i indica que tipos diferentes de peptídeos ligantes podem ser usados na ORF de expressão de CRX? ou proteína de motif XCK, No caso em que sta não ê usada na ORF de expressão de proteína de motif XCK, ersp pode ser diretamente ligado ao polinucleotídeo codificando uma proteína da motif XCK sem um ligante. 0 componente de íck< é um segmento de polinucleotídeo codificando uma proteína de motif XCK (XCK), e o subscrito j indica diferentes proteínas de motif XCK; (líganeei-ic^jj? indica que a estrutura da nucleotídeo codificando um peptídeo ligante interveniente e uma proteína de motif XCK podem ser repetidas ^S'N vezes na mesma estrutura de leitura aberta na mesma ORF de expressão de proteína de motif XCK, onde N pode ser qualquer número inteiro de 1 a 10. N pode ser de 1 alú, especificamente N pode ser 1, 2 3_f 4_f ou 5, e em algumas modalidades N é 6, 7, S, 9 ou 10. As repetições podem conter segmentos de polinucleotídeos codificando diferentes ligantes intervenientes (LXGANTE) e diferentes proteínas de motif XCK» Os diferentes segmentos de polinucleotídeo incluindo as repetições dentro da mesma ORF de expressão de proteína de motif XCK estão todos dentro da mesma estrutura de tradução.

[171] Qualquer combinação dos quatro componentes principais, ersp, sta, .Ligante e críp ou ick como no diagrama da ORF de expressão de proteína de motif XCK, pode ser usada para criar uma ORF de expressão de proteína de motif XCK tipo pep contanto que um mínimo de ersp e pelo menos uma eópia de crip ou íck sejam usados.

[172J X. O componente ERSP ou srsp dos PEPs.

[173] A ORF de expressão de proteína de motif XCK começa com um ersp em seu terminal 5^f . Para a proteína de motif XCK ser dobrada adequadamente e funcional quando ela for expressa de uma planta transgênica, ela deve ter um nucleotídeo ersp fundido na estrutura com o polinucleotídeo codificando uma proteína de motif XCK. Durante o processo de tradução celular, ERSP traduzido pode dirigir a proteína de motif XCK sendo traduzida para inserir no Retículo Bndoplasmãtico (SR) da célula de planta ligando com um componente celular chamado uma partícula de reconhecimento de sinal. Dentro do ER o peptídeo .ERSP é clivado por peptidase sinal e a proteína, de motif XCK ê liberada para, o ER, onde a proteína de motif XCK é adequadamente dobrada durante o processo de modificação pos~tradução, por exemplo, a formação de ligações dissulfeto. Sem quaisquer sinais de proteína de retenção adicionais, a proteína é transportada através do er para o aparelho Golgi, onde ela é finalmente secretada fora da membrana do plasma e para o espaço apoplãsico. Ά proetína de motif XCK pode acumular no espaço apoplãsico de modo eficaz para alcançar a dose inseticida em plantas. Fig» 1 mostra um diagrama representativo de um peptídeo ou nucleotídeo de dois componentes simples composto de um ERSP funcionalmente ligado a um motif XCK. 0 XCK podería ser um CRXP adequado.

Proteínas e polinucleotídeos mais complexos utilizando ERSP são diagramados nas Figs. 2~5 e estas figuras são ainda discutidas na discussão da. STA ou Proteína de Estabilização Translacíonal.

[174] O peptídeo ERSP estã na região N- terminal do complexo de proteína de motif ICK traduzida na planta e a porção de EREP ã composta de cerca de 3 a 50 aminoácidos. Em algumas modalidades ela é de 5 a 60 aminoãcidos. Em algumas modalidades ela é de 10 a 40 aminoácidos, mas frequent emente é composta de 15 a 20? 20 a 25; ou 25 a 30 aminoácidos > 0 ERSP ã um peptídeo sinal assim chamado porque ele dirige, o transporte de uma proteína. Peptídeos sinal também podem ser chamados de sinais alvo, sequências sinal, peptídeos de trânsito ou sinais de localização. Os peptídeos sinal para tráfico de ER são frequentemente de 15 a 30 resíduos de aminoãcido de comprimento e têm uma organização tripartite compreendida de um núcleo de resíduos hidrofóbicos flanqaeado por um aminotermiual positivamente carregado e um polar,, mas região carbóxiterminal não carregada. (Bimmermann, et al, Protein translocation across the ER membrane, Biochimica et Biohysica Acta, 2011, 1808: .912 924) .

[175] Muitos EREPs são conhecidas. Muitos EREPs de planta são conhecidos. NÃO é necessário que o ERSP seja derivado de um ERSP de planta, EREPs não de planta trabalharão com os procedimentos descritos neste documento. Muitos EREPs de planta são, no entanto, bem conhecidos e nós descrevemos alguns EREPs derivados de planta aqui. BAAE, por exemplo, ê derivado da planta, Hordeum vulgare, e tem a sequência de aminoãcido como a seguir:

MANKHLSLSLFLVLLGLSA.SLASG· (SEQ IO NO: 4)

[176] EREPs de planta os quaie são selecionados da sequência genômica para proteínas que são conhecidas por serem expressas e liberadas para o espaço apoplãsico de plantas, e alguns exemplos são BAAS, extensina de cenoura, PR1 de tabaco. As seguintes referências fornecem descriçõs adicionais e são incorporadas por referência neste documento em suas totalidades. De Loose, M> et al. The extensin signal peptide allow secretion of a heterologous protein from protoplasts Gene, 99 (1.991) 95-100. De Loose, M> et al, descreveram a anãlise estrutural de urn gene de codificação de extensina de Nicotians plumbaginifolia, a sequência da qual contêm um peptídeo sinal típico para translocação da proteína para o retículo endoplasmãtico. Chen, Μ.H. et al. Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells* Plant Physiology, 2004 Jul; 135(3): 1367-7'7. Epub 2004 Jul 2. Chen, M.H. et al, estudaram a localização subcelular de o-amilases em células de planta analisando a expressão de o-amylase, com e sem seu peptídeo sinal, em tabaco transgênico. Estas referências e outras ensinam e divulgam o peptídeo sinal que pode ser usado nos métodos, procedimentos e complexos e constructos de peptídeo, proteína e nucleotídeo descritos neste documento.

[177] XX. O componente de CRXP e proteína de motif XCK ou crip e íoà dos FEPs,

[1?§] No nosso diagrama de ORF de expressão de proteína de motif ICK, ick significa um polinucleotídeo codificando uma proteins de motif XCK ou proteína de motif de nó de c is tina inibidor', o qual é um peptídeo de 16 a 60 aminoãcidos com pelo menos 6 aminoácidos de núcleo de meia cisteína tendo três pontes dissulfeto, em que as 3 pontes díssulfeto são ligações covalentes e dos seis resíduos meia cisteína as ligações dissulfeto covalantes estão entre a. primeira e quarta, a segunda a quinta a a terceira e sexta meias cisteínas, dos seis aminoácidos meia cisteína de núcleo começando do aminoãcido N~ terminal. A proteína de motif ICK também compreende uma estrutura secundária beta-hairpín, normalmente composta de resíduos situados entre a quarta e a sexta meias cisteínas de núcleo do motif, o hairpin sendo estabilizado pela reticulação estrutural fornecida pelas trás ligações dissulfeto do motif. Notem que aminoácidos cisteína/cisteína ou meia cistina adicionais podem estar presentes dentro do motif de nó cisteína inibidor, como mostrado na Fig. δ. O CRIP ou motif ICK pode ser repetido a fim de aumentar o acúmulo de peptídeo tóxico na planta. Ver Fig. 4 e Fig. 5. Esta capacidade de repetir o CRIP ou motif XCK de 1 a 10 vezes e algumas vezes até 15, 20 ou 25 vezes também é mostrada no diagrama, tipo equação de um CRIP ou ORF de expressão de proteína ICK descrito neste documento como ersp-sta-(ligantei-ickj)ou ersp-(ickj~.ligantei)s-sta onde o número de motifs bIGANTE-XCK de repetição é dado pelo número subscrito N e N é comumente de 1-10, mas pode ser ainda mais alto em algumas plantas.

[1.79] Uma expressão similar como ersp-sta-{liganteiíakjhn ou ex-sp-ííckj-iígantei)^~^t’® podería ser escrita e descrevería outros peptídeos CRIP. Nesta seção um exemplo de uma ORF de expressão é um usado para aumentar expressão de peptídeo em plantas e é mais bem exemplificada com uma proteína ICK. No diagrama acima, uma estrutura de leitura aberta (ORF)

de	polinu©	leatídeo a	qual expressa um.	complexo	de proteína de
matif ICK	o qual pode	ser descrita como	ERSP~STA	~ (LIGANTEs- XCKy) _s
OU	ERSP- (I·	CK.y-LIGANTEx	)^-STA, au coma ERS	P-STA- CL·	r-ICKjljí au ERSP-

(XCK^-Li)h-STA, contendo quatro componentes de peptídeo possíveis

com sinais de traço

para separar cada componente que e usado.

Um método alternativo de mostrar este tipo de constructo pode ser encontrado nas figuras. No diagrama e nas figuras, o componente de nucleotídeo de ersp é um segmento de polinucleotideo codificando um peptídeo sinal de tráfico de

re tícu1q endoplasmát:

ico de planta (SRSP) . 0 componente de sta é

um segmento de polinucleotídeo codificando uma proteína da estabilização de tradução (STA) a qual ajuda no acúmulo da

proteína de motif 3	:CK expressa em plantas, mas pode não ser
necessário na ORF <	âe expressão de proteína de motif XCK. 0
componente de li ê u	m segmento de polinucleotídeo codificando um
peptídeo ligante inl	:erveniente (L QU LIGANTE) para separar as
proteínas de motif 3	CCK entre si e da proteína de estabilização
de tradução e o sul	escrito i* indica que tipos diferentes de
pept ídeos 1igant es	podem ser usados na ORF de expressão de
proteína de motif IC	K. No caso em que sta não é usado na ORF de

expressão de proteína de motif ICK, ersp pode ser diretamente ligado ao polinucleotídeo codificando uma proteína de motif XCK sem um ligante. O componente de xcRs. é um segmento de polinucleotídeo codificando uma proteína de motif XCK (XCK), e o

subscrito j* índj

Lca diferentes proteínas de motif ICK;

(Hgautei-ácJcfhj indica que a estrutura do nuoleotídeo codificando um peptídeo ligante interveníente e uma proteína de

motif XCK uodem ser

repetidas N vezes na mesma estrutura de

leitura aberta na mesma ORF de expressão de proteína de motif

ICK, onde N pode ser	qualquer número inteiro de 1 a 10, mas pode
ser ainda mais altc	> até 15, 20 e 25, estas repetições podem
conter segmentos	de polinucleotídeo codificando ligantes

intervenientes diferentes e diferentes proteínas de motif XCK ou

GRIP. Os diferentes

segmentos de polinucleotídeo incluindo as

repetições dentro da mesma ORF de expressão de proteína de motif ICK ou CRIP estão todos dentro da mesma estrutura de tradução.

[180] Este motif é comum em peptídeos isolados do veneno de numeroass espécies. Espécies invertebradas incluem aranhas, escorpiões, caramujo cone, anêmona do mar, etc., outros exemplos são numerosos, mesmo veneno de cobra é conhecido por ter peptídeos tendo o motif ICK. Um exemplo dentro das aranhas que nós usamos é de uma classe de peptídeos ACTX da Aranha Teia de Funil das Montanhas Azuis da Austrália, mas os procedimentos descritos neste documenta são úteis e podem ser aplicados a qualquer proteína com o motif XCK.

[181] Exemplos de toxinas de peptídeo com o motif XCK podem ser encontradas nas seguintes referências. 0 bloqueador de canal de cãlcio tipo N o-Conotoxina foi revisto por Lew, M.J. et al» “Structure-Function Relationships of o-Conotoxin GVIA* Journal of Biological Chemistry, Vol. 272, N* 18, Edição de Maio 2, pp. 12014-12823, 1997. Vm sumário de numerosos peptídeos tóxicos de artrópode de diferentes espécies de aranha e escorpião foi revista em Quintero-Hernandez, V. et al. “Scarpion and Spider venom Peptidesj Gene Cloning and Peptide Expression* Toxicon, 58, pp. 844-863, 2811. A estrutura tridimensional, de Hanatoxinl usando espectroscopia NMR foi identificada como um motif de nó cisteina inibidor em Takahashi, H. et al. “Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K* channels: common surface features of gating modifier toxins* Journal of Molecular Biology, Volume 2.97, Edição 3, 31 Março 2088, pp. 771-780, O isolamento e a ident if i cação de cDNA codificando um peptídeo de toxina ICK de veneno de escorpião, Opicalcinel, foram publicados por ãha, s. et al. “Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides* FASES J., 2883 Set 17 (12):1765-7, Epub 2003 Jul 3. A designação específica de sequência e a identificação de estrutura secundária de BgK, uma toxina bloqueadora de canal de κ da anêmona do mar Bunodosoma granulífera, foram divulgadas por Dauplais, M< et al. On the convergent evolution of animal toxins* Journal of Biological Chemistry. 1997 Fev 14; 272(7): 4302-9. Uma revisão da composição e farmacologia de venenos de aranha com ênfase em estrutura de toxina de polipeptídeo, modo de ação e evolução molecular mostrando pontes de cisteina, formações de nô cisteina e a dobra knotting-type* foi publicada por Escoubas, P. et al. Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins* Bioohirda, vol. 82, Edições 8-10, 10 Setembro 2000, pp. 893-907. 0 peptídeo purificado, iberiotoxina, um inibidor do canal de KA ativado por Ca de veneno de escorpião (Suthus tamulus) foi divulgado em Galvez, A, et al. Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus* Journal of Biological C3ies:istry, 199-0 Jul S; 265(19): 11083-90. 0 peptídeo purificado, caribdotoxina, um inibidor do canal de EA ativado por Ca , do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus foi divulgado em Gimensz-Gallego, G. et al, Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels* Proc BbtJ Acad Sei, 1988 Mai; 85(10): 3329-3333. Destas e de outras publicações, aqueles versados na técnica serão capazes de prontamente identificar proteínas e peptídeos tendo o que descrevemos como o motif ICK, proteína de motif ICK ou o motif de nó cistina inibidor.* (182] A proteína de motif ICK pode ser qualquer proteína com o motif ICK. e está entre 16 e 50 aminoácidos de comprimento, com pelo menos 5 resíduos de cisteína que criam ligações dissulfeto de reticulação covalentes na ordem própria. Ver Fig. 6. Alguns peptídeos de motif ICK têm entre 26-50 aminoácidos de comprimento. Algumas proteínas de motif ICK estão entre 16-48 aminoácidos de comprimento. Algumas proteínas de motif ICK estão entre 26-48 aminoácidos de comprimento. Algumas proteínas de motif ICK estão entre .30-44 aminoácidos de comprimento. Proteínas de motif XCK com atividade inseticida natural são preferidas, mas proteínas de motif. ICK com outros tipos de atividade, tal como resistência a sal e congelamento, são conhecidas por aqueles versados na técnica e são reivindicadas neste documento. Exemplos de proteínas de motif ICK inseticidas incluem os peptídeos e genes ACTX, e incluindo todos os peptídeos e seus genes de codificação conhecidos como Magi6.

[183] Um exemplo de uma ORF de expressão de proteína poder ia ser uma ORF de expressão de proteína de motif ICK diagramada abaixo como;

ersp-sta-(lígante^ou ersp- (íefc-IígantexJ_Av~sta

[184] Uma expressão similar podería ser escrita para outros peptídeos CRXP. Nesta seção este exemplo de uma ORF de expressão é um usado para alta expressão de peptídeo e ê mais bem exemplificado com uma proteína ICK. o diagrama acima é uma estrutura de leitura aberta de polinucleotídeo (ORF) gue expressa um complexo de proteína de motif ICK o qual poda ser descrito como ERSP-STA- (LIQANTEr-ICKj)_s ou ERSP- (ICKy-LIGANTE_x)^” STA, ou como ERSF-STA-· (L_x- ICKy)» ou FRSP- {XCKr-I»j)a-STA, contendo guatro componentes de peptídeo possíveis com sinais de traços para separar cada componente. Neste diagrama o componente de

55/273 nucleotídeo de ersp é um segmento de polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal de tráfico de retículo endopl..asmático de planta (ERSP) . 0 componente de sta é um segmento de polinucleotideo codificando uma proteína de estabilização de tradução {STA) a qual ajuda no acúmulo da proteína de motif XCK expressa em plantas, mas pode não ser necessário na ORF de expressão de proteína de motif XCK. 0 componente de é um segmento de polinuc.leotf.deo codificando um peptídeo ligante interveniente (L OU LXGANTE) para separar as proteínas de motif ICK entre ei e da proteína de estabilização de tradução a o subscrito *i indica que tipos diferentes de peptídeos ligantas podem ser usados na ORP de expressão de proteína de motif XCK. No caso em que sta não é usado na 0RF de expressão de proteína de motif XCK, ersp pode ser diretamente ligado ao polinucleotídeo codificando uma proteína de motif XCK sem um ligante < O componente de ick< é um segmento de polinucleotídeo codificando uma proteína de motif ICK (XCK), e o subscrito *j indica diferentes proteínas de motif XCK; (Xígantei.-ic&j)ij indica que a estrutura do nucleotídeo codificando um peptídeo ligante interveniente e uma proteína de motif ICK podem ser repetidas N vezes na mesma estrutura de leitura aberta na mesma. QRF de expressão de proteína de motif XCK, onde N pode ser qualquer número inteiro de 1 a 10, e as repetições podem conter segmentos de polinucleotídeo codificando ligantes intervenientes diferentes e diferentes proteínas de motif ICK ou CRIF» Os diferentes segmentos de polinucleotídeo incluindo as repetições dentro da mesma ORF de expressão de proteína de motif XCK ou CRXP estão todos dentro da mesma estrutura de tradução.

[185] Exemplos de proteínas de motif ICK inseticidas incluem os peptídeos e genes ACTX, e incluem todos os peptídeos e seus genes de codificação coto descritos nas referências fornecidas acima e neste documento. Exemplos específicos de proteinase peptídeos de motif XCK divulgados para fins de fornece exemplos e não destinados a limitar de qualquer maneira, são os peptídeos e suas homologias como descrito acima e, em particular₍ peptídeos e nucleotídeos os quais se originam dos venenos da aranhas Teia de Funil da Austrália. Os seguintes documentos são incorporados por referência nos Estados Unidos em sua totalidade, são conhecidos daqueles versados na técnica e todos foram publicados. Eles divulgam numerosas proteínas de motif ICK a sequência de peptídeo completa, a sequência de nucleotídeo completa das quais são especificamente divulgadas e são incorporadas por referência e em acréscimo ãs divulgações completas são incorporadas por referência incluindo todas as suas listagens de sequência. Ver o seguinteí US 7.354.993 B2, expedida em 8 de abril de 2G08₍ esuecificamente as seouências de peptídeo e nucleotídeo listas como sequências 1 - .39, de 7.354.993 B2, e aquelas denominadas polipeptídeos U-ACTX e estas e outras toxinas que podem formar 2 a 4 pontes dissulfeto intracadeia e variantes das mesmas, e os peptídeos aparecendo nas colunas 4 a 9 e na Fig. 2 de 7.354.993 B2. Outras sequências específicas podem ser encontradas na patente EP 1 >312 464 Bl, publicada e concedida em 08.10.2008, ver .Boletim 2008/41, especificamente as sequências de peptídeo e nucleotídeo listadas na listagem de sequências, e aquelas outras toxinas que podem formar 2 a 4 pontes dissulfeto intracadeia e aquelas sequências listadas lá como 1 - 39, e sequências denominadas polipeptídecs ü-ACTX e variantes das mesmas e os peptídeos apai-ecendo nos parágrafos 0023 a 0055, e aparecendo na Fig. 1 da patente EB 1

[186] Descritas e incorporadas por referência nos peptídeos identificados neste documento estão variantes homólogas de sequências mencionadas tendo homologia para essas sequências ou citadas neste documento as quais também são identifiçadas e reivindicadas como adequadas para se tornarem especiais de acordo com os processos descritos nesta documento, incluindo todas as sequências homólogas tendo pelo menos alguma das seguintes identidades percentuais para alguma das sequências divulgadas neste documento ou para alguma das sequências incorporadas por referência: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 68%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou identidade maior ou 100% de identidade para todas e quaisquer sequências identificadas nas patentes notadas acima, e para alguma outra sequência identificada neste documento, incluindo toda e qualquer sequência na listagem de sequências deste pedido. Quando o termo homolólogo ou homologia ê usado neste documento com um nümero tal como 50% ou maior, então, o que queremos dizer é identidade percentual ou similaridade percentual entra dois peptídeos. Quando homólogo ou homologia é usado sem uma percentagem numérica, então, ele se refere a duas sequências de peptídeo que estão intimamente relacionadas no aspecto evolucionério ou desanvolvimental em que elas compartilham aspectos físicos e funcionais comuns, como toxicidade tópica e tamanho similar (isto é, o homólogo estando dentre de 100% do comprimento maior ou 50% do comprimento menor do peptídeo especificamente mencionado neste documento ou identificado por referência neste documento somo acima)<

[187] Descritos e incorporados por referência nos peptídeos identifiçados neste documento são peptídeos tóxicos incluindo o seguinte? peptídeos e suas variantes encontrados em,

isolados de,

ou derivados de aranhas do gênero Atrax ou

Hadronyche, incluindo a espécie de gênero, Hadronyche versuta, ou aranha de teia de fun.il das Montanhas Azuis, Atrax robustus, Atrax formidabilis, Atrax ínfensus, incluindo toxinas conhecidas como polipeptídeos U-ACTX, n-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU~ACTX~ Hvlb, ou mutantes ou variantes, especialmente peptídeos de quaisquer destes tipos e especialmente aqueles inferiores a cerca de 200 amincácidoa, mas maiores do que cerca de 10

aminoácidos,	e especialmente peptídeos inferiores a cerca de 150
amínoãcidos,	mas maiores do que cerca de 20 amínoãcidos,
especialmente	: peptídeos inferiores a cerca de 100 aminoácidos,
mas maiores	do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente
peptídeos i nj	íeriores a cerca de 65 aminoácidos, mas maiores do
que cerca de	25 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores
a cerca de	55 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25
aminoácidos,	especialmente peptídeos de cerca de 37 ou 35, ou

cerca de 36 a 42 aminoácidos, especialmente peptídeos com mer

do que cerca	de 55 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25
aminoácidos,	especialmente peptídeos inferiores a cerca de 45
amínoãcidos,	mas maiores do que cerca de 35 aminoácidos,

especialmente peptídeos inferiores a cerca de 115 aminoácidos,

mas maiores	do que cerca de 75 aminoácidos, especialmente
peptídeos iní	:erlores a cerca de 105 aminoácidos, mas maiores do
que cerca de	85 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores
a cerca de	100 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 99
aminoácidos,	incluindo toxinas de peptídeos de qualquer um dos
c owp.7? ,í Ü os	mencionados aqui que podem formar 2 , 3 e 4 ou mais
pentes de	dissulfeto íntracadeia, incluindo toxinas que

interrompem as correntes dos canais de cálcio, incluindo as

toxinas cue

interrompem as correntes de canal de potássio,

59/273 especialmente toxinas que interrompem os canais de cálcio de inseto ou Us dos mesmos, especialmente toxinas ou variantes dos mesmos de qualquer um destes tipos, e qualquer combinação de qualquer um dos tipos de toxinas aqui descritos que têm atividade inseticida oral ou tópica, pode ser tornada especial pelos processos aqui descritos.

(188] Os peptídeos ü de Aranha Teia de Funil da Austrália, gênero Atrax e Hadronyc.be são parti cularmente adequados e trabalham bem quando tratados pelos métodos, procedimentos ou processos descritos por esta invenção. Exemplos de tais peptídeos adequados testados e com os dados são fornecidos aqui. As seguintes espécies são também conhecidas especificamente por transportar peptídeos tóxicos adequados para expressão em planta como PXPs pelo processo desta invenção. As seguintes espécies sãc especificamente denominadas: Atrax formídabíllis,. Atrax infensus, Atrax robustus, Hàdronyche ínfensa, Hadronyche versuta. Quaisquer peptídeos tóxicos derivados de qualquer um dos gêneros acima listados e/ou da espécie de gênero e homólogos para o peptídeo U são adequados para expressão em planta como PXPs de acordo com o processo desta invenção.

(189] Os Exemplos neste relatório descritivo não se destinam e não devem ser utilizados para limitar a invenção, eles são fornecidos apenas para ilustrar a invenção.

(190] Conforme indicado acima, muitos peptídeos são candidatos adequados como o objeto do processo para a expressão em planta como PIP. As sequências notadas acima, abaixo e na listagem de sequências são peptídeos especialmente adequados que podem se expressos em. plantas como PXF e alguns destes foram expressos em plantas como PXP de acordo com esta invenção oom os resultados mostrados nos exemplo abaixo.

GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO.

5)

Denominada ^wU-f-2-ACTX-Rvla ela tem pontes dissulfeto nas posições; 5-20, 12-25, 19-39. O peso molecular é de 4564,85 Daltons. Outro exemplo de uma proteína inseticida de motif XCK;

QYOVP YDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA (SEQ ID NO: 6)

Denominada ‘‘Ü-ACTX-Hyla” eia tem pontes dmsuifetu nas posições: 3-18, 10-23, 1737.0 peso molecular e de 44204 Daltons,

[191] Exemplos adicionais incluem muitas sequências na listagem de sequências.

[192] XXIx 0 componente de proteína de estabilização translacional, STA ou ata»

[193] Uma das ORFs de expressão de proteína de motif ICK, ERSP-ICK, é suficiente para expressar um peptídeo de motif XCK corretamente dobrado na planta transformada, mas a fim de proteger eficazmente uma planta de danos por pragas,· a proteína de motif ICK expressa em planta precisa ser acumulada até o nível inseticida. Com uma transformação de uma ORF de expressão de proteína de motif XCK construída adequadamente, uma planta transgênica pode expressar e acumular quantidades maiores da proteína de motif ICK adequadamente dobrada. Quando uma planta acumula maiores quantidades de peptídeos tóxicos devidamente dobrados, ela pode mais facilmente resistir ou matar os insetos que atacam e comem as plantas, A proteína de estabilização translacional pode ser utilizada para aumentar signifícativamente a acumulação do peptídeo tõxico na planta e, assim, a potência do PIR, especialmente quando o PIP tem uma proteína de estabilização translacional própria sua. Ver várias representações de como a STA pode ser utilizada em ORFs de

61/273 expressão nas Figs. 2~S, e em vários diagramas lineares ou expressões tipo equação usadas abaixo. A proteína de estabilização translacional pode ser um domínio de outra proteína ou ela pode compreender uma sequência de proteína inteira. A proteína de estabilização translacional é uma proteína com estrutura terciária suficiente que ela pode acumular em uma célula sem ser alvo pelo processo celular de degradação de proteína. A px^oteína pode ser de entre 5 e 50aa (por exemplo, outra proteína de motif ICK), 50 a 250aa (GNA), 250 a 750aa (por exemplo, quitinase) e 750 a ISOOaa (por exemplo, enhancina).

[194] Em adição às Figs. 2-5 o seguinte diagrama linear abaixo descx'eve um dos exemplos da OFF de expressão de proteína de motif XCK que codifica para uma proteína de estabilização fundida com proteína de motif XCK:

[l$/5] A proteína ou o domínio de proteína podem conter proteínas que não têm outras características úteis que não estabilização de tradução ou elas podem ter outros traços úteis além da estabilização de translacional. Traços úteis podem incluir; atividade inseticida adicional, tal como atividade que ê destrutiva para a membrana peritrófica, atividade que é destrutiva para a parede do intestino e/ou atividade que transporta de forma ativa a proteína de motif XCK através da parede do intestino. Uma modalidade da proteína de estabilização transi acionai pode ser um polímero de proteínas de fusão envolvendo proteínas de motif ICK. üm exemplo especifico de uma proteína de estabilização translacional é fox^xnecido aqui para ilustrar o uso de uma proteína de estabilização translacional. O exemplo não tem a intenção de limitar a divulgação ou as

62/273 reivindicações de qualquer forma. Proteínas de estabilização translacionais úteis são bem conhecidas na arte, e quaisquer proteínas deste tipo poderíam ser usadas como aqui descrito. Procedimentos para avaliar e testar produção de peptídeos são ambos conhecidos na técnica e descritos neste documento. Um exemplo de uma proteína de estabilização translational é SEQ XD NQ:7, cõdigo de uma letra como a seguir:

ASKGE ELFTG WPXL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT

GKLPV PWTL VTTFS YGVQC FSHYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTXSF

K.DDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRXEL KGXDF KEDGN XLGHK LEYNY NSHNV

YITAD KQKNG IKANF KXRHN IEDGB VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY

LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGXT HGMDE LYK (SEQ ID NO: 7) . Denominada GFF.* 0 peso molecular é de 26736,02 Daltons.

[196] Em algumas modalidades a STA pode mesmo ser CRIP ou XCK como mostrado na Pig. 5. Nestas modalidades não existe proteína STA separada, a proteína STA é a mesmo que o CRIP ou ICK. utilizado. Ela podería ser o ICK idêntico que está ligado com o LIGANTE ou podería haver diferentes ICKs um tipo ligado ao ligante e o outro tipo agindo como a STA. Estes arranjos alternativos também são discutidas na seção sobre LXGANTES.

[197] Exemplos adicionais de proteínas de estabilização translational podem ser encontx'ados nas seguintes referências incorporadas por referência em sua totalidade: Kramer, K.J. et al. Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of. Manduca sexta* Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 23, Edição 6, Setembro 1993, pp. 691-701. Kramer, K.<J. et al. isolaram e sequentiaram um cDNA codificando quitinase da lagarta da tabaco, Manduca sexta. Hashimoto, Y. et al. Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichop!usia.

ni granulosis virus* Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651. Hashimoto, ¥. et al. clonaram o gene codificando o fator de intensificação viral de um vírus granuloso de rrichopiusia ni e determinaram a sequência de nucleotídeos completa. Van Damme, E.J.M. et al. Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin* European Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991),

Van Damme, E.J.M>	et al.	isols	iram RNà	rico em Poly(A)	de ovários
amadure c idos de	lectina	snc	JWCiXQp	(GNA), rendendo	um único
poli pept i deo de	leatina	de	r?~km	mediante tradu<	;ão em um

'ansiacionao. que poaem ser usacas nos ma todos, complexos e constructos de peptídeo, proteína e citos neste documento.

Zí 0 componente de Peptídeo Lig&nte LIGANTE, ligante, L ou se polinucleotídco: PEFs

ORF de expressão de proteína de motif ICK invenção também incorpora sequências de oue codificam oeotídeos 1leantes íntervenientes sistema isento de célula de germe de trigo chamado aglutina. Estas referências e outras ensinam e divulgam as proteínas de estabilização ti procedimentos e nucleotídeo desc:

[196] X¹

Interveniente, ligante ou 1 dos

[199] A descrita nesta pol inucleot-ídeos entre as sequências de polinucleotídecs que codificam a proteína de motif ICK (ick) e a proteína de estabilização translacional (sta), ou entre as sequências de polinucleotídeos que codificam múltiplos domínios de proteínas de motif ((l-ick)^ ou (ich-l)j?) se a ÔRF de expressão envolver expressão de múltiplos domínios de proteína de motif ICK. Os peptídeos ligantes íntervenientes (LIGANTBS) separam as diferentes partes do complexo de proteína de motif ICK expresso e ajudam no dobramento adequado das diferentes partes do complexo durante cs processo de expressão.

64/273

No complexo de proteína de motif ICK expresso, diferentes peptídeos ligantes intervenientes podem estar envolvidos para separar diferentes domínios funcionais. Várias representações t ít í λ com LIGANTES são mostradas nas (Figs. 3-5.} o LIGANTE ê fixado a um CRIP, tal oomo um ICK, e este grupo bivalents pode ser repetido até 10 (N =» 1-10) e, possivelmente, até mesmo mais do que 10 vezes a fim de facilitar .a acumulação da peptídeo inseticida adequadamente dobrado na planta que será protegida.

[200] 0 peptídeo ligante interveniente tem geralmente entre 1 e 30 aminoácidos de comprimento. Não é necessário um componente essencial no complexo de proteína de motif XCK expresso em plantas, um peptídeo ligante clivável pode ser projetado para a ORF de expressão de proteína de motif XCK para liberar a proteína de motif ICK adequadamente dobrada a partir do complexo de proteína de motif ICK expresso na planta transformada para melhorar a proteção da proteína de motif XCK para a planta de danos de pragas, Cm tipo de peptídeo ligante interveniente é o peptídeo ligante clivável na planta. Este tipo de peptídeos ligantes pode ser completamente removido do complexo de expressão da proteína de motif ICK expresso durante o processo de expressão pós-translacional nas células de planta. Portanto, a proteína de motif ICK adequadamente dobrada ligada por este tipo de peptídeos ligantes intervenientes pode ser liberada nas células de planta do complexo de proteína de motif ICK expresso durante o processo de expressão pós-translacional. Aqui nós mostramos numerosos exemplos de LIGANTES.

[201] Outro tipo de peptídeo ligante interveniente clivável não é clivável durante α processo de expressão em plantas No entanto, ele tem um sítio de divagem de protease específico para serina, treonina, cisteína, aspartate proteases ou metaloproteases. 0 tipo de peptídeo ligante alivável pode ser digerido por proteases encontradas no ambiente do intestino de insetos e de lepidópteros e/ou ambiente de hemolinfa de inseto e hemolinfa de lepidóptero para liberar a proteína de motif XCK no intestino ou na hemolinfa do inseto. Aqui nós mostramos numerosas exemplos de LIGANTES estes ligantes são apresentados como exemplos apenas e não devem ser considerados como limitativos da invenção. Usando a informação ensinada por esta divulgação deverã ser um assunte de rotina para um perito na arte fazer ou encontrar outros exemplos de LIGANTES que serão úteis nesta invenção>

[202'J Um exemplo de um tipo alívável de ligante ínterveniente que ilustra a invenção está listado em SEQ ID NO: X, mas ligantes díváveis não estão limitados a este exemplo. SEQ ID NO: 1 (código de uma letra) ê IGER e aqui nôs a chamamos de XGER. O peso molecular deste ligante ínterveniente ou LIGANTE é de 473,53 Daltons.

[203} Um peptídeo ligante ínterveniente (LIGANTE) também pode ser um sem qualquer tipo de sítio de divagem de protease, ou seja, um peptídeo ligante ínterveniente não clivável. Um exemplo disto é o ligante ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3).

[204] Outros exemplos de peptídeos ligantes intervenientes podem ser encontrados nas seguintes referências as quais são incorporadas por referência neste documento em sua totalidade: üm precursor de inibidor de serina protease expresso em planta foi considerado conter cinco inibidores de proteína, homogêneos separados por seis peptídeos ligantes iguais em Heath et al. Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotians aiata

European Journal of Biochemistry, 1995; 230; 250-257. Uma comparação do comportamento de dobramento de proteínas fluorescentes verdes através de seis diferentes ligantes é explorada em Chang, H.C. et al. “De novo folding of GFF fusion proteins? high efficiency in eukaryotes but not in bacteria* Journal of Molecular Biology, 2005 Out 21; 353(2): 397-409. Uma isoforma da. família GalNAc-Ts humana, GalNAc-T2, mostrou reter sua localização e funcionalidade mediante, expressão em plantas N. benthamíana por Daskalova, S.M. et al. “Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamineglycosylated proteins* SMC Biotechnology, 2010 Ago 24; 10: 62. A capacidade de proteínas de plastídeo endógenas se deslocarem através de estrêmulos foi mostrada em Kwok, E.Y. et al. “GFPlabelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids* Journal of Experimental Botany, 2084 Mar; 55(.397): 595-604. Epub 2084 Jan 30. Um relatório sobre a engenharia da superfície do virus mosaico do tabaco (W), virion, com um fator oostático de modulação de tripsina, de hormônio decapeptideo de mosquito (TMOF) foi feito por Borovsky, D. et al. “Expression of Aedes trypsin-modula ting oos tat ic factor on the virion of W: A potential larvicide* Proc Natl Acad Bci, 2006 Dezembro 12; 103(58)? 18963-18.968. Estas referências e outras ensinam e divulgam ligantes intervenientes que podem ser usado snos métodos, procedimentos e complexos e constructos de peptídeo, proteína e nucleotídeo descritos neste documento.

[205] A ORF de expressão de proteína de motif XCK descrita acima pode ser clonada em qualquer vetor de expressão de planta para a expressão de proteína de motif ICK em planta transientemente ou estaveImente.

[205] Sistemas de expressão de planta transients® (207] Sistemas de expressão de plantas transientes podem ser utilizados para otimizar prontamente a estrutura da ORE de expressão de proteína de motif XCK para alguma expressão específica de proteína de motif XCK em plantas, incluindo a necessidade de alguns componentes, otimização de códons de alguns componentes, otimização da ordem de cada um dos componentes, etc. Um vetor de expressão de planta transrente é muitas vezes derivado de um genoma de vírus de planta, Vetores de vírus de planta oferecem vantagens em expressão de gene estranho rápida e de alto nível em plantas, devido ã natureza da infecção de vírus de plantas. O comprimento total do genoma viral da planta pode ser utilizado como um vetor, mas muitas vezes um componente viral é deletado, por exemplo, a proteína de revestimento, e ORFs transgénicas são subclonadas nesse lugar. A ORF de expressão de proteína de motif XCK pode ser subclonada em tal sítio para criar um vetor viral. Estes vetores virais podem ser introduzidos em plantas mecanicamente uma vez que eles são em si infecciosas, por exempla, através de ferida da planta, pulverização, etc. Eles também podem ser transformados em plantas por agroinfecção por clonagem do vetor de vírus no T-DHA da bactéria galha da coroa, Agrobacterium tumefacíens, ou a bactéria de raiz pilosa. Agrobacterium rhizogenes. A expressão da proteína de motif XCK neste vetor é controlada pela replicação do vírus de RNA, e a tradução de vírus para mRMA para

•eplicaç	ão é controlad	a por um forte promotes		al, por exemplo
remoter	358 do vírus	do mosaico da Couve-f	lar.	Vetores viraie
om GRF	de expressão	de proteína de motif	XCK	são geralmente

clonados na região de T~DNA em um vetor binário que -pode se replicar em ambas as cepas de E- coli e cepas de Agrobacterium,

A transformação transiente de uma planta pode ser feita por infiltração das folhas de planta com as células de Agrobacterium as quais contêm o vetor viral para expressão de proteína de motif XCK. Na planta transformada transiente ê comum para a expressão de proteína estranha ser cessada num curto período de tempo, devido ao silenciamento do gene de pds~transcricional (PTGS) . Às vezes um gene de proteína de supressão de PTGS é necessário para ser cotransformado na planta transientemente com o mesmo tipo de vetor viral que dirige a expressão com a ORF de expressão de proteína de motif ICK. Isto melhora e estende a expressão da proteína de motif XCK na planta. A proteína supressora de FTGS mais comumente utilizada é proteína. P19 descoberta do vírus tomato bushy stunt (T.BSV) .

[208] Uma demonstração de expressão de planta transíante pode ser encontrada na Fig. 7.

[209] Fig. 7 mostra Proteína Transgênica de Planta expressa transientemente. Aa Fig. 7 relata a acumulação relativa das proteínas ICK em comparação com a % de TSP, tal como detectado por ELISA. Existem quatro variantes de ORFs de expressão de ICK na Fig. 7 que ilustram a necessidade de o ERSP obter o dobramento adequado do ICK e da STA para conseguir a acumulação da proteína. Barra A relata um sistema de expressão FECT expressando SEQ XD NO; 8 o peptídeo ômega (ICK) sem quaisquer fusões. Barra B relata um sistema de expressão TRBO expressando SEQ ID NO: 9 um BAAS ERSP fundido ao peptídeo ômega [ICK]. Barra C relata um sistema de expressão FECT expressando SEQ XD NO: 10 uma GPP (STA) fundida ao IGER (Ligante) fundido ã toxina Híbrida (XCK). Barra D relata um sistema de expressão de FECT expressando SEQ Xb NO: 11 um BAAS (ERSP) fundido a uma GFP (STA) fundida a IGER (Ligante) fundido a toxina Híbrida (XCK).

Os níveis

de detecção para Barra A e B mostram detecção de

proteína desprezível. Na Barra A isto ê provavelmente devido ao

dobramento

não apropriado do XCK o qual ocorre no ER e na Barra

B isto ê provavelmente devido ao dobramento adequado, mas nenhum, acúmulo devido à falta de uma STA. Há níveis detestáveis nas Barras C e D. Quando o experimento para Barra C [(SEQ ID NO: 10 uma GFP (STA) fundida a XGER (Ligante) fundido a toxina Híbrida. (ICK)J foi realizado houve um nível alto de fluorescência de GFP detectada (dados não mostrados) indicando -que muito do TSP era a proteína de fusão, no entanto, quando o ELISA foi realizado apenas 0,01% do TSP foi detectado, e isto é provavelmente devido â falta de dobramento adequada, o que não ocorreu pois esta proteína não foi direcionada para o ER, onde ocorre o dobramento Os anticorpos utilizados no ELXSA apenas detectam a estrutura

terciária	de uma pilotei na adequadamente dourada > Quando u
experimente	.> para a 33-arra D (SSQ àD XX um SAAsí xundxdo

a GFP (STA) fundida a XGER (Ligante) fundido a toxina Híbrida (XCK)] foi realizado houve alguma fluorescência de GFP detectada e uma acumulação de 0,1% do TSP o peptídeo XCK fundido a GFP.

Quando os	dados para as Barras A, B, C e D são tomados em
conjunto,	é evidente que um ERSP na ORF de expressão XCK é
necessário	para obter dobramento adequado e para aumentar a
acumulação	do peptídeo uma STA ê necessária.
[210]	Nôs demonstramos e documentamos a emissão de GFP

da fluorescência, verde de constructor de proteína de fusão GFP-

Híbrido e	m folhas de tabaco transientemente transformadas
utilizando	diferentes vetores FECT projetadas para expressão
dirigida >	Fomos bem sucedidos em usar vetor pFECT~BGXH para
acumulação pe m ec umt	de APO (localização de apoplasto); vetor pFECT-GXH ilação de C¥TO (localização de citoplasma)? e vetor

pFECT-SGIK-ER para acumulação de ER (localização de retículo endoplasmático)< Dados não mostrados.

[211] Nós demonstramos e documentamos a emissão de GFP da fluorescência verde de cons -true tos de proteína de fusão GFPHíbrido em folhas de tabaco transientemente transformadas utilizando diferentes tipos de ERSP. Fomos bem sucedidos em demonstrar expressão com vetor pFECT-BGXH; expressão com vetor pFECT-EGIH; e expressão com vetor pFECT~E*GXH. Dados não mostrados.

[212] Medimos níveis de acumulação -de peptídeo e isto é mostrado nas Figs. 8 e 9. Fig. 8 é um gráfico de % de TSPs detectada de iELXSA de ü-ACTX-Hvla fundido a GFF transientemente expressa de tabaco com localização de acumulação diferente. ABO; localização de apoplasto; CYTO: localização de citoplasma; ER; localização de retículo de endoplasma. Fig« 9 é um gráfico de %TSPs detectada de íELISA de V-ACTX-Hvla fundido a GFR transientemente expressa de folhas de tabaco usando os vetores de expressão FECT codificando fusões translacionais com três diferentes sequências ERSP: BAAS peptídeo sinal (RGXH), peptídeo sinal de Extensina (EGIH) e peptídeo sinal de Extensina modificado (E*GIH),

[213] Integração de ORF da expressão de proteína no genoma de planta utilizando tecnologia de transformação de planta estável

[214] A GRF de expressão de proteína de motif ICK também pode ser integrada no genoma de planta usando tecnologia de transformação de planta estável e, portanto, as proteínas de motif XCK podem ser expressas estaveImente em plantas e proteger as plantas transformadas de geração para geração. Fara a transformação estável de plantas, o vetor de expressão de proteína de motif ICK pode ser circular ou linear. Alguns componentes críticos devem ser incluídos no vector de DNA. A ORF de expressão de proteína de motif ICK para trans formação de planta estável deve ser cuidadosamente projetada para expressão ótima em plantas com base no estudo na expressão da planta translente, tal como descrito acima. A expressão de proteína de motif ICK é geralmente controlada por um promotor que promove transcrição em algumas de todas as células da planta transgênica. 0 promotor pode ser um promotor viral de planta forte, por exemplo, o promotor 35S constitutivo do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV) ; ele também pode ser um promotor de planta forte, por exemplo, o promotor de hidroperóxído liase (pHPL) de Arabidopsls thaliana; o promotor de poliubíquitína Glicína max (Gmubi) da soja; os promotores de ubiquitina de diferentes espécies de plantas (arroz, milho, batata, etc.); etc. üm terminador transcricional de planta ocorre frequentemente após o códon de parada da ORF interromper· a RB polimerase e transcrição do nRMA. Para avaliar a expressão de proteína de motif ICK, um gene repórter pode ser incluído no vetor de expressão de proteína de motif ICK, por exemplo, gene da betaglucuronidase (GUS) para ensaio de coloração de GUS, gene de proteína fluorescente verde (GFP) para detecção de fluorescência verde sob luz ÜV, etc. Para seleção de plantas transíornadas, um gane marcador de seleção é geralmente incluído no vetor de expressão de proteína de motif XCK. O produto de expressão do gene marcador pode proporcionar a planta transformada com resistência a antibióticos específicos, por exemplo, canamicina, higromicina, etc., ou a herbicida específico, por exemplo, glifosato, etc. Se tecnologia de agroinfacção for adotada para transformação de planta, as sequências de borda esquerda e borda direita do T-DNA também são incluídas; no vetor de expressão de proteína de motif ICK para transportar a porção do T-DNA para a planta. O vetor de expressão de proteína de motif ICK construído pode ser transformado em células ou tecidos de planta utilizando muitas tecnologias de txansformação> Agroinfecção é uma maneira muito popular para transformar uma planta usando uma cepa de Agrobacterium tumefacíens ou uma cepa de Agrobacterium rhisogenes. Tecnologia de bombardeamento de partículas (também chamado Pistola de Gene, ou Bíolística) também é muito comumente usada para transformação de planta. Outros métodos de trans -formação menos comumente usados incluem eletroporação de tecido, agitadores de car.beto de silício, injeção direta de dna, etc. Apôs transformação, as células ou os tecidos de planta transformada são colocados no meio de regeneração de planta para regenerar com sucesso células ou tecidos de planta transformada em plantas transgénicas. A avaliação da integração e expressão da ORF de expressão de proteína de motif XCK na planta transformada pode ser realizada como se segue.

[215] Avaliação de uma planta transformada

[218] Avaliação de uma planta transformada pode ser feita em nível de DNA, nível de RNA e nível de proteína. Uma •planta estavelmente transformada pode ser avaliada em todos esses níveis e uma planta transientemente transíormada geralmente só é avaliada no nível de proteína. Fara assegurar que a ORF de expressão de proteína de motif de expressão XCK. se integra no genoma de uma planta transíormada de forma estãveí, o DNA genõmico pode ser extraído dos tecidos de plantas trans formadas de forma estãvel para a avaliação de PCR ou a aplicação de Southern blot. A expressão da proteína de motif ICK na planta estavelmente transformada pode ser avaliada no nível de RNA, ou seja, o mRNA total poda ser extraído dos tecidos da plantas transformadas e a técnica de northern blot e a tecnologia RT-RCR podem ser aplicadas para avaliar o nível de mRNA da proteína de motif ICK qualitativamente ou quantitativamente. A expressão da proteína de motif XCK na planta transformada pode também ser avaliada, em nível de proteína diretamente, Há muitas maneiras de avaliar a proteína da motif XCK expressa em uma planta transfarmada» Sé um gene repórter é transformado na planta juntamente com a ORF de expressão de proteína de motif XCK, o ensaio de gene repórter pode ser realizado para avaliar inicialmente a expressão da. ORF de expressão de proteína de motif XCK transformada, por exemplo, ensaio de coloração de GUS para expressão de gene repórter GüS, ensaio de detecção de fluorescência verde para expressão de gene repórter de GFP, ensaio de luciferase para expressão dd gene repórter de luciferase, etc. Além disso, o total de proteína expressa pode ser extraído dos tecidos de plantas transformadas para a avaliação direta da expressão da proteína de motif XCK .nas plantas transformadas. A amostra de proteína expressa total extraída pode ser utilizada no ensaio de Bradford para avaliar o nível de proteína total na amostra. Tecnologia de cromatografía HPLC analítica, técnica de Western blot ou ensaia ÍEL.XSA podem ser adotados para avaliar qualitativamente ou quantitativamente a proteína de motif XCK na amostra de proteína total extraída dos tecidos de plantas transformadas. A expressão de proteína de motif XCK também pode ser avaliada usando a amostra de proteína total extraída dos tecidos de plantas transformadas num bioensaio de inseto. Finalmente, o tecido de planta transformada ou toda a planta transformada podem ser testados em bioensaíos de inset os para avaliar a expressão de proteína de motif XCK e sua proteção para a planta.

[217] Nós fornecemos uma descrição detalhada e sumário da Parte X da seguinte format

[218] Nós descrevemos uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático (ERSP) operavelmente ligado a uma Proteína .Inseticida Rica, em Cisteína (CRIP), tal como uma proteína de mpti.f de Nó de Cisteína inibidor (ICK) em que o referido ERSP é o N- terminal da referida proteína (ERSPICK) . O ERSP é qualquer peptídeo sinal o qual dirige o GRIP expresso para o retículo endoplasmático de células de planta. 0 CRIP pode ser uma proteína de Nó de Cisteína Inibidor (ICK) ou uma proteína Não XCK. O ERSP é um peptídeo entre 5 a 50 aminoãciôo de comprimento se originando de uma planta que é operavelmente ligada a uma Proteína de Estabilização Translacional (STA) , em que o referido ERSP ê o N-terminal, da. referida proteína e uma sequência de STA interveniente pode estar ou no lado N~ terminal do CRIP a qual é opcionalmente uma proteína de motif ICK (ERSP-STA-ICK) ; ou proteína de motif NáoXCK (ERSP-STA- Não-ICK) ou no lado C-terminal da ICK ou proteína de rnotif Não-ICK (ERSP-ICK-STA) OU ( ERSP- Não-ICK -STA). O ERSP é um peptídeo entre 3 a 60 aminoácidos de comprimento, ou um peptídeo entre 5 a 50 aminoácidos de comprimento ou um peptídeo entre 20 a 30 aminoácidos de comprimento. Ele pode se originar de uma planta, Peptídeo Sinal de Alfa-Amilase de Cevada (BAAS) com uma SEQ ID NO 4. 0 ERSP pode ser um peptídeo que- é peptídeo sinal de extensina de tabaco com uma SEQ ID NO 18. Q ERSP pode ser um peptídeo sinal de extensina. de tabaco modificado com uma SEQ ID NO 19. ou um peptídeo sina Sun a 3 signal de «Tuní perus asheí com uma SEQ ID NO 27.

[219] Nós descrevemos um exemplo de CRIP que é uma proteína de motif XCK entre 16 e 60 amino ácidos de comprimento, entre 2β e 48 aminoácidos de comprimento, entre 30 e 44 aminoácidos de comprimento, onde ela é selecionada de qualquer um dos peptídeos ou fontes de peptídeos oom motif de cisteína inibidor, ou um peptídeo inseticida e onde ela ê qualquer um dos peptídeos ou das fontes de peptídeos incluindo átrax ou Hádronyche, qualquer um dos peptídeos originários de Ma.dranyo.ha versuta, um peptídeo ACTX. A proteína de motif XCK ê qualquer peptídeo inseticida e fragmentos do mesmo incluindo versões peptídicas maduras, pré e pró dos referidos peptídeos e números de sequência, assim como quaisquer mutações, ou deleção ou adição de segmentos peptídicos, mas ainda mantendo a estrutura do nó de cisteína inibidor. A proteína de motif ICK pode ser U~ ACTK-Hvla comh SEQ XD NO: 6, Ômega-ACTX-Hvla com SEQ ID NO;24, CapaACTX-Hvlc. Uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos qu.e codificam para esses peptídeos, Uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que codificam para os peptídeos integrados em um genoma de planta transgênica. 0 uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos neste documento para fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos inseticidas adequadamente dobrados em uma planta transformada e fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos inseticidas adequadamente dobrados na planta, transformada e provocar o acúmulo dos peptídeos inseticidas expressos e adequadamente dobrados na referida planta e provocar um aumento na resistência da planta a danos por inseto. Nós descrevemos procedimentos para usar nucleotídeos para criar plantas transgênicas e plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos descritos neste documento.

Nós descrevemos uma planta feita par qualquer um destes produtos a processos.

[220] Ms descrevemos uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático (ERSP) operavelmente ligado a um CRIP o qual é opoionalmente uma proteína de motif de Nó de Cisteina Inibidor {XCK) ou proteína Não ICK operavelmente ligada a uma Proteína de Estabilização Translacional (STA)> em que o referido ERSP é o ^-terminal da referida proteína e uma sequência de Proteína de Estabilização Translacional pode estar ou no lado N~terminal da proteína de motif I.CK (ERSP-STA-XCK) ou opoionalmente um (ERSP- Não-XCK-STA) ou no lado C-terminal da proteína de motif ICK (ERSP-ICK-STA) ou ERSP-STA-Não-ICK) .

[221] Nós descrevemos essa STA com um peso molecular de 12 kDa e acima, em que a referida STA pode ser muitas proteínas, incluindo uma proteína de motif ICK com peso molecular de 12 kDa e acima, ou múltiplas proteínas de motif ICK conectadas com peptídeos ligantes (L) com peso molecular de 12 kDa e acima, por exemplo, ERSP-ICK- (Li-ICKjk, ou ERSP- {ICK_rLi)_M~ ICK. NÓS explicamos que os peptídeos ligantes podem ser os mesmos ou. diferentes. Nós dizemos que uma STA é uma proteína de fluorescência verde (GFP) originária de medusa com SEQ ID NO 13 e a STA pode ser uma lectina snowdrop, Galanthus nivalis agglutinin (GNA) , com SEQ ID NO 28 e que a STA pode ser uma proteína de Juniperus ashei, Jun a 3, com SEQ ID ND 26.

[222] Nós descrevemos que um LXGANTE é qualquer· peptídeo com 4 a 20 aminoácidos de comprimento. Nós descrevemos um DXGANTE que é qualquer peptídeo que contenha um sítio de reconhecimento da protease. Nós descrevemos um LXGANTE como qualquer peptídeo que contenha um sítio de divagem da protease. NÓs descrevemos um LXGANTE' que á um peptídeo contendo uma sequência de aminoácido da IGER (SEQ ID NO;1), E.EKKN (SEQ ID NO; 2} e (SEQ ID NO: 3) < Nõs descrevemos um LIGANTE como qualquer peptídeo o qual pode ser clivado no sistema digestivo de inseto, ou na hemolinfa de inseto. Nós descrevemos um LIGANTE em que o referido LIGANTE ê um peptídeo que contém um sítio de divagem de tripaina.

[223] Nós descrevemos um nucleotídeo que codifica para qualquer uma das proteínas descritas incluindo ORFs de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que codificam para os peptídeos., assim como ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que codificam, para os peptídeos integrada em um genoma de planta transgênica, assim como transformada em uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos inseticidas adequadamente dobrados em uma planta transformada, assim como transformados em uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos inseticidas adequadamente dobrados na planta transformada, e provocar o acúmulo dos peptídeos inseticidas expressos e adequadamente dobrados na referida planta e provocar um aumento na resistência da planta a danos por inseto. NÕs descrevemos plantas transgênicas que resultam destas descrições e plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos descritos neste documento.

[224] Nós explicamos e descrevemos uma ORF de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que codificam para os peptídeos neste documento, assim como uma ORF de expressão integrada no genoma de uma planta transgênica e uma razão para que isto seja feito é fazer ou transformar uma planta ou genoma de planta a fim de expressar peptídeos tóxicos adequadamente dobrados em uma planta transformada e uma razão para que isto seja feito é fazer a planta transformada provocar o acúmulo dos peptídeos inseticidas expressos e adequadamente dobradas na referida planta e provocar um aumento na resistência da planta a danos por inseto. Nós ensinamos a fazer as plantas transgénicas usando estes procedimentos e expressando os peptídeos deste documento e quaisquer' outros peptídeos que aqueles versados na técnica usariam dado o ensinamento neste documento e usando qualquer um. dos produtos e processos descritos neste documento.

[225] Nós ensinamos como fazer uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático (ERSP) operavelmente ligado a uma proteína de motif de Nó de Cisteina Inibidor (ICK) operavelmente ligado a uma proteína de estabilização translacional (STA) operavelmente ligado a um peptídeo ligante interveniente (1), em que o referido ERSP é o N~terminal da referida proteína e o referido LIGANTE está entre STA e a proteína de motif ICK, e a referida proteína de estabilização translacional pode estar no lado N-terminal (a montante) da proteína de motif ICK ou no lado C-terminal (a jusante) da proteína de motif ICK e descrita como RRSP-STA-L-ICK OU ERSP^ICK-L-STA. E nós explicamos que os ERSP, CRIP e ICK, LINKER, STA. mencionados acima podem ser qualquer um dos peptídeos como descritos neste documento e quaisquer outros peptídeos que aqueles versados na técnica usariam dado o ensinamento neste documento e usando qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento»

[2261 Nós ensinamos como fazer uma proteína compreendida de um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmátioo (ERSP) operavelmente ligado a um domínio de proteína de motif de Nó de Cisteina inibidor (ICK) no qual proteínas de motid ICK são ligadas entre si via peptídeos ligantes íntervenientes (L) , oparavelmente ligado a uma proteína de estabilização translacíonal (STA) operavelmente ligado a um peptídeo ligante intexveniente (L), em que o referido ERSF e o «-terminal da referida proteína e o referido L.IGANTE está entre STA e o domínio de proteína de motif ICK múltiplo, e a referida STA pode estar no lado «-terminal (a montante) do domínio de proteína de motif ICK múltiplo ou no lado C-terminal (a jusante) do domínio de proteína de motif ICK múltiplo e descrita como ERSP-STA-(LtICKQss, ou ERSP- {ICKj-LiJk-STA.

[227]

Nos ensinamos como fazer os nucleotídeos que codificam para estas proteínas, as ORFs de expressão, fazer um e integrar no quiméricos, transgênícas, transgênicas, genoma de uma planta vetores recombinantes, células de plantas plantas transgênicas da transgãnica, os genes cé1ulas hospedeiras transgênicas, plantas quais são milho, soja, algodão, arroz, trigo, sorgo, painço amarelo, cana-de-açúcar, alfafa, batatas, tomates, tabaco, qualquer um dos vegetais folhosos verdes, ou qualquer uma de árvores frutíferas ou quaisquer plantas e espécies como aqui mencionadas, e uma semente de uma planta transgênica de acordo com estes procedimentos em que a semente compreende o gene quimérico.

[228]

Exemplas

[229] Os Exemplos neste relatório descritivo não se destinam e não devem ser utilizados para limitar eles são fornecidos apenas para ilustrar a invenção.

[230] Exemplo 1

[231] Comparação de expressão entre dois expressão de planta transiente

[232] As tecnologias de transformação a invenção, sistemas de de planta transients foram adotadas oara otimizar orontamente a ORF de expressão de proteína de motif ICK para expressão de planta. Tecnologia de agroinfecção com urn vector viral de planta tern sido utilizada aqui para a transformação de planta transients devido a sua alta eficiência,, facilidade e baixo custo. Dois sistemas de expressão de planta transients virais foram avaliados aqui, para a expressão de proteína de motif ICK em plantas. Um foi o sistema de superexpressão de vírus do mosaico do tabaco (TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007, V145c 12321240.) . O vetor de DNA de TRBO tem uma região de T-DM para agroinfecção a qual contém um promotor CaMV 3SS que dirige a expressão do SB do vírus do mosaico do tabaco, sem o gene que codifica a proteína de revestimento viral. O outro sistema de expressão de planta transience viral foi o sistema de expressão FECT (Liu ã & Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88) . o vetor FECT também contêm uma região de T-DNA para agroinfecção a qual contém um promotor' CaMV 3SS que dirige a expressão do RNA do vírus do mosaico do capim rabo de raposa, sem os genes que codificam a proteína de revestimento viral e o bloco de genes triplos. Ambos os sistemas de expressão utilizam genoma de vírus desarmado”, portanto,· a transmissão viral de planta para planta pode ser eficazmente prevenida. Para expressar eficazmente o gene heterólogo introduzido, o sistema de expressão FECT adicionalmente precisa coexpressar PI 9, uma proteína supressora de silenclamento de RNA do vírus tomato bushy stunt, para impedir o silenciamento de gene pôst rans criai ona 1 (PTGS) do T-.DNA introduzido. (O sistema de expressão de TRBO não precisa de coexpressão de PIB) . Os dois sistemas de expressão de planta transients foram testados e comparados pela expressão transients de proteína de motif XCK em Tabaco (Níaotiana benthamíana) como descrito abaixo.

[233j A ORF de expressão de proteína de motif XCK fol projetada para codificar uma série de motifs estruturais fundidos translacionalmente que podem ser descritos como a seguir: N^f -ERRP-Sta-L-XCK-C·' . Aqui a proteína de motif XCK para expressão é U-ACTX~Hvla a qual tem a seguinte sequência de aminoãcido (Ν' a C' , código de uma letra) :

QYCVFVDQPCSLNTQPCOSDATCTQERNWGHTVYYCRA (SEQ ID NO: 12) motif de ERSP usado aqui é o peptídeo Sinal de AlfaAmilase de Cevada (BAAS) o qual compreende 24 Aminoácidos como mostrado abaixo (N^f a C', código de uma letra):

MANKHLSLSLFIiVLLGLBASLABG (SEQ XD NO: 4)

A proteína de estabilização (Sta) nesta QRF de expressão foi Proteína Fluorescente Verde (GFP) a qual tem sequência de aminoáddo como a seguir (Ν' a C', código de uma letra):

MASKGEELFTGWPXLVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKL.TLKFXCTTGKLPVPWP

TEVTTFSYGVQCFSRYPDH^KRHDFFKGAMPEGWQERTXSEKDDGNYKTRABVKFEQDTDVNR XELKGXDFKEDGNXLGHítLEYNYNSHNVYITADKQKNGXKANFKXRHNXEDGSVQLADHYQQNT PXGDGPVLLPDNHYLSTQSAX^KD.PNEKRDHMVLIíEFVTAAGXTHGMDELYK (SEQ ID NO: 13)

O peptídeo ligante entre GFR e U-ACTK-Hvla contém o sítio de divagem de tripsina e tem uma sequência de aminoãcido como mostrada abaixo (Ν' a €' , código de uma letra) :

IGER (SEQ XD NO: 1)

De acordo com a fórmula da ORF de expressão de motif XCK, esta ORF de expresão XCK específica pode ser descrita como BAASGFP- IGER- Híbrido ou BGXH. A ORF de HGIH foi quimicamente sintetisaa adicionando sítio de restrição de Pac I em seu terminal £^r e sitio de restrição de Avr II em seu terminal 3' . A sequência do RGIH sintético está abaixo:

TTMTTAAAXGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTA.

ITTGCTTCACTTGCAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACT^^^ TTGTTGAATTAGATGGTGZvTGTTAATGGGCAC’AAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGA TGC1ACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTAGCTGTTCQATGG C<NUU^CTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGA AACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCA’rGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGOACTATATCTTT CAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTGAAGTTTGAAGGTG.ATACCeTTGTTAAT CGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGT ACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAA CTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAAT ACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCÍTTTACCAGACÁACCATTACCTGTCGACAOAATCTGCCC TTTCGAAAGATCCCAA.CGAAAAGCGTGACCACATGGTCeTTCTTGAGTTTGTAA.CTGCTGCTGG GATTACAGATGGCATGGATQAGGTCTACAAAATTGGTGAAAGACAA'rATTSTGTTCCAGTTGAT CAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATG AAAATGGACA^TACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ IE NO: 14)

[234] A ORF de BGXH fai çlonada .para os sítios de restrição Pac I e Avr II do vetor de expressão FECT para criar um vetor de expressão de BGXH para o sistema de expressão de planta transients FECT (pFBCT-BGXH) > Para maximizar a expressão de BGIH no sistema da expressão FECT, um vetor FECT que expressa a proteína supressora de silenciamento de RNA Pl.9 {pFECT-P19) foi gerado para cotransfarmação> Para criar um vetor de expressão de BGIH para o sistema de expressão de planta transients TRBO, um procedimento de PGR de rotina foi realizado para adicionar um sítio de restrição Not I ao terminal 3’ ’da ORF de BGIH descrita acima. A nova ORF de BGIH foi, então, clanada para os sítios de restrição Pac X e Not X do vetor de expressão TRBO para criar um vetar de expressão de BGIH para o sistema de expressão de planta traxwiente TRBO (pTRBO-BGIH) .

[2351 Uma cepa de Agrobacterí um tumefacie&s, GV3101, foi usada para a expressão trans lente de BGIH em folhas de tabaco pelos sistemas de expressão FECT e TRBD. Para fazer células GV3101 competentes o seguinte procedimento foi realizado; uma cultura durante a noite de GV3101 foi usada .para inocular 200 mL de meio Luria-Bertani (LB) . As células .foram, então, deixadas crescer até fase logarítmica com OD80C entre 0,5 e 0,8. Em seguida, as células foram peletizadas por centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos a 4*C. As células foram,· então, lavadas uma ves com 10 mL de tampão TE pré-resfriado (Tris-HCl 10 mM, EDTA imM, pH 8,0) e em seguida ressuspensas em 20 mL de meio LB. A ressuspensão das células GV3101 foi, então, dividida em alíquotas em frações de 2S0 pL em microtubos de 1,5 mL» As alíquotas foram, então, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a ~8·0^ΦΟ no freezer para futura transformação.

[236] Os vetores pPECT-BGXH e pTRBO-BGXH foram, então, transformados nas células GV3101 competentes usando um método de congelamento-degelo como a seguir: as células GV3101 competentes armazenadas foram degeladas em gelo e, então,· misturadas com 1 5 pg de DNA puro (vetor pFECT-BGIH ou pTRBO-BGXH) . A mistura célula-DNA foi, então, mantida em gelo durante 5 minutos, em seguida, transferida para -80^ôC durante 5 minutos e, em seguida, incubada num banho de água de 37°C durante 5 minutas. As células tratadas com congelamento-descongelamento foram, em seguida, diluídas em 1 mL de meio LB e agitadas numa mesa oscilante dux^ante 2-4 horas à temperatura ambiente» Uma alíquota de 200 pL da mistura de célula-DNA fai, então, espalhada sobre placas de agar de LB com os antibióticos apropriados (10 pg/mL de rifampleina, 25 pg/mL de gentamicina e 50 pg/mL de canamlcina foram utilizados tanto para transformação pFEGT-BGXH quanto transformaçao pTRBO-SGlK) e incubada a 2S®C durante dois dias.

Colônias transformantes resultantes foram, então, colhidas e cultivadas em alíquotas de 6 ml» de meio LB com os antibióticos apropriados para análise de DNA transformado e preparação de estoques de glicero.1 das células GV31Ô1 transformadas.

[237] A transformação transients de folhas de tabaco foi realizada usando injeção de folha com uma seringa de 3 ml» sem agulha, As células GV3101 transformadas foram riscadas sobra uma placa de LB oom os antibióticos apropriados (como descrito acima) s incubadas a 28°C durante dois dias. Uma colônia de células GV3101 transformadas foi inoculada para 5 ml de meio LBMESA (meio LB suplementado com 10 mN MEB, 20 μΜ acetossiringona) e os mesmos antibióticos descritos acima, e cultivada durante a noite a 28*C. As células da cultura durante a noite foram recolhidas por centrifugação a 5000 rpm durante 10 minutes e ressuspensas no meio de indução (10 mN MES, 10 mM MgC12, 100 uM acetossiringona) a. uma QD800 final de 1,0. As células foram, então, incubadas no meio de indução durante 2 horas até durante a noite ã temperatura ambiente e estavam, em seguida, prontas para expressão transients de folhas de tabaco. As células tratadas foram infiltradas no lado debaixo de folhas fixadas de plantas de Nicotians benthamíana por injeção usando uma seringa de 3 mX» sem uma agulha fixada. Para a transformação transients de FECT, as células GV3101 transformadas com pFECT-BGXH e as células GV3101 transformadas com pF.ECT-P19 foram misturadas juntas em quantidades iguais para infiltração em folhas de tabaco por injeção com uma seringa de 3 mL» Para a transformação transients de TRBQ, apenas células GV3101 transformadas por pTRBQ-BGXH foram infiltradas em folhas de tabaco. A expressão de proteína de motif XCK em folhas de tabaco foi avaliada em 6-8 dias após a infiltração.

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[238] A ORF de expressão de BOTH contém uma proteína de fusão de GF? (STA) e U-ACTX-Hvla (ICK) com um peptídeo ligante (LIGANTE) I GER {SEQ ID NO: 1) entre elas, Como mostrado na Fig. 3., a fluorescência verde da porção de GFF expressa dos transgenes foi detectada sob luz U.v. em folhas de tabaco transformadas com ambos os vetores PECT e TRBO. Curiosamente, a fluorescência verde apareceu distribuída uníformemente nas folhas de tabaco transformadas com vetor FECT (com a exceção dos tecidos vasculares), ao passo que a fluorescência verde nas folhas de tabaco transformadas com vetor TRBO pareceram se acumular nos tecidos vasculares, o que é devido ao TRBO reter sua proteína de movimento viral e FECT não.

[339] Fara avaliar quantitativamente a expressão de proteína de motif ICK, as proteínas expressas na-s folhas de tabaco transformadas foram extraídas seguindo o procedimento descrito aqui. Discos de 100 mg de tecido foliar transformado foram coletadas perfurando as folhas com a grande abertura de uma ponta de pipeta de 1000 ul. 0 tecido foliar coletado foi colocado em um micro tubo de 2 mL com esferas de moagem de aço inoxidável de 3/32 de diâmetro e congelado em -80°C durante 1 hora e, em seguida, homogeneizado com um Homogeneizador de Alto Rendimento Troemner-Talboys> 750 pL de soluções de extração TSPSE1 geladas em gelo {solução de fosfato de sódio 50 mM_f coquetel de inibidor da protease diluído 1:100, EDTA ImM, DXECA 10mM, PVPP 8%, pH 7,0) foram adicionados ao tubo e vortexados. G microtubo foi, então, deixado em repouso â temperatura ambiente durante 15 minutos e, então, centrifugado a 16,000 g durante 15 minutos a 4^eC. 100 pL do sobrenadante resultante foram tirados e carregados na coluna pre-Sephadex G-50-packed em placa de microtitu1ação de fi1tro Mi111pore Mu1tiScreen de 0,45 pm com placa de microtitulação Costar receptora vazia no fundo. As placas de microtitulaçãa foram, então, centrifugadas a 800 g por 2 minutos a 4®c. A solução de filtrado resultante, aqui denominada extrato de proteína solúvel total (extrato de TSF) das folhas de tabaco, estava pronta para a análise quantitativa,

[240] A concentração de proteína solúvel total do extrato de TSP foi estimada utilizando ensaio de proteína Pierce Coamassie Plus. Padrões de proteína de BSA com concentrações conhecidas foram usados para gerar uma curva padrão de quantificação de proteína. 2 pL de cada extrato de TSP foram misturadas em 2 00 pL do reagente cromogênico (reagente CPPA) dos kits de ensaio de proteína Coomassie Plus e deixados reagir por 10 minutos. A reação cromogênica foi, então, avaliada lendo QD595 utilizando um leitor de placa S.pectroMax-M2 usando SoftMax Pro como software de controle. As concentrações de proteínas solúveis totais foram de 0,788 ± 0,20 pg/pL e 0,533 i 0,03 pg/pL no extrato de TSP de falhas de expressão de FECT-BGIH e folhas de expressão de TRBO-BGIH, respectivamente. Estes resultados foram utilizadas para o cálculo de percentagem de U-ACTX-HvlA expresso em TSP (% de TSP) no ensaia iELXSA.

[241] Ensaio ELISA indireta (iELISA) fai realizado como se segue para avaliar quantitativamente a proteína de motif ICK em folhas de tabaco transformadas transientemente com os sistemas de expressão fect e TPBO. 5 pL do extrato de T6P da falha foram diluídos em 85 pL de solução de CB2 (Immunochemistry Technologies) no poça de uma placa de 86 poços Xmmulon 2HD com diluições em série realizadas como necessário. Proteínas de folhas das amostras de extrato foram, então, deixadas r'evestir as paredes da paço durante 3 horas no escuro ã. temperatura ambiente e, em seguida, a solução de CB2 foi removida e cada poço foi lavado duas vezes com 200 pL de PBS (Gibco) . 150 pL de solução de bloqueio (BSA de Bloqueio em BBS oom 5% de leite seco sem gordura) foram, então, adicionados em cada poço e incubados por 1 hora no escuro ã temperatura ambiente. Após a remoção da solução de bloqueio e uma lavagem com BBS dos poços, 100 çL de anticorpo anti-U-ACTX-Hvla de coelho (anticorpo primário) (diluição 1: 250 em solução de bloqueio) foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora no escuro à temperatura ambiente. 0 anticorpo primário foi, então, removido e cada poço foi lavado com BBS 4 vezes. Então, 100 uL de anticorpo anticoelho de cabra conjugado a HEP (anticorpo secundário, usado em diluição 1: 1000 na solução de bloqueio) foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora no escuro à temperatura ambiente. Após remoção do anticorpo secundário e lavagem dos poços com BBS, 100 pL de solução de substrato (uma mistura 1: 1 de solução A e solução B de substrato de peroxidase ABTS, KPL) foram adicionados a cada poço, e a reação cromogênica foi deixada ir até a revelação de cor suficiente estar aparente, Em seguida, 100 pL de solução de parada de peroxidase foram adicionados a cada poço para parar a reação. A absorbância de luz de cada mistura de reação na placa foi liga a 4 05 nm usando um leitor de placa SpectroMax~M2 com SoftMax Pro usado como software de controle. Concentrações conhecidas diluídas em série de amostras de U-ACTX-Hvla puras foram tratadas da mesma maneira que a descrita acima no ensaio ÍELISA para gerar uma curva padrão de massa-absorbãncia para análise de quantidades. O VACTX-Kvla expresso foi detectado por iELISA a 3,09 i 1,83 ng/pL nos extratos de TSP de folha do tabaco transformado com FECTBGXH; e 3,56 ± 0,74 ng/pL no extrato de TSP da folha do tabaco transformado com TRBO-BGIH. Ou o G-ACTX-Hvla expresso é de 0,40%

8 / da proteína solúvel total de TSP) para transformantes FECTEGIH e 0,67% de TSP em transformantes TRBO-BGXH.

[242] Em conclusão, ambos os sistemas de expressão de planta trans lent e FET e TRSO podem ser usados para expressar a proteína de motif XCK em planta. O nível de expressão de proteína de motif XCK em ambos os sistemas estã muito próximo. Entretanto, a expressão no sistema FECT distribui uniformemente nas folhas agroinfiltradas, ao passo que a expressão no sistema TRBO acumula no tecido vascular das folhas agroinfiltradas.

[243] Exemplo 2

[244] Expressão transients de proteína de motif XCK em folha de tabaco com acumulação em diferentes alvos subcelulares.

[245] A proteína de motif XCK expressa precisa acumular até um certo nível na planta para proteger eficazmsnte a planta de dandos de insetos. 0 nível de acumulação da proteína de motif ICK expressa pode ser afetado pela sua localização final nas células da planta. Neste exemplo, nos investigamos os efeitos de diferentes localizações subcelulares da proteína de motif XCK expressa em planta no nível de acumulação da proteína na planta (usando o sistema de expressão de planta transients FECT). Três alvos .subcelulares foram investigadas neste exemplo, apaplatso de parede celular de planta (APO), o retículo endoplasmático (ER) e o citop1asma (CYTO).

[246] A ORF de expressão de proteína de motif XCK de alvo APO foi projetada para codificar uma série de motifs estruturais fundidos translacionalmente que podem ser descritos como a seguir: N' ~ERSP-Sta-I»-XCK-C* . Novamente, a proteína de motif XCK neste estudo foi U-ACTX-Hvla e a ORF de expressão de BGXH no exemplo foi usada. 0 mesmo vetor que no exemplo 1, PFECT~BGXH, foi usado aqui.

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[247] A ORF de expressão de proteína de motif ICK dirigida para CYTQ foi projetada para codificar uma série de motifs estruturais fundidos translacionalmente que podem ser descritos como a seguir: N-' -Sta~L~ICK~C-' . Neste estudo, a sequência de ONA codificando o peptídeo sinal de c-amilase de cevada foi removida da ORF de expressão de BGIH e se tornou a ORF de expressão de GIH cuja sequência de estrutura de leitura aberta está abaixo:

ATGGCTAGCAAAGGAGAAGxAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGA TGGTGATGTTAATGGGCACAAAmTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGIGATGCTACATACGGA AAGCTIACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCA CTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTrCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTT TTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAGGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGG AACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAA AAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTC ACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGC

CACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATIGGCG

ATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTITCGAAAGATCC

CAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGC

ATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGAGAATATrGTGTTCQAGTTGATCAACCATGTTCTC

TTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATAC

TGTTTATTATTGTAGAGCTTAA (SEQ ID NO: 15)

A ORF de expressão de GIH foi clonada para os sítios de restrição Pac I e Avr II do vetor de expressão FECT para criar o vetor de expressão de GIH para o sistema de expressão de planta transients FECT (pFECT-GXH) para a expressão de alvo de CYTO de

U-ACTX-Hvla.

[248] dirigida a codificando

A ORF de expressão de proteína de motif ICK ER foi projetada adicionando uma sequência de DNA o peptídeo sinal de alto de KR e a extremidade C' da

ORF de expressão de BGXH que foi denominada como ORF de expressão de BGXH-ER. O peptídeo sinal de alvo de ER usado aqui tem as seguintes sequências de aminoãcido (código de uma letra para amínoãaido):

KDEL (SEQ ID NO: 16)

A sequência de DMA da ORF de expressão de BGXH-ER e como a seguir:

ATGGCTAATAAAavCCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTG

CAAGCGGAGCTAGCXAAGGAGAAGAACnTTTCACWGAGTTGTCCCAATTCTGTTGAATTAGA

TGGTGATQTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGA

AAGCTTACCCTTAAATTTATTTGOCTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTaA

CTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTT

TTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAA.G3CACTATATCTTTGAAAGATGACGGG

AACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAA

AAGGTATTGATTTTAAAGAAQATGGAAACATTCTCSSGACACAAACTCGAGTACAACTATAACrC

ACACAAIGTATACATCACXSGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGC

CACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCxAACAAAATACTCCAATTGGCG

ATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGAaACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCC

C^CGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTrCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACAOATGGC

ATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGIGTTCCAGTTGxATCAACCATGTTCTA

TTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATAC

TGTTTATTATTGTAGAGCTAAAGATGAGCTCTAA (SEQ XP NO: X?)

A ORF de expressão de BGIH-ER foi clonada para os sítios de restrição Pac X e Avr IX do vetor de expressão FECT para criar o vetor de expressão de BGXH-ER para o sistema de expressão de planta transients FECT (pFECT-BGXH-ER), para a expressão de alvo de ER de Ü-ACTX-Hvla.

[249] Todos os três vetores, pFECT -BG.IH, pFECT-GIH e pFECT-BGlH-ER, foram transformados na cepa Agrobacterium, GV3X01 e as células GV3101 transformadas resultantes foram usadas para transformação transients nas falhas de Nicotians benthamiana usando os métodos descritos no Exemplo 1. Todas as três ORFs de expressão devem expressar transientemente uma proteína de fusão compreendendo ü-ACTX-Hvla fundida a GFP com um ligante clivável de tripsina entre os dois domínios estruturais.

[250] Após 6 dias de transformação de tabaco transients, a expressão de u-ACTX-Hvia fundida a GFP foi examinada inicialmente por detecção de fluorescência verde sob luz UV. Fluorescência verde foi detectada em vários níveis em todas as folhas de tabaco transíormadas. As folhas transformadas com acumulação de alvo C¥TO de U-ACTX-Hvla fundida a GFP mostrou a mais forte fluorescência verde e essas folhas com acumulação de proteína de fusão de alvo APO ou SR mostrou fluorescência verde mais fraaa. Assim, os resultados indicaram que expressão de alvo CTTO pode facilitar maior acumulação de proteína U-ACTX-Hvla fundida a GPP transgênica que a expressão de alvo APO e ER em falhas de tabaco. Em três replicações deste experimento, as folhas de tabaco transformado com expressão de alvo de C¥TO mostraram fluorescência verde semelhante ou mais forte que aquela das folhas com expressão de alvo de APO, e a fluorescência verde mais fraca foi detectada nas folhas de tabaco transformadas com os constructos de alto de ER. Estes resultados iniciais indicaram que expressão de alvo de CYTO pode acumular tanto ou mais proteína de fusão transgênica do que a expressão de alvo de APO, e que a expressão de alvo de ER produziu a menor acumulação.

[251] Amostras de proteína solúvel total foram extraídas de folhas de tabaco transformadas com os diferentes vetores FECT (protocolo foi descrita em detalhes no Exemplo 1) .

Ensaio de nroteina Pierce Coomassie Plus foi realizado como na descrição do Exemplo 1 para determinar as concentrações da proteína solúvel total nos extratos de TSP, rendendo as seguintes estimativas de concentraçãox 0,31 ± 0,04 pg/pL, 0,31 ± 0,03 pg/pL e 0,34 ± 0,05 μσ/μ!< para expressões de APQ de alvo, CTTQ de alvo e ER de alvo, respectivamente (N « 3}.

[252] O protocolo ELISA indireto foi, então, realizada utilizando os extractos de TBP como descrito no Exemplo 1 para quantificar o nível de expressão da proteína U-ACTX-Hvla como uma percentagem de proteína solúvel total (% de TSP), rendendo as seguintes estimativas percentuaisx 0,120 ± 0,032%, 0,045 ± 0,005% e 0,025 :fc 0,018% para expressões de APO de alvo, CITO de alvo e ER de alvo, respectivamente (N ~ 3) . Fig» 8 sumariza esta quantificação de ü-ACTX-Hvla expresso (coma valores de % de ISP) para as várias folhas de tabaco transformadas descritas acima. Estes resultados indicam que expressão de transgene de alvo APü resultou na maior acumulação de proteína de motif ICK corretamente dobrada expressa nas folhas.

[253] Na geral, embora a folhas de tabaco transformadas produzam ü-ACTX-Hvla de alvo CYTO, fundido a GPP transgênico apresentaram o sinal de fluorescência verde mais potente, os resultados de 1ELISA detectaram o mínimo de peptídeo U-ACTX-Hvla nestas folhas de tabaco transgênico, de fato, consideravelmente menos da que o que foi detectado para folhas transformadas para expressão de alvo de ER (que teve o sinal de fluorescência verde mais fraco). Em ensaios iELISA, o anticorpo primário (anticorpo anti-ü-xACTX-Hvla de coelho) apenas pode ligar no peptídeo U~ ACTX-HVla corretamente dobrado.

[254] Exemplo 3

[255] Peptídeos sinal alternativas para expressão de proteínas de motif XCK em plantas.

[256] Uma vez que peptídeo sinal da ER podem desempenhar um papel no nível de expressão de proteínas, dois outros EREPs foram testados utilizando o sistema de expressão FECT descrito nos exemplos anteriores. Os dois candidatos de ERSP eram peptídeo sinal de extensina de tabaco, abreviado como

E neste estudo (Memí	slink	et al, the Plant	Journal,	1983,	V 4 ;
1011-1022.}, e uma de	suas	variantes abrevias	la como	E* (P-	ague
GP et al, Plant Eíote	chnol	.ogy Journal, 2010,	V8 ; 08	-854x)<	, As
suas sequências de an	dnoãí	sidos são listadas	abaixo	(n ’ a	c *

código de uma letra, oom resíduos não idênticos em negrito):

Peptídeo sinal de extensina (EMGO4ãSX»FAS'LLWLV$LSLASESSA (SEQ XD NO; 18)

Variante de peptídeo sinal de extensina (E*) t MGKMASLFATFLVVLVSbSLASESSA (SEQ ID NO: 19}

[257] Uma sequência de DNA codificando E foi projetada para expressão de tabaco como a seguir;

•x ts z··* -5¾

TCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTyrCTCTGTCTCT

GGCTTCTOAATCTTCTGCT (SEQ ID HO: 20)

A sequência de DNA E foi gerada usando PGR de oligo extensão com quatro iniciadores de DNA sintéticos. Em seguida, a fim de adicionar um sítio de restrição Pac I em seu terminal 5’ e adicionar parte da sequência 5 ’ terminal de GFP no seu terminal 3‘, uma outra PCR foi efetuada utilizando a sequência de ONA E como um molde, rendendo um fragmento de DNA de 117 bp. Este fragmento foi, então, usado como o iniciador de PCR direto para amplificar a sequência de DNA codificando a ORE de GFP-XGER ligante-U~ACTX~Hvla do vetor pPECT-BGlH (consultar o Exemplo 1 e Exemplo 2), assim produzindo uma ORF de expressão U-ACTX-Hvla codificando (do terminal N' a C-') peptídeo sinal de extensina

GFP-XGER ligante-ü-ACTX-Hvla, seguindo um de nosso projeto de

ORF de expressão de proteína de motif ICK coma EREF-Sta-L-ICK. Esta ORF de expressão, denominada ‘’EGIH”, tem um sítio de restrição de Pac X em seu terminal 5* e sítio de restrição de Avr XX em seu terminal 3'. EGIH tem a seguinte sequência de DNA:

TTAATTAAATGGGTAxAGATCRJCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCT CTGTCTCTGGCTTCTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTrGTCC CAATTCTTGTIGAATTAGATGGTOATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGA AGGTOATGCrACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTQQAAAACTACCTGTT CCATGGCCAACACrTGTCACTACTTrCTCTXATGGTGTrCAATGCn”fTTCCCGTTATCCGGATC ATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTAT ATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGAOGCGTGCTGÁAGTCAAGTTrGAAGGTGATACCCTT GTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTxAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAAC TCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAA AGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAA ÇAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAAT CTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTOACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGC TGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGXX3TTCCA GTXGATCAACC>TGTXCTCTTAATACrCxAACCATGTTGTGATGxATGCTACTTGTACTCAAGAAA GAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (EEQ ID NO: 21)

A sequência de DNA de EGIH foi clonada para os sítios de restrição Pac I e Avr XX do vetor FECT para gerai' o vetor pFECTEGIH para expressão de planta transients de proteína U-ACTX-Hvla fundida a GFP.

[258] Uma sequência de DNA codificando o peptídeo sinal de extensina variante (E*) foi projetada para expressão de tabaco como a seguir:

ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCT

GGCTTCTGxAATCTTCTGCT (SEQ XD NO: 22)

[259] Uma sequência de DNA ”E*GXH^H que codificou uma fusão translacional de (listada de N’ para C‘) proteína GFP-IGER ligante-U-ACTX-Hvl de peptídeo sinal de extensina variante foi orlada usando as mesmas técnicas como descritas acima para a ORF de EGIH. A ORF de E*G-XH resultatne tem a seguinte sequência de WA;

TTAATTAAATGGGTAAGAXGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCT CTGTCTCTGGCTTCTGAATCTTCTGCTGCTAGCAÍGKGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCC CAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGrüAGTGGAGAGGGTGA AGGTGATGCTACATACQGÁAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTT CCATGGCC.AACAOTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGA.TC ATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTArGTACAGGAACGCACTAT ATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGA^GTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTT GTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAAC TCGAGTACAAeTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAA AGCTAACTTCAAAATTCGCCACAAQATTGAAGATGGATGCGTTCAAGTAGCAGAGQATTATCAA CAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTGGACACAAT CTGCCCTTTCGAAAGATCCGAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGC TGOTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTGTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCA GTTGATCAAeCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTQATGATGCTACTTGTACTCAAGAAA GAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NOt 23}

A sequência de DMA de E*GXH foi clonada para os sítios de restrição Pac X e Avr XI do vetor FECT para gerar o vetor pFECTE*GIH para expressão de planta transiente de proteína ü-ACTXHvla. fundida a GFP

[250] Três vetores de expressão FECT diferentes,pFECTBGIH, pFECT-EGXH e pFECT-E*GXíí, foram utilizados para expressar transientemente proteína U-ACTX-Hvla fundida a GFP em plantas de tabaco para avaliar como o nível de expressão de proteína é afetado pelos diferentes ERSPs. Os três vetores de expressão FECT foram transformados em Agrobacterium, GV3101 e, em seguida, a GVXlôi transformada foi injetada em folhas de tabaco para a expres são transi ent e de U-ACTX-Hvla fundida a GFP em falhas de tabaco utilizando as técnicas descritas no Exempla 1.

[261] Qs níveis de expressão de U-ACTX-Rvla fundida a GFP de três vetores de expressão fect diferentes descritos acima são em primeiro lugar avaliados visualmente par meio da detecção de fluorescência verde sob luz UV. Fluorescência verde das folhas de tabaco transitoriamente transformadas dos três vetores FECT diferentes é visível a olho nu. Todas as folhas apresentaram níveis semelhantes de fluorescência verde, sugerindo que nenhum dos três ERSPe testados contribuiu para um aumento significativo no nível de expressão de ü-ACTX-Hvla fundida a gfp.

[262] Amostras de proteína solúvel total foram extraídas das folhas de tabaco transformadas com os três vetores ersp fect corno descrito acima (protocolo é descrito em detalhes no Exemplo 1). Ensaio de proteína Pierce Coomassie Plus foi,então, realizado (como descrito no Exemplo X) para determinar a concentração da proteína solúvel total nas amoshras de TSP resultantes, rendendo valores de 0,85 ± 0,68 pg/pL, 0,70 ± 0,47 pg/pL e 0,76 ± 0,77 pg/pL para amostras correspondendo às ORFs de expressão de RGIH, EGIH e E*GIH, respectivamente (N » 4)

[263] ELISA indireto foi, então, realizado utilizando os extractos de TSP (como descrita no Exemplo 1) para quantificar o nível de expressão da proteína U-ACTX-Hvla como uma percentagem da proteína solúvel total (% de TSP), rendendo os valores de 0,38 ± 0,17% (N®3, porque um panto de dados foi retirado como delineador), 0,48 ± 0,26% (N«4), e 0,62 ± 0,38% (N«4) para amostras correspondendo aos vetores FECT com QRFs de expressão de BGIH, EGXH e E*GXH. Fig 9 sumariza os níveis estimados de U~ACTX~Hvla coma percentagem na proteína solúvel total (% de TSP) para todas as amostras tomadas de folhas de tabaco transformadas com as três ORF de ERSP descritas acima. Embora os dados de % de TSP de três transformações de vetor FECT parecessem diferentes, eles não são estatisticamente diferentes pelo teste t de Student. Em outras palavras, os três ERSPs não fizeram diferença no nível de expressão de U~ACTX~Hvla nas folhas de tabaco transformadas transientemente»

[264] Exemplo 4

[265] Proteína de estabilização expressa como proteína de fusão para a proteína de motif XCK ajuda a acumulação de proteína de motif XCK em plantas transformadas.

[266] A proteína de motif ICK para expressão de planta neste exemplo foi Õmega-ACTX-Hvla, proveniente da Aranha Teia de Funil das Montanhas Azuis da Austrália, Hadronyche versuta. ômega-ACTX-Hvla tem a seguinte sequência de aminoácidos (código de uma letra);

SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)

[2571 0 sistema de expressão de FECT foi usado para expressar ômega~ACTX~-Hvla na planta de tabaco Ni cot. iam benthamíana. Dois vetores FECT codificando diferentes ORFs de expressão de Ômega-ACTX-Hvia foram engenhe-irados. Uma destas ORFs de expressão codificavam Ômega-ACTX-Hvla com peptídeo Sinal de Alfa-Amilase de Cevada (BAAS) no seu N’ terminal sem qualquer proteína estabilizante. Esta ORF de expressão, denominada aqui como foi subclonada para render o vetor de expressão FECT pPECT-BO« A outra ORF de expressão ômega~ACTX~Hvla codifica uma fusão translacional de ômega-ACTX~Hvla ã proteína Jun a 3. A Jnn a 3 é uma proteína defensora de planta de -30 kDa a qual também é um alérgeno para algumas pessoas, ê produzida por árvores Juniper us ashei e é usada nesta ORF como uma proteína de estabilização translacional (STA). A sua sequência de aminoácidos é listada abaixo (código de uma letra);

MARVFEuAFLLAATLAXSLHMQEAGVVKFDXKNQCGYTWAAGEPGGGKREDQGQTWTV NLAAGTASARFWGRTGCTFDASGKGSCQTGDCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLV DGFNXPLAINPTNAQCTAPACKADXNAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPAT NYEKXFKNQCPQAYEYAKDDTATFACASGTDYSXVFC (SEQ XD NO:25)

A proteína Jun a 3 madura ê fornecida abaixo na SEQ xd NO: 26.

O’DlKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNIAAGTASARFNGRTGCTFDxASGKGEC QTGDCGGQLSCTVEGAVPATLAEYTQSDQDYYDVELVDGFNXPLAXNPTNAQCTAPACKADINA VCPSEXíKVDGGOSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACA SGTDYSXVFC (SEQ XD NO: 26)

O ERSP codificado na ORF de SEQ. XD, 25 é o peptídeo sinal nativo Jun a 3 mostrado abaixo como SEQ. XD 27. MARVSEXAFLIAATLAZSLHMQEAGW SEQ. XD. 27 ligante XGER, codificado pela sequência entre o domínio êmega-ACTX~Hvla e cs domínios Jun a 3 que são codificados na ORF, está descrito em detalhes no Exemple 1. Tomadas em conjunto, esta ORF de expressão de Ómega-ACTX Hvia ê denominada como S>~Juna3-XGER~Ômega, ou SJXO, Do mesmo modo, o vector FECT no qual a ORF de expressão SJXO foi inserida foi denominada pFECT-SJÍO.

[268] Os dois vetores de expressão ômega-ACTX Hvla FECT, pFECT-EO e pFECT-SJXO, foram utilizados para expressar transientemente proteína Ómega-ACTX Hvía em plantas de tabaco. Os dois vetores de expressão FECT foram transformados em GV3101 de cepa Agrobacterium e o tranaformante GV3101 resultante foi injetado em folhas de tabaco para a expressão transients de ômega-ACTX-Hvla em folhas de tabaco utilizando as técnicas descritas no Exemplo 1.

[26 9 j No dia 6 pós-transformação de tabaco, folhas de tabaco transformadas foram colhidas e as proteínas de folhas solúveis totais foram extraídas das folhas (vide Exemplo 1 para métodos detalhados). Ensaio de proteína Pierce Coomassie Plus foi,entãoí realizado para determinar as concentrações da proteína de folha solúvel total, rendendo valores de 3,047 i 0,176 pg/pL (N®2) e 2,473 i 0,209 pg/pL (N®2) para as folhas transformadas com constructos coificando pFECT-SJXQ e pFECT~BO, respectívamente

[270] O protocolo ELXSA indireto foi, então, realizado utilizando os extractor de TSP acima como descrito no Exemplo 1 para avaliar quantitativamente o nível de expressão da proteína Ômega-ACTX-Hvla como percentagem da proteína solúvel total (% de TSP) , rendendo valores de 0,133 ± 0,014% (N®=2) e 0,0004 ± 0,0003% (N«2) para as folhas transformadas com os vetores pFECT-SJXO and pFECT~BO, respectivamente. Estes dados indicaram que ômega-ACTXHvla expressa como uma fusão translacional para Jun a 3 acumulou a um nível de estado constante de mais de 300 vezes mais alto que aquele de Ômega-ACTX-Hvla expressa sem fusão translacional a proteína Jun a 3>

[271] o exemplo 4 acima, a função da STA também podería ter sido realizada com lectina snowdrop (GNA) tendo a seguinte sequência:

WXLYSGETI.STGEFLN¥GSFVFXMQEDCNLVL¥DVDKPXWATNT<»LBRSCFLSMQTDGNLW YNPSNKFXWASNTGGQNGN¥VCXI4>KDBNVVX¥GTDRWATG (SEQ ID NO: 28)

[272] Exempla 5

[273] Um liganta clivável entre o domínio de proteína de estabilização ® os domínios da proteína de motif ICK em uma ORF de expressão de proteína de fusão de motif ICK intensifica a atividade inseticida da proteína de motif ICK resultante expressa em uma planta transgênica.

[274] uma vez qae a maioria dos insetos mastigadores secreta tripsina em seus intestinos para digerir alimentos, nós projetamos uma ORF de expressão de proteína de fusão que codificou um. ligante clivãvel da tripsina entre o domínio de proteína de estabilização e o domínio de proteína de motif ICK da fusão, a fim de facilitar a liberação do domínio de motif XCK. da proteína, de fusão intacta no intestino do inseto.

[275] A proteína de motif XCK para expressão de planta aqui foi Ômega-ACTX-Hvla cuja sequência de aminoácidos é como a seguir (código de uma letra):

SPTCITSGQPCPTNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO; 24)

[276] A ORF de expressão de ômega~ACTX~Hvla que foi usada codifica uma oroteína de fusão comoreendendo os seguintes domínios (Ν' a C') : peptídeo sinal Jun a 3c c Jun a 3: c ligante IGERt: ômega-ACTX-HvXa, como ma fórmula estrutural ERSF-Sta-LXCK descrita acima. A origem e sequência de JUn a 3 ê como descrito acima no Exemplo 4.

[277] Q ERSP usado aqui foi o peptídeo sinal nativo Jun a 3, como descrito acima no Exemplo 4,

[278] O ligante XGER, codificado pela sequência entre o domínio ómega-ACTX-HvXa e os domínios Jun a 3 que são codificados na ORF, está descrito em detalhes no Exemplo 1. Tomadas em conjunto, esta ORE de expressão de Ômega-ACTX Hvla ê denominada como S Juna3~XGER~ômega, ou SJIO. Po mesmo modo, o vector FECT no qual a ORE de expressão sjiq foi inserida foi de nomi nada p FE CT - S 3X 0 <

[279] O vetor, pFECT-SJlO, foi, então, usado para expressar transientemente proteína âmega-ACTX-Hvia em plantas de tabaco. O vetor foi transformado em Agrobacterium, GV3101, e, então, a GV31Q1 transformada foi injetada em folhas de tabaco para expressão transiente de Ômega-ACTX-Hvla nas folhas utilizando as técnicas descritas em detalhes no Exemplo 1.

[280] No dia 6 após transformação de folha de tabaco, 3,3 g de folhas de tabaco transformadas foram recolhidos e moidos em nitrogênio líquido. 50 mL de tampão de TSP-Sel foram usados para extrair as proteínas solúveis totais (TSP) das folhas moídas seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1. üm total de 2β ml» de extrato foi recuperado do procedimento de extração de TSP, o qual foi, em seguida, dividido uniformemente em duas amostras, A e B, com 13 ml» de extrato para cada grupo. A amostra A foi tratada com tripsina para liberar Ômega-ACTX-Hvla da proteína Jun a 3 fundida adicionando 1,3 mL de 1 mg/mL de tripsina. em HC1 1 mM a 37 ^eC durante 1 hora Amostra B não foi tratada por divagem com tripsina. Para obter ômega-ACTX-Hvla na faixa de concentração de bioatividade, ambos os grupos foram concentrados do mesmo modo como se segue. Em primeiro lugar, as extrações foram carregadas em um concentrador com membrana de filtro de corte de 10 kb e centrifugadas a 3200 g durante 2 horas. Em seguida, 1,4 mL de retentado da Amostra A e 1,1 mL de retentado da Amostra B foram, guardados para testes posteriores. O filtrado de 12,5 mL da Amostra A e filtrado de 12,5 mL da Amostra B foram ainda concentrados por centrifugação em concentradores com membranas de filtro de corte de 1 kP a 3200 g por 16 horas. 1,3 mL de retentado foram recuperados da Amostra A e 1,1 mL de retentado foram recuperados da Amostra B. Ambos os retentados de filtração de corte de 1 kP foram guardados para testes posteriores. Este procedimento de concentração de amostra foi resumido na Fig. 10. A extração de TSP total de folhas de tabaco trans formadas por pFECT-SJXO foi dividida unifurmemente para duas amostras, Uma amostra (A) foi tratada por divagem com tripsina e a outra (B) não. Ambas os grupos foram concentrados por centrifugação nos concentradores com 10 kD e, então, membranas de filtra de corte de 1 kD, e as re tentados da fíltração de corte de 10 kD e 1 kD foram guardados para mais testas.

[28X] A ORF de expressão de SJ.IO expressou uma proteína de fusão da seguinte forma, Jun a 3: cIGER; ;Omega~AQTX~Kvia_f que compreende um total de 266 resíduos de aminoácidos e tem um peso molecular previsto de 28.204,28 Da. A clivagem de tripsina desta proteína de fusão deve liberar um ômega~ACTX.~Hvla com peso molecular de 4.848,2 Da e proteína de fusão Jun a 3::XGER com peso molecular de 24.155,1 Da. Portanto, se a reação de divagem de tripsina está completa no tratamento, então, os componentes antecipados das da seguintes

Re tent ade filtração de

Xó kD fusão Jun a

11tração de

RD da

Amostra.

Omega-ACTRkD da

Amostra :ger

Retentada de tção

RD da Amostra nenhuma proteína expressa em SJIO.

[282] Para quantificar o peptídeo âmega-ACTX-Hvla nas amostras de retentado, iELISA foi realizada como descrita no Exemplo 1. As concentrações detectadas de âmega-ACTX-Hvla nas amostras eram como se segue;

Re tentado de filtração de 10 kD da Amostra A:

1,328 ng/pl» de Omega-ACTX-Hvla, total 1,86 pg.

Retentado de filtração de 1 kD da Amoetra A: 2,768 ng/pL de ômega-ACTK-Hvla, total. 3,60 pg.

Retentado de filtração de 10 RD da Amostra B: 12,056 ng/pL de ômega~ACTX~Hvia, total 13,52 pg,

Retentado de filtração de 1 kD da Amostra B: 0,752 ng/pL de Ômega-ACTX-Hvla, total 0,83 pg.

Como indicado, ômega~ACTX~Hvia fol detectado em todas as

amostras de	filtração que	foram	analisada:	s. 0 ômega-ACTX-	Hvla
detectedo no	retentado de	filt rs	tção de 1	.0 kD do	Grupo	A é
pre sumi veimen	•te devido em	grande	parte à	retenção	f ísics	da

proteína de fusão não clivada. Da mesma forma o ômega~ACTX~Hvla detectado na amostra de. retentado de filtração de 1. kD do Grupo B podería ser devido a uma baixa taxa de filtração espúria da proteína de fusão não clivada através da membrana de filtro de corte de 10 kD.

[283]Para confirmar que a reação de divagem de tripsina foi bem sucedida, Cromatografia. Líquida de Alto Desemperüio de fase reversa (rpHPDC) foi realizada para analisai' os componentes nas amostras de filtração reservadas. HPLC foi realizada utilizando um sistema de HPLC Variar. E.218 com uma coluna monolítica C₅.₈ Onyx 100 (4,6 x 100 mm), utilizando água com 0,1% de ácido trifluoracético (solvente A) e acetonitrila com 0,1% de ácido trifluoracét-ico (solvente B) , como componentes da fase móvel, O peptídeo ômega-ACTX-Hvla foi eluído da coluna a uma taxa de fluxo de 2 mD por minuta, utilizando um gradiente linear de 10 - 20% do solvente B durante '10 minutos. Amostras de 85% de ômega-ACTX“Hvla sintético puro foram usadas em rpHPLC para produzir uma. curva padrão (relacionando ãrea do pico a massa de peptídeo injetado). Fig. 11 mostra três perfis de eluição separados, 11A, 11B, 11C. Como mostrado na Fig» 11A, o peptídeo

Ômega-ACTX-Hvla eluiu a 6,5 minutos pôs-injeção. Quando uma amostra de 500 pi» do rebentado de filtração de 1 kD da Grupo B foi carregada no sistema HPLC, não havia pico de proteína entre 6 e 7 minutas após injeção no crcmatôgrafo de HPLC correspondente (Figura 11B). Quando uma amostra de EGO pL da

retentado de	filtração de 1 kD da Grupo A foi carregada no
sistema HP.LÇ,	não havia um pico no tempo de retenção de 6 , 3
m inut α s (ve r	linha pontilhada na Fig. 11) no cromatógrafo

correspondente, representando ômega-ACTX-Hvla liberado da

proteína de f

usão por clívagem com tripsina (Figura 110). A área

deste pico correspondeu a uma concentração de Ômega-ACTX-Hvla de entre 16-70 ng/pL no retentado de filtração de 1 kD da Amostra A

(dependendo d	q enfoque utilizado para integrar o pico)<
(2841	As amostras de filtração reservadas foram usadas
pa ra r e a 1 i za:	r bioensaios de injeção de mosca doméstica para
testar a ati'	vidade de Ômega-ACTX-Hvla na forma de proteína de

fusão e na forma liberada da proteína de fusão. Fupas de mosca doméstica (Musca domestica) foram adquiridas de Benzon Research, Inc. e mantidas a 25 em uma caixa de plástico com furos de ar na tampa da caixa e alimento para mosca (razão 1:1 de açúcar e

leite em pó)

e bolas de algodão embebidas em água na caixa. No

ia após a emergência de mosca doméstica adulta, as moscas fora

imobilizadas	usando uma linha de CO_S e mantidas imóveis usando
uma almofada	de infusão de co_;;. Moscas pesando 12-13 mg foram
selecionadas	para o bioensaio de injeção. Para realizar injeção
de mosca, um	microaplicador carregado com uma seringa de vidro

de 1 cm⁵ com uma agulha de calibre 30, na qual a solução de

injeção foi c	carregada, foi usado para distribuir doses de 0.5 μΐ»
para o tórax	dor-sal das moscas. As moscas injetadas foram, então
colocadas er	caixas marcadas com furos de ar e a mortalidade foi

classificada 24 horas após injeção. As seguintes amostras foram injetadas em moscas domésticas (foram utilizados grupos de 10 moscas para cada amostra);

Injeção de água como controle negativo.

Retentado de filtração de 10 kD do Grupo A.

- Retentada de filtração de 1 KD do Grupo A.

Retentado da filtração de 10 kD do Grupo B.

Retentado de filtração de 1 kü do Grupo B.

0,13 mg/mt» de solução de tripsina como controle negativo.

Em 2.4 h após injeção, o retentado de filtração de 10 kD da Amostra A e o retentato de filtração de 1 KD da Amostra causaram

100% de mortalidade da mosca doméstica, enquanto mortalidade de 0% foi observada para as moscas injetadas com as outras amostras. ômega-ACTX~Hvla de sequência nativa puro mostrou uma W.çg de 100 pmolZg de mosca doméstica neste bioensaio de injeção de mosca doméstica; daí, para gerar 100% de mortalidade neste paradigma, a concentração do dmega-ACTX-Hvla injetado deve ser de pelo menos .25 ngZpL. Isto é consistente com os resultados do bioensaio, uma vez que a análise por HPLC do retentado de filtração de 1 kD da Amostra A indicou uma concentração de concentração de ômega-ACTX-Hvla de 16 - 70 ng/pL. Amostras de filtração que não compreendiam material que foi tratado com clivagem de tripsina não geraram mortalidade no bioensaio de injeção de mosca doméstica, indicando que o ômega~3 ACTX Hvla fundido a dun a 3 era consideravelmente menos ativo do que o Ômega-ACTX-Hvla. de sequência nativa clivado do construeto de fusão por tripsina. Portanto, a região de ligante de uma ORF de expressão de proteína de motif ICK de planta pode mostrar função insecticide intensificada quando projetada para ser clivável, de :106/273 modo que o domínio de motif ICK da proteína de fusão ICK pode ser liberada dos outros domínios estruturais da proteína por proteólise.

[285] Parte II. Peptídeos de Alta Produção

[285] A capacidade de produzir com sucesso peptídeos insecticidas em uma escala comercial, com formação e dobramento de peptídeo reprodutível, e com controles de custo pode ser desafiadora. A ampla variedade, propriedades únicas e natureza especial de peptídeos combinadas com a imensa variedade de possíveis técnicas de produção podem apresentar um número esmagador de enfoques para produção de peptídeos.

[287] Existem poucas, se houver, descrições, contudo, que descrevem como mudar um peptídeo de modo que ele seja produzido num sistema biológico, a uma taxa muito mais elevada de produção, que o peptídeo é tipicamente produzido antes de ele ser mudado. Aqui nós apresentamos uma maneira de alterar a composição de um peptídeo e quantidade e, simultaneamente, peptídeo. Nós descrevemos ao fazê-lo aumentar a taxa e reduzir o custo de produção de novas maneiras de mudar ou “converter” um peptídeo em um peptídeo diferente, mais rentável, embora um que surpreendentemente seja tão tóxico como antes de ele ser convertido.

[288] Nós descrevemos exemplos desses novos peptídeos convertidos e nós mostramos como estes métodos para alterar ou converter um peptídeo podem fazer uma melhoria significativa no rendimento de peptídeos sem fazer alterações significativas em sua atividade. Os novos processos, novos peptídeos, novas formulações e novos organismos para produzir esses peptídeos sãc aqui descritos a reivindicados. Um processo é descrito o qual aumenta o rendimento da produção de peptídeo inseticida de sistemas de expressão de levedura adicionando um dipeptideo no terminal N de peptídeos inseticidas. A adição de um dipeptideo não afeta adversamente as atividades inseticidas de peptídeos inseticidas.

[3891 Nós descrevemos exemplos desses novos peptídeos convertidos e nós mostramos como estes métodos para alterar ou converter um peptídeo podem fazer uma melhoria significativa no rendimento de peptídeos sem fazer- alterações significativas em sua atividade. 0s novos processos, novos peptídeos, novas formulações e novos organismos para produzir esses peptídeos são aqui descritos e reivindicados.

[2901 Procedimentos detalhados para fazer peptídeos de a1ta produção.

[291] Nós descrevemos um processo e peptídeo que podem aumentar produção de peptídeo» Quando seguidas estas técnicas proporcionarão um peptídeo convertido adicionando um dipeptideo no N~terminal do peptídeo nativo que tem melhor taxa de produção do que o peptídeo nativo de três maneiras diferentes. Primeira, o rendímento médio global das cepas de peptídeos nativos dipeptídeos é melhor do que aquele das cepas nativas; segunda, o rendimento mediano das cepas de peptídeos nativos dipeptídeos é melhor do que aquele do nativo; e terceira, existem mais cepas de dípeptídeos na faixa de rendimento mais elevado do que para cepas de peptídeo nativas. 0 processo descrito aqui pode ser usado em vãrios in vivo sistemas, incluindo plantas, animais e micróbios. A invenção requer a adição de um dipeptideo ao Nterminal do peptídeo nativo, o qual é o peptídeo que era conhecido antes de o dipeptideo ser adicionado. O peptídeo conhecido é, então, ”convertido«, e ele pode, então, ser feito com maiores rendimentos do que se pensava possível. Numa modalidade peptídeos inseticidas são ligados a um dipeptídeo. Estes sistemas dipeptideo-peptídeo nativo podem ser utilizados em plantas que podem produzir os peptídeos. Peptídeos produzidos em planta têm uma variedade de usos da produção a simplesmente tornar um peptídeo tóxico disponível para consumo por um insecto prejudicial, assim, ou protegendo as plantas ou possivelmente proporcionando outros benefícios.

[292] Em uma modalidade nós descrevemos um processo para aumentar o rmdiment.o da produção de peptídeo inseticida em sistemas de expressão de levedura pela adição de qualquer dipeptídeo ao N-terminal do peptídeo inseticida. O dipeptídeo é composto de um aminoácidc não polar e um aminoácido polar. O aminoácido não polar pode ser selecionado de glicina, alanina, prolína, valína, leucina, isoleucina, fenilalanina e metionina. Glicina é o aminoãcido não polar preferido. O aminoácido polar pode ser selecionado de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptofano e tirosina. Serina é o aminoácido polar preferido. O processo e os aminoácidos são descritos em que o aminoácido não polar está no N-terminal da dipeptídeo e numa modalidade o terminal preferido do dipeptídeo e glicina. O processo e os aminoácidos são descritos em que o aminoãcido polar está no C-terminal do dipeptídeo e numa modalidade o C~terminal preferido do dipeptídeo é serína.

[223] Em uma modalidade da invenção, o dipeptídeo é glicina-serina, g.ly-ser ou GS. Estes aminoãcidos são tipicamente codificados pelos seguintes côdons? Gly pode ser codificadas por códons tais como GGT, GGC, GGA, GGG e Ser pode ser codificada pelos códons tais como TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, e AGC.

[224 ]

Os transgenes dos peptídeos inseticidas são projetados de tal forma que as suas sequências de transgenes sejam otimizadas para a expressão específica que pode ser necessária. Por exemplo, os transgenes de peptídeos inseticidas podem ser otimizados para expressão em levedura, plantas, bactérias e vírus, Exemplos de tais usos da invenção incluiríam a engenharia e otimização de transgenes para culturas como mais e soja, com a finalidade de protegê-los de pragas de insetos. Em um exemplo nés projetamos transgenes de peptídeos inseticidas de tal forma que as suas sequências de transgenes sejam otimizadas para a expressão específica em sistemas de expressão de levedura utilizando, por exemplo, Kluyveromycec lactis, Pichía pastoris, e Nacoharomyces cerevisiae. Outros sistemas de expressão de levedura adequados são conhecidos na. arte» Os códons de nucleotídeos para um dipeptídeo, tal como glicina-serina, {g.ly~ ser), são adicionados ã extremidade 5* das sequências cie transgene dos peptídeos inseticidas maduros. As sequências de transgenes são, então, ligadas em vetores de expressão apropriados os quais podem proporcionar marcadores de seleção apropriados, fortes conjuntos de promotor-terminador para o sistema de expressão de levedura especifico, sequências de sinal para secreção, e sítios de divagem entre as respectivas sequências de sinal e sequências de peptídeos maduros. os vectores de expressão de peptídeo inseticida são, então, transformados em células de levedura por meios conhecidos cie um especialista na técnica, incluindo ambos os métodos de eletroporação ou transformação a fim de gerar cepas de levedura cie expressão de peptídeo estáveis. Quando estas cepas de levedura crescem em meios adequados, elas produzem peptídeos inseticidas modificados pela adição de uma sequência de dipeptídeo, glicina-serina., ao N~ terminal dos peptídeos inseticidas maduros, os quais são secretados para o meio de crescimento. A adição do dipeptídeo, glicína-serina, ao Nterminal dos peptídeos inseticidas maduros melhora significativamente o rendimento dos peptídeos inseticidas, sem efeitos adversos sobre as atividades inseticidas dos peptídeos.

[295] Nossos dados mostram que qualquer Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (CRIP) pode ser feito para crescer em rendimentos significativamente mais elevados do que seria de outro modo possível usando os procedimentos aqui descritos. Nós demonstramos que ambos os tipos ICK e não ICK de CRlPs podem ter seus rendimentos melhorados dramaticamente usando as técnicas de Alta Produção que nós descrevemos. Aqui nós fornecemos evidências de aumentos dramáticos e surpreendentes em rendimentos de dois tipos muito diversos de CRIPS.

[295] Os peptídeos inseticidas que podem ser convertidos podem ser selecionados de veneno inseticida, por exemplo, o veneno de uma aranha. A aranha pode ser uma aranha teia de funil da Austrália. Os peptídeos do gênero Atrax ou Hadronyche são D-ACTX-Hvla e seus análogos e são facilmente tornados especiais utilizando os procedimentos aqui descritos. Exemplos de peptídeos específicos de aranhas são descritos na listagem de sequências aqui fornecida. Estes peptídeos e outros podem ser convertidos utilizando os procedimentos aqui descritos.

[297] Os peptídeos inseticidas que podem ser convertidos podem cer selecionados de toxinas de anêmona do mar, tal como de Anemone víridís como descrito no Exemplo 3. Anêmonas do mar estão longe em seu habitat normal das aranhas teia de funil do gênero de Atrax ou Hadronyche e o veneno de Anemone víridís não é considerado um tipo ICK de veneno, como são peptídeos venenosos de Atrax ou .Hadronyche, mas apesar disso o veneno do ouriça do mar, como os peptídeos tóxicos V~ACTX~Hvla e outros venenos inseticidas, é aquele que eles todos são um tipo de veneno que nós chamamos Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína ou CRIP e identificados aqui pela primeira vez como tal Os procedimentos aqui descritos, em todas as seções, são esperados e acreditados funcionarem com todos os peptídeos nas listagens de sequências e todos os peptídeos relacionados com essas sequências que seriam entendidos por um perito na arte como sendo um Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína ou CRIP. Todos esses peptídeos e outros podem ser convertidos utilizando os procedimentos aqui descritas.

1'388] Além do processo, nós também divulgamos novos Peptídeos de Alta Produção, neste documenta “peptídeos HP”, compreendendo um dipeptídeo ligado a uma extremidade de um peptídeo. Nas nossas modalidades o peptídeo é um peptídeo inseticida. Em uma modalidade o dipeptídeo é adicionado ao H terminal do peptídeo. Nós demonstramos sucesso na produção de cepas de alto rendimento com ambos os peptídeos CRIP ICK e não ICK. Em uma modalidade adicional o dipeptídeo é composto de um aminoãcido não polar e um aminoãcido polar. Em uma modalidade adicional o aminoãcido não polar é selecionado de glicina, alanina, prolina, vaiina, leucina, isoleucina, fenilalanina e metionina, e o aminoãcido polar é se1ec ícnado de s e r 1na, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptofano, tirosina, Numa modalidade específica um peptídeo HP ê compreendido de um peptídeo o qual é modificado para ter o dipeptídeo de glicina-serina como os dois primeiros aminoácidos de um peptídeo maduro de outra forma não modificado. Peptídeos

HP podem ser produzidos adicionando glicina-serina ao peptídeo U e seus análogos para criar peptídeos HP.

[299] Os peptídeos modificadas feitos pelos processos descritos neste documento são novos e são separadamente reivindicados. Estes peptídeos são descritas par todas as suas propriedades e não simplesmente sua sequência. Estes peptídeos são novos e têm propriedades únicas. Ambos os peptídeos HP e o processo de os fazer são reveladas e reivindicadas aqui.

[300] Exemplos de peptídeos úteis são bem conhecidos e podem ser encontrades em numerosas referências, Uma classe de peptídeos úteis são as peptídeos inseticidas. Peptídeos inseticidas podem ser identificados pela sua natureza peptídica e sua atividade, geralmente atividade inseticida oral ou de injeção» Aqui nós fornecemos alguns exemplos para mais bem ilustrar e descrever a invenção, mas a invenção não está limitada a estes exemplos. Todos estes e outras exemplos não aqui apresentados são descritivos de novos materiais, descritos e reivindicadas aqui pela primeira vez.

[301] Peptídeos HP (Alta Produção) são aqui definidos oomo quaisquer peptídeos capazes de serem produzidos a taxas de produção maiores que o normal utilizando as técnicas aqui descritas. Esses peptídeos podem ter atividade inseticida. Tipicamente, os peptídeos inseticidas mostram atividade quando injetados em insetos, mas a maioria não tem atividade significativa quando aplicada topicamente a um inseto. A atividade inseticida de peptídeos HP é medida de uma variedade de formas. Mêtodas comuns de medição são amplamente conhecidos dos peritos na arte. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, determinação das doses de resposta medianas {por exemplo, LD_se, PDss, LC_S«, ED_Sq) por adequação de gráficas doseresposta com base em vários parâmetros de classificação tais coma: paralisia, mortalidade, incapacidade de ganhar peso, etc.

As medições podem ser feitas para as coortes de insetos expostas a várias doses da formulação inseticida em questão. A análise dos dados pode ser feita criando curvas definidas pela análise de probidade e/ou a Equação de Hill, etc. Em tais casos, as doses seriam administradas por injeção hipodérmica, por infusão híperbárica, por apresentação da formulação inseticida, como parte de uma amestra de alimento ou de isca, etc.

[302] Exemplas específicos de peptídeos HP divulgados para fins de fornece exemplos e não destinados a limitar de qualquer maneira, são o peptídeo 0 e suas homologias os quais se originam dos venenos de aranhas Teia de Funil da Austrália.. ,A descrição destes peptídeos pode ser encontrada neste documento em seções anteriores.

[303] Os Exemplos neste relatório descritivo não se destinam e não devem ser utilizados para limitar a invenção, eles são fornecidos apenas para ilustrar a invenção.

[304] Conforme indiçada acima, muitos peptídeos são candidatos adequados como o objeto do processo para se tomarem especiais. As sequências notadas acima, abaixe e na listagem de sequências são peptídeos sspecialmente adequados que podem se tornar especiais e alguns destes se tornaram especiais d.e acordo com esta invenção com as resultados mostrados nos exemplo abaixe

GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A

EEQ ID NO: 5 (código de uma letra).

Denominada *U*2-ACTX~Hvla. Ela tem pontes dissulfeto nas posições; 5-20, 12-25, 19-39. 0 peso molecular é de 4554,85 Daltons.

GSR9C CPCYW GGCPW GQNCf PEGCE GPKV

SEQ ID NO: 29 (código de uma letra) . Denominada Av3r2, ela tem pontes dissulfeto nas posiçõesí 5-19, 6-13, 8-24, £

114/273 peso molecular ê de 3076,4? Daltons.

[305] Preparação de peptídeos HP

[308] Os peptídeos HP aqui descritos podem ser preparadas como abaixa, As estruturas de leitura, aberta (ORFs) dos peptídeos inseticidas são projetadas de tal forma que suas sequências de nucleotídeos sejam otimizadas para expressão específica de espécie. Mostrado abaixo é um exemplo específico de um processo para aumentar o rendimento da produção de peptídeo inseticida de sistemas de expressão de levedura pela adição de um dipeptídeo ao N-terminal do peptídeo inseticida. O dipeptídeo ê composto de um aminoácido não -polar e um aminoãcido polar. O aminoácido não polar pode ser selecionado de glicina, alanina, pro.lx.na, valina, leuoina, isoleucina, fenilalanína e metionina e glicina é o aminoãcido não polar preferido. O aminoácido polar pode ser selecionado de serina, treonina, cisteina, histidina, triptofano, tirosina, asparagina e glutamina e serina é o aminoácido polar preferido, No exemplo abaixo, o aminoácido não polar está no N-terminal do dipeptídeo e ele é glicina. No exemplo abaixo, o aminoãcido não polar está no C-terminal do dipeptídeo e ele é serina,

[3071 A orf de peptídeo inseticida é projetada para secreção de células de levedura de hospedeiro como a seguir: a ORF começa com uma sequência de peptídeo sinal seguida por sequência de dna que codifica um sítio de divagem Kex 2 (Lisina-Arginina) seguida pelo transgene de peptídeo inseticida com adição de códons glicina-serina no terminal 5’ e, fínalmente, termina com um códon de parada no terminal 3 ‘ . Todos estes elementos serão expressos em um peptídeo de fusão em células de levedura como uma única estrutura de leitura aberta, uma sequência sinal do fator a-combinação é mais frequentemente usada para facilitar o processamento metabólico dos peptídeos recombinantes inseticidas através da via de secreção endógena da levedura recombinante, isto é, o peptídeo de fusão expresso tipicamente entrará no Retículo Endoplasmático, em que a sequência sinal de fator a-combinação é removida por atividade de peptidase sinal, e, em seguida, o peptídeo pró-inseticida resultante será traficada para o aparelho de Golgi, no qual o dipeptídeo Lisina-Arginína mencionado acima é completamente removida par Kex 2 endoprotease, após o que o peptídeo inseticida hp maduro compreendendo o dipeptídeo gliciua-serina não nativo adicional em seu N-terminal é secretado para fora das células.

[308] Para intensificar o nível de expressão de peptídeo inseticida nas células de levedura recombinantes, os códons da ORF de peptídeo inseticida são geralmente otimizados para expressão na espécie de levedura hospedeira específica. Frequências de addons ocorrendo naturalmente observadas em. estruturas de leitura abertas endógenas de um determinado organismo hospedeiro não são necessariamente otimizadas para expressão de alta eficiência. Mais ainda, diferentes espécies de levedura (por exemplo, Kluyveromyces lactls, Píqhia pastoris, Eaccharomyces cerevísiae, etc.) têm diferentes códons ótimos para, expressão de alta eficiência. Daí, a otimização de códon deve ser considerada para a ORF de peptídeo incluindo os elementos de sequência que codificam a sequência sinal, o sítio de divagem Kex2 e os peptídeos inseticidas, uma vez que eles são inicialmente traduzidos como um peptídeo de fusão nas células de levedura recombinantes»

[309] Mtó de expressão de peptídeo otimizados em addons são, então, ligados em vetores de expressão adequados para expressão de levedura. Existem muitos vetores de expressão disponíveis para expressão de levedura, incluindo vetores epissomais e vetares íntegrativos, e eles são geralmente projetados para cepas específicas de levedura. Deve-se escolher cuidadosamente o vetor de expressão apropriado em vista do sistema de expressão de levedura específico o qual será utilizado para a produção de peptídeo, Aqui nóe usamos vetores integrativos os quais integrarão nos cromossomos das células de levedura transformadas e serão estáveis pelos ciclos de divisão e proliferação celular»

[3101 Os vetores de expressão geralmente contêm alguns elementos de E. coli para preparação de DNA em E. colí, por exemplo, origem de replicação de E» coli, marcador de seleção de antibióticos, etc. Os vetares também contêm uma matriz dos elementos de sequência necessários para expressão do transgene de interesse, por exemplo, promotores transericionais, terminadores, marcadores de seleção de levedura, sequências de DNA integrativas homólogas a DNA de levedura hospedeira, etc, Existem muitos promotores de levedura adequados disponíveis, incluindo promotores naturais e engenheirados» Em nossos esforços, promotores de levedura, tal aomo plAC4, pAOXl, pVPP, pADHl, pTEF, pGall, etc. foram usadas. Nós também usamos seguintes marcadores de seleção de levedura comumente usados; seleção de prototrofia de acetamida, seleção de resistência a zeocina, seleção de resistência a geneticina, seleção de resistência a nourseotricína, seleção de deficiência de uracila. Outros marcadores conhecidos por aqueles versados na técnica também poderíam ser usados< As sequências de DNA integrativas são homólogas a loci de DNA genómico de alvo na espécie de levedura transformada e tais sequências integrativas incluem pLAC4, 25S rDNA, pAOXl e TRP2, etc. Os locais de transgsnes peptídicas inseticidas podem ser adjacentes à sequência de DNA integrative (Vetores de inserção) ou estar dentro da sequência de DNA integrariva (vetores de substituição).

[311] Para obter mais cópias de ORF de peptídeo inseticida integradas nos cromossomos de levedura hospedeira, as vetores de expressão podem ser projetados e gerados para conter duas ou três cópias de cassete de expressão de peptídeo inseticida. Cada cópia do -cassete de expressão de peptídeo inseticida no vetor de expressão deve conter estruturas de expressão independentes e completas incluindo promotor, sequência sinal, sequência de divagem Kex2 e o transgene de peptídeo inseticida, terminador de transcrição de códon de parada.

[312] Os vetores de expressão de peptídeo são, então, transformados em células de levedura. Em primeiro lugar, os vetores de expressão são geralmente linear!zados por divagem de enzima de restrição específica para facilitar a integração cromossómica via recombinação homóloga. O vetor de expressão linear é, então, transformado em células de levedura por um método de transformação químico ou de eletroporação e integrado no locus de alvo do genoma de levedura por recombinação homóloga. A integração pode acontecer no mesmo locus cromossômico múltiplas vezes; por conseguinte, o genoma de uma célula de levedura transformada poda conter múltiplas cópias de transgenes de peptídeo inseticida. Os transformantes bem sucedidos podem ser identificados usando condições de crescimento que favorecem um marcador seletiva engenheirado no vetor da expressão e cointegrado nos cromossomos de levedura com cs transgenes de peptídeo inseticida; exemplas de tais marcadores incluem, mas

118/273 não estão limitados a, prototrofia de aeetamida, resistência a zeooina, resistência a geneticina, resistência a nourseotricína, e prototrofia de uracila.

[313J Devido à influência de fatores imprevisível e variáveis - tal como modificação epígenética de genes e de redes de genes, e variação no número de eventos de integração que ocorrem em células individuais em uma população sofrendo um procedimento de transformação - transformantes de levedura individuais de um dado processo de transformação diferirão em suas capacidades para produzir um peptídeo inseticida transgênico. Portanto, transformantes de levedura transportando as transgenes de peptídeo inseticida devem ser triados para cepas de alto rendimento. Dois métodos eficazes para tal rastreamento, cada qual dependente do crescimento de culturas em pequena escala dos transformantes para fornecer amostras de meio condicionado para análise subsequente, utilizam HPLC de fase reversa ou procedimentos de injeção de mosca doméstica para analisar amostras de meio condicionado dos transformantes.

[314] As culturas de transformantes são geralmente realizadas em tubos de cultura de polipropileno de fundo redondo de 14 mL com 5-10 mb de meio definido adicionado a cada tuba, ou em placas de cultura de poço profundo de 48 paços com 1-2 ml de meio definido adicionado a cada poço. O meio definido, não contenda extratos proteináceos brutos ou subprodutos , tais como extrato ou peptona de levedura, ê usado para as culturas reduzirem o fundo de proteína no meio condicionado colhido para as etapas posteriores de triagem. As culturas são realizadas à temperatura ótima, por exempla, 23,5 °C para K» lactis, durante 5-6 dias, até que a densidade celular máxima seja atingida. Os peptídeos inseticidas sãa agara produzidos dos transformantes e seerstados para fora das células para o meio de crescimento. Para preparar as amostras para a triagem, as células são removidas das culturas par centrifugaçãa e os sobrenadantes são coletados como o meio condicionado os quais são, então, limpos por filtração através de membrana de filtro de 0,22 μ® e, em seguida, preparadas para triagem de cepa de produção de peptídeo insecticide, alguns exemplos de tais métodos de triagem são descritos abaixo.

[315] Um dos métodos de triagem é triagem par HPLC de fase reversa (rpHPLC) de transformastes. Neste método de triagem, uma coluna analítica de HPLC com fase ligada de CIS é usada» Acetonitrile e ãgua são utilizadas como solventes de fase móvel e um detector de absorbâncía de UV ajustado para 220 nm é utilizada para a detecção de peptídeo. Quantidades apropriadas de amostras de meio condicionado são carregadas no sistema de rpHPLC e eluídas cam um gradiente linear de solventes de fase móvel. A área de pico correspondente do peptídeo inseticida no cromatógrafo de HPLC é utilizada para quantificar as concentrações de peptídeo inseticida no meio condicionado. Quantidades conhecidas de peptídeo inseticida puro são passadas pela mesma coluna de rpHPLC com o mesma protocolo de HPLC para confirmar o tempo de retenção do peptídeo e para produzir uma curva padrão de HPI»C de peptídeo para a -quantificação.

[316] Um segundo método de triagem é o ensaio de injeção de mosca doméstica. Peptídeo inseticida pode matar moscas domésticas quando injetado em doses medidas através da parede do corpo do tórax dorsal. A eficácia do peptídeo inseticida pode ser definida como a dose letal mediana do peptídeo (LD50) a qual provoca mortalidade de 50% das moscas domésticas injetadas. O peptídeo inseticida puro é normalmente

120/273 usado no ensaio de injeção de mosca doméstica para gerar uma curva padrão de dose-resposta a partir da qual um valor W50 pode ser determinado. Utilizando um valor LD50 da análise de uma curva padrão de dose-resposta do peptídeo inseticida puro em questão, a quantificação do peptídeo inseticida produzida por um transformants. de levedura pode, ser conseguida utilizando um ensaio de injeção de mosca doméstica realizado com diluições em série do meio condicionado correspondente.

[317] A triagem de cepa de produção de peptídeo inseticida pode identificar as cepas de leveduras de alto rendimento de centenas de transformantes. Estas cepas podem ser fermentadas em biorreator para atingir até 6 g/L de rendimento dos peptídeos inseticidas quando se utilizam meios de fermentação e condições de fermentação otimizadas. As taxas de produção mais altas podem estar em qualquer lugar de 20 a 400, 20 a 100, 20 a 200, 20 a 300, 40 a 100, 40 a 200, 40 a 300, 40 a 400, 60 a 100, 60 a 200, 60 a 300, 60 a 400, 80 a 100, 80 a 200, 80 a 300, 80 a 400, 100 a ISO, 100 a 200, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 250 a 350, 250 a 400, 300 a 350, 300 a 400% e 350 a

400 ou qualquer gama de qualquer valor fornecido· ou até mesmo maiores rendimentos do que podem ser conseguidos com um peptídeo antes da conversão usando os mesmos ou métodos de produção similares que foram utilizados para produzir o peptídeo antes da conversão.

[318] Qualquer uma das sequências da listagem de sequências e, tanto quanto sabemos qualquer CRIP, podaria todos ser usados para fazer peptídeos de alta produção semelhantes a cada um dos motifs ACTX da Aranha Teia de Funil das Montanhas

Azuis da. Austrália que chamamos de peptídeo descrito abaixo, ou o peptídeo AV3 t 2 da anêmona do mar tóxica, Anemone vírldis, que nós ensinamos e descrevemos nos exemplos abaixo utilizando os procedimentos aqui ensinados e o conhecimento de alguém versada na arte. Além disso, qualquer outro peptídeo CRIP adequado podería ser utilizado de uma maneira semelhante para produzir uma alta produção ou mais 2, ou seja, -peptídeo * 2.

[319] Exemplas da Peptídeos de Alta Produção

[320] Os Exemplos neste relatório descritivo não se destinam e não devem ser utilizados para limitai' a invenção, eles são fornecidos apenas para ilustrar* a invenção.

[321] Exemplo 1.

[322] Expressão de ü e U*2~ACTXHvla nativos em

Zluyveromyces 1actis [K> lactis).

[323] Peptídeos inseticidas a expressar:

U^2-ACTX-Hvla;

GSQYCVPVDQPCELNTQFCCDDATCTQERNENGHTVYECRA (SEQ ID NO: 5} ü~ACTX~Hvla nativo;

OYCVPVDQPCSUnQPCaJDATCTQERNENGirrVYYCRA (SEQ ID NO: 6)

[324] Para expressar os dais peptídeos inseticidas acima em K. lactís, o vetor de expressão, pKLACl, e a cepa de K. lactis, YCT306, foram usados os quais são disponíveis de New England Biolabs, Ipswich, MA, USA. O vetor pKLACl é um vetor de expressão integrative. Uma vez que os transgenes ü*2 e U-ACTXHvla nativo foram clonados em pKDACl e trans formados em ¥01:306, sua expressão foi controlada pelo promotor LAC4. Os transfozmantes resultantes produziram pré-propeptídeos compreendendo um peptídeo sinal de fator u-combínação, um sítio de divagem Kex2 e peptídeos inseticidas maduros. O peptídeo sinal de fator u~Combinação orienta os pré-propeptídeos a atravessarem a via de secreção endôgena e, finalmente, os peptídeos inseticidas maduros são crescimento.

liberados no meio de

[325] Otimização de códon para expressão de U*2-ACTX-

Hvla foi realizada em duas rodadas. Na primeira rodada, com base em algumas características comuns de sequências de DNA de alta expressão, 33 variantes da ORF de peptídeo, expressando um peptídeo sinal de fator <x-Combinação, um sítio de divagem Kex2 e o peptídeo U*2~ACTX-Hvla, foram projetadas e seus níveis de expressão foram avaliados na cepa YCT30S deK, lactis, resultando em um algoritmo de expressão de K. lactís inicial. Na 2’ rodada de otimização, mais cinco ORFs de peptídeo U4-2~ACTX-Hvla variante foram projetadas com base no algoritmo de expressão de K. lactis inicial para afinar ainda mais o algoritmo de expressão de K. lactís e identificada a melhor ORF para a expressão de peptídeo U*2-ACTX-Hvla em X. lactís. Esta sequência de DNA tem uma estrutura de leitura aberta codificando um peptídeo sinal de fator α-combinação, um sítio de divagem Kex2 e um peptídeo th-2-ACTX-Hvla. A sequência de DNA otimizada foi clonada no vetor pKLACl utilizando sítios de restrição Hind I.IX e Not I resultando no vetor de expressão U*2-ACTX-Hvla, pLBIOVS.

[326] Para permitir a integração de mais cópias do transgene otimizado U*2-ACTX-Hvla no genoma de X. lactis durante a transformação, a geração de um vetor de expressão Ü4-2-ACTXHvla contende duas cópias de cassete de expressão de IR2-ACTXHvia foi processada como a seguirc uma sequência de DNA de cassete de expressão U*2 -ACTX-Hvla intacto de 3.306 bp foi sintetizada a qual compreendeu um elemento promotor de LAC4 intacto, um elemento de ORF de peptídeo U*2-ACTX-Hvla otimizado em códon e um elemento term!nador pLAC4» Este cassete de expressão intacto foi, então, ligado no vetor FLB10V5 entre os

123/273 sítios de restrição Sal I e Κρη I, a jusante do terminador pLAC4 de FlíHlOVS, resultando no vetor de expressão U*2-ACTX-Hvla de duplo transgene<

[327] Para gerar um vetor de expressão u~ACTX~Hvla «ativo, o vetor pLBlOVS foi mutagenizado deletando os códons de glicina-serina no terminal 5’ da região de transgene υ*2«Α0ΓΧ“ Hvla utilizando um kit de mutagênese dirigido a sítio Stratagene. Esta mutagênese resultou em um novo vetor, pI>B12, contendo uma única cópia do cassete de expressão de ü-ACTX-Hvla nativo otimizado. Para gerar um vetor de expressão de U-ACTX~Hvla nativo de duplo transgene, um kit de mutagênese dirigido a sítio Stratagene foi utilizado de novo para remover os cddons de glicina-serina no terminal 5’ da região de transgene do V no transgene de cassete de expressão de ü*2-ACTX-HvXa de 3.306 bp sintetizado anteriormente, seguido por ligação para inserir o cassete de mutagenizado no vetor PLB12 entre, os sítios de restrição Sal I e Κρη X, resultando no plasmídeo, pLB12D, um vetor de expressão que compreende duas cópias intactas do cassete de expressão de U-ACTX-Hvla nativo otimizado em côdon.

[328] Os vetores de duplo transgene, pLBlóVSD e pLBXRD,

foram,	então, linearizados usando	endonucloase	de	restrição Sac
XX e q	uimicamente transformados em	cepa YCT306	de	K. laatís, de
acordo	com instruções fornecidas	com um Kit	de	Expressão de

Proteína de X. lactís. Os traneformantes resultantes cresceram em placa de âgar YCB suplementada com acetamida 5 mM a qual apenas os transformantes expressando acetamídase poderíam utilizar eficientemente como uma fonte de nitrogênio metabôlica.

[329] Para avaliações de rendimento de peptídeo inseticida, 316 colônias foram colhidas das placas de transformantes pLBlGVSD, e 40 colônias foram colhidas das placas de tx*ansformantes pLB12D, Inéculos das colônias foram cultivados am 6 mL do meio de K. .lact.is definido com 2% de glicerol pure adicionado como uma fonte de carbono. As culturas foram incubadas a 23,5*C, com agitação a 280 rpm, durante seis dias, em cujo ponto as densidades celulares nas culturas tinham atingido os seus níveis máximos como indicados por absorbância de luz a 600 nm (GD600). As células foram, então, removidas das culturas por centrífugação a 4.000 rpm por 10 minutas. Os sobrenadantes resultantes (meios condicionados) foram filtrados através de membranas de 0.2 pm. para análises de rendimento por HPLC.

[330] Para a avaliação de rendimento de peptídeo, as amostras de meio condicionado filtradas foram analisadas num sistema Agilent 1100 hplc equipado com uma coluna de KPLC analítica de fase reversa C18, de 4,5 x 100 mm, Onyx e um autoinjetor. Água de grau HPLC e acetonitrile, ambas contendo 0,1% de ácido trifluoracético, constituíram os dois solventes de fase móvel utilizados para as análises de HPLC. As ãreas de picos de ambos U nativo e U*2-AdX-Hvl foram medidas usando cromatógrafos de HPLC e, em seguida, utilizadas para calcular a concentração de peptídeo no meio condicionada a qual, em seguida, foi ainda normalizada para as correspondentes densidades celulares finais (como determinado por medições de OP600) como rendimento de peptídeo normalizado.

[331] Bioensaio de injeção de mosca doméstica foi utilizado para avaliar a atividade inseticida dos peptídeos. Os meios condicionados foram diluídos em série para gerar curvas de dose-resposta completas do bioensaio de injeção de mosca doméstica. Antes da injeção, mascas domésticas adultas (Musca domestica) foram imobilizadas com COs, e 12-18 mg de mascas domésticas foram selecionados para injeção. Um mícroaplicador, carregada com uma seringa de lem* e agulha de calibre 30, foi utilizado para injetar O.spL por moeoa de doses de amostras de meios condicionados diluídos em série em moscas domésticas através da parede do corpo do tórax dorsal. As moscas domésticas injetadas foram colocadas em recipientes fechados com papel de filtra úmida e furos de respiração nas tampas, e elas foram examinadas para classificação de mortalidade em 24 horas após injeção-

[332] Rendimentos normalizados foram calculadas. Rendimento de peptídeo significa concentração de peptídeo nos meios condicionados em unidades de mg/L. Mas os rendimentos de peptídeos nem sempre são suficientes para comparai- com precisão a taxa de produção de cepa. Cepas individuais podem ter diferentes taxas de crescimento, daí quando uma cultura é colhida, diferentes culturas podem variar na densidade de células. A cultura com uma alta densidade celular pode produzir uma concentração mais alta do peptídeo nos meios, muito embora a taxa de produção de peptídeo da cepa seja mais baixa do que outra aepa a qual tem uma taxa de produção mais alta. Assim, o termo rendimento normalizado” é criado dividindo o rendimento de peptídeo com a densidade celular na. cultura correspondente e isto permite uma melhor comparação da taxa de produção de peptídeo entre cepas. A densidade de células é representada pela absorbãncia de luz a 600 nm com uma unidade de ”A“ (unidade de Absorbãncía).

[333] Tabela 1, Fig, 12 e Fig. 13 sumarizam as distribuições de rendimento de peptídeo normalizado de U*2- e U~ ACTX-Hvla nativo das cepas de K. lactis. O rendimento de peptídeo normalizado U+2-ACTX-Hvla mediado global das cepas de K laceis foi de 4,06 i 3,05 mg/L.A, o que fai estatisticamente

126/273 significativamente mais alto que o rendimento de peptídeo normalizado ü-ACTX-Hvla nativo mediado, 2,73 ± 1,25 mg/L.A, pelo teste t de Student ao nível de confiança de 99%. O rendimento de peptídeo normalizado mediano das cepas K. lactis de Ü*2-ACTX~ Hvla foi de 9,36 mg /L.A, o que foi quase três vezes mais alto que o rendimento mediano de cepas de U-ACTX-Hvla nativo (3,35 mg/L.A). As cepas de expressão de peptídeo U*2-ACTX-Hvla tinham razões muito mais altas das contagens de cepa a alto nível de rendimento do que as cepas de U-ACTX-Hvla nativo. Todos estes resultados indicaram que a adição do dipeptídeo glicina-serina ao N terminal do peptídeo U~ACTX~Hvla contribuí para melhoria significativa do rendimento previsto para os transformantes de levedura que expressam este peptídeo,

[334] Tabela 1 mostra uma comparação de rendimentos de peptídeo de cepas de K. lactis.

Tabela 1. Comparação de Rendimento de Peptídeo d* 2 e d··

ACTX-Hvla nativo mSmsm ------ W-®---W-SK «orfjsa&ád» <fe««£8 m fetal Msdére . ímfefel M Msér-s

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[335] Fíg. 12 mostra os histogramas das distribuições de rendimentos de peptídeo normalizadas para as cepas U*2 e U nativo. A escala X mostra a faixa do rendimento de peptídeo normalizado. A escala Y à esquerda mostra a frequência das cepas produtoras de U+2 na faixa específica do rendimento normalizado, e a escala Y ã direita mostra a frequência das cepas produtoras de U nativo na faixa específica do rendimento normalizado. As barras pretas representam a distribuição de rendimento de U+2 e as barras cinzas representam a distribuição de t-endímento de U nativo. For exemplo, as primeiras barras pretas dizem que cerca de 9,03 (3%) das cepas produtoras de U*2 total têm rendimentos normalizados entre 0 e 0,5 mg/L.A. As contagens de cepas são diferentes entre as cepas nativa e *2 porque 316 cepas para U*2 foram triadas e 40 cepas para o peptídeo nativa foram tríadas.

[336] Fig. 13 mostra a distribuição dos rendimentos de peptídeo de e U-ACTX-Hvla nativo produzidos das cepas de K. lactis. Os dados 0+2 são mostrados em preto e os dados de U nativo estão em cinza. 0 eixo x mostra o rendimento em miligramas por litre e a escala y mostra a fração de produção de U*2 ou U nativa total de cepasK. lactis . 0 rendimento das cepas Ue2 e o número de cepas U*2 disponíveis que podem produzir* rendimentos altos são muito mais altos para as cepas U+2 em comparação com as cepas de U nativo.

[337] Normalmente se podería esperar que a execução de alterações em uma sequência peptídica que melhora dramaticamente o seu rendimento podería afetar sua toxicidade. Surpreendentsmente não é isso que acontece com os dipeptídeos desta divulgação. Nossos dados indicam que a adição do dipeptideo e, especialmente o dipeptideo glicina-serina, ao N~ terminal do peptídeo U-ACTX»Hvla, não abaixa a eficácia das atividades inseticidas do peptídeo. Fig. 14 mostra duas curvas de dose-resposta para bioensaios de injeção de mosca doméstica realizados com as amostras de meio condicionado nativo e U*2~ ACTX-Hvla. 0 ü-«-2-ACTX-Hvla tem uma dose letal mediana (WS O) de 76,8 pmol/g, o que é consistente com a WSO de U-ACTX-Hvla, 77,6 pmol/g.

[338]

Exemplo 2 x

[338] .Rendimentos de peptídeo de transformantes da levedura, Pichia pastoris (P. pastoris.), expressando ou th-2~

ACTX-Hvla ou U-’ACTK-Hvla foram estudados

[340] Dois vetores de P. pastoris, pJUGoKR e pJVEoKR, foram usado para a expressão de peptídeo de U*2-ACTX-hvla ou U-

ACTX-Hvla nativo em P. pastoris. pJUGaKR e disponíveis de Biogrammatics, Carlsbad, California, pJüZcKR são

USA. Ambos os vetores são vetores íntegrativos e usam o promotor de uracila fosforribosiltransferase {pUPP} para aumentar a expressão de transgene heterõlogo. A única diferença entre os vetores é que pJUGaKR proporciona resistência a G418 para a levedura hospedeira, enquanto pJUEaKR proporciona resistência a Beocin.

[341] Pares de oligonucleotídeos complementares que codificam o U-ACTX-Hvla nativo U*2-ACTX-Hvla respect .ivamente, foram projetados e sintetizados para subclonagem nos dois vetores de expressão de levedura. Reações de hibridização foram realizadas misturando os oligonucleotídeos complementares correspondentes até uma concentração final de 20 μΜ em NaCl 30 mM, Tris-Cl 10 mM (todas concentrações finais), pH 8, e, então, incubação a 95«C por 20 min., seguida por uma incubação de 9 horas começando em 92®C e terminando a 17°C, com 3*C de quedas de temperatura a cada 20 min. As reações de hibridização resultaram em dois fragmentos de DNA codificando peptídeos U*2~ACTX-Hvla e U-ACTX-Hvla nativo, respectivamente. Os dois vetores de P. pastoris foram digeridos com enzimas de restrição Bsal~HF, e os produtos de fita dupla das reações de Uização foram, em seguida, subclonados nos vetores de P. pastoris linear!zados utilizando procedimentos padrão. Após a verificação das sequências dos quatro subclones, alíquotas de plasmídeo foram transformadas por

129/273 eletroporação na cepa da P. pastoris, BgOB. A levedura transformada resultante, selecionada com base na resistência a Xeocin ou G418 conferida por elementos engenheirados nos vetores pJUEcKR e pJUGaKR, respectivamente, foi cultivada e triada como descrito abaixo» Uma vez que nenhuma cepa de transformante tinha mais do que um. marcador de resistência a antibiótico, e uma vez que os procedimentos de transformação foram executados da mesma maneira para células de levedura transformadas com o transgene U*2-ACTX-Hvla. que para aquelas transformada com o transgene UACTX-Hvla nativo, é razoável supor que as distribuições de número de cópias do transgene era comparável para as duas populações de transformantes sendo comparadas abaixo.

[342] Receitas para meios estoques utilizados para as culturas de P. pastoris são descritas a seguir:

Receita de meio MSM g/.L de citrato de sódio di-hidratado g/L de sulfato de cálcio d i -'hidratado (0,79 g/h de. sulfato de cálcio anidro)

42,9g/L de fosfato de potâssio monobásico

S,17g/L de sultado de amônio

14,33 g/h de sulfato de potássio

11,7 g/L de sulfato ds magnésio hepta-hidratado mh/t- de solução de sal de traço de PTM1

0,4 ppm de biotina (de estoque 5O0X, 200 ppm)

1-2% de glicerol puro ou outra forne de carbono

Solução de sais de traço de RTM1:

Sulfato cúprico-SHxO 8,0 g

Iodeto de sódio 0,08 g

Sulfato de manganês-HjO 3,0 g

Molibdato de sódio-2H_s0 0,2 g

Ácido Bôrico 0,02 g

Cloreto de cobalto 0,5 g

Cloreto de zinco 20,0 g

Sulfato terroso-7H₂O 65,0 g

Biotina 0,2 g

Ácido Sulfdrico 5,0 ml

Adicionar Água até um volume final de 1 litro

[343] Placas de poços profundos de 48 poços, vedadas após inoculação com fita estéril permeável a ar, foram usadas para cultivar os transformantes de peptídeo inseticida P. pastoris. Colônias nas placas de transformastes de P. pastoris foram colhidas e inoculadas nas placas de poços profundos com imL de meio por poço, o qual era composto de MSM * 0, 2% de PTM 1 + biotina (500X diluído de estoque de 200 ppm) «· 1% de glicerol (puro). As placas inoculadas foram crescidas 5 dias a 23,5°C, com agitação a 220 rpm num incubador-agitador refrigerado. 100 pL de glicerol 5% foram adicionados a cada poço das placas em 2,

3, e 4 dias após	inoculação	, Do dia 5 ap(	inoc^:		ão, o meio
condicionado foi ;	colhido uor X·	centrifugaçãa	a 3700	rptn	durante 15
minutos, seguido	nor filtras	ão utilizando	placa	de	filtro com
membrana de 0,22	μΜ. Meio	de filtro arm	azenado	a	-20 «C para

futuras aná1ises,

[344] Alíquotas de 0,3 mb de meio de p. pastoris condicionado preparadas como descrito acima, foram analisadas usando rpHPLC descrita no EXEMPLO 1 para determinar as concentrações de peptídeo U-ACTX-Hvla nativo ou U4-2~ACTX~Hvla presente no meio. Os resultados desta análise estão resumidos na Tabela 2, Fig« 15 e Fig. 16. Os rendimentos médios de peptídeos com uma média e desvio padrão comuns são de 67,0 ± 27,9 mg/L para as cepas P. pastoris de ϋ^-2-ACTX-Hvla e 42,9 ± 18,3 mg/L para as cepas de ü-ACTX-Hvia nativo. Um teste t de student indicou que a probabilidade dessas diferentes distribuições de rendimento ê muito inferior a 1%. O rendimento mediano das cepas de ü*2~ACTX~ Hvia foi de 79,0 .mg /1, muito mais alto que aquele das cepas de U-ACTX-Hvla nativo (44,7 mg/L) . Ê observado que as cepas de 0+2ACTX-Hvla tinham razões muito mais altas das contagens de cepa a alto nível de rendimento do que as cepas de U-ACTX-Hvla nativo. Todos estes resultados suportam a conclusão de que o dipeptídeo de glicina-serina extra no N-terminal do u+S-ACTX-Hvla melhorou significativamente a capacidade de transformantes de levedura produzirem este peptídeo e secretarem o mesmo no meio condicionado.

[345] Tabela 2 mostra uma comparação de rendimentos de peptídeo de cepas P. pastoris .

Tabela 2, Comparação de Rendimento de Peptídeo ü*2 e UACTX-Hvla nativo ««sstab . &W8 waít&í Gfems Meáís» pmwl GUísí ífete

> 33 wsíã.	«S		$?.<? :à ? ? S	J3_:v	aa	«í.$ « ÍS.S	44.7
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[348] EXEMPLO 3,

[347] Expressão de uma das toxinas de. anêmona do mar tipo 3 descobertas de Anemone viridis, Av3 e Av3v2 nativo na cepa de levedua Kluyveromyoes lactis.

[345] Peptídeos inseticidas a expressar:

Av3 4-2 í

GSRSCCFCYWGGCWGQNOTEGCSGPKV' (SEQ IQ NO. 29}

Av3 Nativo:

RSCCPCYNGGCPNGaNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NQ. 30)

[34.9] Para expressar os dois peptídeos CRIB não XCK acima em Kluyveromyces lactis, o vetor pKLACl e a cepa Kluyveromyces lactís, YCT306, foram utilizados oomo no exemplo 1.

[330] A ORF de peptídeo Av3 e AV3*2 que codifica aMF;cKex2 sítio de clivagem:Av3 (ou Av3*2) foi côdon otimizada usando o algoritmo de expressão de X. Jaotis previamente determinado.

[351] A sequência de ORF de expressão de Av3*2 otimizada ê a seguinte:

AAGCTTGAAAAAAATGAAATTTTCCACTATTTTAGCAGCATCTACAGCTrTAATCAGTG

TTGTC^TGGCTGCACCTGÍGAGTACCGAAACAGATATAGACGACCTTCCAATCTCmTTCCAGA

AGAGGCTTrGATAGGATrCATCGATTTGACTGGTGATGAAGTTTCATTGTTACCAGTGAATAAT

GGTACCCATACTGGTATTTTGTTCCTAAACACCACAATTGCTGAAGCTGCTmGCAGATAAGG ATGATTTGGAGAAAAGAGGTTCTAGATCATGCTGCCOTGTrACTGGGGTGGTTGTCCATGGGG ACAAAACTGTTATCCTGAAGGATGTTCTGGTCCAAAGGTATGAGCGGCCGC (SEQ ID NO. 31)

Beta sequência de DNA. otimizada fol clonada no vetor pKLACl utilizando sítios de restrição Hind III e Not I resultando no vetor de expressão de Av3+2, pLBlOz.

[352] A sequência de ORF de expressão de Av3 nativa otimizada é a seguinte;

AAGCTFGAAAAAAATGAAATTTTCCAC^TCTrAGCTGa^GTACTGCTCTrATTrCTG TTGTGATGGCTGCTCCAGTATCTACCGAAACAGATATC^ATC^TTTGCCAATTTCAGTCCCIXM. AGAGGCACTAATCGGATTCATTGACTTAACCGGTGATGAAGTGAGTTTGTTGCCAGTTAACAAC GGTACTCATACAGGTATATrGTTTTTGAATACCACTATAGCTGAAGCAGCATTCGCTGATAAAG AÍGACTTAGAAAAGAGAAGATCATGCTGCCCTTGTTACTG^GTGGTÍGTCCATGGGGTCAAAA TIGTTATCCAGAGaSTTGTTCTGGACCTAAGGTTTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO. 32)

Esta sequência de DNA otimizada foi clonada no vetor pKLACl utilizando sítios de restrição Hind IXI e Not I resultando no vetor de expressão de .Av3, pLB103.

[353] Os vetores de expressão pLBIOS e pLB103 foram, então, linear!zados usando endonuclease de restrição Sec II e transformados em cepa YCT306 de K< lactís, usando o método de transformação de eletroporação. Os transformantes resultantes cresceram em placa de ãgar ycb suplementada com acetamida 5 mH a qual apenas os transformantes expressando acetamidase poderíam utilizar eficientemente como uma fonte de nitrogênio metabólica.

[354] Para avaliações de rendimento de peptídeo inseticida, 48 colônias de transformantes pLB102 e 48 colônias de transformantes pLB103 foram apanhadas e inoculadas 2,2 mL da melo de K. laotís definido com 2% de sorbitol adicionado como uma fonte de carbono em placas de poço profunda de 48 poços aom 5 ml de capacidade de volume em cada poço. As culturas foram, processadas a 23,5*C, com agitação a 280 rpm, durante seis dias, quando as densidades celulares nas culturas foram determinadas por absorbância de luz a 600 nm (OD600) . As células foram, então, removidas das culturas por centrifugação a 4,000 rpm por 10 minutas. Os sobrenadantes resultantes {meios condicionados) foram filtrados através de membranas de 0.2 pm para análises de rendimento por hplc.

(355] Para a avaliação de rendimento de peptídeo, as amostras de meio condicionado filtradas foram analisadas num sistema Agilent 1100 HPLC equipado com uma coluna de KPLC analítica de fase reversa C18, de 4,5 x 100 mm, Onyx e um autoinjetor. Âgua de grau HPLC a acetonitrila, ambas contendo 0,1% de ácido trifluoracético, constituíram os dois solventes de fase móvel utilizados para as análises de HPI»C. As áreas de picos de Av 3 ou Av3*2 nativos nos cromatógrafos de HPLC resultantes foram utilizadas como indicação da concent.ração ds peptídeo no meio condicionada a qual, em seguida, foi ainda normalizada para as correspondentes densidades celulares finais (coma determinado por medições de 623600) como rendimento de peptídeo normal!zado.

[356] A Tabela 3, .Figura 17 e Figura 18 sumarizam as distribuições de rendimento de peptídeo normalizado de Av3*2 e Av3 nativo das cepas de K. lactis . 0 rendimento de peptídeo normalizado ê representado pela área de pico w de peptídeo no cromatógrafo HPLC dividida pela densidade celular correspondente (representada pela ODSOO) no final da cultura de células. 0 rendimento de peptídeo normalizado mediado global das cepas de Av3*2 foi de 117,5 ± 50,1 mAu.s/A, o que foi estatisticamente signif i cat ivamente mais alto que aquele de Av3 nativo que. foi de 29,8 ± 16,1 mAu.s/A, pelo teste t de Student ao nível de confiança de 99% > O rendimento de peptídeo normalizado mediano das cepas K. lactis de Av3*2 foi de 186,7 mAu.s/A_f o que foi mais de trés vezes mais- alto que aquele das cepas de Av3 (31.7 mAu.s/A) . As cepas de expressão de Av3*2 tinham razões muito mais altas das contagens de cepa a alto nível de rendimento do que as cepas de Av3 nativo (tabela 3) . E, como mostrado na Figura 18, em geral, a qualquer percentil de rendimento peptídeo, as cepas de AV3 * 2 tinham rendimento mais alto do que as cepas de Av3 nativo. Todos estes resultados indicaram que a adição do dipeptídeo glicina-serina ao N terminal do peptídeo Av3 contribui para melhoria significativa do rendimento de peptídeo de transformantes de levedura que expressam este peptídeo.

Tabela 3. Comparação de Rendimento de Peptídeo Av3*2 e Av3 nativo

............................. noemstoã?	........................................................................................................ AvM jpLTOZYCT, btss 4S cej>ss\| Mm	r AiSSS	ins® ^8raW	MèíÍÍS sms
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[357] Culturas e Insetos

[358] Culturas específicas e insetos que podem ser controlados por estes métodos incluem o seguinte:

[359] A presente invenção pode ser utilizada para transformação de qualquer espécie de planta incluindo, mas não limitada a, monocotiledôneas e dicotiledõneas. Culturas para as quais uma abordagem transgênica ou PEP seria uma abordagem especificamente útil incluem, mas não estão limitadas a: alfafa, algodão, tomate, maís, trigo, milho, milho doce, luzerna, soja, sorgo, ervilha, linhaça, cértamo, colza, colza de óleo, arroz, soja, cevada, girassol, árvores (incluindo coníferas e decídua), flores (incluindo aquelas cultivadas comercialmente e em estufas), lupines do campo, painço amarelo, cana-de-açúcar, batatas, tomates, tabaco, crucíferas, pimentão, beterraba, cevada e colza de óleo, Brassica sp., centeio, milheto, amendoim batata-doce, cassaya, café, coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, chã, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, mamão, caju, macadtmia, amêndoas, aveia, legumes, plantas ornamentais, e coníferas.

[360] «Pragas” incluem, mas

não estão limitadas at

insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes.

[361] Pragas de insetos incluem, mas não estão limitadas a, insetos selecionados das ordens de Coleoptera,

Diptera, Hymenóptera, Lepidoptera,

Mal lophaga, Homoptera .<

Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera

Anqplura, Sichonaotera> Trichontera

e semelhantes< Mais

particularmente, pragas de insetos incluem Coleoptera, Lepídoptera e Diptera.

[362] Insetos de importância	agrícola, domés t i ca e/ ou
médica/vetet'inária adequados para	tratamento com os
polípeptídeos inseticidas incluem, ma	.s não estão limitados a,

membros das seguintes classes e ordens:

[383] A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. A subordem Adephaga inclui as superfamílías Caraboidea e Gyrincidea. A Subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoídea, Byrrhoidea,

Cucujoidea,

Scstricri-oissâ,

Curculionoidea.

Neloidea, Morde1loidea, Tenebrí onoidea,

Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea e A superfamília Caraboidea inclui as famílias

Cicíndelidae, Carabidae a Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A supexfamílía Staphylinoidea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae. A superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e bampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae A superfamília Elateroidea incluí as famílias Elateridae and Buprestidae. A superfamília Cucuioidea inclui a família

Coccinellidae. A superfamilia Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamilia Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae > A superfamilia Scarabaeoídea incluí as famílias Passaiidae e Scarabaeidae. A superfamilia Cerambycoidea inclui a familia Cerambycidae< A superfamilia Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculicnidae e Scolvtidae.

* .......

[364]	Exemplos de	Coleopters, i nc luem >	mas	não estão
limitados a:	o gorgulho	da vagem Americano	Acan >	rhoseelides
obtectus, o	besouro-da-	folha Agelastica	alni,	besouros

bioluminescences (Agriotes lineatus, Agriotes obscuras, Agriotes .binder), o besouro do grão Ahasvcrus advena, o schafer do verão AmphimaiIon solstitialís, o besouro de mobilia Anobium punctatum Anthonomus spp. (gorgulhos), o besouro mangold Pygmy Atomaria linearis, besouros de carpete (Anthrenus spp,.. Attagenus spp.), o gorgulho do feijão-fradinho Callosobrucbus maculates, o besouro de fruta frita carpophilus hesjipterus, o gorgulho seedpod de- repolho Ceutorhyuchus assimilis, gorgulho do caule de inverno da colza Ceutorhyncbus pi eftarsis, larvas arame Conoderus vespertinas e Conoderus fall!, gorgulho da banana Cosmopolites sordidus, larva da grama da Nova Zelândia Castelytra zealandica, besouro-de-junho Cotinis nítida, gorgulho do caule do girassol Cylindrocopturus adspersus, besouro de despensa Permeates lardarius, lagartas da raiz do milha Pi abro t X ca vi rgi f e ra, Di abro t i ca vi rgi fe ra vi rgi fora, e Diabrotica barber!, besouro do feijão mexicano Bpiiachna varivestie, teredo de casa velha Hylotropos bag'ulus, gorgulho lucerne Hypera postiaa, besouro aranha brilhoso Gibbium psylloides, besouro-do-cigarro basioderma serricorne, bescuro da batata do Colorado Lsptinotarsa decemlinsata, besouros Lyctus

138/273 (Xyct'us spp.), besouro do pólen Meligethes aeneus, cockshafer comum Melolontha meldontha, besouro aranha americano Medium americanum, besouro aranha de ouro Kiptus hololeucus, besouros dos grãos Oryzsephfius surinamensis e óryzaephilus mercator, gorgulho da videira preta Otiorhynchus sulcatus, besouro da mostarda Phaedon cochleariae, besouro da pulga crucifez* Phyllotreta cruciferae, besouro da pulga listrado Phyllotreta striolata, besouro da pulga do caule do repolho Psylliodes chzysocephala, Ptínus spp. (besouros aranhas), teredo de menos grãos Rhisopertha dominica, besouro da ervilha e do feijão Bitona Üneatus, besouros do arroz e celeiro Gitophilus oryzae e Bítophilus granaries, gorgulho da semente do girassol vermelho Smicronyx fulvus, besouro de drogaria Btegobium paniceum, besouro da lagarta refeição amarela Tenebrio molitor, besouros de farinha Tribolium castaneum e Tribolium oonfusum, besouros de armário (Trag<xie.rma spp.), e o besouro-do-girassol Eygogramma exclamation^!s<

[365j Exemplos de Dermaptera (tesourinhas) incluem, mas não estão limitados a: a tesourinha Européia Forficula auricularfa, e a tesourinha listrada Labidura riparia.

[366] Exemplos de siotvontera incluem, mas não estão limitados a: a barata oriental Elatta or.ienta.lis, a barata alemã

Blatella germanica, a barata da Madeira Laucophaea maderae, a barata-americana Periplaneta americana, e a barata marram esfumaçado Periplaneta fuliginosa.

[367] Exemplos de piplonpda incluem, mas não se limitam a: a centopeia-serpente-manchada Bianiuius guttulatus., a centopeia Brachydesmus superus, e centopeia de estufa oxidus gracilis.

[368]

A ordem Diptera inclui as Subordens Nematocera,

139/273

Brachycera, e Cyclorrhapha. A subordem Nematocera inclui as .famílias Tipulidae, Fsychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, e Ceoidomyiidae. A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, e Dolichopodidae. A subordem Cyclerrhapha inclui as Divisões Aschiza e Aschiza. A divisão Aschiza inclui as famílias Fhoridae, Syrphidae, e Conopidae. A divisão Aschiza inclui as Seções Acalyptratae e Calyptratae. A seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, e Drosophilidae. A seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Museidae, Calliphoridae, e Sarcophagi.dae.

[3591 Exemplos de Diptera incluem, mas não se limitam at mosca doméstica (Musca domestica), mosca tumbu africana (Cordylobia acthropophaga,⁵., mosquitos mordedores iOilicoides spp.), piolho da abelha (Braula spp.), mosca da beterraba Psgomyia betae, moscas pretas (Chephia spp., Eusimulium spp., Simulium spp.), moscas de berne (Cbterebra spp., Gastrophilus spp., Oestrus spp.), moscas de guindaste (Tipula spp.), moscas dos olhos (Hippelates spp»), moscas varejeiras i'Oaillphura spp., Fannia spp., Hermstia spp., Aucilla spp., Musca spp., Muscina spp., Phaenicia epp. > Phormía spp.), moscas varejeiras (Sarcophaga spp., Nohlfshrtia spp.); mosca borboleta Oscine!la frit, moscas de fruta iDacus spp.., Drosophila sppJ, moscas da cabeça [Hydrotea spp.), mosca-de~hesse Mayetlola destructor, moscas dos chifres e búfalo (Maematobia spp.), moscas do cavalo e veado (Chrysopc spp., Haematopota spp., Tabanus spp.), moscas do piolho (’l/.ipcptena spp.,- Lynch!a spp., e Pseudolyncbia spp.), moscas do mediterrâneo (Ceratites spp.), mosquitos (Aedes spp., Anopheles spp., Calex spp., Psorpphora spp.), moscas de areia ('Phlebotomus spp., Lutzomyla -sppj, moscas-da-bicheira (Chtysomya bezziana e Ccchliomyia hmisiwrax), moscas dos ovinos (Meiophagus spp»); moscas do estábulo (Stomxys spp.), moscas tsetse (Glossina spp.), e moscas warble (Hypoderma spp.).

[370] Exemplos de Isontera (térmite) incluem, mas não se limitam a: espécies das famílias Hodotennitidae, Kalotermit idae, Mastotermitidae, Rhino te.nnitid.ae , Serritermitidae , Termitidae, Termopsidae

[371] Exemplos de Heteroptera incluem, mas não se limitam a: percevejos da cama Cimex lectularius, manchador-doalgodão bysdercus intermedies, a praga Sunn Eurygaster integriceps, percevejo da planta maculada Lygus lineolaris, percevejo fedorento verde Nezara antennata, percevejo fedorento verde do sul ifezara viridula, e os percevejos triatoma Panstrogylus megistus, Ehodnius eouadoriensin, Rhadnies pallsscans, Rhodníes prolixas, Rhodnius robustes, Triatoma dimidiata, Triatoma infsstans, e Triatoma sórdida.

[372] Exemplos de Howptera incluem, mas não se limitam a: cochonilha pinta vermelha da Califórnia Aonidieila aurantii, afídeo do feijão preto Aphis fabae, afídeo do algodão ou melão Aphis gossypii, afídeo da maçã verde Aphis pomi, mosca branca espinhosa dos citricos Alsurosanthus spiniferes, cochonilha de oleandro Aspidiotes hederae, mosca branca da batata doce Bemesia tabaci, afídeo do repolho Brevicorjme brassicae, psila da pereira Cacopsylla pyricola, afídeo da groselha Cryptomyzus rihis, filoxera da uva baktulosphaira vitifbliae, psila dos cítricos Diaphorina citri, gafanhoto da folha da batata Empoasca fabae, gafanhoto do feijão Etopoasca solana, gafanhoto da videira Empoasca vitis, afídeo da lã Eriosoma lanigerum, cochonilha de fruta euroneia Eeleca&ium corai, afídeo da oluma farinácea

141/273

Hyalopterus arundinis, cigarra marram pequena Xaodelphax striatellus, afideo da batata Macrosiphum euphorbias, afídeo do pêssego verde Myxus pérsicas, gafanhoto do arroz verde Nephctettix cínticeps., cigarra marrom Nilaparvata iugens, afideos formadores de galha (Pemphigus spp.), afídeo do lúpulo Phorodon humuli, afídeo bird-cherry Ehopalosiphum padi,· cochonílha ρχ-eta Náissstia oleas, percevejo verde Echizaphis graminum, afideo do grão Eitobion avenae, e mosca branca de estufa Trí aleurodes vaporariorum.

[373] Exemplos de Isopoda incluem, mas não se limitam a: tatuzinho comum .Axrsadíllidíum vulgars e o piolho da madeira comum Oniscus aseilus.

[374] A ordem Lepídoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, hycaenidae, Eymphalxdae, Danaidae, Eatyridae, Hesperiídae, Sphingidae, Satumiidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, e Timidae.

[375] Exemplas de Lepidoptera incluem, mas n<o se limitam a: Adoxophyes orana (mariposa-tortrix-de-f'ruta-de-verão), Agrobis ipsolon (lagarta preta) , Arohips podana (mariposa tortrix de árvore frutífera), Bucaulatrix pyrívorella (leafminer da pera), Bucculatrix thurherialla (perfurador de folha de algodão), Bupalus piníarius (verme do pinheiro), Carpocapsa pomonslia (lagarta), Chilo suppressalis (teredo do arroz listrado.), chorístoneura fumíferana (lagarta picea oriental), Cochylis hospes (mariposa do girassol)_f Píatraea grandiose!Ia (teredo do milho do sudoete), Earls insulana (lagarta egípcia), Euphestía kuehníella (mariposa da farinha do mediterrâneo), Eupoecilia ambiguella (mariposa da uva europsia), Euproctís chrysorrhoea (mariposa da cauda marrom), Euprootís subflax^a (mariposa tussock oriental tussock), Galleria mellonelia (mariposa da cera maior)_f Mslicoverpa armígera (lagarta do algodão), Hslicoverpa zea (lagarta, do algodão), Meliothis virescens (lagarta do tabaco), Hofmannqphila pseudopretelia (mariposa doméstica marrom), Homeosoma electellum (mariposa do girassol), Humona magnanima (mariposa tortrix da árvore do chá oriental), Lithocoíletís blancardella (leafminer lentiforme manchado), Lymantria díspar (mariposa-cigana), Malacoscma .neustria (lagarta da barraca), Mamestra brassicae (lagarta de braços do repolho), Mamsstra confígurata (lagarta de braços Bertha), as lagartas de chifre Manduca sexta e Manuduca quínquemaculata, Cpercphtera brumata (mariposa do inverno), Ostrínia nubilalís (teredo do milho europeu), Panelis flammea (mariposa do pinheiro), Pectinophora gossypiella (lagarta rosa), Pbyilocnistis citrelia (leafminer dos oi'tricôs), Pieris .brassicas (borboleta branca do repolho), Plutelia xyiostella (mariposa de dorso diamante), Rachiplusia ni (lagarta da soja), Spílosoma virgínica (mariposa amarela), Gpodoptera exígua (lagarta de braços da beterraba), .Spodoptera frugíperda (lagarta de braços do outono), Jpodoptera littora!is (lagarta da folha do algodão), .Spodoptera li cura (lagarta comum), Gpodoptera praefíca (lagarta de braços de listras amarelas), sylepta. derogate (rolo de folha de algodão), Tíneola bisseliiella (mariposa de roupas de trama), Tineola pellionella (cmariposa de roupas), Tcrtríx ví ridana (rolo de folha de carvalho europeu.), Trichoplusía ni (lagarta do repolho), e rponomauta padella (mariposa, ermine pequena).

[376] Exemolos de Or thontera incluem, mas não se limitam a: grilo comum áaheta domestíous, tree gafanhoto (Auacrídium spp.), gafanhoto migratório Locusta migratória, gafanhoto de duas listras Malanoplus Bivíttatus, gafanhoto

		143/
diferencial	Me.1 anopl us	χΛ 0		gafanhoto	das patas
vermelhas	Melanoplus	fém ur r ubrum,	gafanhoto	migratório
Melanoplus	sangudnipes,	grilo	toupeira	do norte	Meoaur t i .11 a

hexadectyla, gafanhoto vermelho No-madacris septemfascíata, grilo toupeira de asa curta Scapteriscus abbreviatus, grilo toupeira do sul Boapteriscus borellid, grilo toupeira trigueiro Scapteriscus vícinus, e gafanhoto do deserto schistocerca gregaría.

[377] Exemplos de fhthiraptera incluem, mas não se limitam a: piolho mordedor do gado Bovicola bovis, piolhos picadoras (Damalinia spp.}» piolho do gato Fellcola subrostrata, piolho do gado de nariz curto Hacmatopínus eloystemus, piolho tail-switch Haematopínus guadriperiussus, piolho suíno Haematopinus suis, piolho da face Líncgnathus ovíllus, piolho do pé Ünognathus pedalis, piolho sugador do cão Ldnognathus setosus, piolho do galho de nariz longo Idnognathus vítulí, piolho do corpo da galinha Menacanthus stramineus,· piolho das aves Menopon gallinae, piolho do corpo humano Pediculus humanus, piolho público Phthirus pubds, piolho do gado azul pequena Folsnopairea capíllatus, e piolho mordedor do cão Trichodectes canxs.

[378] Exemplos de Psocoptera incluem, mas não se limitam a: piolhos dos livros Liposcelis bostrychophila, biposcelís decolor, xdposcelís entomophila, e Trogium pulsatorium.

[379] Exemplos de S iphonap t e r a incluem, mas não se limitam a: pulga dos pássaros Ceratophyllus gallinae, pulga da cão Ctenuoephalides canis, pulga do gato Ctenocephalddes fells, pulga humana Pulex irritans, e pulga do rato oriental Xenopsyila cheopís.

144

[380] Exemplos de gymphyla incluem, mas não se limitam at sinfilia de jardim Bcutfgereiia immaculate.

[381] Exemplos de Thysanura incluem, mas não se limitam a; peixinho de prata cinza Ctenolepisma long!caudata, peixinho de prata de quatro linhas Ctendepisma quadriserfata, peixinho de prata comum Lepiama saccharins, e a traça Thennobia domestica;

[382] Exemplos de Thysanoptera incluem, mas não se limitam a: tripes do tabaco Franklin! e 1.1 a .fusca, tripes das flores Frank.linielia intensa, tripes das floras do oeste Franklíníella occidentalis, tripes do botão do algodão Franklínieila schultzei, tripes de estufa com faixa He.rcinothrips femoral is, tripes da soja Nsohydatothríps variabilis, tripes dos citricos de Kelly Pezothríps kellyaísus, tripes do abacate Bcirtothrfps perseae, tripes do melão Thrips palmi, e tripes da cebola Thríps tabaci.

[333] Exemplos de incluem, mas não se limitam a; nematódeos parasítico, tal como nematódeos no dá raiz, cisto, e de lesão, incluindo Neterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos de cisto incluindo, mas não se limitando a: Heterodera glycines (nematódeo de cisto da soja); Heterodera schachtii (nematódeo de cisto da beterraba); Hecerodera avenae (.nematódeo de cisto do cereal); e Globodera rostochienais s Globodera pailida (nematódeo de cisto da batata). Nematódeos de lesão incluem, mas não estão limitados a: Pratylenohus spp.

[384] Em uma modalidade, as composições inseticidas compreendendo os polipeptídeos, polinucleotideos, células, vetores, etc., podem ser empregadas para tratar ectoparasitas. Ectoparasites incluem, mas não se limitam a: pulgas, carrapatos, sarna, ácaros, mosquitos, moscas de incômodo mordedoras, piolhos e combinações que compreendem um ou mais dos ectoparasites precedentes. O termo pulgas incluí as espécies usuais ou casuais de pulga parasitica da ordem Siphonaptera, e em particular a espécie Ctsnocephaiides, ém particular C fells e C. cams, pulgas do rato (Xenopsylla cheqpís.) e pulgas humanas (Pulex irritans).

[385] Pragas de insetos da invenção para as culturas principais incluem, mas não se limitam a: Mais: Pstrinia nubílalis, teredo do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta preta; Édícovsrpa sea, lagarta do milho; ^podoptera frugíperda, lagarta de braços do outono; .biatraea grandioseila, teredo do milho do sul; Flasmopalpus lignoselius, teredo de pedúnculo de milho menor; Piatraea saccharalis, teredo da cana-de-açúcar; XJíabrotíca virgifez^a, lagarta da raiz do milho oriental;

Pi abrotica longi	cornis barberi,	lagarta da	raiz do	milho do
norte; Di abro t i c<	a undecimpunctai	ía howardi,	laccarta da	raiz da
milho do sul;	.Melanotus spp.	, lagartas	armeC/c	iocephala

borealis, besouro mascarado do norte (larva branca); Cyclocephalá immaculate, besouro mascarado do sul (larva branca) Popiliia gaponica, besouro japonês; Chae tocnsaw pul i caria, besouro da pulga do milho; sphenop&orus maídis, percevejo billbug de mais; Rhopalosiphum maidis, aíideo da folha de milho; Anuraphis maídiradicis, aí ideo da raiz de milho; Blissus leucoptsrus leucqpterus, percevejo chinch; Meianoplus femurrubrum, gafanhoto de pata vermelha; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mylemya platura, verme do milho da semente Agromyza parvicornis, leafminer de borrão de milho; Anaphothríps obsorurus, tripes de grama; Bolenopsis milesta, formiga ladra; Tetranychus urticae, ãcaro aranha dois manchado; Sorgoc Chiio partelius, teredo do sorgo; Epodcptera frugipsrda, lagarta de braços do outono; Heliooverpa zea, lagarta da milho;

148/273

ElssmopaJpus lignosellus, teredo de pedúnculo de milho menor; Feitia subterrânea, lagarta granulosa; Phyliqphaga crinita, larva branca; Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp», lagartas arame; Gulema melanopus, besouro da folha do cereal; Chaetocnema pulicaria, besouro da pulga do milho; Sphenophorus maidis, billbug do mais; Rhopalosiphwn maidís, afídeo da folha do milho; £ipha fiava, afídeo da cana-de-açúcar amarelo; Blisses Isuoopteros leucopterus, percevejo chinch; Contarinia sarghfcola, mosquito do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro aranha carmim; Tetranychus urticae, ácaro aranha dois manchado; Trigo: Pseudaletia unípunctata, lagarta com braços; ^podoptera frugíperda, lagarta com braços do outono; Elas^opalpua lignosellus, teredo de pedúnculo de milho menor; Agrotis orthogonia, lagarta do oeste; Klasmopalpus lígnoaeiius, teredo de pedúnculo de milho menor; Oulema melauopus, besouro da folha do cereal; Hypera punctata, gorgulho da folha do trevo,· Diabrotica undecímpunctata hofc*ardi, lagarta de raiz do milho do sul; Afídeo do trigo da Rússia; Schizaphis graminum, percevejo verde; Macrosiphum avenae, Afídeo do grão inglês; Melanqpius femurrubrum, gafanhoto da pata vermelha; .Melanoplus difxerentíalis, gafanhoto diferencial; Nelanoplus sanguínipes, gafanhoto migratório; Nayetiola dostrueCor, mosca de Hess; áfitodíplcsis mosellana, mosquito do trigo; Meromysa americana, larva do caule do trigo; Hylemya coarefcata, mosca da bulbo do trigo; Frankliniella fusca, tripes do tabaco; Cqphus cinctus, vespa do caule do trigo; Aderia tuiipae, ácaro ondulado do trigo; Girassol: Buleima helianthana, mariposa do botão do girassol; Nomoeosoma electellum, mariposa do girassol; Eygogramma exclama .tionis, besouro do girassol; Botbyrus gibbosus, besouro da cenoura; Naolsaíoptera mcrtfeldti^na,. ácaro da semente do

147/273 girasssol; Algodap: Heliothis ví rescans, lagarta do algodão; Helicoverpa sea, lagarta da algodão; Spodopfera exígua, lagarta com braços da beterraba; Peotinophora gossypíells, lagarta rosa; Anthonomus grand!s, gorgulho de cápsula; Aphis gossypíi, afídeo

do algodão; Pseudatomcscelis seriatus, gafanhoto	pulga do
algodão; Trialeurodes abutxíonea, mosca branca com	asa larga;
bygus líneoíaris, percevejo de planta embaçado;	Melanopius
femurrubrum, gafanhoto da pata vermelha;	Ne1anqplus
differentialís, gafanhoto diferencial; Thríps tabací.	_t tripés da
cebola; Frank!ínkielIa fusca, tripes do tabaco;	Te t ra nych us
cinnabarinus, ácaro aranha carmim; Tetranychus urfc;	icae, ácaro
aranha dois marcado; Arrozt Diatraea saccharalís,	teredo da
cana-de-açúcar; áfpodpptera frugiperda, lagarta com	braços do

outono,· Helicoverpa zea, lagarta do milho; Colaspís bi'unnea, colaspis da uva; Aissorhcptrus cryzaphílus, gorgulho d’água do

arroz; &’i tophi lus oryzaa, gorgulho do arroz;	Nephotettix
nigropictns, gafanhoto da folha do arroz; Blissus	leuccpterus
leucopterus, percevejo chinch; Acros temam hilare,	percevejo
fedorento verde; Sola:. Pseudopiusia includens, lagart	:a de soja;
Anticarsia gemmatalís, lagarta de feijão veludo;	Pia thypena
sóabra, lagarta do trevo verde; Ostrinia nubilalis,	teredo do

nilho europeu; Agrotis ípsilon, lagarta preta; Spodoptera exígua

lagarta com braços da beterraba; Heüothis virescens,

lagarta do

algodão; Helicoverpa zea, lagarta do algodão; Epílachna varivestis, besouro do feijão mexicano; Myzus persicae, afídeo

do pêssego verde; i&qooasca fahae, gafanhoto da folha	na oat a ta;
Acros ternum hi.3a.re, percevejo fedorento verde;	Mélanoplus
femurrubrum, gafanhoto da nata vermelha;	Melanoplus

dífferentiaíís, gafanhoto difrencial Hylemya platura, verme do milho da semente; Sericothríps vaziabílis, tripes de soja;

Thripa tabaci, tripes de cebola; Tetranychus turkestani, ácaro aranha do morango; Tetranychus urticae, ácaro aranha dois manchado; Cevada; Ostrimia nubilalis, teredo do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta preta; Bchisaphis graminum, percevejo verde; Blissue leucopterus leucopterus, percevejo chinch; Acrosternum hiIare, percevejo fedorento verde; Euschistus servus percevejo fedorento marrom; Delia platura, verme do milho da semente; Mayetiola destructor, mosca de Hess; Petrobia iatens, ácaro do trigo marrom; Ccl&L,.^^ .Brevicoryne brassicas, afídeo de repolho; Phyiiotreta cruciferae, besouro pulga; Mamestra configurata, lagarta com braços Bertha; Plutelia xyiostelia, mariposa de dorso em diamente; Delia ssp., Larvas de raiz.

[386] Em algumas modalidades, as composições inseticidas podem ser empregadas para tratar combinações que compreendem um ou mais dos insetos precedex^tes,

[387] Os insetos que são suscetíveis aos peptídeos desta invenção incluem, mas não sao limitados aos seguintes: toxinas de Cyt afetam famílias tais como: Blattaria, Coleoptera, Collembola, Diptera, Bchinostomida, Hemiptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Neuroptera, Orthoptera, Rhabditida, siphonoptera, Thysanoptera. Gênero-Espécie são indicados como a seguir; Aatebia-fennica, Agrotís-ipsilon, A.

sege turn, Antioarsin -gemma tails, Àrgyrotaenia- c.i trana... Arto$?ei& rapas, .Bombyx mori, Busseola-fusca, Cacyreus-marshall, Chilosuppressalis, Chris toneura-fumiferana, C. -oecidentalis, C. -pinus pinus, C. -rosacena, Cnaphalocrocis-medinal xs, Conopomotphaoramere 11 a, Ct enopsues t i s - obl 1 guana, çydia - pomonel la, Dana us plexippus, Diatraea-saccharallis, D. -grandiosella,· Bariasvi ttel la, Elasasolpalpus -lígnusel ius... El dana - saccharins,

149/273

Ephes tia-Ruehniel1a, Epi n©t1a-aporema, Epiphyaa-postvi ttana, Galleria-meilonella, Gênero - Espécie, Helicoverpa-zea, Η. punctigers, Η.-armigera, hi?liothf s-vfrescens, Hyphantria- cunea, Lambdixa - .f 1 s eel 1 aria, Legumini vora - glyc.inivo.rel 1 a, Lobesia botrans, lyman tri a-díspar,. Malacosoma-disstria, Mames trabrassicae, M. configurate, Manduca-sexta, Marasmia-patnalis, Ma.ruca-vitrata, 0,rgyía-.].euaostígK7a, Ostrinia-nubilalis, ó. furnacalis, Pandemis-pyrusana, Pectinophora-gossypielia,

Ferileucoptara «cof fsella, Phthozi maaa-qperculi el a, Pi ano tort ri x ©cto, Piat yn©ta - stu1tana, Pieris-brassi cae, Piodia-ínterpun©tais PI utel 1 a “xylostella, Pseudopl usia - includens ,· Rachipl usia -nu, Pcirppophaga-incertulas, Besamia-calamistis, Ppilosomavi rgin1ca, ápodoptera-exigua, Si -frugiperda, S.-1i 11ora1ía, S. -exempta, S.-litura, Fecia-soianivors, Thaumetopoes-pityocampa, T.rf chcplusia-ni, ^iseana-cervinata, ^iseana-copularis, ^iseana j'oeosa, Blattaria-Blsttella, Collsmbola-Xsxylla, U. -Folsomia, Echinostomida-Fascioia, Pemiptera-Oncopeltrus, He.-Bemisia, He. ~ iiasrosíphum, 3fe.-Rhopslosiphum, He. -Myzus, Hymenqptera-Diprion, Hy. -Apia, Hy. -Mácroaentrus, Hy\ -Meteorus, Hy. -Pasonia, Hy. ~ HoI enopsi s, Xsopoda ~ Porce 11 i o, 1 sop t era - Reticuli t ezmes,

-Ash ta, Pros t igma ta - Te tranychus, Phabi tida Acxobeloides, R. -Caenorhabditis, R, -Pistolabrellus, R> Panagrellus, P.-Pristionchus, R.-Pratylenchus, R.-Ancylostoma, R. .Hippostrongylus, R. -Panagrellus, R.-Haemonchus, R.Meloidbgyne, e Siphonaptera-Ctenocsphalides.

[388] Nós descrevemos a Parte II com a seguinte descrição e sumário:

[389] Nós descrevemos um peptídeo com um dipeptídeo Nterminal que é adicionado a e operavelmente ligado a um peptídeo conhecido, em que o referido dipeptídeo N-terminal é

1S0/273 compreendido de um aminoácido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no C-terminal do dipeptídeo, em que o referido peptídeo é selecionado de um CRIP (Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína), tal como de um peptídeo ICK, ou um peptídeo Não-XCK. 0 dipeptídeo N-terminal que é adicionada a e operavelmente ligado a um peptídeo conhecido, em que o referido dipeptídeo N-terminal é compreendido de um aminoácido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoácida polar na C-terminal do dipeptídeo. O dipeptídeo N--terminal tem um aminoácido não polar como o aminoácido terminal do dipeptídeo N-terminal que pode ser selecionado de glicina, alanina, prolina, vaiina, leucina, isoleucina, fenilalanina e metionina, e um aminoácido polar do aminoácido C~terminal da peptídeo N--terminal pode ser selecionado de serína, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptofano, tirosina.

[390] O dipeptídeo N-terminal pode ter um aminoácido não polar como o aminoácido N~ terminal do dipeptídeo N-terminal selecionado de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e metionina, e o referido aminoácido polar do amincáoido C-terminal do peptídeo N-terminal é selecionado de serina, treonina,· cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptofano, tirosina. O dipeptídeo N-terminal pode e preferivelmente é compreendido de glicina-serína.

[391] Nós descrevemos um peptídeo com um dipeptídeo Nterminal que é adicionada a e operave Imente ligado a um peptídeo conhecido, em que o referido dipeptídeo N-terminal é compreendido de um aminoácida não polar no N~ terminal do dipeptídeo e um aminoácida polar no c-terminal da dipeptídeo, em que o referido peptídeo é selecionado de uma PFIP (Proteína Inseticida Formadora de Poro) ou ele pode selecionado de um GRIP (Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína)_f tal como de um peptídeo ICK, ou um peptídeo Não XCK. O peptídeo Não XCK podería ser uma anêmona de mar, peptídeo de origem como Av.2 ou Av3 e o dipeptídeo preferido é compreendido de glicina-serina. O peptídeo ICK podería ser de uma aranha como os peptídeos ACTX e o dipeptídeo preferido ê compreendido de glicina-serina. A BFIP podería ser uma proteína de Bt, como qualquer uma daquelas aqui divulgadas, na listagem de sequências e conhecida dos peritos na arte que lerem esta descrição e o dipeptídeo preferido é compreendido de glicina-serina.

[392] Conforme indicado acima, nós explicamos que o dipeptídeo N~terminal é compreendido de um aminoãcido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no C-terminal do dipeptídeo e o aminoãcido não polar do aminoãcido N-terminal do dipeptídeo N-terminal pode ser selecionado de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e metionina e de preferência o aminoãcido não polar ê glicina. E nós explicamos e reivindicamos que qualquer um dos peptídeos no parãgrafo abaixo e qualquer um dos peptídeos neste parágrafo podem agir independentemente e devem, ser tratados de forma independente e todas as combinações possíveis são reivindicadas i ndepe nden t emen t e.

[393] Conforme indicado acima, nós explicamos que o dipeptídeo N-terminal, á compreendido de um aminoãcido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoãcido polar no C- terminal do dipeptídeo e o aminoãcido polar do amincácido C-terminal do peptídeo d-terminal é selecionado de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptcfano, tirosina e de preferência o aminoãcido polar é serina. E nós explicamos e reivindicamos que qualquer um dos peptídeos no parágrafo acima e qualquer um dos peptídeos neste parágrafo podem agir independentemente e devem ser tratados de forma independente e todas as combinações possíveis são reivindicadas independentemente.

[3.94] o peptídeo ao qual o dipeptídeo N- terminal e fixado pode ser qualquer peptídeo, qualquer peptídeo tóxico, qualquer peptídeo inseticida, qualquer PFXP, qualquer CR.IP, um CR IP que é um peptídeo ACTX (que e um exemplo de um. peptídeo ICK) , CRXD ê um peptídeo de anêmona do mar (que ê um exemplo de um peptídeo Não ICK), ele pode ser uma PFIP, a PFXP pode ser uma proteína de Bt, a proteína de Bt pode ser cry, ait, VIP e ela pode ser como qualquer destes peptídeos como aqui divulgados ou na listagem de sequências, ou conhecidos por um perito na. arte que lê estas descrições e compreende o documento.

[398] Nós notamos especificamente que estes procedimentos são úteis e nós reivindicamos os próprios procedimentos e os produtos dos procedimentos, tanto como reivindicações independentes como reivindicações de processa por produto para fazer qualquer peptídeo inseticida e, em particular, qualquer peptídeo selecionado da qualquer um dos peptídeos ou das fontes de peptídeos incluindo Atrax ou .Hádzonyche, como aqui ou em outro lugar divulgados, bem como qualquer peptídeo inseticida com fragmentos do mesmo incluindo versões de peptídeo maduro, pre e pró dos referidos peptídeos e números de sequência e o peptídeo na SEQ, ID, NO. 5.

[3:96] Estes peptídeos são úteis e os procedimentos podem ser todos feitos e utilizados onde .haja um amincácído não polar na extremidade N- terminal e um aminoãcido polar na extremidade C-terminal e o dipeptídeo do referido aminoácido não polar ácido ê selecionado de glicina, alanina, prolina, valína,

1S3/273 leucine, isoleucina, fenilalanina e metionina, e á de preferência glicina ou gly, e o aminoãcido polar é selecionado de serina, treonina, cisteína, asparagína, glutamína, histidina, triptofano e tirosina e é, de preferência serina « ser. Q dipeptídeo gly-ser é mais preferido. 0 dipeptídeo pode ser operaveImente ligado a qualquer peptídeo conhecido, qualquer peptídeo tóxico, qualquer peptídeo inseticida, qualquer um dos peptídeos incluindo Atrax ou Hadronyche, aqui divulgados qualquer peptídeo inseticida com fragmentos do mesmo, incluindo versões de peptídeo maduras, pré e pró dos referidos peptídeos e números de sequência, qualquer peptídeo inseticida maduro, o peptídeo compreende SEQ. ID. NO; 6, ou o peptídeo tóxico compreende GSQYC VPVDQ PCELN TQPCC DDATC TQERN VYYCR A (SEQ XD NO; 5).

[327] Nós também descrevemos e reivindicamos o dipeptídeo Gly-Ser, nucleotídeos que codificam o dipeptídeo GlySer selecionados de GGT, GGC, GGA, ou GGG, qualquer um dos quais codifica Gly, e TCT, TCC, TCA, TCG, AGT e AGO, qualquer um dos quais codifica Ser, e aqueles nucleotídeos ligados a qualquer uma das proteínas e o processo e os produtos do processo. Nós descrevemos e reivindicamos estes nucleotídeos que codificam para estes peptídeos operavelmente ligados ac terminal 5‘ da sequência de .DNA que codifica qualquer peptídeo divulgado neste documenta.

[338] Nós explicamos e divulgamos um processo para aumentar o rendimento de peptídeos inseticidas os quais são produzidos de sistemas de expressão de levedura compreendendo a adição de qualquer dípeptídeo ao N-terminal de qualquer peptídeo inseticida. Q processo e produto pelo processo para aumentar o rendimento usou o dipeptídeo como discutido nos parágrafos acima.

154/273

[399] NÕs discutimos especificamente os procedimentos ,· produtos, processos e produtos pelo processo com. qualquer peptídeo inseticida que inibe ambos os canais de Cálcio regulados por voltagem e os canais de potássio ativados por Cálcio em insetos, com origens de peptídeos de quaisquer espécies de aranha teia de Funil da Austrália, uma aranha é selecionada das aranhas teia de Funil da Austrália do gênero Atrax ou Hadronyche, incluindo Hãdronyche versuta. NÕs também descrevemos e reivindicamos especificamente peptídeos inseticidas que náo são peptídeos de motif de ICK, tal como peptídeos com origens de quaisquer espécies de anêmona do mar venenosas, nos referimos ás proteínas como exemplos de peptídeo de motif CRXP que são Não ICK< Nós divulgamos e testamos e mostramos que os procedimentos trabalham com proteínas da gênero anêmona do mar Anemonía, e especificamente de espécies selecionadas, Anemonia viridis» Nós acreditamos até uma certeza.

científica que os métodos trabalharão com peptídeos inseticidas que contêm 20-100 aminoácidos e 2-6 ligações dissulfeto, e com peptídeo inseticida que é qualquer peptídeo inseticida com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, §0%,· 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior identidade de sequência para SEQ XD NO 5, SEQ ID HQ 6, Av2 e Av3,

[400] NÕs especificamente descrevemos e reivindicamos os procedimentos quando utilizados com qualquer espécie de levedura incluindo, mas não se limitando a, quaisquer espécies do s gêneros Sa cchazomyces, Pi chia, Kluyveromyces, Hansenu1a, yarrowia ou Schízosaccharomyces e a espécie Baccharomyces inclui quaisquer espécies de Baccharomyces, e preferivelmente nós divulgamos a espécie de Eacoharosiyces Eaacharomyces cerevisiae. Nós específicamente divulgamos a espécie Paccharomyces cerevisiae que é selecionada das seguintes cepasx IWScl, YNN27,

S150-2B, W303-1B, CG25, W3124, JRY188, BJ54S4, AH22, GRP18, W303-1A e BJ3S0S. Nós especificamente divulgamos especie Pichia incluindo qualquer especie de Pichia e preferivelmente a espécie de Pichia, Pichia pastoris, e preferivelmente a Pichia pastoris é selecionada das seguintes cepasx Bg08, ¥-11430, x-33, GS115, GB130, JC22Ü, UC254, GS200, GC227, JC300, JC301, JC3Ô2, JC303,

JC304, JC3QS, JC306, JC307, JC308, ¥JN165, KM71, MC1Ô0-3, SMQ1163, SMD1165, SMD1168, GS241, MS1S5, qualquer cepa de knockout pep4 a qualquer cepa de knock-out prbl, assim como Pichia pastoris e selecionada das seguintes cepasx Bg0S, .X-33, SMD1188 e KM71. Nós especificamente divulgamos espécie Kluyveromyces que inclui qualquer espécie de Kluyveromyces, e preferivelmente Xluyveromyces lactis, e nós ensinamos que a cepa de Kluyveromyces iactis pode ser, mas não ê necessário que seja selecionada das seguintes cepas s GG7S9, YCT306’, ¥CT284, YCT339, YCT390, YCT569, YCT538, W98-3C, MS1, CBS293.91, ¥721, MD2/I, PM6-7A, WM37, K8, K7, 22AR1, 22A295-1, SD11, MG1/2, MSK110, JA6, CMK5, HP101, HP108 e PMé-3C, além da espécie Kiuyveromyces Iactis que é selecionada de GG799 e YCT306.

[401] Nós especificamente descrevemos e reivindicamos os procedimentos quando utilizados com qualquer espécie de levedura incluindo, mas não se limitando a, qualquer espécie de espécie de Hansenulaincluindo quaisquer espécies de Hansenula e preferivelmente Hanssnula polymorpha.Nós especificamente descrevemos e reivindicamos os procedimentos quando utilizados com qualquer espécie de levedura incluindo, mas não se limitando a, qualquer espécie de espécie de Zarrowia incluindo quaisquer espécies de yarrowia e preferivelmente Karrowia lípolytíca. Nós especificamente descrevemos e reivindicamos os procedimentos quando utilizados com qualquer espécie de levedura incluindo, mas não se limitando a, qualquer espécie de espécie de Schizosacoharomyaes incluindo quaisquer espécies de Bchizosacaharomyces e preferivelmente Bchizosaccharomyces pombe.

[402] PARTE 3. Nesta parte nós descrevemos combinações de CRXPS* e FFXPS.-*

[403] Pm grande número de peptídeos de veneno foi caracterizado como “inseticida”. No entanto, apesar de inúmeros relatos, poucos encontraram qualquer utilidade no mercado como inseticidas reais ou eficazes. Na verdade, apenas o-ACTX-Hvla. foi relatado ser tóxico por administração oral ao carrapato estrela solitário da América Amblyomma americanum. Nenhuma outra toxina de aranha foi relatada como possuindo atividade oral, mesmo no intestino modificada de carrapatas. Hauve um relato de que a biodisponibilidade destes peptídeos pode ser aumentada acoplando-os a uma. proteína transportadora, tal como leutina snowdrop (aglutinina Galanthus nivalis, GNA). Mukherjee, A.K.; Soiled, B.L.; Wike.1, S.K.; King, G.F. Orally active, acaricidal peptide tosins from spider' venom.’·' Toxicon 2006, 47, 182-187. Lectinas de alho sao relatadas como aumentando a absorção de toxinas através do intestino médio do inseto Fitches E et. al. Insect Sei., 2008, 25, 483-495, Fitches, δ., et. al., Xnsect Biochem. Mol. Bíol. 2008, 38, 905-915. Firches, B. et. al.,J. insect Physiol. 2004, 50, 61-71. Por exempla, a fusão da toxina de aranha inseticida U2-SGTX-Sfla [SFX1) a GNA aumentou significativamente sua toxicidade arai para a mariposa de tomate Daconobia oleracea Down, R.E. et. al., Best Manag. Sei. 2006, 62,77-85, assim como a cigarrinha. marrom do arroz Nilaparvata lugens e o afídeo do pêssego-batata Myzus persicae. Suroreendentemente. uma proteína de fusão t.iorredoxina-0-.HXTX“

Hvla foi considerada ser inseticida em lagartas Helicoverpa armigera e Bpodoptera littoralis por aplicação tópica, Khan , S. A. Transgenic Res. 2606, 15, 349-357, (embora a proteína de fusão fosse aplicada topicamente em uma solução contendo altos níveis de imidazol, um composto conhecido por ter atividade inseticida de contato,* Pence, R. J. California Agríc. 1965, 1315. Estes esforços e conclusões indicam claramente a importância de desenvolver meios para melhorar a biodisponibilidade oral de toxinas de veneno. Nós acreditamos que estes esforços também são mal dirigidos. Nesta divulgação nós ensinamos que a fusão de peptídeos inseticidas a proteínas transportadoras que ligam ao intestino de insetos é desnecessária. Nós descrevemos uma.

melhor maneira de distribuir a ⁵⁵toxina” em peptídeos inseticidas para insetos. Sem pretender ser vinculado à teoria, é nossa teoria de que PPIPS, ou Proteínas Inseticidas Pozmadoras de Poros, agem ligando seletivamente a receptores no intestino de inseto. As PFIPS então, em eventos subsequentes, agem para interromper o potencial da membrana das células epiteliais que revestem o intestino. Quando um CRIP ou TMOF apropriado é também oportunamente introduzido nc intestino, ao mesmo tempo que os PFXPS estão agindo no intestino do inseto, o resultado é apoptose e morte, das células que revestem o intestino. Assim, o revestimento do intestino é alargado a simultaneamente os peptídeos venenosos, muitas vezes gr^andes peptídeos isolados de veneno, podem passar através do intestino e adoecer ou matar © inseto alvo. Surpreendentemente, os insetos que desenvolveram resistência a proteínas de Bt não têm defesas e não mostram nenhuma resistência absolutamente até mesmo a níveis baixos de Bt, quando uma PFIP como Bt é administrada a um inseto em combinação com CRIP ou TMOP, que é um peptídeo tóxico, mas um

1S8/273 com propriedades que não agem como uma PFIPS, tal como Bt. Nós fornecemos dados que mostram que certas combinações de CRIPS e PFIPS coadministrados podem fornecer mais do que o dobro do extermínio e poder de parada do que seria esperado de aplicações de concentração semelhante da qualquer um de CRI? OU FFIPS aplicados individualmente.

[4Q4] Exemplos de uma PFI.P incluem as proteínas cry e VIP de organismos de Bt > Proteínas de Bt como as proteínas cry interrompem a membrana do intestino de inseto permitindo infecção acidental (sepse) do inseto pela flora intestinal. Na ausência de micróbios do intestino, Bt não é inseticida. Broderick, Nichole PNAS Vol. 103, No. 41 (2006) . Daí, espera-se que o mecanismo mostrado para causar mortalidade de Bt (infecção) seria mitigado nesses insetos mostrando resistência de Bt, e ele é mitigado nesses insetos. Insetos resistentes a Bt mostx-am pouca interrupção intestinal, mesmo quando alimentados com níveis elevados de proteínas de Bt, como cry. O que, surpreendentemente, descobrimos é que de alguma forma, muito embora esses intestinos de insetos não exibam mais os efeitos dramáticos de Bt no intestino, isto é, eles são realmente resistentes, quando eles são expostos a peptídeos inseticidas de um determinado tipo, como os CRIPS e TMOF que têm um modo muito diferente de ação do que PFIPS como Bt, então, estes insetos muito resistentes não têm nenhuma resistência seja qual for. O desaparecimento de resistência em um inseto ’’resistente a Bt” é surpreendente, e nós mostramos que isto acontece, com os nossos dados, nos exemplos aqui fornecidos. Este resultado foi totalmente inesperado. Agora, no entanto, nós entendemos, e nós podamos usar, este conhecimento para explicar como quantidades subletais de uma proteína. PFIP como Bt, podem ser ” convert idas” em um coquetel letal, de tal forma que se 2 (duas) ou male quantidades subletais da proteína inseticida são coadministradas então, a combinação de proteínas terna-se letal para os insetos que são de outro modo considerados sarem grandes demais, ou resistentes demais para serem suscetíveis a peptídeos tóxicos.

ê surpreendente que a resistência de insetos a FFlPs sozinha não confera resistência à combinação de PFIPS com CRXPS e/ou TMOF. Bevido ao mecanismo de ação das PFIPS seria de esperar que a PFIP, como uma proteína de Bt, deixaria de contribuir para os efeitos tóxicos da combinação de PFXPS com CRIBB e/ou TMOF. .Em vez disso, acontece o contrário e a combinação tem um nível maior do que o esperado de atividade como mostrado com nossos dados.

[405] Os insetos desenvolveram resistência a Bt. As tentativas de combater esta resistência resultaram no uso de muitos subtipos diferentes de Bt. Nós ensinamos aqui que a resistência de insetos pode ser superada por coaplicação de peptídeos de veneno. Uma ves que o modo de resistência mais comum (modo 1, ref. anterior) Pence, R. J. The antimetabolite imidazole as a pesticide. California Agric. 1965, 13-15. ê infrarregulação de receptores de Bt que revestem o intestino, seria de esperar que a resistência do inseto fosse mantida em insetos resistentes a Bt, porque o número de receptores é insuficiente para tornar o inseto vulnerável a sepse pela flora intestinal. 0 que nós descobrimos e acreditamos, e nossos dados suportam a nossa teoria, de forma dramática (veja exemplos abaixo}, é que mesmo com insetos resistentes a Bt permanecem anormalidades de membrana suficientes que a exposição ao níveis mesmo baixos de Bt, quando combinada com certos pequenos peptídeos inseticidas “tóxicos·” tendo um tipo diferente de modo de ação do que Bt, surp.reendentemen.te faz com que insetos resistentes a Bt parem de comer ou morram. Acreditamos que isto é porque o revestimento do intestino ainda está ainda interrompido nestes insetos resistentes, apenas o bastante, o suficiente para permitir a passagem de peptídeos de veneno muito menores característicos de cada um dos tipos de CRXP e TMOF de peptídeos inseticidas.

[406] Neste documento, não consideramos peptídeos TMOF ou. peptídeos de fator oostático de modulação de Tripsina {TMOF) que foram identificados como um potencial larvicida, ver D. Borovsky, Journal of Experimental Biology 2G8, 3859-3875, serem um tipo CRXP de peptídeo inseticida. Nós definimos um. peptídeo CRIP ccmo um com várias cisteínas de acordo com as nossas definições neste documento. Peptídeos TMOF não se adequam ao motif que nõs descrevemos como um peptídeo CRIP. Por favor, consulte a seção de definição na direção do início destes documentes para a definição de GRIP e TMOF. Nós discutimos combinar os tipos de proteínas CRIP e/ou TMOF com um. tipo diferente de proteína que descrevemos como PFXPS.

[407] PFIPS são Proteínas Formadoras de Poros que também são definidas na seção de definição. Um exemplo de um tipo de PFXP são várias proteínas do grupo de proteínas amplamente utilizado derivado de Bt, tal come o cry, cyt e VXP. Estas são inseticidas eficazes usados para proteção de colheita na forma de ambos protetores incorporados na planta e sprays foliares. Formulações comerciais dessas proteínas de Bt são amplamente usadas para controlar insetos no estágio de larva.

[408] Em contraste com PFIPS, CRXPS, tal como peptídeos de nó de cisteína Inibidor ou XCK são grupos de peptídeos muito diferentes que também tém atividade inseticida, mas eles agem com um modo de ação muito diferente. Neste documento não há sobreposição de uma proteína PFIP com uma proteína CRXP, os dois grupos são separados e distintos. Peptídeos XCK e mesmo peptídeos Não XCK são ambos considerados CRXPS neste documento. CRIPS são frequentemente tóxicos para espécies alvo biológicas ocorrendo naturalmente, geralmente insetos ou aracnídeos de algum tipo. Frequentemente peptídeos CRI.? podem ter origens de artrópodes, tal como os venenos de escorpiões ou aranhas, esta origem de veneno é muito comum com ICRs. CRIP pode ser distribuído para seu sítio de ação fisiológico de várias maneiras, por exemplo, distribuindo a toxina diretamente para o intestino ou órgãos internos do inseto por injeção, por aplicação a um locus de inseto e absorção da superfície de contato, ou por indução do inseto para consumir a toxina do seu alimento, por exemplo, alimentação de im inseto sobre uma planta tranagênica.

[409] Os peptídeos aqui descritos ou como produtos aplicados ou através de que enfrentam desafios. Pode ser difícil podem ser formulados p .1 antas t rans gênioas produzir com sucesso esses peptídeos inseticidas em uma escala comercial, com formação e dobramento de peptídeo reprodutível. Os controles de custo podem ser desafíadores. A ampla variedade, propriedades únicas e natureza especial de peptídeos combinadas com a imensa variedade de possíveis técnicas de produção apresentam um número esmagador de enfoques para produção de peptídeos. Produtos comerciais têm seus próprios desafios significativos. Peptídeos são muitas vezes instáveis quando aplicados no ambienta de uma cultura. Irradiação üV e outros fatores podem fazer os inseticidas Bt decaírem rapidamente no ambiente, muitas vezes em tão pouco quanto algumas horas. Além disso, a eficácia comercial

162/273 pods mudar. Ambos pulverização de Bt em produtos e as proteínas de Bt transgênica.s utilizadas como protetor incorporado na planta enfrentam resistência de inseto emergente.

[410] É necessário um produto que aumente a atividade aguda, melhore o desempenha de resistência, ou estenda, a duração de ação a fim de aumentar o controle de inseto e a proteção da cultura >

[411] Aqui apresentamos combinações de proteínas de Bt e peptídeos ICK e TMOF em várias combinações. Nós descrevemos exemplos destas novas combinações. As novas combinações, produtos, métodos e sua formulação e usos dos mesmos são descritos e reivindicados aqui.

[412] PEPTÍDEOS INSETICIDAS RICOS EM CISTEÍNA (CRIPS) EM COMBINAÇÕES SINÊRGICAS

[413] Peptídeos inseticidas ricos em cisteína [CRIBS] são peptídeos ricos em cisteína os quais formam ligações dissulfeto. As ligações de dissulfeto cisteína “-cisteína desempenham um papel significativo na toxicidade destes peptídeos inseticidas os quais são exemplificados por ambos os peptídeos de nó de cisteína inibidor ou ICK e por exemplos de peptídeos tóxicos com ligações dissulfeto que não são consideradas peptídeos ICK (CRIPS não ICK), tal camo peptídeos da anêmcna do mar, como peptídeos de Av2 e Av3. Estes peptídeos tóxicos estabilizados por ligações dissulfeto cisteína-cisteína (CRIPS) podem ter estabilidade notável quando expostos ao ambiente. Muitos peptídeos ICK são isoladas de animais venenosos, tal como aranhas, escorpiões e cobras e são tóxicas para insetos. Peptídeos TMGE são conhecidos por terem atividade larvicida. Peptídeos Av2 e Av3 são isolados de anêmonas do mar. Nós também descrevemos um grupo diferente de peptídeos que agem no revestimento do intestino da inseto. Nós chamamos estas PFIPS de Proteínas inseticidas Formadoras de Pozos. A maioria dos exemplos bem conhecidos de uma PFIPB são as proteínas de Bt, bem conhecidas devido às suas atividades pesticidas específicas e aplicações comerciais. Surpreendentemente, nós descobrimos que, quando a combi nação destes peptídeos, PFIPS C.RIPS, é combinada e administrada, de forma que eles atuem em conjunto no intestino (coadmínistração da combinação não necessária somente a combinação da atividade no intestino é necessária) eles se tornam altamente eficazes no control.e de insetos. Por exemplo, uma das combinações preferidas seria combinar uma proteína de Bt com um peptídeo ICK, ou peptídeos de anêmona do mar, eles criam um inseticida altamente eficaz com uma potência muito maior do que se esperaria,

[414] Nós descrevemos uma composição de peptídeo de combinação inseticida compreendendo tanto uma PPIP (Proteína Inseticida Formadora de Poros) em combinação com um tipo crip e/ou TMOF de proteína inseticida. Notem que CRIP inclui essas proteínas inseticidas como peptídeos ICK (Nó de Cistina Inibidor) e proteínas Não ICK, mas peptídeos TMOF não são considerados proteínas CRIP. Proteínas CRIP podem incluir proteínas Não ICK como as proteínas identificadas primeiro em anêmonas do mar, por

exempla Av2	OU Av3,	A Ct	imposição	pode ser na	razão de	PFIP:
para CRIP e,	'OU TMOF,	em ^:	uma base	da peso see:	o, de ce:	eca de
qualquer uma	ou todas	as	secuintes	razõesx 99 x:	1., 95x5,	90:10,
85;IS, 80:20	í 7 o 2 5 _z	7 0 : 3 0	, 65:35,	60:40, 55:45	50:50_f	45:95,
40:80, 35x85,	30:70, 2	5:75,	20:80, 1	5:85, 10:90,	5:99 e 1:	9 9, ou

qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. Nós também descrevemos uma composição onde a razão de PFIP para CRIP ou TMOF, em uma base de peso seco, ã selecionada de cerca das seguintes razões: 50:50, 45:55, 40:80, 35:65, 30:70, 25:75,

20:80, 15:85, 10:50, 5:55, 1:95, 0,5:95,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99, ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. GRIP, XCK, CRXP Não ICK e TMOF podem ser ou 100% do peptídeo combinado com Bt, ou qualquer peptídeo em qualquer combinação que totaliza 100% de ambos os peptídeos ICK * 7MOF pode ser combinado com Bt.

[415] Sm outra modalidade a combinação de misturas de PFXP em combinação com peptídeos CRIP ou TMOF incluí cada um ou ambos os peptídeos ICK e não ICK PFIP e CRXP que são derivados de mais de um tipo diferente ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos PFIP, XCK e TMOF. Por origens de cepa bacteriana queremos dizer que os peptídeos podem ser descritos como tendo sido expressos por uma cepa bacteriana que expressa os peptídeos com o entendimento de que muitos peptídeos também são artificiais no sentido de que eles não são mais todos desenvolvidos de cepas animais ou bacteríanas«

[41	.6]	NÓS	também	descrevemcs	composições	em	que cada
uma ou	ambas	as $	sisturas	de PFIP em	combinação	com	peptídeos
CRXP ou	TMOF	e/ou	misturas	de PFIP em	combinação	com	CRXP mais

ou com peptídeos TMOF são derivadas de entre 2 e 5, 2 - 15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 e vários outros tipos diferentes ou origens de cepas bacteríanas de cada uma ou ambas as proteínas. Nós divulgamos uma composição em que cada uma ou ambas as proteínas são codificadas por de 2 a 15 tipos diferentes ou origens ou cepa bacteriana de cada uma ou ambas as PFIP em combinação com peptídeos CRIP ou TMOF, E qualquer uma destas combinações de 2-5, 2-15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 e vários outros tipos e misturas diferentes de PFIP em combinação aom peptídeos CRXP ou TMOP podem contribuir mais do que pelo menos 1% de cada tipo de cepa para a composição.

165/273

[417] Nós divulgamos composições de Bt e XCK, Bt e peptídeos TMOF ou BT e peptídeos XCK + TMOF das reivindicações 1 a 6, em que a concentração total de peptídeo Bt e ICK, Bt e peptídeos TMOF ou bt e peptídeos XCK * TMQF na composição é selecionada a partir das seguintes concentrações percentuais: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100%, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a. percentagem restante da composição é compreendida de excipientes. Nós divulgamos composições em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida, em que o referido ERSP ê ligado no Nterminal do peptídeo XCK inseticida. Nós divulgamos composições em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida, em que o referi do ERSP é ligado no Nterminal do peptídeo XCK inseticida, nm que o ERSP é BAAS.

[418] Nos divulgamos composições em que a referida combinação de peptídeos a produzida usando um cassete genético que compreende ainda um dipeptídeo operativamente ligado ao peptídeo XCK e TMOF inseticida, em que o referida dipeptídeo é ligada na extremidade N-terminal do peptídeo XCK inseticida; e em que o dipeptídeo é compreendido de um aminoácido não polar no N-terminal do dipeptídeo a um aminoácido polar no c-terminal do dipeptídeo, incluindo modalidades em que o dipeptídeo é glicinaserina, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida é qualquer peptídeo inseticida que inibe tanto as canais de Cálcio regulados em voltagem quanto os canais de potássio ativados por

166/273

Cálcio em insetos, incluindo modalidades em que as origens de peptídeo ICK insecticide de qualquer espécie de aranha teia de funil da Austrália, incluindo modalidades em que a aranha é selecionada de aranhas teia de funil da Australia do gênero Atrax ou Hadronyche»· incluindo modalidades em que a aranha é selecionada de aranhas teia de funil da Australia do gênero Hadronyche, incluindo modalidades em que a aranha é selecionada de teia de funil das Montanhas .Azuis da Australia, ííadronyche versuta, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida é Híbrido-ACTX-Hvla, incluindo modalidades em que c peptídeo ICK inseticida contém 20-100 aminoácidos e 2-4 ligações dissulfeto, incluindo modalidades em que o referido peptídeo ICK inseticida

é qualquer peptídeo :

ICK inseticida com pelo menos. 50%, 55%, 60%

65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior identidade de sequência para qualquer uma das sequências ICK aqui reveladas, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida ê selecionado de publicações incorporadas por referência, incluindo as modalidades em que proteína de Bt é qualquer proteína de Bt inseticida, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é uma proteína ou Cry ou Cyt, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é selecionada do grupo consistindo de uma Cryl. Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, uma proteína inseticida binária CryET80 e CryET76, uma proteína inseticida binária TIC10O e TIC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ou ET37 com uma proteína inseticida TIC81Q ou TIC812 e uma proteína inseticida binária PS149B1, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CrylA ou uma proteína CrylF, incluindo modalidades em que a proteína de Bt ê uma combinação de proteína CrylF-CrylA, incluindo modalidades em

187/273 que a proteína de Bt compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO; 10, 12, 14, 26, 28, ou 34 da Patente VS 7 >.304.206, incluindo modalidades em que a Proteína de Bt ê Dipel, incluindo modal idades em que a proteína de Bt é Thuricide.

[419] NÓs divulgamos uma composição que compreende os nucleotídeos de: proteína de Bt (Bacillus thuríngíensus); e peptídeo XCK inseticida. (Nó Cistina Inibidor), peptídeo Bt e TMOF ou BT e peptídeos XCK + TMQF em uma planta transformada ou genoma de planta; onde a razão de Bt para XCK, Bt e peptídeos

TMOF	ou BT	e peptideos XCK * TMOF, numa	base de	peso seco, é
selec	ionada	de cerca das seguintes razõe·	S; 99:1,	95:5, 90:10,
85 :15	,. 80:20	_t 75:25, 70:30, 65:35, 60:40,	55:45,	50:50, 45:55,
40 :6 0	, 35:65	, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85,	10x90, 5:	95 e. 1x99, ou

qualquer combinação de quaisquer dois destes valores.

[42δ] Nós divulgamos planta transformada ou genoma de planta em que a razão de Bt para XCK, Bt e peptídeos TMOF ou BT e peptídeos XCK * TMQF, numa base de peso seco, é selecionada de cerca das seguintes razões; 58:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:.90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99, ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. A planta transformada ou o genoma de planta podem ter cada um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de mais de Itipo diferente ou origem de cepa bacteriana de peptídeos Bt ou ICK, ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de entre 2 e S tipos diferentes ou origem de cepa bacteriana de cada um dos peptídeos Bt. ou ICK ou ambos os peptídeos Bt e XCK são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origens de cepa, ou cada um nu ambos os peptídeos de Bt e ICK são derivados de 2 a 15 diferentes tipos ou. origens de cepa

168/273 bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e ICK a pelo menos .uma cepa de cada um de Bt ou ICK .ou. ambos os peptídeos de Bt e XCK codificados por* mais do que uma cópia dos genes de Bt ou ICK, ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e ICK são derivados de mais de um tipo diferente ou de origem de cepa bacteriana de peptídeos de Bt e ou ICK onde todas as cepas de peptídeos Bt e/ou ICK contribuem em mais dó que pelo menos 1¾ de cada tipo de cepa para a referida composição, ou cada um de ou ambos os peptídeos de Bt e ICK são derivados de 2 a 5 tipos diferentes ou origens da cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e XCK e peXo menos uma cepa de cada um de Bt ou XCK ou ambos os peptídeos Bt e XCK cod.ificados por mais do que um cópia dos genes Bt ou ICK, ou a concentração total de peptídeo Bt e ICK na composição pode ser selecionada das seguintes concentrações percentuaisx 0, 1, 5, 10, .15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 50, 95, 99 OU 100%, OU qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a percentagem restante da composição e compreendida de excipientes.

[421] As composições e plantas descritas neste documento incluem um peptídeo de combinação inseticida produzido usando um. cassete genético que compreende adicíonalmente um ERSF (Peptídeo Binai de Retículo Bndoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida, ou a um peptídeo TMOP em que

o referido ERSP	£5	ligada no N~terminal	do peptídeo ICK nu TMOF
inseticida, £	Sm	out:	ra modalidade o	peptídeo	de	combinação
inseticida ã px*<			usando um cassete	genética	que	compreende
adielonaImente			ERSP (Peptídeo	Sinal	de	Retículo
Endoplasmático)	operat	ivamente ligada aa	peptidea	ICK	inseticida

em que o referido ERSP é ligado no N~ terminal da peptídeo ICK inseticida, em que o ERSP é BAAS, Numa outra modalidade a

169/273 planta transgênica incorporando e expressando cs peptídeos de combinação de nucleotídeos aqui descritos, em que o referido peptídeo de combinação é produzido usando um cassete genético que compreende ainda nucleotídeos que expressam um dipeptídeo operavelmente ligado ao peptídeo ICK ou TMOF inseticida, em que o referido dipeptídeo é ligado ao N-terminal do peptídeo ICK inseticida; e em que o dipeptídeo é compreendido de um aminoãcido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoãcido pelar no C'terminal do dipeptídeo. Em outra modalidade a planta transgênica tem um dipeptídeo que g lie ina -serina. Em outra modalidade a planta transgênica tem peptídeos ICK inseticidas expressos que são compreendidos de uma combinação de peptídeo inseticida de proteínas ICK e Bt. As plantas transgênicas podem ter um peptídeo ICK inseticida derivado de qualquer espécie de aranha teia de funil da Austrália, ou aranhas teia de funil da Austrália do gênero Atrax ou Hádronyche, e teia de Funil das Montanhas Azuis da Austrália, Kádronyche versuta.

[422] Nós descrevemos e i-evindicamos -uma planta transgênica em que o peptídeo ICK inseticida expresso é HíbridoACTX-Hvla, e/ou o peptídeo ICK inseticida expresso pode conter 20-100 aminoácidos e 2-4 ligações dissulfeto e/ou o peptídeo ICK inseticida é qualquer peptídeo inseticida com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior identidade de sequência para qualquer um dos peptídeos ICK descritos neste documento. As plantas transgênicas divulgadas podem conter qualquer proteína de Bt conhecida incluindo peptídeos onde a proteína de Bt é uma proteína Cry ou Cyt, e/ou a proteína de Bt é selecionada do grupo consistindo em uma Cryl, Cry3, TXC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, uma proteína inseticida binária

CryETSO, e cryET76, uma proteína inseticida binária TlClãó e TIC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ου ET37 com uma proteína inseticida TXC8X0 ou TXC812 e uma proteína inseticida binária PS148B1. A proteína de Bt pode ser selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CrylA ou uma proteína CrylF, ou uma combinação de proteína CrylF-CrylA ou ela compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica ãs sequências 10, 12, 1.4, 28, 23, ou 34 da Patente US 7.304.206. Nós descrevemos uma planta transgênica em que a proteína de Bt é Dipel e nõs descrevemos uma planta transgênica em que a proteína de Bt é Thurícide.

[423] Nós específicamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada expressando os peptídeos aqui descritos, onde a concentração média de peptídeo de Bt e XCK, peptídeos de

Bt e TMOF ou peptídeos de BT e XCK * TMOF, em uma folha média de uma planta transformada é de cerca de; 1,

15, 20,

30,

35, 40, 45, SO, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 50, 85 OU 98 %, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores. Nós especificamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada expressando peptídeos tóxicos devidamente dobrados na planta transformada. Nõs especificamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada que expressa peptídeos tóxicos de combinação devidamente dobrados na planta transformada e que causam a acumulação dos peptídeos tóxicos

expressos e	devidamente dobrados na	ref	erida	planta	e causam	um
aumento no	rendimento da planta ou	na	rests	tência	a danos	por
insetos e	eles controlam pragas	de	inset	;os em	lavouras
florestas.	Nós descrevemos plantas	feitas ç	>or qualquer um	dos

produtos e processos descritos neste documento.

[424] Nós descrevemos cassetes de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que expressam quaisquer peptídeos descritos neste documento incluindo modalidades tendo um cassete de expressão funcional incorporado em uma. planta transformada compreendendo nucleotídeos que codificam para qualquer um dos peptídeos divulgadas neste documento ou que poderíam ser feitas par alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Nós descrevemos e reivindicamos procedimentos para a geração de plantas transfcimiadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos descritos neste documento.

[425] Nós descrevemos o uso de qualquer* um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos neste documento para fazer uma planta ou transformar estes peptídeos ou nucleotídeos em uma planta, e métodos e técnicas para gerar estas proteínas em plantas e/ou cassetes de expressão compreendendo qualquer um dos peptídeos e métodos para os transformar em um genoma de planta e qualquer método para usar, fazer, transformar qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos em uma planta e métodos e técnicas para gerar plantas transformadas tendo ou. expressando qualquer um dos peptídeos e cassetes de expressão funcionais em plantas compreendendo qualquer um dos peptídeos divulgados e seus nucleotídeos correspondentes e quaisquer plantas feitas pelas produtos e processos descritas neste documento.

[426] Em algumas modalidades nós divulgamos um gene

quimérico com	preendendo	um promotor at	i vo	em plan
ope ratívamente	ligada aos	ácidos nucleicos	ou		de
expressão como descritos n;	s s t e documenta.	NÓS	dx vu X c?su&o &	um

método para fazer, produzir cu usar a combinação de genes descritos neste documento. Nós divulgamos um vetor recombinants compreendendo a combinação de genes descritas neste documento.

Nós divulgamos um método para fazer, produzir ou usar as vetores

recombinantes.	Nós divulgámos uma	célula hospedei	ra transgênica
compreendendo	a combinação de genes	descrita	neste	documento e o
método para	fazer, produzir ou	usar a	célu	la hosnedeira X·
transgêni ca a	qual pode ser uma cé	•lula de p	Tanta	transgênica e

nós divulgamos um método para fazer, produzir ou usar essa célula de planta transgênica, assim como a planta transgênica compreendendo a célula de planta transgênica e como fazer e usar a planta transgênica. Nós divulgamos planta transgênica e semente tendo as propriedades descritas neste documento que são derivadas de milho, soja, algodão, arroz, sorgo, painço amarelo, cana-de-açúcar, alfaia, batatas ou tomates. A semente transgênica pode ter um gene quimêrico que nós descrevemos neste documento. Nós descrevemos métodos para fazer, produzir ou usar a planta e/ou a semente transgênicas desta divulgação.

[417] Nós também descrevemos métodos para usar a invenção e fornecer novas formulações. A invenção é mais útil para controlar insetos. Nós descrevemos um método de controlar um inseto que compreendes Aplicar proteína de Bt {Bacillus thuríngiensis} ao referido inseto; e Aplicar um peptídeo ICK (Nó de cistina Inibidor) ao referido inseto. Este método pode ser utilizado quando a proteína de Bt e o peptídeo ICK inseticida, peptídeos de Bt e TMOF ou peptídeos de BT e ICK i TMQF são aplicados em conjunto, ao mesmo tempo, nas mesmas composições ou em separado em composições diferentes e em momentos diferentes. A proteína de Bt e o peptídeolCK inseticida e/ou o peptídeo TMOF podem ser aplicados sequencialmente e eles podem ser aplicados aos insetos resistentes a (proteína de Bt) . A razão de Bt para ICK ou TMOF, em uma base de peso seco, pode ser selecionada de pelo menos cerca das seguintes razões; 99:1, 95:5, 90:10, 85;15,

3C:2Q_;. 75:25, 70:30, 65:30, 60:40,

50:45, 50:50, 45:05, 40:60,

35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, ou qualquer combinação de quaisquer dais destes vaiares. A razão da Bt para XCK, em uma base de peso seco, pode ser selecionada de pela menos cerca das seguintes razões: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5,

0,1:99,9 e 0,01:99,99, ou qualquer combinação de quaisquer deis destes valores. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de mais de 1 tipo diferente ou origens de capa bacteriana de peptídeos de Bt e XCK, peptídeos Bt e TMOF ou peptídeos BT e XCK + TMOF. Qualquer um ou ambas as peptídeos de Bt e XCK, Bt e TMOF ou peptídeos de BT e XCK 4 TMOF são derivados de entre 2. e 5 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de qualquer um de peptídeos de Bt ou XCK ou ambas as peptídeos de Bt e .XCK. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivadas de 2 a 15 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK e pelo menos uma cepa de cada um de Bt ou XCK ou ambos os peptídeos de Bt e ICK sãa codificados por mais do que uma cópia dos genes de Bt ou XCK. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de mais do que 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana das peptídeos Bt e/ou XCK, com todas as cepas de peptídeos de Bt e/ou XCK contribuindo cam mais de pelo menos 1% dos peptídeos de cada tipo de cepa na referida composição. Qualquer um au ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de 2 a 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK e pelo menos uma cepa de qualquer um dos peptídeos Bt ou XCK ou ambos Bt e XCK são codificados por mais de uma cópia dos genes Bt ou XCK. A concentração total de peptídeos de Bt e XCK, Bt e IMOF au

174/273 peptídeos ST e XCK * TMOF na composição é selecionada das seguintes concentrações percentuais: 0, 1₍ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 50, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 OU 100%, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valot'es e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

[428] Qs métodos podem ser usados onde o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicíonalmsnte um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo XCK inseticida, ou peptídeo TMOF; em que o referido ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo ICK inseticida. Em algumas modalidades os peptídeos de combinação inseticidas usados são produzidos usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Reticule Endoplasmático} operativamente ligado ao peptídeo XCK inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N~ terminal do peptídeo XCK inseticida, em que c ersp é BAAE.

[429] Qualquer um dos peptídeos e plantas descritos neste documento podem ser usados para cont relax' insetos, seu crescimento e danos, especialmente seu dano ás plantas. A. proteína de Bt de combinação e o peptídeo ICK inseticida podem ser aplicados por serem pulverizados em uma planta, ou no locus do inseto, ou no locus de uma planta em necessidade de proteção.

[430] Nós também, descrevemos formulações compreendendo: proteína de Et; e um peptídeo ICK inseticida e/ou um peptídeo tmof inseticida que podem incluir qualquer uma das composições aqui descritas, ou capazes de serem feitas por um perito na arte dada esta divulgação. Algumas das formulações descritas incluem o uso de um solvente aprôtico polar e/ou água e/ou quando o solvente aprôtico polar está presente em uma quantidade de 1-99% em peso, o solvente prótico polar está presente em uma quantidade de 1-99% em peso e a água está presente em uma quantidade de ü-98%em peso. Às formulações incluem formulações em que a proteína de Bt é Dipal e onde o peptídeo ICK inseticida é um peptídeo híbridc-ACTX-Hvla. As formulações de solvente aprótico polar são espeoialmente eficazes quando elas contêm MSO MSO é uma mistura de óleo de semente metí lado e surfactants que utiliza ésteres metílicos de õleo de soja em quantidades de entre cerca de 80 e 85 por cento de õleo de petróleo com IS a 20 por cento de surfactante.

[431] Esta revelação fornece numerosos exemplos de peptídeos tipo CRIP adequados, peptídeos ICK, peptídeos CRIP NÃO-ICK e peptídeos TMGF além de muitos tipos de peptídeos tipo PFIP, tal como proteínas de st e VIP e os peptídeos, quando combinados, fornecem novos produtos inseticidas e estes podem ser aqui referidos como “peptídeos de combinação*. Os peptídeos adequados para utilização com esta invenção são descritos no presente documento e exemplos específicos são divulgados na listagem de sequências. Os peptídeos na listagem de sequências são fornecidas apenas como exemplos para ilustrar a invenção e para proporcionar direção e sentido para um perito na arte. Deve ser entendido que a listagem de sequências não fornece uma lista completa e exaustiva de todos os CRIPS, ICKs, CRIPS NÃO-ICK e TMOF nem ela fornece uma lista completa e exaustiva de todas as pfips. insetos podem ser tratados com peptídeos de combinação aplicados diretamente, tal como pulverizados em um inseto ou seu locus, ou cs peptídeos de combinação podem ser aplicados

índiretament	:e, tal <	somo distribuídos	em	uma planta transgênica.
Primeiro nó	>s f ornes	;emos descrições	per	escrito e exemplos de
peptídeos Cl	31Ρ como	ICK (Seção X) , e	est	;es também são fornecidos

acima. Então, nós fornecemos descrições por escrito detalhadas e exemplos de peptídeo TMOF (Seção II). A seguir nós fornecemos descrições por- escrito detalhadas e exemplos de proteínas de Bt (Seção III). Deve ser entendido que a o pedido fornece estes exemplos como um meio para ilustrar e não limitar as fronteiras da patente e da invenção reivindicada. Qualquer proteína de peptídeo Bt e ICK ou peptídeo TMOF adequado podería sercombinado da maneira descrita e resultaria em um inseticida eficaz. Após descrever as proteínas ICK e Bt, o requrente descreve várias composições pesticidas (Seção IV)<

Transformações de planta usando ambas as proteínas ICK e Bt são descritas (Seção V) . Descrições e exemplos de Combinações de CHIP e Bt (Seção VI) . Combinações de proteínas TMOF e Bt são descritas (Seção VII). Nós fornecemos exemplos e descrições não limitantes de como as proteínas ICK e Bt foram combinadas para produzir um inseticida altamente eficaz, com resultados e dados fornecidos neste documento.

[432] Seção X« Os peptídeos de motif ICK ou peptídeos

4* <a^íX «

[433] ’’Motif de ICK⁸, ’’proteína de motif ICK, motif de nó de cistina inibidor, peptídeos XCK de inseto tóxicos ou ’’peptídeos ICK” significam um peptídeo de 16 a 60 aminoácidos com pelo menos 6 aminoácidos de núcleo de meia cistina tendo três pontes dissulfeto, em que as 3 pontes dissulfeto são ligações covalentes e dos seis resit dissulfeto covalentes estão entre a e quinta e a terceira e sexta aminoácidos meia cistina de núcleo terminal. O motif ICK também secundária beta-hairpin, normalme situados entre a quarta e a sexta luos meia cistina as ligações primeira e quarta, a segunda meias cistinas, dos seis começando do aminoácido Ncompreende uma estrutura nte oomposta de resíduos meias cistinas de núoleo do motif, o hairpin sendo estabilizado pela retinalação estrutural fornecida pelas três ligações dissulfeto do motif. Notem que aminoácidos cisteína/cistina ou meia cistina adicionais podem estar presentes dentro do motif de nó cistina inibidor.

[434] Este motif é comum em peptídeos isolados do veneno de numeroass espécies. Espécies invertebradas incluem aranhas e escorpiões, outros exemplos são numerosos, mesmo veneno de cobra é conhecido por ter peptídeos tende o motif ICK. Exemplos específicos de -peptídeos XCK inseticidas são os peptídeos U divulgados neste documento e em patentea e pedidos de patente publicados e suas homologias que têm uma origem dos venenos de aranhas Teia de Funil da Austrália. Estas proteínas também são denominadas como peptídeos ACTX da Aranha Teia de Funil das Montanhas Azuis da Austrália, mas os procedimentos descritos neste documento são úteis e podem ser aplicados a qualquer proteína com o motif ICK. Os seguintes documentos são incorporados por referência nos Estados Unidos em sua totalidade são conhecidos daqueles versados na técnica e todos foram publicados.

[435] Exemplos de toxinas de peptídeo com a proteína de motif XCK podem ser encontrados nas seguintes referências. 0 bloqueador de canal de cálcio tipo N o-Conotoxina foi revista por Lew, M.C. et al. Structure-Function Relationships of ωConotoxin GVIA* Journal of Biological Chemistry, Vol. 272, N” 18 Edição de Maio 2, pp. 12014-12023, 1997. Um sumário de numerosos peptídeos XCK tóxicas de artrópode de diferentes espécies de aranha e escorpião foi revisto em Quintero-Hernandez V. et al. Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene Cloning and Peptide Expression* Toxicon, 58, pp. 644-063, 2011. A estrutura tridimensional de Hanatoxinl usando espectrosoopia NMR foi

178/273 identificada como um motif de nó cistina inibidor em Takahashi, H. et al. ^Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K4· channels: common surface features of gating modifier toxins* Journal of Molecular Biology, Volume 297, Edição 3, 31 Março 20OQ, pp. 771-780. O isolamento e a identificação de oDNA codificando um peptídeo de toxina ICK de veneno de escorpião, Cpicalcinel, foram publicados por Ehu, S. et al. Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides* FASEB J., 2003 Set 17, (12):1765-7, Epub 2003 Jul 3. A designação específica, de sequência e a identif icação de estrutura secundária de BgK, uma toxina bloqueadora de canal de Ka da anêmona do mar Bunodosoma grand if era, foram divulgadas por Dauplais, M. et al. On the convergent evolution of animal toxins* Journal of Biological Chemistry. 1997 Fev 14; 272(7): 4302-9. Uma revisão da composição e farmacologia de venenos de aranha com ênfase em estrutura de toxina de polipeptídeo, modo de ação e evolução molecular mostrando pontes de cistina, formações de nó cistina e a dobra knotting-type* foi publicada por Escoubas, P. et al. Structure and pharmacology of spider venom, neurotoxins* Biochimie, Vol. 82, Edições 9-10, 1Q Setembro 2800, pp. 893-907. Q peptídeo purificado, iberiotoxina, um inibidor do canal de K* ativado por Calf de veneno de escorpião (Buthus tamulus) foi divulgado em Galvez, A. et al. Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Butbas tamuius* Journal of Biological Chemistry, 1990 Jul 5; 265(19): 11063-90. O peptídeo purificado, caríbdotoxina, um inibidor do canal de K* ativado por Ca2*, do veneno do escorpião Leiurus guinguestriatus foi divulgado em Gimenez-Gallego, G. et al. ^Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels* Proc Natl Acad Sei, 1988 Mai? 85(10)? 3329-3333, Destas e de outras publicações, aqueles versados na técnica serão capazes de prontamente identificar proteínas e peptídeos tendo o que descrevemos como o motif ICK, proteína de motif ICK ou o ”motif de nó cistina inibidor.

[436] A proteína de motif ICK pode ser qualquer proteína com o motif ICK e está entre 16 e 60 aminoácidos de comprimento, com pelo menos 6 resíduos de cisteína que criam ligações dissulfeto de reticulação covalentes na ordem própria. Alguns peptídeos de motif ICK têm entre 26-60 aminoácidos de comprimento. Algumas proteínas de motif ICK estão entre 16-48 aminoácidos de comprimento. Algumas proteínas de motif ICK. estão entre 26-48 aminoácidos de comprimento. Algumas proteínas de motif ICK estão entre 30-44 aminoácidos de comprimento. Proteínas de motif ICK com atividade inseticida natural são preferidas, mas proteínas de motif ICK com outros tipos de atividade, tal como resistência a sal e congelamento, são conhecidas por aqueles versados na técnica e são reivindicadas neste documento. Exemplos de proteínas de motif ICK inseticidas incluem os peptídeos e genes ACTX, e incluindo todos os peptídeos e seus genes de codificação conhecidos como Magi6.

[437] Exemplos de proteínas de motif ICK inseticidas incluem os peptídeos e genes ACTX, e incluem todos os peptídeos e seus genes de codificação como descritos nas referências fornecidas acima e neste documento. Exemplos específicos de proteinase peptídeos de motif ICK divulgados para fins de fornece exemplos e não destinados a limitar de qualquer maneira, são os peptídeos e suas homologias como descrito acima e, em particular, peptídeos e nucleotídeos os quais se originam dos venenos de aranhas Teia de Funil da Austrália. Os seguintes documentos são incorporados por referência nos Estados Unidos em sua totalidade, são conhecidos daqueles versados na técnica e todos foram publicados. Eles divulgam numerosas proteínas de motif ICK a sequência de peptídeo completa, a sequência de nucleotídeo completa das quais são especificamente divulgadas e são incorporadas por referência e em acréscimo às divulgações

comp1etas s ão	inco rporadas	por	referência incluindo todas	as
suas listagens	de sequência.	As	suas listagens de	sequências	são
conhecidas e	publicadas.	Ver	o seouinte: ns	7.354.993	B2,
expedida em. 8	de abril de 2C	iG8,	especificamente as	sequências	3 de
peptídeo e nucleotídeo lis	Pada	s na listagem de	sequência;	s e

numeradas SEQ XD NOs: 33 - 71., de7.354.993 B2, e aquelas denominadas polipeptídeos ü-ACTX e estas e outras toxinas que •podem formar 2 a 4 pontes dissulfeto intracadeia e variantes das mesmas, e os peptídeos aparecendo nas colunas 4 a 9 e na Fig. 2 de 7,354,993 B2. Outras sequências específicas podem ser encontradas na patente EP 1 812 464 Bl, publicada e concedida em G8.10.2Ü08, ver Boletim 2008/41, especificamente as sequências de peptídeo e nucleotídeo listadas na listagem de sequências, e outras toxinas que -podem formar 2 a 4 pontes dissulfeto intracadeia e aquelas sequências numeradas SEQ ID NOs: 33 - 71, e sequências denominadas polipeptídeos D-ACTX e variantes das mesmas e os peptídeos aparecendo nos parágrafos 0023 a 0055, e

aparecendo na. patente EP 1	1 812 46	4 BI, ver Fig.	1 de B	.P 1 812
464 BI.

[438} Descritas e incorporadas por referência a fim de divulgar os peptídeos identificados neste documento estão variantes homólogas de sequências mencionadas tende homología para essas sequências ou citadas neste documento as quais também, são identificadas e reivindicadas como adequadas para se tornarem especiais de acordo com os processos descritos neste documento, incluindo todas as sequências homólogas tendo pelo menos alguma das seguintes identidades percentuais para alguma das sequências divulgadas neste documento ou para alguma das sequências incorporadas por referência: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 88%, 85%, 90%, 95%, 98%, 97%, 98% ou 99% ou identidade maior ou 100% de identidade para todas e quaisquer sequências identificadas nas patentes notadas acima, e para alguma outra sequência identificada neste documenta, incluindo toda e qualquer sequência na listagem de sequências daste pedido. Quando o termo homolólogo ou homologia é usado neste documento com um número tal como 50% ou maior, então, o que queremos dizer é identidade percentual ou similaridade percentual entre dois peptídeos. Quando homólogo ou homologia é usado sem uma percentagem numérica, então, ele se refere a duas sequências de peptídeo que estão intimamente relacionadas no aspecto evoluoionãrio ou desenvolvímental em que elas compartilham aspectos físicos e funcionais comuns, como toxicidade tópica e tamanho similar (isto é, o homólogo estando dentro de 100% do comprimento maior ou 50% do comprimento menor do peptídeo especificamente mencionado neste documenta ou identificada por referência neste documento como acima).

[43.9] Descritas e incorporados por referência para descrever os peptídeos identificados neste documento são peptídeos XCK tóxicos incluindo o seguinte: o peptídeo U e suas variantes encontrados em, isaladas de, ou derivados de aranhas do gênero Aèrax ou Badronyahe, incluindo a espécie de gênero, Hadronyche versata, ou aranha de teia de funil das Montanhas

182/273 incluindo toxinas conhecidas como polipeptídeos ü-ACTX, U-ACTXHvla, rü-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvib, ou mutantes ou variantes, especialmente peptídeos de quaisquer destes tipos e especialmente aqueles inferiores a cerca de 200 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 10 aminoácidos, e especialmente peptídeos inferiores a coroa de 150 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 20 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 100 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 65 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 55 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos de cerca de 37 ou 39, ou cerca de 36 a 42 aminoácidos, especialmente peptídeos com menos do que cerca de 55 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 45 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 35 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 11S aminoácidos, mas maiores do que cerca de 75 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 105 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 85 aminoácidos, especialmsnte peptídeos inferiores a cerca de 100 aminoáoiâos, mas maiores do que cerca de 90 aminoácidos, incluindo toxinas de peptídeos de qualquer* um dos comprimentos mencionados aqui que podem formar 2, 3 e 4 ou mais pontes de dissulfeto intracadeia, incluindo toxinas que interrompem as correntes dos canais de cálcio, incluindo as toxinas que interrompem as correntes de canal de potássio, especialmente toxinas que interrompem os canais de. cálcio de inseto ou Us dos mesmos, especialmente toxinas ou variantes dos mesmos de qualquer um destes tipos, e qualquer combinação de qualquer um dos tipos de toxinas aqui descritos que têm atividade inseticida oral ou tópica., pode ser tornada especial pelos processos aqui descritos.

[440] Os peptídeos Ü da Aranha Teia de Funil da Austrália, gênero Atrax e Hadronyche são particularmente adequados e trabalham bem quando colocado em combinação de acordo com os métodos, procedimentos ou processos descritos por esta invenção. Exemplos de tais peptídeos adequados testados e com dados são fornecidos aqui. As seguintes espécies são também conhecidas especificamente por transportar peptídeos XCK tóxicos adequados para serem tornadas especiais pelo processo desta invenção. As seguintes espécies são especificamente denominadas: Atrax formidab.il lis, Atrax infensus, Atrax robustos, Hadronyche infensa, Hadronyche versuta. Quaisquer peptídeos ICK. tóxicos derivados de qualquer um dos gêneros acima listados e/ou da espécie de gênero e homólogos ao peptídeo U são adequados para serem tornados especiais de acordo com o processo nesta invenção.

[441] Os fôcemplos neste relatório descritivo não se destinam e não devem ser utilizados para limitar a invenção, ales são fornecidos apenas para ilustrar a invenção.

[442] Conforme indicado acima, muitos peptídeos são candidatos adequados para combinações com proteína de Bt. As sequências notadas acima, abaixo e na listagem de sequências são peptídeos especialmente adequados que podem se tomar especiais e alguns destes se tornaram especiais de acordo com esta invenção com os resultados mostrados nos exemplo abaixo.

[443] Exemplas de peptídeos de inseto ICK tóxicos são bem conhecidos e podem ser encontrados em numerosas referências. Eles podem ser identificados pela sua natureza peptídica e sua atividade, geralmente atividade inseticida oral ou de injeção.

Aqui nós fornecemos alguns exemplos para mais bem ilustrar' e descrever a invenção, mas a invenção não está limitada a estes exemplos. Todos estes e outros exemplas não aqui apresentados são descritivos de novos materiais, descritos e reivindicados aqui pela primeira vez.

[444] Peptídeos de inseto XCK são peptídeos maiores de 5 resíduos de aminoácidos e menores que 3,000 resíduas de aminoácidos. Eles variam em peso molecular de cerca de 350 Da a cerca de 350.000 Da, Peptídeos de inseto XCK tóxicos têm algum tipo de atividade inseticida. Tipicamente, eles mostram atividade quando injetadas em insetos, mas a maioria não têm atividade significativa quando aplicada topicamente a um inseto. A atividade inseticida de peptídeos de inseto XCK é medida de uma variedade de formas, Métodos comuns de medição são amplamente conhecidos dos peritos na arte. Tais métodos incluem, mas não estão limitadas a, determinação das doses de resposta medianas (por exemplo, W, PD_SS, ICss, ED_S5) por adequação de gráficos dose-resposta com base em vários parâmetros de classificação tais como? paralisia, mortalidade, incapacidade de ganhar peso, etc. As medições podem ser feitas para as coortes de insetos expostas a várias doses da formulação inseticida em questão. A análise dos dados pode ser feita criando curvas definidas pela análise de probidade e/ou a Equação de Hill, etc. Em tais casos, as doses seriam administradas por injeção hipodérmica, por infusão hiperbárica, por apresentação da formulação inseticida, como parte de uma amostra de alimento ou de isca, etc,

[445] Peptídeos de inseto XCK tóxicos ou peptídeos XCK são definidos aqui como todos os peptídeos mostrados serem inseticidas mediante distribuição para insetos seja por injeção

185/273 hipodérmica, infusão hiperbárica ou mediante distribuição per os a um inseto {isto ê, por ingestão como parte de uma amostra de alimento apresentada ao inseto). Esta classe de peptídeos assim compreende, mas não se limita a, muitos peptídeos produzidos naturalmente como componentes dos venenos de aranhas, ácaros, escorpiões, cobras, caracóis, etc. Esta classe também compreende mas não se limita a, vários peptídeos produzidos por plantas (por exemplo, vãrias lectinas, proteínas de inativação de rdbossoma e proteases de cisteína), e vários peptídeos produzidos por micróbios entomopatogênicos (por exemplo, a família de proteínas da proteína Cryl/Bt produzida por várias espécies de Bacillus).

[446] Os peptídeos inseticidas podem ser selecionados de veneno inseticida, por exemplo, o veneno de uma aranha. A aranha pode ser uma aranha teia de funil da Austrália. Os peptídeos podem ser do gênero de Atrax ou Hadronyche incluindo ü-ACTK-Hvla e seus análogos. Exemplos de peptídeos específicos de aranhas são descritos na listagem de sequências aqui fornecida. Estes peptídeos podem ser combinados com proteína de

Bt utilizando os procedimentos aqui descritos.

[447] Exemplos de Sequência de Peptídeo ICK

[448] Os seguintes documentos são incorporados por referência nos EUA em sua totalidade e em outras jurisdições onde permitido e eles são do conhecimento comum dada a sua publicação. Além disso eles são incorporados por referência e conhecidos especificamente pelas suas listagens de sequência até o grau que eles descrevem sequências de peptídeo. Ver o seguinte

Patentes US?

[449] US 5.763.568, expedida em 9 de junho de 1998, incorporada neste documento em sua totalidade, especificamente as sequências na listagem de sequências e aquelas numeradas 3358, e aquelas conhecidas como toxinas capa ou «ômega”, incluindo aquelas que podem formar 2-4 pontes dissulfeto intracadeia, e os peptídeos aparecendo nas colunas 2 e 4, e Tabela 5, e nas Fig. 5, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18.

[45-0] U8 5,959,132, expedida em 28 de setembro de 1999, incorporada neste documento em sua totalidade, especificamente as sequências na listagem de sequências e aquelas numeradas 3358 , e aquelas conhecidas como toxinas capa” ou «ômega, incluindo toxinas que podem formar 2-4 pontes dissulfeto intracadeia, e os peptídeos aparecendo nas colunas 2 e 4, e Tabela 5, e nas Fig. 5, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18.

[4511 US 6.583.264 B2, expedida em 24 de junho de 2083, e US 7.173.136 B2, expedida em 6 de fevereiro da 2007, incorporadas neste documento em sua totalidade, especificamente a sequência número 1, denominada ’*ômega-atracOtoxina-Hv2a ou catracotoxina-Hv2a, incluindo toxinas que podem formar 2-4 pontes dissulfeto intracadeia.

[452] US 7.279.547 B2, expedida em 9 de outubro de 2007, incorporada neste documento em sua totalidade, especificamente as sequências na listagem de sequências e aquelas numeradas 3367, e variantes de o-atracotoxina-Hv2a, toxinas que podem formar 2-4 pontes dissulfeto intracadeia, e os peptídeos aparecendo nas colunas 4 a 8 do relatório descritivo e na Fig. 3 e Fig. 4.

(4531 US 7,354.993 B2, expedida em 8 de abril de 2008, incorporada neste documento em sua totalidade, especificamente as sequências de peptídeo listadas na listagem, de sequências e aquelas numeradas 33-71, e aquelas denominadas polipeptídeos UAOTX, toxinas que podem formar 2-4 pontes dissulfeto intracadeia, e variantes das mesmas, e os peptídeos aparecendo nas colunas 4 a 9 do relatório descritivo e na Fig, 1<

[454] A patente EP X 8X2 484 BX, publicada e concedida em 08.10,2008, Boletim 2008/41, incorporada neste documento em sua totalidade, especifioamente as sequências de peptídeo listadas na listagem de sequências, toxinas que podem formar .2 a 4 pontes dissulfeto intracadeia e aquelas numeradas 33-71, e aquelas denominadas polipeptídeos U-ACTX e variantes das mesmas e os peptídeos aparecendo nos parágrafos 0023 a 0055, e aparecendo na Fig. 1.

[455] Descritas e incorporadas -por referência nos peptídeos identificados neste documento estão variantes homólogas de sequências mencionadas tendo homología para essas sequências ou citadas neste documento as quais também são identificadas e reivindicadas como adequadas para se tomarem especiais de acordo com cs processos descritos neste documento, incluindo todas as sequências homólogas tendo pelo menos alguma das seguintes identidades percentuais para, alguma das sequências divulgadas neste documente ou para alguma das sequências incorporadas por referência; 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%., 60%, 65%, 70%,· 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou identidade maior para todas e quaisquer sequências identificadas nas patentes notadas acima, e para alguma outra sequência identificada neste documento, incluindo toda e qualquer sequência na listagem de sequências deste pedido. Quando o termo homolõlogo ou homologia ê usado neste documento com um número tal como 30% ou maior, então, o que queremos dizer ê identidade percentual ou similaridade percentual entre dois peptídeos. Quando homólogo ou homologia é usado sem uma percentagem numérica, então, ele se refere a duas sequências de peptídeo que estão intimamente relacionadas no aspecto evolucionário ou desenvolvimental em que elas compartilham aspectos físicos e funcionais comuns, como toxicidade tópica e tamanho similar dentro de 100% do comprimento maior ou do comprimento menor do peptídeo.

[456] Descritos e incorporados por referência aos peptídeos identificados neste documento que são derivados de qualquer fonte mencionada nos documentos de patente US e EP citados acima incluindo, mas não se limitando ao seguinte: toxinas isoladas de plantas e insetos, especialmente toxinas de aranhas escorpiões e plantas que rapinam ou se. defendem de insetos, tal como aranhas teia, de funil, especialmente aranhas teia de funil da Austrália, incluindo toxinas encontradas em, isoladas de ou derivadas do gênero Atrax ou Hadronyche, incluindo a espécie do gênero Madronyche versuta, ou a aranha teia da funil das Montanhas Azuis, Atrax rebustus, Atrax formidableis, Atrax infensus, incluindo toxinas conhecidas atracotoxinas, *co-atracotaxinas^#, *capa* atracotoxinas, '‘õmega* atracotoxinas também conhecidas como o-atracotoxina, polipeptídeos D-A.CTX., U-ACTX-Hvla, rD-ACTX» Hvla, rU-ACTX-Hvlb, ou mutantes ou variantes, especialmente peptídeos de quaisquer destes tipos e especialmente aqueles inferiores a cerca de 200 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 10 aminoácidos, e especialmente peptídeos inferiores a cerca de 150 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 20 aminoácidos, e spe cíalmente peptídeos inferiores a cerca de 100 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos Inferiores a cerca de 65 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de S5 mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos de cerca de 37 ou 39, ou cerca de 36 a aminoácidos, especialmente peptídeos com menos do que cerca de 55 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 25 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 45 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 3S aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 115 aminoácidos, mas maiores da que cerca de 75 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 105 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 85 aminoácidos, especialmente peptídeos inferiores a cerca de 100 aminoácidos, mas maiores do que cerca de 90 aminoácidos, incluindo toxinas de peptídeos de qualquer um dos comprimentos mencionadas aqui que podem formar 2, 3 e/ou 4 ou mais pontes de dissulfeto intracadeia, incluindo toxinas que interrompem as correntes dos canais de cálcio, incluindo as toxinas que interrompem as correntes de canal de potássio, especialmente canais de cálcio de inseto ou híbridos dos mesmos, especialmente toxinas ou variantes dos mesmos de qualquer um destes tipos, e qualquer combinação de qualquer um dos tipos de toxinas aqui descritos que têm atividade inseticida tópica, pode ser tornada especial pelos processos aqui descritos.

[457] Peptídeos venenosos da Aranha Teia de Funil da

Austrália, gênero Atrax e Hadronyche são particularmente· adequados e trabalham bem quando tratados pelos métodos, procedimentos ou processos descritos per esta invenção. Estes peptídeos de aranha, como muitos outros peptídeos ICK tóxicos, incluídos especialmente são peptídeos de escorpião tóxico e planta tóxica, se tornam topicamente ativos ou tóxicos quando tratados pelos processos descritos per esta invenção. Exemplos de peptídeos adequados testados e dados resultantes são fornecidos aqui. Além dos organismos -mencionados acima, as seguintes espécies também são especificamente conhecidas por carregarem toxinas adequadas para serem tornadas especiais pelo

190/273 processo desta invenção. As seguintes espécies são especificamente citadas: Agelenopsis aparta, Androctonus australis Héctor, Antrax formfdabíllis, ântrax infensus, Atrax robustas, Baaillus thuringíensis, Bothus a^rtsnsíi. Kãrsch, Bothus occitanus tunetanus, Butbacus arenioola, Buthotus Judafcus, Buthus occitanus mardoaheí, centruroides noxius, Centruroídes suffusus suffusus, Hadronychs infensa, Hadronychs versuta, Hadronyche versutus, Hold ona curta, Hottentotta J udai ca, .beiurus guinques tría t us, £ei urns guínguest.r.ia tus hebraeus, Leiurus guínguestríatus quinquestríatus, Oldenlandia affinis, Scorpio mauros palma tus, Tityus serrulatus, Títyus zuli&nu. Quaisquer toxinas peptídicas de qualquer um dos gêneros acima listados e/ou de espécie de gênero são adequados para serem tornados especiais de acordo com o processo nesta invenção.

[458] Os Exemplos neste relatório descritivo não se destinam e não devem ser utilizados para limitar a invenção, eles são fornecidos apenas para ilustrar a invenção.

[459]	Conforme i	ndicado acima,	muitos peptídeos são
candidatos	adequados como	o objeto do pro	cesso para se tornarem
espaciais.	As sequéncias	notadas acima, s	(.baixo e na listagem de
sequências	são peptídeos	especialmente a	dequados qua podem se
tornar especiais e muitos	destes se tornai	ram especiais de acorda
com esta i	.nvenção com os 3	?esultados mostrs	idos nas exemplo abaixo
[480]	Os Exemplo	s neste relatório descritivo não se

destinam e não devem ser utilizados para limitar a invenção, eles são fornecidos apenas para ilustrai* a invenção.

[461] Conforme indicado acima, muitos peptídeos são candidatas adequados como o objeto do processo para a expressão em planta como PXP< As sequências notadas acima, abaixo e na listagem de sequências são peptídeos especialmente adequados que podem se expressos em plantas como BEP e alguns destes foram expressos em plantas como PEB de acordo com esta invenção com os resultados mostrados nos exemplo abaixo.

[482] SEQ ID NO? XQ42 (código de uma letra).

GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A

[463] Denominada *0*2-ACTX-Hvla*. Ela tem pontes dissulfeto nas posições; 5-20, 12-25, 19-39. O peso molecular ê de 4 5 6 4,25 Da1tons.

[464] Outro exemplo de uma proteína inseticida de motif ICK ê SEQ ID NO: 1010.

[485] SEQ ID NO; 661 (código de uma letra)

QYCVF VDQFC SLNTQ FCCDD ATCTQ ERNEN GHTVY YCRA

[466] SEQ ID NO: 661, denominada. ^Hlbridc-ÃCTX-Hvla, tem pontes dissulfeto nas posições: 3-18, 10-23, 17-37. O peso molecular é de 4426.84 Daltons.

[467] SEQ ID NO: 593 (código de uma letra)

SPTCI FSGQP CBYNE NCCSQ SCTFK ENENG NTVKR CD

[468] SEQ ID NO: 593 (código de três letras)

Ser Pre Thr Cys lie Pro Ser Gly Gin Pro Cys Pro Tyr Asn Glu Asn

Cys Cys Ser Gin Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly Asn Thr

Vai Lys Arg Cys Asp

Denominada ^ftm-ACTX-Hvla^s ela tem pontes dissulfeto nas posições; 4-18, 11-22 e 17-36. O peso molecular ê de 4096.

[469] SEQ ID NO; 656 (código de uma letra)

GSSPT CIPSG QPCPY NENCC SQSCT FKENE NGNTV KRCD

[470] SEQ ID NO; 65ã (código de três letras)

Gly Ser Ser Pro Thr Cys lie Bro Ser Gly Gin Bro Cys Pro Tyr

Glu Asn Cys	Cys Ser Gin Ser ·*	Cys	rhr Phe Lys <	Glu Asn Glu Asn
Gly
Asn Thr Vai	Lys Arg Cys Asp
Denominada	«m-ACTX-Hvla^2^,í	ela	tem pontes	dissulfeto nas
posições: 6-20, :	13-24 e 19-38< 0	peso	molecular ê	de 4199.

[471] SEQ ID NO: 651 (código de uma letra)

GSAIC TGADR PCAAC CPCCP GTSCK AESNG VSYCR KDEP

[472] SEQ ID NO: 851 (cddigo de três letras)

Gly Ser Ala lie Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys cys

Pro Cys Cys Pro Gly Thr Ser Cys 'Lys Ala Glu Ser As.n Gly Vai

Ser

Tyr Cys Arg I»ys Asp Glu Pro

Denominada rK-ACTX-Hvic ela tern pontes dissulfeto nas posições; 5-19, 12-24, 15-15, 18-34. 0 peso molecular é de 3912,15.

[473] SEQ ID NO: 652 (código de três letras)

	Gly	Ser	Gin	Tyr	CyS Vai	Pro	Vai Asp Gin Pro Cys		Deu Asn
Thr
	Gin	Pro	Cys	Cys	Asp Asp	Ara	Thr Cys Thr Gin Glu	Arg	Asn Glu
Asn
	Gly	His	Thr	Vai	Tyr Tyr	cys	Arg Ala
	Denc	>min«	ida	rü	ACTX-Hv	La	(“Hybrid)e2 ela	tem	pontes

dissulfeto nas posições; 5-20, 12-25, 19-39. O peso molecular ê de 4570,51.

[474] Outros peptídeos ICK são fornecidos na listagem de sequências. SEQ ID NOs; 534-707 sMo sequências de peptídeo ICK e incluem, as toxinas capa / ômega* e as toxinas híbridas. SEQ ID NO: 593 ê Ômega-ACTX-Hvla. SEQ ID NO: 661 é

193/273 híbrido-ACTX-Hvla ou u-ACTX-Hvla.

[475,1 Seção IX. Os peptídeos da motif TMOF ou peptídeos

TMOF.

[476] Motif TMOF* ou proteínas TMOF significa

peptídeo de fator	oostático	de mcdulaçã	o de (	tripsina.
Numerosos exemplos e	variantes são	fornecidos.	SEQ ID J	10: 708 é
a sequência TMOF tip	o selvagem. 0	utras variant	.es não 1;	ímitantes
são fornecidas na S	BQ. ID. NO : a	709 ~ 721.	Outros	exemplos
seriam conhecidos ou poderíam ser	c nados por	aqueles	versados
na técnica.

[477] SecMo XXI. Proteínas de Bt av^wmvmMvmwmvavmwmvmwmvmmwmwmwmwvwwawwmwwhwmvwmw^wmwa

[478] Bt são as iniciais para uma bactéria chamada

Bacillus thuringíensís. A bactéria Bt produz «ma família de peptídeos que são tóxicos para muitos insetos. Os peptídeos tóxicos de Bt são bem conhecidos por sua capacidade de produzir inclusões de proteína cristalina paraesporal (geralmente denominadas cristais) que caem em duas classes principais de toxinas; citolisinas (Cyt) e proteínas de Bt de cristal. Desde a clonagem e o sequenciamento dos primeiros genes de proteínas de cristal no início dos anos 1980, outros podem ter sido caracterizados e são agora classificados de acordo com a nomenclatura de Crickmore et al. (1998), Geralmente proteínas Cyt são tóxicas para as ordens de insetos Coleoptera (besouros) e Diptera (moscas), e as proteínas Cry têm como alvo I,epidópteros (mariposas e borboletas) . Proteínas Cry ligam a receptores específicos nas membranas de células do intestino médio (epitelial) resultando em ruptura dessas células. Be uma proteína cry não puder encontrar um receptor específico na célula epitelial â qual ela pode ligar, então, ela não é tóxica. Cepas de Bt podem ter complementos diferentes de proteínas Cyt e

194/273

Cry, assim definindo snaa faixas hospedeiras. Os genes codificando muitas proteínas Cry foram identifiçados.

[479] Atualmente há quatro patótipos principais de peptídeos paraesporais de Bt inseticidas com na especificidade da ordem; específicos de Lepidotera (Cryl, agora Cryl), específicos de Coleoptera (CrylXX, agora Cry3), específicos de Diptera (CryXV, agora Cry4_f Cry 10, Cryll; e CytA, agora CytlA)< e CryXX (Agora Cry2), a única família conhecida nesse tempo por ter especificidade dupla (Lepídoptera e Diptera). Atividade de ordem cruzada é agora aparente em. muitos casos.

[480] A nomenclatura atribui ãs sequências de holótipo um nome exclusivo o qual incorpora classificações com base no grau de divergência com as fronteiras entre a classe primária (numeral Arábico), secundária (letra maiúscula) e terciária (letra minúscula) representando aproximadamente 95%, 78% e 45% de identidades, üma quarta classificação (outro número Arábico) é usada para indicar isolamentos independentes de genes de toxina holótipo com sequências que são idênticas ou diferem apenas ligeiramente. Atualmente, a nomenclatura distingue 174 sequências de holótipo estão agrupadas em famílias de 55 cry e 2 cyt (Crickmore, N., Zeigler, D.R., Sohnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J, Bravo, A., Dean, D.H., B. thuringiensis toxin nomenclature). Qualquer uma destas proteínas de cristal e dos genes que as produzem podem ser usados para produzir uma toxina relacionada a Bt adequada para esta invenção.

[481] Também estão incluídas nas descrições desta invenção famílias de proteínas de cristal altamente relacionadas produzidas por outras bactériast Cryl6 e Cryl7 de Clostridium bi ferment ans (Barloy et al., 1996, 1996), Cry 18 de Bacillus popilliae (Zhang et al., 1997), Cry43 de Paenibacillus

195/273

lentimorbi	s {Vokoyama	et al., 2004)	a a Cry48	/Cry 49	binária
produzida	por Bacillus	sphaericus (Jones et al.,	2008)	. Outras
proteínas	pesticidas s	: ri stalinas ou	secretadas,	tal	como as
proteínas	da camada S	(Peda et al.,	20 os) que s	‘Stão i	.ncluídas
aqui são	proteínas de	cristal genet1	camente a1teradas	, exceto

aquelas que foram modificadas por meio de simples substituições de aminoácidos [par exemplo., Lambert et al., 1996). Qualquer um destes genes pode ser usado para produzir uma toxina relacionada a Bt adequada para esta invenção.

[482] Exemplos de Bt

[483] Em particular, moléculas de ácido nucleico isoladas correspondendo a sequências de ácido nucleico de proteína de Bt são fornecidas. Adicionalmente, sequências de aminoácido correspondendo aos polinucleotídeos são englobadas. Em particular, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotideo codificando a sequência de aminoácido mostrada em US 2009/0099081, publicado em 18 da abril de 2009, todo o qual ê incorporado neste documento por referência em sua totalidade, e todas as sequências identificadas pelo número especificamente incorporadas por referência. SEQ XD NO: 9, 11, 13, 15, ou 18, ou uma sequência de nucleotideo estabelecida em SEQ ID NOsl, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, ou 17, assim como variantes e fragmentos das mesmas. Sequências de nucleotídeos que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da ixwenção, ou que hibrídizam a uma sequência da invenção também estão englobadas.

[484] Sequências de nucleotídeos codificando as proteínas da presente invenção incluem a sequência estabelecida em US 2009/0099081, publicado em 18 de abril de 2009, SEQ XX3 NC:

196/273

1, 2, 4., 6., 7, 8, 10, 12, 14, 16, ou 17 e variantes, fragmentos e complementos da mesma. Por “complemento” queremos dizer uma sequência de nucleotídeos que ê suficientemente complementar a uma dada sequência de nucleotídeos, de modo que ela pode hibridizar à dada sequência de nucleotídeos para, desse -modo, formar um duplex estável. A correspondente sequência de aminoácidos da proteína de Bt codificada por esta sequência de nucleotídeos está estabelecida em 5EQ ΧΠ NO: 33-533.

[485) Moléculas de ácido nucleico que são fragmentos destas sequências de nucleotídeo codificando proteína de Bt também estão englobadas pela presente invenção (por exemplo, ÜS 2099/0099081, publicado em 18 de abril de 2009, todo o qual é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, e todas as sequências identificadas pelo número especificamente incorporadas por referência. SEQ IP NO: 8 é um fragmento de SEQ ID NO: 4 e 12; SEQ IP NO: 4 ê um fragmento de SEQ IP NO: 2) . Por “fragmento” queremos dizer uma porção da sequência de nucleotídeoe que decodifica uma proteína de Bt. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína de Bt, ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciados' de PCR usando métodos divulgados abaixo. Moléculas de ácido nucleico que sao fragmentos de uma sequência de nucleotídeos de proteína de Bt compreendem pelo menos cerca de 59, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 799, 800, 900, 1000, 1050,

1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1860, 1870, 1880, 1885 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos codificando proteína de Bt de comprimento completo divulgada neste documento (por exemplo, 1890 nucleotídeos para US 2009./8099081, publicado em 18 de abril de 2009. Aqui estas sao fornecidas como SEQ ID NO: 1 e

2, 1805 nucleotídeos para SEQ ID NO: 4, 1743 nucleotídeos para SEQ ID NO: 6, 7, 8 e 16, 1809 nucleotídeos para SEQ ID NO: 10 é 1752 nucleotídeos para SEQ ID NO: 12 e 14, na listagem de sequências) dependendo do uso pretendido. Por nucleotídeos contíguos queremos dizer resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adjacentes um ao outro. Fragmentos das sequências de nucleotídeos da presente invenção codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína de Bt e, daí, retêm atividade pesticida. Por reter atividade queremos dizer que o fragmento terá. pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína de Bt. Métodos para medira a atividade pesticida são bem conhecidos na. arte. Ver, por exemplo Czapla e bang (1.990) J. Econ. Entomol. 83; 2480-2485; Andrews et al. (1938) Biochem. J, 25.2:199-206; Marrone et al. (1985) j. of .Economic Entomology 78:290-293; e Patente US 5.743.477, todas as quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade e todas as sequências identificadas pelo número especifioamente incorporadas por referência.

[485] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos codificando proteína de Bt que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção codificará pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 109, 125, 150, 175,- 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,- 550, 560, 570, 575, 580, 585, 590, 595., 600 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em. uma proteína de Bt de comprimento total da invenção (por exemplo, 580 aminoácidos para SEQ ID NO; 41, 602 aminoácidos para. SEQ ID NO; 43, e 583 aminoácidos para SEQ ID NO

1.98 e 47),

[487] Proteínas de Bt preferidas da presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficíentemente idêntica à sequência de nucleotídeos de US 2089/0099081, publicado em 18 de abril de 2009, todo o qual é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, e todas as sequências identificadas pelo número especificamente incorporadas par referência, sequências 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 14, 16, or 17. Por «suficientemente idêntica queremos dizer uma sequência de aminoãcido ou nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70%' ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência, em comparação com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento descritos neste documento, usando parâmetros padrão. Alguém versado na técnica reconhecerá que estes valores podem ser ajustados apropriadamente para determinar a correspondente identidade de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeo levando em conta degeneração de códon, similaridade de aminoãcido, posicionamento de estrutura de leitura e afins.

[488] A invenção também engloba, moléculas de ácido nucleico variantes (por exemplo, ü'S 2809/8899081, publicado em 18 de abril de 2009, toda o qual é aqui incorporados per referência na sua totalidade e todas as sequências identifiçadas pelo número especificamente incorporadas por referência, sequência 2 é uma variante das sequências 1; as sequências 7 e 8 são variantes das sequências 6; a sequêncialO é uma variante das sequências 4 e 12; e a sequência 14 é uma variante da sequência 12). “Variantes” das sequências de nucleotídeos codificando proteína de Bt incluem aquelas sequências que codificam a proteína de Bt divulgada neste documento, mas que diferem conservativamente devido ã degeneração do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas, como discutido ac ima<

[489] variantes alélics ocorrendo naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tal como técnicas de hibrídização e de reação em cadeia da polimerase (PCB.), conforme descrito abaixo. Sequências de nucleotideo variantes também incluem sequências de nucleotídeo sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, usando mutagênese dirigida sítio, mas as quais ainda, codificam proteínas da proteína de Bt divulgadas na presente invenção, como discutido abaixo. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a desejada atividade biológica da proteína nativa, isto é, reter a atividade pesticida. Por «reter atividade queremos dizer que a variante terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca da 70%, ou pelo menos cerca de 88% da atividade pesticida, da proteína nativa. Métodos para medira a atividade pesticida são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Ecos. Entomol. 83; 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) <J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente US 5.743.477, todas as quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade e todas as sequências identificadas pelo número especificamente incorporadas por referência.

[490] Exemplos da Geração de Genes de Bt Sintéticos e

Variantes

200/273

[491] Em um aspecto da invenção, sequências axmi-004 sintéticas foram geradas, por exemplo synaxmi-004, US 2009/0099081, publicado em 18 de abril de 2009, todo o qual é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, e todas as sequências identifiçadas pelo número especificamente incor-poradas por referência, (sequência 1) e synaxmi-004B {sequência 2}. Estas .sequências sintéticas têm uma sequência de DNA alterada em relação à sequência axmi~0G4 (sequência 3) recitada em US 7.355.099, toda a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade e todas as sequências identificadas pelo número especificamente incorporado por* referência.} e codificam a proteína AXMI-004 original. Do mesmo modo, synaxmi-

O04B-2M (sequência 4) foi projetada e codifica o sítio de partida alernativo de axmi-004 (nesta documento denominado como axmi~0O4B”2M e estabelecido na sequência 5} originalmente identificado no pedido da patente US 10/782.020.

[492] Em outro aspecto da invenção, um terceiro sítio de partida foi identificado na sequência de codificação axmi-004.

Esta região de codificação é designada axmi-004B-:3M (US

2009/0099081, publicado em 18 de abril de 200.9, todo o qual, ê aqui incorporado por referência na sua totalidade e todas as sequências identificadas pelo número especificamente incorporadas por referência, sequência 16) e codifica a sequência de aminoácidos ÂXMI-004B-3M estabelecida na sequência

9. Sequências sintéticas que codificam a proteína AXMI~OO4B~3M também foram projetadas. Estas sequências de nucleotídeos sintéticos foram designadas synaxmi~0O4B-3M, synaxmi-O04~C-3M e synaxmi-004D~3M e estão estabelecidas nas sequências 6, 7 e 8, respectívamente. Em outro aspecto da invenção, versões modificadas da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína

201/2 73

AXMI-O04B--3M foram projetadas de modo que resíduos N~terminal adicionais sejam adicionados à proteína, codificada. Estes sequências são designadas synaxmi-0O4B-3M-altl (us 2009/0099081, publicado em 18 de abril de 2009, sequência 10), synaxmi-004B3M~alt2 (sequência .12) < synaxmi-O04B~3M~alt3 (sequência. 14) e cynaxml-G04B--3M~alt4 (sequência 17) . As proteínas codificadas são designadas AXMX-004B-3M-ALT1 {sequência 11) , AXMX-G04B-3MALTS {sequência 13), AXMX-004B-3M-M.T3 (sequência 15} e AXMX0O4B-3M-ALT4

[493] (sequência 18) .

[494] Outras proteínas de Bt e descrições de gene podem ser encontradas a seguir. Toda e qualquer publicação de patente referida abaixe com uma nota sobre a toxina de Bt à qual a publicação se refere, por este meio é incorporada por referência na sua totalidade. Estes documentos também foram publicados e eles e suas sequências são de domínio público.

[495] Mais exemplos de genes de Bt, proteínas e dos documentos de patentes que os descrevem são encontrados nas Tabelas 4, Se 6' abaixo.. Os documentos de patente nas Tabelas 4, 5, 6, em particular as Patentes UE e os pedidos US, são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade.

[495] Tabela 4. Toxinas de Bt

toxina	MawraSs Patentes ou OMfeaçíta tía	Τ4ΒΚΛ8	0« wm l-srnMa «« py&lkaçSo 6«
CM	952903046726. 95 6833449, C0126O397, 0S2O1Õ25938,, 992806174372,052086174373.	Crv? Cryg CM	C0395325
	95643241., 956233004,	CM	U52CS3O1796
	052004194155.956573348,	CM	»02806053473, 992007245430,
	955434409,955487825,	CM	1'0208609347
	955135867, 955855294,	CM	052097061911
CsYl	»82807.187382, 056655873.	CM	1'0200809620
	»02084820636, 9.53007661919, 056048830.953807061919, A9764649S, 952607061919,955150581	CM	052087061811958448226, 992005097833, »02805968202, 955143580, 996028246,056727489,
	055679341955816313.955322687,	CM	952005697639, »02005966202,
CM	»02007.187382, 952886174372,	CM	O5897W5,
	052085891714. 952904058880, 952008020953, 086043415, 955842664,	CM	Â07846468.0520070743^, 95735100
CM	»02087107303, 952807081919,	CM2	MXÓA020WO
	956173201	CM2	992804818982,. 056166191
CM	»083882810, MX9600203,055530395,		958077937, 995824792,055753482,
	085487621 955845461	CM3	992004018982,058166195,
CM	952000174372,		955077937, 055824392,056753482,
CM	053087061811	CM4	^2007095895. 955831011,
4.0'1	992807001939,	CM1	955831011,955670368.
CM.	082007061811070401772, 956083605.	CM2	9520062188^, 982001010932,
CM	052007061921AV78464W, 085723758,		ΜΧίΆ81804361,055824782,
	956616319,055366623,95532268?	CM2	952083229819.
Co'l	055723758	CM3	982005053322,052803144192,
CM	041942582,»09848490, 0830878618.119Â75S78,		9A75317,0S6.3893M 935326351,, 056349620,
	MX8M38051.38,953003167517,	CM6	95200315001
	U561O7278,056096708, 955073632,	Cfv28	05209318091
	087203474. 957244880,	CM1	CA2419153,
CO'3	952902152486,892278161,	CM4	95209318782
	053083854393,	CMã	952003187532,
coe	955837237,. 955723756,955683893, 085184974,994096158,	CM7	052086051822.952003144152, 9Â75317.956398330, 986326331.
CM	965837237,085723756,		966949626,
Coô	WQ9840491, 062004026982,986166295,	CM3	95200527164
	953002028932,955985831,055824792,	Cytl	WÔ2087027776,
	95538153	CM	9561501.65,
CM cm CM CM'	54'92007052004,082001010932.. 958324702, 1'02007052084,052004018982, 06597323.1, 055874286.095236843, 05683186 953004028982,056286195, 056043831 95TT.M .. 955378625, 95513709	Cyt2	952007198000, 601681381. 956683482. 956537756,

[497] Tabela 5

Híbridas e Patentes.

Proteínas de Cristal inseticida

	T-ròste ítetetw*
	Crym»
usxomm?	emc«
US2SÔ?24S4SO	UyMa
usaoosomss	CryMs
isseosnosss	CfylCb

[498]

Tabela 8«

Patentes Referentes a Outras Proteínas de Cristal Inseticida Híbridas

&V?.3A, UvsJA	ysni-r$$
CryiA	womss?
!>XÃ, OW	unnrioo
CylA, CrylC	auxxhb&sx®
GfySSA.CtySFA	usxrvwm
CrySA, Cyli, Cry 18	yymmm
ο-γη, uw. .cm«	yszm»S523
Cryi?\. CryiC Cryl£> CrylS	m?s»s
CrylÁ, CryIF	U82S!5SQ4?m

n«íòá& es feats'	[ Fatemss* I W»»Wí4W«»MM»KWWW«WMWXWWM»»»»»XWW»»W»\WV>»«mWVWWWWWWW<««WíWW^^
CryXA, CryiC	[ y^smi, usssnzos 1

204/273 csyír eryíA, cm* | weww, vsnsosn,

WWW, VSSi5SS7§

USaC^wa^-?,

[4.99] A listagem de sequências inclui sequências de Bt SEQ. 113. NG;s 33-533. Estas sequências incluem exemplos de sequências de proteína de Bt e proteína Cry e Cyt. Exemplos são numerosos e aqueles versados na técnica saberíam de muitos outros exemplos de várias sequências de Bt que são substitutos adequados para aquelas nesta divulgação.

[500] ú sçãg IV ♦ Composições Fgs t4ó idas e Rendimentos de Rianta Crescents

[501] Os polipeptídeos ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados ã área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos e composições. Estes compostos podem ser' fertilizantes, exterminadores de ervas daninhas, crioprotetores, surfactantes, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros e/ou formulações transportadoras de liberação no tempo ou biodegradáveis que permitem dosagem de longo prazo de uma área de alvo após uma única aplicação da formulação. Eles também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, vdrucídas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bacteriocidas, nematocidas,· moiuscicidas ou misturas de várias destas preparações, se desejado, juntamente com outros transportadores agriculturalmente aceitáveis, surfactant.es ou adjuvantes que promovem aplicação habitualmente empregados na técnica de formulação. Transportadores e adjuvantes adequados podam ser sólidos ou líquidos e correspondem ãs substâncias ordinariamente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias

208/273 minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersastes, agentes umectant.es, agentes de pegajosidade, ligantes ou fertilizantes. Da mesma forma as formulações podem ser preparadas em iscas” comestíveis ou formadas em «armadilhas* para pragas para permitir alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[502] Métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que contém pelo manos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacterianas da presente invenção incluem aplicação de folha, revestimento de semente e aplicação ao solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade de infestação pela praga correspondente.

[503] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, spray, emulsão, coloide, solução, ou afins, e pode ser preparada por meios convencionais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas essas composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[504] Pragas de lepiddpteros ou coleõpteros podem ser mortas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da invenção, ou podem ser aplicadas profilaticamente a uma ãrea ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferancialmente a praga ingere, ou ê posta em contato com, uma quantidade pesticidamente eficaz do polipeptídeo. Por «quantidade pesticidamente eficaz* queremos dizer uma quantidade do pesticida que é capaz de provocar morte de pelo menos uma

206/2 73 praga, ou visivelmente reduzir o crescimento da praga, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal. Esta quantidade variará dependendo de tais fatores como, por exemplo, as pragas de alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, localização, planta, cultura ou sítio agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, a taxa, a concentração, a estabilidade, e a quantidade de aplicação da composição de polipeptídeo pesticidamente eficaz. As formulações podem também variar com relação às condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação da praga.

[505] As composições pesticidas descritas podem ser feitas formulando cada célula bacterlana, suspensão de cristal e/ou esporo ou componente de proteína isolada com o transportador agricolamente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em um meio adequado, tal como liofilizadas, secas por congelamento, dessecadas ou em um transportador aquoso, meio ou diluente adequado, tal como salina ou outro tampão. As composições formuladas podem ser na fom de um pó ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral), ou água ou emulsões õleo/água ou como um pó umectante ou em combinação com qualquer outro material transportador adequado para aplicação agrícola. Transportadores agricolamente adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na arte. O termo transportador agricolamente aceitável” abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, promotores de pegajosidade, ligantes, etc. que são ordinariamente utilizados em tecnologia de formulação de pesticida; estes são bem conhecidos daqueles versados na formulação de pesticida. As formulações podem ser

207/273 misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por diversos maios, por* exemplo, misturando de forma homogênea, combinando e/ou moendo a composição pesticida com adjuvantes apropriados usando técnicas de formulação convencionais. Formulações adequadas e métodos de aplicação são descritos na Patente US 6.468.523, incorporada neste documento por re f erênc i a..

[506] Métodos para Aumentar Rendimento de Planta

[507] Métodos para aumentar rendimento de planta são fornecidos . Cs métodos compreendem introduzir em uma planta ou célula de planta um polinucleotídeo compreendendo uma sequência pesticida divulgada neste documento. Conforme definido neste termo, o rendimento da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por biomassa” queremos dizer qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto de planta medido. O aumento do rendimento de planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Além disso, o aumenta da biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos industriais ou farmacêuticos derivados da planta. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumenta estatisticamente significativo incluindo, mas não limitado a, pelo menas um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%\ pelo menos um aumento de 101, pela menos um aumento de 20%, pelo menos um de 30%, pelo menos um de 50%, pelo menos um de 70%, pelo menas um de 100% au um maior aumento no rendimento em comparação com uma planta não expressando a sequência pesticida.

[5083 Em métodos específicos, rendimento de planta é aumentado como resultado de resistência a praga melhorada de uma planta expressando uma proteína pesticida divulgada neste documento» Expressão da proteína pesticida resulta em uma capacidade reduzida de uma praga infestar ou se alimentar na planta, melhorando assim o rendimento da planta.

[509] Seção V» Transformações de Slants

[510] Qualquer combinação dos componentes principais de proteína de motif ICK e ou proteína de motif WF e proteína de Bt pode ser combinada em um PIP. Nós divulgamos também a adição de ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico) e uma proteína de estabilização translacional e ligante interveniente. a fim de criar um PIP superior (protetor incorporado na planta) e expresso em como um PEP (Peptídeo Expresso em Planta), contanto que um mínimo de ambas proteína de Bt e motif XCK seja usado, é preferível usar estes dois peptídeos em combinação com ERSP. Moti TMOF também pode ser usado com ou substituir o motif ICK» Estas composições podem ser criadas, usadas como um PEP e expressas como um PIP.

[&11] Nós descrevemos métodos para aumentar a eficácia da expressão de planta, aumentar o acúmulo de proteínas expressas em planta e aumentar dramaticamente a atividade inseticida de proteínas expressas em planta. Nós descrevemos ter dirigir a proteína de motif ICK para o Retículo Endoplasmático (ER) por uma Proteína de Sinalização de Retículo Endoplasmático (ERSP) em plantas a fim de proporcionar a correta •reticulação covalente de pontes dissulfeto de peptídeo as quais geram a estrutura de motif ICK terciária essencial requerida para atividade inseticida» Nós ainda descrevemos dirigir o complexo de proteína de motif ICK para o ER por uma ERSP em plantas com um domínio de proteína de estabilização translacional adicionado a fim de aumentar o tamanho da proteína de fusão ICK resultante a qual intensifica o acúmulo de peptídeo na planta. Nós ainda descrevemos dirigir a proteína de motif ICK para o ER por uma ERSP em plantas com uma proteína de estabilização translacional adicionada como acima e com uma sequência de peptídeo interveniente adicionada, o último dos quais permite divagem potencial e a recuperação da forma ativa da. proteína de motif ICK tendo atividade inseticida.

[512] Esta invenção descreve as proteínas de motif ICK com atividade inseticida, que são expressas em planta e as quais podem proteger com sucesso uma planta ou colheita de danos de inseto. Os métodos ensinados neste documento habilitarão peptídeos a não só serem expressos em uma planta, mas serem expressos e dobrados devidamente, de modo que eles mantenham, sua atividade inseticida mesmo depois de expressão na planta.

(513] Nós descrevemos como a. estrutura de leitura aberta (ORF) de um peptídeo alvo, tal como um peptídeo de motif XCK, deve ser modificada a fim de que a atividade biológica desejada permaneça após a expressão na planta do peptídeo de motif XCK. Em uma modalidade nós descrevemos um Protetor de Planta Incorporado, ou .PXP, que expressa uma proteína inseticida ativa. A proteína inseticida PXP e compreendida de um Peptídeo Sinai de .Retículo Endoplasmático (ERSP) operavelmente ligada a um Peptídeo Inseticida Rico em Císteína (CRXP), ou Proteína de motif de Nó de Cistina Inibidor (ICK) em que o referido ERSP é o N-terminal da referida proteína de motif ERSPrlCK. ligada. A proteína inseticida PXP é, então, incorporada em uma planta de escolha para dar resistência a inseto à planta. As células da planta expressão e acumularão a proteína inseticida de motif XCK devidamente dobrada, Quando um inseto consome as células da planta, a proteína inseticida de motif ICK devidamente dobrada se distribuirá dentro do inseto, onde ela terá atividade inseticida e fará com que o inseto ou desacelere ou paralise sua alimentação, desacelere seus movimentos e desacelere ou paralise a reprodução, todos os quais fornecem proteção para a planta contra dano de inseto.

[ 514] Nós de s crevemos	sister	nas de express	ão transient	:.es
para expressar vários casset*	as de	expressão de	planta.	Gm
transgene expresso que usamos	é Prot	;eína Flúores cs	ente Verde,	ou

GFP, que ê detectável visualmente quando excitada por luz UV. O sistema de expressão transients de GFP que nós utilizamos para a avaliação de proteínas transgênícas de planta é para todos os fins práticos equivalente ã utilização de um sistema de planta transgênica estável para estes tipos de avaliações.

[515] 0 motif de CRIP, XCK, TI4CF, anêmona de mar pude ligada ao ERSP.

[516] Para a proteína inseticida de motif ICK ser dobrada adequadamente quando ela for expressa de uma planta transgênica, ela deve ter um ERSP fundido na estrutura com a proteína inseticida de motif ICK.» Isto também pode ser feito com um motif TMOF. Isto pode ser realizado da várias maneiras. Ver Figs. 1, 2 e 3. A proteína deve ser roteada através do ER onde se formam as conexões de ligação covalente corretas para formação de ligação dissulfeto adequada. Sem querer estar vinculado pela teoria, acreditamos que o roteamento de ER resulta na estrutura terciária correta da proteína de motif ICK. É comumente postulado que tal roteamento é alcançado por um componente celular chamado uma partícula de reconhecimento de sinal? a partícula de reconhecimento de sinal lioa ao ribossoma traduzindo a proteína, ela pausa a tradução e ele transporta o complexo ribossoma/mRNA para um poro translocador no ER, onde o xibossoma, então, continua a tradução e enrola a proteína resultante no ER. Dentro do ER o ERSP é clivado e a proteína ê trabalhada por processos de modificação põe-translacionais no ER. Uma vez que tal processo envolve isomerases de dissulfeto de proteína, uma classe de proteínas que catalisa a formação de ligações dissulfeto. sem quaisquer sinais de proteína de

retenção	adicionais, a	proteína	é transportada através do ER
para o aparelho golgi,	onde ela	é fínalmente secretada fora da
membrana	do plasma e pa	ra o espa	ço apoplásico. Sem querer ser
vinculado	pela teoria,	pensamos	que as proteínas, tal como
proteínas	inseticidas,	que têm	um motif ICK, precisam ser
roteadas	através do El	X, a fim	de que as proteínas tenham

formação de ligação dissulfeto correta, se elas forem expressas em plantas.

[517] A ERSP (Proteína de Sinalização de Retículo

Endoplasmãtico).

[518] Além do texto abaixo, ver Parte I - 1 (0 componente de EERSP ou ersp dos PEPs.

[519] A ERSP estã na região N-terminal do complexo de proteína da motif ERSP*ICK e a porção de ERSP é composta de cerca de 3 a 80 aminoácidos. Em algumas modalidades ela é de 5 a 50 aminoácidos. Em algumas modalidades ela ê de 10 a 40 aminoácidos, mas frequentemente é composta de 15 a 20; 20 a 25; ou 25 a 30 aminoácidos. 0 ERSP é um peptídeo sinal assim chamado porque ele dirige o transporte de uma proteína. Peptídeos sinal também podem ser chamados de s-inaís alvo, sequências sinal, peptídeos de trânsito ou sinais de localização. Os peptídeos sinal para direcionamento de 'ER são frequentemente de 15 a 30 resíduos de aminoãoide de comprimento e têm uma organização tripartite compreendida de um núcleo de resíduos hidrofdbicos flanqueado por um aminoterminal positivamente carregado e um polar, mas região carboxiterminal não carregada. Ver; Eimmermann, Richard; Eyrisch, Susanne; Ahmad, Mazen e Helms, Volkhardí «Protein translocation across the ER membrane* Biochimica et Biohysica .Acta 1808 (20:11} 912-924, Elsevier.

(520} Cerca de metade e muitas vezes mais do ERSP geralmente é compreendida de aminoácidos hidrofôbicos< mas a porcentagem de aminoácidos em um ERSP que são hidrofdbicos pode variar. Sem querer ser vinculado por qualquer teoria de como a invenção funciona, achamos que os aminoácidos hidrofôbicos colam na membrana do ER após tradução e isto permite a peptidase de peptídeo sinal clivar o ERSP fora da proteína traduzida, liberando a proteína de motif ICK para o ER. Muitos ERSPs são conhecidos. Muitos ERSPs de planta são conhecidos. NÃO é necessário que o ERSP seja derivado de um ERSP de planta, ERSPs não de planta trabalharão com os procedimentos descritos neste documento. Muitos ERSPs de planta são, no entanto, bem conhecidos e nós descrevemos alguns ERSPs derivados de planta aqui. BAAS, por exemplo, ê derivado da planta, Hordeum vulgare.

[521] Outro exemplo de um ERSP usado aqui é BAAS, a sequência de BAAS ê MANKH LSLSX, FLVLL GLSAS LASG (SEQ ID NO; 1035 código de uma letra)

[522] Este peptídeo, denominado ^ttBAAS^w é clivado do motif de XCK mediante a tradução de proteína no ER. O peso molecular ê de 2442,94 Daltons. Figs. 1-3 mostram uma representação de uma. proteína de motif ICK ligada a um ERSP. Estas figuras igualmente poderíam representar uma proteína de motif TMOF ligada a um ERSP.

[523] ERSPs de planta as quais são selecionados da sequência genõmíca para proteínas que são conhecidas par serem expressas e liberadas para o espaço apoplásico de plantas, e alguns exemplos são BAAS, extensina de cenoura, PR1 de tabaco. As seguintes referências fornecem, descriçõs adicionais e são incorporadas por referência neste documento om suas totalidades. De l«oose, M. et al. The extension signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts* Gene, 99 (1991) 95-100< De boose, M. et al. descreveram análise estrutural de um gene de codificação de extensina de Nicotians piumbaginifalia, a sequência do qual contém um peptídeo sinal típico para translocação da proteína para o retículo endoplasmãtico. Chen, M.H. et al. Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells* Plant Physiology, 2004 Jul; 135(3): 1367-77. Epub 2004 Jul 2. Chen, M.H. et al. estudaram a localização subcelular de o-amilases em células de plantas analisando a expressão de o-amilase, com a sem seu peptídeo sinal, em tabaca transgênico, Estas referências e outras ensinam e divulgam as proteínas de estabilização translacional que podem ser usadas nos métodos, procedimentos e complexos e constructos de peptídeo, proteína e nucleotideo descritos neste documento.

[524] A proteína da estabilização translacional.

[525] Além da texta abaixo, ver Parte I - III (O componente de proteína de estabilização translacional, STA ou

[526] Os procedimentos descritos acima se referem a fornecer um ERSP * GRIP onde ERSP * CRIP poderíam ser ERSP * ICK, ERSP 4 Não ICK, ERSP * Αν (ANÊMONA DO MAR) ou cs procedimentos poderíam se referir a ERSP * w, ou eles poderíam se referir a ERSP 4- CRIP e um TMOF suficiente para fazer uma planta produzir peptídeos devidamente dobrados. Nós sugerimos também que para proteger mais plenamente uma planta de alguns insetos·, mais do que apenas dobrar adequadamente é âs vezes necessário. Com um. cassete de expressão construído adequadamente, uma planta pode ser induzida a fazer e acumular quantidades ainda maiores de peptídeo tóxico. Quando uma planta acumula quantidades maiores de peptídeos CRIP ou tmcf tóxicos devidamente dobradas ela pode mais facilmente resistir ou matar* os insetos que atacam e comem as plantas. Uma maneira de aumentar a atividade inseticida da

PIP é com proteínas de estabilização translacional.

A proteína de estabilização translacional pode ser usada para aumentar signíficativamente α acúmulo do peptídeo tóxico na planta e, assim, a potência da PIP, especialmente quando a PIP tem uma proteína de estabilização translacional própria. Os procedimentos aqui descritos podem fornecer a acumulação na planta de transgênica expressando grandes quantidades das proteínas de planta agora devidamente dobradas. Plantas transgênicas tanto uma proteína inseticida de motif XCK quanto uma proteína de estabilização translacional demonstram dramaticamente acumulação melhorada de peptídeos tóxicas ICK sobra sistemas sem uma proteína de estabilização translacional.

PI Ps representativas cam uma proteína de translacional são aqui descritas.

[527] Experimentos comparando peptídeos planta tanto com quanto sem uma proteína, de estabilização expressos em estab!1ização translacional mostram diferenças dramáticas.

A expressão de proteína de uma proteína de motif ICK sem uma proteína de estabilização translacional pode ser muito baixa. Quando uma proteína de estabilização translacional é fundida à proteína de motif ICK, existem níveis mais altos de acumulação detectável. A proteína de estabilização translacional. pode ser um domínio de outra proteína ou ela pode compreender uma sequência de proteína inteira. A proteína de estabilização transi acionai é uma proteína com estrutura terciária suficiente que ela pode acumular em uma célula sem ser alvo pelo processo celular de degradação de proteína. A proteína pode ser entre 5 e 50aa (por exemplo, outra proteína de motif ICK}, 50 a 250aa (GNA), 250 a 7S0aa (por exemplo, quitinase) e 750 a 1500aa (por exemplo, enhancina).

[528] A proteína de estabilização translacional (ou domínio de proteína) pode conter proteínas que não têm outras características úteis que não estabilização de tradução ou elas podem ter outros traços úteis além da estabilização de translacional. Uma modalidade da proteína de estabilização de tradução pode ser múltiplas proteínas de motif ICK em tandem. Características úteis podem incluir: atividade inseticida adicional, tal como atividade que ê destrutiva para a membrana peritrôfica, atividade que é destrutiva para a parede do intestino e/ou atividade que transporta at.ivamente a proteína de motif ICK através da parede do intestino. Uma modalidade da proteína de estabilização translacional pode ser um polímero de proteínas de fusões envolvendo proteínas de motif ICK. Uma modalidade da proteína de estabilização translacional pode ser um polímero de proteínas de fusões envolvendo proteínas de motif TMOF. um exemplo específico de uma proteína de estabilização translacional é fornecido aqui para ilustrar o uso de uma proteína de estabilização translacional. O exemplo não se destina a limitar a divulgação ou as reivindicações de qualquer maneira. Proteínas de estabilização translacional úteis são bem conhecidas na arte, e quaisquer proteínas deste tipo poderíam ser usadas conforme divulgado neste documento. Procedimentos para avaliação e testes de produção de peptídeos são ambos conhecidos na arte e aqui descritos. Um exemplo de uma proteína de estabilização translacional é S'EQ ID NO: 1036, código de uma letra, como a seguir;

[529] SEQ XD NO: 1036 (código de uma letra).

ASKGE ELFTG WPXL VELDG DVRGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT

GKLPV PWPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPS GYVQE RTISF

KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV FRIEL KGIDF KEDGN XLGHK LEYNY NSHNV

YXTAD KQKNG XKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY

LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK

[530] Seq. XD No. 1036 ê Denominada GFP. O peso molecular é de 26736,02 Daltons.

[531] Exemplos adicionais de proteínas de estabilização translacional podem ser encontrados nas seguintes referências, incorporadas por referência na sua totalidade: Kramer, K.J. et al. * Sequence of a cDNA and expression of the gene encodingepidermal and gut chitinases of Manduca sexta Insect Biochemistry- and Molecular Biology, Vol. 23, Edição 6, setembro 1993, pp. 691-701. Kramer, K.J. et al. isolaram e seguenciaram urn cDNA codificando quítinase de lagarta do tabaco, Manduca sexta. Hashimoto, Y. et al. Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the

Trlchcylosia ni granulosis virus Journal of General Virology, (1991) , 72, 2645-2651. Hashimoto, Y. et al. clonaram o gene codificando o fator de intensificação viral de urn virus granuloso Trichoplusia ni e dete.rmina.ram a sequência de nucleotídeos completa. Van Damme, E.J.M. et al. Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin* European *Toumal of Biochemistry, 202,, 23-30 (1991} . Van. Damme, E.J.M. et al. isolaram ENA rico am Poli (A) de ovários amadurecidos de lectina snowdrop, rendendo um único polipeptideo de lectina de 1? kDa mediante tradução em sistema isento de célula de germe de trigo. Estas referências e outras ensinam e divulgam as proteínas de estabilização translacional que podem ser usadas nos métodos, procedimentos e complexos e construetos de peptídeo, proteína e nucleotídeo descritos neste documenta >

[532] Ligante Interveniente

[533] Além do texto abaixo, ver Parte X - IV (O componente de Peptídeo Ligante interveniente, LIGANTE, ligante,· L ou se polinucleotídeo: ligante ou 1 dos PBPs.

[534] Esta invenção também incorpora um ligante interveniente entre proteína de motif XCK e a proteína de estabilização translacional< O ligante interveniente é de entre 1 e 30 aminoácidos. Ele pode ter ou nenhum sítio de divagem ou um sítio de divagem de protease específico para serina, treonina, cisteína e aspartate proteases ou metaloproteases. 0 ligante clivável pode ser o ponto de digestão por proteases encontrado no ambiente o intestino de lepidõptero e/ou no ambiente de hemolinfa de lepidóptero> Um exemplo do componente adicional para ilustrar esta invenção estã listado abaixo, mas ele não estã limitado a este exemplo.

[535] O exemplo para um ligante interveniente é XGER (SEQ XD NO: 1037)

[536] Denominado IGER Q peso molecular deste ligante interveniente é de 473.,53 Daltons <

[537] Outros exemplos de ligantes intervenientes podem ser encontrados nas seguintes referências as quais são incorporadas por referência neste documento na íntegra: uma comparação do comportamento de dobramento de proteínas fluorescentes verdes através de seis diferentes ligantes é explorada em Chang, H.C. et al. «De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bactet'ia Journal of Noiecuiar Biology, 20Q5 out 21; 353.(2); 397-409. Uma isoforma da família GalEAc~Ts humana, GalBAc-T2, foi mostrada reter sua localização e funcionalidade mediante expressão em plantas benthamiana por Daskalova, S.M. et al. «Engineering of N, benthamiana L. plants for production of Nacetylgalactosamine-glycosylated proteins BMC Biotechnology, 2010 Ago 24; 10: 62. A capacidade de proteínas de plastideo enddgenas se deslocarem através de estrêmulos foi mostrada em Kwok, E.Y. et al. «GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids” Journal of Experimental Botany, 2004 Mar; 55(397): 595-604. Epub 2004 Jan 30. Um relatório sobre a engenharia da superfície do vírus mosaico do tabaco (TMV), virion, com um fator oostãtico de modulação de tripsina (WP), de hormônio decapeptídeo de mosquito foi feito por Borovsky, D. et al. «Expression of Aedes trypsin-modulating oostabic factor on the virion of W: A potential larvicide Proc Natl Acad Eci, 2006 Dezembro 12; 103(50): 15963-18968. Estas referências e outras ensinam e divulgam as proteínas de estabilização translacional que podem ser usadas nos métodos, procedimentos e complexos e construetos de peptídeo, proteína e nucleotídeo descritos neste documento.

[538] conhecidas

Outras Transformações de Planta são mais bem

219/27 3

[53 9] Métodos da invenção envolvem introduzir um construto de nucleotídeo em uma planta. Por ®introduzir” queremos dizer apresentar a planta, o construct© de nucleotídeo de tal modo que o construct© ganhe acesso ao interior de uma célula, da planta. Os métodos da invenção não exigem que um método particular para introduzir um construct© de nucleotide© em uma planta seja usado, apenas que o construct© de nucleotide© ganhe acesso a© interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir constructos de nucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transients e métodos mediados por vírus.

[540] Por «planta® queremos dizer plantas totais, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de planta, propágulos, embriões e progênie da mesma. Células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura de

suspensão,	protoplastos, célula
células de	floewa, pólen).
[541]	®Plantas t rs	ou ^í#planta$

transformadas® ou plantas, ou células ou tecidos «estavelmente transformados” se referem a plantas que tenham incorporado ou integrado sequências de ácido nucleic© exógeno ou fragmentas de DNA na célula da planta. Estas sequências de ácido nucleic© incluem aquelas que são exógenas, ©u não presentes na célula de planta não transformada, bem como aquelas que podem ser endógenas, ou presentes na célula de planta não transformada. ®Heteróloga® geralmente se refere a sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas para a célula ou parte do genoma nativo na qual elas estão presentes e foram adicionadas ã célula por infecção, transfacção, mícroinjeção, eletroporação, microprojeção ou algo parecido.

[542] Transformação de células de planta pode ser realizada por uma de várias técnicas conhecidas na arte. O gene de proteína de Bt da invenção pode ser modificado para obter ou aumentar a expressão em células de planta. Tipicamente um construoto que expressa tal proteína ççnteria um promotor para conduzir transcrição do gene, bem como uma região não traduzida 3‘ para permitir a terminação de transcrição e poliadenilação< A organização desses constructos é bem conhecida na técnica, Em alguns casos, pode sei útil engenheirar o gene de tal modo que o peptídeo resultante seja secretado, ou de outro modo direcionado dentro da. célula de planta. For exemplo, o gene pode ser engenheirado para conter um peptídeo sinal para facilitar transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Também pode ser preferível engenheirar o cassete de expressão de planta para conter um íntron, de tal modo que o processamento do mRNA do íntron seja necessário para expressão.

[543] Tipicamente este “cassete de expressão de planta” será inserido em um vetor de transformação de planta”. Este vetor de transformação de planta pode ser compreendido de um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar transformação de planta. Por exempla, é uma prátiaa comum na arte utilizar ve tores de transformação de planta que são compreendidas por mais de um segmento de CM contíguo. Estes vetores são frequentemente denominados na arte como “vetores binários”. Vetores binários, bem como vetores com plasmídeos auxiliares, sãa mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrcbacteríum, onde o tamanho e a complexidade de segmentos de DNA necessários para alcançar a transformação

221/273 eficiente é bastante grande, e é vantajoso separar funções em moléculas de dna separadas. Vetores binários tipicamente contêm um vetor de plasmídeo que contêm as sequências de ação cis exigidas .para transferência de T--DNA (tal como borda esquerda e horda direita}, um marcador selecionável que ê engenheirado para ser capaz de expressão- em uma célula de planta e um “gene de interesse” (um gene engenheirado para ser capaz de expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também presentes neste vetor de plasmídeo estão sequências necessárias para replicação bacteriana. As sequências de ação cis são organizadas de uma forma a permitir transferência eficiente em células de planta e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e a proteína de Bt estão localizadas entre as bordas esquerdas e direita. Muitas vezes um segundo vetor de plasmídeo contém os fatores de ação trans que medeiam transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de planta. Este plasmídeo frequentemente contêm as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de planta por Agrobacterium e transferência de DNA por divagem em sequências de fronteira e transferência de ΏΝΑ vir-mediada, como é entendido na arte (Hellene e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para transformação de planta. 0 segunda vetor de plasmídeo não ê necessário para transformar as plantas por outros métodos, tal como miurcprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glícol, etc.

[544] Em geral, métodos de transformação de plantas envolvem transferência de X>NA heterólogo para células de planta alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas de suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguida pela aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas de um grupo de massa de células não transformadas. Sxplantes tipicamente são transferidos para uma fonte fresca do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Posteriormente, as células transformadas são diferenciadas em brotos depois de colocar no meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar broto ou plântula enraizada. A plântula transgênica, então, cresce em uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hieí et al. (1994) The Plant Journal δ:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Explantes tipicamente são transferidos para uma fonte fresca do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e dos métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células; células tanto transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer pedaço de calo alvo submetido ou tecido ou grupo de células. A capacidade de matar células não transformadas e permitir que células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transíormadas. Frequentemente, a capacidade da remover células não transformadas é uma limitação para a recuperação rápida de células de plantas transformadas e a geração bem sucedida de olantas transqênicas.

[545] Protocolos de transformação, bem como protocolos para .introduzir sequências nucleotídicas em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos incluindo, mas não se limitando a, microinjeção, e.letroporação, transferência de gene direta, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células de plantas (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeio de células de plantas com DNA estranho heterólogo aderido ãs partículas, aceleração de partícula balística, transformação de feixe de aerossol (Pedido Publicado us 20010026.941; Patente us 4.945.050; Publicação Internacional WO 91/00915; Pedido Publicado US 2002015066), transformação de Led e diversos outros métodos mediados diretamente por não partícula para transferir DNA.

[546] Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Pros. Natl. Acad. Bci. USA 67:8526-6530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab e Maliga (.1993) EMSO 0. 12:601-606. O método depende de distribuição por pistola de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e do alvo do DNA para o genoma de plastídeo por meio de recombinação homóloga. Além disso, transformação de plastídeo pode ser realizada por transativação de um transgene transmitido -por plastídeo silencioso por expressão preferida de tecido de uma RNA polimerase codificada nuclear e dirigida ao plastídeo. Tãl sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91x7301-7305.

[547] Em seguida ã integração de DNA estranho heterõlogo em células de planta, então, se aplica um nível de limiar máxima de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas putativamente que sobrevivem a este tratamento de seleção transferindo regularmente para um meio fresco. Por passagem contínua e desafio com seleção apropriada, se identificam e proliferam as células que são transformadas com o vetor de plasmídso. Métodos moleculares e bioquímicos, em seguida, podem ser usados para confirmar a presença do gene heterõlogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

[548] As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas de acordo com as formas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem, então, sex crescidas e polinizadas com a mesma, cepa transformada ou cepas diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva dá característica fenotípíca desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que a expressão da característica fenotípíca desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então as sementes colhidas para assegurar que expressão da característica fenotípíca tenha sido alcançada. Desta forma, a presente invenção fornece sementes transformadas (também denominadas como sementes transgênicas”) tendo um construct© de nucleotideo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em. seu genoma.

[549] Expressão de ICK a TMOF em plantas.

[5501 Como observado acima, há muitas alternativas que poderíam ser usadas para os componentes de ERSP, proteína de motif ICK, motif TMOF, proteína de estabilização translacional e 1igante interveniente.

[551] Avaliação de Transformações da Planta

[552] Apõs a introdução de DNA estranho heterõlogo em células de planta, a transformação ou integração do gene heterõlogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, tal como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ccm o gene integrado.

[553] Análise PCR é um. método rápido para triar células transformadas, tecido ou brotos para a presença de gene incorporado no estágio anterior antes de transplantar no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N.Y.). PCR é realizada usando iniciadores de oligonucleotídio específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor* Agrobacterium, etc.

[554] Transformação de planta pode ser confirmada par análise de Southern blot de DMA genõmico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em. geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição adequadas, fracionado em urn gel de agarose e transferida para uma membrana de nitrccelulose ou náilon. A membrana ou ’’blot⁸ é, então, sondada com, por exemplo, fragmento de DNA de alvo .sup.32P radiomarcado para confirmar a integração de gene introduzido na genama da planta, de acordo com as técnicas padrão (Bambrook e Russell, 2001, supra).

[555] Em análise Northern blot, o RNA é isolado de tecidos específicos de transformante, f.racionado em um gel de formaldeído agarose e manchado em um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente usadas na técnica (por exemplo, Sambrook e Russell, 2001, supra). Expressão de SN& codificado pela proteína de Bt é, então,· testado hibridizando o filtro para uma sonda radioativa derivada da uma proteína de Bt por métodos conhecidos na técnica (Bambrook e Russell, 2001, supra).

[556] Western blot, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar* a presença de proteína codificada pelo gene de proteína de Bt por procedimentos padrão (Bambrook e Russell, 2001, supra) usando anticorpos que ligam a um ou mais epítopos presentes .na proteína de Bt<

[557] Atividade Festiaída em PIantas

[558] Em outro aspecto da invenção, podem-se gerar plantas transgênicas expressando uma proteína de Bt que tem atividade pesticida. Métodos descritos abaixo, a título de exemplo, podem ser utilizados para gerar plantas transgênicas, mas a maneira pela qual as células de plantas transgênicas são geradas não é crítica para esta invenção. Métodos conhecidos au descritos na arte, tal como transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística e métodos mediados por não partícula podem ser usados. Plantas expressando uma proteína de Bt podem ser isoladas por métodos comuns descritos na técnica, par exemplo, por transformação de calo, seleção de calo transformado e regeneração de plantas férteis desse cala transgênicc. Em tal processo, pode-se usar qualquer gene como um marcador selecionável, contanto que sua expressão em células de plantas confira capacidade para identificar ou selecionar para células transformadas.

[559] inúmeros marcadores foram desenvolvidos para uso com células de plantas, tal como resistência a cloranfenicol, o aminaglicosídeo G418, higromicina ou semelhantes. Outros genes que codificam um produto envolvido no metabolismo de cioroplasto também podam ser utilizados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, genes que proporcionam resistência a herbicidas de planta, tal como glifosato, bromoxínil ou imidazolinona, podem encontrar uso particular. Esses genes foram relatados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene nitrílase de resistência a bromoxinil) ; s sathasívan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gene de resistência a imidazolinona AHAS). Além disso, os genes divulgados aqui também são úteis como marcadores para avaliar transformação de células bacteríanas ou de planta. Métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (par exemplo, folhas, caules, raizes, eto.), semente, célula de planta, propágulo,· embrião ou prcgênie da mesma são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada por testes para atividade pesticida.

[S80] Plantas férteis expressando uma proteína de Et podem, ser testadas para atividade pesticida e as plantas mostrando atividade ideal podem ser selecionadas para reprodução adicional. Métodos estão disponíveis na técnica para avaliar para atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Ver, per exemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

[561] Segão VI. XJssariçÕss e Exemplos de Cambínaçõas de CRIP e Rrotsína de Bt

[562] Os peptídeos de Bt e XCK podem inibir o crescimento, prejudicar o movimento ou até mesmo matar um inseto guando a combinação de toxina é distribuída adequadamente para o locus habitado pelo inseto. SDF 1234604, 1234605 e 609 são preparações de pós secas por spray de peptídeo híbrida*2-ACTXHvla, aqui “peptídeo Hvla”. Os pós de peptídeo Hvia seco par spray são feitos do peptídeo, vários excipientes e subprodutos de fermentação. As formulações *604 e *605 usam o mesmo peptídeo, apenas os excipientes são diferentes. A concentração do peptídeo híbrido ativo foi quantificada em cerca de 26% peso/pe-so em ambos os pôs *604 e *605» A concentração do peptídeo híbrido ativo foi quantificada em cerca de 35% peso/peso nos pós 609. 0 peptídeo Hvla em. cada pó foi quantificado utilizando métodos de rpHPLC Cl8 conhecidos por aqueles qualificados na arte.

[563] Peptídeos de nó de cisteína inibidor ou ICK podem ter estabilidade notável quando expostos ao ambiente. Muitos peptídeos ICK são isolados de animais venenosos, tal como aranhas, escorpiões e cobras. Proteínas de Bt são bem conhecidas por causa de suas atividades pesticidas específicas. Burpreendentemente, nós concluímos que, quando proteínas de Bt são seletivamente misturadas com peptídeos ICK, a combinação de peptídeos Bt e ICK produz um inseticida altamente eficaz com uma potência muito maior do que o esperado.

(564] Nós descrevemos uma composição de peptídeo de combinação inseticida o que compreende tanto uma proteína de Bt (Bacillus thuringisnsís); quanto um peptídeo ICK (Nó de Cistina Inibidor) inseticida. A composição pode set na razão de Bt para ICK, em uma base de peso seco, de cerca de qualquer uma das seguintes razões: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 6'5:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. Nós também descrevemos uma composição onde a razão de Bt para ICK, em uma base de peso seco é selecionada de cerca das seguintes razões: 0:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90,

3:95, 1:.99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99, ou qualquer comb inação de quaisquer· dois destes valores.

[583] os procedimentos descritos neste documento podem ser aplicados a qualquer peptídeo PFXP ou CRXP. A combinação de peptídeos PFXP e CRXP inclui cada um ou ambos os peptídeos PFIP e CRXP que são derivados de mais de 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos PFXP e CRXP. Por origens de cepa bacteriana queremos dizer que os peptídeos podem ser descritos como tendo sido expressos por uma cepa bacteriana que expressa os peptídeos com o entendimento de que muitos peptídeos PFXP incluindo muitas proteínas de Bt também são artificiais no sentido de que eles não são mais todos desenvolvidos de cepas bacterianas.

[335] Em outra modalidade a combinação de peptídeos PFIP e CRXP inclui cada um ou ambos o PFIP, tal como Bt, em combinação com peptídeos XCK, Não XCK e TMOF sendo derivados de mais de X tipo diferente ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e XCK. Por origens de cepa bacteriana queremos dizer que os peptídeos podem ser descritos como tendo sido expressos per uma cepa bacteriana que expressa os peptídeos com o entendimento de que muitas proteínas de Bt também são artificiais no sentido de que elas não são mais todas desenvolvidas de cepas bacterianas.

[567] Nós também divulgamos composições em que cada um ou ambos os PFXP, tal como Bt, em combinação com peptídeos ICK, Não XCK e TMQF são derivados de entra 2 e S, 2a 15, 2 a 30, 5 a xo, 5 a 15, 5 a 30, 5 a SC e vários outros tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt ou XCK. Nós divulgamos uma composição em que qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são codificados por de 2 a 15 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os -peptídeos de St e XCK. E qualquer uma destas combinações de 2 a S, 2 a 15, 2 a 30, 5 a 10, 5 a 1.5, .5 a 30, 5 a 50 e vários outros tipos e misturas diferentes de peptídeos de Bt e ICK podem contribuir mais do que pelo menos 1% de cada tipo de cepa para a composição·.

[568] Nós divulgamos composição de peptídeos de Bt e ICK das reivindicações 33 a 38 em que a concentração total de PFIP, tal como Bt, em combinação com peptídeos ICK, Não ICK e tmqf na composição é selecionada a partir das seguintes concentrações percentuais: 1, 5, 10, 1.5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 %, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a. percentagem restante da composição é compreendida de excipientes. Nõs divulgamos composições em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicíonalments um ERSP (Peptídeo Sinal de Reticula Endoplasmãtico) operativamente ligado aos peptídeos ICK, Não ICK e/ou TMOF peptídeo ICK inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo ICK inseticida> Nós divulgamos composições em que α peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicianalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Reticula Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo ICK inseticida, em que o ERSP é BAAS.

[569] Nds divulgamos composições em que o referido peptídeo de combinação é produzido usando um cassete genético que compreende ainda um dipeptídeo operativamente ligado ao peptídeo XCK inseticida, em que o referido dipeptídeo é ligado no N-terminal do peptídeo ICK inseticida; e em que o dipeptídeo ê compreendido de um aminoácido não polar no N~terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no C-terminal do dipeptídeo, incluindo modalidades em que o dipeptídeo ê glicina-serina, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida é qualquer peptídeo inseticida que inibe tanto os canais de Cálcio regulados em voltagem quanto os canais de potássio ativados por Cálcio em insetos, incluindo modalidades em que as origens de peptídeo ICK insecticida de qualquer espécie de aranha teia de funil da Austrália, incluindo modalidades em que a aranha é selecionada de aranhas teia de funil da Australia do gênero Atrax ou Hadronyche, incluindo modalidades em que a aranha é selecionada de aranhas teia de funil da .Australia do gênero Nadronyche, incluindo modalidades em que a aranha ê selecionada de teia de funil das Montanhas Azuis da Australia, Hadronyche versuta, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida ê Híbrido-ACTX-Hvla, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida contêm 20-180 aminoácidos e 2-4 ligações dissulfeto, incluindo modalidades em que o referido peptídeo ICK inseticida ê qualquer peptídeo ICK inseticida com pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, .96%, 97%, 98%, ou 99% OU maior identidade de sequência para qualquer uma das sequências ICK aqui reveladas, incluindo modalidades em que o peptídeo ICK inseticida é selecionado de publicações incorporadas por referência, incluindo as modalidades em que proteína de Bt ê qualquer proteína de Bt inseticida, incluindo modalidades em que a proteína de Bt ê uma proteína ou Cry ou Cyt, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é selecionada do grupo consistindo de uma Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TXC201, TIC407, TIC417, uma proteína inseticida binária CryETSO e CryET76, uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101, uma combi nação de uma proteína inseticida ET29 ou ET 3 7 com. uma proteína inseticida TIC810 ou TIC812 e uma proteína inseticida binária PS149B1, incluindo modalidades em que a proteína de Bt ê selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CzylA ou. uma proteína CrylF, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é uma combinação de proteína CrylF-CrylA, incluindo modalidades em que a proteína de Bt compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ã EEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28, ou 34 da Patente US 7.304.20$, incluindo modalidades em que a Proteína de Bt ê Dipel, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é Thuricide.

[570] Nós divulgamos uma composição que compreende os nucleotídeos de: Proteína de Bt (Bacillus thuríngiensis); e uma proteína ICK (Nõ Cistina Inibidor) inseticida, em uma planta transformada ou genoma de planta; onde a razão de Bt. para ICK, numa base de peso seco, é selecionada de cerca das seguintes razões: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35,

55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80,

15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, ou qualquer combinação de quaisquer do i s de s t. e s valore s.

[571] Nós divulgamos planta transformada ou genoma de planta em que a razão de PFIP, tal como peptídeos Bt para ICK, Não ICK e TMQ.F; e preferivelmente Bt para ICK, ou Bt para uma toxina, de Anêmona, numa base de peso seco, é selecionada de cerca das seguintes razões:

50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70,

5:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e

0,01:99,99, ou qualquer' combinação de quaisquer dois destes valores. A planta transformada ou o genoma de planta podem ter cada um ou ambos os peptídeos de Bt e ICK são derivados de mais

de	Itipc	diferente	ou erigem de cepa bacteriana	de pept	.ide©	a Bt
ou	XCK,	ou cada ·	om ou ambos os peptídeos de	Bt e	XCK	são
	ivados	de entre	2 e 5 tipos diferentes ou	origem	de	cepa

bacteriana de cada um dos peptídeos Bt ou XCK ou ambos os peptídeos Bt e XCK são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origens de cepa, ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de 2 a 15 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e ICK e pelo menos uma cepa de cada um de Bt ou ICK ou ambos os peptídeos de Bt e ICK codificados por mais do que uma cópia dos genes de Bt ou ICK, ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de mais de um tipo diferente ou de origem de cepa bacteriana de peptídeos de Bt e ou ICK onde todas as cepas de peptídeos St e/ou XCK contribuem em mais do que pelo menos 1% de cada tipo de cepa para a referida composição, ou cada um de ou ambos os peptídeos de Bt e ICK são derivados de 2 a S tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e ICK e pelo menos uma cepa de cada um de Bt ou ICK ou ambos os peptídeos Bt e ICK codificados por mais do que um cópia dos genes Bt ou ICK, ou a concentração total de peptídeo Bt e ICK na composição pode ser selecionada das seguintes concentrações percentuais: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 , ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

[572] As composições e plantas descritas neste documento inaluem um peptídeo de combinação inseticida produzido usando um cassete genético que compreende adicion.almen.te um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico) operativamente ligado ao peptídeo XCK inseticida, em que o referido ERSP é

234/273 ligada no N~terminal do peptídeo ICK inseticida» Em outra modalidade o peptídeo de combinação inseticida ê produzido usando um cassete genético que compreende adicionaImente um ERSP {peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo XCK inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo XCK inseticida, em que o ERSP ê BAAS. Numa outra modalidade a planta transgênica incorporando e expressando os peptídeos de combinação dos nucleotídeos aqui descritos, em que o referido peptídeo de combinação ê produzido usando um cassete genético que compreende ainda nucleotídeos que expressam um dipeptídeo operavelmente ligado ao peptídeo XCK inseticida, em que o referido dipeptídeo é ligado ao N~terminal do peptídeo ICK inseticida; e em que o dipeptídeo é compreendido de um aminoácido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no c-terminal do dipeptídeo> Em outra modalidade a planta transgênica tem um dipeptídeo que é glícinaserina. Em outra modalidade a planta transgênica tem peptídeos ICK inseticidas expressos que são compreendidos de uma combinação de peptídeo inseticida de proteínas XCK e Bt. As plantas transgênicas podem ter um peptídeo XCK inseticida derivado de qualquer espécie de aranha teia de funil da Austrália, ou aranhas teia de funil da Austrália do gênero Atrax ou Madronyche, e teia de Funil das Montanhas Azuis da Austrália, Hadronyche versata<

[573] Nós descrevemos e revindicamos uma planta transgênica em que o peptídeo XCK inseticida expresso ê HíbridoACTX-Hvla, e/ou o peptídeo ICK inseticida expresso pode conter 20-100 aminoácidos e 2-4 ligações dissulfeto e/ou o peptídeo XCK inseticida é qualquer peptídeo inseticida com pelo menos 50%, 53%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, OU

99% ou maior identidade de sequência para qualquer um dos peptídeos ICK descritos neste documento. As plantas transgênicas divulgadas podem conter qualquer proteína de Bt conhecida incluindo peptídeos onde a proteína de Bt é uma proteína Cry ou Cyt, e/ou a proteína de Bt ê selecionada do grupo consistindo em uma Cryl, Cry3, TXC851, CryÉT7Q, Cry22, TXC901, TIC201, TXC407, TXC417, uma proteína inseticida binária CryET80, e CryET76, uma proteína inseticida binária. TXCiOü e TXC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ou ET37 com uma proteína inseticida TXC810 ou TI.C812 e uma proteína inseticida binária. PS149B1. A proteína de Bt pode ser selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CryiA ou uma proteína CrylF, ou uma combinação de proteína CrylF-CryIA ou ela compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica ás BBQ ID NOs 10, 12, 14, 26, 28, OU 34 da Patente US 7.304.206. Nós descrevemos uma planta transgênica em que a proteína de Bt é Dipel e nós descrevemos uma planta transgênica em que a proteína de Bt ê Thuricide.

[574] Nós especificamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada expressando os peptídeos aqui descritos, onde a concentração média de peptídeo de Bt e ICK em uma folha média de uma planta transformada ê de cerca de: 1, 5, 10, 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores. Nós especificamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada expressando peptídeos tóxicos devidamente dobrados na planta transformada. Nós especificamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada que expressa peptídeos tóxicos de combinação devidamente dobrados na planta transformada e que causam a acumulação dos peptídeos tóxicos expressos e devidamente dobrados na referida planta e causam um aumento no rendimento da planta ou na resistência a danos por insetos e eles controlam pragas de insetos em lavouras e florestas. Nós descrevemos plantas feitas por qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento.

Nós compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que expressam quaisquer peptídeos descritos neste documento incluindo modalidades tendo um cassete da expressão funcional incorporado em uma planta transformada compreendendo nucleotídeos que codificam para qualquer um dos peptídeos divulgados neste documento ou que podezdam ser feitos por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Nós descrevemos e reivindicamos procedimentos para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos descritos neste documento,

[576] Nós descrevemos o uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos neste documento para fazer uma planta ou transformar estes peptídeos ou nucleotídeos em uma planta, e métodos e técnicas para gerar estas proteínas em plantas e/ou cassetes de expressão compreendendo qualquer um dos peptídeos e métodos para os transformar em um genoma de planta e qualquer método para usar, fazer, transformar qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos em uma planta e métodos e técnicas para gerar plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos e cassetes de expressão funcionais em plantas compreendendo qualquer um dos peptídeos divulgados e seus nucleotídeos correspondentes e quaisquer plantas feitas pelos produtos e processos descritos neste documento.

[577] Em algumas modalidades nós divulgamos um gene quimérico compreendendo um promotor ativo em plantas operativamente ligado aos ácidos nuoleicos ou cassastes de expressão como descritos neste documento. Nós divulgamos um método para fazer, produzir au usar a combinação de genes descritos neste documento. Nós divulgamos um vetor recombinante compreendendo a combinação de genes descritos neste documento. Nós divulgamos um método para fazer, produzir ou usar os vetores recombinantes. Nós divulgamos uma célula hospedeira transgênica compreendendo a combinação de genes descrita neste documento e o método para fazer, produzir ou usar a célula hospedeira transgénioa a qual pode ser uma célula de planta transgênica e nós divulgamos um método para fazer, produzir au usar essa célula de planta transgênica, assim como a planta transgênica compreendendo a célula de planta transgênica e como fazer e usar* a planta transgênica. Nós divulgamos planta transgênica e semente tendo as propriedades descritas neste documento que são derivadas de milho, soja, algodão, arroz, sorgo, painço amarelo, cana-de-açúcar, alfafa, batatas ou tomates. A semente transgênica pode ter um gene quimérico que nós descrevemos neste documento. Nós descrevemos métodos para fazer, produzir ou usar a planta e/ou a semente transgênicas- desta divulgação.

[578] Nós também descrevemos métodos para usar a invenção e fornecer novas formulações. A invenção ê mais útil para controlar insetos. Nós descrevemos um método de controlar um inseto que compreende: Aplicar proteína de Bt (Bacillus thuríngíensís) ao referido inseto; e Aplicar um peptídeo XCK (Nó de Cistina inibidor) ao referido inseto. Este método pode ser utilizado quando a proteína de Bt e o peptídeo XCK inseticida são aplicados em conjunto, ao mesmo tempo, nas mesmas composições ou em separado em composições diferentes e em momentos diferentes - A proteína de Bt e o peptídeo XCK inseticida podem ser aplicados sequencialmente e eles podem ser aplicados a insetos resistentes a (proteína de Bt}. A razão de Bt para XCK, em uma base de peso seco, pode set .selecionada de pelo menos cerca das seguintes razões: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, OU qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. A razão de Bt para XCK, em uma base de peso seco, pode ser selecionada de cerca das seguintes razões: 50:58, 45:55, 48:80, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99, ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de mais de 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana de peptídeos de Bt e XCK. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um dos peptídeos de Bt e XCK ou de ambos os peptídeos de Bt e XCK.

Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivadas de 2 a 15 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK e pelo menos uma cepa de cada um de Bt au XCK ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são codificados por mais do que uma cópia dos genes de Bt au XCK. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de mais do que 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana dos peptídeos Bt e/ou XCK, com todas as cepas de peptídeos de Bt e/ou XCK contribuindo com mais de pelo menos 1% dos peptídeos de cada tipo de cepa na referida composição. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de 2 a 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de qualquer um ou ambos os

239/273 peptídeos de Bt e ICK e pelo menos uma cepa de qualquer um dos peptídeos Bt ou ICK ou ambos Bt e XCK são codificados por mais de uma cópia dos genes Bt ou ICK. A concentração total de peptídeo de Bt e CRIB na composição é selecionada das seguintes concentrações percentuais: 1, s, 10, is, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 80, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 % ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

[579] Os métodos podem ser* usados onde o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicianalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico) operativamente ligado ao peptídeo XCK inseticida em que o referido ERSP é ligado no N~terminal do peptídeo ICK inseticida. Em algumas modalidades os peptídeos de combinação inseticidas usados são produzidas usando um cassete genético que compreende adicíonalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico} operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida em que o referida ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo ICK inseticida, em que o ERSP é BAAS.

[580] Qualquer um dos peptídeos e plantas descritos neste documento podem ser usados para controlar insetos, seu crescimento e danos,· especialmente seu dano ãs plantas. A proteína de Bt de combinação e o peptídeo ICK inseticida podem ser aplicados por serem pulverizados em uma planta, ou no locus do inseto, ou no locus de uma planta em necessidade de proteção.

[581] Nós também descrevemos formulações compreendendo: Proteína de Bt; e um peptídeo ICK inseticida que pode incluir qualquer uma das composições aqui descritas, ou capaz de ser feito por um perito na arte dada esta divulgação. Algumas das formulações descritas incluem o uso de um solvente aprético polar e/ou água e/ou quando o solvente aprótico polar está presente em uma quantidade de 1-99% em peso, o -solvente prático polar está presente em uma quantidade de 1-99% em peso e a água está presente em uma quant idade de 0~98%em peso, ás formulações incluem formulações em que a proteína de Bt é Dipel e onde o peptídeo XCK inseticida é um peptídeo híbrido-ACTX-Hvla. As formulações de solvente aprótico polar são especialmente eficazes quando elas contêm MSO. Os exemplos abaixo se destinam a ilustrar e não limitar a invenção de qualquer maneira.

[582] Seção VII. Descrições e exemplos de Combinações w>aai*»a*>4s**»**mw>amvvw>***^**»*********a*********************a***i>4*a*******************mwv>*a*>vwvvw de TMOF e Bt

[583] Os peptídeos de Bt e TMOF podem inibir o crescimento, prejudicar o movimento ou atê mesmo matar um inseto quando a combinação de toxina é distribuída adequadamente para o locus habitado pelo inseto. Põe secos por spray são feitos do peptídeo, vários excipientes e subprodutos de fermentação.

[584] Nós descrevemos uma composição de peptídeo de combinação inseticida, que compreende tanto uma proteína de Bt (Bacillus thuríngiensis); quanto um peptídeo TMOF inseticida. A composição pode ser na razão de Bt para TMOF, em uma base de peso seco, de cerca, de qualquer uma das seguintes razões: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50.:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. Nós também descrevemos uma composição onde a razão de Bt para TMOF, em uma base de peso seco, ê selecionada de cerca das seguintes razões: 0:50, 45:55, 40x60, 35:65, 30:70,

25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99 ou qualquer combinação de quaisquer dois destes 'valores.

241/273

[585] Em outra modalidade a combinação de peptídeos de Bt e TMOF incluí cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF sendo derivados de mais de 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF, Por origens de cepa bacteriana queremos dizer que os peptídeos podem ser descritos como tendo sido expressas por uma cepa bacteriana que expressa os peptídeos com o entendimento de que muitas proteínas de Bt também são artificiais no sentida de que elas não são mais todas desenvolvidas de cepas bacteríanas.

[586] Nós também divulgamos composições em que cada um ou ambos os peptídeos de Bt e ΊΜΟΕ são derivados de entre 2 e 5, 2 a 15, 2 a 30, 5 a 10, 5 a 15, 5 a 30,. 5 a 50 e vários outros tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt ou WF. Nós divulgamos uma composição em que qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são codificados por de 2 a 15 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF.. E qualquer uma destas combinações de 2 a», 2 a 15, 2 a 30, 5 a 10, 5 a 15, 5 a 30, 5 a 50 e vários outros tipos e misturas diferentes de peptídeos de Bt e WF podem contribuir mais do que pelo menos 1% de cada tipo de cepa para a composição.

[587] Nõs divulgamos composição de Bt e TMOF onde a concentração total de -peptídeo de Bt e TMOF na composição é. selecionada das seguintes concentrações percentuais; .1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 00, .95 ou 99 %, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes. Nós divulgamos composições em que o peptídeo de combinação inseticida é produzida usando um cassete genética que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal, de Retículo

Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N~terminal do peptídeo TMOF inseticida. Nós divulgamos composições em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo TMOF inseticida, em que o ERSP é M&S.

[588] Nós divulgamos composições em que o referido peptídeo de combinação é produzido usando um cassete genético que compreende ainda um dipeptídeo operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido dipeptídeo ê ligado no N-terminal do peptídeo TMOF inseticida; e em que o dipeptídeo é compreendido de um aminoácido não polar no N~terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no C~terminal do dipeptídeo, incluindo modalidades em que o dipeptídeo ê glicina.-serina, incluindo modalidades em que o peptídeo TMOF inseticida é qualquer inclui modalidades em que o peptídeo TMOF inseticida é pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 79%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior identidade de sequência para qualquer uma das sequências TMOF aqui reveladas, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é qualquer proteína de Bt inseticida incluindo modalidades em que a proteína de Bt é uma proteína Cry ou Cyt, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é selecionada do grupo consistindo de uma Cryl, Cry3, TXC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TXC417, uma proteína inseticida binária CryET80 e CryST76, uma proteína inseticida binária T.IC100 e TXC101, uma combinação de uma proteína, inseticida ET29 ou ET37 com uma proteína inseticida TXC810 ou TXCB12 e uma proteína inseticida binária PS149B1, incluindo modalidades em que a proteína de Bt ê selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CrylA ou uma proteína CrylF, incluindo modalidades em que a proteína de Bt é uma proteína CrylF-CrylA de combinação, incluindo modalidades em. que a proteína de Bt compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ã SEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28, ou 34 da Patente US 7.304.206, incluindo modalidades em que a Endotoxins de Bt é Dipel, incluindo modalidades em que a proteína de Bt ê Thuricide<

[5891 Nós divulgamos uma composição que compreende os nucleotídeos dex proteína de Bt (Bacillus thuríngíensís) ; e uma. proteína TMOF inseticida, em uma planta transformada ou genoma de planta,* onde a razão de Bt para TMOF, numa base de peso seco, é selecionada, -de cerca das seguintes razõest 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55,

40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, Ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores.

[590] Nós divulgamos planta transformada ou genoma de planta em que a razão de Bt para tmof, numa base de peso seco, é

selecionada de cerca	das seguintes razões:
50:50, 45:55, 48:60, 35:65,	30:70,	25:75, 20:80,	15;85, 10:90,
5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,	1;99 - 9	e 0,01:99,99,	ou qualquer
combinação de quaisquer	dois	de s te s valores.	A planta
transformada ou o genoma de	planta	podem ter cada t	im ou ambos os

peptídeos de Bt e TMOFF são derivados de mais de 1 tipos diferentes ou origem de cepa bacteriana de peptídeos Bt ou TMOF, ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origem de cepa bacteriana de cada um dos peptídeos Bt ou TMQF ou ambas os peptídeos Bt e TMQF são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origens de cepa ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são derivados de 2 a 15 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e TMQF e pelo menos uma cepa de cada um de Bt ou WOF ou ambos os peptídeos de Bt e WF codificados por mais do que uma cópia dos genes de Bt ou TMOF, ou cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são derivados de mais de um tipo diferente ou de origem de cepa bacteriana de peptídeos de Bt e/ou tkgf onde todas as cepas de peptídeos Bt e/ou tmof contribuem em mais do que pelo menos 1% de cada tipo de cepa para a referida composição, ou cada um de ou ambos os peptídeos de Bt e tmof são derivados de 2 a 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF e pelo menos uma cepa de cada um de Bt ou TMOF ou amboa os peptídeos de Bt e TMQF codificados por mais do que um cópia dos genes Bt ou TMOF, ou a concentração total de peptídeo Bt e TMOF na composição pode ser selecionada das seguintes concentrações percentuais: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 33,. 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, B5, 90, 95 ou 99%, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

[591] As composições e plantas descritas neste documento incluem um peptídeo de combinação inseticida produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ersp (Peptídeo Sinal de Retículo Bndoplasmãtico) operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N-terminal do peptídeo TMOF inseticida. Em outra modalidade o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSF (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico} operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido ER8P é

245/273 ligado no N~terminal do peptídeo TMOF inseticida, em que o ERSF ê baas. Numa outra modalidade a planta transgêníca incorporando e expressando os peptídeos de combinação dos nucleotídeos aqui descritos, em que o referido peptídeo de combinação é produzido usando um cassete genético que compreende ainda nucleotídeos que expressam um dipeptideo operavelmente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido dipeptideo é ligado ao N~terminal do peptídeo TMOF inseticida; e em que o dipeptideo é compreendido de um aminoácido não polar no N--terminal do dipeptideo e um aminoácido polar no C-terminal do dipeptideo. Em outra modalidade a planta transgênica tem um dipeptideo que ê glicína-serina. Em outra modalidade a planta transgênioa tem peptídeos TMOF inseticidas expressos que são compreendidos de uma combinação de peptídeo inseticida de proteínas TMOF e Bt, As plantas transgênicas podem ter um peptídeo TMOF inseticida derivado de qualquer espécie de TMOF.

[592] Nós descrevemos e revindicamos uma planta

transgênica em que o peptídeo	TMOF inseticida	expresso pode
conter 20-100 ami noác idos	e	o peptídeo	TMOF	inseticida ê
qualquer peptídeo inseticida	con	s pelo menos	50%,	55%, 50%, 65%,

70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 9.9% ou maior identidade de sequência para qualquer um dos peptídeos TMOF descritos neste documento. As plantas transgênicas divulgadas podem conter qualquer proteína de Bt conhecida incluindo peptídeos onde a proteína de Bt é uma proteína Cry ou Cyt, e/ou a proteína de Bt é selecionada do grupo consistindo em uma Cryi, Cry3, TXC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC4Ô7, TXC417, uma proteína inseticida binária CryET80, e CryET76, uma proteína inseticida binária TIC100 e TXC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ou BT37 com uma proteína inseticida

TICS10 ou TIC812 e uma proteína inseticida binária PS149B1. Λ proteína de Bt pode ser selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CrylA ou uma proteína CrylF, ou uma combinação de proteína CrylF-CrylA ou ela compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica às SEQ XD NO: 10, 12, 14, 26,

28, ou 34 da Patente US 7.304.206. nós descrevemos uma planta transgênica em que a proteína de Bt é Dipel e nós descrevemos uma planta

[593] transgênica em que a proteína de Bt é Thurícide.

Nós especifícamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada expressando os peptídeos aqui descritos, onde a concentração média de peptídeo de Bt e IMOF em uma folha média de uma planta transformada é de cerca de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 OU 99% ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores. Nós especifícamente descrevemos e reivindicamos uma planta transformada expressando peptídeos tóxicos devidamente dobrados na planta transformada. reivindicamos uma planta tóxicos de combinação

Nós especifícamente descrevemos e transformada que expressa peptídeos devidamente dobrados na planta transformada e que causam a acumulação dos peptídeos tóxicos expressos e devidamente dobrados ©a referida planta e causam um aumento no rendimento da planta ou na resistência a danos por insetos e eles controlam pragas de insetos em lavouras e florestas. Nós descrevemos plantas feitas por qualquer um dos produtos e processos descritos neste documento.

[594] Nós descrevemos cassetes de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que expressam quaisquer peptídeos descritos neste documento incluindo modalidades tendo um cassete de expressão funcional incorporado em uma planta transformada compreendendo nucleotídeos que

codificam para qualquer um	des pept	: ide os d ivul<	gados neste
documento ou que podariam «	ser feitos	por alguém	versado na
técnica dado o ensinamento	divulgado	neste datum	sento. Nós
descrevemos e reivindicamos	procedimentos para a	geração de
plantas transformadas tendo	ou expre;	zsando qualq	uer um das

peptídeos descritos neste documento.

[595] Nós descrevemos o uso de qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos neste documento para fazer uma planta ou transformar estes peptídeos ou nucleotídeos em uma planta, e métodos e técnicas para gerar estas proteínas em plantas e/ou cassetes de expressão compreendendo qualquer um dos peptídeos e métodos para os transformar em um genoma de planta e qualquer método para usar, fazer, transformar qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos em uma planta e métodos e técnicas para gerar plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos e cassetes de expressão funcionais em plantas compreendendo qualquer um dos peptídeos divulgados e seus nucleotídeos correspondentes e quaisquer plantas feitas pelos produtos e processos descritos neste documento.

('5981 Em algumas modalidades nós divulgamos um gane quiméríco compreendendo um promotor ativo em plantas operativamente ligado aos ácidos nucléicos ou cassestes de expressão como descritos neste documento. Nós divulgamos um método para fazer, produzir ou usar a combinação de genes descritos neste documenta. Nós divulgamos um vetor recombinante compreendendo a combinação de genes descritos neste documento. Nós divulgamos um método para fazer, produzir ou usar os vetores recombinantss. Nós divulgamos uma célula hospedeira transgênica compreendendo a combinação de genes descrita neste documento e o método para fazer, produzir ou usar a célula hospedeira transgênica a qual pode ser uma célula de planta transgênica e nós divulgamos um método para fazer, produzir ou usar essa célula de planta transgênica, assim como a planta transgênica compreendendo a célula de planta transgênica e como fazer e usar a planta transgênica. > Nós divulgamos planta transgênica e semente tendo as propriedades descritas neste documento que são derivadas de milho, soja, algodão, arroz, sorgo, painço amarelo, cana-de-açúcar, alfafa, batatas ou tomates. A semente transgênica poda ter um gene quimérico que nós descrevamos nesta documento. Nós descrevemos métodos para fazer, produzir ou usar a planta e/ou a semente transgênicas desta divulgação.

[597] Nós também descrevemos métodos para usar a invenção e fornecer novas formulações. A invenção é mais útil para controlar insetos. Nôs descrevemos um método de controlar um inseto que compreende: Aplicar Proteína de Bt (Badllus thuringiensís) ao referido inseto; e Aplicar um peptídeo TMOF inseticida ao referido inseto. Este método pede ser utilizado quando a proteína de Bt e o peptídeo ICK inseticida são aplicados em conjunto, ao mesmo tempo, nas mesmas composições ou em separado em composições diferentes e em momentos diferentes. A proteína de Bt e o peptídeo TMOF inseticida, podem ser aplicados sequencialmente e eles podem ser aplicados a insetos resistentes a (proteína de Bt) - A razão de Bt para TMOF, em uma base de peso seco, pode ser selecionada de pelo menos cerca das seguintes razões: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30,

65:35, 60:40, 55145,	50:	50,	45:55, 40:60, 35:65,	3 Λ > Λ > SC > W? y » f X-í f Xv .SA V
20:80, 15:85, 10:90,	5:	95	a 1:99., au qualquer	combinação	de
quaisquer dois destes	va:	lore	5S. A razão da Bt pars	: TMOF, em	uma
base de peso seco, pede		selecionada de pelo menos cerca	das#
seguintes razões:	59:	50 <	45:55, 40:80, 35:65, 3	0:70, 25:	75

20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99 ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. Qualquer um ou ambos os peptídeos de st e TMOF são derivados de mais de 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana de peptídeos de Bt e TMOF. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana. de cada um. dos peptídeos de Bt e TMOF ou de ambos os peptídeos de Bt e TMOF. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são derivados de 2 a 15 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF e pelo menos uma cepa de cada um de Bt ou TMOF ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são codificados por mais do que uma cópia dos genes de Bt ou TMOF. Qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF são derivados de mais do que 1 tipo diferente ou origens de cepa bacteriana dos peptídeos Bt e/ou

TMOF, com	todas	as cepas de pop'	:ideos de	Bt e/ou TMOF
contribuindo	com n	'uis de pelo menos	1% dos pe	jptídeos de cada
tipo de ceps	Ϊ- a l-CS· í-	eferida composição.	Qualquer	um ou ambos os
peptídeos de	Bt e	TMOF são derivados	de 2 a 5	tipos diferentes

ou origens de cepa bacteriana de qualquer um ou ambos os peptídeos de Bt e TMOF e pelo menos uma cepa de qualquer um dos peptídeos Bt ou TMOF ou ambos Bt e TMOF são codificados por mais de uma cópia dos genes Bt ou TMOF. A concentração total de peptídeo de Bt e TMOF na composição é selecionada das seguintes concentrações percentuais: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 65, 90, 95 ou 99 %, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

[598] Qs métodos podem ser usados onde o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adiei.coalmen-te um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico) operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido ERSP é ligado· no N-terminal do peptídeo TMOF inseticida. Em algumas modalidades os peptídeos de combinação inseticidas usados são produzidos usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ersf (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico} operativamente ligado ao peptídeo TMOF inseticida, em que o referido ERSP ê ligado no Nterminal do peptídeo TMGF inseticida, em que o ERSP é baas.

[599] Qualquer um dos peptídeos e plantas descritos neste documento podem ser usados para controlar insetos, seu crescimento e danos, espec ia Imente seu dano às plantas. A proteína de Bt de combinação e o peptídeo TMOF inseticida podem ser aplicados por serem pulverizados em uma planta, ou no locus do inseto, ou no locus de uma planta em necessidade de proteção.

[600] Nós também descrevemos formulações compreendendo; proteínas de Bt; e um peptídeo TMOF inseticida que pode incluir qualquer uma das composições aqui descritas, ou capaz de ser feito por um perito na arte dada esta divulgação. Algumas das formulações descritas incluem o uso- de um solvente aprõtico polar e/ou ãgua e/ou quando o solvente aprõtico polar estã presente em uma quantidade de X-99% em peso, o solvente prótico polar está presente em uma quantidade de 1~99% em peso e a ãgua es té presente em uma quantidade de 0~98%em peso. As f emulações incluem formulações em que a proteína de Bt é Dipel e onde o peptídeo TMOF inseticida é um peptídeo como qualquer um dos peptídeos TMOF fornecidos na listagem de sequências. As formulações de solvente aprõtico polar são especialmente eficazes quando elas contêm MSO. Os exemplos abaixo se destinam a ilustrar e não limitar a invenção de qualquer maneira.

[601] Para resumir, nõs descrevemos na Parte 3, o seguinte;

[502] uma composição que compreende pelo menos dois tipos de proteína ou peptídeos inseticidas, em que um tipo é uma Proteína inseticida Formadora de Poro (PFIP) e o outro tipo é um Peptídeo inseticida Rico em Cisteína (CRXP). Quando a composição puder compreender pelo menos dois tipos de peptídeos inseticidas em que um tipo é Proteína Inseticida Formadora de Poro (PFIP), em que a referida PFIP ê uma proteína de Bt e o outro tipo é Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (CRIP), em que o referido CRIP é uma proteína ICK, em que a referida proteína ICK é derivada da aranha teia de funil. Nós descrevemos um processo de: a) avaliação e teste opcional de um inseto ou uma amostra de insetos para determinar se ou não os insetos mostram resistência a uma PFIP e b) quando o resultado da referida avaliação levar à conclusão de que a referida amostra de insetos é resistente a uma PFIP, então, c) a aplicação de um ou mais

CRIPS e, opcionalmente, o CRI PS pode ser um ICK de Hadrcnyche versuta, ou a aranha teia de funil das Montanhas Azuis, Atrax robustas, Atrax formídabílis, Atrax infensus, incluindo toxinas conhecidas como .polipeptídeos u-ACTK, U-ACTZ-Hvla, rU-ACTX~Hvla, rU-ACTX-Hvlb, ou mutantes ou variantes, ou o CRIP pode ser um Não XCK de anêmonas do mar, da anêmona do mar denominada Anemonia viridi, os peptídeos denominados Av2 e Av3 especialmente peptídeos similares a estes na listagem de sequências. Nôs descrevemos um método para controlar Insetos incluindo insetos resistentes a Bt compreendendo criar composição de pelo menos dois tipos de peptídeos em que um tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida formador de poro (PFIP) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína

252/273 (CRIP) e as proteínas PFXP e CRIP são selecionadas de qualquer uma das composições descritas neste documento e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem de sequências e, então, aplicar a referida composição ao locus do inseto. NÕs descrevemos um método de controlar Insetos incluindo insetos resistentes a Bt compreendendo proteger uma planta de insetos resistentes a Bt compreendendo criar uma planta que expressa uma combinação de pelo menos dois peptídeos devidamente dobrados em que um tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida formador de poro (FFIP) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRIP) e as proteínas PFXP e CRIP são selecionadas de qualquer uma das composições aqui descritas e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem sequências. Nõs descrevemos um processo de: a) avaliação e teste opcional de um inseto ou uma amostra de insetos para determinar se ou não os insetos mostram resistência a uma PFIP e b) quando o resultado da referida avaliação leva à conclusão de que a referida amostra de insetos é resistente a uma PFIP, então, c) a aplicação de um ou mais CRIPS e, opcionalmente, d) a aplicação de urna combinação de PFIP e CRIP, em quaisquer aplicações simultâneas ou sequenciais.

[503] Nós descrevemos uma composição que compreende pelo menos dois tipos de proteína ou peptídeos inseticidas, em que um tipo é uma Proteína Inseticida Formadora de Poro (PFXP) e o outro tipo ê um Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (CRIP). Uma composição em que o referido CRIP é um ICK e, opcionalmente, o referido ICK é derivado de ou se origina de , Hadronyche versuta, ou da aranha teia de funil Blue Mountain, Atrax rohustus, Atrax formidabílis, Atrax infensus, incluindo toxinas conhecidas como polipept.ídeos U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACXX-Hvlb, ou mutantes ou variantes. Uma composição em que o CRXR é um GRIP Não-ICK e, opcionalmente, o referido CRXP Não-ICK é derivado de, ou se origina de, animais tendo GRIPS Não-ICK, tal como anémonas do mar, ouriços do mar e lesmas do mar, opcionalmente incluindo a anêmona do mar denominada Anemonia viridi, opcionalmente incluindo os peptídeos denominados Av2 e Av3 especialmente peptídeos similares a Av2 e Av3 incluindo esses peptídeos listados na listagem de sequências ou mutantes ou variantes.Um método para usar a composição para controlar insetos, incluindo insetos resistentes a Bt, que compreende criar composição de pelo menos dois tipos de peptídeos em que um tipo de peptídeo é uma proteína inseticida formadora de poro (PFXP) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRXP) e as proteínas PFIP e CRXP são selecionadas de qualquer uma das composições descritas na reivindicação 1 e neste documento e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem de sequências e, então, aplicar a referida composição ao locus do inseto. Um método para controlar insetos, incluindo insetos resistentes a Bt, compreendendo proteger uma planta de insetos resistentes a Bt, compreendendo criar uma. planta que expressa uma combinação de pelo menos dois peptídeos dobrados devidamente em que um tipo de peptídeo é uma proteína inseticida formadora de poro (PFX.P) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRXF) e as proteínas PFXF e CRXP são selecionadas de qualquer uma das composições descritas neste documento e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem de sequências. Um método para controlar insetos, incluindo insetos resistentes a Bt, em que o CRXF é administrado a qualquer momento durante o qual a FFXP está afetando o revestimento do intestino do inseto. um método para controlar insetos, incluindo insetos resistentes a Bt, em que o CRXP ê administrado em seguida ao teste do inseto para resistência a Bt e em que o referido inseto testou positivo para resistência a Bt. A aplicação ou distribuição de qualquer um dos compostos descritos neste documento em forma sólida ou líquida para qualquer um do inseto, do locus do inseto ou como um Protetor incorporado na Planta.

[604] Nós descrevemos uma composição que compreende pelo menos dois tipos de peptídeos inseticidas, em que um tipo é uma proteína inseticida formadora de poro (PFXP), em que a referida PFXP é uma proteína cry e o outro tipo ê um peptídeo inseticida rico em cisteina (CRXP), em que o referido CRXP é uma proteína XCK, em que a referida proteína ICK. é derivada a aranha teia de funil. Nós descrevemos uma composição que compreende pelo menos dois tipos de peptídeos inseticidas, em que um tipo é um peptídeo inseticida formador de poro (PFIP), em que o referido PFXP tem como sua origem o organismo de Bt e o outro tipo ê um peptídeo inseticida rico em cisteina (CR-XP) , em. que o referido CRXP é uma proteína Não XCK. Nós descrevemos uma composição que compreende pelo menos dois tipos de peptídeos inseticidas, em que um tipo ê uma peptídeo inseticida formador de poro (PFXP) e o outro tipo ê um TMOF. Nós descrevemos um método para proteger uma planta de Insetos, incluindo insetos resistentes a Bt, compreendendo criar uma Planta Incorporando uma combinação de pelo menos dois tipos diferentes de peptídeos em que um tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida formador de poro (PFXP) e o outro tipo é um peptídeo inseticida rico em cisteina (CRXP). Nós descrevemos um método para proteger uma planta de Xnsetos, incluindo insetos resistentes a Bt, compreendendo criar uma planta que expressa uma combinação de pelo menos dois peptídeos dobrados devidamente em que um tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida formador de poro (PFIP) e o outro tipo de peptídeo é um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRIP) e as proteínas PFXP e CRIP são selecionadas de qualquer uma das composições descritas neste documento e de qualquer uma das proteínas fornecidas na listagem de sequências.

(6051 Nõs descrevemos uma composição de peptídeo de combinação inseticida compreendendo proteína Inseticida Pica em Cisteína (CRIP); tal como um peptídeo XCK (Nó de Cistina Inibidor) inseticida como um peptídeo de aranha ou Não ICK como uma toxina de anêmona do mar combinados com proteína inseticida formadora de poro (PFIP) como um peptídeo de Bt, tal como cry, cyp ou VIP; ou uma proteína Inseticida Rica em Cisteína (CRIP) ; tal como um peptídeo ICK (Nó de Cistina Inibidor) inseticida combinado com um peptídeo TOQF (fator oostãtico de modulação de tripsína) . Notem que CRIP pode ser uma proteína Não ICK, como um peptídeo de anêmona do mar, tal como Av2 e Av3 e outras sequências similares na Listagem de Sequências. Nõs descrevemos tais composições onde a razão de Bt para CRIP, Bt .para ICK, Bt para CRIP não ICK, Bt para TKOF ou Bt para XCK e TMQF em uma ba.se de peso seco, é selecionada de cerca das seguintes razões: 9:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:6S, 30:70, 25:75, 20:00, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:9.9, ou qualquer combinação de dois destes valores. Al te mat ivamente quando a t~azão de Bt para CRIP, Bt para ICK, Bt para CRIP não ICK, Bt para TMOF, e TMOF e anêmona do mar em uma base de peso seco, ê selecionada de cerca das seguintes razões: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99, ou qualquer combinação de quaisquer dois destes valores. Alternativamente quando a razão de Bt para CHIP, Bt para XCK, Bt para CRXP não XCK, Bt para TMQF, ou Bt para XCK e TMOF e peptídeos de anêmona do mar são derivados de mais de 1 tipo diferente de origens de cepa baceriana de cada um ou de ambos os peptídeos Bt e XCK. Como alternativa quando os peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, anêmona do mar e peptídeos TMOF são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou origens de cepas bacterianas de cada um ou de ambos de Bt, XCK, CRXP não XCK, peptídeos de anêmona do mar e peptídeos TMOF são derivados de entre 2 e 5 cepas diferentes. Como alternativa quando cada um ou ambos os peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, de anêmona do mar e peptídeos TMOF são derivados de 2 a 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou de todos os peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, peptídeos de anêmona do mar e peptídeos TMOF. Como alternativa quando cada um ou ambos os peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, de anêmona do max' e peptídeos TMQF são codificados por de 2 a 15 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou de todos os peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, peptídeos de anêmona do mar e peptídeos TMOF, Como alternativa quando um ou todos os peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, anêmona do mar e -peptídeos TMQF são derivados de 2 a X5 diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou de todos os peptídeos de Bt, XCK e TMOF e pelo menos uma cepa de cada um de peptídeos de Bt, XCK, CRXP não XCK, anêmona da mar e peptídeos TMOF ou ambos os peptídeos de Bt, XCK, CRXPS não XCK, anêmona do mar e peptídeos TMOF e peptídeos de Bt e XCK, Bt e TMOF, ou Bt e XCK * TMOF são codificados por mais de uma cópia dos genes de Bt ou XCK. Como alternativa quando cada um ou ambos os peptídeos de Bt, CRXP, XCK, CRXP não XCK, anêmona d© mar e peptídeos TMOF são derivados de 2 a 15 tipos de cepas ou bactérias de peptídeos de Bt e/ou XCK, CRIP não ICK, anêmona do mar e peptídeos TMOF com todas as cepas dos peptídeos de Bt e/ou XCK contribuindo com mais de pelo menos 1% de cada tipo de cepa para a referida composição.

[608] Nós descrevemos uma composição de peptídeos de Bt e ICK, CRXR não XCK, anémona do mar e peptídeos TMOF de números í a 9, em que a concentração total de peptídeo Bt e CRIP na composição é selecionada das seguintes concentrações percentuais: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 85, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 %, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a. percentagem restante da composição é compreendida de exciplentes. Nós descrevemos uma composição em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático) operativamente ligado ao peptídeo CRIP inseticida, em que o referido ERSP é ligado no Ν'terminal do peptídeo CRIP inseticida. Nós descrevemos uma composição em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que compreende adicionalmente um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmátíco) operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida, em que o referido ERSP é ligado no N~ terminal do peptídeo CRIP inseticida, em que o ERSP é BAAS. Nós descrevemos uma composição em que o referido peptídeo de combinação é produzido usando um cassete genético que compreende ainda um dipeptídeo operativamente ligado ao peptídeo CRIP inseticida, em que o referido dipeptídeo é ligado ao N-terminal do peptídeo CRIP inseticida; e em que o dipeptídeo é compreendido de um aminoácido não polar no N-terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no C~ terminal do dipeptídeo. Nós descrevemos uma composição em que o referido dipeptideo é glicina-serina.

[6Ô7] Nôs descrevemos uma composição em que o peptídeo CRIP inseticida ê qualquer peptídeo inseticida que inibe ambos os canais de Cálcio regulados por voltagem, e canais de potássio ativados por Cálcio em insetos, e em que o peptídeo CRIP inseticida se origina de qualquer especie de aranha teia de funil da Austrália, e em que a referida aranha é selecionada de aranhas teia de funil da Austrália do gênero Atrax ou Madronyche e em que a referida aranha é selecionada de aranhas teia de funil da Austrália do gênero Hadronyche, e em que a referida aranha é selecionada da teia de funil das Montanhas Azuis da Austrália, Hadronyche versuta, e em que o peptídeo CRIP inseticida é Híbrido-ACTX-Bvla, e em que o referido peptídeo CRIP inseticida contém 20-100 aminoácidos e 2-4 ligações dissulfeto, em que o referido peptídeo CRIP inseticida é qualquer peptídeo inseticida com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior' identidade de sequência para qualquer um dos peptídeos na listagem de sequências.

[608] Nós descrevemos peptídeo CRIP inseticida que é de proteína de Bt e onde a proteína de Bt ê uma proteína Cry ou Cyt ou selecionada do grupo consistindo em uma Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TXC417, uma proteína .inseticida binária CryETSO, e CryET76, uma proteína inseticida binária TIC1.00 e TXC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ou ET37 com uma proteína inseticida TXC810 ou TXC812 e uma proteína inseticida binária PS149B1. Nós descrevemos proteína de Bt selecionada de uma proteína Cry, uma proteína Cry IA ou uma proteína CrylF. Nós descrevemos em que a referida proteína de Bt é uma proteína CrylF-CryIA de combinação

Dipe.1 ou Thurioide e onde a proteína de Bt é de

rivada de

Bacillus thuríngiensis ãurstaki.

[609] Nós descrevemos composições compreendendo os

nucleotídeos de uma PFIF, tal como proteína de Bt	(Bacillus
thuringíensís) ; e um CRIP, tal como um peptídeo IC	’K (nó de
cistina inibidor} inseticida, ou um peptídeo Não ICí	C; em urna
planta transformada ou genoma de planta; e onde a ra-	zão de Bt
para ICK, numa base de peso soco, é selecionada de	cerca das

seguintes razões: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25

70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65

30:7'0, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 O 1:99 Ol	1 qualquer
combinação de quaisquer* dois destes valores, ou	onde a
composição de número 33, em uma planta transformada ou	genoma de
planta e em que a razão de Bt para ICK, em uma base de	peso seco.
ê selecionada de cerca das seguintes	razões:
0:50, 45:55, 40:60, 35:65,	3 v c ./ v s

25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0.5:99.5, 0.1:99.9 e

0.01:99.99 ou qualquer combinação de quaisquer dois dastes valoras.

[610] Nos descrevemos uma composição em que cada um ou ambos os peptídeos de Bt e ICK são derivados de mais de itipo diferente ou origem de cepa bacteriana- de origem de peptídeos Bt ou XCK, onde cada um ou ambos os peptídeos de Bt e ICK codificados são derivados de entre 2 e 5 tipos diferentes ou

origem de cepa bacteriana de cada um dos peptídeos Bt	ou ICK ou
ambos os peptídeos Bt e ICK são derivados de entre 2	e 5 tipos
diferentes ou origens de cepa, onde cada um ou	ambos os
peptídeos de Bt e ICK codificados são derivados d	e 2 a 15

diferentes tipos ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e ICK e pelo menos uma cepa de cada um de

260/273

Bt ou XCK ou ambos os peptídeos de St e ICK codificados por mais do que uma cópia dos genes de Bt ou XCK, onde cada um ou ambos os peptídeos de Bt e ICK codificados são derivados de mais da um tipo diferente ou de origem de cepa bacteriana de peptídeos de Bt e XCK onde todas as cepas de peptídeos Bt e/ou ICK contribuem em mais do que pelo menos 1% de cada tipo da cepa para a referida composição, ou cada um de ou ambos os peptídeos de Bt e XCK são derivados de 2 a 5 tipos diferentes ou origens de cepa bacteriana de cada um ou ambos os peptídeos Bt e ICK e pelo manos uma cepa de cada um de Bt ou ICK ou ambos os peptídeos Bt e ICK codificados por mais do que um cópia dos genes Bt ou XCK.

[611] Nós descrevemos uma composição onde a concentração total de peptídeo de Bt e ICK transgenicamente expresso resultante da composição é selecionada das seguintes concentrações percentualss 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 % ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

Noa descrevemos uma composição em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um genético que compreende adicíonalmente um ERSP

Cap tídeo s i nal

Retículo

Endoplasmãtico} operativamente ligado ao peptídeo ICK inseticida em que o referido ERSP é ligado no N--terminal do peptídeo ICK inseticida, e em que o peptídeo de combinação inseticida é produzido usando um cassete genético que ainda compreende um ERSP (Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmãtico) operativamente ligado ao peptídeo CRXP inseticida, em que o referido ERSP está ligado no N-terminal do peptídeo CRXP inseticida, em que o ERSP é EAAS.

[612] Nós descrevemos uma planta transgénica incorporando e expressando os peptídeos de combinação divulgados neste documento em que o referido peptídeo de combinação é produzido usando um cassete genético que compreende ainda nucleotídeos que expressam um dipeptídeo operavelmente ligado ao CRIP (peptídeo) inseticida, em que o referido dipeptídeo é codificado de modo que ele seja ligado covalentemente ao Nterminal do CRIP inseticida; e em que o dipeptídeo é compreendido de um amincácido não polar no N~ terminal do dipeptídeo e um aminoácido polar no C~terminal do dipeptídeo. Nõs descrevemos uma planta transgêníca em que o peptídeo transformado inclui um dipeptídeo com um N terminal glicinaserina. Nós descrevemos planta transgêníca em que os peptídeos inseticidas expressos são qualquer combinação de peptídeo inseticida de CRIP e PFIP (ou peptídeos de Bt) que permite ao peptídeo tanto entrar no intestino quanto, então, inibir ambos os canais de Cálcio regulados por voltagem os canais de potássio ativados por Cálcio em insetos.

[613] Nós descrevemos uma planta transgêníca em que o peptídeo CRIP inseticida produzido recombinantemente é derivado de uma aranha teia de furi.il da Australia ou uma anêmona do mar e nós descrevemos e fornecemos exemplos ou reais ou nocíonais de plantas transformadas, transformadas com um CRIP de uma aranha que é selecionada de aranhas teia de funil da Austrália do gênero Atrax ou Madronychò ou uma anêmona do mar que é selecionada de Anemonía vírídis. A planta transgêníca pode ter peptídeo ICK inseticida expresso que é Híbrido-ACTX-Hvla. 0 CRIP pode ser um ICK ou Não ICK que quando expresso contém 20 100 aminoácidos e 2-4 ligações dissulfeto» Os peptídeos PIP podem ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais de identidade de sequência para SEQ ID NO: 33 e/ou peptídeo selecionado de SEQ· ID NO: 33 ~ 1032 .

[6X4] Nós descrevemos uma planta transgênica em que a proteína de Bt é qualquer proteína de Bt inseticida e em que a proteína de Bt é uma proteína Cry ou Cyt, e em que a proteína de

Bt ê selecionada do grupo consistindo em uma Cryl, Cry3_; TXC851,

CryET7G, Cry22, TXC901, TXC201, TXC407, TXC417, uma proteína inseticida binária CryBTSú, e CryET76, uma proteína inseticida binária TXC100 e TIC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET2.9 ou ET37 com uma proteína inseticida TIC810 ou TXC812 e uma proteína inseticida binária PS149B1 e em que a proteína de Bt é selecionada de uma proteína Cry, uma proteína CrylA ou uma proteína CrylF e em que a proteína de Bt é uma combinação de proteína CrylP-CrylA e/ou Dipel e/ou Thuricide.

[615] Nós descrevemos uma planta transgênica em que a concentração média de peptídeo Bt e XCK/Não ICK, em uma folha média de uma planta transformada, ê de cerca de: 1, 5, 10, IS, 20 2S, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, .90, 95 ou 99 da proteína solúvel recuperável total, ou qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores, e em que a planta transformada expressando os peptídeos adequadamente dobrou peptídeos tóxicos na planta transformada, e em que ela provocou a acumulação dos peptídeos tóxicos expressos e adequadamente dobrados na referida planta e causou um aumenta no rendimento da planta ou na resistência a danos por inseto. Nós descrevemos estas composições e procedimentos para controlar insetos.

[616] Nós descrevemos cassetes de expressão compreendendo qualquer um dos nucleotídeos que expressam quais peptídeos mencionados aqui. Nós descrevemos um cassete de expressão funcional incorporado em uma planta transformada

263/273 compreendendo nucleotídeos que codificam para qualquer um dos peptídeos divulgados neste documento ou que poderíam ser feitos por alguém versado na técnica dado o ensinamento divulgado neste documento. Nós descrevemos procedimentos para a geração de plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos de combinação descritos neste documento. Nós descrevemos uma planta feita por qualquer um dos produtos e

processos	descritos neste	documento.
[617]	Nós descx	revemos o uso	de qualquer um	dos
peptídeos	ou nucleotídeos	s descritos neste	* documento para	fazer

uma planta ou transformar estes peptídeos ou nucleotídeos em uma planta, e métodos e técnicas para gerar estas proteínas em plantas e/ou cassetes de expressão compreendendo qualquer- um dos peptídeos e métodos para, os transformar em um genoma de planta e qualquer método para usar, fazer, transformar qualquer um dos peptídeos ou nucleotídeos descritos em uma planta e métodos e técnicas para gerar plantas transformadas tendo ou expressando qualquer um dos peptídeos e cassetes de expressão funcionais em plantas compreendendo qualquer um dos peptídeos divulgados e seus nucleotídeos correspondentes e quaisquer plantas feitas pelos produtos e processos descritos neste documento.

[618] Nós descrevemos um gene quimérico compreendendo um promotor^- ativo em plantas operativamente ligado aos ácidos nucléicos ou cassetes de expressão como descritos neste documento e o método de fazer, produzir ou usar a combinação dos genes descritos neste documento. Nós descrevemos um vetor recombinante compreendendo a combinação de genes descritos neste documento. Nós descrevemos um método para fazer, produzir ou usar os vetores recombinantes, uma célula hospedeira transgênica compreendendo a combinação de genes, a célula hospedeira transgênica a qual é uma célula de planta transgênica, a planta transgênica e plantas transgênicas as quais são milho, soja, algodão, arroz, sorgo, painço amarelo, cana-de-açúcar, alfafa, batatas ou tomates, e as sementes destas e de outras plantas, e em que a semente compreende um gene quimérico.

[6191 Nós descrevemos método para controlar um inseto ou o locus de um inseto compreendendo; aplicar uma PFXP, como proteína de Bt (Bacillus thuringíensisl ao referido inseto; seguida de uma aplicação de qualquer um ou qualquer combinação do seguinte: um peptídeo inseticida rico em cisteína (CRXP) ao referido inseto e em combinação ou como alternativa aplicar um peptídeo XCK (Nó de Cistína inibidor) inseticida ao referido inseto e em combinação ou como alternativa aplicar um peptídeo CRXP não XCK ao referido inseto e em combinação ou como alternativa aplicar um peptídeo tmof ao referido inseto, aplicar um peptídeo de anêmona d© mar ao referido inseto.

[820] Nós explicamos que a proteína Bt e o peptídeo CRXP, XCK e ©u TMOF inseticida são aplicados de modo que eles trabalhem juntos, mas eles não precisam ser aplicados a© mesmo tempo. A PFXP com© urna proteína de Bt e o peptide© CRXP, XCK e. ou TMOF inseticida podem ser aplicados simultaneamente ou sequencialmente.

[821] Nós explicamos as quantidades como a seguir; a razão de Bt para CRXP, Bt para XCK, .Bt para CRXP não XCK, Bt para TMOF, ou Bt para XCK e TMOF; em uma base de peso seco, é selecionada de cerca das seguintes razões: 99:1, 95;S, 90:10, 85;15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 e 1:99, ©U qualquer combinação de qualquer um destes valores; alternativamenet a razão de Bt para CRXP, Bt para XCK, Bt para

CRIP não ICK, Bt para TMOF, ou Bt para ICK e TMOF; em uma base de peso seco, é selecionada de cerca das seguintes razões: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 e 0,01:99,99 ou qualquer combinação de quaisquer dais destes vaiares.

[622] Nós explicamos que ambos ou todos dos Bt * CRIP;

Bt V ICK, Bt* CRIP Não-ICK, Bt * TMOF OU Bt 4 ICK * TMOF; são derivados de mais de 1 diferentes tipos ou origens de cepa hacteriana de peptídeos de Bt, de ICK, e TMQF e ou ambos os Bt e CRIP, ICK, CRIP não ICK, Bt e TMQF ou Bt e ICK * TMOF; Bt -f peptídeos peptídeos de anêmona do mar são derivados de entre 2 e 5 diferentes tipos ou origens de cepas bacterianas de cada um, dois ou mais de Bt, CRIP, ICK, CRIP não ICK, peptídeos de anêmona do mar ou peptídeos TMOF e ou qualquer um, dois ou todos os peptídeos de Bt, XCK e TMGF são derivados de 2 a 15 diferentes tipos ou origens de cepa baateriana de qualquer um ou ambos as peptídeos de Bt e ICK e pelo menos uma cepa de. qualquer um, dois ou todos de Bt, CRIP, ICK, CRIP não ICK, peptídeos de anêmona do mar ou peptídeos de IMOF são codificados par mais de uma cópia de um, dois ou. todos de peptídeos de Bt, CRIP, ICK, CRXF não ICK, anêmona do mar ou genes de TMOF.

(623] Nós explicamos que um, dois ou todos os peptídeos Bt, ICK e TMOF são derivados de mais de 1 tipo diferente ou origem de cepa bacteriana de um, dois ou todos os peptídeos Bt, ICK e TMOF cam todas as cepas de um, dois ou todos os peptídeos Bt, ICK e TMÔF contribuindo mais de pelo menos 1% dos peptídeos de cada tipo de cepa na dita composição. A concentração total de peptídeo de Bt e CRIP na composição é selecionada das seguintes concentrações percentuais: 1, 5, 1$, 15, 20, 2.5, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 OU 99%, OU qualquer faixa entre quaisquer dois destes valores e a percentagem restante da composição é compreendida de excipientes.

[624] Nós ainda fornecemos ou fornecemos bastante informação que aqueles versados na técnica poderiam fazer uma formulação compreendendo; uma RFIP_; tal como uma proteína de Bt; e um CRXP, tal como um peptídeo ICK. ou Não ICK inseticida.; e/ou um peptídeo TMÔF. Nós explicamos que essas formulações poderiam ser fatias usando um solvente aprótico polar s um solvente prõtico polar e ainda compreendendo água <. Ba algumas formulações o solvente aprótico polar está presente em uma quantidade de 1-99% em peso, o solvente prõtico polar está presente em uma quantidade de 1-99% em peso e a água está presente em uma quantidade de 0-9 8% em peso e ainda pode compreender M30.

[625] Exemplo 1

[626] Bioensaio Foliar usando EDF 1234504 e 1234695 contra Ppsdopèera exígua em Alface Romana Mud Lakes Farms

[627] Propósito: 0 propósito deste experimento é destinado a determinar a mortalidade percentual a qual ocorre contra exígua quando BDP 1234604 {formulação wp) e 60S {formulação por grão) são pulverizados contra larvas do 1% 2’, 3* e 4* instar em um bioensaio de disco de folha foliar.

[628] Preparação do Ensaio s Formulação da Tratamentos ovos de B. exígua foram recebidos de Benzon Research. Os ovos foram colocados a 10oC na. adega refrigeradora por dois dias, então, movidos para o Xncubador de Baixa Temperatura WR ajustado para 28°C e 2-30% de umidade Relativa em uma prateleira sob luzes de LED, até os neonatos resentemente incubados estarem com ~24.h de idade para o primeiro experimento. Alface Mud Lake Farms foi recebida em 09/07/12 e armazenada a 4^ÔC em um refrigerador até ser usada» Para cada instar, as larvas foram colocas em alfaces mud lakes farms após 24 'horas no incubador. Folhas de alface foram cortadas e colocadas em um. recipiente de polietileno quadrado médio e larvas foram atiradas no recipiente. Após 24 horas, as larvas foram removidas da alface valha e alface fresca foi substituída, de modo que as larvas não fossem criadas em menos do que o tecido superior. Isto ocox^reu uma vez ao dia, por três dias, até as larvas estarem com 96' horas de idade. Folhas de alface foram cortadas em discos usando um arco de 2 de polegada o qual foi sanitizado com etanol 70% e limpo para remover qualquer tecido de folha de ensaios anteriores. Discos de folha foram perfurados em uma placa de corte de bamboo verdadeira» Uma solução de alvejamento de 12 ppm muita diluída (1/500* diluição de 6ppt de hipoclorito (Clorox Bleach} de Estoque) foi usada para sanitizar α tecido de folha sem danificar' os discos de folha antes do enxágue quádruplo. Discos de folha foram submetidos ao tratamento de alvejamento de 12ppm colocando o disco de folha cortado em uma solução de alvejamento de 12ppm em um recipiente de polietileno retangular grande (coberto com uma tampa) e agitação a 3500rpm em um agitador orbital por 1,5 minutos. A solução de alvejamento foi, então, drenada do recipiente e as folhas foram enxaguadas em recipientes com dH2O quatro vezes para remover alvejamento residual oom ligeira agitação em diH2O no agitador orbital. Discos de falha foram colocados nas toalhas de papel e cobertos com toalhas de papel adicionais, de modo que eles não secassem. Somente os discos mais planos, circulares e uniformes foram, então, secos com Kimwipes para remover qualquer água restante e colocados em recipientes Tupperware rotulados, o lado abaxial para cima para pulverização. Durante este tempo, formulações

288/273 foram feitas (como descrito na tabela a seguir) para. as soluções de pulverização de pôs secos por spray nos discos de folha em tubo Falcon de SOmL, assegurando encher os tubos com H2O deionizada antes de adicionar a quantidade amontoada precisamente de pôs secos por spray. A pulverização foi realizada na cabine de fumo Labconco em E207 começando com o lado ventral do disco de folha. Para pulverização, um aerógrafo de mistura, interna de dupla ação (Paasch Airbrush Company, Chicago ID com a linha de ar ajustada a uma taxa de 2GOpL/segundo (20psi)< Discos de folha foram pulverizados de um modo circular com o aerógrafo perpendicular ã superfície da folha, de modo que uma névoa fina cobrisse a superfície da folha inteira uniformemente (-3-4 segundos). Entre cada pulverização de tratamento, o copo contendo solução de pulverização foi enxaguado com dH2O para remover quaisquer resíduos de tratamentos anteriores. Após pulverização, a secagem foi permitir por uma hora, então, os discos foram dobrados de modo que seu lado adaxial estivesse agora orientado voltado para cima no Recipiente Tupperware e pulverizados da mesma maneira. Apôs pulverização do lado adaxial, uma hora foi permitida para secagem e os discos de folha foram colocados em pratas petri rotulados com 2 Rapeis de Filtro Whatman 3 Qualitative de 98 mm (GE Healthcare UK Limited, Amersham Place Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, UK) no fundo que foram umedecidos com 4mL de diH2O usando urn Eppendorf Repeater Plus e uma penta de 2SmL. Pratos Petri foram cobertos e randamizados antes que -7-9 B.exigua neonates recentemente incubados fossem aplicados a cada disco de folha usando uma escova de pelos finos #0 obtendo uma placa branca e esvaziando um recipiente de neonatos de 24, 48, 72 ou 96 h nele. Os pratos foram vedadas com parafilme e colocados aleatoriamente na estante para fins estatísticos a 27*c. 0 ensaio foi classificado no dia seguinte a 18, 24, 40 e 48 horas observando a mortalidade e notando quaisquer diferenças entre folhas não tratadas e tratadas.

[629] Figura 19 mostra os resultados de mortalidade percentual de quatro experimentos registrados para cada experimento a 18.< 24, 40 e 48 horas. O tratamento de controle seco sem spray mostrou a mortalidade média mais baixa de quaisquer tratamentos. A maior parte de mortalidade de inseto é observada na classificação de 18 horas e mortalidade adicional é observada a 40 e 48 horas mostrada pela classificação de 40 e 48 horas. Insetos saudáveis têm cor tipo clorofila, verde notável, rápida resposta de evasão quando picados com pincel e crescimento médio por 48 horas. Resultados de mortalidade percentual de larvas de 72 e 96 horas são significativamente reduzidos em comparação com as larvas de 24 e 48 horas de idade. Claramente, ambos os tratamentos de proteína de Bt e peptídeo Híbrido sozinhos são ineficazes em controlar insetos mais velhos.

[630] Exemplo 2

[631] Bioensaio Foliar usando BDP 1234605 contra Spodoptera exígua em Alface Romana Mud Lakes Farms

[632] Propósito: 0 propósito deste experimento ê destinado a determinar a mortalidade percentual a qual ocorre contraE.exígua quando BDP 1234605 é pulverizado centra larvas de 72 horas de idade em um bioensaio de disco de folha foliar e quando Dipel DF é copulverizado com SDP SDP 1234605.

[633]

Preparação de Ensaio e Formulação de Tratamento:

Ver preparação no Exemplo 1< Ovos de B. exígua foram recebidos de

Benzon Research. Pratos Petri foram cobertos e randomizados antes que ~7~9 S.exígua neonatos recentemente incubados fossem aplicados a cada disco de folha usando uma escova de pelos finos #0 obtendo uma placa branca e esvaziando um recipiente de larvas de 72 h de idade nele. Os pratos foram vedados com pa.ra.fi Ime e colocados aleatoriamente na estante para fins estatísticos a 27*0\ O ensaio foi classificado no dia seguinte a 18, 24 e 48 horas observando a mortalidade e notando quaisquer diferenças entre folhas não tratadas e tratadas.

Fig. 20 mostra dados do Exemplo 2 em um gráfico de coluna a 18, 24 e 48 horas. individualmente 10 partes por milhar {ppt} de peptídeo Híbrido na formulação '605 e Dipel a 300 partes por milhão (ppm) mostram pouca melhoria sobre as mortalídades da controle não tratado ou de surfactants. No entanto, quando combinada a mortalidade resultante a 48 horas de 84,4% surpreendentemente ultrapassa, aquela que seria esperada dos efeitos aditivos dos tratamentos individuais (29,1%}. A sinergia dos componentes individuais é de pelo menos 2,9 vezes (84,4/29,1). ê inesperado que uma proteína inseticida, que mata por sepse seria sinérgica com um peptídeo inseticida que modula canais de íon no CNB.

[634] Exemplo 3

[635] Nõs investigamos os efeitos aditivos e/ou sinérgícos potenciais de combinações de proteínas de Bacillus thuríngiensis (Bt) e do peptídeo Av2 de anêmonas do mar. Nós usamos o produto de Bt: Dipel DF que ê comercialmente disponível e Av2 ccmercialmente disponível um peptídeo de anémona do mar tõxíco.

[636 ]

Métodos: Pequenos discos de folha 2cm) foram cortados nas folhas internas de repolho comprado de um armazém local. Os discos foram mergulhados em 400 μ-l» de tratamento e colocados em discos de filtro #4 de 4,25 cm (Whatman) no fundo de copos de condimento de -4,5 cm. Quarto discos foram preparados para tratamento. 75 pL de água foram aplicados a um segundo menor disco de filtro #1 de 3,2 cm (Whatman) acima do disco de filtro .maior» Os discos de folha foram deixados secar aproximadamente dez minutos antes de adicionar quatro Plutella xyloatella resistentes a Cryla. de 12 Oh de idade por disco de folha> Os copos de condimento foram vedados com tampas não perfuradas. Os tratamentos foram colocados no incubador e classificados quanto a mortalidade e danos à alimentação em 24 e 48 h. Devido ao grande consumo de discos de folha em muitos tratamentos, um disco de folha não tratado de 3,2 cm adicional foi adicionado em 24h para assegurar que a inanição larval não ocorreu.

[537] Em 24 e 48 h, fotos dos discos de folha foram tiradas usando um iphone 48 (Apple Incj, e salvas. Fotos dos discos de folhas individuais foram colhidas das fotos de tratamento do grupo e receberam números aleatórios. Usando o programa XmageJ, a área de folha comida foi calculada. A imagem foi aberta em imaged e a escala na foto foi ajustada. Para ajustar a escala, uma distância conhecida na foto sm centímetros (cm) foi desenhada usando a ferramenta de linha de segmento e medida em unidades de pixels. Para este experimento, o diâmetro conhecido do disco de papel de filtro ê de 1,5 cm para disco de filtro #1 e 4,5 cm para o disco de Filtro Whatman #4. Usando este comprimento conhecido em cm, unidades de pixel são convertidas na imagem em centímetros. Uma vez que a escala é

ajustada,	uma	ferr	amenta	de	seleção	livre e usada para desenhar
em torno	da	área	onde	o	tecido	de folha permanece. Este
processo	foi :		ido para	todas as	fotos assegurando registrar

a área calculada nela imaoem J' no notebook do laboratório. Para este experimento a área de controle de disco de folha não comido

é de 2,54cm^s e cálculos	foram feitas	para determinar %	de área
comida.
[638] Iratamento
150 FPM de Dipel DF:	í 200 pL 300	de PPM Dipel DF *	Λ. 0
água
1 PPT Av2: 0,1 mg	Av2 em 100	pL de água (quatro	frascos
combinados 1 PPT Av2 para	t ratamentos	necessários de 400	pU
150 PPM de Dipel DF	+ 1PPT Av2:	100 pL 150 PPM de	Dipel DF

foram adicionados a 0,lmg Av2 (quatro frascos foram combinados para o tratamento necessário de 400 qL}

Fig. 21 mostra o percentual de dano ã alimentação resultante de larva de mariposa de dorso de diamante resistente a proteína de Bt (12Oh de idade) em discos de folha de repolho. G escore tanto em 24horas quanto 48 horas mostra melhoria significativa sobre tratamento com Dipel sozinho. Embora estes insetos sejam resistentes a Bt, ales ainda se alimentam até certo grau sem mortalidade. 0 tratamento de combinação resulta em proteção significativamente aperfeiçoada do material foliar. Além disso, o tratamento com Av2 sozinha não tem nenhum efeito no dano ã alimentação a é apenas em combinação com a proteína de Bt que seu efeito é tornado aparente. Isto é consistente com a elevada biodisponibilidade de Av2 tornada possível pela proteína de Bt.

[639] Exempla 4

[640] Bioensaio Foliar usando SDP 1234609 e DiPel DF contra. Alface Romana Earthbound Farms

[641] Propósito: O propósito deste experimento Ó determinar a mortalidade percentual a qual ocorre contra {HD-1) xylostella resistente a Be quando SDF 1234669 é pulverizado contra larvas de 120 horas de idade em um bioensaio de disco de folha foliar e quando Dipel DF é copulverizado com' SDP 1234609.

[642] Preparação de Ensaio e Formulação de Tratamentos Ver preparação no Exemplo 1.

Fig.	22 mc	>stra dados do Exemplo	4 em um orá	fico de coluna a
24 e 43	horas	individualmente 1	parte por	milhar (ppt) de
peptídeo	Híbris	âo .na formulação *669	e Dipel a	156 partes por

milhão (ppm) mostram pouca melhoria sobre as mort•alidades de controle não tratado ou de surfactants. No entanto, quando combinadas a mortalidade resultante a 4 δ horas de 62,5% surpreendentemente ultrapassa aquela que seria esperada dos efeitos aditivos dos tratamentos individuais (21,8%}. A sinergia dos componentes individuais é de pelo menos 2,86 vezes (62,5/21,3). Novamente, é inesperado que uma proteína inseticida que mata por sepse seria sinérgica com um peptídeo inseticida que modula canais de íon no CNS<

Claims

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um Peptídeo Sinal de Retículo Endoplasmático (ERSP) de planta operavelmente ligado a uma proteína Inseticida Rica em Cisteína (CRIP).

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ERSP de planta é qualquer peptídeo sinal o qual dirige o polipeptídeo expresso para o retículo endoplasmático de células de planta.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida CRIP é uma proteína do Nó de Cistina Inibidor ( ICK) • 4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida CRIP é uma proteína Não ICK. 5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fate 3 de que o dito ERSP de planta é um peptídeo entre 5 a 50 aminoácidos de comprimento. 6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é operavelmente ligado a um constructo compreendendo um ou mais dentre: (1) um Ligante (L) ; e (2) uma Proteína de Estabilização Translacional

(STA), en i que dita STA é a mesma ou o peptídeo que o CRIP, ou um peptídeo diferente que o CRIP; em que o dito ERSP esta no N- terminal da dit constructo. 7 . Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (CRIP)

compreendendo um dipeptídeo N-terminal, caracterizado pelo fato de que o referido dipeptídeo N-terminal compreende um aminoãcido não polar N-terminal e um aminoãcido polar C-terminal.

8. CRIP, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido aminoãcido não polar N-terminal é glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina ou metionina.

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9. CRIP, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido aminoãcido polar C-terminal é serina treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptofano ou tirosina.

10. CRIP, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido aminoãcido não polar N-terminal é glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina ou metionina; e o dito aminoãcido polar C-terminal é serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptofano ou tirosina.

11. CRIP, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que dito dipeptídeo N-terminal compreende glicina de aminoãcido não polar N-terminal; e serina de aminoãcido polar C-terminal.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois tipos de proteínas ou peptídeos inseticidas, em que um tipo é uma Proteína Inseticida Formadora de Poro (PFIP) e o outro tipo é um Peptídeo Inseticida Rico em Cisteína (GRIP).

13. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o referido GRIP é um Nó de Cistina Inibidor (ICK) derivado de Hadronyche versuta, Atrax robustus, Atrax formídabílís ou Atrax ínfensus, incluindo toxinas conhecidas como polipeptídeos U-ACTX, polipeptídeos UACTX-Hvla, polipeptídeos rU-ACTX-Hvla, polipeptídeos rU-ACTXHvlb, ou variantes destes.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o referido GRIP é um GRIP Não-ICK derivado de anêmonas do mar, ouriços do mar ou lesmas do mar.

15. Método para usar a composição da reivindicação 12 para controlar insetos resistentes a Bt, caracterizado pelo fato de que compreende criar composições de pelo menos dois tipos de peptídeos em que um tipo de peptídeo é uma Proteína Inseticida Formadora de Poro (PFIP) e o outro tipo de peptídeo é um

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Peptídeo Inseticida Rico em Cisteina (CRIP) e, então, aplicar a referida composição ao locus do inseto.

16. Método para proteger uma planta de insetos resistentes a Bt, caracterizado pelo fato de compreender criar uma planta trasgênica que expressa recombinantemente uma combinação de pelo menos dois peptídeos dobrados devidamente, em que um tipo de peptídeo é uma Proteína Inseticida Formadora de Poro (PFIP) e o outro tipo de peptídeo é um Peptídeo Inseticida Rico em Cisteina (CRIP).

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o CRIP é administrado a qualquer momento durante o qual a PFIP está afetando o revestimento do intestino do inseto.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o CRIP é administrado em seguida ao teste do inseto para resistência a Bt e em que o referido inseto testou positivo para resistência a Bt.

19. Aplicação de qualquer um dos compostos descritos neste documento em forma sólida ou líquida, caracterizada pelo fato de que é a qualquer um do inseto, do locus do inseto ou como um

Protetor 20 . Incorporado na Polipetídeo, Planta. reivindicação 6, de acordo com a caracterizado pelo fato de que referido constructo compreende o seguinte polipeptídeo em uma orientação N-terminal ou c- terminal: ERSP-(L-CRIP) ¹ Ní ERSP-(CRIP-L)_N; ERSP-(CRIP-L-)_n-STA;

ERSP-(L-CRIP) _n-STA; ERSP-STA-(L-CRIP)_n; ERSP-STA-(CRIP-L)_n; ERSPCRIP-STA-L; ERSP-CRIP-STA-(L-CRIP)_N; ERSP-CRIP-STA-(CRIP-L) _N; ERSP-L-STA-CRIP; ERSP-L-STA-CRIP-(L-CRIP)_N; ERSP-L-STA-CRIP(CRIP-L)_N; ERSP-L-CRIP-(L-CRIP)_N; ou ERSP-CRIP-L-(CRIP-L)_N; em que o N subescrito indica um número de repetições variando de 1 a 200.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o CRIP não ICK é derivado de

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Anemonia viridis incluindo os peptídeos denominados Av2, Av3 ou variantes destes.

22. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a PFIP é selecionada do grupo consistindo em Cryl; Cry3; TIC851; CryETVO; Cry22; TIC901; TIC201; TIC407; TIC417; uma proteína inseticida binária CryET80 e CryET76; uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101, uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ou ET37 com uma proteína inseticida TIC810 ou TIC812; e uma proteína inseticida binária PS149B1.

23. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o CRIP é selecionado do grupo consistindo em polipeptídeos U-ACTX; polipeptídeos U-ACTX-Hvla; polipeptideos rU-ACTX-Hvla; polipeptídeos rU-ACTX-Hvlb; ou variantes destes.

24. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que que a PFIP é selecionada do grupo consistindo em Cryl; Cry3; TIC851; CryET70; Cry22; TIC901; TIC201; TIC407; TIC417; uma proteína inseticida binária CryET80 e CryET76; uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101; uma combinação de uma proteína inseticida ET29 ou ET37 com uma proteína inseticida TIC810 ou TIC812; e uma proteína inseticida binária PS149B1.

25. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o CRIP é selecionado do grupo consistindo em polipeptídeos U-ACTX; polipeptídeos U-ACTX-Hvla; polipeptídeos rU-ACTX-Hvla; polipeptídeos rU-ACTX-Hvlb; ou variantes destes.