JP6308955B2 - 毒性ペプチドの製造、植物におけるペプチドの発現、およびシステインリッチペプチドの組み合わせ - Google Patents

毒性ペプチドの製造、植物におけるペプチドの発現、およびシステインリッチペプチドの組み合わせ Download PDF

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Description

（関連出願の参照）
本出願はＰＣＴ出願であり、２０１２年３月９日に出願された米国仮特許出願第６１／６０８，９２１号、２０１２年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／６４４，２１２号、２０１２年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／６９８，２６１号、および、２０１２年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／７２９，９０５号、の優先権の利益を主張し、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
新規殺虫性のタンパク質、ヌクレオチド、ペプチド、植物におけるそれらの発現、ペプチドの製造方法、新規プロセス、製造技術、新規ペプチド、新規製剤、ならびに、昆虫の制御に関連するペプチドに予期されるものよりもより多い産生量で製造する新たな、および既知の生物体の組み合わせ、が本明細書に記述され、クレームされる。
現代農業により生産される食物および園芸の世界的な安全性は、害虫により脅かされている。農業従事者は、殺虫剤に頼り、昆虫による損害を抑えているが、危険な化学物質を除去するという業界からの要望と、化学殺虫剤および生物殺虫剤の主要な種類全てに対し抵抗性のある昆虫系統が発生したことにより、農業従事者が選択することができる安全で、機能的な、市販製品の選択肢は、減少しつつある。農作物生産の維持のために、農業従事者は、新たな殺虫剤を必要としている。
殺虫性のペプチドとは、通常は昆虫、または一部のタイプのクモ類を標的とする毒性のあるペプチドであり、通常、そのペプチドは、例えばサソリまたはクモ由来等の、クモ形類を起源とする。それらは、例えば、昆虫の胃腸もしくは内部器官へと直接注入することにより、または、食物から昆虫が毒物を吸収するよう誘導すること（例えば、トランスジェニック植物で昆虫に食餌を与える）により、内部へと送達され、および／または、それらは、昆虫が生息する場所へ、もしくはスプレー（または他の手段）により昆虫の環境中へと毒素が拡散されることにより、昆虫へと毒素が送達され、次いで、ペプチドと昆虫が何らかの形で接触する状態になることにより、成長を阻害し、運動機能を損ね、または昆虫を殺す能力を有する。
しかしながら、殺虫性のペプチドは、市販品とするには非常に多くの問題があり、現在のところ、承認され、市場で販売されている殺虫性のペプチドは、あるにはあるが、非常にわずかであり、注目すべき唯一の例外は、Ｂａｃｉｌｌｉｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来のペプチドまたはＢｔである。そして現在、Ｂｔタンパク質に対する昆虫の抵抗性が発生していることに対し、懸念が生じている。
Ｂｔタンパク質、またはＢｔペプチドは、植物組込み型の保護剤および葉面散布の両方の形態で、農作物生産に用いられている効果的な殺虫剤である。Ｂｔタンパク質の市販製剤は、幼虫段階での昆虫の制御のために広く用いられている。ＩＣＫペプチドとしては、殺虫活性を有する多くの分子が挙げられる。そのようなＩＣＫペプチドは多くの場合、自然発生の生物的な標的種（通常は、昆虫または一部のタイプのクモ形類）に毒性がある。ＩＣＫペプチドは、例えばサソリまたはクモ類の毒液等の節足動物が起源であることが多い。Ｂｔは、市販されている、ただ１つの有用な生物起源の殺虫性ペプチドである。他の、可能性のあるペプチドの種類および型も特定されており、例えば、トリプシン介在型オースタティック因子（Ｔｒｙｐｓｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＴＭＯＦ）ペプチドがある。ＴＭＯＦペプチドは、様々な方法で、その生理学的な作用部位へと送達されなければならず、そして、ＴＭＯＦペプチドは、幼虫駆除剤としての高い可能性を秘めていることが判明している（Ｄ． Ｂｏｒｏｖｓｋｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０６， ３８６９−３８７５を参照のこと）が、類似の他の全ての殺虫性ペプチドのように、ＴＭＯＦは市販されておらず、また、農業従事者に広く用いられてはいない。これには理由がある。
再現可能なペプチド構造およびフォールディング、リーズナブルで経済的な値段で、首尾良く殺虫性ペプチドを市販スケールで製造することは、非常に困難である。様々な種類の、可能性のある製造技術と組み合わせて、種類に富み、ユニークな特性および特別な性質を有する殺虫性ペプチドによって、ペプチドの応用および製造のための非常に多くの方法が可能となるが、商業化に成功しているものはごく少数である。
なぜ、同定されている多くの殺虫性ペプチドが市場にはほとんど出回っていないか、その理由はいくつかある。第一に、ほとんどの殺虫性のペプチドは、デリケートであるか、または商業的に利用するには毒性が不十分であるかのいずれかなのである。第二に、殺虫性のペプチドは、商業的に製造するのが困難であり、コストもかかる。第三に、多くの殺虫性のペプチドは、速やかに分解され、半減期が短い。第四に、植物で発現された場合、適切にフォールディングされる殺虫性ペプチドはごくわずかであり、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）ではその毒性を失ってしまう。第五に、特定されている殺虫性ペプチドのほとんどが、昆虫体内で全身に分布することができず、および／または、昆虫により摂取された際にその毒性を失ってしまう。Ｂｔタンパク質は、この最後の課題に対しては例外であり、Ｂｔタンパク質は昆虫の食物摂取を混乱させるため、広く世界で用いられるようになった。
Ｄ． Ｂｏｒｏｖｓｋｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０６， ３８６９−３８７５
本明細書において、殺虫性ペプチドの商業化および広範囲での利用を阻害する、これらの主要な課題に対するいくつかの解決法を提示する。最初の項において、昆虫に対する毒性を維持している、適切にフォールディングされた殺虫性ペプチドを植物で作製および発現させる特別な発現カセットおよびシステムを作製する方法を記述する。
第二の項において、比較的小さい変化をペプチドの組成物に作製する方法および、その際に、発酵を介して作製することができる、比率および量を劇的に増大させる方法を記述する。また、このプロセスは同時に、商業的な工業ペプチド生産のコストを減少させる。この項により、高い収率で製造され、そして驚くべきことに、それでもなお転換される前と同じ毒性のある、最も費用対効率の良い異なるペプチドへとどのようにタンパク質を「転換させる」のかを提示する。第三および最後の項において、異なる種類の殺虫性ペプチドを、共に操作し、個々の成分と比較して相乗的に劇的にその成分ペプチドの毒性および活性を変化および増大させることができるような、それら異なる種類の殺虫性ペプチドを組み合わせる方法を記述する。また、この項において、Ｂｔ抵抗性昆虫の発現および分布の迫りくる脅威を解決する、我々のシステム、方法およびペプチドの組み合わせをサポートするための詳細およびデータを提示する。Ｂｔ抵抗性昆虫は、食物の世界的な供給に対する次なる大きな脅威であり、我々は当業者に対し、この脅威に対処し、打ち勝つための方法を提示する。
本発明により、植物において毒性のある殺虫性ペプチドを製造する方法を提示し、それらは、植物により発現された際、適切にフォールディングされる。様々なベクターを用いて、実験室および商業製造環境において、高い収率でペプチドを製造する方法を提示する。我々がＣＲＩＰＳ（システインリッチ殺虫性ペプチド、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓを表す）と呼ぶ、毒性のある殺虫性ペプチドの１種を提示する。我々がＰＦＩＰＳと呼ぶ、（孔形成殺虫性ペプチド、Ｐｏｒｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓを表す）と呼ぶ、毒性のある他種の殺虫性ペプチドを提示する。そして、ＣＲＩＰＳおよびＰＦＩＰＳの新規および相乗的な組み合わせをどのように共に製造するか、ならびに、様々な目的（ＢｔまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓペプチド抵抗性昆虫に対する農作物の保護を含む）に対してどのように使用するかを提示する。昆虫、Ｂｔ抵抗性昆虫でさえも、あらゆる低用量で殺虫し、制御するＣＲＩＰＳおよびＰＦＩＰＳの組み合わせを作製および使用する方法を提示する。学説に縛られることなく、ＢｔまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓペプチドおよびタンパク質に対する我々の理解では、我々は、当業者に対し、植物を保護し、昆虫を制御するための新規の方法、組成物、化合物（タンパク質およびペプチド）および方法の作製を教示することができる。
本明細書において、システインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）（例えば、インヒビターシステインノット（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｋｎｏｔ（ＩＣＫ））モチーフタンパク質）に操作可能に連結された、小胞体シグナルペプチド（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＥＲＳＰ））から構成されるタンパク質を記述およびクレームし、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端である（ＥＲＳＰ−ＩＣＫ）。前記ＥＲＳＰが、植物細胞の小胞体に発現されるＣＲＩＰを誘導させる任意のシグナルペプチドである、ペプチド。前記ＣＲＩＰがインヒビターシステインノット（ＩＣＫ）タンパク質である、ペプチド。前記ＣＲＩＰが、非ＩＣＫタンパク質である、ペプチド。前記ＥＲＳＰが、５〜５０アミノ酸の間の長さのペプチドであり、植物由来である、ペプチド。翻訳安定化タンパク質（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＴＡ））に操作可能に連結されたペプチドであって、ここで、前記ＥＲＳＰが、前記タンパク質のＮ末端であり、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）は、任意選択的にＩＣＫモチーフタンパク質（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＩＣＫ）；もしくは非ＩＣＫモチーフタンパク質（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−非ＩＣＫ）である、ＣＲＩＰのＮ末端側上；または、ＩＣＫもしくは非ＩＣＫモチーフタンパク質（（ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＳＴＡ）もしくは（ＥＲＳＰ−非ＩＣＫ−ＳＴＡ））のＣ末端側上、のいずれかであっても良い、ペプチド。
我々は、公知のペプチドに操作可能に連結され、および、公知のペプチドに付加される、Ｎ末端ジペプチドを有するペプチドを開示し、ならびにクレームし、ここで、前記Ｎ末端ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸、および、ジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成され、ここで、前記ペプチドは、ＣＲＩＰ（システインリッチ殺虫性ペプチド）、例えば、ＩＣＫペプチド、または非ＩＣＫペプチドから選択される。公知のペプチドに付加され、および操作可能に連結されるＮ末端ジペプチドを有するペプチドであって、前記Ｎ末端ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸、およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される、ペプチド。Ｎ末端ジペプチドのＮ末端アミノ酸の非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択される、ペプチド。Ｎ末端ペプチドのＣ末端アミノ酸の極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンから選択される、ペプチド。Ｎ末端ジペプチドのＮ末端アミノ酸の非極性アミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択され、Ｎ末端ペプチドのＣ末端アミノ酸の前記極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンから選択される、請求項８に記載のペプチド。前記ジペプチドが、グリシン−セリンから構成される、ペプチド。
本明細書において、少なくとも２つのタイプの殺虫性タンパク質またはペプチドを含有する組成物を開示し、ここで、１つのタイプは、孔形成殺虫性タンパク質（Ｐｏｒｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＰＦＩＰ））であり、他方のタイプは、システインリッチ殺虫性ペプチド（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ （ＣＲＩＰ））である。前記ＣＲＩＰはＩＣＫであり、および任意選択的に、前記ＩＣＫは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、または、ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｆｕｎｎｅｌ ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ）、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓ（Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは突然変異体または変異体）として知られる毒素を含む）から誘導される、または由来する。前記ＣＲＩＰは、非ＩＣＫ ＣＲＩＰであり、および任意選択的に前記非ＩＣＫ ＣＲＩＰが、非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳを有する動物（例えば、イソギンチャク、ウニおよびウミウシ等（任意選択的に、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉと名付けられているイソギンチャクを含む））から誘導される、または由来し、任意選択的に、Ａｖ２およびＡｖ３と名付けられるペプチド、特に配列表にリストアップされるペプチドまたは突然変異体または変異体を含むＡｖ２およびＡｖ３に類似するペプチドを含む。
我々は、請求項１３に記載の組成物を、Ｂｔ抵抗性昆虫を制御するために使用する方法を開示し、方法には、少なくとも２つのタイプのペプチドの組成物を作製すること（ここで、ペプチドの１つのタイプは、孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他のペプチドのタイプは、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰとＣＲＩＰタンパク質は、請求項１および本明細書に記述される任意の組成物、ならびに、配列表に提示される任意のタンパク質から選択される）、および、次いで、前記組成物を、昆虫の位置に適用することが含まれる。Ｂｔ抵抗性昆虫を制御する方法には、少なくとも２つの適切にフォールディングされるペプチドの組み合わせを発現する植物を作製することを含む、Ｂｔ抵抗性昆虫から植物を防御することが含まれ、ここで、ペプチドの１つのタイプは、孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他のペプチドのタイプは、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰタンパク質は、本明細書に記述される任意の組成物、および配列表に提示される任意のタンパク質から選択される。ＣＲＩＰは、ＰＦＩＰが昆虫の消化管の内膜に影響を与える任意の時間の間、投与される、方法。前記ＣＲＩＰが、Ｂｔ抵抗性について昆虫をテストした後に投与される方法であって、ここで、前記テストされる昆虫が、Ｂｔ抵抗性が陽性である、方法。本明細書において、固体または液体の形態にある、本明細書に記述される任意の化合物を、昆虫、昆虫のいる位置、または植物組込み型保護剤（Ｐｌａｎｔ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）としてのいずれかに対して適用することを記述する。
ＣＲＩＰ（システインリッチ殺虫性タンパク質）（例えば、ＩＣＫ（インヒビターシステインノット）モチーフ（縦縞））への、ＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド（斜線））のＮ末端融合の本発明の略図である。 ＳＴＡ（翻訳安定化タンパク質（横縞））と融合されたＣＲＩＰモチーフ殺虫性タンパク質（縦縞）への、ＥＲＳＰ（斜線）のＮ末端融合の本発明の略図である。図２において、２つの可能性のある方向性を示す。 翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）（横縞）と融合されたＣＲＩＰモチーフ（縦縞）へ融合された、ＥＲＳＰ（斜線）のＮ末端融合の、本発明の略図である。ＳＴＡは、格子柄で示される、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）と呼ばれる介在配列により、ＣＲＩＰモチーフから分離される。２つの可能性のある方向性を、図３に示す。 ＬＩＮＫＥＲ−ＣＲＩＰモチーフは、１回、または繰り返し数回、好ましくは１〜１０回繰り返し使用されることが可能である（さらには１５、２０または２５回まで多く使用されることが可能である）ことを示す、下付き文字「Ｎ」で表された（ＬＩＮＫＥＲ−ＣＲＩＰ）モチーフを有する、図３に類する略図である。 ＣＲＩＰ−ＬＩＮＫＥＲまたはＩＣＫ−ＬＩＮＫＥＲ群が、ＳＴＡ−ＬＩＮＫＥＲ群としても機能することができることを示す略図である。言い換えると、ＣＲＩＰ−ＬＩＮＫＥＲまたはＩＣＫ−ＬＩＮＫＥＲの組み合わせは、ＳＴＡ−ＬＩＮＫＥＲとして機能することができる。言い換えると、１つのＬＩＮＫＥＲを有する２つのＩＣＫモチーフを用いることができ、翻訳安定化タンパク質またはＳＴＡを不要とすることができる。 インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質中の、システインの共有結合架橋の概略である。概略図中の矢印はβシートを表す；数字は、Ｎ〜Ｃ末端の一次構造中に存在する順に番号付けられた、ＩＣＫモチーフ形成システインアミノ酸を表す。太い曲線は、タンパク質の一次構造を表す；薄い直線は、ＩＣＫモチーフを生成する、特定のシステインの共有結合架橋を表す。システイン番号２を包含するβシートは、存在しないこともある。 様々な他の構造要素との翻訳融合物としてのＡＣＴＸをコードする植物の導入遺伝子からの発現から得られた、総可溶性タンパク質のパーセンテージ（％ＴＳＰ）としての、ＡＣＴＸのＥＬＩＳＡ検出レベルのグラフである。 異なる蓄積位置での、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを融合した、タバコ一過性発現ＧＦＰのｉＥＬＩＳＡ検出％ＴＳＰのグラフである。ＡＰＯ：アポプラスト位置；ＣＹＴＯ：細胞質位置；ＥＲ：小胞体位置。 ３つの異なるＥＲＳＰ配列を有する翻訳融合物をコードするＦＥＣＴ発現ベクターを用いた、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ融合ＧＦＰを、一過性発現するタバコの葉のｉＥＬＩＳＡ検出％ＴＳＰのグラフである：ＢＡＡＳシグナルペプチド（ＢＧＩＨ）、エクステンシンシグナルペプチド（ＥＧＩＨ）および改変エクステンシンシグナルペプチド（Ｅ※ＧＩＨ）。 一過性形質転換されたタバコの葉から抽出された、トリプシン処置および非トリプシン処置Ｊｕｎ ａ３融合オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の濃縮プロセスの略図である。 オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを含有する試料のＨＰＬＣクロマトグラフである。クロマトグラフを作製するために、ＨＰＬＣシステムにロードされた試料は以下である：Ａ．２５μｇ合成オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ；Ｂ．５００μＬ試料Ｂ １ｋＤ ろ過残余分；Ｃ．５００μＬの試料Ａ １ｋＤ ろ過残余分。 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）株で産生された、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（本明細書において、「Ｕ＋２」と呼称することもある）および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（本明細書において、「天然型Ｕ」と呼称することもある）の両方の、正規化ペプチド産生量分布のグラフ表示である。Ｕ＋２データは、黒色で示し、天然型Ｕデータは、グレーで示す。Ｘ軸は、６００ｎｍの波長での、ミリグラム／リットル・吸光度の単位（ｍｇ／Ｌ．Ａ．）での、正規化産生量を示す。左のＹ軸は、Ｕ＋２株のフラクションを示す。右のＹ軸は、天然型Ｕ株のフラクションを示す。 Ｕ＋２および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株からの正規化ペプチド産生量分布のもう１つのグラフ表示である。ここで、Ｙ軸は、個々の株に対する、６００ｎｍの波長での、ミリグラム／リットル・吸光度の単位（ｍｇ／Ｌ．Ａ．）での、正規化産生量を示し（以下に記述される、各培養における細胞密度に対して正規化）、Ｘ軸は、同じペプチドアイソフォームを産生するように操作された他の全てのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に対して観察された産生量に関して、各株に対し観察された産生量のパーセンタイル順位に相当する。 Ｕ＋２および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを用いた、イエバエ注入バイオアッセイの用量応答性に関するグラフ表示である。Ｕ＋２データは、黒色の丸ドットで印を付けられ、天然型Ｕデータは、グレーの三角で印を付けられている。Ｘ軸は、イエバエのグラム当たりの、ピコモル単位での投与量を示す。Ｙ軸は、死亡率のパーセンテージを示す。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株から産生された、Ｕ＋２および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａからのペプチド産生量分布のグラフ表示である。Ｕ＋２データは黒色で示し、天然型Ｕデータはグレーで示す。Ｘ軸は、ｍｇ／Ｌでの産生量を示し、Ｙ軸は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株からの、総Ｕ＋２または天然型Ｕ産生のフラクションを示す。 Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株から産生された、Ｕ＋２および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａからのペプチド産生量分布のもう１つのグラフ表示である。ここで、Ｙ軸は、個々の株に対する、産生量（ｍｇ／Ｌ）を示し、Ｘ軸は、各株に対し観察された産生量のパーセンタイル順位に相当する（同じペプチドアイソフォームを産生するように操作された、他の全てのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に対して観察された産生量に関する）。 Ｋ．ｌａｃｔｉｓ発現株から産生された、イソギンチャク毒素、Ａｖ３およびＡｖ３＋２のペプチド産生量分布のグラフ表示である。天然型毒素は、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉｓと名付けられたイソギンチャクから、Ａｖ３と名付けられる。改変毒素は、ここで、Ａｖ３＋２と名付けられる。上述の試料のように、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓまたは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株において毒素ペプチドを産生した。Ｘ軸は、個々の株に対する、ｍＡｕ．ｓｅｃ／Ａでのペプチド産生量を示し、Ｙ軸は、株のフラクションを示す。図１７において、天然型Ａｖ３株は、ライトグレーで示され、改変高産生株Ａｖ３＋２は、黒色で示される。 同じペプチドを産生する形質転換体のパーセンタイル順位の関数として、ペプチド産生量をプロットすることにより、対応するＫ．ｌａｃｔｉｓ株から産生されたＡｖ３＋２および天然型Ａｖ３のペプチド産生量の差異を示す。ここで、Ｙ軸は、同じペプチドアイソフォームを産生するように操作された他の全てのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に対して観察された産生量に関する、個々の株に対する、ｍＡｕ．ｓｅｃ／Ａでの正規化産生量を示し、Ｘ軸は、各株に対して観察された産生量のパーセンタイル順位に相当する。 ＩＣＫペプチドまたはＢｔタンパク質の適用および曝露後の、幼虫の齢に対する、葉バイオアッセイ２４時間死亡率パーセントのグラフである。 Ｂｔタンパク質またはＩＣＫペプチドまたはＢｔ＋ＩＣＫペプチドの組み合わせを用いた適用後、１８、２４、および４８時間の７２時間幼虫の死亡率パーセントを測定した葉バイオアッセイのグラフである。 Ｂｔタンパク質または非ＩＣＫ ＣＲＩＰまたはその組み合わせへの暴露後、２４時間および４８時間での、Ｂｔ抵抗性昆虫による葉損傷を測定した、葉摂取バイオアッセイのグラフ。 Ｂｔタンパク質抵抗性Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ幼虫に対する、Ｂｔタンパク質またはＩＣＫペプチドまたはそれらの組み合わせを用いた適用後、２４時間および４８時間での死亡率を測定した、葉摂取バイオアッセイのグラフ。
（配列表の簡単な説明）
本発明は、１５９３の配列の配列表を含む。
配列番号１−２８、１５５３−１５７０および１５９３は、パート１として言及または参照される。
配列番号２９−３２および１５７１−１５９２は、パート２として言及または参照される。
配列番号３３−１０４２は、パート３として言及または参照される。
配列番号１０４３−１２２１は、クモ起源から得られた、またはクモ起源を有する配列である。
配列番号１２２２−１２６２は、イソギンチャク起源から得られた、またはイソギンチャク起源を有する配列である。
配列番号１２６３−１３３６は、サソリ起源から得られた、またはサソリ起源を有する配列である。
配列番号１３３７−１３６５は、サソリ起源から得られた、またはサソリ起源を有する配列である。
配列番号１３６６−１４４６は、ＣｒｙまたはＣｙｔ起源から得られた、またはＣｒｙまたはＣｙｔ起源を有する配列である。
配列番号１４４７−１５５２は、ＶＩＰ起源から得られた、またはＶＩＰ起源を有する配列である。
＜定義＞
「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」とは、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属する、オーストラリアジョウゴグモから単離された、殺虫性ＩＣＫペプチドのファミリーを意味する。そのようなクモの１つは、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモとして知られ、学名は、Ｈｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａである。この種由来のＡＣＴＸペプチドの２つの例は、オメガおよびＵペプチドである。
「アグロインフェクション（Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、植物形質転換法を意味し、アグロバクテリア Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いることにより、植物細胞へＤＮＡが導入される。
「ＢＡＡＳ」とは、オオムギα−アミラーゼシグナルペプチドを意味する。ＥＲＳＰの一例である。
「バイナリーベクター」または「バイナリー発現ベクター」とは、大腸菌株およびアグロバクテリウム株の両方において、自身で複製することができる発現ベクターを意味する。また、このベクターは、アグロバクテリウムにより植物細胞へとコピーおよび送達される、毒性遺伝子により認識される、左右の境界配列により囲まれるＤＮＡ（しばしば、ｔ−ＤＮＡと呼称される）の領域を含有する。
「Ｂｔ」は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓもしくは、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとしても知られており、農業、臨床および公衆衛生上の害虫を制御するために６０年以上にわたり世界中で用いられているグラム陽性土壌バクテリウムを意味する。
「Ｂｔタンパク質」および「Ｂｔペプチド」とは、本明細書で同じものを指し、これらは、Ｂｔにより産生されるペプチドである。そのようなペプチドは、たびたび、「ｃｒｙ」、「ｃｙｔ」または「ＶＩＰ」タンパク質と記述され、ｃｒｙ、ｃｙｔ、およびｖｉｐ遺伝子によりコードされる。Ｂｔタンパク質は、通常、ｃｒｙ遺伝子によりコードされる殺虫性結晶タンパク質に属する。Ｂｔタンパク質は、以下に定義される、ＰＦＩＰＳ（孔形成殺虫性タンパク質）の一例である。例示的なＰＦＩＰＳおよび他のＢｔタンパク質は、配列表に提示される。
「キメラ遺伝子」とは、新しい遺伝子を産生するために、１以上のコード配列の部分から誘導される遺伝子をコードするＤＮＡ配列を意味する。
「開裂可能なリンカー」とは、タンパク質を２つの部分へと開裂および分離することができるプロテアーゼの標的部位である、タンパク質中の短いペプチド配列、または、ＯＲＦ中のリーディングフレーム中に位置し、タンパク質を２つの部分へと開裂および分離することができるプロテアーゼの標的部位である、タンパク質中の短いペプチド配列をコードする、短いＤＮＡ配列を意味する。
「馴化培地」とは、細胞により使用された細胞培養培地を意味し、細胞誘導物質に富むが、細胞を含有しないものである。
「転換」または「転換された」とは、ＨＰペプチドを作製するプロセスを指す。
「ＣＲＩＰ」および「ＣＲＩＰＳ」とは、システインリッチ殺虫性タンパク質（複数含む）の略語である。システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、ジスルフィド結合を形成するシステインに富んだペプチドである。ＣＲＩＰＳは、少なくとも１０アミノ酸を有するタンパク質またはペプチド中に、少なくとも４、時に６、および時に８のシステインアミノ酸を含有し、ここで、システインは、２、３、または４のジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合は、フォールディング、３次元構造および殺虫性ペプチドの活性に寄与する。システイン−システインジスルフィド結合および、それらにより形成される３次元構造は、これらの殺虫性ペプチドの毒性において、重要な役割を果たす。ＣＲＩＰは、インヒビターシステインノットまたはＩＣＫペプチド（通常、６〜８システインを有する）の両方が典型例であり、および、ジスルフィド結合を有するが、ＩＣＫペプチドとはみなされない毒性ペプチド（非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳ）の例もある。ＩＣＫの例は、クモ由来のＡＣＴＸペプチドおよび上記に定義されるものである。非ＩＣＫ ＣＲＩＰの例は、Ａｖ２およびＡｖ３等のペプチドであり、イソギンチャクから最初に同定されたペプチドである。これらのペプチドは、昆虫の末梢神経系（ＰＮＳ）中のナトリウムチャネルを調節する化合物類の例である。非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳは、４〜８システインを有し、それらは２〜４のジスルフィド結合を形成する。これらのシステイン−システインジスルフィド結合安定化毒性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、環境中に曝されたとき、驚くべき安定性を有し得る。多くのＣＲＩＰＳは、例えばクモ、サソリ、ヘビおよびウミヘビおよびイソギンチャク等の有毒動物から単離され、昆虫に対する毒性がある。さらなる詳述は以下に示す。
「既知培地（Ｄｅｆｉｎｅｄｍ ｍｅｄｉｕｍ）」とは、既知の化学成分から構成されるが、粗タンパク性の抽出物または、例えば酵母抽出物もしくはペプトン等の副産物を含有しない培地を意味する。
「ジスルフィド結合」とは、その側鎖上の２つのチオール基のカップリングにより誘導される、２つのシステインアミノ酸間の共有結合を意味する。
「ダブル導入遺伝子ペプチド発現ベクター」または「ダブル導入遺伝子発現ベクター」とは、殺虫性ペプチドの発現カセットを２コピー含有する酵母発現ベクターを意味する。
「ＥＬＩＳＡ」または「ｉＥＬＩＳＡ」とは、試料がプレートの表面に固定され、次いで、以下のように検出される分子生物学的プロトコールを意味する：一次抗体をアプライし、次いで、無色基質を、検出可能な発色基質へと転換させる酵素に結合された二次抗体をアプライし、試料全体にわたり定量する。プロトコールの間、抗体は、エピトープに結合している抗体のみが検出のために残るように、洗浄される。我々が所有している試料は、植物から単離されたタンパク質であり、ＥＬＩＳＡにより、回収された発現トランスジェニックタンパク質の量が定量される。
「発現ＯＲＦ」とは、タンパク質複合体をコードするヌクレオチドを意味し、ＯＲＦ中のヌクレオチドとして定義される。
「ＥＲ」または「小胞体」は、全ての真核生物に共通の細胞内小器官であり、ここで一部の翻訳後修飾プロセスが発生する。
「ＥＲＳＰ」または「小胞体シグナルペプチド」は、トランスジェニックｍＲＮＡ分子のタンパク質翻訳の間に、宿主細胞シグナル認識粒子により認識および結合されるアミノ酸のＮ末端配列であり、タンパク質翻訳リボソーム／ｍＲＮＡ複合体を、細胞質のＥＲへと移動させる。結果、ＥＲとドッキングするまでタンパク質翻訳が停止され、ＥＲにおいてそれが継続し、得られたタンパク質はＥＲ内へと注入される。
「ｅｒｓｐ」とは、ＥＲＳＰペプチドをコードするヌクレオチドを意味する。
「ＥＲトラフィッキング」とは、翻訳後修飾、ソーティングおよび輸送のための、細胞発現タンパク質のＥＲへの輸送を意味する。
「ＦＥＣＴ」とは、コーティングタンパク質遺伝子および三重遺伝子ブロックの除去を伴うＦｏｘｔａｉｌモザイクウイルスを用いた一過性の植物発現システムを意味する。
「ＧＦＰ」とは、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質を意味する。翻訳安定化タンパク質の一例である。
「高産生ペプチド」または「ＨＰペプチド」とは、本明細書に記述される手順に従い、作製することができる、または「転換する」ことができるペプチドを意味し、転換された時点で、増大した産生量で、または高率生産で、または通常の量よりも多い量で、生物学的システム中で製造することができる。高率生産は、転換前のペプチドを製造するために用いられたものと同じ製造方法または類似の製造方法を用いて、転換前のペプチドで得られるものよりも２０〜４００％以上高いものであっても良い。
「ハイブリッドペプチド」、またの名を「ハイブリッド毒素」、またの名を「ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」またの名を「天然型ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」ならびに、「Ｕペプチド」またの名を「Ｕ毒素」またの名を「天然型Ｕ」またの名を「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」またの名を「天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は、全て、ＡＣＴＸペプチドを指し、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａとして知られるクモから発見されたものであり、昆虫の電位依存性Ｃａ２＋チャネルおよび電位依存性Ｋ＋チャネルに対するデュアルアンタゴニストである。
「ＩＧＥＲ」とは、１文字コードの実際の配列に基づく、短いペプチドに対する名称である。介在リンカーの一例である。
「ＩＣＫモチーフ」、「ＩＣＫモチーフタンパク質」、「インヒビターシスチンノットモチーフ」、「毒性昆虫ＩＣＫペプチド」、「ＩＣＫペプチド」、「ＣＫペプチド」、「シスチンノットモチーフ」、または「シスチンノットペプチド」とは、３つのジスルフィド架橋を有する、少なくとも６半シスチンコアアミノ酸を伴う１６〜６０アミノ酸ペプチドを意味し、ここで、３つのジスルフィド架橋は共有結合であり、６半シスチン残基の内、共有ジスルフィド結合は、Ｎ末端アミノ酸から始まる、６コア半シスチンアミノ酸の、第一と第四の間、第二と第五の間、および第三と第六の半シスチンの間である。概して、このタイプのペプチドは、βヘアピン二次構造（通常、モチーフの第四および第六のコア半シスチンの間に位置付けられる残基から構成される）を含有し、ヘアピンは、モチーフの３つのジスルフィド結合によりもたらされる構造的架橋により安定化される。付加的なシステイン／シスチンまたは、半シスチンアミノ酸が、インヒビターシスチンンノットモチーフの内に存在しても良いことに留意されたい。配列表に例を提示する。
「ｉｃｋ」とは、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。
「ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦ」または「発現ＯＲＦ」とは、ＩＣＫモチーフタンパク質複合体をコードするヌクレオチドを意味し、ＯＲＦ中のヌクレオチドとして定義される。
「ＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター」または「ＩＣＫ発現ベクター」または「ＩＣＫモチーフ発現ベクター」とは、発現ＯＲＦを含有するバイナリーベクターを意味する。バイナリーベクターはまた、ＯＲＦの発現およびそれがコードするタンパク質の発現を促進するための、発現ＯＲＦを囲む、必要な転写プロモーターおよびターミネーター配列を含有する。
「昆虫」とは、任意の節足動物および線形動物を意味し、コナダニ類、および全ての農産物、野菜、および樹木に群がることが知られる昆虫を含み、ならびに、林業、園芸および農業の分野において害虫であるとみなされている昆虫を含む。本明細書に記述される方法で保護されうる特定の農作物の例は、大豆、トウモロコシ、綿花、アルファルファおよび野菜作物である。特定農作物および昆虫のリストは、本明細書の終わり頃にある。
「昆虫腸内環境」または「腸内環境」とは、昆虫または昆虫の幼虫の、前腸、中腸および後腸内に見出される、特定のｐＨおよびプロテイナーゼ条件を意味する。
「昆虫の血リンパ環境」とは、昆虫または昆虫の幼虫内に見出される、特定のｐＨおよびプロテイナーゼ条件を意味する。
「殺虫活性」とは、昆虫が化合物またはペプチドに曝されている最中、またはその後に、昆虫が、死ぬか、その動きもしくは摂食行動を止めるか、または減速するか、成長を止めるまたは減速させるか、または、蛹化に失敗するかのいずれかであり、再生または繁殖力のある子孫を産生することができないことを意味する。
「殺虫性ペプチド」または「殺虫性タンパク質」または「毒性ペプチド」または「毒性タンパク質」とは、昆虫が摂取、または昆虫と接触、または昆虫内に注入された際に、殺虫活性を有するタンパク質を意味する。
「殺虫性ペプチド産生株スクリーニング」とは、低産生株から、高殺虫性ペプチド産生酵母株を特定するスクリーニングプロセスを意味する。本明細書に記述される方法において、逆相ＨＰＬＣまたはイエバエ注入バイオアッセイを用いるスクリーニングを指す。
「統合発現ベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」または「統合ベクター」とは、酵母細胞ゲノムの特定の遺伝子座にそれ自身を挿入することができ、そして安定して酵母ゲノムの一部となる酵母発現ベクターを意味する。
「介在リンカー」とは、タンパク質の異なる部分を分ける、タンパク質中の短いペプチド配列、または、ＤＮＡにコードされるタンパク質が、タンパク質翻訳の間に、独立した二次構造および三次構造を取れるように、上流ＤＮＡ配列および下流ＤＮＡ配列を分けるための、ＯＲＦのリーディングフレーム中に位置する短いＤＮＡ配列を意味する。介在リンカーは、植物細胞環境中、昆虫および／もしくは鱗翅目昆虫の腸環境中、ならびに、昆虫の血リンパ環境中および鱗翅目昆虫の血リンパ環境中での開裂に抵抗性または感受性のいずれであっても良い。
「公知のペプチド」とは、生物学活性を有していることが知られているペプチドを意味し、成熟ペプチドまたは、プレおよびプロペプチドを含む、その任意の型もしくは断片、および活性ペプチドの結合物であっても良い。好ましい公知のペプチドは、殺虫活性を有するものである。
本題中の「Ｌ」は、介在リンカーペプチドを意味し、ＩＣＫモチーフタンパク質、または、複合ＩＣＫモチーフタンパク質ドメインと、翻訳安定化タンパク質を結び付け、および、同じ、または異なる複合ＩＣＫモチーフタンパク質を結び付ける。アミノ酸に対して言及した場合、「Ｌ」はまた、ロイシンを意味することがある。
「リンカー」、「ＬＩＮＫＥＲ」または一部の文脈においては、「Ｌ」は、介在リンカーペプチドを意味し、それらは、ＩＣＫモチーフタンパク質または、複合ＩＣＫモチーフタンパク質ドメインと、翻訳安定化タンパク質を結び付け、および、同じまたは異なる複合ＩＣＫモチーフタンパク質を結び付ける。リンカーは、（少なくとも）３つの役割の内の１つを有することができる：昆虫腸内環境中で開裂すること、植物細胞中で開裂すること、または、意図して開裂しないように設計されること。
「ｌ」または「ｌｉｎｋｅｒ」は、介在リンカーペプチドをコードするヌクレオチドを意味する。
「鱗翅目昆虫の腸環境」とは、鱗翅目昆虫もしくは幼虫の前腸、中腸または後腸内に見出される、特定のｐＨおよびプロテイナーゼ状態を意味する。
「鱗翅目昆虫の血リンパ環境」とは、鱗翅目昆虫または幼虫内に見出される、特定のｐＨおよびプロテイナーゼ状態を意味する。
「複合ＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン」とは、複数の介在リンカーペプチドにより結び付けられる、複合ＩＣＫモチーフタンパク質から構成されるタンパク質を意味する。複合ＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン内のＩＣＫモチーフタンパク質は同じまたは異なっていても良く、ならびに、このドメイン中の介在リンカーペプチドも、同じまたは異なっていても良い。
「非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳ」は、４〜８システインを有しても良く、それらは２〜４のジスルフィド結合を形成する。非ＩＣＫペプチドには、ＩＣＫペプチドではないシスチンノットペプチドが含まれる。非ＩＣＫペプチドは、ＩＣＫとは異なるシスチン結合の結合順序を有していても良い。非ＩＣＫ ＣＲＩＰの例は、Ａｖ２およびＡｖ３等のペプチドであり、それらはイソギンチャクから最初に特定されたペプチドである。これらのイソギンチャクペプチドは、昆虫の末梢神経系（ＰＮＳ）のナトリウムチャネルを調節する化合物の種類の一例である。
「非極性アミノ酸」は、弱い疎水性のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンが含まれる。グリシンまたはｇｌｙは、本発明のジペプチドに対し、最も好ましい非極性アミノ酸である。
「正規化ペプチド産生量」とは、ペプチド産生量が測定される時点で、対応する細胞密度により分割された馴化培地中のペプチド産生量を意味する。ペプチド産生量は、体積単位での産生されたペプチドの質量により表すことができ、例えば、リットル当たりのｍｇもしくはｍｇ／Ｌ、または、ＨＰＬＣクロマトグラフィーでの産生されたペプチドのＵＶ吸光ピーク面積により表すことができる（例えば、ｍＡｕ．ｓｅｃ）。細胞密度は、６００ｎｍでの培養物の可視光吸光度により表すことができる（ＯＤ６００）。
「一文字コード」とは、タンパク質の一次構造中の様々なアミノ酸を識別するための、その一文字コードにリストアップされるペプチド配列を意味する。アラニン＝Ａ、アルギニン＝Ｒ、アスパラギン＝Ｎ、アスパラギン酸＝Ｄ、アスパラギンまたはアスパラギン酸＝Ｂ、システイン＝Ｃ、グルタミン酸＝Ｅ、グルタミン＝Ｑ、グルタミンまたはグルタミン酸＝Ｚ、グリシン＝Ｇ、ヒスチジン＝Ｈ、イソロイシン＝Ｉ、ロイシン＝Ｌ、リジン＝Ｋ、メチオニン＝Ｍ、フェニルアラニン＝Ｆ、プロリン＝Ｐ、セリン＝Ｓ、スレオニン＝Ｔ、トリプトファン＝Ｗ、チロシン＝Ｙ、バリン＝Ｖ。
「オメガペプチド」またの名を「オメガ毒素」またの名を「オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」またの名を「天然型オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は、全て、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａとして知られるクモから最初に単離されたＡＣＴＸペプチドを指し、昆虫の電位依存性Ｃａ２＋チャネルに対するアンタゴニストである。
「ＯＲＦ」または「オープンリーディングフレーム」または「ペプチド発現ＯＲＦ」とは、ＡＴＧ開始コドンで始まり、ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ停止コドンで終わるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。ＯＲＦはまた、ＤＮＡがコードする翻訳タンパク質を意味することができる。
「操作可能に連結された」とは、２つの隣接するＤＮＡ配列が、１つの転写活性化が他方に作用することができるように、共に配置されることを意味する。
「ＰＥＰ」とは、植物発現ペプチド（Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を意味する。
「ペプチド発現カセット」または「発現カセット」とは、生物学的発現システム中の殺虫性ペプチドの転写を完了するために必要なＤＮＡ要素全てから構成されるＤＮＡ配列を意味する。本明細書に記述される方法において、転写プロモーター、α接合因子シグナル配列およびＫｅｘ２開裂部位をコードするＤＮＡ配列、殺虫性ペプチド導入遺伝子、停止コドンおよび転写ターミネーターが含まれる。
「ペプチド発現ベクター」とは、異種殺虫性ペプチド導入遺伝子を含有する、宿主生物発現ベクターを意味する。
「ペプチド発現酵母株」、「ペプチド発現株」または「ペプチド産生株」とは、異種殺虫性ペプチドを産生することができる酵母株を意味する。
「特別に製造されたペプチド」とは、産生量を増加させるために用いられる本明細書に記述される方法により、従前、生物的発現システムではペプチド産生量が低かったペプチドが、ＨＰペプチドとなることを意味する。
「ペプチド導入遺伝子」または「殺虫性ペプチド導入遺伝子」とは、殺虫性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味し、生物的発現システム中で翻訳されることができるものである。
「ペプチド産生量」とは、ペプチド発現酵母株の細胞から産生される、馴化培地中の殺虫性ペプチド濃度を意味する。体積単位で産生されたペプチドの質量により表されても良く（例えば、リットル当たりのｍｇまたはｍｇ／Ｌ）、または、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで産生されたペプチドのＵＶ吸光度ピーク面積により表されても良い（例えば、ｍＡｕ．ｓｅｃ）。
「囲食膜（Ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）」とは、大きな食物粒子を捕える昆虫の腸内の内膜を意味し、消化させながら腸を通過させる動きを手助けし、腸壁も保護する。
「ＰＦＩＰ」とは、昆虫の腸に並ぶ細胞中に孔またはチャネルを形成することができるタンパク質を意味し、例えば腸上皮細胞がある。ＰＦＩＰＳの例は、例えばｃｒｙ、ｃｒｔおよびＶＩＰ等のＢｔタンパク質があり、他のＰＦＩＰの例は配列表の中に見出される。
「ＰＩＰ」または「植物組込み型保護剤」とは、トランスジェニック植物により産生された殺虫性タンパク質、およびタンパク質を産生するために植物に必要な遺伝的材料を意味する。
「植物開裂可能なリンカー」とは、植物プロテアーゼ認識部位を含有し、植物細胞中でのタンパク質発現プロセス中に開裂することが可能な、開裂可能なリンカーペプチドをコードするヌクレオチド、または開裂可能なリンカーペプチドを意味する。
「植物再生培地」とは、植物の成長に必要な成分およびビタミン、ならびに細胞の胚への再生を促進するために必要な植物ホルモンを含有する任意の培地を指し、それにより、組織培養物から誘導された栄養分体（ｐｌａｎｔｌｅｔ）を発生および生成することができる。多くの場合、培地は、選択可能剤を含有し、トランスジェニック細胞は、その選択可能剤に対する抵抗性を与える選択遺伝子を発現している。
「植物トランスジェニックタンパク質」とは、コードするＤＮＡまたはＲＮＡが、１以上の植物細胞内へと送達された後に、植物内で発現される異種のタンパク質を意味する。
「極性アミノ酸」とは、極性があるアミノ酸であり、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンが含まれ、好ましくは、極性アミノ酸はセリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンであり、最も好ましくはセリンである。
「転写後遺伝子サイレンシング」または「ＰＴＧＳ」とは、遺伝子の発現を抑制する生細胞内の細胞プロセスを意味する。
「タンパク質」とは、本明細書において、「ペプチド」と同じ意味を有する。
「組換えベクター」とは、外来性ＤＮＡが挿入されるＤＮＡプラスミドベクターを意味する。
「選択遺伝子」とは、遺伝的に改変された生物を、選択圧力のもと、増殖させる利点を与える遺伝子を意味する。
「ＳＴＡ」または「翻訳安定化タンパク質」または「安定化」タンパク質または「融合タンパク質」とは、タンパク質分解の細胞プロセスによる標的にされることなく、細胞内に蓄積することができる、十分な三次元構造を有するタンパク質を意味する。タンパク質は、５〜５０ａａ（例えば、他のＩＣＫモチーフタンパク質）、５０〜２５０ａａ（ＧＮＡ）、２５０〜７５０ａａ（例えばキチナーゼ）および７５０〜１５００ａａ（例えばエンハンシン（ｅｎｈａｎｃｉｎ））の間であっても良い。翻訳安定化タンパク質は、ＯＲＦで殺虫性タンパク質をコードする配列を有するフレーム内に融合されるタンパク質に対するＤＮＡ配列によりコードされる。融合タンパク質は、殺虫性タンパク質の上流または下流のいずれかであっても良く、介在配列が、いずれかのＤＮＡ配列のフレームシフトをもたらさない限り、２つの配列の間に任意の介在配列を有しても良い。翻訳安定化タンパク質はまた、ＩＣＫモチーフタンパク質が昆虫の腸壁を横切り血リンパへと送達されることを増加させる活性を有しても良い。そのような送達は、腸壁全体にわたるＯＲＦ全体を積極的にトラフィッキングすることにより得ることができ、または、翻訳安定化タンパク質が囲食膜および／または腸壁を損傷させ、血リンパ内へのＩＣＫモチーフタンパク質の拡散を増加させながら、腸環境内で開裂し、ＩＣＫモチーフタンパク質を分離することにより得られても良い。
「ｓｔａ」とは、翻訳安定化タンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。
「ＴＭＯＦ」、「ＴＭＯＦモチーフ」または「ＴＭＯＦタンパク質」とは、「トリプシン介在オースタティック因子（ｔｒｙｐｓｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）」タンパク質配列を意味する。配列表に例示する。多くの例および変異体が本明細書に提示される。配列番号７０８は、野生型ＴＭＯＦ配列である。他の非限定的な変異型は、配列番号７０９〜７２１に提示される。他の例は、当業者により公知または作製することができる。
「ＴＳＰ」または「総可溶性タンパク質」とは、植物組織試料から抽出し、抽出緩衝液へと可溶化させることができるタンパク質の総量を意味する。
「導入遺伝子」とは、植物へと形質転換されるタンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を意味する。
「トランスジェニック宿主細胞」とは、遺伝子で形質転換される細胞を意味し、付加的な選択遺伝子を介して、トランスジェニックの状態に対し選択される。
「トランスジェニック植物」とは、植物の全ての細胞がその導入遺伝子を含有するように、外来性ＤＮＡで形質転換された単一細胞から誘導された植物を意味する。
「一過性発現システム」とは、それが発現される植物細胞へと、感染力を失った植物ウイルスをコードするＤＮＡを送達する、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベースのシステムを意味する。植物ウイルスは、対象のタンパク質を、ＴＳＰの４０％まで、高濃度で発現するために操作されている。技術的な証明において、用いられたのは２つの一過性発現システム、ＴＲＢＯおよびＦＥＣＴシステムであり、植物細胞は、タバコ植物「Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ」の葉組織である。
「ＴＲＢＯ」とは、ウイルスコーティングタンパク質遺伝子を除去したタバコモザイクウイルスを用いた一過性植物発現システムを意味する。
「トリプシン開裂」とは、開裂部位で、開裂可能なリンカーを分離するために、プロテアーゼ酵素トリプシン（露出リジンおよびアルギニンアミノ酸残基を認識する）を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを意味する。また、その部位を開裂するトリプシン酵素の作用を意味する。
「Ｕペプチド」、「Ｕタンパク質」、またの名を「Ｕ毒素」、またの名を「天然型Ｕ」、またの名を「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、またの名を「天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、ならびに、「ハイブリッドペプチド」、またの名を「ハイブリッド毒素」、またの名を「ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、またの名を「天然型ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は全て、自然の中に見出すことができる、または、さもなければ、「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」またの名を「天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の場合には、このタンパク質は、オーストラリアブルーマウンテンに起源を有するクモから最初に発見され、昆虫の電位依存性Ｃａ２＋チャネルおよびＫ＋チャネルに対するデュアルアンタゴニストである、天然型クモ毒素であると知られている、天然型タンパク質または天然型毒素を指す。毒素が発見されたクモは、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモとして知られており、学名は、Ｈｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａである。
「Ｕ＋２ペプチド」、「Ｕ＋２タンパク質」、「Ｕ＋２毒素」または、「Ｕ＋２」または、「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は全て、天然型ペプチドに操作可能に連結された付加的なジペプチドを有する毒素のいずれかを指し、および、Ｕペプチドおよび上述の他の名称で呼ばれることもある、クモ毒素を指しても良い。Ｕペプチドに操作可能に連結され、ゆえに、「＋２」または「プラス２」と示されている付加的なジペプチドは、いくつかのペプチドの間で選択することができ、それらの内の任意のものにより、本明細書に記述されるユニークな特性を有する「Ｕ＋２ペプチド」がもたらされても良い。これらはまた、「高産生ペプチド」と呼ばれることもある。「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」という用語が用いられる場合、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ（学名は、Ｈｙｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）由来の天然発生型ペプチドを含有する、特定の高産生毒性ペプチドを指す。
「ＶＩＰ」タンパク質は、殺虫活性の可能性に対して、Ｂｔの植物ガウン（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙ ｇｏｗｎ）株の上清のスクリーニングから発見された。それらは、ｃｒｙタンパク質に対して類似性はわずか、またはほとんど無く、植物殺虫性タンパク質（Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）またはＶＩＰと名付けられた。本明細書において、特定の用途および、使用に好ましいものは、鱗翅目昆虫活性を有するＶＩＰ３、Ｖｉｐ３タンパク質またはＶｉｐ毒素と呼ばれるものである。それらは、Ｂｔ ｃｒｙペプチドと類似の作用様式を有していると考えられている。本明細書において、ＶＩＰタンパク質は、ＰＦＩＰ型のタンパク質としてカテゴライズされる。
「酵母発現ベクター」または「発現ベクター」または「ベクター」は、転写および翻訳される酵母細胞へと、異種遺伝子および／または発現カセットを導入することができるプラスミドを意味する。
「産生量」とは、ペプチドの産生を指し、産生量の増加は、産生する量の増加、産生率の増加、ならびに、産生量の平均およびメジアンの増加、ならびに高産生量の頻度の増加を意味することができる。
＜パート１．植物組込ペプチドまたは、植物発現ペプチド「ＰＩＰＳ」および「ＰＥＰＳ」＞
植物組込み型保護剤、または「ＰＩＰｓ」は、農業従事者が直面する、昆虫による困難に対する１つの解決法を提示する。現代農業において、植物トランスジェニックタンパク質として発現された、ＰＩＰｓとして作用するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の遺伝子を用いているが、自然発生の抵抗昆虫株が野外で検出されており、このクラスの脅威となっている。新規の作用様式を有する、さらなるＰＩＰｓを開発し、抵抗性の発現を管理する必要がある。ＰＩＰｓとなる可能性を有する、殺虫活性を有する新規のクラスのタンパク質は、システインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰＳ）と呼ばれ、これらタンパク質は４、６または８のシステインを有し、２、３または４のジスルフィド結合を有する。この化合物のクラスの１つの例は、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質と呼ばれるタイプのものであると言われている。殺虫活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質は、殺虫性タンパク質およびＰＩＰｓとなる可能性を有している。
ＩＣＫモチーフタンパク質は、少なくとも６つのシステイン残基を有するタンパク質の１種であり、特定のＩＣＫ三次元構造を形成する。ＩＣＫモチーフタンパク質中のシステイン残基共有結合架橋は、ジスルフィド結合を形成し、それによってタンパク質をプロテアーゼ、および、時には極端な生理条件（ｐＨ、温度、ＵＶ光等）に対し比較的抵抗性とさせ、昆虫に特異的であるイオンチャネルに対する活性を与える三次元構造がもたらされる。多くのＩＣＫモチーフタンパク質は、無脊椎動物および脊椎動物の毒液中で発達し、ＩＣＫモチーフタンパク質は、捕食者や餌食を機能停止させる、または殺すための毒素として使用される。そのような殺虫性ペプチドは多くの場合、サソリ、クモおよび時としてヘビを起源とする。自然界においては、毒素ペプチドは、注入により昆虫の腸内または内部器官を標的としうる。ＰＩＰの場合、通常、植物組織で発現されたトランスジェニックタンパク質の昆虫による摂取を介して、送達される。食物から毒素が摂取（例えば、トランスジェニック植物上での昆虫の摂食）されることで、ＩＣＫモチーフタンパク質は、昆虫の成長を阻害し、動きを損ない、または殺虫をする能力を有し得る。
しかしながら、毒素ペプチドはしばしば、植物で発現された際にその毒性を失ってしまう。ＩＣＫモチーフタンパク質が適切にフォールディングされたタンパク質として発現されない限り、昆虫によるダメージから植物または農作物を成功裏に防御することはできない。一部の場合において、植物で発現されたペプチドは、活性状態となるために、昆虫体内、または植物での発現プロセスの間に、開裂による活性化を必要とする。ペプチドが植物内で発現されるだけではなく、適切にフォールディングされた状態で発現され、一部の場合においては、適切に開裂され、植物での発現の後でさえも、ペプチドが昆虫に対するその活性を維持できるような、方法および改変ペプチドおよび核酸に対する必要性が存在する。この項において、我々は、植物での発現に適応した活性ペプチドを生成するためのいくつかの方法を提示する。
新規のタンパク質複合体を生成するために、操作可能に共に連結された異なるペプチドの様々な組み合わせについて記述する。以下のタンパク質の複合体を記述する。ペプチドは、例えばインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質等のシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）に操作可能に連結された小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成され（ＥＲＳＰ−ＩＣＫとして指定される）、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記ペプチドのＮ末端であり、ＥＲＳＰペプチドは３〜６０アミノ酸の間の長さであり、５〜５０アミノ酸の間の長さであり、２０〜３０アミノ酸の間の長さであり、および、または、ペプチドはＢＡＡＳであり、またはタバコエクステンシンシグナルペプチドであり、または改変タバコエクステンシンシグナルペプチドであり、またはＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉまたは、Ｊ ａｓｈｅｉのＪｕｎ ａ３シグナルペプチドである。
ペプチドは、例えばインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質等のシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）に操作可能に連結された小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成され（ＥＲＳＰ−ＩＣＫとして指定される）、ここで、ＩＣＫモチーフタンパク質は、１６〜６０アミノ酸の間の長さであり、２６〜４８アミノ酸の間の長さであり、３０〜４４アミノ酸の間の長さであり、および、または、ＩＣＫモチーフタンパク質はＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、またはオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、またはカッパ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃである。
ペプチドは、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質に操作可能に連結された小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成され（ＥＲＳＰ−ＩＣＫとして指定される）、ここで、前記ＥＲＳＰおよびインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質は、本明細書に記述される任意のサイズおよび長さの組み合わせであり、本明細書に提示される任意の特定配列から構成される。
小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）および／またはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）（例えば、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質）として本明細書に記述される任意のペプチドをコードするヌクレオチド。これらのペプチドをコードする任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。トランスジェニック植物ゲノムへと形質転換される、これらのペプチドをコードする任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。前記ＩＣＫモチーフタンパク質が、殺虫性タンパク質であるペプチド。前記殺虫性ペプチドが任意のＩＣＫモチーフタンパク質または本明細書に記述されるペプチドである、ペプチド。前記殺虫性ペプチドが、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅを含む任意のペプチド源またはペプチドから選択される任意のペプチドである、ペプチド。配列表にある任意のペプチド、およびそれらの断片（前記ペプチドおよび配列番号の成熟、プレおよびプロペプチド型を含む）から選択される殺虫性ペプチド。前記殺虫性ペプチドが、ＡＣＴＸタンパク質から選択される、または選択された記述された任意のペプチドである、ペプチド。ＴＭＯＦタンパク質。
形質転換植物で、適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させるために、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換させるための、本明細書に記述される任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させ、ならびに、発現され、および適切にフォールディングされた毒性ペプチドを、前記植物に蓄積させ、ならびに、昆虫の損害に対する植物の抵抗性を増加させるために、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換させるための、本明細書に記述される任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。
トランスジェニック植物を作製するための、任意のペプチドのヌクレオチド、またはＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ、モチーフタンパク質発現ベクターの発現ＯＲＦの使用方法。本明細書に記述される任意のペプチドを発現する任意のヌクレオチドを含有する、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター。本明細書に記述される任意のペプチドをコードする、または本明細書の教示により、当業者によって作製することができる、ヌクレオチドを含有する、形質転換植物へ組み込まれたＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター。本明細書に記述される任意のペプチドを有する、または発現する形質転換植物の作製方法。本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物。
インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質またはシステインリッチペプチドに操作可能に連結され、介在リンカーペプチド（ＬまたはＬｉｎｋｅｒ）に操作可能に連結されている小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成されるタンパク質は、ＥＲＳＰ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＩＣＫ、（ＥＲＳＰ−Ｌ−ＩＣＫ）または、ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−Ｌｉｎｋｅｒ（ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−Ｌ）と指定され、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質および前記ＬまたはＬｉｎｋｅｒのＮ末端であり、ＩＣＫモチーフタンパク質のＮ末端側（上流）またはＩＣＫモチーフタンパク質のＣ末端側（下流）のいずれか上に合っても良い。本明細書に記述される任意のＥＲＳＰまたはＩＣＫモチーフタンパク質を含有する、ＥＲＳＰ−Ｌ−ＩＣＫまたは、ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−Ｌと指定されるタンパク質であって、ここで、前記Ｌは、開裂不可能なリンカーペプチドであっても良く、または、タンパク質発現プロセスの間に植物細胞中で開裂されうる、もしくは昆虫の腸内環境および血リンパ環境中で開裂されうる、開裂可能なリンカーペプチドであっても良く、または以下の配列（ＩＧＥＲ（配列番号１）、ＥＥＫＫＮ（配列番号２）およびＥＴＭＦＫＨＧＬ（配列番号３））を含む本明細書に記述または教示される任意の介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）から構成されても良い。
小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および、または介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）として記述される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、ならびに、トランスジェニック植物を作製するために用いられる、任意のこれらタンパク質をコードする任意の、および全てのヌクレオチド。
形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させるための、植物または植物ゲノムを作製またはトランスフォームさせるための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および、または介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）をコードする、任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させ、発現され、および適切にフォールディングされた毒性ペプチドを前記植物中で蓄積させ、および、昆虫の損害に対する植物の抵抗性を増加させるための、植物または植物ゲノムを作製またはトランスフォームさせるための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および、または介在リンカーペプチドをコードする、任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。
トランスジェニック植物を作製するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および／または介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）をコードする、ヌクレオチドまたは発現ＯＲＦの使用方法。本明細書に記述される任意のペプチド（ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質および／またはＬＩＮＫＥＲ）を発現するＩＣＫ発現ベクター中にある、任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質および／またはＬＩＮＫＥＲをコードする、本明細書に記述される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、または、本明細書の教示により、当業者によって作製することができるヌクレオチドを含有する、形質転換植物に組み込まれたＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター中の機能的発現ＯＲＦ。本明細書に記述される任意のペプチド（ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質および／またはＬＩＮＫＥＲ）を有する、または発現する形質転換植物の作製方法。本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物。
翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結された、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質に操作可能に連結された、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成されるタンパク質（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＩＣＫまたはＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＳＴＡと指定される）であって、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であって、前記ＳＴＡは、ＩＣＫモチーフタンパク質のＣ末端側（下流）のＩＣＫモチーフタンパク質のＮ末端側（上流）上のいずれかであっても良い。本明細書に記述されるＥＲＳＰまたはＩＣＫモチーフタンパク質のいずれかを含有する、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＩＣＫまたはＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＳＴＡと指定されるタンパク質で、ここで、ＳＴＡは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＧＮＡ（スノードロップレクチン）、Ｊｕｎ ａ３（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ）および多くの他のＩＣＫモチーフタンパク質を含む、本明細書に記述または教示される、翻訳安定化タンパク質のいずれかから構成される。
小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）として記述される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、ならびに、トランスジェニック植物を作製するために用いられる、任意のこれらタンパク質をコードする、これら機能的な群のいずれかを有する任意の、および全てのヌクレオチド。
形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換させるための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードする任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させ、前記植物で発現され、適切にフォールディングされた毒性ペプチドの蓄積をもたらし、および、昆虫の損傷に対する植物の抵抗性を増加させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換させるための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードする任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。
トランスジェニック植物を作製するための、ＩＣＫ発現ベクターで、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするヌクレオチドまたは発現ＯＲＦを使用する方法。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質および／またはＳＴＡを発現する任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質および／またはＳＴＡをコードするヌクレオチド、または、本明細書の教示により当業者によって作製されうるヌクレオチドを含有する、形質転換植物へ組み込まれるＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクターの機能的発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質および／またはＳＴＡを有する、または発現する、形質転換植物作製のための方法。本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物。
介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）に操作可能に連結されている、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結されている、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質に操作可能に連結されている、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＬＩＮＫＥＲ−ＩＣＫ、ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＬＩＮＫＥＲ−ＳＴＡ、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−Ｌ−ＩＣＫ または、ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−Ｌ−ＳＴＡと指定される）から構成されるタンパク質であって、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であり、および前記ＳＴＡは、ＩＣＫモチーフタンパク質のＣ末端側（下流）のＩＣＫモチーフタンパク質のＮ末端側（上流）のいずれかであっても良く、および、前記ＬＩＮＫＥＲは、ＳＴＡおよびＩＣＫモチーフンタンパク質の間である。本明細書に記述される、ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質、介在リンカーペプチドおよび翻訳安定化タンパク質を含有する、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＬＩＮＫＥＲ−ＩＣＫまたはＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＬＩＮＫＥＲ−ＳＴＡと指定されるタンパク質。
小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）として記述される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、ならびに、トランスジェニック植物を作製するために用いられる、これらタンパク質のいずれかをコードする任意の、および全てのヌクレオチド。
形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製、または形質転換するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードする任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させ、前記植物で発現され、適切にフォールディングされた毒性ペプチドの蓄積をもたらし、および、昆虫の損害に対する植物の抵抗性を増加させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製、または形質転換するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードする任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。
トランスジェニック植物を作製するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするＩＣＫ発現ベクターのヌクレオチドまたは発現ＯＲＦを使用する方法。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質、ＬＩＮＫＥＲおよび／またはＳＴＡを発現するＩＣＫ発現ベクターの任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質、ＬＩＮＫＥＲおよび／またはＳＴＡをコードするヌクレオチド、または、本明細書の教示により当業者によって作製されうるヌクレオチドを含有する、形質転換植物へ組み込まれるＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクターの機能的発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質、ＬＩＮＫＥＲおよび／またはＳＴＡを有する、または発現する、形質転換植物作製のための方法。本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物。
介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）に操作可能に連結されている、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結されている、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）に操作可能に連結されている、複数のインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質ドメインに操作可能に連結されている、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩＮＫＥＲｉ−ＩＣＫｊ）Ｎ、または、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫｊ−ＬＩＮＫＥＲｉ）Ｎ−ＳＴＡ、および時として、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（Ｌｉ−ＩＣＫｊ）Ｎまたは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫｊ−Ｌｉ）Ｎ−ＳＴＡと指定される）から構成されるタンパク質であって、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であり、および前記ＳＴＡは、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン（（ＬＩＮＫＥＲｉ−ＩＣＫｊ）Ｎ）のＮ末端側（上流）、または複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン（（ＩＣＫｊ−ＬＩＮＫＥＲｉ）Ｎ）のＣ末端側（下流）のいずれかであっても良く、および、前記複数の介在ペプチド（ＬＩＮＫＥＲｉ）は、ＳＴＡおよび複数ＩＣＫモチーフンタンパク質ドメインの間、ならびに、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメインのＩＣＫモチーフタンパク質の間である。ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩＮＫＥＲｉ−ＩＣＫｊ）Ｎまたは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫｊ−ＬＩＮＫＥＲｉ）Ｎ−ＳＴＡと指定される、本明細書に記述される任意のＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質、介在リンカーペプチドおよび翻訳安定化タンパク質を含有するタンパク質。
小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、複数のインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質ドメイン、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）と記述される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、ならびにトランスジェニック植物を作製するために用いられる任意のこれらタンパク質をコードする任意の、および全てのヌクレオチド。
形質転換植物で、適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、複数のインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質ドメイン、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードする任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現させ、前記植物で発現され、適切にフォールディングされた毒性ペプチドの蓄積をもたらし、および、昆虫の損害に対する植物の抵抗性を増加させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、複数のインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質ドメイン、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードする任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。
トランスジェニック植物を作製するための、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）、複数のインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質ドメイン、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）および／または、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするヌクレオチドまたは発現ＯＲＦを使用する方法。ＥＲＳＰ、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン、ＬもしくはＬＩＮＫＥＲ、および／またはＳＴＡを発現する任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン、ＬＩＮＫＥＲおよび／またはＳＴＡをコードするヌクレオチド、または、本明細書の教示により当業者によって作製されうるヌクレオチドを含有する、形質転換植物へ組み込まれる機能的発現ＯＲＦ。ＥＲＳＰ、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン、ＬＩＮＫＥＲおよび／またはＳＴＡを有する、または発現する、形質転換植物作製のための方法。本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物。
本明細書に記述されるヌクレオチドの核酸または発現ＯＲＦに操作可能に連結される、植物中の活性プロモーターを含有するキメラ遺伝子。本明細書に記述される、これらキメラ遺伝子を作製する、製造する、または使用する方法。本明細書に記述されるキメラ遺伝子を含有する組換えベクター。本明細書に記述される組換えベクターを作製する、製造する、または使用する方法。本明細書に記述されるキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック宿主細胞。本明細書に記述されるトランスジェニック宿主細胞を作製、製造または使用する方法。トランスジェニック植物細胞である、本明細書に記述されるトランスジェニック宿主細胞。本明細書に記述されるトランスジェニック植物細胞を作製、製造または使用する方法。本明細書に記述されるトランスジェニック植物細胞を含有する、トランスジェニック植物。本明細書に記述されるトランスジェニック植物を作製、製造または使用する方法。トウモロコシ、大豆、綿花、イネ、小麦、モロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、タバコ、任意の緑色葉物野菜、または任意の果樹から作製される、本明細書に記述されるトランスジェニック植物。本明細書に記述するトランスジェニック植物由来の種子であって、前記種子が、本明細書に記述されるキメラ遺伝子を含有する、種子。本明細書に記述されるトランスジェニック植物を作製、製造、または使用する方法。本明細書に記述される種子を作製、製造または使用する方法。
本明細書に記述される、植物で発現された、クモおよびサソリ由来のインヒビトリーシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．， ２００６， １５： ３４９−３５７； Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏ ｅｔ ａｌ， Ｔｏｘｉｃｏｎ． ２００９ Ｊａｎ；５３（１）：１２２−８．）。本明細書において、殺虫投与レベルで活性および植物に蓄積される、植物で発現されたＩＣＫモチーフタンパク質を作製する方法を開示する。本明細書において、植物で発現されたＩＣＫモチーフタンパク質に関する従前の記述が、実際には、その本来の毒性を失っていた不活性のタンパク質に関する記述であったことを提示する。本明細書において、植物発現の効率を増加させる方法、植物で発現されたタンパク質の蓄積を増加させる方法、および植物発現されたタンパク質の殺虫活性を劇的に増加させる方法を提示する。殺虫活性のために必要とされる、必須の三次元ＩＣＫモチーフ構造を生成する、ペプチドジスルフィド架橋の正確な共有結合架橋のために、植物細胞で、小胞体シグナルタンパク質（ＥＲＳＰ）の指示により、小胞体（ＥＲ）へと入る、植物で発現されるＩＣＫモチーフタンパク質を誘導する方法を提示する。さらに、植物で発現される、翻訳安定化タンパク質ドメイン（ＳＴＡ）とのＥＲ−トラフィッキングＩＣＫモチーフタンパク質複合体を提示し、この複合体は、得られるＩＣＫ融合タンパク質のサイズを増加させるために付加され、ＩＣＫ融合タンパク質は植物でのペプチド蓄積を増強させる。さらに、植物で発現される、ＥＲ−トラフィッキングＩＣＫモチーフタンパク質を提示し、このタンパク質は、上述のように翻訳安定化タンパク質が付加され、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）が付加され、後者により、開裂が可能となり、殺虫活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質の活性形態の回収が可能となる。さらに、植物で発現されるポリペプチドを開示し、それには、ＥＲ−トラフィッキングＩＣＫモチーフタンパク質ドメインが含有され、このドメインには、介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）により分離される複数のＩＣＫモチーフタンパク質、介在リンカーペプチドの付加、翻訳安定化タンパク質の付加が伴い、後者により正確にフォールディングされたＩＣＫモチーフタンパク質の殺虫用量までの植物での蓄積が可能となる。
本発明により、植物細胞得発現され、昆虫の損傷から植物または農作物を成功裏に防御することができる、殺虫活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質が開示される。本明細書に記述されるＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、植物翻訳ペプチドが、植物で発現されるだけではなく、植物で発現および正確にフォールディングされ、殺虫用量にまで蓄積されることが可能となるヌクレオチドである。タンパク質発現ＯＲＦの一例は、数式のスタイルで以下に記述される、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦであっても良く、図表で図形のスタイルでまたは図面で示されている。
ｅｒｓｐ−ｓｔａ−（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｃｒｉｐｊ）Ｎ または、ｅｒｓｐ−（ｃｒｉｐｊ−ｌｉｎｋｅｒｉ）Ｎ−ｓｔａ
上記の表現は単に一例であり、類似の表現が、他のＣＲＩＰ発現ＯＲＦのタイプに対して記述され、例えば、ＩＣＫ発現ＯＲＦは、以下の様に記述され得る。
ｅｒｓｐ−ｓｔａ−（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ または、ｅｒｓｐ−（ｉｃｋｊ−ｌｉｎｋｅｒｉ）Ｎ−ｓｔａ
これらの表現、式および線形図は、あるタイプのＣＲＩＰ（４つの可能性のあるペプチド成分（各成分から分離するために、ダッシュ記号を伴う）を含有する、ＩＣＫモチーフタンパク質複合体、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩＮＫＥＲＩ−ＩＣＫＪ）Ｎまたは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫＪ−ＬＩＮＫＥＲＩ）Ｎ−ＳＴＡ、または、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩ−ＩＣＫＪ）Ｎもしくは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫＪ−ＬＩ）Ｎ−ＳＴＡと記述される、ＩＣＫモチーフタンパク質複合体を発現するもの）に対するポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を記述する。上述の図において、ｅｒｓｐのヌクレオチド成分は、植物小胞体トラフィッキングシグナルペプチド（ＥＲＳＰ）をコードするポリヌクレオチドセグメントである。ｓｔａ成分は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、植物で発現されたＩＣＫモチーフタンパク質の蓄積を補助するが、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦにおいて必須ではない。ｌｉｎｋｅｒｉの成分は、介在リンカーペプチド（ＬまたはＬＩＮＫＥＲ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、ＩＣＫモチーフタンパク質を互いに分離させ、および翻訳安定化タンパク質から分離させ、「ｉ」の下付き文字は、異なるタイプのリンカーペプチドを、ＣＲＩＰまたはＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦで用いることができることを示している。ｓｔａがＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦで用いられない場合、ｅｒｓｐを、リンカー無しで、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするヌクレオチドに直接連結させることができる。ｉｃｋｊの成分は、ＩＣＫモチーフタンパク質（ＩＣＫ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、「ｊ」の下付き文字は、異なるＩＣＫモチーフタンパク質（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ）を示しており、介在リンカーペプチドをコードするヌクレオチドの構造を示していることを示唆し、そして、ＩＣＫモチーフタンパク質は、同じＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦ内の同じオープンリーディングフレーム内で、「Ｎ」回、繰り返すことができ、ここで、Ｎは、１〜１０の任意の整数であっても良い。Ｎは、１〜１０であっても良く、特に、Ｎは、１、２、３、４または５であっても良く、および一部の実施態様においては、Ｎは、６、７、８、９または１０である。繰り返しは、異なる介在リンカー（ＬＩＮＫＥＲ）および異なるＩＣＫモチーフタンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントを含んでも良い。同じＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦ内の繰り返しを含む、異なるポリヌクレオチドセグメントは全て、同じ翻訳フレーム内にある。
最小限のｅｒｓｐおよび少なくとも１コピーのｃｒｉｐまたはｉｃｋが用いられる限り、ＰＥＰ型ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦを作製するために、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの図表にあるような、４つの主な成分、ｅｒｓｐ、ｓｔａ、ｌｉｎｋｅｒおよびｃｒｉｐまたはｉｃｋの任意の組み合わせを用いても良い。
［Ｉ．ＰＥＰのＥＲＳＰまたはｅｒｓｐ成分］
ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、その５’末端のｅｒｓｐと共に開始される。トランスジェニック植物から発現された際に、適切にフォールディングされ、機能するＩＣＫモチーフタンパク質のために、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するフレームに融合されたｅｒｓｐヌクレオチドを有していなければならない。細胞の翻訳プロセスの間に、翻訳されたＥＲＳＰは、翻訳されるＩＣＫモチーフタンパク質を指示し、シグナル認識粒子と呼ばれる細胞成分と結合させることにより、植物細胞の小胞体（ＥＲ）へと挿入させることができる。ＥＲ内で、ＥＲＳＰペプチドはシグナルペプチダーゼにより開裂され、ＩＣＫモチーフタンパク質は、ＥＲへと放出され、ここで、ＩＣＫモチーフタンパク質は、翻訳後修飾プロセスの間に適切にフォールディングされる（例えば、ジスルフィド結合の形成）。任意の付加的な保留タンパク質シグナルが無ければ、タンパク質は、ＥＲを通過して、ゴルジ装置へと移送され、ここで、最終的に細胞膜の外、アポプラストの空間へと分泌される。ＩＣＫモチーフタンパク質は、アポプラストの空間で効果的に蓄積されることができ、植物内で殺虫用量にまで到達する。図１において、ＩＣＫモチーフに機能的に連結されたＥＲＳＰから構成される、シンプルな２つの成分ペプチドまたはヌクレオチドの代表的な図を示す。ＩＣＫは、適切なＣＲＩＰであっても良い。ＥＲＳＰを利用する、より複雑なタンパク質およびポリヌクレオチドは、図２〜５に図示し、これら図によりさらに、ＳＴＡまたは翻訳安定化タンパク質に関する検討について考察される。
ＥＲＳＰペプチドは、植物で翻訳されたＩＣＫモチーフタンパク質複合体のＮ末端領域にあり、ＥＲＳＰ部分は、約３〜６０アミノ酸から構成される。一部の実施態様においては５〜５０アミノ酸である。一部の実施態様においては１０〜４０アミノ酸であるが、最も多いのは、１５〜２０；２０〜２５；または２５〜３０アミノ酸から構成されるものである。ＥＲＳＰは、タンパク質の移送を指示することから、いわゆるシグナルペプチドである。シグナルペプチドはまた、標的シグナル、シグナル配列、通過（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチドまたは局在化シグナルとも呼ばれても良い。ＥＲトラフィッキングのためのシグナルペプチドは多くの場合１５〜３０アミノ酸残基の長さであり、三部の構造を有し、正荷電のアミノ末端に隣接した疎水性残基のコアおよび極性から構成されるが、カルボキシ末端領域は非荷電である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ， “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ＥＲ ｍｅｍｂｒａｎｅ”， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２０１１， １８０８： ９１２−９２４）。
多くのＥＲＳＰが公知である。多くの植物ＥＲＳＰが公知である。植物ＥＲＳＰから誘導されるＥＲＳＰ、非植物ＥＲＳＰが、本明細書に記述される方法で機能することは、必要ではない。しかしながら、多くの植物ＥＲＳＰは周知であり、我々は、一部の植物誘導ＥＲＳＰを本明細書に記述する。例えばＢＡＡＳは、植物、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来であり、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧ（配列番号４）
発現され、植物のアポプラストの空間へと放出されることが公知である、タンパク質のゲノム配列から選択される植物ＥＲＳＰの、少ない例は、ＢＡＡＳ、ニンジンエクステンシン、タバコＰＲ１である。以下の参照文献に、さらなる記述が提示され、本明細書に、その全体が参照により組み込まれる。 Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｌｌｏｗｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ” Ｇｅｎｅ， ９９ （１９９１） ９５−１００。Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ， Ｍ．らは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ由来の遺伝子をコードするエクステンシンに関する構造分析を記述し、その配列は、小胞体へのタンパク質移送に対する典型的なシグナルペプチドを含有している。Ｃｈｅｎ， Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｐｌａｓｔｉｄｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ” Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２００４ Ｊｕｌ； １３５（３）： １３６７−７７． Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊｕｌ ２。Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．らは、トランスジェニックタバコにおいて、シグナルペプチドの有無でαアミラーゼの発現を分析することにより、植物細胞におけるαアミラーゼの細胞内局在性を研究した。これらの参照文献および他の文献から、本明細書に記述される本方法、手順ならびにペプチド、タンパク質およびヌクレオチド複合体ならびに構築物に用いることができるシグナルペプチドが教示および提示される。
［ＩＩ．ＣＲＩＰおよびＩＣＫモチーフタンパク質成分、またはｃｒｉｐおよびＰＥＰのｉｃｋ］
本明細書のＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの図において、「ｉｃｋ」とは、「ＩＣＫモチーフタンパク質」または「インヒビターシスチンノットモチーフタンパク質」をコードするポリヌクレオチドを意味し、少なくとも６半のシステインコアアミノ酸（３つのジスルフィド架橋を有する）を伴う、１６〜６０のアミノ酸ペプチドであり、ここで、３つのジスルフィド架橋は共有結合であり、６半シスチン残基の内、Ｎ末端アミノ酸から開始して、６つのコア半シスチンアミノ酸の、第一と第四、第二と第五、および第三と第六の半シスチンの間である。また、ＩＣＫモチーフタンパク質は、通常は、このモチーフの第五および第六コア半システインの間に位置される残基から構成される、βヘアピン二次構造を含有し、このヘアピンは、モチーフの３つのジスルフィド結合によりもたらされる構造的架橋により安定化される。追加のシステイン／システインまたは半シスチンアミノ酸が、図６に示されるように、インヒビターシステインノットモチーフの中に存在しても良い。植物での毒素ペプチド蓄積を増加させるために、ＣＲＩＰまたはＩＣＫモチーフを繰り返すことができる。図４および図５を参照のこと。１〜１０回、または時として１５、２０または２５回、ＣＲＩＰまたはＩＣＫモチーフを繰り返すこの能力はまた、本明細書において、ｅｒｓｐ−ｓｔａ−（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ、または、ｅｒｓｐ−（ｉｃｋｊ−ｌｉｎｋｅｒｉ）Ｎ−ｓｔａと記述される、ＣＲＩＰまたは、ＩＣＫタンパク質発現ＯＲＦの図等の方程式に示されており、ここで、ＬＩＮＫＥＲ−ＩＣＫモチーフを繰り返す数は、下付きの数Ｎで示されており、Ｎは、通常１〜１０であるが、一部の植物においては、さらに高い数字とすることができる。
ｅｒｓｐ−ｓｔａ−（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ、または、ｅｒｓｐ−（ｉｃｋｊ−ｌｉｎｋｅｒｉ）Ｎ−ｓｔａと類似の表現を記載することができ、および他のＣＲＩＰペプチドを記述しうる。この項において、１つの発現ＯＲＦの一例は、植物でのペプチド発現を増加させるために用いられるものであり、ＩＣＫタンパク質で最も良く例示される。上述の図式において、４つの可能性のあるペプチド成分（各成分を分離するためにダッシュ記号を付されている）を含有する、ＩＣＫモチーフタンパク質を発現するポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩＮＫＥＲＩ−ＩＣＫＪ）Ｎ、もしくは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫＪ−ＬＩＮＫＥＲＩ）Ｎ−ＳＴＡ、または、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩ−ＩＣＫＪ）Ｎ、もしくはＥＲＳＰ−（ＩＣＫＪ−ＬＩ）Ｎ−ＳＴＡと記述されうる）が、用いられている。このタイプの構築物を示す別の方法は、図表において見出される。図式および図表において、ｅｒｓｐのヌクレオチド成分は、植物小胞体トラフィッキングシグナルぺプチド（ＥＲＳＰ）をコードするポリヌクレオチドセグメントである。ｓｔａの成分は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、植物で発現されるＩＣＫモチーフタンパク質の蓄積を補助するが、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦにおいて必須のものではなくても良い。ｌｉの成分は、ＩＣＫモチーフタンパク質を互いに分離させ、および翻訳安定化タンパク質から分離させるための介在リンカーペプチド（ＬまたはＬＩＮＫＥＲ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、下付き文字の「ｉ」は、異なるタイプのリンカーペプチドを、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦにおいて用いることができることを示している。ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦでｓｔａが用いられない場合においては、ｅｒｓｐを、リンカー無しで、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするポリヌクレオチドに直接、連結させることができる。ｉｃｋｊの成分は、ＩＣＫモチーフタンパク質（ＩＣＫ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、下付き文字の「ｊ」は、異なるＩＣＫモチーフタンパク質を示す；（（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ）は、介在リンカーペプチドおよびＩＣＫモチーフタンパク質をコードするヌクレオチドの構造が、「Ｎ」回、同じＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの同じオープンリーディングフレーム内で、繰り返すことができることを示しており、Ｎは、１〜１０の任意の整数であっても良いが、さらに高く、１５、２０、および２５までであっても良く、これらの繰り返しは、異なる介在リンカーをコードするポリヌクレオチドセグメント、および異なるＩＣＫまたはＣＲＩＰモチーフタンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントを含有しても良い。同じＩＣＫまたはＣＲＩＰモチーフタンパク質発現ＯＲＦ内の繰り返しを含有する、異なるポリヌクレオチドセグメントは全て、同じ翻訳フレーム内である。
このモチーフは、多くの種の毒液から単離されたペプチドで共通である。無脊椎動物種としては、クモ、サソリ、イモガイ、イソギンチャク等が挙げられ、他の例は非常に多く、ヘビ毒も、ＩＣＫモチーフを有するペプチドを有していることが知られている。我々が用いたクモの例は、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴクモ由来のＡＣＴＸペプチド類由来であるが、本明細書に記述される方法は有用であり、ＩＣＫモチーフを有する任意のタンパク質に適用できる可能性がある。
ＩＣＫモチーフを有するペプチド毒素の例は、以下の参照文献に見出すことができる。Ｎ型カルシウムチャネルブロッカー ω−コノトキシン（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）は、Ｌｅｗ， Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ω−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ ＧＶＩＡ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２７２， Ｎｏ． １８， Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｍａｙ ２， ｐｐ． １２０１４−１２０２３， １９９７に概要がまとめられている。異なるクモおよびサソリ種からの多くの節足動物毒素の概要は、Ｑｕｉｎｔｅｒｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ａｎｄ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” Ｔｏｘｉｃｏｎ， ５８， ｐｐ． ６４４−６６３， ２０１１に概要がまとめられている。ＮＭＲ分光法を用いた、ハナトキシン１（Ｈａｎａｔｏｘｉｎ１）の３次元構造は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈａｎａｔｏｘｉｎ１， ａ ｇａｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ： ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇａｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｔｏｘｉｎｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２９７， Ｉｓｓｕｅ ３， ３１ Ｍａｒｃｈ ２０００， ｐｐ． ７７１−７８０で、インヒビターシステインノットモチーフとして、特定された。サソリ毒ＩＣＫ毒素ペプチド、オピカルシン１（Ｏｐｉｃａｌｉｃｉｎｅ１）をコードするｃＤＮＡの単離および同定は、Ｚｈｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ” ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ２００３ Ｓｅｐ １７， （１２）：１７６５−７， Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｌ ３に公表された。イソギンチャク、Ｂｕｎｏｄｏｓｏｍａ ｇｒａｎｕｌｉｆｅｒａ、由来のＢｇＫ、ａＫ＋チャネルブロッキング毒素の配列特異的割り当ておよび二次構造特定は、Ｄａｕｐｌａｉｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｏｘｉｎｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９７ Ｆｅｂ １４； ２７２（７）： ４３０２−９に開示された。ポリペプチド毒素構造、作用機序およびシステイン架橋を示す分子進化、システインノット形成、および「ノッティング型」フォールディングに焦点を当てた、クモ毒の組成および薬理に関する概要は、Ｅｓｃｏｕｂａｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｖｅｎｏｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ” Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｖｏｌ． ８２， Ｉｓｓｕｅｓ ９−１０， １０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０００， ｐｐ． ８９３−９０７により公表された。サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ）毒由来の精製ペプチド、イベリオトキシン（ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ）、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルの阻害物質については、Ｇａｌｖｅｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ， ｐｏｔｅｎｔ， ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｒｏｍ ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９０ Ｊｕｌ ５； ２６５（１９）： １１０８３−９０に開示された。サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）毒由来の、精製ペプチド、カリブドトキシン（ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ）、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルの阻害物質については、Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ， ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， １９８８ Ｍａｙ； ８５（１０）： ３３２９−３３３３に開示された。これらの、および他の公表文献から、当業者であれば容易に、我々がＩＣＫモチーフ、ＩＣＫモチーフタンパク質または「インヒビターシスチンノットモチーフ」として開示したものを有するタンパク質およびペプチドを特定することができるであろう。
ＩＣＫモチーフタンパク質は、ＩＣＫモチーフを有する任意のタンパク質であっても良く、１６〜６０アミノ酸の長さであり、少なくとも６つのシステイン残基を有し、それにより適切な順で、共有架橋ジスルフィド結合が形成される。図６を参照のこと。一部のＩＣＫモチーフペプチドは、２６〜６０アミノ酸の長さを有する。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は、１６〜４８アミノ酸の長さである。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は、２６〜４８アミノ酸の長さである。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は３０〜４４アミノ酸の長さである。天然殺虫活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質が好ましいが、他のタイプの活性（例えば、塩耐性および霜耐性）を有するＩＣＫモチーフタンパク質も当業者には公知であり、本明細書にクレームされる。殺虫性ＩＣＫモチーフタンパク質の例には、ＡＣＴＸペプチドおよび遺伝子が含まれ、ならびに、Ｍａｇｉ６として知られるペプチドおよびそのコード遺伝子の全てが含まれる。
タンパク質発現ＯＲＦの例は、以下の図式のＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦであっても良い。
ｅｒｓｐ−ｓｔａ−（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ、または、ｅｒｓｐ−（ｉｃｋｊ−ｌｉｎｋｅｒｉ）Ｎ−ｓｔａ
類似の表現で、他のＣＲＩＰペプチドに対しても記述することができる。この項において、発現ＯＲＦのこの例は、高いペプチド発現に対して用いられるものであり、ＩＣＫタンパク質で最も良く例示される。４つの可能性のあるペプチド成分（各成分を分離させるためにダッシュ記号を付されている）を含有する、上記の図式の、ＩＣＫモチーフタンパク質複合体を発現するポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩＮＫＥＲＩ−ＩＣＫＪ）Ｎもしくは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫＪ−ＬＩＮＫＥＲＩ）Ｎ−ＳＴＡ、または、ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＬＩ−ＩＣＫＪ）Ｎ、もしくは、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫＪ−ＬＩ）Ｎ−ＳＴＡ）として記述される）。この図式において、ｅｒｓｐのヌクレオチド成分は、植物小胞体トラフィッキングシグナルペプチド（ＥＲＳＰ）をコードするポリヌクレオチドセグメントである。ｓｔａの成分は、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、植物で発現されるＩＣＫモチーフタンパク質の蓄積を補助するが、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦにおいて必須のものではなくても良い。ｌｉの成分は、ＩＣＫモチーフタンパク質を互いに分離させ、および翻訳安定化タンパク質から分離させるための介在リンカーペプチド（ＬまたはＬＩＮＫＥＲ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、下付き文字の「ｉ」は、異なるタイプのリンカーペプチドを、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦにおいて用いることができることを示している。ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦでｓｔａが用いられない場合においては、ｅｒｓｐを、リンカー無しで、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするポリヌクレオチドに直接、連結させることができる。ｉｃｋｊの成分は、ＩＣＫモチーフタンパク質（ＩＣＫ）をコードするポリヌクレオチドセグメントであり、下付き文字の「ｊ」は、異なるＩＣＫモチーフタンパク質を示す；（（ｌｉｎｋｅｒｉ−ｉｃｋｊ）Ｎ）は、介在リンカーペプチドおよびＩＣＫモチーフタンパク質をコードするヌクレオチドの構造が、「Ｎ」回、同じＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの同じオープンリーディングフレーム内で、繰り返すことができることを示しており、Ｎは、１〜１０の任意の整数であっても良く、繰り返しは、異なる介在リンカーをコードするポリヌクレオチドセグメント、および異なるＩＣＫまたはＣＲＩＰモチーフタンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントを含有しても良い。同じＩＣＫまたはＣＲＩＰモチーフタンパク質発現ＯＲＦ内の繰り返しを含有する、異なるポリヌクレオチドセグメントは全て、同じ翻訳フレーム内である。
殺虫性ＩＣＫモチーフタンパク質の例としては、ＡＣＴＸペプチドおよび遺伝子が挙げられ、本明細書および上記に提示される参照文献に記述されるペプチドおよびそのコード遺伝子の全てが挙げられる。ＩＣＫモチーフタンパク質およびペプチドの具体的な例は、例を提示する目的で開示され、決して限定を意図しておらず、上述のペプチドおよびそのホモログが例示であり、特に、オーストラリアジョウゴクモの毒由来のペプチドおよびヌクレオチドが例示される。以下の書面は、その全体で、米国において参照により組み込まれ、当業者には公知であり、全て公表されている。それらは多くのＩＣＫモチーフタンパク質（その全長ペプチド配列、その全長ヌクレオチド配列は、具体的に開示され、参照により組み込まれる）を開示しており、さらに、全ての開示物（その配列表の全てを含む）が、参照により組み込まれる。以下を参照のこと：米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号（２００８年４月８日に発行）および、米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号から、配列１〜３９としてリストアップされるヌクレオチド配列、ならびに、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられたものおよびその変異体、ならびに２〜４の鎖内ジスルフィド結合を形成することができるこれら、および他の毒素、ならびに、米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号のカラム４〜９および図２にあるペプチド。他の具体的な配列は、２００８年１０月８日に公開され、特許付与された、欧州特許第１ ８１２ ４６４ Ｂ１号（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２００８／４１を参照のこと）に見出すことができ、具体的には、欧州特許第１ ８１２ ４６４ Ｂ１号の、配列表にリストアップされるペプチドおよびヌクレオチド配列、ならびに、２〜４の鎖内ジスルフィド結合を形成することができるそれらおよび他の毒素、ならびに、配列１〜３９としてリストアップされるそれら配列、ならびに、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられる配列およびその変異体、ならびに、段落００２３〜００５５および図１にあるペプチド。
本明細書に言及される配列と相同な変異体、そのような配列と相同性を有する配列、または本明細書に引用される配列は、本明細書に特定されるペプチドを参照することにより記述され、および組み込まれ、また、本明細書に記述されるプロセスに従い、特別に作製するために適していると特定され、およびクレームされ、参照により組み込まれる任意の配列、または本明細書に開示される任意の配列に対し、少なくとも以下の同一性のパーセンテージを有する、全ての相同な配列が含まれる：上述の特許に特定されている任意のおよび全ての配列に対して、ならびに、本明細書に特定される任意の他の配列（本出願の配列表のありとあらゆる配列を含む）に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の同一性、または１００％の同一性。例えば５０％以上という数字と共に、本明細書において、相同な、または相同性という用語が用いられる場合、その意味するところは、２つのペプチド間の同一性または類似性のパーセントである。数字的なパーセントが無く、相同な、または相同性、が用いられる場合、２つのペプチド配列が、進化的または発生的な面で近い関係性にあり、局所毒性および類似のサイズ等の、共通の物理的および機能的な特徴を共有していることを指す（すなわち、上述の本明細書の参照文献により特定される、もしくは本明細書で具体的に言及されるペプチドの、１００％より大きい長さの内である、または、５０％より短い長さの内である、ホモログ）。
以下を含む毒性ペプチドが、本明細書に特定されるペプチドを参照して記述され、および組み込まれる：Ａｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａの属種、またはブルーマウンテンジョウゴクモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕを含む）に見出される、誘導される、または単離されるペプチドおよびその変異体であって、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、または突然変異体もしくは変異体を含み、特に、これらの任意の型のペプチド、および特に、約２００アミノ酸未満だが約１０アミノ酸超のもの、および特に、約１５０アミノ酸未満だが約２０アミノ酸超のペプチド、特に、約１００アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約６５アミノ酸未満だが約25アミノ酸超のペプチド、特に、約５５アミノ酸未満だが約２5アミノ酸超のペプチド、特に、約３７または３９または約３６〜４２アミノ酸のペプチド、特に約５５アミノ酸未満であるが、約２５アミノ酸超のペプチド、特に約４５アミノ酸未満であるが、約３５アミノ酸超のペプチド、特に約１１５アミノ酸未満であるが、約７５アミノ酸超のペプチド、特に約１０５アミノ酸未満であるが、約８５アミノ酸超のペプチド、特に約１００アミノ酸未満であるが、約９０アミノ酸超のペプチドであって、本明細書に言及される、２、３および４以上の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる、任意の長さのペプチド毒素を含み、カルシウムチャネル電流を攪乱させる毒素を含み、カリウムチャネル電流を攪乱させる毒素を含み、特に、昆虫のカルシウムチャネルまたはそのＵｓを攪乱させる毒素、特に任意のこれらのタイプの毒素またはその変異体、および本明細書に記述される、経口または局所の殺虫活性を有する毒素の任意のタイプの任意の組み合わせを含み、本明細書に記述されるプロセスにより具体的に作製することができるもの。
オーストラリアジョウゴクモ、ＡｔｒａｘおよびＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属、由来のＵペプチドは、特に、本発明に記述される方法、手順またはプロセスにより処置される場合に、適切であり、および、良く作用する。そのような、適した検証およびデータを有するペプチドの例が本明細書に提示される。以下の種もまた、本発明のプロセスによりＰＩＰとしての植物発現に適した毒性ペプチドを担持するとして具体的に知られている。以下の種が具体的に指定される：Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｉｎｆｅｎｓａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ。上記にリストアップされる任意の属および／または属種から誘導される任意の毒性ペプチド、ならびに、Ｕペプチドの相同物が、本発明のプロセスに従う、ＰＩＰとしての植物発現に適している。
本明細書における実施例は、本発明を限定するものと意図されておらず、および限定のために用いられてはならず、それらは、本発明を図解するためにのみ、提示されている。
上述のように、多くのペプチドが、ＰＩＰとしての植物発現のための本プロセスの対象として適した候補となる。上記の配列、以下の配列および配列表の配列は、ＰＩＰとして植物で発現することができるペプチドとして特に適しており、これらの内の、一部は、以下の実施例に示される結果にあるように、本発明によるＰＩＰとして植物で発現されている。
ＧＳＱＹＣ ＶＰＶＤＱ ＰＣＳＬＮ ＴＱＰＣＣ ＤＤＡＴＣ ＴＱＥＲＮ ＥＮＧＨＴ ＶＹＹＣＲ Ａ（配列番号５）。
「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられるそれは、５〜２０、１２〜２５、１９〜３９の位置で、ジスルフィド架橋を有する。分子量は、４５６４．８５ダルトンである。他のＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質の例は、ＱＹＣＶＰ ＶＤＱＰＣ ＳＬＮＴＱ ＰＣＣＤＤ ＡＴＣＴＱ ＥＲＮＥＮ ＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号６）。
「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられるそれは、３〜１８、１０〜２３、１７〜３７の位置で、ジスルフィド架橋を有する。分子量は、４４２６．８４ダルトンである。
配列表にある多くの配列が、さらなる例示として含まれる。
［ＩＩＩ．翻訳安定化タンパク質成分、ＳＴＡまたはｓｔａ］
ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの内の１つ、ＥＲＳＰ−ＩＣＫは、形質転換植物で適切にフォールディングされたＩＣＫモチーフペプチドを十分に発現するが、害虫の損傷から植物を効果的に防御するためには、植物で発現されるＩＣＫモチーフタンパク質が、殺虫レベルまで蓄積されることが必要である。適切に構築されたＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの形質転換で、トランスジェニック植物は、正確にフォールディングされた、より多くの量のＩＣＫモチーフタンパク質を発現し、蓄積することができる。植物が、適切にフォールディングされた毒性ペプチドをより多くの量で蓄積すると、植物を攻撃および食する昆虫を殺虫、またはより容易に抵抗することができる。翻訳安定化タンパク質を用いて、植物における毒性ペプチドの蓄積、および、特にそれ自身の翻訳安定化タンパク質をＰＩＰが有する場合には、ＰＩＰの有効性を著しく増加させることができる。どのようにＳＴＡが発現ＯＲＦで用いられうるかを様々に表した図２〜５、および、以下に用いられる表現のような、様々な線形図または式を参照のこと。翻訳安定化タンパク質は、他のタンパク質のドメインであっても良く、または、タンパク質配列全体を含有しても良い。翻訳安定化タンパク質は、タンパク質分解の細胞プロセスの標的とされることなく細胞内に蓄積することができる、十分な三次元構造を有するタンパク質である。このタンパク質は、５〜５０ａａ（例えば、他のＩＣＫモチーフタンパク質）、５０〜２５０ａａ（ＧＮＡ）、２５０〜７５０ａａ（例えば、キチナーゼ）および７５０〜１５００ａａ（例えば、エンハンシン）の間であっても良い。
図２〜５に加えて、以下の線形図により、ＩＣＫモチーフタンパク質に融合される安定化タンパク質をコードするＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの例の１つが記述される。
ｅｒｓｐ−ｓｔａ−ｉｃｋ
タンパク質、またはタンパク質ドメインは、翻訳安定化以外の有用な特徴を有しないタンパク質を含有することができ、または、翻訳安定化に加えて他の有用な特質を有するものを有することができる。有用な特質としては、以下が挙げられる：追加の殺虫活性（例えば、囲食膜を破壊する活性、腸壁を破壊する活性、および／または、腸壁を横切り、ＩＣＫモチーフタンパク質を能動移送させる活性）。翻訳安定化タンパク質の１つの実施態様は、ＩＣＫモチーフタンパク質を包含する融合タンパク質のポリマーであっても良い。翻訳安定化タンパク質の具体的な例が本明細書に提示され、翻訳安定化タンパク質の用途を図解する。これらの例は決して、本開示またはクレームを限定する意図のものではない。有用な翻訳安定化タンパク質は当分野に公知であり、このタイプの任意のタンパク質を本明細書に開示されるように用いることができる。ペプチド製品の評価および検証の手順は、当分野で周知であり、また本明細書にも開示される。１つの翻訳安定化タンパク質の１つの例は、配列番号７であり、１文字コードで以下である：
ＡＳＫＧＥ ＥＬＦＴＧ ＶＶＰＩＬ ＶＥＬＤＧ ＤＶＮＧＨ ＫＦＳＶＳ ＧＥＧＥＧ ＤＡＴＹＧ ＫＬＴＬＫ ＦＩＣＴＴ
ＧＫＬＰＶ ＰＷＰＴＬ ＶＴＴＦＳ ＹＧＶＱＣ ＦＳＲＹＰ ＤＨＭＫＲ ＨＤＦＦＫ ＳＡＭＰＥ ＧＹＶＱＥ ＲＴＩＳＦ
ＫＤＤＧＮ ＹＫＴＲＡ ＥＶＫＦＥ ＧＤＴＬＶ ＮＲＩＥＬ ＫＧＩＤＦ ＫＥＤＧＮ ＩＬＧＨＫ ＬＥＹＮＹ ＮＳＨＮＶ
ＹＩＴＡＤ ＫＱＫＮＧ ＩＫＡＮＦ ＫＩＲＨＮ ＩＥＤＧＳ ＶＱＬＡＤ ＨＹＱＱＮ ＴＰＩＧＤ ＧＰＶＬＬ ＰＤＮＨＹ
ＬＳＴＱＳ ＡＬＳＫＤ ＰＮＥＫＲ ＤＨＭＶＬ ＬＥＦＶＴ ＡＡＧＩＴ ＨＧＭＤＥ ＬＹＫ （配列番号７）
「ＧＦＰ」と名付けられている。分子量は、２６７３６．０２ダルトンである。
一部の実施態様において、ＳＴＡは、図５に示されるＣＲＩＰまたはＩＣＫであることさえできる。これらの実施態様において、別のＳＴＡタンパク質は無く、ＳＴＡタンパク質は、用いられるＣＲＩＰまたはＩＣＫと同じである。ＬＩＮＫＥＲに結合される同一のＩＣＫであっても良く、または、ＬＩＮＫＥＲに結合される異なるＩＣＫの１つのタイプであっても良く、および、ＳＴＡとして作用する他のタイプであっても良い。これらの代替的な配列もまた、ＬＩＮＫＥＲＳの項において検討される。
翻訳安定化タンパク質のさらなる例は、以下の参照文献（それらの全体で、参照により組み込まれる）に見出すことができる：Ｋｒａｍｅｒ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｎｄ ｇｕｔ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｏｆ Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ” Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２３， Ｉｓｓｕｅ ６， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９３， ｐｐ． ６９１−７０１。Ｋｒａｍｅｒ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ， Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． “Ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， （１９９１）， ７２， ２６４５−２６５１。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ。Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ， Ｅ．Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｎｏｗｄｒｏｐ （Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌ．） ｌｅｃｔｉｎ” Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０２， ２３−３０ （１９９１）。Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ， Ｅ．Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙ（Ａ）−ｒｉｃｈ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｏｖａｒｉｅｓ ｏｆ ｓｎｏｗｄｒｏｐ ｌｅｃｔｉｎ （ＧＮＡ）， ｙｉｅｌｄｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ １７−ｋＤａ ｌｅｃｔｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｕｐｏｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ， ｃａｌｌｅｄ ａｇｇｌｕｔｉｎ。これらおよび他の参照文献により、本明細書に記述される方法、手順およびペプチド、タンパク質およびヌクレオチド複合体および構築物に用いることができる翻訳安定化タンパク質が教示および開示される。
［ＩＶ．介在リンカーペプチド成分、ＬＩＮＫＥＲ、ｌｉｎｋｅｒ、Ｌまたは、もしポリヌクレオチドである場合には、ＰＥＰのｌｉｎｋｅｒまたはｌ］
本発明に記述されるＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦはまた、ＩＣＫモチーフタンパク質（ｉｃｋ）および翻訳安定化タンパク質（ｓｔａ）をコードするポリヌクレオチド配列の間の、または、もし発現ＯＲＦが複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン発現を包含する場合には、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン（（ｌ−ｉｃｋ）Ｎまたは、（ｉｃｋ−ｌ）Ｎ）をコードするポリヌクレオチド配列の間の、介在リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲＳ）は、発現されたＩＣＫモチーフタンパク質複合体の異なる部分を分離させ、発現プロセスの間の複合体の異なる部分の適切なフォールディングを補助する。発現されたＩＣＫモチーフタンパク質複合体において、異なる介在リンカーペプチドは、異なる機能ドメインの分離に関与することができる。ＬＩＮＫＥＲＳを有するタンパク質の様々な説明を、図３〜５に示す。ＬＩＮＫＥＲは、例えばＩＣＫ等のＣＲＩＰに付着され、この二価のグループは、１０（Ｎ＝１〜１０）まで繰り返すことができ、防御される植物で適切にフォールディングされる殺虫性ペプチドの蓄積を促進するためには、さらに１０回を超えることもある。
介在リンカーペプチドは、通常、１〜３０アミノ酸の長さの間である。それは、植物において発現されたＩＣＫモチーフタンパク質複合体の必須成分である必要は無い。開裂可能なリンカーペプチドをＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦに対して設計して、適切にフォールディングされたＩＣＫモチーフタンパク質を、形質転換植物で発現されたＩＣＫモチーフタンパク質複合体から放出させ、ＩＣＫモチーフタンパク質による、害虫の損害からの植物の防御を改善することができる。このタイプのリンカーペプチドは、植物細胞の翻訳後発現プロセスの間に、発現されたＩＣＫモチーフタンパク質発現複合体から完全に除去することができる。ゆえに、このタイプの介在リンカーペプチドに連結された、適切にフォールディングされたＩＣＫモチーフタンパク質を、翻訳後発現プロセスの間に、発現されたＩＣＫモチーフタンパク質複合体から、植物細胞に放出させることができる。本明細書において、ＬＩＮＫＥＲＳの多くの例を提示する。
他のタイプの開裂可能な介在リンカーペプチドは、植物の発現プロセスの間に開裂することはできない。しかし、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼに特異的なプロテアーゼ開裂部位を有する。開裂可能なリンカーペプチドのタイプは、昆虫および鱗翅目昆虫の腸環境ならびに／または昆虫の血リンパおよび鱗翅目昆虫の血リンパ環境に存在するプロテアーゼにより消化され、昆虫の腸または血リンパにＩＣＫモチーフタンパク質を放出するものである。本明細書において、多くのＬＩＮＫＥＲＳの例を提示する。これらリンカーは、例として提示されるのみであり、本発明を限定するものとみなされるべきではない。本開示により教示される情報を用いれば、本発明に有用なＬＩＮＫＥＲの他の例を作製または見出すことは、当業者にとって日常的な事柄であろう。
本発明が図解する開裂可能なタイプの介在リンカーの例は、配列番号１にリストアップされているが、開裂可能なリンカーはこの例に限定されない。配列番号１（１文字コード）は、ＩＧＥＲであり、本明細書において、「ＩＧＥＲ」と指定される。この介在リンカーまたはＬＩＮＫＥＲの分子量は、４７３．５３ダルトンである。
介在リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）はまた、いずれのタイプのプロテアーゼ開裂部位をも有しないものであっても良い。すなわち、開裂不可能な介在リンカーペプチドである。リンカー、ＥＴＭＦＫＨＧＬ（配列番号３）が、この例である。
介在リンカーペプチドの他の例は、以下の参照文献（その全体で、参照により本明細書に組み込まれる）において見出すことができる：Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｆｒｏｍ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ” Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９５； ２３０： ２５０−２５７に、６つの同じリンカーペプチドにより分離される、５つの同種タンパク質インヒビターを含有する、植物で発現されるセリンプロテアーゼインヒビター前駆体がある。Ｃｈａｎｇ， Ｈ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． “Ｄｅ ｎｏｖｏ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ＧＦＰ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００５ Ｏｃｔ ２１； ３５３（２）： ３９７−４０９に、６つの異なるリンカーを介した、緑色蛍光タンパク質のフォールディングの性質の比較についての説明がある。Ｄａｓｋａｌｏｖａ， Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ． ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１０ Ａｕｇ ２４； １０： ６２に、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔｓファミリー、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２のアイソフォームが、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における発現で、その局在および機能を維持することが示されている。Ｋｗｏｋ， Ｅ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． “ＧＦＰ−ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｒｕｂｉｓｃｏ ａｎｄ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｐｌａｓｔｉｄ ｓｔｒｏｍｕｌｅｓ ａｎｄ ｔｒａｆｆｉｃ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｔｉｄｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ， ２００４ Ｍａｒ； ５５（３９７）： ５９５−６０４． Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊａｎ ３０に、内因性色素タンパク質が、ストロミュールを介して移送する能力が示されている。Ｂｏｒｏｖｓｋｙ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｅｄｅｓ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｏｆ ＴＭＶ： Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｌａｒｖｉｃｉｄｅ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２００６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １２； １０３（５０）： １８９６３−１８９６８に、蚊のデカペプチドホルモン、トリプシン介在オースタティック因子（ＴＭＯＦ）を伴う、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ビリオンの表面エンジニアリングに関する報告がある。これら、および他の参照文献により、本明細書に記述される方法、手順およびペプチド、タンパク質、およびヌクレオチド複合体および構築物に用いることができる介在リンカーが教示および開示される。
上述のＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、植物での一過性または安定したＩＣＫモチーフタンパク質発現のために、任意の植物発現ベクターへとクローニングすることができる。
［一過性植物発現システム］
一過性の植物発現システムを用いて、迅速に、植物において、一部の特定のＩＣＫモチーフタンパク質発現に対して、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの構造を最適化させることができる（一部の成分の必要性、一部の成分のコドン最適化、各成分の順序の最適化を含む）。一過性の植物発現ベクターは多くの場合、植物ウイルスゲノム由来のものである。植物ウイルスベクターは、植物ウイルスの感染特質によって、素早く、高レベルで植物における外来性遺伝子発現がもたらされるという利点がある。植物ウイルスゲノムの全長をベクターとして用いるが、多くの場合、ウイルス成分（例えば、外殻タンパク質）は除去され、トランスジェニックＯＲＦが、その位置にサブクローニングされる。ウイルスベクターを作製するために、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦをそのような部位へとサブクローニングすることができる。これらのウイルスベクターは、それら自身で感染性があるため、例えば植物の傷を介しての、スプレー散布等、機械的に植物へと導入することができる。また、クラウンゴール（ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ）細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ、または、毛根（ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ）細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＴ−ＤＮＡへとウイルスベクターをクローニングすることによる、アグロインフェクション（ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）により、それらを植物へ形質転換することができる。このベクターにおけるＩＣＫモチーフタンパク質の発現は、ＲＮＡウイルスの複製により制御され、複製のためのｍＲＮＡへのウイルスの翻訳は、強力なウイルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター等）により制御される。ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦを有するウイルスベクターは、通常、大腸菌株およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の両方でそれ自身を複製することができるバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域へとクローニングされる。植物の一過性形質転換は、植物の葉への、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞（ＩＣＫモチーフタンパク質発現のためのウイルスベクターを含有している）の浸潤により行うことができる。一過性形質転換植物において、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）により、短期間で外因性タンパク質の発現が停止するのは通常のことである。時として、ＩＣＫモチーフタンパク発現ＯＲＦの発現を活性化させる同じタイプのウイルスベクターと、ＰＴＧＳ抑制タンパク質遺伝子を、植物へ一過性に、共に形質転換される必要がある。これにより、植物におけるＩＣＫモチーフタンパク質の発現が改善および延長される。最も普遍的に用いられているＰＴＧＳ抑制タンパク質は、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）から発見された、Ｐ１９タンパク質である。
一過性植物発現の証明は、図７に見出すことができる。
図７において、一過性に発現された植物トランスジェニックタンパク質を示す。図７において、ＥＬＩＳＡによる検出として、ＴＳＰの％と比較した、ＩＣＫタンパク質の相対的な蓄積を説明する。図７において、ＩＣＫ発現ＯＲＦの４つのバリエーションを示し、ＩＣＫの適切なフォールディングを得るためのＥＲＳＰの必要性、および、タンパク質の蓄積を得るためのＳＴＡの必要性を解説する。バーＡは、何らの融合も無い、配列番号８ オメガペプチド（ＩＣＫ）を発現する、ＦＥＣＴ発現システムを説明する。バーＢは、オメガペプチド（ＩＣＫ）に融合された、配列番号９ ＢＡＡＳ ＥＲＳＰを発現するＴＲＢＯ発現システムを説明する。バーＣは、ハイブリッド毒素（ＩＣＫ）に融合された、ＩＧＥＲ（Ｌｉｎｋｅｒ）に融合された、配列番号１０ ＧＦＰ（ＳＴＡ）を発現する、ＦＥＣＴ発現システムを説明する。バーＤは、ハイブリッド毒素（ＩＣＫ）に融合されたＩＧＥＲ（Ｌｉｎｋｅｒ）に融合されたＧＦＰ（ＳＴＡ）に融合された、配列番号１１ ＢＡＡＳ（ＥＲＳＰ）を発現するＦＥＣＴ発現システムを説明する。バーＡおよびＢの検出レベルは、無視できる程度のタンパク質の検出しか示さない。バーＡでは、これはおそらく、ＥＲにおいて、存在するＩＣＫが、適切にフォールディングしていないことによるものであろう。バーＢでは、これはおそらく、ＳＴＡを欠いたことにより、適切にフォールディングされたが、蓄積が為されなかったことによるものであろう。バーＣおよびバーＤにおいては、検出可能なレベルである。バーＣ［ハイブリッド毒素（ＩＣＫ）に融合されたＩＧＥＲ（Ｌｉｎｋｅｒ）に融合された、（配列番号１０）ＧＦＰ（ＳＴＡ）］に対する実験が行われた際、高レベルのＧＦＰ蛍光が検出されたことから（データは示さず）、ＴＳＰのほとんどが融合タンパク質であったことが示唆されるが、ＥＬＩＳＡが行われた際には、わずか０．０１％のＴＳＰが検出されたのみであり、これはおそらく、このタンパク質が、フォールディングが発生するＥＲに対して標的化されていないために、適切なフォールディングが欠落した（発生しなかった）ためであろう。ＥＬＩＳＡに用いられる抗体は、適切にフォールディングされたタンパク質の三次元構造のみを検出する。バーＤ［ハイブリッド毒素（ＩＣＫ）に融合された、ＩＧＥＲ（Ｌｉｎｋｅｒ）に融合された、ＧＦＰ（ＳＴＡ）に融合された、配列番号１１ ＢＡＡＳ（ＥＲＳＰ）］に対する実験が行われた際、いくらかのＧＦＰ蛍光が検出され、ＧＦＰに融合されたＩＣＫペプチドの、０．１％のＴＳＰの蓄積があった。バーＡ、Ｂ、ＣおよびＤのデータを考え合わせると、ＩＣＫ発現ＯＲＦのＥＲＳＰが、適切なフォールディングを得るために必要であること、および、ＳＴＡが、ペプチドの蓄積を増加させるために必要であることが明らかである。
本明細書において、標的化発現に対して設計された、異なるＦＥＣＴベクターを用いた、一過性形質転換されたタバコ葉における、ＧＦＰ−ハイブリッド融合タンパク質構築物の、緑色蛍光のＧＦＰ発光を、実証および記述する。我々は、ＡＰＯ（アポプラスト局在）蓄積に対するｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨベクター；ＣＹＴＯ（細胞質局在）蓄積に対するｐＦＥＣＴ−ＧＩＨベクター；およびＥＲ（小胞体局在）蓄積に対するｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ−ＥＲベクター、を用いることに成功した。データは示さず。
本明細書において、異なるタイプのＥＲＳＰを用いた、一過性形質転換されたタバコ葉における、ＧＦＰ−ハイブリッド融合タンパク質構築物の、緑色蛍光のＧＦＰ発光を、実証および記述する。我々は、ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨベクター；ｐＦＥＣＴ−ＥＧＩＨベクター；およびｐＦＥＣＴ−Ｅ＊ＧＩＨベクターを伴う発現の実証に成功した。データは示さず。
我々はペプチド蓄積のレベルを測定し、この結果を図８および９に示す。図８は、異なる蓄積局在化を伴う、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを一過性に発現したタバコの％ＴＳＰをｉＥＬＩＳＡで検出したグラフである。ＡＰＯ：アポプラスト局在；ＣＹＴＯ：細胞質局在；ＥＲ：小胞体局在。図９は、３つの異なるＥＲＳＰ配列（ＢＡＡＳシグナルペプチド（ＢＧＩＨ）、エクステンシンシグナルペプチド（ＥＧＩＨ）、および改変エクステンシンシグナルペプチド（Ｅ＊ＧＩＨ））を有する、翻訳融合物をコードするＦＥＣＴ発現ベクターを用いた、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを一過性発現するタバコ葉の％ＴＳＰをｉＥＬＩＳＡで検出したグラフである。
［安定植物形質転換技術を用いた、タンパク質発現ＯＲＦの、植物ゲノムへの組込み］
安定植物形質転換技術を用いて、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦもまた植物ゲノムへと組み込むことができ、それゆえに、ＩＣＫモチーフタンパク質は、何世代にもわたり、植物において安定して発現され、この形質転換植物を防御することができる。植物の安定形質転換に対して、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクターは、環状または線状であっても良い。ベクターＤＮＡ中に、２〜３の重要成分が含まれなくてはならない。植物における最適発現のために、安定植物形質転換に対するＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、上述の一過性植物発現に関する研究成果に基づき、慎重に設計されなければならない。ＩＣＫモチーフタンパク質の発現は通常、トランスジェニック植物の全細胞の一部における転写を促進するプロモーターにより制御される。プロモーターは、強力な植物ウイルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の構造性３５Ｓプロモーター）であっても良く、また、強力な植物プロモーター（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のヒドロペルオキシドリアーゼプロモーター（ｐＨＰＬ）、大豆由来のＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘポリユビキチン（Ｇｍｕｂｉ）プロモーター、異なる植物種（イネ、トウモロコシ、ジャガイモ等）由来のユビキチンプロモーター等）であっても良い。植物転写ターミネーターは多くの場合、ＯＲＦの停止コドンの後に存在し、ＲＮＡポリメラーゼおよびｍＲＮＡの転写を停止させる。ＩＣＫモチーフタンパク質の発現を評価するために、レポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ重圧アッセイのためのβグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ＵＶ光下での緑色蛍光検出のための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子等）をＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクターに含ませることができる。形質転換植物の選択のために、通常、選択マーカー遺伝子がＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター内に含まれる。マーカー遺伝子発現産物により、形質転換植物に、特定の抗生物質（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン等）に対する抵抗性、または特定の除草剤（例えば、グリホサート等）に対する抵抗性をもたらすことができる。アグロインフェクション技術を植物の形質転換に適用させる場合、植物内にＴ−ＤＮＡ部分を移送させるために、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター内に、Ｔ−ＤＮＡの左縁配列および右縁配列もまた含まれる。構築されたＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクターは、多くの形質転換技術を用いて、植物の細胞または組織へと形質転換することができる。アグロインフェクションは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株、または、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株を用いた、植物を形質転換させるための、非常にポピュラーな方法である。粒子照射（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ、またはＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓとも呼ばれる）技術も、植物の形質転換に非常に良く用いられる。あまり普遍的には用いられていない他の形質転換法としては、組織エレクトロポレーション、シリコンカーバイドウイスカー（ｓｉｌｉｃｏｎ ｃａｒｂｉｄｅ ｗｈｉｓｋｅｒｓ）、ＤＮＡの直接注入等が挙げられる。形質転換の後、形質転換植物の細胞または組織を、植物再生培地に置き、成功裏に形質転換植物の細胞または組織を、トランスジェニック植物へと再生させた。形質転換植物における、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの組込みおよび発現の評価は、以下のように行うことができる。
［形質転換植物の評価］
形質転換植物の評価は、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで行うことができる。安定的に形質転換された植物は、これら全てのレベルで評価することができ、一過性に形質転換された植物は通常、タンパク質レベルでのみ評価される。ＩＣＫ発現モチーフタンパク質発現ＯＲＦが安定形質転換植物のゲノムへと組み込まれたことを確認するために、このゲノムＤＮＡを、安定形質転換植物組織から抽出し、ＰＣＲ評価またはサザンブロット法へ適用しても良い。安定形質転換植物でのＩＣＫモチーフタンパク質の発現は、ＲＮＡレベルで評価することができ、すなわち、トータルｍＲＮＡを形質転換植物組織から抽出しても良く、そしてノーザンブロット法およびＲＴ−ＰＣＲ法を適用し、ＩＣＫモチーフタンパク質のｍＲＮＡを定性的に評価、または定量的に評価しても良い。形質転換植物のＩＣＫモチーフタンパク質の発現はまた、タンパク質レベルで直接、評価することができる。形質転換植物で発現されたＩＣＫモチーフタンパク質を評価するための、多くの方法がある。もし、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦと共に、レポーター遺伝子が植物に形質転換されている場合、レポーター遺伝子アッセイを実施し、形質転換ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦの発現を最初に評価しても良く、例えば、ＧＵＳレポーター遺伝子発現に対するＧＵＳ重圧アッセイ、ＧＦＰレポーター遺伝子発現に対する緑色蛍光検出アッセイ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現に対するルシフェラーゼアッセイ等がある。さらに、総発現タンパク質を、形質転換植物組織から抽出し、形質転換植物におけるＩＣＫモチーフタンパク質の発現を直接評価することができる。抽出された総発現タンパク質試料をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイに用いて、試料中の総タンパク質レベルを評価しても良い。形質転換植物組織由来の抽出総タンパク質試料における、ＩＣＫモチーフタンパク質の定性的、または定量的評価のために、分析ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ウェスタンブロット法、またはｉＥＬＩＳＡアッセイを採用しても良い。また、ＩＣＫモチーフタンパク質発現を、昆虫バイオアッセイにおいて、形質転換植物組織から抽出された総タンパク質試料を用いることにより、評価することができる。最後に、形質転換植物組織または全形質転換植物を、昆虫バイオアッセイで検証し、ＩＣＫモチーフタンパク質発現および、植物に対する防御を評価しても良い。
パート１の詳細な記述および概要を、以下にまとめる。
例えばインヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質等のシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）に操作可能に連結された、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成されるタンパク質を、本明細書において提示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質（ＥＲＳＰ−ＩＣＫ）のＮ末端である。ＥＲＳＰは、発現ＣＲＩＰを植物細胞の小胞体へと誘導する任意のシグナルペプチドである。ＣＲＩＰは、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）タンパク質または非ＩＣＫタンパク質であっても良い。ＥＲＳＰは、植物由来の５〜５０アミノ酸の長さのペプチドであり、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結され、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であり、介在ＳＴＡ配列は、ＣＲＩＰ（任意選択的にＩＣＫモチーフタンパク質である）のＮ末端側（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＩＣＫ）もしくは非ＩＣＫモチーフタンパク質のＮ末端側（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−非ＩＣＫ）、またはＩＣＫもしくは非ＩＣＫモチーフタンパク質のＣ末端側（ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＳＴＡ、またはＥＲＳＰ−非ＩＣＫ−ＳＴＡ）上のいずれかであっても良い。ＥＲＳＰは、３〜６０アミノ酸の長さの間、または５〜５０アミノ酸の長さの間、２０〜３０アミノ酸の長さの間のペプチドである。植物、αアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）（配列番号４）、由来であっても良い。ＥＲＳＰは、配列番号１８のタバコエクステンシンシグナルペプチドであるペプチドであっても良い。ＥＲＳＰは、配列番号１９の改変タバコエクステンシンシグナルペプチドであっても良い。または、配列番号２７の、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ由来のＪｕｎ ａ３シグナルペプチドであっても良い。
１６〜６０アミノ酸の長さの間、２６〜４８アミノ酸の長さの間、３０〜４４アミノ酸の長さの間であるＩＣＫモチーフタンパク質である、ＣＲＩＰの例を提示し、ここで、インヒビトリーシステインノットモチーフを有するペプチドもしくは殺虫性ペプチドの任意のペプチドまたは源から選択され、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅを含むペプチドの任意のペプチドまたは源であり、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａに由来する、ＡＣＴＸペプチドの任意のペプチドである。ＩＣＫモチーフタンパク質は、前記のペプチドおよび配列番号の成熟、プレおよびプロペプチドの型、ならびに、任意の変異体、またはペプチド断片の欠損もしくは不可を含む、任意の殺虫性ペプチドおよびその断片であり、しかしインヒビトリーシステインノット構造をいまだ維持しているものである。ＩＣＫモチーフタンパク質は、配列番号６のＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、配列番号２４のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、カッパ−ＡＣＴＸ−ＨＶ１ｃであっても良い。それらペプチドをコードする任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。トランスジェニック植物ゲノムに組み込まれるペプチドをコードする、任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ。本明細書において、形質転換植物で適切にフォールディングされる殺虫性ペプチドを発現するための、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換するための、または、形質転換植物で適切にフォールディングされる殺虫性ペプチドを発現させ、発現および適切にフォールディングされた殺虫性ペプチドを前記植物で蓄積させ、および、昆虫の損害に対する植物の抵抗性を増加させるための、植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換するための、本明細書に開示される任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用。本明細書に記述される任意のペプチドを有する、または発現するトランスジェニック植物および形質転換植物を作製するためにヌクレオチドを使用する方法を開示する。任意のこれらの産物およびプロセスにより作製される形質転換植物を開示する。
翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結される、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質または非ＩＣＫタンパク質である（任意選択的）、ＣＲＩＰに操作可能に連結される小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成されるタンパク質が開示され、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であり、介在翻訳安定化タンパク質配列は、ＩＣＫモチーフタンパク質（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−ＩＣＫ、または任意選択的にＥＲＳＰ−非ＩＣＫ−ＳＴＡ）のＮ末端側、またはＩＣＫモチーフタンパク質（ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−ＳＴＡ、またはＥＲＳＰ−ＳＴＡ−非ＩＣＫ）のＣ末端側のいずれかであっても良い。
上述の、分子量１２ｋＤのそのようなＳＴＡが開示され、前記ＳＴＡは多くのタンパク質（上述の分子量１２ｋＤのＩＣＫモチーフタンパク質、または上述の分子量１２ｋＤの、リンカーペプチド（Ｌ）に連結される複数のＩＣＫモチーフタンパク質（例えば、ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−（Ｌｉ−ＩＣＫｊ）Ｎ、または、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫｊ−Ｌｉ）Ｎ−ＩＣＫ））であっても良い。我々は、リンカーペプチドは同じまたは異なっていても良いことを説明する。我々は、１つのＳＴＡがクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１３）であり、ＳＴＡがスノードロップレクチン、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓアグルチニン（ＧＮＡ）（配列番号２８）であっても良く、および、ＳＴＡがＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉであるタンパク質、Ｊｕｎ ａ３（配列番号２６）であっても良いことを述べる。
ＬＩＮＫＥＲは、４〜２０アミノ酸の長さの任意のペプチドであることを提示する。プロテアーゼ認識部位を含有する任意のペプチドであるＬＩＮＫＥＲを提示する。植物プロテアーゼ開裂部位を含有する任意のペプチドとしてＬＩＮＫＥＲを提示する。ＬＩＮＫＥＲが、ＩＧＥＲ（配列番号１）、ＥＥＫＫＮ（配列番号２）および（配列番号３）のアミノ酸配列を含有するペプチドであることを提示する。昆虫の消化システム中で開裂されることができる、または昆虫の血リンパ中で開裂されることができる、任意のペプチドとしてＬＩＮＫＥＲを提示する。前記ＬＩＮＫＥＲがトリプシン開裂部位を含有する、ＬＩＮＫＥＲを提示する。
ペプチドをコードする任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦを含む、記述される任意のタンパク質をコードするヌクレオチドを開示し、ならびに、トランスジェニック植物ゲノムへと組み込まれる、ペプチドをコードする任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦを含む、記述される任意のタンパク質をコードするヌクレオチドを開示し、ならびに、形質転換植物で適切にフォールディングされる殺虫性ペプチドを発現するために植物または植物ゲノムにトランスフォームされる発現ＯＲＦを含む、記述される任意のタンパク質をコードするヌクレオチドを開示し、ならびに、形質転換植物で適切にフォールディングされる殺虫性ペプチドを発現させ、前記植物で発現され、適切にフォールディングされた殺虫性ペプチドの蓄積をもたらし、昆虫の損害に対する植物の抵抗性を増加させるために、植物または植物ゲノムにトランスフォームされる発現ＯＲＦを含む、記述される任意のタンパク質をコードするヌクレオチドを開示する。本明細書に記述される任意のペプチドを有する、または発現する、形質転換植物および、これらの記述からもたらされるトランスジェニック植物を開示する。
本明細書のペプチドをコードする任意のヌクレオチドを含有する発現ＯＲＦ、ならびにトランスジェニック植物へと組み込まれる発現ＯＲＦを説明および記述し、ならびに、これが行われる１つの理由は、形質転換植物で適切にフォールディングされた殺虫性ペプチドを発現するために植物もしくは植物ゲノムを作製または形質転換することであり、および、これが行われる１つの理由は、前記植物で発現され、適切にフォールディングされた殺虫性ペプチドの蓄積を形質転換植物にもたらし、昆虫の損害に対する植物の抵抗性増加をもたらすことであることを、説明および記述する。我々は、これらの手順を用いてトランスジェニック植物を作製する方法、ならびに、本明細書に記述されるペプチドおよび、当業者が本明細書の教示により、および本明細書に記述される任意の産物およびプロセスを用いて使用する任意の他のペプチドを発現するトランスジェニック植物を作製する方法を教示する。
介在リンカーペプチド（Ｌ）に操作可能に連結される、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結されるインヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質に操作可能に連結される小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成される、タンパク質を作製する方法を教示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であり、前記ＬＩＮＫＥＲは、ＳＴＡおよびＩＣＫモチーフタンパク質の間であり、前記翻訳安定化タンパク質は、ＩＣＫモチーフタンパク質のＮ末端側（上流）またはＩＣＫモチーフタンパク質のＣ末端側（下流）上のいずれか（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−Ｌ−ＩＣＫ、または、ＥＲＳＰ−ＩＣＫ−Ｌ−ＳＴＡと記述される）であっても良い。我々は、前述のＥＲＳＰ、ＣＲＩＰおよびＩＣＫ、ＬＩＮＫＥＲ、ＳＴＡが、本明細書に記述される任意のペプチド、および、当業者が本明細書の教示により、および本明細書に記述される任意の産物およびプロセスを用いて使用する任意の他のペプチドであっても良いことを説明する。
介在リンカーペプチド（Ｌ）に操作可能に連結される、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）に操作可能に連結される、複数のインヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質ドメイン（ＩＣＫモチーフタンパク質は介在リンカーペプチド（Ｌ）を介して、互いに連結されている）に操作可能に連結される、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成されるタンパク質を作製する方法を教示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、前記タンパク質のＮ末端であり、前記ＬＩＮＫＥＲは、ＳＴＡと複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメインの間であり、前記ＳＴＡは、複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメインのＮ末端側（上流）または複数のＩＣＫモチーフタンパク質ドメインのＣ末端側（下流）のいずれか上であっても良い（ＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（Ｌｉ−ＩＣＫｊ）Ｎ、または、ＥＲＳＰ−（ＩＣＫｊ−Ｌｉ）Ｎ−ＳＴＡと記述される）。
これらのタンパク質、発現ＯＲＦをコードするヌクレオチドを作製する方法、トランスジェニック植物ゲノム、キメラ遺伝子、組換えベクター、トランスジェニック宿主細胞、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物（トウモロコシ、大豆、綿花、イネ、小麦、モロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、タバコ、任意の緑色葉物野菜、または任意の果樹、または本明細書に言及される任意の植物種である）、および、これら手順に従うトランスジェニック植物由来の種子（種子はキメラ遺伝子を含有）を作製する方法、ならびに、これらへと組み込む方法を教示する。
（実施例）
本明細書の実施例は本発明を限定する意図は無く、および限定するために用いられてはならず、それらは、本発明を解説するためにのみ、提示されるものである。
＜実施例１＞
［２つの一過性植物発現システムの間の発現比較］
一過性の植物形質転換技術を採用し、ただちに、植物発現に対して、ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦを最適化した。高効率、容易性および廉価であることから、一過性の植物形質転換には、植物ウイルスベクターを用いるアグロインフェクション技術を用いた。２つのウイルス一過性植物発現システムを、植物におけるＩＣＫモチーフタンパク質発現に対し、ここで評価した。１つはタバコモザイクウイルス過剰発現システム（ＴＲＢＯ， Ｌｉｎｄｂｏ ＪＡ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２００７， Ｖ１４５： １２３２−１２４０）である。ＴＲＢＯ ＤＮＡベクターは、アグロインフェクションのためのＴ−ＤＮＡ領域（ウイルス外殻タンパク質をコードする遺伝子無しで、タバコモザイクウイルスＲＮＡの発現を促進する、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含有する）を有している。他のウイルス一過性植物発現システムはＦＥＣＴ発現システム（Ｌｉｕ Ｚ ＆ Ｋｅａｒｎｅｙ ＣＭ， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１０， １０：８８）である。ＦＥＣＴベクターもまた、アグロインフェクションのためのＴ−ＤＮＡ領域（ウイルス外殻タンパク質および三重遺伝子ブロックをコードする遺伝子無しで、フォックステールモザイクウイルスＲＮＡの発現を活発化させるＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含有する）を含有している。両方の発現システムともに、「武装解除した」ウイルスゲノムを使用しており、ゆえに、ウイルスの植物〜植物感染は、効果的に阻害される。導入された異種遺伝子を効率的に発現させるために、ＦＥＣＴ発現システムはさらに、Ｐ１９（トマトブッシースタントウイルス由来のＲＮＡサイレンシング抑制タンパク質）を共発現し、導入されたＴ−ＤＮＡの翻訳後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を阻害することが必要である（ＴＲＢＯ発現システムは、Ｐ１９の共発現を必要とはしない）。２つの一過性植物発現システムを検証し、以下に記述されるように、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）におけるＩＣＫモチーフタンパク質の一過性発現により比較した。
ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、以下に記述される、一連の翻訳段階で融合された構造モチーフをコードするように設計された：Ｎ’−ＥＲＳＰ−Ｓｔａ−Ｌ−ＩＣＫ−Ｃ’。ここで、発現のためのＩＣＫモチーフタンパク質は、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａであり、以下のアミノ酸配列を有している（Ｎ’からＣ’へ。１文字コード）：
ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号１２）
ここで用いられたＥＲＳＰモチーフは、Ｂａｒｌｅｙ αアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）であり、以下に示される２４のアミノ酸を含有している（Ｎ’からＣ’へ。１文字コード）：
ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧ（配列番号４）
本発現ＯＲＦの安定化タンパク質（Ｓｔａ）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、以下のアミノ酸配列を有している（Ｎ’からＣ’へ。１文字コード）：
ＭＡＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＦＳＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＲＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号１３）
ＧＦＰとＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの間のリンカーペプチドは、トリプシン開裂部位を有しており、以下のアミノ酸配列を有している（Ｎ’からＣ’へ。１文字コード）：
ＩＧＥＲ（配列番号１）
ＩＣＫモチーフ発現ＯＲＦの化学式に従い、この具体的なＩＣＫ発現ＯＲＦは、ＢＡＡＳ−ＧＦＰ−ＩＧＥＲ−ハイブリッド、またはＢＧＩＨと記述することができる。ＢＧＩＨ ＯＲＦは、その５’末端にＰａｃＩ制限酵素部位を、その３’末端にＡｖｒＩＩ制限酵素部位を加えることにより化学的に合成された。合成ＢＧＩＨの配列は以下である：
ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号１４）
ＢＧＩＨ ＯＲＦを、ＦＥＣＴ発現ベクターのＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素部位へとクローニングし、ＦＥＣＴ一過性植物発現システムのためのＢＧＩＨ発現ベクター（ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ）を作製した。ＦＥＣＴ発現システムにおけるＢＧＩＨ発現を最大化するために、ＲＮＡサイレンシング抑制タンパク質Ｐ１９を発現するＦＥＣＴベクター（ｐＦＥＣＴ−Ｐ１９）を、共形質転換のために作製した。ＴＲＢＯ一過性植物発現システムに対するＢＧＩＨ発現ベクターを作製するために、一般的なＰＣＲ法を実施し、上述のＢＧＩＨ ＯＲＦの３’末端にＮｏｔＩ制限酵素部位を付加した。次いで、新たなＢＧＩＨ ＯＲＦをＴＲＢＯ発現ベクターのＰａｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位へとクローニングし、ＴＲＢＯ一過性植物発現システムのためのＢＧＩＨ発現ベクターを作製した（ｐＴＲＢＯ−ＢＧＩＨ）。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株、ＧＶ３１０１を、ＦＥＣＴおよびＴＲＢＯ発現システムによる、タバコ葉の一過性ＢＧＩＨ発現に用いた。コンピテントＧＶ３１０１細胞を作製するために、以下の手順を実施した：ＧＶ３１０１の一晩培養物を用いて、２００ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種した。次いで、細胞を対数増殖期まで増殖させた（ＯＤ６００は０．５と０．８の間）。次いで、細胞を、４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより、沈殿させた。次いで、細胞を１０ｍＬの前冷却ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ８．０）で一回洗浄し、次いで、２０ｍＬのＬＢ培地に再懸濁した。次いで、ＧＶ３１０１細胞の再懸濁液を、１．５ｍＬのマイクロチューブへ、２５０μＬのフラクションで分注した。次いで、分注物を、液体窒素中で急速冷凍させ、この先の形質転換のために−８０℃で保存した。
次いで、ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨおよび、ｐＴＲＢＯ−ＢＧＩＨベクターを、コンピテントＧＶ３１０１細胞へ、以下の凍結融解法を用いて形質転換した：保存したコンピテントＧＶ３１０１細胞を氷上で溶かし、次いで、１〜５μｇの精製ＤＮＡ（ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨまたはｐＴＲＢＯ−ＢＧＩＨベクター）と混合した。細胞−ＤＮＡ混合物を、次いで、氷上に５分間置き、次いで、−８０℃に５分間、移し、次いで、５分間、３７℃の水槽でインキュベートした。次いで、凍結融解処置細胞を、１ｍＬのＬＢ培地で希釈して、振動台上で、室温、２〜４時間、振とうさせた。細胞−ＤＮＡ混合物の２００μＬの分注物を、次いで、適切な抗生物質を有するＬＢ寒天プレート（ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ形質転換およびｐＴＲＢＯ−ＢＧＩＨ形質転換の両方に対して、１０μｇ／ｍＬのリファンピシン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを用いた）上に播種し、２日間、２８℃でインキュベートした。次いで得られた形質転換体のコロニーを、ピックアップし、形質転換されたＤＮＡ分析のための適切な抗生物質を有するＬＢ培地の６ｍＬの分注物中で培養し、形質転換されたＧＶ３１０１細胞のグリセロールストックを作製した。
タバコ葉の一過性形質転換は、３ｍＬシリンジ（針は無い）での葉注射を用いて実施した。形質転換されたＧＶ３１０１細胞を、適切な抗生物質（上述）を有するＬＢプレート上に画線し、２日間、２８℃でインキュベートした。形質転換ＧＶ３１０１細胞のコロニーおよび同じ抗生物質（上述）を、５ｍｌのＬＢ−ＭＥＳＡ培地（１０ｍＭ ＭＥＳ、２０μＭ アセトシリンゴンを補充したＬＢ培地）に接種し、一晩、２８℃で増殖させた。細胞の一晩培養物を、１０分間、５０００ｒｐｍの遠心で回収し、誘導培地（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭアセトシリンゴン）中に最終ＯＤ６００は１．０で再懸濁した。次いで、細胞を２時間から一晩、室温で、誘導培地中でインキュベートし、次いで、タバコ葉の一過性形質転換のための準備を整えた。処置した細胞を、３ｍＬシリンジ（付着針は無い）を用いた注射により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物についている葉の下面へと浸潤させた。ＦＥＣＴ一過性形質転換に対しては、ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ形質転換ＧＶ３１０１細胞およびｐＦＥＣＴ−Ｐ１９形質転換ＧＶ３１０１細胞を、等量で共に混合させ、３ｍＬのシリンジを用いた注入によるタバコ葉への浸潤に用いた。ＴＲＢＯ一過性形質転換に対しては、ｐＴＲＢＯ−ＢＧＩＨ形質転換ＧＶ３１０１細胞のみを、タバコ葉へと浸潤させた。タバコ葉におけるＩＣＫモチーフタンパク質発現は、浸潤後６〜８日で評価した。
ＢＧＩＨ発現ＯＲＦは、ＧＦＰ（ＳＴＡ）およびＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（ＩＣＫ）の融合タンパク質と、その間にＩＧＥＲ（配列番号１）リンカーペプチド（ＬＩＮＫＥＲ）を含有している。図３に示されるように、ＦＥＣＴおよびＴＲＢＯベクターの両方で形質転換されたタバコ葉において、ＵＶ光下、導入遺伝子の発現ＧＦＰ部分の緑色蛍光を検出した。興味深いことに、ＦＥＣＴベクター形質転換タバコ葉（維管束組織を除く）において、緑色蛍光は均一に分布して観察されたが、一方で、ＴＲＢＯベクター形質転換葉では、維管束組織に蓄積して観察されたが、これはおそらく、ＴＲＢＯがそのウイルス性の移動タンパク質を維持していた一方、ＦＥＣＴは維持していないことによるものである。
ＩＣＫモチーフタンパク質発現の定量的評価のために、形質転換タバコ葉で発現されたタンパク質を、本明細書に記述される以下の手順で抽出した。形質転換葉組織の１００ｍｇディスクを、大きく開いた１０００μＬのピペットチップを用いて葉をパンチすることにより採取した。採取した葉組織を、２ｍＬのマイクロチューブ（５／３２”直径のステンレススチールの破砕の球が入っている）へと入れ、１時間、−８０℃で凍結させた後、Ｔｒｏｅｍｎｅｒ−Ｔａｌｂｏｙｓ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いてホモジナイズした。７５０μＬの氷冷ＴＳＰ−ＳＥ１抽出溶液（リン酸ナトリウム溶液５０ｍＭ、１：１００希釈プロテアーゼインヒビターカクテル、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＤＩＥＣＡ １０ｍＭ、ＰＶＰＰ ８％、ｐＨ７．０）をチューブに加えてボルテックスを行った。次いで、マイクロチューブを１５分間、室温に静置し、次いで、４℃で１５分間、１６，０００ｇで遠心した。得られた上清１００μＬを取り出し、０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎでの、ｐｒｅ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０−ｐａｃｋｅｄカラム（底面上に、空のレシーブＣｏｓｔｅｒマイクロタイタープレートがある）へと、ロードした。次いで、マイクロタイタープレートを４℃で２分間、８００ｇで遠心した。得られたろ過溶液（本明細書において、タバコ葉の総可溶性タンパク質抽出物（ＴＳＰ抽出物）と呼称する）を、定量的解析に供した。
ＴＳＰ抽出物の総可溶性タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを用いて推定した。濃度が既知のＢＳＡタンパク質標準を用いて、タンパク質定量標準曲線を作製した。各ＴＳＰ抽出物２μＬを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキットの発色試薬（ＣＰＰＡ試薬）２００μＬと混合し、１０分間、反応させた。次いで、発色反応を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏをコントロールソフトウェアとして使用するＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ−Ｍ２プレートリーダーを用いて、ＯＤ５９５を測定することにより評価した。総可溶性タンパク質の濃度は、ＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ発現葉およびＴＲＢＯ−ＢＧＩＨ発現葉からのＴＳＰ抽出物において、それぞれ、０．７８８±０．２０μｇ／μＬおよび、０．５３３±０．０３μｇ／μＬであった。これらの結果を、ｉＥＬＩＳＡアッセイにおけるＴＳＰ（％ＴＳＰ）での、発現Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのパーセンテージ算出に用いた。
間接ＥＬＩＳＡ（ｉＥＬＩＳＡ）アッセイを、以下のように実施し、ＦＥＣＴおよびＴＲＢＯ発現システムで一過性に形質転換されたタバコ葉におけるＩＣＫモチーフタンパク質を定量的に評価した。５μＬの葉ＴＳＰ抽出物を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＤ ９６−ウェルプレート中で、９５μＬのＣＢ２溶液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと希釈し、必要に応じて段階希釈を実施した。次いで、３時間、遮光、室温にて、抽出試料からの葉タンパク質でウェル壁をコートさせ、次いで、ＣＢ２溶液を除去し、各ウェルを２００μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄した。１５０μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳに溶解したＢｌｏｃｋ ＢＳＡ（５％の無脂肪ドライミルク添加））を、次いで、各ウェルに添加し、１時間、室温、遮光でインキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した後、１００μＬのウサギ抗Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ抗体（１次抗体）（ブロッキング溶液で１：２５０倍希釈）を各ウェルに添加し、１時間、遮光、室温にてインキュベートした。次いで、１次抗体を除去し、各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。次いで、１００μＬのＨＲＰ接合ヤギ抗ウサギ抗体（２次抗体、ブロッキング溶液で１：１０００倍希釈して使用）を各ウェルに添加し、１時間、遮光、室温にてインキュベートした。２次抗体を除去し、ＰＢＳでウェルを洗浄した後、１００μＬの基質溶液（ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質溶液Ａおよび溶液Ｂの１：１混合物、ＫＰＬ）を各ウェルに添加し、十分な発色発現が現れるまで、発色反応を行わせた。次いで、１００μＬのペルオキシダーゼ停止溶液を各ウェルに添加し、反応を停止させた。プレートの各反応混合物の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ−Ｍ２プレートリーダー（コントロールソフトウェアとしてＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを使用）を用いた、４０５ｎｍで測定した。段階希釈された濃度既知の精製Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ試料を、ｉＥＬＩＳＡアッセイにおいて上述と同じように処置し、定量分析のための質量−吸光度標準曲線を作製した。ｉＥＬＩＳＡにより、発現Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、ＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ形質転換タバコ由来の葉ＴＳＰ抽出物中で、３．０９±１．８３ｎｇ／μＬで検出され、ＴＲＢＯ−ＢＧＩＨ形質転換タバコ由来の葉ＴＳＰ抽出物中で、３．５６±０．７４ｎｇ／μＬで検出された。すなわち、発現Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、ＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ形質転換体に対しては、０．４０％総可溶性タンパク質（％ＴＳＰ）であり、ＴＲＢＯ−ＢＧＩＨ形質転換体では０．６７％ ＴＳＰである。
結論として、ＦＥＣＴおよびＴＲＢＯ一過性植物発現システムは両方とも、植物におけるＩＣＫモチーフタンパク質の発現に用いることができる。両システムにおけるＩＣＫモチーフタンパク質の発現レベルは非常に似ている。しかしながら、ＦＥＣＴシステムにおける発現はアグロ浸潤（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）した葉において均一に分布している一方、ＴＲＢＯシステムにおける発現は、アグロ浸潤した葉の維管束組織に蓄積している。
＜実施例２＞
［異なる細胞内標的での蓄積を伴う、タバコ葉におけるＩＣＫモチーフタンパク質の一過性発現］
昆虫の損害から植物を効果的に防御するためには、植物発現ＩＣＫモチーフタンパク質があるレベルまで蓄積される必要がある。植物発現ＩＣＫモチーフタンパク質の蓄積レベルは、植物細胞内におけるその最終的な局在に影響される可能性がある。本実施例において、植物におけるタンパク質の蓄積レベルに対する、植物発現ＩＣＫモチーフタンパク質の、異なる細胞内局在に対する効果を調査した（ＦＥＣＴ一過性植物発現システムを使用）。３つの細胞内標的を本実施例において調査した：植物細胞壁アポプラスト（ＡＰＯ）、小胞体（ＥＲ）、および細胞質（ＣＹＴＯ）。
ＡＰＯ標的化ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、以下に記述される、一連の翻訳段階で融合された構造モチーフをコードするように設計された：Ｎ’−ＥＲＳＰ−Ｓｔａ−Ｌ−ＩＣＫ−Ｃ’。本実験におけるＩＣＫモチーフタンパク質はＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａであり、実施例１のＢＧＩＨ発現ＯＲＦを再度、用いた。実施例１と同じベクター、ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨをここでも用いた。
ＣＹＴＯ標的化ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、以下に記述される、一連の翻訳段階で融合された構造モチーフをコードするように設計された：Ｎ’−Ｓｔａ−Ｌ−ＩＣＫ−Ｃ’。本実験において、バーレー（ｂａｒｌｅｙ）αアミラーゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をＢＧＩＨ発現ＯＲＦから除去してＧＩＨ発現ＯＲＦとし、そのオープンリーディングフレーム配列は以下である：
ＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡ（配列番号１５）
ＧＩＨ発現ＯＲＦを、ＦＥＣＴ発現ベクターのＰａｃＩとＡｖｒＩＩ制限酵素部位へとクローニングして、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＣＹＴＯ標的発現に対するＦＥＣＴ一過性植物発現システムのためのＧＩＨ発現ベクター（ｐＦＥＣＴ−ＧＩＨ）を作製した。
ＥＲ標的化ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦは、ＢＧＩＨ発現ＯＲＦのＣ末端でＥＲ標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を付加することにより設計され、ＢＧＩＨ−ＥＲ発現ＯＲＦを名付けた。ここで用いられたＥＲ標的シグナルペプチドは以下のアミノ酸配列を有している（アミノ酸１文字コード）：
ＫＤＥＬ（配列番号１６）
ＢＧＩＨ−ＥＲ発現ＯＲＦのＤＮＡ配列は以下である：
ＡＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＡ（配列番号１７）
ＢＧＩＨ−ＥＲ発現ＯＲＦを、ＦＥＣＴ発現ベクターのＰａｃＩとＡｖｒＩＩ制限酵素部位へとクローニングして、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＥＲ標的化発現に対するＦＥＣＴ一過性植物発現システムのためのＢＧＩＨ−ＥＲ発現ベクター（ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ−ＥＲ）を作製した。
ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ、ｐＦＥＣＴ−ＧＩＨおよびｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ−ＥＲの３つ全てのベクターを、アグロバクテリウム株、ＧＶ３１０１へと形質転換し、得られた形質転換ＧＶ３１０１細胞を、実施例１に記述される方法を用いた、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉への一過性形質転換に用いた。３つ全ての発現ＯＲＦは、２つの構造ドメインの間にトリプシン開裂可能なリンカーを伴う、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを含有する、融合タンパク質を一過性に発現するはずである。
一過性タバコ形質転換の６日後、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの発現を、緑色蛍光のＵＶ光下での検出を最初に検証した。緑色蛍光は全ての形質転換タバコ葉で様々なレベルで検出された。ＣＹＴＯ標的化ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを有する形質転換葉は、最も強い緑色蛍光を示し、ＡＰＯまたはＥＲ標的化融合タンパク質を有する葉の蓄積は、それよりも弱い緑色蛍光を示した。ゆえに、この結果から、ＣＹＴＯ標的化発現が、ＡＰＯおよびＥＲ標的化発現よりも、タバコの葉において、トランスジェニックＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのより多くの蓄積を促進しうることが示唆された。本実験の３つの反復実験において、ＣＹＴＯ標的化発現を有する形質転換タバコ葉は常に同じか、または、ＡＰＯ標的化発現の葉よりも強い緑色蛍光を示し、ＥＲ標的化構築物で形質転換したタバコの葉において、最も弱い緑色蛍光が検出された。これらの最初の結果から、ＣＹＴＯ標的化発現が、最も多く、またはＡＰＯ標的化タンパク質よりも多く蓄積しうること、およびＥＲ標的化発現の蓄積は最も少ないことが示唆された。
異なるＦＥＣＴベクターで形質転換されたタバコ葉から、総可溶性タンパク質試料を抽出した（プロトコールは実施例１に詳述）。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを、実施例１に記述されるように実施し、ＴＳＰ抽出物中の総可溶性タンパク質の濃度を測定し、以下の推定濃度を得た：０．３１±０．０４μｇ／μＬ、０．３１±０．０３μｇ／μＬ、および、０．３４±０．０５μｇ／μＬ（それぞれ、ＡＰＯ標的化、ＣＹＴＯ標的化およびＥＲ標的化発現、Ｎ＝３）。
次いで、実施例１に記述されるように、ＴＳＰ抽出物を用いて、関節ＥＬＩＳＡプロトコールを実施し、総可溶性タンパク質のパーセンテージとして（％ＴＳＰ）、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の発現レベルを定量し、以下の推定パーセンテージを得た：０．１２６±０．０３２％、０．０４９±０．０８５％および、０．０２５±０．０１８％（それぞれ、ＡＰＯ標的化、ＣＹＴＯ標的化およびＥＲ標的化発現、Ｎ＝３）。図８に、上述の様々な形質転換タバコ葉に対する、発現Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのこの定量（％ＴＳＰ値として）を要約している。これらの結果から、ＡＰＯ標的化導入遺伝子発現により、葉において、正確にフォールディングされたＩＣＫモチーフタンパク質の発現が最も高くなることが示唆された。
全体として、ＣＹＴＯ標的化、トランスジェニックＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを産生するように形質転換されたタバコ葉は、最も強い緑色蛍光シグナルを示したが、ｉＥＬＩＳＡの結果では、これらのトランスジェニックタバコ葉の中で最も弱いＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドが検出され、実際には、ＥＲ標的化発現で形質転換された葉（最も弱い緑色蛍光シグナルであった）に対して検出されたものよりもかなり低いものであった。ｉＥＬＩＳＡアッセイにおいて、一次抗体（ウサギ抗Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ抗体）は、正確にフォールディングされたＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドのみを検出することができる。
＜実施例３＞
［植物におけるＩＣＫモチーフタンパク質発現に対する別のシグナルペプチド］
おそらくＥＲシグナルペプチドはタンパク質発現レベルに重要な役割を果たすことが推察されるため、前述の実施例に記述されるように、ＦＥＣＴ発現システムを用いて、２つの他のＥＲＳＰを検証した。２つのＥＲＳＰ候補は、タバコエクステンシンシグナルペプチド（本実験において、「Ｅ」の略字）（Ｍｅｍｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ， ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９３， Ｖ４： １０１１−１０２２．）、および、その変異体の内の１つ（略字は「Ｅ＊」）（Ｐｏｇｕｅ ＧＰ ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１０， Ｖ８： ６３８−６５４．）であった。それらのアミノ酸配列を以下に記す（Ｎ’からＣ’へ。１文字コード。同一ではない残基は太字）：
エクステンシンシグナルペプチド
ＥＭＧＫＭＡＳＬＦＡＳＬＬＶＶＬＶＳＬＳＬＡＳＥＳＳＡ（配列番号１８）
エクステンシンシグナルペプチド変異体（Ｅ＊）
ＭＧＫＭＡＳＬＦＡＴＦＬＶＶＬＶＳＬＳＬＡＳＥＳＳＡ（配列番号１９）
ＥをコードするＤＮＡ配列を、以下のように、タバコ発現に対して設計した：
ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴ（配列番号２０）
Ｅ ＤＮＡ配列を、４つの合成ＤＮＡプライマーを用いたオリゴ伸長ＰＣＲにて作製した。次いで、ＰａｃＩ制限酵素部位をその５’末端に付加し、その３’末端にＧＦＰの５’末端ＤＮＡ配列部分を付加するために、Ｅ ＤＮＡ配列を鋳型として用いてさらにＰＣＲを行い、１１７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。次いで、この断片をフォワードＰＣＲプライマーとして用いて、ＧＦＰ−ＩＧＥＲリンカー−Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列を、ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ（実施例１および実施例２を参照のこと）から増幅し、ＥＲＳＰ−Ｓｔａ−Ｌ−ＩＣＫとしての我々のＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦ設計の内の１つの後に、エクステンシンシグナルペプチド−ＧＦＰ−ＩＧＥＲリンカー−Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをコードする（Ｎ’からＣ’末端へ）、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ＯＲＦを作製した。この発現ＯＲＦ（「ＥＧＩＨ」と名付けられた）は、その５’末端にＰａｃＩ制限酵素部位を有し、３’末端にＡｖｒＩＩ制限酵素部位を有している。ＥＧＩＨは、以下のＤＮＡ配列を有している。
ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号２１）
ＥＧＩＨ ＤＮＡ配列を、ＦＥＣＴベクターのＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素部位へとクローニングし、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質が融合された一過性植物発現のためのｐＦＥＣＴ−ＥＧＩＨベクターを作製した。
変異型エクステンシンシグナルペプチド（Ｅ＊）をコードするＤＮＡ配列を、以下のように、タバコでの発現のために設計した：
ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴ（配列番号２２）
（Ｎ’からＣ’へとリストされる）変異型エクステンシンシグナルペプチド−ＧＦＰ−ＩＧＥＲリンカー−Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の翻訳段階での融合をコードした「Ｅ＊ＧＩＨ」ＤＮＡ配列は、ＥＧＩＨ ＯＲＦに対する上述のものと同じ技術を用いて作製された。得られたＥ＊ＧＩＨ ＯＲＦは以下のＤＮＡ配列を有している：
ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号２３）
Ｅ＊ＧＩＨ ＤＮＡ配列を、ＦＥＣＴベクターのＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素部位へとクローニングして、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の一過性植物発現のためのｐＦＥＣＴ−Ｅ＊ＧＩＨベクターを作製した。
ｐＦＥＣＴ−ＢＧＩＨ、ｐＦＥＣＴ−ＥＧＩＨおよびｐＦＥＣＴ−Ｅ＊ＧＩＨの３つの異なるＦＥＣＴ発現ベクターを用いて、タバコ植物でＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質を一過性に発現させ、タンパク質発現レベルがどの程度異なるＥＲＳＰにより影響を受けるか評価した。３つのＦＥＣＴ発現ベクターをアグロバクテリウム、ＧＶ３１０１へと形質転換し、次いで、実施例１に記述される技術を用いて、タバコ葉における、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の一過性発現のために、形質転換されたＧＶ３１０１をタバコ葉へと注入した。
上述の３つの異なるＦＥＣＴ発現ベクターからのＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの発現レベルを、ＵＶ光下で、緑色蛍光を検出することにより視覚的に最初に評価する。３つの異なるＦＥＣＴベクター由来の一過性形質転換タバコ葉からの緑色蛍光は、裸眼で見ることができる。全ての葉が類似の緑色蛍光レベルを示したことから、検証した３つのＥＲＳＰはどれも、ＧＦＰ融合Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の発現レベルの顕著な増加には寄与しないことが示唆される。
総可溶性タンパク質試料を、上述のように（プロトコールは実施例１に詳述）、３つのＥＲＳＰ ＦＥＣＴベクターで形質転換されたタバコ葉から抽出した。次いで、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを実施し（実施例１に記述）、得られたＴＳＰ試料中の総可溶性タンパク質の濃度を測定し、ＢＧＩＨ、ＥＧＩＨおよびＥ＊ＧＩＨ発現ＯＲＦ（Ｎ＝４）のそれぞれに対応する試料に対し、０．８５±０．６８μｇ／μＬ、０．７０±０．４７μｇ／μＬ、および０．７６±０．７７μｇ／μＬの値を得た。
次いで、ＴＳＰ抽出物（実施例１に記述）を用いて間接ＥＬＩＳＡを実施し、総可溶性タンパク質のパーセンテージとして（％ＴＳＰ）、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の発現レベルを定量し、ＢＧＩＨ、ＥＧＩＨおよびＥ＊ＧＩＨ発現ＯＲＦを有するＦＥＣＴベクターのそれぞれに対応する試料に対し、０．３９±０．１７％（Ｎ＝３、１データポイントはアウトライナー（ｏｕｔｌｉｎｅｒ）として除外されたため）、０．４８±０．２６％（Ｎ＝４）、および、０．６２±０．３８％（Ｎ＝４）の値を得た。図９に、上述の３つのＥＲＳＰ ＯＲＦで形質転換されたタバコ葉から取り出された全ての試料に対する総可溶性タンパク質でのパーセンテージとして（％ＴＳＰ）の、推定Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａレベルを要約する。３つのＦＥＣＴベクター形質転換の％ＴＳＰのデータは異なるように見えるが、スチューデントｔ検定によると、統計的な差異は無い。言い換えれば、３つのＥＲＳＰは、一過性形質転換タバコ葉において、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の発現レベルに差異をもたらさないということである。
＜実施例４＞
［ＩＣＫモチーフタンパク質への融合タンパク質として発現された安定化タンパク質は、形質転換植物におけるＩＣＫモチーフタンパク質の蓄積を補助する］
本実験の植物発現のためのＩＣＫモチーフタンパク質は、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ由来のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａであった。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、以下のアミノ酸配列を有している（１文字コード）：
ＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤ（配列番号２４）
ＦＥＣＴ発現システムを用いて、タバコ植物、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａでオメガ−ＡＣＴＸ−１ａを発現させた。異なるオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ＯＲＦをコードする２つのＦＥＣＴベクターを設計した。これらの発現ＯＲＦの内１つは、そのＮ’末端で、いずれの安定化タンパク質も付属していない、バーレーαアミラーゼシグナルペプチド（Ｂａｒｌｅｙ Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＢＡＡＳ）を有するオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをコードした。この発現ＯＲＦ（本明細書において、「ＢＯ」と呼称される）をサブクローニングして、ＦＥＣＴ発現ベクター、ｐＦＥＣＴ−ＢＯを得た。他のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ＯＲＦは、タンパク質Ｊｕｎ ａ３に対するオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの翻訳融合物をコードしている。成熟型のＪｕｎ ａ３は約３０ｋＤａの植物防御タンパク質であり、また、一部の人々にとってはアレルゲンとなり、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉの木から産生され、翻訳安定化タンパク質（ＳＴＡ）としてこのＯＲＦに用いられる。そのアミノ酸配列を以下に示す（１文字コード）：
ＭＡＲＶＳＥＬＡＦＬＬＡＡＴＬＡＩＳＬＨＭＱＥＡＧＶＶＫＦＤＩＫＮＱＣＧＹＴＶＷＡＡＧＬＰＧＧＧＫＲＬＤＱＧＱＴＷＴＶＮＬＡＡＧＴＡＳＡＲＦＷＧＲＴＧＣＴＦＤＡＳＧＫＧＳＣＱＴＧＤＣＧＧＱＬＳＣＴＶＳＧＡＶＰＡＴＬＡＥＹＴＱＳＤＱＤＹＹＤＶＳＬＶＤＧＦＮＩＰＬＡＩＮＰＴＮＡＱＣＴＡＰＡＣＫＡＤＩＮＡＶＣＰＳＥＬＫＶＤＧＧＣＮＳＡＣＮＶＦＫＴＤＱＹＣＣＲＮＡＹＶＤＮＣＰＡＴＮＹＳＫＩＦＫＮＱＣＰＱＡＹＳＹＡＫＤＤＴＡＴＦＡＣＡＳＧＴＤＹＳＩＶＦＣ（配列番号２５）
成熟型のＪｕｎ ａ３タンパク質は以下の配列番号２６に示す。
ＫＦＤＩＫＮＱＣＧＹＴＶＷＡＡＧＬＰＧＧＧＫＲＬＤＱＧＱＴＷＴＶＮＬＡＡＧＴＡＳＡＲＦＷＧＲＴＧＣＴＦＤＡＳＧＫＧＳＣＱＴＧＤＣＧＧＱＬＳＣＴＶＳＧＡＶＰＡＴＬＡＥＹＴＱＳＤＱＤＹＹＤＶＳＬＶＤＧＦＮＩＰＬＡＩＮＰＴＮＡＱＣＴＡＰＡＣＫＡＤＩＮＡＶＣＰＳＥＬＫＶＤＧＧＣＮＳＡＣＮＶＦＫＴＤＱＹＣＣＲＮＡＹＶＤＮＣＰＡＴＮＹＳＫＩＦＫＮＱＣＰＱＡＹＳＹＡＫＤＤＴＡＴＦＡＣＡＳＧＴＤＹＳＩＶＦＣ（配列番号２６）
配列番号２５のＯＲＦにコードされるＥＲＳＰは、Ｊｕｎ ａ３天然型シグナルペプチドであり、以下の配列番号２７に示す。
ＭＡＲＶＳＥＬＡＦＬＬＡＡＴＬＡＩＳＬＨＭＱＥＡＧＶＶ（配列番号２７）
ＯＲＦにコードされるオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａドメインおよびＪｕｎ ａ３ドメインの間の配列にコードされるＩＧＥＲリンカーは、実施例１に詳述される。併せて、このオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ＯＲＦを、Ｓ−Ｊｕｎａ３−ＩＧＥＲ−オメガまたはＳＪＩＯと呼称される。同様に、ＳＪＩＯ発現ＯＲＦが挿入されたＦＥＣＴベクターは、ｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯと名付けられた。
ｐＦＥＣＴ−ＢＯおよびｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯの２つのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＦＥＣＴ発現ベクターを用いて、タバコ植物において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質を一過性に発現させた。２つのＦＥＣＴ発現ベクターを、アグロバクテリウムＧＶ３１０１株へと形質転換させ、得られたＧＶ３１０１形質転換体を、実施例１に記述される技術を用いたタバコ葉におけるオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの一過性発現のために、タバコ葉へと注入した。
タバコ形質転換後６日で、形質転換タバコ葉を採取し、総可溶性葉タンパク質を葉から抽出した（詳細な方法は実施例１を参照のこと）。次いで、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを行い、総可溶性葉タンパク質の濃度を測定し、ｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯおよびｐＦＥＣＴ−ＢＯをコードする構築物で形質転換された葉のそれぞれに対して、３．０４７±０．１７６μｇ／μＬ（Ｎ＝２）および２．４７３±０．２０９μｇ／μＬ（Ｎ＝２）の値を得た。
次いで、上記実施例１に記述されるように、ＴＳＰ抽出物を用いた間接ＥＬＩＳＡを実施して、総可溶性タンパク質のパーセンテージとして（％ＴＳＰ）、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質の発現レベルを定量的に評価し、ｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯおよびｐＦＥＣＴ−ＢＯベクターで形質転換された葉のそれぞれに対し、０．１３３±０．０１４％（Ｎ＝２）、および、０．０００４±０．０００３％（Ｎ＝２）の値を得た。これらのデータから、Ｊｕｎ ａ３への翻訳融合物として発現されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、Ｊｕｎ ａ３タンパク質に翻訳融合されずに発現されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａよりも、３００倍超、高い定常状態で蓄積されたことが示唆された。
ＳＴＡの機能に関する上述の実施例４において、以下の配列を有するスノードロップレクチン（ＧＮＡ）もまた、検討された：
ＤＮＩＬＹＳＧＥＴＬＳＴＧＥＦＬＮＹＧＳＦＶＦＩＭＱＥＤＣＮＬＶＬＹＤＶＤＫＰＩＷＡＴＮＴＧＧＬＳＲＳＣＦＬＳＭＱＴＤＧＮＬＶＶＹＮＰＳＮＫＰＩＷＡＳＮＴＧＧＱＮＧＮＹＶＣＩＬＱＫＤＲＮＶＶＩＹＧＴＤＲＷＡＴＧ（配列番号２８）
＜実施例５＞
［ＩＣＫモチーフ融合タンパク質発現ＯＲＦ中の安定化タンパク質ドメインおよびＩＣＫモチーフタンパク質ドメインの間の開裂可能なリンカーが、トランスジェニック植物で発現して得られたＩＣＫモチーフタンパク質の殺虫活性を増強させる］
ほとんどの噛む虫は、食物を消化するために、その消化管内へトリプシンを分泌するため、我々は、融合物の安定化タンパク質ドメインとＩＣＫモチーフタンパク質ドメインの間に、トリプシン開裂可能なリンカーをコードした融合タンパク質発現ＯＲＦを設計し、昆虫腸内での、元の融合タンパク質からのＩＣＫモチーフドメインの放出を促進させた。
本実験で植物発現に用いたＩＣＫモチーフタンパク質はオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａであり、そのアミノ酸配列を以下に示す（１文字コード）：
ＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤ（配列番号２４）
用いられたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ＯＲＦは、以下のドメイン（Ｎ’〜Ｃ’）を含有する融合タンパク質をコードする：Ｊｕｎ ａ３シグナルペプチド：：Ｊｕｎ ａ３：：ＩＧＥＲリンカー：：オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（上述の構造式としては、ＥＲＳＰ−Ｓｔａ−Ｌ−ＩＣＫ）。Ｊｕｎ ａ３の起源および配列は、上記実施例４に記述される。
本実験に用いたＥＲＳＰは、上記実施例４に記述されるＪｕｎ ａ３天然型シグナルペプチドであった。
ＯＲＦ中にコードされる、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａドメインとＪｕｎ ａ３ドメインの間の配列によりコードされる、ＩＧＥＲリンカーは、実施例１に詳述される。まとめると、このオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ＯＲＦは、Ｓ−Ｊｕｎａ３−ＩＧＥＲ−オメガまたは、ＳＪＩＯと呼称される。同様に、ＳＪＩＯ発現ＯＲＦが挿入されたＦＥＣＴベクターは、ｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯと名付けられた。
次いで、ｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯベクターを用いて、タバコ植物においてオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａタンパク質を一過性に発現させた。ベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１へと形質転換し、次いで、実施例１に詳述される技術を用いた、葉でのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの一過性発現のために、形質転換されたＧＶ３１０１をタバコ葉へと注入した。
タバコ葉形質転換後の６日目に、３．３ｇの形質転換タバコ葉を採取し、液体窒素中ですりつぶした。５０ｍＬのＴＳＰ−Ｓｅ１緩衝液を用いて、すりつぶした葉から総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を抽出し、次いで、実施例１に記述の手順を行った。トータルで２６ｍＬの抽出物をＴＳＰ抽出手順から回収し、次いで、２つの試料（ＡおよびＢ）へと均等に分けた（各群、１３ｍＬの抽出物）。１．３ｍＬのトリプシン（１ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＭのＨＣｌ中で３７℃で１時間、添加することにより、試料Ａをトリプシンで処置し、融合Ｊｕｎ ａ３タンパク質から、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを放出させた。試料Ｂは、トリプシン開裂で処置しなかった。生物活性の濃度範囲でオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを得るために、両群を、以下のように同じ方法で濃縮した。最初に、抽出物を、１０ｋＤのカットオフフィルター膜を備えた濃縮器へとロードし、２時間、３２００ｇでスピンさせた。次いで、試料Ａ由来の１．４ｍＬの残余分、および、試料Ｂ由来の１．１ｍＬの残余分を、後の検証のために保存した。試料Ａからの１２．５ｍＬのろ過物、および試料Ｂからの１２．５ｍＬのろ過物を、１ｋＤのカットオフフィルター膜を備えた濃縮器で、１６時間、３２００ｇでスピンさせることによりさらに濃縮させた。試料Ａからは１．３ｍＬの残余分が回収され、試料Ｂからは１．１ｍＬの残余分が回収された。１ｋＤカットオフろ過の残余分を両方とも、後の検証のために保存した。この試料濃縮手順は、図１０に要約した。ｐＦＥＣＴ−ＳＪＩＯ形質転換タバコ葉由来の総ＴＳＰ抽出物を、２つの試料へと均等に分割した。１つの試料（Ａ）は、トリプシン開裂で処置し、他方（Ｂ）は行わなかった。両群を、１０ｋＤおよび、次いで１ｋＤのカットオフフィルター膜を備えた濃縮器でスピンさせることにより濃縮させ、１０ｋＤおよび１ｋＤカットオフろ過から得た残余物をさらなる検証のために保存した。
ＳＪＩＯ発現ＯＲＦは以下の融合タンパク質を発現した：Ｊｕｎ ａ ３：：ＩＧＥＲ：：Ｏｍｅｇａ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（総アミノ酸２６６を含有し、予測分子量は２８，２０４．２８Ｄａである）。この融合タンパク質のトリプシン開裂により、分子量４０４９．２Ｄａのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、および分子量２４，１５５．１ＤａのＪｕｎ ａ３：：ＩＧＥＲ融合タンパク質が放出されるはずである。ゆえに、もしトリプシン開裂反応がその処理を完了した場合、ろ過試料の予測される主な成分は以下である：
試料Ａ １０ｋＤ ろ過残余物：Ｊｕｎ ａ３：：ＩＧＥＲ融合物
試料Ａ １ｋＤ ろ過残余物：オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ
試料Ｂ １０ｋＤ ろ過残余物：Ｊｕｎ ａ３：：ＩＧＥＲ：：オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ融合物
試料Ｂ １ｋＤ ろ過残余物：ＳＪＩＯ発現タンパク質は無し。
残余物試料中のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドを定量するために、ｉＥＬＩＳＡを実施例１に記述されるように実施した。試料中で検出されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ濃縮物は以下であった：
試料Ａ １０ｋＤ ろ過残余物：１．３２８ｎｇ／μＬのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、トータルで１．８６μｇ。
試料Ａ １ｋＤ ろ過残余物：２．７６８ｎｇ／μＬのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、トータルで３．６０μｇ。
試料Ｂ １０ｋＤ ろ過残余物：１２．６５６ｎｇ／μＬのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、トータルで１３．９２μｇ。
試料Ｂ １ｋＤ ろ過残余物：０．７５２ｎｇ／μＬのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、トータルで０．８３μｇ。
示唆されるように、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、分析した全てのろ過試料中で検出された。Ａ群（１０ｋＤろ過残余物）で検出されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの大部分はおそらく、未開裂融合タンパク質の物理的な残留によるものである。同様に、Ｂ群（１ｋＤろ過残余物）で検出されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、１０ｋＤカットオフフィルター膜を低率で通過する未開裂の融合タンパク質の擬似的なろ過によるものであろう。
トリプシン開裂反応が上手くいったことを確認するために、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）を実施して、保存されたろ過試料中の成分を分析した。ＨＰＬＣは、移動相成分として０．１％トリフルオロ酢酸含有の水（溶媒Ａ）および０．１％トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いた、Ｏｎｙｘ １００モノリシックＣ１８カラム（４．６×１００ｍｍ）を備えたＶａｒｉａｎ Ｅ２１８ ＨＰＬＣシステムを用いて行われた。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドは、１０〜２０％溶媒Ｂの直線勾配を用いて、１０分にわたり、流速２ｍＬ／分でカラムから溶出された。９９％精製合成オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの試料を、ｒｐＨＰＬＣに用いて、標準曲線を作製した（注入したペプチドの質量に対する関連ピーク面積）。図１１に、３つの別の溶出プロファイルを示す（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ）。図１１Ａに示されるように、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドは、注入後６．５分で溶出された。Ｂ群の１ｋＤろ過残余物由来の試料５００μＬを、ＨＰＬＣシステムにロードした場合には、対応するＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいて、注入後６〜７分の間、タンパク質ピークは認められなかった（図１１Ｂ）。Ａ群の１ｋＤろ過残余物由来の試料５００μＬをＨＰＬＣシステムにロードした場合には、対応するクロマトグラフィーにおいて、６．３分の保持時間（図１１の点線を参照）で、トリプシン開裂により融合タンパク質から放出されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを表すピークがあった（図１１Ｃ）。このピーク面積は、試料Ａ １ｋＤろ過残余物中の、１６〜７０ｎｇ／μＬの間のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ濃度に相当する（ピークを積分するために用いた方法に依存する）。
逆ろ過試料を用いて、イエバエ注入バイオアッセイを実施し、融合タンパク質の形態、および融合タンパク質から放出された形態での、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの活性を検証した。イエバエの蛹（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）は、Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から購入し、箱の蓋に空気穴を開けたプラスチックボックス中に、２５℃で維持し、箱の中に、ハエの餌（砂糖と粉ミルクが１：１の比率）および綿ボール（水に浸したもの）を入れた。成虫のイエバエが発生した後の日に、ＣＯ２ラインを用いてハエを静止し、次いで、ＣＯ２注入パッドを用いて静止し続けた。１２〜１８ｍｇの体重のハエを、注入バイオアッセイに選択した。イエバエ注入を実施するために、３０ゲージの針を備えた１ｃｃのガラス製シリンジをロードしたマイクロアプリケーター（注入溶液がロードされている）を用いて、ハエの胸郭背面へ０．５μＬを送達させた。注入されたハエを、次いで、空気穴を開け、ラベルされた箱へと入れ、死亡率を注射後２４時間にスコア化した。以下の試料を、イエバエに注入した（各試料に対して、１０匹のハエの群を用いた）：
陰性対照として、水の注射
Ａ群 １０ｋＤろ過残余物
Ａ群 １ｋＤろ過残余物
Ｂ群 １０ｋＤろ過残余物
Ｂ群 １ｋＤろ過残余物
陰性対照として、０．１３ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液
注入後２４時間で、試料Ａ １０ｋＤ ろ過残余物および試料Ａ １ｋＤ ろ過残余物は１００％のイエバエ死亡率をもたらした一方で、他の試料を注入されたハエに対する死亡率は０％であった。精製された、天然型配列のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、このイエバエ注入バイオアッセイにおいて、１００ｐｍｏｌ／グラムのイエバエのＬＤ５０を示した；従って、このパラダイムにおいて１００％の死亡率をもたらすためには、注入されるオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの濃度は少なくとも２５ｎｇ／μＬでなければならない。これはバイオアッセイの結果とも一致する（試料Ａ １ｋＤろ過残余物のＨＰＬＣ分析は、１６〜７０ｎｇ／μＬのオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ濃度を示していたため）。トリプシン開裂で処置された材料を含まないろ過試料は、イエバエ注入バイオアッセイで死亡をもたらさなかったことから、Ｊｕｎ ａ３融合オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、トリプシンにより融合構築物から開裂された天然型オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ配列よりも、かなり活性が低かったことが示唆される。それゆえ、ＩＣＫ融合タンパク質のＩＣＫモチーフドメインがタンパク質溶解によりタンパク質の他の構造ドメインから放出されるように、開裂可能に設計された場合には、植物ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦのリンカー領域は、殺虫機能の増強を示すことができる。
＜パート２．ペプチドの高産生＞
コストを制御しつつ、再現可能なペプチドの構造およびフォールディングで、市販スケールで成功裏に殺虫性ペプチドを生産することは困難である可能性がある。様々な可能性のある製造技術と組み合わせて、多種多様、ユニークな特性、そして特別な性質のペプチドの、圧倒的な数のペプチド製造方法を示すことができる。
しかしながら、ペプチドが変化を受ける前に、通常生産される生産率よりもずっと高い生産率で、生物学的システムにおいて製造するために、どのようにペプチドを変化させるかを記述する文献は、あるとしてもごくわずかである。ここに、我々は、ペプチドの組成を変化させ、そうすることにより同時にペプチド生産の生産率、生産量を上げ、製造コストを下げる方法を提示する。我々は、１つのペプチドを、驚くべきことに、転換前と同じ毒性でありながら、異なるペプチド（より費用対効果の良いペプチド）へと変化、または「転換」させる新規の方法を提示する。
これらの新規転換ペプチドを提示し、ペプチドを変化または転換させるこれらの方法が、どのようにして、その活性に顕著な変化を起こさせずにペプチドの産生量を著しく改善させることができるかを提示する。これらのペプチドを製造するための新しいプロセス、新しいペプチド、新しい剤型、および新しい生物を、本明細書において記述およびクレームする。殺虫性ペプチドのＮ末端にジペプチドを付加することにより、酵母発現システムからの殺虫性ペプチド産生量を増加させるプロセスを提示する。ジペプチドの付加によって、殺虫性ペプチドの殺虫活性に負の影響は無い。
これらの新規転換ペプチドを提示し、ペプチドを変化または転換させるこれらの方法が、どのようにして、その活性に顕著な変化を起こさせずにペプチドの産生量を著しく改善させることができるかを提示する。これらのペプチドを製造するための新しいプロセス、新しいペプチド、新しい剤型、および新しい生物を、本明細書において記述およびクレームする。
［高産生ペプチドを作製するための詳細な手順］
ペプチド産生を増加させることができるプロセスおよびペプチドを記述する。以下のこれらの技術により、天然型ペプチドのＮ末端でジペプチドを付加することにより転換された、３つの異なる方法で、天然型ペプチドよりも良い生産率を有する、ペプチドがもたらされる。第一に、ジペプチド天然型ペプチド系統の全体的な平均産生量は、天然型系統よりも良い；第二に、ジペプチド天然型ペプチド系統のメジアン産生量は、天然型のそれよりも良い；および第三に、天然型ペプチド系統に対してよりも、より高い産生量の範囲にあるジペプチドの系統が多い。本明細書に記述されるプロセスは、様々なｉｎ ｖｉｖｏシステム（植物、動物および微生物を含む）において用いることができる。本発明では、天然型ペプチド（ジペプチドが付加される前の既知ペプチド）のＮ末端にジペプチドを付加することが必要である。次いで、既知ペプチドは、「転換され」、次いで、従前に可能と想定されていたよりも高い産生量で作製される。１つの実施態様において、殺虫性ペプチドはジペプチドに連結される。これらのジペプチド−天然型ペプチドシステムは、ペプチドを産生することができる植物において用いることができる。ペプチドを生産する植物は、昆虫を損傷させ、それにより植物を防御する、または他の利益をもたらしうることにより、摂取に利用可能な毒性ペプチドの製造から、シンプルに作製するまでの様々な用途を有している。
１つの実施態様において、殺虫性ペプチドのＮ末端に任意のジペプチドを付加することによる、酵母発現システムにおける殺虫性ペプチドの産生量を増加させるプロセスを記述する。ジペプチドは、非極性アミノ酸および極性アミノ酸から構成される。非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択されても良い。グリシンは好ましい非極性アミノ酸である。極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンから選択されても良い。セリンは好ましい極性アミノ酸である。プロセスおよびアミノ酸は、非極性アミノ酸がジペプチドのＮ末端であるとして記述され、１つの実施態様においては、好ましいジペプチドのＮ末端はグリシンである。プロセスおよびアミノ酸は、極性アミノ酸はジペプチドのＣ末端であるとして記述され、１つの実施態様においては、好ましいジペプチドのＣ末端はセリンである。
本発明の１つの実施態様において、ジペプチドは、グリシン−セリン、ｇｌｙ−ｓｅｒまたはＧＳである。これらのアミノ酸は通常、以下のコドンによりコードされる：Ｇｌｙは、例えばＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ等のコドンによりコードされても良く、および、Ｓｅｒは、例えばＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴおよびＡＧＣ等のコドンによりコードされても良い。
殺虫性ペプチドの導入遺伝子は、その導入遺伝子配列が、必要とされうる特定の発現に対して最適化されるように設計される。例えば、殺虫性ペプチドの導入遺伝子は、酵母、植物、細菌、およびウイルスにおける発現に対して最適化されても良い。そのような本発明の用途の例としては、害虫からの防御を目的とした、トウモロコシおよび大豆等の農作物に対する導入遺伝子の操作および最適化が挙げられるであろう。１つの例において、殺虫性ペプチドの導入遺伝子配列が、例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等を用いる酵母発現システムにおける特定の発現のために最適化されるように、その導入遺伝子を設計する。他の適切な酵母発現システムも当分野に公知である。例えばグリシン−セリン（ｇｌｙ−ｓｅｒ）等のジペプチドに対するヌクレオチドコドンを、成熟型殺虫性ペプチドの導入遺伝子配列の５’末端に付加する。次いで、導入遺伝子配列を適切な発現ベクターへとライゲートし、それにより、適切な選択マーカー、特定の酵母発現システムに対する強力なプロモーター−ターミネーターのセット、分泌のためのシグナルペプチド、および各シグナル配列と成熟ペプチド配列の間の開裂部位がもたらされる。次いで、殺虫性ペプチド発現ベクターを、当業者に公知の手段（エレクトロポレーションまたは化学的形質転換法のいずれかを含む）により、酵母細胞へと形質転換し、安定ペプチド発現酵母株を作製する。これらの酵母は適切な培地中で増殖する際、成熟型殺虫性ペプチドのＮ末端にジペプチド配列（グリシン−セリン）が付加されたことより改変された殺虫性ペプチドを産生し、それらは増殖培地中へと分泌される。ジペプチド（グリシン−セリン）の成熟型殺虫性ペプチドのＮ末端への付加により、そのペプチドの殺虫活性への悪影響を与えることなく、殺虫性ペプチドの産生量が大幅に改善される。
我々のデータより、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）は、本明細書に記述される手順を用いて、他で行うよりも、顕著に高い収率で増殖させることができる。我々は、ＩＣＫおよび非ＩＣＫタイプのＣＲＩＰの両方が、本明細書に記述される高生産技術を用いて、劇的に収率を改善させることができたことを示す。ここに、我々は、２つのまさに異なるタイプのＣＲＩＰＳの、劇的な、驚くべき産生量の増加の証拠を提示する。
転換することができる殺虫性ペプチドは、例えば、クモ毒等の殺虫性の毒から選択されても良い。クモは、オーストラリアジョウゴグモであっても良い。Ａｔｒａｘ、または、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ属由来のペプチドが、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよびそのアナログであり、本明細書に記述される手順を用いて容易に具体的に作製される。クモ由来の具体的なペプチドの例は、本明細書に提示される配列表に記述される。これらのペプチドおよびその他のものは、本明細書に記述される手順を用いて転換することができる。
転換することができる殺虫性ペプチドは、イソギンチャク毒素（例えば、実施例３に記述されるＡｎｅｍｏｎｅ ｖｉｒｉｄｉｓ由来のもの）から選択されても良い。イソギンチャクは、Ａｔｒａｘ、または、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のジョウゴグモの、その通常の生息域から遠く離れたものであり、ウニ毒、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ毒素ペプチドおよび他の殺虫性の毒、それら全てが、我々がシステインリッチ殺虫性ペプチドまたはＣＲＩＰと呼ぶタイプの毒であるにもかかわらず、Ａｎｅｍｏｎｅ ｖｉｒｉｄｉｓ由来の毒は、Ａｔｒａｘ、または、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ由来の毒ペプチドのようにはＩＣＫタイプの毒とはみなされておらず、本明細書において初めてそのように特定される。本明細書の全ての項において記述される手順は、配列表にある全てのペプチドおよび当業者にシステインリッチ殺虫性ペプチドまたはＣＲＩＰであると理解されうる配列に関連するペプチドと作用すると予期され、および考えられる。そのようなペプチドおよび他の全ては本明細書に記述される手順を用いて転換することができる。
プロセスに加え、本明細書において、「ＨＰペプチド」と呼ぶ、ペプチドの１つの末端に結合されるジペプチドを含有する、新規の高生産性ペプチドもまた開示する。本明細書の実施態様において、ペプチドは殺虫性ペプチドである。１つの実施態様において、ジペプチドはペプチドのＮ末端に付加される。我々は、ＩＣＫおよび非ＩＣＫ ＣＲＩＰペプチドの両方を伴う、高生産性株の産生に成功したことを示す。さらなる実施態様において、ジペプチドは、非極性アミノ酸および極性アミノ酸から構成される。さらなる実施態様において、非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択され、極性アミノ酸はセリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンから選択される。１つの特定の実施態様において、ＨＰは、他の未改変状態にある成熟ペプチドの最初の２つのアミノ酸として、グリシン−セリンのジペプチドを有するように改変されたペプチドから構成される。ＨＰペプチドは、ＨＰペプチドを生成するために、Ｕペプチドおよびそのアナログにグリシン−セリンを付加することにより、製造されても良い。
本明細書に開示されるプロセスにより作製される改変ペプチドは新規であり、独立してクレームされる。これらのペプチドは、単にその配列ではなく、その特性の全てにより記述される。これらのペプチドは新規であり、ユニークな特性を有している。ＨＰペプチドおよびその作製プロセスの両方が、本明細書に開示され、クレームされる。
有用なペプチドの例は周知であり、多くの参照文献の中に見出すことができる。有用なペプチドの１種は、殺虫性ペプチドである。殺虫性ペプチドは、そのペプチドの性質および活性（通常は、経口または注入による殺虫活性）により特定される。本明細書において、本発明をより良く図解および記述するためのいくつかの例を提示するが、これらの例は本発明を限定するものではない。本明細書のこれらの例の全ておよび示されてはいないその他のものは、新規の材料を記述するためのものであり、本明細書において初めて記述およびクレームされる。
ＨＰ（高産生）ペプチドは、本明細書に記述される技術を用いて、通常の産生率よりも高い率で産生することができる任意のペプチドとして、本明細書において定義される。そのようなペプチドは殺虫活性を有していても良い。典型的には、殺虫性ペプチドとは、昆虫に注入された場合に活性を示すが、昆虫に局所的に塗布した場合には、そのほとんどは顕著な活性を有しない。ＨＰペプチドの殺虫活性は、様々な方法で測定される。測定の普遍的な方法は、当業者に広く公知である。そのような方法として、限定されないが、例えば、麻痺、死亡率、体重減少等の様々なパラメータのスコア化に基づく用量反応プロットのフィッティングによる、メジアン用量反応（例えば、ＬＤ５０、ＰＤ５０、ＬＣ５０、ＥＤ５０）の測定が挙げられる。測定は、様々な用量の本題の殺虫製剤に曝された昆虫のコホートに対して行われても良い。データの分析は、プロビット解析および／またはＨｉｌｌ Ｅｑｕａｔｉｏｎ等により定義される曲線を作成することにより行われても良い。そのような場合、投与は、皮下注射、高圧注入、食事または餌の試料の一部として殺虫製剤を提示すること等により、行われても良い。
決して限定の意図ではなく、実施例の提示を目的として開示されるＨＰペプチドの具体的な例は、Ｕペプチドおよびそのホモログであり、それらはオーストラリアジョウゴグモの毒に由来する。これらのペプチドの記述は、本明細書の上述の項において、見出すことができる。
本明細書の実施例は、本発明の限定を意図しておらず、および限定のために用いられてはならず、それらは、本発明の解説のためにのみ提示される。
上述のように、多くのペプチドが、具体的に作製するためのプロセスの対象として適切な候補となる。上述および以下に記述される配列および配列表の配列は、特に、具体的に作製することができる適切なペプチドであり、これらの内の一部は、以下の実施例に示される結果と共に、本発明により具体的に作製される。
ＧＳＱＹＣ ＶＰＶＤＱ ＰＣＳＬＮ ＴＱＰＣＣ ＤＤＡＴＣ ＴＱＥＲＮ ＥＮＧＨＴ ＶＹＹＣＲ Ａ（配列番号５）（１文字コード）。
「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられる。５−２０、１２−２５、１９−３９位でジスルフィド架橋を有している。分子量は、４５６４．８５ダルトンである。
ＧＳＲＳＣ ＣＰＣＹＷ ＧＧＣＰＷ ＧＱＮＣＹ ＰＥＧＣＳ ＧＰＫＶ（配列番号２９）（１文字コード）。「Ａｖ３＋２」と名付けられる。５−１９、６−１３、８−２４位でジスルフィド架橋を有している。分子量は３０７６．４７ダルトンである。
［ＨＰペプチドの調製］
本明細書に記述されるＨＰペプチドは以下のように調製することができる。殺虫性ペプチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、そのヌクレオチド配列が、種特異的発現に最適化されるように設計する。以下に示されるものは、殺虫性ペプチドのＮ末端にジペプチドを付加することにより、酵母発現システムから得られる殺虫性ペプチドの産生量を増加させるプロセスの具体的な例である。ジペプチドは、非極性アミノ酸および極性アミノ酸から構成される。非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択されても良く、グリシンが好ましい非極性アミノ酸である。極性アミノ酸はセリン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンから選択されても良く、セリンが好ましい極性アミノ酸である。以下の実施例において、非極性アミノ酸はジペプチドのＮ末端であり、グリシンである。以下の実施例において、極性アミノ酸はＣ末端であり、セリンである。
殺虫性ペプチドＯＲＦを、以下のように、宿主酵母細胞からの分泌のために設計する：シグナルペプチド配列と共にＯＲＦを開始させ、続いて、Ｋｅｘ２開裂部位（リシン−アルギニン）をコードするＤＮＡ配列、続いて、５’末端でグリシン−セリンコドンの付加を有する殺虫性ペプチドの導入遺伝子、そして最後に３’末端で、ストップコドンとともに終わる。これらの要素の全ては、酵母細胞において、単一のオープンリーディングフレームとして、融合ペプチドで発現される。αメーティング（α−ｍａｔｉｎｇ）因子シグナル配列は、組換え酵母の内因性分泌経路を介して、組換え殺虫性ペプチドの代謝プロセッシングを促進するために最も良く使用されている。すなわち、発現された融合タンパク質は、多くの場合、小胞体に入り、ここで、αメーティング因子シグナル配列が、シグナルペプチダーゼ活性により除去され、次いで、得られたプロ−殺虫性ペプチドは、ゴルジ装置に輸送され、そこで、上述のリシン−アルギニンジペプチドはＫｅｘ２エンドプロテアーゼにより完全に除去され、成熟化の後で、Ｎ末端に非天然型グリシン−セリンジペプチドの付加を含有するＨＰ殺虫性ペプチドが細胞の外に分泌される。
組換え酵母細胞における殺虫性ペプチドの発現レベルを高めるために、殺虫性ペプチドＯＲＦのコドンは、通常、具体的な宿主酵母種における発現に対して最適化される。所与の宿主生物の、生来のオープンリーディングフレームにおいて見られるコドンの自然発生頻度は、必ずしも高効率発現のために最適化される必要性は無い。さらに、異なる酵母種（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）は、高効率発現に対し、異なる最適コドンを有している。ゆえに、コドン最適化は、シグナル配列、Ｋｅｘ２開裂部位および殺虫性ペプチドをコードする配列要素を含む、ペプチドＯＲＦを考慮しなければならない（それらは当初、組換え酵母細胞内で１つの融合ペプチドとして翻訳されるため）。
次いで、コドン−最適化ペプチド発現ＤＮＡを、酵母発現のための適切な発現ベクターへとライゲートする。酵母発現に利用可能な発現ベクターは多くあり、エピソームベクター（ｅｐｉｓｏｍｅ ｖｅｃｔｏｒ）および組込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、それらは通常、特定の酵母株に対して設計されている。ペプチド産生に用いられる特定の酵母発現システムを考慮して、適切な発現ベクターを注意深く選択しなければならない。本明細書において、我々は、形質転換酵母細胞の染色体へと組み込まれ、細胞の分割および増殖のサイクルの間、安定な、組込みベクターを使用した。
通常、発現ベクターは、大腸菌でのＤＮＡ調製のために、例えば大腸菌複製起点、抗生物質選択マーカー等のいくつかの大腸菌要素を含有している。また、ベクターは、例えば転写プロモーター、ターミネーター、酵母選択マーカー、宿主酵母ＤＮＡにホモログな組込みＤＮＡ配列等の、対象の導入遺伝子の発現に必要とされる一連の配列要素を含有している。天然型および遺伝子操作されたプロモーターを含む多くの適切な酵母プロモーターが利用可能である。我々の目的のために、例えばｐＬＡＣ４、ｐＡＯＸ１、ｐＵＰＰ、ｐＡＤＨ１、ｐＴＥＦ、ｐＧａｌ１等の酵母プロモーターを使用している。また、以下の普遍的に用いられている酵母選択マーカーを使用した：アセトアミド原栄養性選択、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性選択、ジェネテシン抵抗性選択、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ抵抗性選択、ウラシル欠損選択。他の当業者公知のマーカーもまた使用することができる。組込みＤＮＡ配列は、形質転換される酵母種の標的ゲノムＤＮＡ遺伝子剤に対してホモログであり、そのような組込み配列としては、ｐＬＡＣ４、２５Ｓ ｒＤＮＡ、ｐＡＯＸ１、およびＴＲＰ２が挙げられる。殺虫性ペプチド導入遺伝子の位置は、組込みＤＮＡ配列の隣にあるか（挿入ベクター）、または、組込みＤＮＡ配列の内にあっても良い（置換ベクター）。
宿主酵母染色体へと組み込まれる殺虫性ペプチドのＯＲＦのコピーをより多く得るために、発現ベクターは、２または３の殺虫性ペプチド発現カセットのコピーを含有するよう設計および作製されることができる。発現ベクター中の殺虫性ペプチド発現カセットの各コピーは、プロモーター、シグナル配列、Ｋｅｘ２開裂配列、および殺虫性ペプチド導入遺伝子、停止コドン、転写ターミネーターを含む独立した、完全な発現構造を含有しなければならない。
次いで、ペプチド発現ベクターを酵母細胞へと形質転換する。最初に、発現ベクターは通常、特定の制限酵素開裂により直線化され、相同組換えによる染色体組込を促進させる。直線化発現ベクターを、次いで、化学的またはエレクトロポレーションの形質転換法により酵母細胞へと形質転換し、相同組換えにより酵母ゲノムの標的遺伝子座へと組み込む。組込は、同じ染色体遺伝子座で複数回、発生しうる。ゆえに、形質転換された酵母細胞のゲノムは、殺虫性ペプチド導入遺伝子を複数コピー、含有することができる。成功裏に形質転換されたものは、発現ベクターへと組み込まれ、酵母染色体へ殺虫性ペプチド導入遺伝子と共に組み込まれた選択マーカーを指向する増殖条件を用いて、特定することができる。そのようなマーカーの例としては、限定されないが、アセトアミド原栄養性、ゼオシン抵抗性、ジェネテシン抵抗性、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ抵抗性、およびウラシル原栄養性が挙げられる。
例えば、遺伝子および遺伝子ネットワークのエピジェネティックな改変、形質転換法を経た群中の個々の細胞に発生する、組込事象の数における変動等の、予想できない様々な因子の影響により、所与の形質転換プロセスを受けた個々の酵母形質転換体は、トランスジェニック殺虫性ペプチドを産生する能力が異なることがある。それゆえ、殺虫性ペプチド導入遺伝子を担持する酵母形質転換体は、高産生株をスクリーニングしなければならない。そのようなスクリーニングには２つの効果的な方法があり、それぞれは、形質転換体の小規模培養の増殖次第であり、引き続く分析のための馴化培地試料をもたらし、逆相ＨＰＬＣまたはイエバエ注入法を用いて、形質転換体由来の馴化培地試料を分析する。
形質転換体培養は通常、１４ｍＬの丸底ポリプロピレン培養チューブで、各チューブ５〜１０ｍＬの既定の培地を添加して、または４８ウェルの深さのウェル培養プレートに１〜２ｍｌの既定の培地を各ウェルに添加して行われる。既定の培地（粗タンパク性の抽出物または、例えば酵母抽出物もしくはペプトン等の副産物を含有していない）を、培養に用いて、後のスクリーニング工程のために採集される馴化培地中のタンパク質のバックグラウンドを減少させる。培養を、最適温度（例えばＫ．ｌａｃｔｉｓに対しては２３．５℃）で、５〜６日間、最大細胞密度に達するまで行う。殺虫性ペプチドは、ここで、形質転換体から産生され、細胞から増殖培地中へと分泌される。スクリーニング用の試料を調製するために、細胞を、遠心により培養物から除去し、上清を、馴化培地として採取し、次いで、それを、０．２２μｍろ過膜を通してろ過することにより清浄化させ、次いで、殺虫性ペプチド産生株スクリーニング（そのようなスクリーニング法を２例、以下に記述する）のための準備を整える。
スクリーニング法の１つは、形質転換体の逆相ＨＰＬＣ（ｒｐＨＰＬＣ）スクリーニングである。このスクリーニング法においては、Ｃ１８の結合相を備えたＨＰＬＣ分析カラムが用いられる。アセトニトリルと水を移動相溶媒として用いて、２２０ｎｍでセットされたＵＶ吸光度検出器を、ペプチド検出に用いる。適切な量の馴化培地試料をｒｐＨＰＬＣシステムへとロードして、移動相溶媒の直線勾配で溶出する。ＨＰＬＣクロマトグラフィーの殺虫性ペプチドに相当するピーク面積を用いて、馴化培地中の殺虫性ペプチド濃度を定量する。既知量の精製殺虫性ペプチドを、同じＨＰＬＣプロトコールで、同じｒｐＨＰＬＣカラムを通して泳動させ、ペプチドの保持時間を確認し、定量のための標準ペプチドＨＰＬＣ曲線を作成する。
第二のスクリーニング法は、イエバエ注入アッセイである。殺虫性ペプチドは、胸郭背面の体壁を通して、測定された用量で注射した場合、イエバエを殺すことができる。殺虫性ペプチドの効果は、ペプチドのメジアン致死量（ＬＤ５０）（注射されたイエバエに５０％の死亡率をもたらす）により停止することができる。通常、精製殺虫性ペプチドをイエバエ注入アッセイに用いて標準用量応答曲線を作製し、それからＬＤ５０値を決定することができる。問題となっている精製殺虫性ペプチドの標準用量応答性曲線の分析から得られたＬＤ５０の値を用いて、酵母形質転換体から産生された殺虫性ペプチドの定量は、対応する馴化培地の段階希釈で実施されたイエバエ注入アッセイを用いて達成することができる。
殺虫性ペプチド産生株のスクリーニングは、数百の形質転換体から高産生酵母株を特定することができる。これらの株を、バイオリアクターの中で発酵させ、最適化発酵培地および発酵条件を用いた場合には、最大で６ｇ／Ｌの殺虫性ペプチドの収率を得ることができる。高率の産生は、２０〜４００、２０〜１００、２０〜２００、２０〜３００、４０〜１００、４０〜２００、４０〜３００、４０〜４００、６０〜１００、６０〜２００、６０〜３００、６０〜４００、８０〜１００、８０〜２００、８０〜３００、８０〜４００、１００〜１５０、１００〜２００、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、２５０〜３５０、２５０〜４００、３００〜３５０、３００〜４００％および、３５０〜４００の範囲であっても良く、または、提示された任意の値の任意の範囲であっても良く、または、転換の前のペプチドを産生するために用いられた産生法と同じ、もしくは類似の方法を用いて、転換前のペプチドで得ることができる収率よりもさらに大きい収率であっても良い。
配列表の任意の配列、および我々の知る範囲では、任意のＣＲＩＰ全てが、以下に記述される、我々が「Ｕ＋２」ペプチドと呼ぶオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ由来のＡＣＴＸモチーフ、または、以下の実施例に教示および記述する毒性イソギンチャク、Ａｎｅｍｏｎｅ ｖｉｒｉｄｉｓのＡｖ３＋２ペプチドのいずれかに類似するペプチドを、本明細書に教示される手順および当業者の知識を用いることにより、高率に産生させるために用いることができる。
さらに、任意の他の適切なＣＲＩＰペプチドを、高産生、またはプラス２（すなわち＋２）ペプチドを産生させるために、類似の方法で用いることができる。
（高産生ペプチドの実施例）
本明細書の実施例は、本発明を限定する意図は無く、および限定するために用いられてはならず、それらは本発明を解説するためにのみ、提示される。
＜実施例１＞
［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）における、天然型ＵおよびＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの発現］
発現される殺虫性ペプチド：
Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：
ＧＳＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号５）
および、
天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：
ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号６）
上述の２つの殺虫性ペプチドをＫ．ｌａｃｔｉｓにおいて発現させるために、発現ベクター、ｐＫＬＡＣ１、およびＫ．ｌａｃｔｉｓ株、ＹＣＴ３０６を用いた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ， ＵＳＡより入手可能）。ｐＫＬＡＣ１ベクターは、組込み発現ベクターである。Ｕ＋２および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ導入遺伝子がｐＫＬＡＣ１へとクローニングされ、ＹＣＴ３０６へと形質転換されると、その発現はＬＡＣ４プロモーターにより制御された。得られた形質転換体は、αメーティング因子シグナルペプチド、Ｋｅｘ２開裂部位および成熟型殺虫性ペプチドを含有するプレ−プロペプチドを産生した。αメーティング因子シグナルペプチドは、プレ−プロペプチドを、内因性分泌経路を通過するよう導き、最終的に、成熟型殺虫性ペプチドは、増殖培地中へと放出される。
Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現に対するコドン最適化は、２ラウンドで実施された。最初のラウンドにおいて、高発現ＤＮＡ配列のいくつかの共通の特徴に基づき、αメーティング因子シグナルペプチド、Ｋｅｘ２開裂部位およびＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドを発現する、ペプチドＯＲＦの３３の変異体を設計し、その発現レベルを、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＹＣＴ３０６株で評価して、最初のＫ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムを得た。２回目の最適化ラウンドにおいて、さらに５つの変異体Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドＯＲＦを、最初のＫ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムに基づき設計し、さらにＫ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムを微調整し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチド発現に対するベストのＯＲＦを特定した。このＤＮＡ配列は、αメーティング因子シグナルペプチド、Ｋｅｘ２開裂部位およびＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有している。最適化ＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて、ｐＫＬＡＣ１ベクターへとクローニングして、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ベクター、ｐＬＢ１０Ｖ５を得た。
形質転換の間に、Ｋ．ｌａｃｔｉｓゲノムへより多くの最適化Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ導入遺伝子のコピーを組み込ませるために、２コピーのＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現カセットを含有するＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ベクターを、以下のプロセスで作製した：損なわれていないＬＡＣ４プロモーター要素、コドン最適化されたＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドＯＲＦ要素、およびｐＬＡＣ４ターミネーター要素を含有した、３，３０６ｂｐの損なわれていないＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現カセットＤＮＡ配列を合成する。この損なわれていない発現カセットを、次いで、ｐＬＢ１０Ｖ５のｐＬＡＣ４ターミネーターの下流、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位の間で、ｐＬＢ１０Ｖ５ベクターへとライゲートし、二重の導入遺伝子Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ベクター、ｐＬＢ１０Ｖ５Ｄを得た。
天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ベクターを作製するために、ｐＬＢ１０Ｖ５ベクターを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ特定部位の突然変異誘発キットを用いて、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ導入遺伝子領域の５’末端でグリシン−セリンコドンを欠損させることにより、突然変異させた。この突然変異生成により、新たなベクター、ｐＬＢ１２（コドン最適化天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現カセットのシングルコピーを含有）が得られた。二重導入遺伝子の天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現ベクターを作製するために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ特定部位の突然変異誘発キットを再度用いて、従前に合成された、３，３０６ｂｐ Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現カセット導入遺伝子のＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ導入遺伝子領域の５’末端で、グリシン−セリンコドンを除去し、次いで、突然変異されたカセットを、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位の間でｐＬＢ１２ベクターへと挿入するためにライゲートし、プラスミドｐＬＢ１２Ｄ（損なわれていない２コピーのコドン最適化天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ発現カセットを含有する発現ベクター）を得た。
二重導入遺伝子ベクター、ｐＬＢ１０Ｖ５ＤおよびｐＬＢ１２Ｄを、次いで、ＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化させ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓタンパク質発現キットに付属した説明書に従い、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＹＣＴ３０６株へと化学的に形質転換した。得られた形質転換体を、５ｍＭのアセトアミド（アセトアミダーゼ発現形質転換体のみが、窒素の代謝源として効率的に用いることができる）を補充したＹＣＢ寒天プレート上で増殖させた。
殺虫性ペプチド産生量の評価のために、３１６コロニーをｐＬＢ１０Ｖ５Ｄ形質転換体プレートからピックアップし、４０コロニーをｐＬＢ１２Ｄ形質転換体プレートからピックアップした。コロニー由来の接種材料はそれぞれ、６ｍＬの既定Ｋ．ｌａｃｔｉｓ培地（炭素源として２％精製グリセロールを添加）で培養させた。培養は、２３．５℃で、２８０ｒｐｍの振とうとともに、培養物中の細胞密度のポイントが、その最大レベル（６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）で示される）まで達する６日間、インキュベートして行われた。次いで、細胞を、４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により培養物から除去した。得られた上清（馴化上清）を、ＨＰＬＣ産生量分析のために、０．２μｍ膜を通してろ過した。
ペプチド産生量評価のために、ろ過された馴化培地試料を、Ｏｎｙｘ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ４．５ｘ１００ｍｍ、Ｃ１８逆相分析ＨＰＬＣカラムおよび自動インジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステム上で分析した。ＨＰＬＣグレードの水およびアセトニトリル（両方とも０．１％のトリフルオロ酢酸を含有）が、ＨＰＬＣ分析に用いられる２つの移動相溶媒を構成した。天然型ＵおよびＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの両方のピーク面積を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて測定し、次いで、馴化培地中のペプチド濃度を算出するために用いて、次いで、それをさらに、対応する最終細胞密度（ＯＤ６００測定により決定）に対して、正規化ペプチド産生量として正規化した。
イエバエ注入バイオアッセイを用いて、ペプチドの殺虫活性を評価した。馴化培地を段階希釈して、イエバエ注入バイオアッセイから全用量応答曲線を作成した。注入の前に、成虫のイエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）を、ＣＯ２で不動化させ、１２〜１８ｍｇのイエバエを、注入のために選択した。１ｃｃのシリンジと３０ゲージの針を備えたマイクロアプリケーターを用いて、段階希釈された馴化培地試料をハエ１匹当たり０．５μＬで、胸郭背面の体壁を通してイエバエに注射した。注射されたイエバエを、湿らせたろ紙と、呼吸用の穴を蓋に開けた、密閉容器へと置き、それらを注射後２４時間での死亡率をスコアリングすることにより試験した。
正規化された産生量を算出した。ペプチド産生量は、ｍｇ／Ｌの単位での、馴化培地中のペプチド濃度を意味する。しかしペプチド産生量は、株の産生率を正確に比較するのに、常に十分であるわけではない。個々の株は、異なる増殖率を有している可能性があり、ゆえに、培養物を回収した際、異なる培養物では細胞密度が変化している可能性がある。高い細胞密度の培養では、たとえその下部のペプチド産生率が、高産生率を有する他の株よりも低くても、培地中のペプチド濃度も高くなるであろう。そこで、「正規化された産生量」という用語は、ペプチド産生量を、対応する培養の細胞密度で割ることにより生じるものであり、これにより、株間のより良い比較が可能となる。細胞密度は、「Ａ」の単位（吸光度単位）と共に、６００ｎｍでの吸光度により表される。
表１、図１２および図１３に、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株由来のＵ＋２−および、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ正規化ペプチド産生量分布を要約する。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株由来の全体的な平均ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ正規化ペプチド産生量は、４．０６±３．０５ｍｇ／Ｌ．Ａであり、平均天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの正規化ペプチド産生量の２．７３±１．２５ｍｇ／Ｌ．Ａよりも統計的に有意に高いものであった（スチューデントｔ検定、９９％信頼レベル）。Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のメジアン正規化ペプチド産生量は、９．３６ｍｇ／Ｌ．Ａであり、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株のメジアン産生量（３．３５ｍｇ／Ｌ．Ａ）よりもほとんど３倍高いものであった。Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチド発現株は、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株よりも、高い産生量レベルの株総数の比率もより高いものであった。これらの結果の全てから、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドのＮ末端にグリシン−セリンジペプチドを付加することにより、本ペプチドを発現する酵母形質転換体の予測産生量の著しい改善がもたらされることが示唆された。
表１は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株からのペプチド産生量の比較を示す。
図１２は、Ｕ＋２および天然型Ｕ株に対する正規化ペプチド産生量分布のヒストグラムを示す。Ｘ軸は、正規化ペプチド産生量の範囲を示す。左側のＹ軸は、正規化産生量の特定の範囲内にある、Ｕ＋２産生株の頻度を示し、右側のＹ軸は、正規化産生量の特定の範囲内にある天然型Ｕ産生株の頻度を示す。黒色のバーは、Ｕ＋２産生量の分布を示し、グレーのバーは、天然型Ｕ産生量の分布を示す。例えば、最初の黒色のバーは、Ｕ＋２産生株の総数の約０．０３（３％）が、０〜０．５ｍｇ／Ｌ．Ａの間の正規化産生量を有していることを示す。Ｕ＋２に対しては３１６株がスクリーニングされ、天然型ペプチドに対しては４０株がスクリーニングされたため、株数は、天然型および＋２株の間で異なっている。
図１３は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株から産生された、Ｕ＋２および天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ由来のペプチド産生量の分布を示す。Ｕ＋２データは、黒色で示され、天然型Ｕデータはグレーで示されている。Ｘ軸は、リットル当たりのミリグラムで産生量を示し、Ｙ軸は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株からの総Ｕ＋２またはＵの産生のフラクションを示す。Ｕ＋２株からの産生量、および高産生量で製造することができる、利用可能なＵ＋２株の数は、天然型Ｕ株と比較して、Ｕ＋２株のほうがずっと高い。
通常、産生量を大幅に改善するペプチド配列への変化により、その毒性が影響を受けることが予測される。驚くことに、本開示のジペプチドについては、そのようなことは起こらなかった。我々のデータからは、ジペプチドの付加、特にグリシン−セリンのジペプチドの、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドのＮ末端への付加は、ペプチドの殺虫活性の効果を減少させないことが示唆される。図１４は、天然型およびＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ馴化培地試料で行われたイエバエ注入バイオアッセイに対する、２つの用量応答曲線を示す。Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、７６．８ｐｍｏｌ／ｇのメジアン致死量（ＬＤ５０）を有し、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの７７．６ｐｍｏｌ／ｇのＬＤ５０と一致している。
＜実施例２＞
Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのいずれかを発現する酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）の形質転換体のペプチド産生量について実験を行った。
２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクター、ｐＪＵＧαＫＲおよび、ｐＪＵＺαＫＲを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのペプチド発現に用いた。ｐＪＵＧαＫＲ、およびｐＪＵＸαＫＲは、Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手することができる。両ベクターは組込みベクターであり、異種導入遺伝子の発現の増強に、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター（ｐＵＰＰ）を用いる。このベクター間の唯一の違いは、ｐＪＵＧαＫＲは、宿主酵母にＧ４１８抵抗性をもたらす一方で、ｐＪＵＺαＫＲは、ゼオシン抵抗性をもたらすということである。
天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよびＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをそれぞれコードする相補的オリゴヌクレオチドの対を設計して、２つの酵母発現ベクターへのサブクローニングのために合成した。対応する相補オリゴヌクレオチドを、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（全て最終濃度）、ｐＨ８で、最終濃度２０μＭで混合し、次いで、２０分間、９５℃でインキュベートして、次いで、９２℃で開始して、１７℃で終了（２０分毎に３度ずつ温度が下がる）するインキュベーションを９時間行い、ハイブリダイゼーション反応を実施した。ハイブリダイゼーション反応により、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよび天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドをそれぞれコードする２つのＤＮＡ断片を得た。２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターを、ＢｓａＩ−ＨＦ制限酵素で消化して、次いで、Ｕｉｚａｔｉｏｎ反応の二重鎖産物を直線化したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターへと、標準的な手法を用いてサブクローニングした。４つのサブクローン配列の確認の後、プラスミドのアリコートを、エレクトロポレーションによりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株、Ｂｇ０８へと形質転換した。ｐＪＵＺαＫＲおよびｐＪＵＧαＫＲベクターのそれぞれへと組み込まれた要素により与えられた、ゼオシンまたはＧ４１８に対する抵抗性に基づき選択され、得られた形質転換酵母を培養し、以下に記述されるようにスクリーニングした。２以上の抗生物質抵抗性マーカーを有する形質転換体株は無く、形質転換の方法は、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ導入遺伝子で形質転換された酵母細胞対して行われたものと、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ導入遺伝子で形質転換された酵母細胞に対して行われたものは同じであったため、導入遺伝子のコピー数の分布は、以下に比較される形質転換体の２つの群で同等であったと仮定することは合理的である。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養に用いられる培地およびストックのレシピを以下に記述する：
ＭＳＭ培地のレシピ
２ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム二水和物
１ｇ／Ｌ 硫酸カルシウム二水和物（０．７９ｇ／Ｌ 無水硫酸カルシウム）
４２．９ｇ／Ｌ 第一リン酸カリウム
５．１７ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム
１４．３３ｇ／Ｌ 硫酸カリウム
１１．７ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物
２ｍＬ／Ｌ ＰＴＭ１トレース塩溶液
０．４ｐｐｍ ビオチン（５００Ｘ、２００ｐｐｍのストックより）
１−２％ 精製グリセロール、または他の炭素源
ＰＴＭ１トレース塩溶液：
硫酸銅−５Ｈ２Ｏ ６．０ｇ
ヨウ化ナトリウム ０．０８ｇ
硫酸マグネシウム−Ｈ２Ｏ ３．０ｇ
モリブデン酸ナトリウム−２Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ホウ酸 ０．０２ｇ
塩化コバルト ０．５ｇ
塩化亜鉛 ２０．０ｇ
硫酸鉄−７Ｈ２Ｏ ６５．０ｇ
ビオチン ０．２ｇ
硫酸 ５．０ｍｌ
最終体積１リットルまで水を加える。
４８ウェルの深さが十分あるプレートを、接種の後で、滅菌された空気透過性のテープでシールし、殺虫性ペプチドＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体の培養に用いた。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体プレート上のコロニーをピックアップし、十分な深さのプレート（１ウェルあたり１ｍＬの培地（ＭＳＭ＋０．２％ ＰＴＭ１＋ビオチン（５００Ｘ希釈された、２００ｐｐｍストックより）、１％グリセロール（精製）から構成される））に接種した。接種されたプレートを、冷却された、インキュベーター振とう器中で、２２０ｒｐｍで振とうさせながら、２３．５℃で、５日、増殖させた。接種後２、３および４日で、１００μＬの５％グリセロールをプレートの各ウェルに添加した。接種後５日目で、馴化培地を、１５分間、３，７００ｒｐｍでの遠心により回収し、次いで、０．２２μＭ膜を備えたフィルタープレートを用いてろ過した。ろ過された培地を、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
以下に記述されるように調製されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ馴化培地の０．３ｍＬのアリコートを、ｒｐＨＰＬＣ（実施例１に記述される）を用いて分析し、培地中に存在する天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドの濃度を測定した。この実験の結果を、表２、図１５、および図１６に要約する。共通の平均および標準偏差を有する平均ペプチド産生量は、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に対しては、６７．０±２７．９ｍｇ／Ｌであり、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株に対しては、４２．９±１８．３ｍｇ／Ｌである。スチューデントｔ検定からは、産生量のそのような差異の分布の確率は、１％をはるかに下回ることが示唆された。Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株由来のメジアン産生量は７９．０ｍｇ／Ｌであり、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株（４４．７ｍｇ／Ｌ）よりもずっと高いものであった。Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株は、天然型Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ株よりも、高いペプチド産生量レベルにある株数の比率が、ずっと高かった。これら全ての結果から、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＮ末端でのグリシン−セリンジペプチドの追加により、このペプチドを産生し、馴化培地中へと分泌する酵母形質転換体の能力が大幅に改善されたという結論が指示される。
表２はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株由来のペプチド産生量の比較を示す。
＜実施例３＞
［Ａｎｅｍｏｎｅ ｖｉｒｉｄｉｓから発見された、タイプ３のイソギンチャク毒素の内の１つ、天然型Ａｖ３および、Ａｖ３＋２の、酵母株Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおける発現］
発現される殺虫性ペプチド：
Ａｖ３＋２：
ＧＳＲＳＣＣＰＣＹＷＧＧＣＰＷＧＱＮＣＹＰＥＧＣＳＧＰＫＶ（配列番号２９）
天然型Ａｖ３：
ＲＳＣＣＰＣＹＷＧＧＣＰＷＧＱＮＣＹＰＥＧＣＳＧＰＫＶ（配列番号３０）
上述の２つの非ＩＣＫ ＣＲＩＰペプチドをＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおいて発現させるために、ｐＫＬＡＣ１ベクターおよび、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ株、ＹＣＴ３０６を、実施例１に記述されるように用いた。
α−ＭＦ：：Ｋｅｘ２開裂部位：：Ａｖ３（またはＡｖ３＋２）をコードする、Ａｖ３およびＡｖ３＋２ペプチドＯＲＦを、従前に決定されたＫ．ｌａｃｔｉｓ発現アルゴリズムを用いて、コドン最適化を行った。
最適化されたＡｖ３＋２発現ＯＲＦ配列は以下である：
ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＧＴＡＣＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＴＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号３１）
この最適化ＤＮＡ配列を、ｐＫＬＡＣ１ベクターへと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いてクローニングし、Ａｖ３＋２発現ベクター、ｐＬＢ１０２を得た。
最適化された天然型Ａｖ３の発現ＯＲＦ配列は以下である：
ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＡＴＣＴＡＣＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＴＡＡＴＣＧＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号３２）
この最適化ＤＮＡ配列を、ｐＫＬＡＣ１ベクターへと、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いてクローニングし、天然型Ａｖ２発現ベクター、ｐＬＢ１０３を得た。
次いで、発現ベクター、ｐＬＢ１０２およびｐＬＢ１０３を、ＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化し、エレクトロポレーション形質転換法を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＹＣＴ３０６株へと形質転換した。得られた形質転換体を、５ｍＭアセトアミド（アセトアミダーゼ発現形質転換体のみが、窒素代謝源として有効に用いることができる）を補充されたＹＣＢ寒天プレート上で増殖させた。
殺虫性ペプチド産生量評価のために、ｐＬＢ１０２形質転換体の４８コロニー、およびｐＬＢ１０３形質転換体の４８コロニーをピックアップし、４８ウェルの十分な深さのプレート（各ウェルは５ｍＬの体積容量がある）既定のＫ．ｌａｃｔｉｓ培地２．２ｍＬ（炭素源として２％ソルビトールを添加）へと、接種した。培養物を、２８０ｒｐｍで振とうさせながら、６日間、２３．５℃で処置し、培養物中の細胞密度を吸光度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定した。次いで、４０００ｒｐｍ、１０分間、遠心により培養物から細胞を除去した。得られた上清（馴化培地）を、ＨＰＬＣ産生量分析のために、０．２μｍ膜を通してろ過した。
ペプチド産生量評価のために、ろ過された馴化培地試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステム（Ｏｎｙｘ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ４．５ｘ１００ｍｍ、Ｃ１８逆相分析ＨＰＬＣカラムおよびオートインジェクターを備える）で分析した。ＨＰＬＣグレードの水およびアセトニトリル（両方とも０．１％のトリフルオロ酢酸を含有）が、ＨＰＬＣ分析に用いられる２つの移動相溶媒を構成した。得られたＨＰＬＣクロマトグラフィーの天然型Ａｖ３およびＡｖ３＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのピーク面積を、馴化培地中のペプチド濃度の指標として使用し、次いで、それをさらに対応する最終細胞密度（ＯＤ６００測定により測定された）に対して、正規化ペプチド産生量として、正規化した。
表３、図１７および図１８に、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株由来のＡｖ３＋２および天然型Ａｖ３世紀かペプチド産生量分布を要約する。正規化ペプチド産生量は、対応する細胞培養の最後での細胞密度（ＯＤ６００により表される）により割られた、ＨＰＬＣクロマトグラフィーのペプチドＵＶピーク面積により表される。Ａｖ３＋２由来の全平均正規化ペプチド産生量は、１１７．５±５０．１ｍＡｕ．ｓｅｃ／Ａであり、スチューデントｔ検定（９９％信頼レベル）で、天然型Ａｖ３のそれ（２９．８±１６．１ｍＡｕ．ｓｅｃ／Ａ）よりも、統計的に有意に高いものであった。Ａｖ３＋２ Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のメジアン正規化ペプチド産生量は、１０６．７ｍＡｕ．ｓｅｃ／Ａであり、Ａｖ３株（３１．７ｍＡｕ．ｓｅｃ／Ａ）のそれよりも３倍以上高いものであった。Ａｖ３＋２発現株は、天然型Ａｖ３株よりも、高い産生量レベルにある株数の比率が、ずっと高いものであった（表３）。図１８に示されるように、ペプチド産生量の任意のパーセンタイル全体で、Ａｖ３＋２株は、天然型Ａｖ３株よりも高い産生量であった。これらの結果全てから、Ａｖ３ペプチドのＮ末端にグリシン−セリンジペプチドを添加することにより、このペプチドを発現する酵母形質転換体から得られるペプチド産生量が著しく改善されることが示唆された。
［農作物および昆虫］
これらの方法により制御されうる具体的な農作物および昆虫としては以下が挙げられる。
本発明は、任意の植物（限定されないが、単子葉植物および双子葉植物等）の形質転換体に用いられても良い。トランスジェニック法またはＰＥＰが特に有用な方法となりうる農作物としては、限定されないが、以下が挙げられる：アルファルファ、綿花、トマト、トウモロコシ、小麦、トウモロコシ、スイートコーン、ルーサン（ｌｕｃｅｒｎｅ）、大豆、モロコシ、フィールドピー（ｆｉｅｌｄ ｐｅａ）、亜麻仁、サフラワー、菜種、菜種油、イネ、大豆、オオムギ、ヒマワリ、樹木（針葉樹および落葉樹を含む）、花（商業的に育てられるもの、および温室で育てられるものを含む）、フィールドルピン（ｆｉｅｌｄ ｌｕｐｉｎｓ）、スイッチグラス、サトウキビ、ジャガイモ、トマト、タバコ、十字花植物（ｃｒｕｃｉｆｅｒｓ）、トウガラシ、サトウダイコン、モロコシ、および種子油、Ｂｒａｓｓｉｃａ類、ココア、茶葉、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、オーツ、野菜類、観賞植物および針葉樹。
「害虫」としては、限定されないが、以下が挙げられる：昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ（ｍｉｔｅｓ）、ダニ（ｔｉｃｋｓ）等。
昆虫の害虫としては、限定されないが、以下の目から選択される昆虫が挙げられる：Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、 Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ａｎｏｐｌｕｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ等。より具体的には、昆虫の害虫としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、およびＤｉｐｔｅｒａが挙げられる。
本殺虫性ポリペプチドでの処置に重要な、適切な農業の、家庭用の、および／または、医学／獣医学の昆虫は、限定されないが、以下の綱および目のメンバーが挙げられる。
Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目としては、ＡｄｅｐｈａｇａおよびＰｏｌｙｐｈａｇａ亜目が挙げられる。Ａｄｅｐｈａｇａ亜目としては、ＣａｒａｂｏｉｄｅａおよびＧｙｒｉｎｏｉｄｅａの上科が挙げられる。Ｐｏｌｙｐｈａｇａ亜目としては、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ、Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ、Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ、Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ、Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ、Ｄａｓｃｉｌｌｏｉｄｅａ、Ｄｒｙｏｐｏｉｄｅａ、Ｂｙｒｒｈｏｉｄｅａ、Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ、Ｍｅｌｏｉｄｅａ、Ｍｏｒｄｅｌｌｏｉｄｅａ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ、Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ、Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ、Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ、およびＣｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａの上科が挙げられる。Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ上科としては、Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ、ＣａｒａｂｉｄａｅおよびＤｙｔｉｓｃｉｄａｅの科が挙げられる。Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ上科としては、Ｇｙｒｉｎｉｄａｅ科が挙げられる。Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ上科としては、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ科が挙げられる。Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ上科としては、Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ科およびＳｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ科が挙げられる。Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ上科としては、ＣａｎｔｈａｒｉｄａｅおよびＬａｍｐｙｒｉｄａｅの科が挙げられる。Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ上科としては、ＣｌｅｒｉｄａｅおよびＤｅｒｍｅｓｔｉｄａｅの科が挙げられる。Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ上科としては、ＥｌａｔｅｒｉｄａｅおよびＢｕｐｒｅｓｔｉｄａｅの科が挙げられる。Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ上科としては、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ科が挙げられる。Ｍｅｌｏｉｄｅａ上科としては、Ｍｅｌｏｉｄａｅ科が挙げられる。Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ上科としては、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ科が挙げられる。Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ上科としては、ＰａｓｓａｌｉｄａｅおよびＳｃａｒａｂａｅｉｄａｅ科が挙げられる。Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ上科としては、Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ科が挙げられる。Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ上科としては、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ科が挙げられる。Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ上科としては、ＣｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅおよびＳｃｏｌｙｔｉｄａｅの科が挙げられる。
甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、アメリカマメゾウムシ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｂｅａｎ ｗｅｅｖｉｌ Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ハムシ（ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ）、コメツキムシ（ｃｌｉｃｋ ｂｅｅｔｌｅｓ （Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ、 Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ヒラタムシ（ｇｒａｉｎ ｂｅｅｔｌｅ Ａｈａｓｖｅｒｕｓ ａｄｖｅｎａ）、ｔｈｅ ｓｕｍｍｅｒ ｓｃｈａｆｅｒ Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ、家具の害虫（ｆｕｒｎｉｔｕｒｅ ｂｅｅｔｌｅ Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ類（ｗｅｅｖｉｌｓ））、ｔｈｅ Ｐｙｇｍｙ ｍａｎｇｏｌｄ ｂｅｅｔｌｅ Ａｔｏｍａｒｉａ ｌｉｎｅａｒｉｓ、カツオブシムシ（ｃａｒｐｅｔ ｂｅｅｔｌｅｓ（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ．、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ．））、ヨツモンマメゾウムシ（ｃｏｗｐｅａ ｗｅｅｖｉｌ Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｅｓ）、ｔｈｅ ｆｒｉｅｄ ｆｒｕｉｔ ｂｅｅｔｌｅ Ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ、ｔｈｅ ｃａｂｂａｇｅ ｓｅｅｄｐｏｄ ｗｅｅｖｉｌ Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｓｓｉｍｉｌｉｓ、ｔｈｅ ｒａｐｅ ｗｉｎｔｅｒ ｓｔｅｍ ｗｅｅｖｉｌ Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｐｉｃｉｔａｒｓｉｓ、ｔｈｅ ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｖｅｓｐｅｒｔｉｎｕｓ および、Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｆａｌｌｉ、ｔｈｅ ｂａｎａｎａ ｗｅｅｖｉｌ Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｏｒｄｉｄｕｓ、ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｇｒａｓｓ ｇｒｕｂ Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ、ｈｅ Ｊｕｎｅ ｂｅｅｔｌｅ Ｃｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ、ｔｈｅ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｔｅｍ ｗｅｅｖｉｌ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ、ｔｈｅ ｌａｒｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ ｌａｒｄａｒｉｕｓ、ｔｈｅ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、および、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、インゲンテントウ（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ） Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、ｔｈｅ ｏｌｄ ｈｏｕｓｅ ｂｏｒｅｒ Ｈｙｌｏｔｒｏｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ、ｔｈｅ ｌｕｃｅｒｎｅ ｗｅｅｖｉｌ Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ、ｔｈｅ ｓｈｉｎｙ ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ Ｇｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ、ｔｈｅ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｂｅｅｔｌｅ Ｌａｓｉｏｄｅｒｍａ ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ、ｔｈｅ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｌｙｃｔｕｓ ｂｅｅｔｌｅｓ’ （Ｌｙｃｔｕｓ ｓｐｐ．）、ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｂｅｅｔｌｅ Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ、ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｃｋｓｈａｆｅｒ Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ Ｍｅｚｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、ｔｈｅ ｇｏｌｄｅｎ ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅ Ｎｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ、ｔｈｅ ｇｒａｉｎ ｂｅｅｔｌｅｓ Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ、および、Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｍｅｒｃａｔｏｒ、ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｖｉｎｅ ｗｅｅｖｉｌ Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｕｌｃａｔｕｓ、ｔｈｅ ｍｕｓｔａｒｄ ｂｅｅｔｌｅ Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ、ｔｈｅ ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、ｔｈｅ ｓｔｒｉｐｅｄ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ、ｔｈｅ ｃａｂｂａｇｅ ｓｔｅａｍ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｔｉｎｕｓ ｓｐｐ．（ヒョウホンムシ科（ｓｐｉｄｅｒ ｂｅｅｔｌｅｓ））、ｔｈｅ ｌｅｓｓｅｒ ｇｒａｉｎ ｂｏｒｅｒ Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ、ｔｈｅ ｐｅａおよびｂｅｅｎ ｗｅｅｖｉｌ Ｓｉｔｏｎａ ｌｉｎｅａｔｕｓ、ｔｈｅ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｇｒａｎａｒｙ ｂｅｅｔｌｅｓ Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｅｓ、ｔｈｅ ｒｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｗｅｅｖｉｌ Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ、ｔｈｅ ｄｒｕｇｓｔｏｒｅ ｂｅｅｔｌｅ Ｓｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ、ｔｈｅ ｙｅｌｌｏｗ ｍｅａｌｗｏｒｍ ｂｅｅｔｌｅ Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、ｔｈｅ ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅｓ Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ、および、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ、ｗａｒｅｈｏｕｓｅおよび、ｃａｂｉｎｅｔ ｂｅｅｔｌｅｓ （Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、および、ｔｈｅ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎ’ｓ、が挙げられる。
ハサミムシ類（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、ヨーロッパハサミムシ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｅａｒｗｉｇ Ｆｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）および、ｔｈｅ ｓｔｒｉｐｅｄ ｅａｒｗｉｇ Ｌａｂｉｄｕｒａ ｒｉｐａｒｉａが挙げられる。
Ｄｉｃｔｖｏｎｔｅｒａの例としては、限定されないが、トウヨウゴキブリ（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ、Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ドイツゴキブリ（Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、マデイラゴキブリ（Ｍａｄｅｉｒａ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ）、アメリカゴキブリ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、および、クロゴキブリ（ｓｍｏｋｙｂｒｏｗｎ ｃｏｃｋｒｏａｃｈ Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｆｕｌｉｇｉｎｏｓａ）が挙げられる。
ヤスデ綱（Ｄｉｐｌｏｎｏｄａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｎａｋｅ ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ、ｔｈｅ ｆｌａｔ−ｂａｃｋ ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ Ｂｒａｃｈｙｄｅｓｍｕｓ ｓｕｐｅｒｕｓ、および、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ Ｏｘｉｄｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓが挙げられる。
双翅目としては、Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ、Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａおよび、Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａの亜目が挙げられる。Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ亜目としては、Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ、Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ、Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ、Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ、Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ、Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅおよび、Ｃｅｃｉｄｏｍｙｉｉｄａｅの科が挙げられる。Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ亜目としては、Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ、Ｔａｂａｎｉｄａｅ、Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ、Ａｓｉｌｉｄａｅ、Ｍｙｄｉｄａｅ、Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ、およびＤｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅの科が挙げられる。Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ亜目としては、Ａｓｃｈｉｚａ門および、Ａｓｃｈｉｚａ門が挙げられる。Ａｓｃｈｉｚａ門としては、Ｐｈｏｒｉｄａｅ、Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ、および、Ｃｏｎｏｐｉｄａｅの科が挙げられる。Ａｓｃｈｉｚａ門としては、Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節およびＣａｌｙｐｔｒａｔａｅ節が挙げられる。Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節としては、Ｏｔｉｔｉｄａｅ、Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ、Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ、および、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅの科が挙げられる。Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節としては、Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ、Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ、Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ、Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ、Ｍｕｓｃｉｄａｅ、Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅおよび、Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅの科が挙げられる。
双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ｔｈｅ Ａｆｒｉｃａｎ ｔｕｍｂｕ ｆｌｙ （Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、ヌカカ（ｂｉｔｉｎｇ ｍｉｄｇｅｓ（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、ｂｅｅ ｌｏｕｓｅ （Ｂｒａｕｌａ ｓｐｐ．）、ｔｈｅ ｂｅｅｔ ｆｌｙ Ｐｅｇｏｍｙｉａ ｂｅｔａｅ、ブユ（ｂｌａｃｋ ｆｌｉｅｓ（Ｃｎｅｐｈｉａ ｓｐｐ．、Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ウマバエ（ｂｏｔ ｆｌｉｅｓ（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ ｓｐｐ．、Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．））、ガガンボ（ｃｒａｎｅｆｌｉｅｓ （Ｔｉｐｕｌａ ｓｐｐ．））、ｅｙｅ ｇｎａｔｓ（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ ｓｐｐ．）、ｆｉｌｔｈ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｌｉｅｓ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｓｐｐ．， Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．、Ｈｅｒｍｅｔｉａ ｓｐｐ．、Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃｉｎａ ｓｐｐ．、Ｐｈａｅｎｉｃｉａ ｓｐｐ．、Ｐｈｏｒｍｉａ ｓｐｐ．）、シマバエ（ｆｌｅｓｈ ｆｌｉｅｓ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．， Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ ｓｐｐ．））；ｔｈｅ ｆｌｉｔ ｆｌｙ Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ、ミバエ（ｆｒｕｉｔｆｌｉｅｓ（Ｄａｃｕｓ ｓｐｐ．， Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．））、ｈｅａｄ ａｎｄ ｃａｎｏｎ ｆｌｉｅｓ （Ｈｙｄｒｏｔｅａ ｓｐｐ．）、ｔｈｅ ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、ｈｏｒｎ ａｎｄ ｂｕｆｆａｌｏ ｆｌｉｅｓ （Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ ｓｐｐ．）、ｈｏｒｓｅ ａｎｄ ｄｅｅｒ ｆｌｉｅｓ（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．， Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ ｓｐｐ．， Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．）、シラミバエ（ｌｏｕｓｅ ｆｌｉｅｓ （Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ ｓｐｐ．、Ｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．、および、Ｐｓｅｕｄｏｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．））、ｍｅｄｆｌｉｅｓ（Ｃｅｒａｔｉｔｕｓ ｓｐｐ．）、蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ（Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．、Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．、Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、サシチョウバエ（ｓａｎｄｆｌｉｅｓ（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ ．ｓｐｐ．）、ラセンウジバエ（ｓｃｒｅｗ−ｗｏｒｍ ｆｌｉｅｓ （Ｃｈｔｙｓｏｍｙａ ｂｅｚｚｉａｎａおよび、Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ））、ヒツジシラミバエ（ｓｈｅｅｐ ｋｅｄｓ （Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｓｐｐ．））；サシバエ（ｓｔａｂｌｅ ｆｌｉｅｓ （Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．））、ツェツェバエ（ｔｓｅｔｓｅ ｆｌｉｅｓ （Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｓｐｐ．））および、ウシバエ（ｗａｒｂｌｅ ｆｌｉｅｓ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．））が挙げられる。
Ｉｓｏｎｔｅｒａ（シロアリ）の例としては、限定されないが、Ｈｏｄｏｔｅｎｎｉｔｉｄａｅ、Ｋａｌｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｒｈｉｎｏｔｅｎｎｉｔｉｄａｅ、Ｓｅｒｒｉｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ、Ｔｅｒｍｏｐｓｉｄａｅの科が挙げられる。
異翅目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、トコジラミ（ｂｅｄ ｂｕｇ Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）、ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ ｓｔａｉｎｅｒ Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、 ｔｈｅ Ｓｕｎｎ ｐｅｓｔ Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｃｅｐｓ、サビイロメクラガメ（ｔｈｅ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ Ｎｅｚａｒａ ａｎｔｅｎｎａｔａ、ｔｈｅ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、および、オオサシガメ（ｔｒｉａｔｏｍｉｄ ｂｕｇｓ Ｐａｎｓｔｒｏｇｙｌｕｓ ｍｅｇｉｓｔｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐａｌｌｅｓｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｄｉｍｉｄｉａｔａ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、および、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｓｏｒｄｉｄａ）が挙げられる。
同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｒｅｄ ｓｃａｌｅ Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉｉ、ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｂｅａｎ ａｐｈｉｄ Ａｐｈｉｓ ｆａｂａｅ、ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ または、ｍｅｌｏｎ ａｐｈｉｄ Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ Ａｐｈｉｓ ｐｏｍｉ、ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｉｎｙ ｗｈｉｔｅｆｌｙ Ａｌｅｕｒｏｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｉｎｉｆｅｒｕｓ、ｔｈｅ ｏｌｅａｎｄｅｒ ｓｃａｌｅ Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｈｅｄｅｒａｅ、ワタコナジラミ（ｔｈｅ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）Ｂｅｍｅｓｉａ ｔａｂａｃｉ、ｔｈｅ ｃａｂｂａｇｅ ａｐｈｉｄ Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、ｔｈｅ ｐｅａｒ ｐｓｙｌｌａ Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ、ｔｈｅ ｃｕｒｒａｎｔ ａｐｈｉｄ Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ、ｔｈｅ ｇｒａｐｅ ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ Ｄａｋｔｕｌｏｓｐｈａｉｒａ ｖｉｔｉｆｏｌｉａｅ、ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｐｓｙｌｌａ Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ、ｔｈｅ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、ｔｈｅ ｂｅａｎ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ Ｅｍｐｏａｓｃａ ｓｏｌａｎａ、ｔｈｅ ｖｉｎｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ Ｅｍｐｏａｓｃａ ｖｉｔｉｓ、ｔｈｅ ｗｏｏｌｌｙ ａｐｈｉｄ Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｆｒｕｉｔ ｓｃａｌｅ Ｅｕｌｅｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ、ｔｈｅ ｍｅａｌｙ ｐｌｕｍ ａｐｈｉｄ Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ、ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ、ｔｈｅ ｐｏｔａｔｏ ａｐｈｉｄ Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ、ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ、ｇａｌｌ−ｆｏｒｍｉｎｇ ａｐｈｉｄｓ （Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．）、ｔｈｅ ｈｏｐ ａｐｈｉｄ Ｐｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ、ｔｈｅ ｂｉｒｄ−ｃｈｅｒｒｙ ａｐｈｉｄ Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ、ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｓｃａｌｅ Ｓａｉｓｓｅｔｉａ ｏｌｅａｅ、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｂｕｇ Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ｔｈｅ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ Ｓｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ、および、ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｗｈｉｔｅｆｌｙ Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ。
ワラジムシ（Ｉｓｏｐｏｄａ）の例としては、限定されないが、リクダンゴムシ（ｃｏｍｍｏｎ ｐｉｌｌｂｕｇ Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）および、ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｗｏｏｄｌｏｕｓｅ Ｏｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓが挙げられる。
鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）としては、Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ、Ｐｉｅｒｉｄａｅ、Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ、Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ、Ｄａｎａｉｄａｅ、Ｓａｔｙｒｉｄａｅ、Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ、Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ、Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ、Ａｒｃｔｉｉｄａｅ、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ、Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ、Ｓｅｓｉｉｄａｅ、およびＴｉｎｅｉｄａｅの科が挙げられる。
鱗翅目の例としては、限定されないが、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ （ｓｕｍｍｅｒ ｆｒｕｉｔ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｏｌｏｎ （ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ａｒｃｈｉｐｓ ｐｏｄａｎａ （ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｐｙｒｉｖｏｒｅｌｌａ （ｐｅａｒ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ （ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｐｅｒｆｏｒａｔｏｒ）、Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ （ｐｉｎｅ ｌｏｏｐｅｒ）、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ （ｃｏｄｌｉｎｇ ｍｏｔｈ）、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ （ｓｔｒｉｐｅｄ ｒｉｃｅ ｂｏｒｅｒ）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ （ｅａｓｔｅｒｎ ｓｐｒｕｃｅ ｂｕｄｗｏｒｍ）、Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ （ｂａｎｄｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ （ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）、Ｅａｒｌｓ ｉｎｓｕｌａｎａ （Ｅｇｙｐｔｉａｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ｅｕｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ （Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｌｏｕｒ ｍｏｔｈ）、Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｇｒａｐｅ ｂｅｒｒｙ ｍｏｔｈ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ （ｂｒｏｗｎ−ｔａｉｌ ｍｏｔｈ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｓｕｂｆｌａｖａ （ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔｈ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ （ｇｒｅａｔｅｒ ｗａｘ ｍｏｔｈ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ （ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ （アメリカタバコガ、ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ （オオタバコガ、ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｔｅｌｌａ （ｂｒｏｗｎ ｈｏｕｓｅ ｍｏｔｈ）、Ｈｏｍｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ （ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）、Ｈｏｍｏｎａ ｍａｇｎａｎｉｍａ （ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｅａ ｔｒｅｅ ｔｏｒｔｒｉｘ ｍｏｔｈ）、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ （ｓｐｏｔｔｅｄ ｔｅｎｔｉｆｏｒｍ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ （ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ）、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ （ｔｅｎｔ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ （ｃａｂｂａｇｅ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ （Ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、ｔｈｅ ｈｏｒｎｗｏｒｍｓ Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ、および、Ｍａｎｕｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ （ｗｉｎｔｅｒ ｍｏｔｈ）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）、Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ （ｐｉｎｅ ｂｅａｕｔｙ ｍｏｔｈ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ （ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ （ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ （ｃａｂｂａｇｅ ｗｈｉｔｅ ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ （ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｉ （ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ）、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ （ｙｅｌｌｏｗ ｂｅａｒ ｍｏｔｈ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ （ビートアワヨトウ、ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ （ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆｗｏｒｉｎ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ （ｃｏｍｍｏｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｐｒａｅｆｉｃａ （ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｓｙｌｅｐｔａ ｄｅｒｏｇａｔａ （ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｒｏｌｌｅｒ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ （ｗｅｂｂｉｎｇ ｃｌｏｔｈｅｓ ｍｏｔｈ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ （ｃａｓｅ−ｍａｋｉｎｇ ｃｌｏｔｈｅｓ ｍｏｔｈ）、Ｔｏｒｔｒｉｘ ｖｉｒｉｄａｎａ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｏａｋ ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ （ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）、および、Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ （ｓｍａｌｌ ｅｒｍｉｎｅ ｍｏｔｈ）が挙げられる。
直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｒｉｃｋｅｔ Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、ｔｒｅｅ ｌｏｃｕｓｔｓ （Ａｎａｃｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｌｏｃｕｓｔ Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、ｔｈｅ ｔｗｏｓｔｒｉｐｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ、ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｔｈｅ ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ｔｈｅ ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ Ｎｅｏｃｕｒｔｉｌｌａ ｈｅｘａｄｅｃｔｙｌａ、ｔｈｅ ｒｅｄ ｌｏｃｕｓｔ Ｎｏｍａｄａｃｒｉｓ ｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔａ、ｔｈｅ ｓｈｏｒｔｗｉｎｇｅｄ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ、ｔｈｅ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｂｏｒｅｌｌｉｉ、ｔｈｅ ｔａｗｎｙ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｖｉｃｉｎｕｓ、および、ｔｈｅ ｄｅｓｅｒｔ ｌｏｃｕｓｔ Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａが挙げられる。
シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｃａｔｔｌｅ ｂｉｔｉｎｇ ｌｏｕｓｅ Ｂｏｖｉｃｏｌａ ｂｏｖｉｓ、ｂｉｔｉｎｇ ｌｉｃｅ （Ｄａｍａｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ｔｈｅ ｃａｔ ｌｏｕｓｅ Ｆｅｌｉｃｏｌａ ｓｕｂｒｏｓｔｒａｔａ、ｔｈｅ ｓｈｏｒｔｎｏｓｅｄ ｃａｔｔｌｅ ｌｏｕｓｅ Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｅｌｏｙｓｔｅｒｎｕｓ、ｔｈｅ ｔａｉｌ−ｓｗｉｔｃｈ ｌｏｕｓｅ Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｑｕａｄｒｉｐｅｒｉｕｓｓｕｓ、ｔｈｅ ｈｏｇ ｌｏｕｓｅ Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｕｉｓ、ｔｈｅ ｆａｃｅ ｌｏｕｓｅ Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｏｖｉｌｌｕｓ、ｔｈｅ ｆｏｏｔ ｌｏｕｓｅ Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｐｅｄａｌｉｓ、ｔｈｅ ｄｏｇ ｓｕｃｋｉｎｇ ｌｏｕｓｅ Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｅｔｏｓｕｓ、ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｎｏｓｅｄ ｃａｔｔｌｅ ｌｏｕｓｅ Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｖｉｔｕｌｉ、ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｏｄｙ ｌｏｕｓｅ Ｍｅｎａｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ、ｔｈｅ ｐｏｕｌｔｒｙ ｓｈａｆｔ ｌｏｕｓｅ Ｍｅｎｏｐｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｏｄｙ ｌｏｕｓｅ Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ、ｔｈｅ ｐｕｂｉｃ ｌｏｕｓｅ Ｐｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ、ｔｈｅ ｌｉｔｔｌｅ ｂｌｕｅ ｃａｔｔｌｅ ｌｏｕｓｅ Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ、および、ｔｈｅ ｄｏｇ ｂｉｔｉｎｇ ｌｏｕｓｅ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｃａｎｉｓが挙げられる。
チャタテムシ類（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｂｏｏｋｌｉｃｅ Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｄｅｃｏｌｏｒ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、および、Ｔｒｏｇｉｕｍ ｐｕｌｓａｔｏｒｉｕｍが挙げられる。
ノミ類（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｂｉｒｄ ｆｌｅａ Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ、イヌノミ（ｄｏｇ ｆｌｅａ）Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｃａｎｉｓ、ネコノミ（ｃａｔ ｆｌｅａ） Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｌｓ、ヒトノミ（ｈｕｍａｎ ｆｌｅａ）Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ、および、ケオプスネズミノミ（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｒａｔ ｆｌｅａ）Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓが挙げられる。
結合類（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）の例としては、限定されないが、ｇａｒｄｅｎ ｓｙｍｐｈｙｌａｎ Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔｅが挙げられる。
シミ類（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｇｒａｙ ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ、ｔｈｅ ｆｏｕｒ−ｌｉｎｅｄ ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｑｕａｄｒｉｓｅｒｉａｔａ、ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、および、ｔｈｅ ｆｉｒｅｂｒａｔ Ｔｈｅｎｎｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａが挙げられる。
総翅類（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）の例としては、限定されないが、ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐｓ Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒ ｔｈｒｉｐｓ Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｉｎｔｏｎｓａ、ｔｈｅ ｗｅｓｔｅｒｎ ｆｌｏｗｅｒ ｔｈｒｉｐｓ Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄ ｔｈｒｉｐｓ Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｓｃｈｕｌｔｚｅｉ、ｔｈｅ ｂａｎｄｅｄ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｈｒｉｐｓ Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ、ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｔｈｒｉｐｓ Ｎｅｏｈｙｄａｔｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｋｅｌｌｙ’ｓ ｃｉｔｒｕｓ ｔｈｒｉｐｓ Ｐｅｚｏｔｈｒｉｐｓ ｋｅｌｌｙａｎｕｓ、ｔｈｅ ａｖｏｃａｄｏ ｔｈｒｉｐｓ Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ ｐｅｒｓｅａｅ、ｔｈｅ ｍｅｌｏｎ ｔｈｒｉｐｓ Ｔｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ、および、ｔｈｅ ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐｓ Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉが挙げられる。
線虫（Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）の例としては、限定されないが、例えば、根瘤、シストおよびｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ等の寄生性線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．、および、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．を含む）；特に、シスト線虫（ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）（限定されないが、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ （ダイズシスト線虫、ｓｏｙｂｅａｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）； Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ （ビートシスト線虫、ｂｅｅｔ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）； Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ （穀類シスト線虫、ｃｅｒｅａｌ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）；および、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ、および、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ （ジャガイモシスト線虫、ｐｏｔａｔｏ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）を含む）が挙げられる。Ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅｓとしては、限定されないが、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐが挙げられる。
１つの実施態様において、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ベクター等を含有する殺虫性組成物を、外部寄生体の治療に用いることができる。外部寄生体としては、限定されないが、ノミ、ダニ（ｔｉｃｋｓ）、疥癬、ダニ（ｍｉｔｅｓ）、蚊、不快害虫およびサシバエ、シラミ、ならびに、前述の外部寄生体の１以上を含有する組み合わせが挙げられる。「ノミ」という用語には、ノミ目の寄生性のみの通常の種類および偶生種が含まれ、特に、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ、特に、Ｃ．ｆｅｌｌｓおよび、Ｃ．ｃａｍｓ、ラットノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）およびヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）が挙げられる。
主要農作物に対する本発明の害虫としては、限定されないが、以下が含まれる：トウモロコシ：Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、タマナヤガ（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）；Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ；Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、サトウキビ害虫（ｓｕｒｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ；Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．、ハリガネムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ（コガネムシ類幼虫、ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ（コガネムシ類幼虫、ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ）；Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、マメコガネ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ）；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ、ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ； Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ、ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ、ｃｏｒｎ ｌｅａｆ ａｐｈｉｄ；Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ、ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ；Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ、ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ；Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ、ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ；Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ、ｇｒａｓｓ ｔｈｒｉｐｓ；Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ、ｔｈｉｅｆ ａｎｔ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）： Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ； Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ；Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ；Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ、コガネムシ類幼虫（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ）；Ｅｌｅｏｄｅｓ、Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ、および、Ａｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．，ハリガネムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）；Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、ｃｅｒｅａｌ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ、ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ、ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ、ｃｏｒｎ ｌｅａｆ ａｐｈｉｄ；Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ、ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）； Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｄｇｅ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、ｃａｒｍｉｎｅ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；小麦（Ｗｈｅａｔ）：Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ、ヨトウムシ（ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ； Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ； Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、ｃｅｒｅａｌ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ； Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ、ｃｌｏｖｅｒ ｌｅａｆ ｗｅｅｖｉｌ； Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ、ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ；Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギミドリアブラムシ（ｇｒｅｅｎｂｕｇ）；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ、Ｅｎｇｌｉｓｈ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、Ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ、ｗｈｅａｔ ｍｉｄｇｅ；Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ、ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｍａｇｇｏｔ；Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ、ｗｈｅａｔ ｂｕｌｂ ｆｌｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、タバコアザミウマ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐｓ）；Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ、ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｓａｗｆｌｙ； Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ、ｗｈｅａｔ ｃｕｒｌ ｍｉｔｅ；ヒマワリ（Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）： Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ ｍｏｔｈ； Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ； Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ； Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ、ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ； 綿花（Ｃｏｔｔｏｎ）： Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄｗｏｒｍ； Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ； Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ； Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ； Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ、ワタミハナゾウムシ（ｂｏｌｌ ｗｅｅｖｉｌ）；Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、ワタアブラムシ（ｃｏｔｔｏｎ ａｐｈｉｄ）；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ、ｃｏｔｔｏｎ ｆｌｅａｈｏｐｐｅｒ； Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ、ｂａｎｄｅｄｗｉｎｇｅｄ ｗｈｉｔｅｆｌｙ； Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、サビイロメクラガメ（ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ）； Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ； Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ； Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ、ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐｓ； Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、タバコアザミウマ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐｓ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、ｃａｒｍｉｎｅ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ； Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ， ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ；イネ（Ｒｉｃｅ）： Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、サトウキビ害虫（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）； Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ；Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ、ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ、イネミズゾウムシ（ｒｉｃｅ ｗａｔｅｒ ｗｅｅｖｉｌ）；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、コクゾウムシ（ｒｉｃｅ ｗｅｅｖｉｌ）；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ、ｒｉｃｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ； Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）； Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ；ダイズ（Ｓｏｙｂｅａｎ）： Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ； Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ； Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ、ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ； Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、タマナヤガ（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、ビートアワヨトウ（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）； Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄｗｏｒｍ； Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、アメリカタバコガ（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）； Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、インゲンテントウ（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ）； Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、アカアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ）； Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ； Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ； Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ； Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ； Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ、ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ； Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ｓｏｙｂｅａｎ ｔｈｒｉｐｓ； Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ、ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐｓ； Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ； Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；オオムギ（Ｂａｒｌｅｙ）： Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、タマナヤガ（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギミドリアブラムシ（ｇｒｅｅｎｂｕｇ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ；Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ、ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ； Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、Ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ； Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ、ｂｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ ｍｉｔｅ；
アブラナ（Ｏｉｌ Ｓｅｅｄ Ｒａｐｅ）： Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、ｃａｂｂａｇｅ ａｐｈｉｄ； Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、ノミトビヨロイムシ（Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ， Ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ； Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、コナガ（Ｄｉａｍｏｎｄ−ｂａｃｋ ｍｏｔｈ）；Ｄｅｌｉａ ｓｓｐ．、Ｒｏｏｔ ｍａｇｇｏｔｓ。
一部の実施態様において、殺虫性組成物を用いて、１以上の上述の昆虫を含有する組み合わせを処置することができる。
本発明のペプチドに感受性のある昆虫としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｃｙｔ毒素は、例えば、Ｂｌａｔｔａｒｉａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍｉｄａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ、Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ等の科に影響を与える。属種としては、以下が示される：Ａｃｔｅｂｉａ−ｆｅｎｎｉｃａ、Ａｇｒｏｔｉｓ−ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａ．−ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ−ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ−ｃｉｔｒａｎａ、Ａｒｔｏｇｅｉａ−ｒａｐａｅ、Ｂｏｍｂｙｘ−ｍｏｒｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ−ｆｕｓｃａ、Ｃａｃｙｒｅｕｓ−ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｃｈｉｌｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｈｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ−ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ、Ｃ．−ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｃ．−ｐｉｎｕｓ ｐｉｎｕｓ、Ｃ．−ｒｏｓａｃｅｎａ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ−ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｎｏｐｏｍｏｒｐｈａ−ｃｒａｍｅｒｅｌｌａ、Ｃｔｅｎｏｐｓｕｅｓｔｉｓ−ｏｂｌｉｑｕａｎａ、Ｃｙｄｉａ−ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｄａｎａｕｓ− ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ−ｓａｃｃｈａｒａｌｌｉｓ、Ｄ．−ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｅａｒｉａｓ−ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｅｌａｓｍｏｌｐａｌｐｕｓ−ｌｉｇｎｏｓｅｌｉｕｓ、Ｅｌｄａｎａ−ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、Ｅｐｈｅｓｔｉａ−ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ、Ｅｐｉｎｏｔｉａ−ａｐｏｒｅｍａ、Ｅｐｉｐｈｙａｓ−ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ、Ｇａｌｌｅｒｉａ−ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｇｅｎｕｓ−Ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ−ｚｅａ、Ｈ．−ｐｕｎｃｔｉｇｅｒａ、Ｈ．−ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ−ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ− ｃｕｎｅａ、Ｌａｍｂｄｉｎａ−ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ、Ｌｅｇｕｍｉｎｉｖｏｒａ−ｇｌｙｃｉｎｉｖｏｒｅｌｌａ、Ｌｏｂｅｓｉａ−ｂｏｔｒａｎａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ−ｄｉｓｐａｒ、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ−ｄｉｓｓｔｒｉａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ−ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｍ．ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｍａｎｄｕｃａ−ｓｅｘｔａ、Ｍａｒａｓｍｉａ−ｐａｔｎａｌｉｓ、Ｍａｒｕｃａ−ｖｉｔｒａｔａ、Ｏｒｇｙｉａ−ｌｅｕｃｏｓｔｉｇｍａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ−ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｏ．−ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｐａｎｄｅｍｉｓ−ｐｙｒｕｓａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ−ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ−ｃｏｆｆｅｅｌｌａ、Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ−ｏｐｅｒｃｕｌｌｅｌａ、Ｐｉａｎｏｔｏｒｔｒｉｘ−ｏｃｔｏ、Ｐｉａｔｙｎｏｔａ−ｓｔｕｌｔａｎａ、Ｐｉｅｒｉｓ−ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｌｏｄｉａ−ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔａｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ−ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ−ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ−ｎｕ、Ｓｃｉｒｏｐｏｐｈａｇａ−ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ、Ｓｅｓａｍｉａ−ｃａｌａｍｉｓｔｉｓ、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ−ｖｉｒｇｉｎｉｃａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ−ｅｘｉｇｕａ、Ｓ．−ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓ．−ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓ．−ｅｘｅｍｐｔａ、Ｓ．−ｌｉｔｕｒａ、Ｔｅｃｉａ−ｓｏｌａｎｉｖｏｒａ、Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ−ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ−ｎｉ、Ｗｉｓｅａｎａ−ｃｅｒｖｉｎａｔａ、Ｗｉｓｅａｎａ−ｃｏｐｕｌａｒｉｓ、Ｗｉｓｅａｎａ−ｊｏｃｏｓａ、Ｂｌａｔｔａｒｉａ−Ｂｌａｔｔｅｌｌａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ−Ｘｅｎｙｌｌａ、Ｃ．−Ｆｏｌｓｏｍｉａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍｉｄａ−Ｆａｓｃｉｏｌａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ−Ｏｎｃｏｐｅｌｔｒｕｓ、Ｈｅ．−Ｂｅｍｉｓｉａ、Ｈｅ．−Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ、Ｈｅ．−Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ、Ｈｅ．−Ｍｙｚｕｓ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ−Ｄｉｐｒｉｏｎ、Ｈｙ．−Ａｐｉｓ、Ｈｙ．−Ｍａｃｒｏｃｅｎｔｒｕｓ、Ｈｙ．−Ｍｅｔｅｏｒｕｓ、Ｈｙ．−Ｎａｓｏｎｉａ、Ｈｙ．−Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ、Ｉｓｏｐｏｄａ−Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ−Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ−Ａｃｈｔａ、Ｐｒｏｓｔｉｇｍａｔａ−Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ−Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ、Ｒ．−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ、Ｒ．−Ｄｉｓｔｏｌａｂｒｅｌｌｕｓ、Ｒ．−Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ、Ｒ．−Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ、Ｒ．−Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、Ｒ．−Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ、Ｒ．−Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｒ．−Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ、Ｒ．−Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ、Ｒ．−Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ、および、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ−Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ。
以下の記述および要約と共に、パート２について記述する。
公知のペプチドに付加および操作可能に連結されている、Ｎ末端ジペプチドを有するペプチドを開示し、ここで、前記Ｎ末端ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸および、ジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成され、ここで、前記ペプチドは、ＣＲＩＰ（システインリッチ殺虫性ペプチド）（例えば、ＩＣＫペプチド）、または非ＩＣＫペプチドから選択される。公知のペプチドに付加および操作可能に連結されている、Ｎ末端ジペプチドであって、ここで、前記Ｎ末端ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される。Ｎ末端ジペプチドは、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択されるＮ末端ジペプチドのＮ末端アミノ酸としての非極性アミノ酸を有し、および、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンから選択されるＮ末端ペプチドのＣ末端アミノ酸の極性アミノ酸を有している。
Ｎ末端ジペプチドは、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択されるＮ末端ジペプチドのＮ末端アミノ酸として、非極性アミノ酸を有しても良く、およびＮ末端ペプチドのＣ末端アミノ酸の前記極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンから選択される。Ｎ末端ジペプチドは、好ましくは、グリシン−セリンから構成されても良い。
公知のペプチドに付加および操作可能に連結されている、Ｎ末端ジペプチドを有するペプチドを記述し、ここで、前記Ｎ末端ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成され、ここで、前記ペプチドはＰＦＩＰ（孔形成殺虫性タンパク質）から選択され、または、ＣＲＩＰ（システインリッチ殺虫性ペプチド）（例えば、ＩＣＫペプチド）、または非ＩＣＫペプチドから選択されても良い。非ＩＣＫペプチドはＡｖ２またはＡｖ３のようなイソギンチャク起源のペプチドであっても良く、好ましいジペプチドは、グリシン−セリンから構成される。ＩＣＫペプチドはＡＣＴＸペプチドのようなクモ由来のものであっても良く、好ましいジペプチドはグリシン−セリンから構成される。ＰＦＩＰは、本明細書に記述され、配列表に記述され、これらの記述を読む当業者に理解される任意のもののような、Ｂｔタンパク質であっても良く、好ましいジペプチドは、グリシン−セリンから構成される。
上述のように、Ｎ末端ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸および、ジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成され、Ｎ末端ジペプチドのＮ末端アミノ酸由来の非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンから選択されても良く、好ましい非極性アミノ酸はグリシンである。ならびに、我々は、以下の項にある任意のペプチドおよび、本項にある任意のペプチドが、独立して作用しうること、ならびに、独立して処理されるべきであることを説明およびクレームし、ならびに、可能性のある組み合わせ全てを独立してクレームする。
上記のとおり、我々は、Ｎ末端ジペプチドが、Ｎ末端の１個の非極性アミノ酸と、Ｃ末端の１個の極性アミノ酸から成り、Ｎ末端ペプチドのＣ末端アミノ酸である極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンから選択され、好ましくは、この極性アミノ酸はセリンであることを説明する。また、我々は、上記段落中のあらゆるペプチド及びこの段落中のあらゆるペプチドが、独立して作用し、そして、独立して扱われるべきで、全ての可能な組み合わせが独立してクレームされることを説明し、クレームする。
Ｎ末端ジペプチドが付着されるペプチドは、任意のペプチド、任意の毒素ペプチド、任意の殺虫性ペプチド、任意のＰＦＩＰ、任意のＣＲＩＰ（ＡＣＴＸペプチドであるＣＲＩＰ（ＩＣＫペプチドの例である））であっても良く、ＣＲＩＰはイソギンチャクペプチドであり（非ＩＣＫペプチドの例である）、ＰＦＩＰであっても良く、ＰＦＩＰはＢｔタンパク質であっても良く、Ｂｔタンパク質はｃｒｙ、ｃｙｔ、ＶＩＰであっても良く、本明細書または配列表に記述される、またはこれらの記述を読み、本明細書を理解する当業者に公知である、任意のこれらのペプチドの様であっても良い。
これらの手順が有用であることを具体的に記述し、任意の殺虫性ペプチド、特に、本明細書および別に開示される、ＡｔｒａｘもしくはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅを含む任意のペプチドまたは、任意のペプチド源から選択される任意のペプチド、ならびに、前記ペプチドおよび配列番号の成熟型、プレ、およびプロペプチドのバージョン、ならびに配列番号５のペプチドを含む、その断片を有する任意の殺虫性ペプチド、を作製するためのその手順自体、ならびに、独立項として、およびプロダクトバイプロセスクレームとしての両方で、この手順による生産物をクレームする。
これらのペプチドは有用であり、その手順は全て、Ｎ末端で１つの非極性アミノ酸、Ｃ末端で１つの極性アミノ酸である場合に作製され、および用いられることができ、および、前記非極性アミノ酸のジペプチドは、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択され、好ましくはグリシンまたはｇｌｙであり、ならびに、極性アミノ酸はセリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンから選択され、好ましくはセリンまたはｓｅｒである。ジペプチドｇｌｙ−ｓｅｒが、最も好ましい。ジペプチドは、任意の公知のペプチド、任意の毒性ペプチド、任意の殺虫性ペプチド、ＡｔｒａｘまたはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ、本明細書に開示される、前記ペプチドおよび配列番号の成熟型、プレ、およびプロペプチドのバージョンを含むその断片を有する任意の殺虫性ペプチド、配列番号６を含む毒性ペプチド、または、ＧＳＱＹＣ ＶＰＶＤＱ ＰＣＳＬＮ ＴＱＰＣＣ ＤＤＡＴＣ ＴＱＥＲＮ ＥＮＧＨＴ ＶＹＹＣＲ Ａ（配列番号５）を含む毒性ペプチドである、任意の成熟型殺虫性ペプチド、を含むペプチドの任意のものに操作可能に連結されることができる。
ジペプチドＧｌｙ−Ｓｅｒ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡまたはＧＧＧから選択されるジペプチドＧｌｙ−Ｓｅｒをコードするヌクレオチド、ＧｌｙならびにＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴおよびＡＧＣをコードする任意のもの、Ｓｅｒをコードする任意のもの、ならびに、任意のこのタンパク質に連結されるそれらヌクレオチド、プロセスおよび、プロセスの産物を記述し、クレームする。本明細書に開示される任意のペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端に操作可能に連結されるこれらペプチドをコードする、これらヌクレオチドを記述し、クレームする。
任意の殺虫性ペプチドのＮ末端への、任意のジペプチドの付加を含有する、酵母発現システムから産生される殺虫性ペプチドの産生量を増加させるためのプロセスを説明および開示する。産生量を増加させるための、プロセスおよびプロセスによる産物は、上述の項において検討されているジペプチドを用いた。
昆虫の電位依存性カルシウムチャネルおよびカルシウム活性化カリウムチャネルの両方を阻害する、オーストラリアジョウゴグモの任意の種類（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａを含む、Ａｔｒａｘ、または、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモから選択されるクモ）由来のペプチドを有する、任意の殺虫性ペプチドを伴う、手順、産物、プロセス、およびプロセスによる産物を具体的に検討する。また、有毒イソギンチャクの任意の種類由来のものを含むペプチド等の、ＩＣＫモチーフペプチドではない、殺虫性ペプチドを具体的に記述し、クレームする（我々は、非ＩＣＫである、ＣＲＩＰモチーフペプチドの例として、このタンパク質を呼称する）。Ａｎｅｍｏｎｉａ属のイソギンチャク由来のタンパク質（特に、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉｓの選択種由来のもの）で、この手順が機能することを開示し、検証し、および示す。我々は、この方法が、２０〜１００アミノ酸および２〜６ジスルフィド結合を含有する殺虫性ペプチドに機能すること、および、配列番号５、配列番号６、Ａｖ２およびＡｖ３と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである、殺虫性ペプチドに機能することの科学確実性を確信している。
限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａまたは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの任意の属の任意の種、および、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの任意の種を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種を含む、酵母の任意の種と共に用いられる手順を具体的に記述し、クレームし、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを我々は開示する。我々は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種が、以下の株から選択されることを具体的に開示する：ＩＮＶＳｃ１、ＹＮＮ２７、Ｓ１５０−２Ｂ、Ｗ３０３−１Ｂ、ＣＧ２５、Ｗ３１２４、ＪＲＹ１８８、ＢＪ５４６４、ＡＨ２２、ＧＲＦ１８、Ｗ３０３−１ＡおよびＢＪ３５０５。我々は、Ｐｉｃｈｉａの任意の種を含む、Ｐｉｃｈｉａ種、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ種であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを具体的に開示し、および、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは以下の株から選択される：Ｂｇ０８、Ｙ−１１４３０、Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＧＳ１９０、ＪＣ２２０、ＪＣ２５４、ＧＳ２００、ＪＣ２２７、ＪＣ３００、ＪＣ３０１、ＪＣ３０２、ＪＣ３０３、ＪＣ３０４、ＪＣ３０５、ＪＣ３０６、ＪＣ３０７、ＪＣ３０８、ＹＪＮ１６５、ＫＭ７１、ＭＣ１００−３、ＳＭＤ１１６３、ＳＭＤ１１６５、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ２４１、ＭＳ１０５、任意のｐｅｐ４ノックアウト株および、任意のｐｒｂ１ノックアウト株、ならびに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、以下の株から選択される：Ｂｇ０８、Ｘ−３３、ＳＭＤ１１６８およびＫＭ７１。我々は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓの任意の種を含有することを具体的に開示し、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓの株が、必ずしも必要ではないが、以下の株から選択されるものであっても良いことを教示する：ＧＧ７９９、ＹＣＴ３０６、ＹＣＴ２８４、ＹＣＴ３８９、ＹＣＴ３９０、ＹＣＴ５６９、ＹＣＴ５９８、ＭＷ９８−８Ｃ、ＭＳ１、ＣＢＳ２９３．９１、Ｙ７２１、ＭＤ２／１、ＰＭ６−７Ａ、ＷＭ３７、Ｋ６、Ｋ７、２２ＡＲ１、２２Ａ２９５−１、ＳＤ１１、ＭＧ１／２、ＭＳＫ１１０、ＪＡ６、ＣＭＫ５、ＨＰ１０１、ＨＰ１０８および、ＰＭ６−３Ｃ。さらに、我々は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ種が、ＧＧ７９９およびＹＣＴ３０６から選択されることを教示する。
我々は、限定されないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａおよび好ましくは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの任意の種を含む、任意の種のＨａｎｓｅｎｕｌａ種を含む、任意の種の酵母と共に用いられる場合の、手順を具体的に記述し、クレームする。我々は、限定されないが、Ｙａｒｒｏｗｉａおよび好ましくは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの任意の種を含む、任意の種のＹａｒｒｏｗｉａ種を含む、任意の種の酵母と共に用いられる場合の、手順を具体的に記述し、クレームする。我々は、限定されないが、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよび好ましくは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅの任意の種を含む、任意の種のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種を含む、任意の種の酵母と共に用いられる場合の、手順を具体的に記述し、クレームする。
＜パート３．この項において、「ＣＲＩＰＳ」および「ＰＦＩＰＳ」の組み合わせを記述する＞
多くの数の毒ペプチドが、「殺虫性」としての特性が明らかとなっている。しかしながら、多くの報告があるにもかかわらず、実際の殺虫剤または効果的な殺虫剤としての、市場での有用性が見出されているものはほとんど無い。実際に、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのみが、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｌｏｎｅ ｓｔａｒ ｔｉｃｋ Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ（アンブリオンマ−アメリカヌム）への経口投与による毒性が報告されている。他のクモ毒はいずれも、ダニの改変腸内でさえも、経口活性を有しているものは報告されていない。これらのペプチドの生物学的利用性は、例えばスノードロップレクチン（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓアグルチニン、ＧＮＡ）等の担体タンパク質へそれらを結合させることにより、増加しうることが報告されている。 Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ， Ａ．Ｋ．： Ｓｏｌｌｏｄ， Ｂ．Ｌ．； Ｗｉｋｅｌ， Ｓ．Ｋ．； Ｋｉｎｇ， Ｇ．Ｆ． “Ｏｒａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｃａｒｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏｓｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｐｉｄｅｒ ｖｅｎｏｍ．” Ｔｏｘｉｃｏｎ ２００６， ４７， １８２−１８７。にんにくレクチンは、中腸を横切る毒素の吸収を増加させることが報告されている。Ｆｉｔｃｈｅｓ， Ｅ ｅｔ． ａｌ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｓｃｉ．， ２００８， １５， ４８３−４９５、Ｆｉｔｃｈｅｓ， Ｅ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２００８， ３８， ９０５−９１５． Ｆｉｒｃｈｅｓ， Ｅ． ｅｔ． ａｌ．，Ｊ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００４， ５０， ６１−７１。例えば、殺虫性クモ毒Ｕ−ＳＧＴＸ−Ｓｆ１ａ（ＳＦＩ１）の、ＧＮＡへの融合により、トマトの蛾である、Ｌａｃｏｎｏｂｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ｔｏｍａｔｏ ｍｏｔｈ Ｌａｃｏｎｏｂｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）への経口毒性が増加し（ ｏｗｎ， Ｒ．Ｅ． ｅｔ． ａｌ．， Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ． Ｓｃｉ． ２００６， ６２，７７−８５）、ならびに、イネの茶色ウンカ（ｒｉｃｅ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ）および、ｐｅａｃｈ−ｐｏｔａｔｏ ａｐｈｉｄ Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅへの経口毒性が増加した。驚くべきことに、チオレドキシン−ω−ＨＸＴＸ−Ｈｖ１ａ融合タンパク質は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａおよび、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓの毛虫において、局所塗布による殺虫活性があることが判明した（Ｋｈａｎ ， Ｓ． Ａ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ２００６， １５， ３４９−３５７）。（ただし、融合タンパク質は、高レベルのイミダゾール（接触性の殺虫活性を有していることが公知の化合物）を含有する溶液中で局所塗布された）（Ｐｅｎｃｅ， Ｒ． Ｊ． Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ａｇｒｉｃ． １９６５， １３−１５）。これらの努力および発見により、毒素の経口生物学的利用性を増強させるための開発手段の重要性がはっきりと示唆される。本開示において、我々は、昆虫の腸に結合する担体タンパク質への殺虫性ペプチドの融合が不要であることを教示する。我々は、昆虫に、殺虫性ペプチド中の「毒素」を送達するためのより良い方法を提示する。学説に縛られることを望まないが、昆虫の腸内のレセプターへの選択結合により、ＰＦＩＰＳ（または孔形成殺虫性タンパク質）は作用するというのが我々の理論である。次いで、ＰＦＩＰＳは、次なる事象において、腸内膜上皮細胞の膜電位を破壊するように作用する。ＰＦＩＰＳが昆虫の腸に作用すると同時に、適切なＣＲＩＰまたはＴＭＯＦをもタイムリーに腸へ導入する場合、腸内膜の細胞にアポトーシスおよび死が結果としてもたらされる。ゆえに、腸内膜に穴が開けられ、それと同時に、毒性ペプチド（多くの場合、毒素から単離された大きなペプチド）が腸を通過し、標的昆虫を病気または殺すことができる。驚くべきことに、Ｂｔ様のＰＦＩＰが、ＣＲＩＰまたはＴＭＯＦ（毒性ペプチドであるが、例えばＢｔ等のＰＦＩＰＳの様には作用しない特性を有しているもの）との組み合わせで昆虫へ経口投与された際、Ｂｔタンパク質に対する抵抗性を発現した昆虫は、Ｂｔが低レベルの場合でさえも、防御および抵抗性は全く示さない。我々は、共に投与されたＣＲＩＰＳおよびＰＦＩＰＳのある組み合わせにより、ＣＲＩＰまたはＰＦＩＰＳのいずれかを個々に適用した場合の類似の濃度適用から予測されるものより、２倍以上の殺傷力および阻止能をもたらすことができることを示すデータを提示する。
ＰＦＩＰの例としては、Ｂｔ生物体由来のｃｒｙおよびＶＩＰタンパク質が挙げられる。ｃｒｙタンパク質様のＢｔタンパク質は、昆虫の腸膜を破壊し、腸内細菌叢による、昆虫の偶発的な感染（敗血症）をもたらす。腸内微生物がいない場合には、Ｂｔは殺虫性ではなくなる。Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ， Ｎｉｃｈｏｌｅ ＰＮＡＳ Ｖｏｌ． １０３， Ｎｏ． ４１ （２００６）。ゆえに、Ｂｔ死亡率（感染）をもたらすことが示されているメカニズムは、Ｂｔ抵抗性を示す昆虫においては緩和されると予測され、および、それら昆虫において、緩和されている。Ｂｔ抵抗性昆虫は、ｃｒｙ様の、高レベルのＢｔタンパク質を食餌に与えた際でさえも、腸の破壊をほとんど示さない。我々が驚きと伴に発見したことは、これらの昆虫の腸がどういうわけか、もはや腸に対してＢｔは劇的な効果を示さないにもかかわらず（すなわち、本当に抵抗性である）、あるタイプの殺虫性ペプチド（Ｂｔ様のＰＦＩＰＳとは全く異なる作用様式を有する、ＣＲＩＰＳおよびＴＭＯＦ様のもの）に曝されたとき、これまで非常に抵抗性であった昆虫が、もはや抵抗性ではなくなっていることである。「Ｂｔ抵抗性」昆虫における、抵抗性の消失は驚きであり、我々は、本明細書に提示される実施例において、データとともに、この出来事を示す。この結果は全くの予想外であった。しかしながら、我々はこれを理解し、この知識を用いて、Ｂｔ様タンパク質ＰＦＩＰの致死未満量が、どのようにしたら、２以上の殺虫性タンパク質の致死量未満量が共に投与されると、そのタンパク質の組み合わせにより、昆虫（大きすぎるか、または抵抗性でありすぎると想定される）が、毒性ペプチドに対して感受性となるような、致死的カクテルへと「転換される」ことができるのかを説明することができる。ＰＦＩＰ単独に対する昆虫の抵抗性が、ＣＲＩＰＳおよび、またはＴＭＯＦとのＰＦＩＰＳの組み合わせに対する抵抗性には寄与しないということは驚きである。ＰＦＩＰＳの作用メカニズムから、Ｂｔタンパク質様であるＰＦＩＰは、ＣＲＩＰＳおよび、またはＴＭＯＦとＰＦＩＰＳの組み合わせの毒性効果には、もはや貢献しないことが予期されたであろう。しかしそれどころか、反対の出来事が起こり、その組み合わせは、我々のデータで示されるように、予期される活性レベルよりも大きいレベルにあった。
昆虫は、Ｂｔに対する抵抗性を発現する。この抵抗性と戦う試みにより、多くの異なるサブタイプのＢｔが使用された。本明細書において、我々は、昆虫の抵抗性は、毒ペプチドの共適用により克服することができることを教示する。最も普遍的な抵抗性の様式（（モード１、前述の参照文献）Ｐｅｎｃｅ， Ｒ． Ｊ． “Ｔｈｅ ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ａｓ ａ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ．” Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ａｇｒｉｃ． １９６５， １３−１５）は、腸に並ぶＢｔ受容体の下方制御であり、昆虫を、腸内細菌叢による敗血症に罹りやすい状態にするには、受容体の数は不十分であるため、昆虫の抵抗性はＢｔ抵抗性昆虫において維持されるものと、予期されていた。我々が発見したこと、考えること、および我々のデータによって我々の理論が劇的に支持されること（以下の実施例を参照）は、Ｂｔ抵抗性昆虫でさえ、低レベルのＢｔに露出される膜の異常は十分に残っており、ある小さな「毒性」の殺虫性ペプチド（Ｂｔとは異なるタイプの作用機序を有する）と組み合わせると、驚くべきことに、Ｂｔ抵抗性昆虫は食事を止め、または死ぬことである。これは、腸内膜がまだ、これらの抵抗性昆虫において妨害されているためであり、殺虫性ペプチドのＣＲＩＰおよびＴＭＯＦ型のいずれかの、もっと小さな毒ペプチドの特性の通過を許可するのにちょうど十分であると我々は考えている。
本明細書において、我々は、幼虫駆除剤として特定されている、ＴＭＯＦペプチド、またはトリプシン介在オースタティック因子（ＴＭＯＦ）ペプチドを、殺虫性ペプチドのＣＲＩＰ型であるとはみなしていない（Ｄ． Ｂｏｒｏｖｓｋｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０６， ３８６９−３８７５参照）。我々は、ＣＲＩＰペプチドを、我々の本明細書における定義に従い、様々ンシステインを有するものとＣＲＩＰペプチドを定義する。ＴＭＯＦペプチドは、我々がＣＲＩＰペプチドと記述するモチーフに適合しない。ＣＲＩＰおよびＴＭＯＦの定義については、本明細書の始めのほうの、定義の項を参照にされたい。我々は、我々がＰＦＩＰＳと記述する、異なるタイプのタンパク質を有する、ＣＲＩＰおよび、またはＴＭＯＦタイプのタンパク質を組み合わせることについて検討する。
ＰＦＩＰＳは、孔形成殺虫性タンパク質であり、また、定義の項においても定義されている。ＰＦＩＰの１つのタイプの一例は、広く用いられている、Ｂｔ（例えば、ｃｒｙ、ｃｙｔおよびＶＩＰ）から誘導されるタンパク質の群の様々なタンパク質である。これらは、植物組込み型保護剤および葉面散布の両方の形態で農作物保護に用いられている、効果的な殺虫剤である。そのようなＢｔタンパク質の市販の製剤は、幼虫ステージにある昆虫を制御するために広く用いられている。
ＰＦＩＰＳとは対照的に、例えばインヒビトリーシステインノットまたはＩＣＫペプチド等のＣＲＩＰＳは、全く異なる群のペプチドであり、殺虫活性も有しているが、全く異なる作用機序で作用する。本明細書において、ＰＦＩＰタンパク質とＣＲＩＰタンパク質の重複は無く、２つの群は別であり、はっきりと区別できる。ＩＣＫペプチドおよび、非ＩＣＫペプチドでさえも、両方とも、本明細書においてはＣＲＩＰＳとみなされる。多くの場合、ＣＲＩＰＳは、天然型の生物学的標的種（通常、一部のタイプの昆虫またはクモ形類動物）に対して毒性がある。多くの場合、ＣＲＩＰペプチドは、例えば、サソリまたはクモの毒等の節足動物起源を有しており、この毒の起源は、ＩＣＫに良く共通している。ＣＲＩＰは、様々な方法で、その生理学的な作用部位へと送達されても良く、例えば、昆虫の腸または内部器官へと、注入により直接、毒を送達する、昆虫のいる場所に塗布して表面接触から取りこませる、または、食べ物から毒を昆虫に摂取させる（例えば、トランスジェニック植物上で昆虫が食餌をする）。
本明細書に記述されるペプチドは、いずれかの応用品として処方されても良く、または、トランスジェニック植物を介して、困難に直面しても良い。再現可能なペプチド構造およびフォールディングを有する、そのようなペプチドを商業規模で成功裏に生産することは困難である可能性がある。コストの制御は困難である可能性がある。多様性に富み、ユニークな特性があり、特別な性質のあるペプチドを、様々な可能性のある製造技術と組み合わせることにより、ペプチド産生の圧倒的多数の方法が提示される。市販品は、それ自身、大きな挑戦である。ペプチドは多くの場合、農作物の環境中で適用される際、不安定である。ＵＶ照射および他の因子により、多くの場合、数時間の短さで、Ｂｔ殺虫剤の環境中での急速な崩壊がもたらされる。さらに、商業的有効性も変化する可能性がある。製品でのＢｔスプレー、および植物組込み型保護剤として用いられるトランスジェニックＢｔタンパク質は両方とも、昆虫の抵抗性の発生に直面する。
昆虫の制御および農作物保護を増強させるために、急速な活性を増強させ、抵抗性パフォーマンスを改善し、または作用器官を延長させる製品が求められている。
我々は、本明細書において、様々な組み合わせでの、Ｂｔタンパク質およびＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドの組み合わせを提示する。我々はこれらの新規組み合わせを例示する。新たな組み合わせ、製品、方法およびそれらの製剤、ならびに、それらの使用について、本明細書に記述およびクレームする。
［相乗的な組み合わせにおける、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）］
システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、ジスルフィド結合を形成するシステインに富んだペプチドである。システイン−システインジスルフィド結合は、インヒビトリーシステインノットまたはＩＣＫペプチドの両方により例示される、および、ＩＣＫペプチドとはみなされないジスルフィド結合を有する毒性ペプチド（非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳ）（例えば、Ａｖ２およびＡｖ３のような、イソギンチャク由来のペプチド）の例により例示される、これら殺虫性ペプチドの毒性に重要な役割を果たしている。これらのシステイン−システインジスルフィド結合安定化毒素ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、環境中に曝された際、際立った安定性を有し得る。多くのＩＣＫペプチドが、例えばクモ、サソリおよびヘビ等の毒を有する動物から単離されており、昆虫に対して毒性がある。ＴＭＯＦペプチドは、殺幼虫活性を有することが知られている。Ａｖ２およびＡｖ３ペプチドは、イソギンチャクから単離される。我々はまた、昆虫の腸の内膜に作用する異なるペプチド群を記述する。我々は、これらのＰＦＩＰＳを孔形成殺虫性タンパク質とみなす。最も良く知られているＰＦＩＰＳの例は、Ｂｔタンパク質であり、その特異な殺虫活性と市販応用のために良く知られている。驚くべきことに、これらのペプチドの組み合わせ、ＰＦＩＰＳおよびＣＲＩＰＳが組み合わされ、共に腸内で作用するように投与された場合（その組み合わせの共投与は必要とされず、腸内での活性の組み合わせのみが必要とされる）、それらは昆虫制御に対し非常に有効となる。例えば、好ましい組み合わせの内の１つは、Ｂｔタンパク質とＩＣＫペプチドまたはイソギンチャクペプチドを組み合わせたものであり、それらは１つで予測されるものよりも非常に高い効力で、高い有効性の殺虫剤を生み出す。
我々は、ＣＲＩＰおよび／またはＴＭＯＦタイプの殺虫性タンパク質のいずれかと組み合わせた、ＰＦＩＰ（孔形成殺虫性タンパク質）の両方を含有する、殺虫性組み合わせペプチド組成物を記述する。ＣＲＩＰは、ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチド、および非ＩＣＫタンパク質等の殺虫性タンパク質を含むが、ＴＭＯＦペプチドはＣＲＩＰタンパク質とはみなされないことに注意されたい。ＣＲＩＰタンパク質は、例えばＡｖ２またはＡｖ３等のイソギンチャクで最初に同定されたタンパク質のような非ＩＣＫタンパク質を含むことができる。組成物は、ＣＲＩＰおよび、またはＴＭＯＦに対するＰＦＩＰの比率で、乾重量ベースで、およそ以下の比率の全てまたは任意のものであっても良い：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。また、我々は、ＣＲＩＰまたはＴＭＯＦに対するＰＦＩＰの比率（乾重量ベース）が、およそ以下の比率から選択されることを記述する：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および、０．０１：９９．９９または、これらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。ＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰおよびＴＭＯＦのいずれかが、Ｂｔと組み合わされて１００％のペプチドであっても良く、または、ＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドの両方のトータル１００％が、Ｂｔと組み合わされる、任意の組み合わせのいずれかペプチドであっても良い。
他の実施態様において、ＣＲＩＰまたはＴＭＯＦペプチドと組み合わされるＰＦＩＰの混合物の組み合わせとして、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰ、ＩＣＫおよび非ＩＣＫペプチド（ＰＦＩＰ、ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは両方のいずれかに対する細菌株起源、または２以上の異なるタイプから誘導される）のいずれか、または両方を含む。細菌株由来については、我々は、それら全てがもはや動物または細菌株から生じたものではないという意味で、多くのペプチドもまた人工物であるという理解と共に、ペプチドは、ペプチドを発現する細菌株により発現されていると記述されることができるということを意味する。
我々はまた、ＣＲＩＰまたはＴＭＯＦペプチドとの組み合わせでのＰＦＩＰの混合物、および、または、ＣＲＩＰ＋またはＴＭＯＦペプチドとの組み合わせでのＰＦＩＰの混合物のいずれかまたは両方が、２および５、２−１５、２−３０、５−１０、５−１５、５−３０、５−５０の間、および様々な他の異なるタイプまたは、タンパク質１または両方いずれかの細菌株由来から誘導される、組成物を開示する。我々は、タンパク質のいずれかまたは両方が、２〜１５の異なるタイプ、またはＣＲＩＰまたはＴＭＯＦペプチドとの組み合わせでのＰＦＩＰの１つまたは両方のいずれかの細菌株起源によりコードされる、組成物を開示する。そして、２−５、２−１５、２−３０、５−１０、５−１５、５−３０、５−５０の任意のこれらの組成物、および様々な他の異なるタイプ、およびＣＲＩＰまたはＴＭＯＦペプチドとの組み合わせのＰＦＩＰの混合物が、組成物に対する各株タイプの少なくとも１％以上を提供することができる。
我々は、請求項１〜６に記載のＢｔおよびＩＣＫ、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドまたは、ＢｔおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦの組成物を開示し、組成物中のＢｔおよびＩＣＫペプチド、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドのトータルの濃度が以下のパーセンテージ濃度から選択されることを記述する：０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９もしくは１００％、または、これらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端で連結されている、組成物を記述する。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端で連結され、ＥＲＳＰがＢＡＡＳである、組成物を記述する。
我々は、前記ペプチドの組成物が、殺虫性ＩＣＫに操作可能に連結されるジペプチドおよび、ＴＭＯＦペプチドのジペプチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ジペプチドは殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結され、ならびに、ここで、ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸、およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される、組成物を開示し、ジペプチドはグリシン−セリンである実施態様を含み、殺虫性ＩＣＫペプチドが、昆虫の電位依存性カルシウムチャネルおよびカルシウム活性価カリウムチャネルの両方を阻害する任意の殺虫性ペプチドである実施態様を含み、殺虫性ＩＣＫペプチドが、オーストラリアジョウゴグモの任意の種由来である実施態様を含み、クモが、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモから選択される実施態様を含み、クモが、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモから選択される実施態様を含み、クモが、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａのオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモから選択される実施態様を含み、殺虫性ＩＣＫペプチドが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである実施態様を含み、殺虫性ＩＣＫペプチドが、２０〜１００のアミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有する実施態様を含み、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが、本明細書に記述される任意のＩＣＫ配列に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである実施態様を含み、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが、参照により組み込まれる公表文献から選択される実施態様を含み、Ｂｔタンパク質が任意の殺虫性Ｂｔタンパク質である実施態様を含み、Ｂｔタンパク質が、ＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質である実施態様を含み、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２を有する殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７の組み合わせ、およびバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される実施態様を含み、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から選択される実施態様を含み、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質の組み合わせである実施態様を含み、Ｂｔタンパク質が、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８または３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する実施態様を含み、Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌである実施態様を含み、Ｂｔタンパク質がＴｈｕｒｉｃｉｄｅである実施態様を含む。
以下のヌクレオチド：Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質；および、形質転換植物または植物ゲノム中の殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチド、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチド、を含有する組成物を開示し、ここで、ＩＣＫに対するＢＴ、およびＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドの比率（乾重量ベース）は、およそ以下の比率から選択される：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。
我々は、形質転換植物または植物ゲノムを開示し、ここで、ＩＣＫに対するＢｔ、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、または、ＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドに対するＢｔの比率（乾重量ベース）は、およそ以下の比率から選択される：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。形質転換植物または植物ゲノムは、Ｂｔのいずれかまたは両方を有していても良く、および、ＩＣＫペプチドは、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドの２以上の異なるタイプ、または細菌株起源から誘導されており、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方は、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドのいずれかの２〜５の間の異なるタイプ、または細菌株起源から誘導されており、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方は、２〜５の間の異なるタイプまたは株起源から誘導されており、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかもしくは両方は、ＢｔおよびＩＣＫぺプチドのいずれかまたは両方の２〜１５の異なるタイプ、または細菌株起源から誘導されており、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方は、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーにコードされており、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかもしくは両方は、Ｂｔおよび／またはＩＣＫペプチドの２以上の異なるタイプまたは細菌株起源から誘導されており、全てのＢｔおよび／またはＩＣＫペプチドの株は、前記組成物に対する各株タイプの少なくとも１％超を与え、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方は、ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかもしくは両方の２〜５の異なるタイプまたは細菌株起源から誘導され、そしてＢｔもしくはＩＣＫのいずれか、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方の内の少なくとも１つの株は、ＩＣＫ遺伝子のＢｔの２以上のコピーによりコードされ、または、組成物中のＢｔおよびＩＣＫペプチドのトータルの濃度は、以下のパーセンテージ濃度から選択することができる：０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９もしくは１００％、または、これらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
本明細書に記述される組成物および植物は、殺虫性ＩＣＫペプチドまたはＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結される、ＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される、殺虫性組み合わせペプチドを含み、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫまたはＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結されている。他の実施態様において、殺虫性組み合わせペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結される、ＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫのＮ末端に連結され、ここで、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。他の実施態様においては、本明細書に記述されるヌクレオチド由来の組み合わせペプチドを組込み、および発現するトランスジェニック植物であり、ここで、前記組み合わせペプチドは、殺虫性ＩＣＫまたはＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されるジペプチドを発現するヌクレオチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結され、および、ここで、ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸および、ジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される。他の実施態様において、トランスジェニック植物は、グリシン−セリンのジペプチドを有している。他の実施態様において、トランスジェニック植物は、ＩＣＫおよびＢｔタンパク質の殺虫性ペプチド組み合わせから構成される、発現された殺虫性ＩＣＫペプチドを有している。トランスジェニック植物は、オーストラリアジョウゴグモの任意の種、またはＡｔｒａｘまたはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅＯｋｕ ｎｏオーストラリアジョウゴグモ、およびオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ由来の殺虫性ＩＣＫペプチドを有していても良い。
我々は、発現される殺虫性ＩＣＫペプチドが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａであり、および、または、発現される殺虫性ＩＣＫペプチドが２０〜１００アミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有し、および、または、殺虫性ＩＣＫペプチドが、本明細書に記述される任意のＩＣＫペプチドと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである、トランスジェニック植物を記述し、クレームする。記述されるトランスジェニック植物は、Ｂｔタンパク質がＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質であり、および／または、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２を有する殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７の組み合わせ、およびバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、ペプチドを含む、任意の公知のＢｔタンパク質を含有しても良い。Ｂｔタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａの組み合わせから選択されても良く、または、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８または３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する。我々は、Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌであるトランスジェニック植物を記述し、および、我々は、Ｂｔタンパク質がＴｈｕｒｉｃｉｄｅであるトランスジェニック植物を記述する。
我々は、本明細書に記述されるペプチドを発現する形質転換植物を具体的に記述およびクレームし、ここで、ＢｔおよびＩＣＫペプチド、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、または、ＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドの平均濃度が、形質転換植物の平均的な葉において、およそ、以下である：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％、または、これらの値の任意の２つの間の任意の範囲。我々は、形質転換植物において適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現する形質転換植物を具体的に記述し、クレームする。我々は、形質転換植物において適切にフォールディングされた組み合わせ毒性ペプチドを発現し、および、発現され、適切にフォールディングされた毒性ペプチドの前記植物における蓄積をもたらし、および、植物の産生量の増加または昆虫による障害に対する抵抗性の増加をもたらす、形質転換植物を具体的に記述ならびにクレームし、それらは農作物や林業における害虫を制御する。我々は、本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物を記述する。
我々は、本明細書に開示される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、または、本明細書に開示される教示により当業者に作製されうるヌクレオチドを含有する、形質転換植物に組み込まれた機能的発現カセットを有する実施態様を含む、本明細書に記述される任意のペプチドを発現する任意のヌクレオチドを含有する発現カセットを記述する。我々は、本明細書に記述される任意のペプチドを有する、または発現する形質転換植物の作製のための手順を記述およびクレームする。
我々は、植物を作製するための、または植物へこれらのペプチドまたはヌクレオチドを形質転換するための、本明細書に記述される任意のペプチドまたはヌクレオチドの使用を記述し、植物においてこれらのタンパク質、および／または、任意のペプチドを含有する発現カセットを作製するための方法および技術を記述し、植物ゲノムへとそれらを形質転換するための方法を記述し、任意の記述されたペプチドまたはヌクレオチドを使用、作製、植物へと形質転換する任意の方法を記述し、任意のペプチドを有する、または発現する形質転換植物および記述される任意のペプチドおよびその対応するヌクレオチドを含有する植物の機能的発現カセットを作製するための方法および技術を記述し、ならびに、本明細書に記述される産物およびプロセスにより作製される任意の植物を記述する。
一部の実施態様において、我々は、本明細書に記述される核酸または発現カセットに操作可能に連結される、植物において活性状態となるプロモーターを含有するキメラ遺伝子を記述する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを作製、製造、または使用する方法を開示する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを含有する組換えベクターを記述する。我々は、組換えベクターを作製、製造、または使用する方法を開示する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを含有するトランスジェニック宿主細胞、および、トランスジェニック宿主細胞（トランスジェニック植物細胞であっても良い）を作製、製造または使用する方法を開示し、我々は、そのようなトランスジェニック植物を作製、製造または使用する方法を開示し、ならびに、トランスジェニック植物細胞を含有するトランスジェニック植物を作製、製造または使用する方法開示し、ならびに、トランスジェニック植物をどのように作製および使用するかを開示する。我々は、トウモロコシ、大豆、綿花、イネ、モロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモまたはトマトから誘導される、本明細書に記述される特性を有する、トランスジェニック植物および種子を開示する。トランスジェニック種子は、本明細書に記述されるキメラ遺伝子を有していても良い。我々は、本開示のトランスジェニック植物および、または、種子を作製、製造、または使用する方法を記述する。
我々はまた、本発明を使用する方法を記述し、新規製剤を提示する。本発明は、昆虫の制御に最も有用である。我々は、以下を含有する昆虫を制御する方法を記述する：Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質を前記昆虫に適用する；および、殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシステインノット）ペプチドを前記昆虫に適用する。本方法は、Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチド、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチド、が、同じ組成で、同じ時間に、共に適用されて使用されても良く、または、異なる時間に、異なる組成で、別々に適用されて使用されても良い。Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチド、および、または、ＴＭＯＦペプチドは、連続的に適用されても良く、および、（Ｂｔタンパク質）抵抗性昆虫に適用されても良い。ＩＣＫに対するＢｔ、またはＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、少なくともおよそ以下の比率から選択されても良い：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および、１：９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。ＩＣＫに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択されても良い：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および、０．０１：９９．９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方が、ＢｔおよびＩＣＫペプチド、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドの２以上の異なるタイプ、または細菌株起源から誘導される。ＢｔおよびＩＣＫ、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドのいずれかまたは両方が、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドのいずれか、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方の２〜５の異なるタイプ、または細菌株起源から誘導される。ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれか、または両方が、ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方の２〜１５の異なるタイプ、または細菌株起源から誘導され、および、ＢｔもしくはＩＣＫのいずれか、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方の内の少なくとも１つの株が、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーによりコードされる。ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれか１つまたは両方が、Ｂｔおよび／またはＩＣＫペプチドの、２以上の異なるタイプまたは細菌株起源から誘導され、全てのＢｔおよび／またはＩＣＫペプチドの株は、前記組成中の各株タイプ由来のペプチドの少なくとも１％超に貢献する。ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれか、または両方が、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれか１つまたは両方の、２〜５の異なるタイプまたは細菌株起源から誘導され、ＢｔもしくはＩＣＫのいずれか、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方の内の少なくとも１つの株は、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーによりコードされる。組成物中のＢｔおよびＩＣＫ、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチド、またはＢＴおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドのトータルの濃度は、以下のパーセント濃度から選択される：０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９もしくは１００％、または、これらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
本方法は、殺虫組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチド、またはＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される場合に使用されても良く；ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されている。一部の実施態様において、用いられる殺虫性組み合わせペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ＥＲＳＰは殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結され、ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。
本明細書に記述される任意のペプチドおよび植物を用いて昆虫、それらの増殖および損害、特に植物に対するその損害を制御することができる。Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチドの組み合わせは、植物、または昆虫のいる位置、または保護が必要な植物の位置 への散布により適用されても良い。
我々はまた、以下を含有する製剤を記述する：Ｂｔタンパク質；殺虫性ＩＣＫ、および、または、殺虫性ＴＭＯＦ（それらは、本明細書に記述される任意の組成物を含有することができ、または、本開示により当業者により作製されることができる）。記述される製剤の一部には、極性非プロトン性溶媒、および、または水の使用が含まれ、ならびに、または、その場合には、極性非プロトン性溶媒が、１〜９９ｗｔ％の量で存在し、極性プロトン性溶媒が、１〜９９ｗｔ％の量で存在し、および、水が、０〜９８ｗｔ％の量で存在する。製剤には、Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌであり、殺虫性ＩＣＫペプチドがハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドである、製剤が含まれる。極性非プロトン性溶媒製剤は、特に、ＭＳＯを含有する場合に有効である。ＭＳＯは、メチル化種子油であり、大豆油のメチルエステルを石油の約８０〜８５パーセントの量で使用する界面活性剤の混合物である（１５〜２０パーセントの界面活性剤を含有）。
本開示により、適切なＣＲＩＰタイプペプチド、ＩＣＫペプチド、非ＩＣＫ ＣＲＩＰペプチドおよびＴＭＯＦペプチド、さらに、多くのタイプのＰＦＩＰ型ペプチド（例えば、ＢｔおよびＶＩＰタンパク質およびペプチド）の多くの例が提示され、組み合わされた場合、新規の殺虫性製品が提示され、および、これらは、本明細書において、「組み合わせペプチド」と呼称されうる。本発明の使用に適切なペプチドが本明細書に記述されており、具体的な例は、配列表に記述されている。配列表のペプチドは、本発明を解説するための例示としてのみ提示されるものであり、当業者に説明および意図を提示するためのものである。配列表は、全てのＣＲＩＰＳ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳおよびＴＭＯＦの全長および完全なリストを提示してはおらず、全てのＰＦＩＰＳの全長および完全なリストを提示してはいないことを理解されたい。直接塗布された組み合わせペプチドで昆虫を処理しても良く（例えば、昆虫またはその位置へのスプレー）、または、組み合わせペプチドを間接的に適用しても良く、例えばトランスジェニック植物内に送達しても良い。最初に、我々は、ＩＣＫ様のＣＲＩＰペプチドの詳細な記述および実施例を提示し（セクションＩ）、および、これらはまた、上記にも提示されている。次いで、我々は、ＴＭＯＦペプチドの詳細な記述および実施例を提示する（セクションＩＩ）。次に、我々は、Ｂｔタンパク質の詳細な記述および実施例を提示する（セクションＩＩＩ）。応用は、本特許およびクレームされた発明を解説するための手段として、これら実施例を提示するものであり、その範囲を限定するものではないことを理解されたい。任意の適切なＢｔタンパク質およびＩＣＫペプチドまたはＴＭＯＦペプチドを、記述される方法で組み合わせ、効果的な殺虫剤を得ることができるであろう。ＩＣＫおよびＢｔタンパク質の記述の後、出願人は、様々な殺虫剤組成物を記述する（セクションＩＶ）。ＩＣＫおよびＢｔタンパク質の両方を用いた植物形質転換を記述する（セクションＶ）。ＣＲＩＰおよびＢｔの組み合わせを記述および例示する（セクションＶＩ）。ＴＭＯＦおよびＢｔタンパク質の組み合わせを記述する（セクションＶＩＩ）。我々は、どのようにＩＣＫおよびＢｔタンパク質を組み合わせ、高い有効性の殺虫剤を作製するかを、本明細書に結果とデータを提示しながら、非限定的な例および記述として提示する。
［セクションＩ．ＩＣＫモチーフペプチドまたはＩＣＫペプチド］
「ＩＣＫモチーフ」、「ＩＣＫモチーフタンパク質」、「インヒビターシスチンノットモチーフ」、「毒性昆虫ＩＣＫペプチド」、または、「ＩＣＫペプチド」とは、３つのジスルフィド架橋を有する少なくとも６半シスチンコアアミノ酸を伴う、１６〜６０アミノ酸ペプチドを意味し、ここで、３つのジスルフィド架橋は、共有結合であり、６半シスチン残基の共有ジスルフィド結合は、Ｎ末端アミノ酸から開始する６つのコア半シスチンアミノ酸の、第一および第四、第二および第五、ならびに、第三および第六半シスチンの間である。ＩＣＫモチーフはまた、βヘアピン二次構造を含有し、通常、モチーフの第五および第六コア半システインの間に位置する残基から構成され、ヘアピンは、モチーフの３つのジスルフィド結合によりもたらされる構造的架橋により安定化される。追加のシステイン／シスチンまたは、半シスチンアミノ酸が、インヒビターシスチンノットモチーフの内に存在しても良いことに注意されたい。
このモチーフは、多くの種類の毒から単離されるペプチドにおいて共通のものである。無脊椎種としては、クモおよびサソリが挙げられ、他の例も多くあり、ヘビ毒でさえ、ＩＣＫモチーフを有するペプチドを有していることが知られている。殺虫性ＩＣＫペプチドの具体的な例は、本明細書および公表文献および特許出願に開示される「Ｕペプチド」およびそのホモログであり、オーストラリアジョウゴグモの毒が起源である。これらのタンパク質はまた、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ由来のＡＣＴＸと呼称されるが、本明細書に記述される手順は、ＩＣＫモチーフを有する任意のタンパク質対し有用であり、適用されても良い。以下の文献は、その全体で、米国において参照により組み込まれ、当業者に公知であり、全て公開されている。
ＩＣＫモチーフタンパク質を有するペプチド毒素の例は、以下の参照文献に見出すことができる。Ｎ型カルシウムチャネル阻害物質ωコノトキシン（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）は、Ｌｅｗ， Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ω−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ ＧＶＩＡ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２７２， Ｎｏ． １８， Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｍａｙ ２， ｐｐ． １２０１４−１２０２３， １９９７によりレビューされている。多くの節足動物毒素ＩＣＫペプチドの様々なクモおよびサソリ種での要約は、Ｑｕｉｎｔｅｒｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ａｎｄ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” Ｔｏｘｉｃｏｎ， ５８， ｐｐ． ６４４−６６３， ２０１１にレビューされている。ＮＭＲ分光法を用いたハナトキシン１（Ｈａｎａｔｏｘｉｎ１）の３次元構造により、インヒビターシスチンノットモチーフとして特定された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈａｎａｔｏｘｉｎ１， ａ ｇａｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ： ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇａｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｔｏｘｉｎｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２９７， Ｉｓｓｕｅ ３， ３１ Ｍａｒｃｈ ２０００， ｐｐ． ７７１−７８０）。サソリ毒ＩＣＫ毒素ペプチド、オピカルシン１（Ｏｐｉｃａｌｃｉｎｅ１）をコードするｃＤＮＡの単離および同定は、Ｚｈｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ” ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ２００３ Ｓｅｐ １７， （１２）：１７６５−７， Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｌ ３に公表された。イソギンチャク、Ｂｕｎｏｄｏｓｏｍａ ｇｒａｎｕｌｉｆｅｒａ由来のＢｇＫ、Ｋ＋チャネル阻害毒素の配列特異的アサインメントおよび二次構造の特定は、Ｄａｕｐｌａｉｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｏｘｉｎｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９７ Ｆｅｂ １４； ２７２（７）： ４３０２−９により開示された。ポリペプチド毒素の構造、作用機序、ならびにシスチン架橋、シスチンノット形成および「ノッティングタイプ」フォールディングを示す分子進化に充填を置いたクモ毒の組成および薬理学に関するレビューは、Ｅｓｃｏｕｂａｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｖｅｎｏｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ” Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｖｏｌ． ８２， Ｉｓｓｕｅｓ ９−１０， １０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０００， ｐｐ． ８９３−９０７に公開された。サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ）毒由来の精製ペプチド、イベリオトキシン（ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ）、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルの阻害物質は、Ｇａｌｖｅｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ， ｐｏｔｅｎｔ， ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｒｏｍ ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９０ Ｊｕｌ ５； ２６５（１９）： １１０８３−９０に開示された。サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）毒由来の精製ペプチド、Ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルの阻害物質は、Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ， ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， １９８８ Ｍａｙ； ８５（１０）： ３３２９−３３３３に開示された。これらおよび他の公開文献より、当業者であれば、我々がＩＣＫモチーフ、ＩＣＫモチーフタンパク質、または「インヒビターシスチンノットモチーフ」として記述するものを有するタンパク質およびペプチドを容易に特定することが可能であろう。
ＩＣＫモチーフタンパク質は、ＩＣＫモチーフを有する任意のタンパク質であっても良く、１６〜６０の間のアミノ酸の長さがあり、適切な順序で共有架橋ジスルフィド結合を生み出す、少なくとも６つのシステイン残基を有する。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は、２６〜６０アミノ酸の長さの間である。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は、１６〜４８アミノ酸の長さの間である。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は、２６〜４８アミノ酸の長さの間である。一部のＩＣＫモチーフタンパク質は、３０〜４４アミノ酸の長さの間である。天然の殺虫活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質が好ましいが、例えば塩耐性および霜耐性等の他のタイプの活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質も当業者に公知であり、本明細書にクレームされる。殺虫性ＩＣＫモチーフタンパク質の例としては、ＡＣＴＸペプチドおよび遺伝子が挙げられ、および、Ｍａｇｉ６として知られる全てのペプチドおよびそのコード遺伝子が含まれる。
殺虫性ＩＣＫモチーフタンパク質の例としては、ＡＣＴＸペプチドおよび遺伝子、ならびに、本明細書および上述の参照文献に記述される全てのペプチドおよびそのコード遺伝子が挙げられる。決して限定の意図ではなく、例示の目的でのＩＣＫモチーフタンパク質およびペプチドの具体的な例は、上述のペプチドおよびそのホモログであり、特に、オーストラリジョウゴグモの毒由来のペプチドおよびヌクレオチドである。以下の文献は、その全体で、米国において参照により組み込まれ、当業者に公知であり、すでに公表されている。それらは多くのＩＣＫモチーフタンパク質を開示しており、その全長ペプチド配列、前腸ヌクレオチド配列が具体的に開示され、参照により組み込まれ、さらに、全ての開示が、その配列表の全ても含み、参照により組み込まれる。その配列表は公知であり、公開されている。以下を参照のこと：２００８年４月８日に発行された、米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号、特に、米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号からの配列表にリストアップされるペプチドおよびヌクレオチドの配列（配列番号３３〜７１）、および、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられたものであり、２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができるこれら、および他の毒素、およびその変異体、および米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号の図２、カラム４〜９に現れるペプチド。他の具体的な配列は、欧州特許第１ ８１２ ４６４ Ｂ１号（２００８年１０月８日に公開および特許付与、公報2008/41参照）に見出すことができ、特に、配列表にリストアップされるペプチドおよびヌクレオチド配列、および、２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる他の毒素、および、配列番号３３〜７１の配列、およびＵ−ＡＣＴＸポリぺプチドと名付けられた配列およびその変異体、欧州特許第１ ８１２ ４６４ Ｂ１号の段落００２３〜００５５に現れるペプチド（欧州特許第１ ８１２ ４６４ Ｂ１号の図１を参照）である。
本明細書に言及される、またはそのような配列と相同性を有する、言及される配列のホモログ変異体が、本明細書に特定されるペプチドの開示のために、記述され、参照により組み込まれ、それらはまた、本明細書に記述されるプロセスにより特に作製するために適したものとして特定され、およびクレームされ、それらには、本明細書に開示される任意の配列または参照により組み込まれる任意の配列に対し、少なくとも任意の以下のパーセントの同一性を有する、全てのホモログ配列が含まれる：上述の特許中に特定される任意の、および全ての配列、および本明細書に特定される任意の他の配列（本出願の配列表にある、ありとあらゆる配列を含む）に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または、９９％以上の同一性、または１００％の同一性。相同の（ホモログの、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または相同性（ホモロジ―、ｈｏｍｏｌｏｇｙ）という用語が本明細書において、例えば５０％以上等の数字と共に用いられる場合、その意味するところは、２つのペプチド間の同一性パーセントまたは類似性パーセントである。相同の、または相同性が、数字のパーセントが無く用いられる場合は、２つのペプチド配列が、共通の物理的および機能的な特徴（局所毒性およびサイズの類似のような特徴）において、進化的、または発生的な面で非常に近しい関係にあるということを指す（すなわち、本明細書において、または上述の参照により具体的に言及されるペプチドの、１００％のより大きい長さ、または５０％のより短い長さの内にある相同性）。
本明細書に特定されるペプチドを記述するために、以下を含む毒性ＩＣＫペプチドが記述および参照により組み込まれる：Ｕペプチドおよびその変異体；Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは突然変異体もしくは変異体として知られる毒素を含む、Ａｔｒａｘ、または、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅの属のクモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａの属種または、ブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓを含む）に見出され、単離され、または誘導されるもので、特に、任意のこれらのタイプのペプチドおよび特に、約２００アミノ酸未満だが約１０アミノ酸超のもの、および特に、約１５０アミノ酸未満だが約２０アミノ酸超のペプチド、特に、約１００アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約６５アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約５５アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約３７または３９または約３６〜４２アミノ酸のペプチド、特に、約５５アミノ酸未満であるが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約４５アミノ酸未満であるが約３５アミノ酸超のペプチド、特に、約１１５アミノ酸未満であるが約７５アミノ酸超のペプチド、特に、約１０５アミノ酸未満であるが約８５アミノ酸超のペプチド、特に、約１００アミノ酸未満であるが約９０アミノ酸超のペプチドで、２、３および、または４以上の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる、本明細書に言及される任意の長さのペプチド毒素を含み、カルシウムチャネル流を破壊する毒素を含み、カリウムチャネル流を破壊する毒素を含み、特に、昆虫カルシウムチャネルまたはそのＵｓを破壊する毒素、特に、任意のこれらのタイプの毒素またはその変異体、および局所殺虫活性または経口殺虫活性を有する、本明細書に記述される任意のタイプの毒素の任意の組み合わせ、が本明細書に記述されるプロセスにより具体的に作製することができる。
オーストラリアジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ、および、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅの属由来のＵペプチドは、本発明に記述される方法、手順またはプロセスによる組み合わせにセットされた場合に特に適しており、良く作用する。そのような適した検証ペプチドの例を、本明細書にデータと共に提示する。以下の種もまた、本発明のプロセスにより具体的に作製されるのに適した毒性ＩＣＫペプチドを担持することが具体的に知られている。具体的な種の名称は以下：Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｉｎｆｅｎｓａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ。上述の任意の属および／または属種から誘導される任意の毒性ＩＣＫペプチド、およびＵペプチドのホモログは、本発明におけるプロセスにより具体的に作製されるのに適している。
本明細書の実施例は、本発明の限定を意図しておらず、および限定のために用いられてはならず、本発明の解説のためにのみ、提示されている。
上述のように、多くのペプチドが、Ｂｔタンパク質の組み合わせに適した候補となる。上述の配列、以下に記述される配列、および配列表の配列は、特に、具体的に作製できる適格なペプチドであり、これらの内一部は、以下の実施例に示される結果と共に、本発明に従い、具体的に作製されている。
毒性ＩＣＫ昆虫ペプチドの例は良く知られており、多くの参照文献中に見出すことができる。それらは、そのペプチドの性質および活性（通常は、経口または注入の殺虫活性）により特定することができる。本明細書において、我々は、本発明をより良く解説し、記述するために、いくつかの例を提示するが、本発明はこれらの例に限定されない。これら、および本明細書に示されない他の例の全ては、新規物質を説明するものであり、本明細書において最初に記述され、クレームされるものである。
毒性ＩＣＫ昆虫ペプチドは、５アミノ酸残基より長く、３０００アミノ酸残基より短いペプチドである。分子量は、約５５０Ｄａ〜約３５０，０００Ｄａの範囲にある。毒性ＩＣＫ昆虫ペプチドは、いくつかのタイプの殺虫活性を有している。典型的には、昆虫に注入された際に活性を示すが、ほとんどは、昆虫の局所に塗布された場合には明らかな活性を有しない。毒性ＩＣＫ昆虫ペプチドの殺虫活性は、様々な方法で測定される。普遍的な測定法は、当業者に広く知られている。そのような方法として、限定されないが、様々なパラメータ（例えば、麻痺、死亡率、体重減少等）のスコアリングに基づいた用量応答プロットのフィッティングによる、メジアン応答容量（例えば、ＬＤ５０、ＰＤ５０、ＬＣ５０、ＥＤ５０）の測定が挙げられる。測定は、問題となっている殺虫製剤の様々な用量に曝された昆虫のコホートに対して行っても良い。データ分析は、プロビット解析および／またはＨｉｌｌ Ｅｑｕａｔｉｏｎ等により定義される曲線を作成することによりなされても良い。そのような場合、皮下注射、低圧注入、食物または餌等の試料の一部として殺虫製剤を与えることにより、用量が投与される。
毒性ＩＣＫ昆虫ペプチドまたはＩＣＫペプチドは、皮下注射、低圧注入または経口（すなわち、昆虫に提供される食物試料の一部として摂取することによる）のいずれかで昆虫へと送達されることで、殺虫性を示す全てのペプチドとして本明細書において定義される。ゆえに、この種のペプチドには、限定されないが、クモ、ダニ（ｍｉｔｅｓ）、サソリ、ヘビ、カタツムリ等の毒の成分として自然に産生される多くのペプチドが含まれる。この種にはまた、限定されないが、植物により産生される様々なペプチド（例えば、様々なレクチン、リボソーム不活化タンパク質およびシステインプロテアーゼ等）、および、昆虫病原性細菌により産生される様々なペプチド（例えば、様々なＢａｃｉｌｌｕｓ種により産生されるタンパク質のＣｒｙ１／Ｂｔタンパク質ファミリー等）が含まれる。
殺虫性ペプチドは、例えばクモの毒等の殺虫性毒から選択されても良い。クモは、オーストラリアジョウゴグモでも良い。ペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ-Hv１ａおよびそのアナログを含む、ＡｔｒａｘまたはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅの属由来のものであっても良い。クモ由来の具体的なペプチドの例は、本明細書に提示される配列表に記述される。これらのペプチドは、本明細書に記述される手順を用いてＢｔタンパク質と組み合わされても良い。
（ＩＣＫペプチド配列の例）
以下の文献は、その全体で米国において、許可される他の法域において、参照により組み込まれ、発行され周知の知識となっている。さらに、それらは参照により援用され、ペプチド配列が記述される範囲で、その配列表に関して具体的に公知となっている。以下を参照のこと。
米国特許：
米国特許第５，７６３，５６８号
１９９８年６月９日に発行され、その全体、特に配列表にある配列および、配列番号３３〜５８のもの、および「カッパ」または「オメガ」毒素として知られているもの（２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができるものを含む）ならびに、カラム２および４、ならびに表５、ならびに図５、図１５、図１６、図１７、図１８にあるペプチド、が本明細書に組み込まれる。
米国特許第５，９５９，１８２号
１９９９年９月２８日に発行され、その全体、特に配列表にある配列および、配列番号３３〜５８のもの、および「カッパ」または「オメガ」毒素として知られているもの（２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる毒素を含む）ならびに、カラム２および４、ならびに表５、ならびに図５、図１５、図１６、図１７、図１８にあるペプチド、が本明細書に組み込まれる。
米国特許第６，５８３，２６４ Ｂ２号
２００３年６月２４日に発行されたもの、および、
米国特許第７，１７３，１０６ Ｂ２号
２００７年２月６日に発行されたもの、
が、その全体、特に配列番号１、「オメガ−アトラコトキシン（ａｔｒａｃｏｔｏｘｉｎ）−Ｈｖ2ａ」または「ω−アトラコトキシン−Ｈｖ２ａ」と名付けられたもの（２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる毒素を含む）が、本明細書に援用される。
米国特許第７，２７９，５４７ Ｂ２号
２００７年１０月９日に発行され、その全体、特に配列表にあるペプチド配列および、配列番号３３〜６７のもの、およびω−アトラコトキシン−Ｈｖ２ａの変異体、２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる毒素、ならびに、明細書の４〜８カラムおよび図３、図４にあるペプチドが、本明細書に組み込まれる。
米国特許第７，３５４，９９３ Ｂ２号
２００８年４月８日に発行され、その全体、特に配列表にある配列および、配列番号３３〜７１のもの、およびＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられたもの、２〜４の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる毒素、およびその変異体、ならびに、明細書の４〜９カラムおよび図１にあるペプチドが、本明細書に組み込まれる。
欧州特許第１ ８１２ ４６４ Ｂ１号
２００８年８月１０日、公報２００８／４１に公開および特許付与され、その全体、特に配列表にあるペプチド配列、２〜４のジスルフィド架橋を形成することができる毒素、ならびに、配列番号３３〜７１のもの、ならびに、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられたもの、およびその変異体、ならびに、００２３〜００５５段落および図１にあるペプチドが、本明細書に組み込まれる。
言及される配列の相同な変異体は、本明細書に特定されるペプチドに対する参照により記述され、および組み込まれ、そのような配列、または本明細書に言及される配列に対して相同性を有し、また、本明細書に記述されるプロセスにより具体的に作製するのに適したものとして、特定およびクレームされ、それらには、限定されないが、本明細書に開示される任意の配列に対して、または参照により組み込まれた任意の配列に対して、少なくとも以下の同一性パーセントのいずれかを有する相同な配列を含む、全ての相同な配列が含まれる：上述の特許において特定される任意の、および全ての配列に対して、ならびに、本明細書に特定される任意の他の配列（本出願の配列表にあるあらゆる配列を含む）に対して、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の同一性。例えば３０％以上という数字と共に、相同な、または相同という用語が本明細書において用いられる場合、その意味するところは、２つのペプチドの間の同一性のパーセントまたは類似性のパーセントである。数字のパーセントが無く、相同な、または相同という用語が用いられた場合、２つのペプチド配列が、物理的および機能的な特徴（局所毒性および、１００％より大きい長さ、または５０％より短い長さまたはペプチド等のサイズの類似のような特徴）を共有しているという点において、進化的、または発生的な態様で非常に近しい関係にあるということを指す。
上記で参照された米国特許文献および欧州特許文献において言及された任意の源に由来する、本明細書に特定されるペプチドに対して、参照により記述され、および組み込まれるものは、限定されないが、以下を含む：植物および昆虫から単離された毒素、特に、クモ、サソリおよび、昆虫からそれ自身を防御する、または捕食する植物由来の毒素であり、例えば、ジョウゴグモ、および特にオーストラリアジョウゴグモ等であり、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅの属（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａの属種、または、ブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓを含む）に見出され、単離され、または誘導された毒素を含み、「アトラコトキシン」、「コ−アトラコトキシン」、「カッパ」アトラコトキシン、「オメガ」アトラコトキシン（ωアトラコトキシンとしても知られる）、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたはその突然変異体もしくは変異体として知られる毒素を含み、特に、任意のこれらのタイプのペプチドおよび特に、約２００アミノ酸未満だが約１０アミノ酸超のもの、および特に、約１５０アミノ酸未満だが約２０アミノ酸超のペプチド、特に、約１００アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約６５アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約５５アミノ酸未満だが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約３７または３９または約３６〜４２アミノ酸のペプチド、特に、約５５アミノ酸未満であるが約２５アミノ酸超のペプチド、特に、約４５アミノ酸未満であるが約３５アミノ酸超のペプチド、特に、約１１５アミノ酸未満であるが約７５アミノ酸超のペプチド、特に、約１０５アミノ酸未満であるが約８５アミノ酸超のペプチド、特に、約１００アミノ酸未満であるが約９０アミノ酸超のペプチドで、２、３および、または４以上の鎖内ジスルフィド架橋を形成することができる、本明細書に言及される任意の長さのペプチド毒素を含み、カルシウムチャネル流を破壊する毒素を含み、カリウムチャネル流を破壊する毒素を含み、特に、昆虫カルシウムチャネルまたはそのハイブリッドを破壊する毒素、特に、任意のこれらのタイプの毒素またはその変異体、および局所殺虫活性を有する、本明細書に記述される任意のタイプの毒素の任意の組み合わせ、が本明細書に記述されるプロセスにより具体的に作製することができる。
オーストラリアジョウゴグモ、ＡｔｒａｘおよびＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属由来の毒性ペプチドは、本発明により記述される方法、手順、またはプロセスにより処置された場合に特に適しており、良く作用する。これらのクモのペプチドは、多くの他の毒性ＩＣＫペプチド（特に毒性サソリペプチドおよび毒性植物ペプチドを含む）のように、局所的に活性となり、または、本発明により記述されるプロセスにより処置された場合に毒性を持つ。適切な検証ペプチドの例および得られたデータを本明細書に提示する。上述の生物に加え、以下の種もまた、本発明のプロセスにより具体的に作製されるのに適した毒素を担持することが具体的に知られている。具体的な種の名称は以下である：Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｅｒｔａ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｈｅｃｔｏｒ、Ａｎｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｌｉｓ、Ａｎｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂｏｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ Ｋａｒｓｃｈ、Ｂｏｔｈｕｓ ｏｃｃｉｔａｎｕｓ ｔｕｎｅｔａｎｕｓ、Ｂｕｔｈａｃｕｓ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｂｕｔｈｏｔｕｓ ｊｕｄａｉｃｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓ ｏｃｃｉｔａｎｕｓ ｍａｒｄｏｃｈｅｉ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｎｏｘｉｕｓ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｓｕｆｆｕｓｕｓ ｓｕｆｆｕｓｕｓ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｉｎｆｅｎｓａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔｕｓ、Ｈｏｌｏｌｅｎａ ｃｕｒｔａ、Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ ｊｕｄａｉｃａ、Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ、Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕｓ、Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ、Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ ａｆｆｉｎｉｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏ ｍａｕｒｕｓ ｐａｌｍａｔｕｓ、Ｔｉｔｙｕｓ ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ、Ｔｉｔｙｕｓ ｚｕｌｉａｎｕ。上述の任意の属および、または属種の任意のペプチド毒素は、本発明のプロセスに従い特に作製されるのに適している。
本明細書の実施例は、本発明の限定を意図しておらず、および限定のために用いられてはならず、本発明の解説のためにのみ、提示されている。
上述のように、多くのペプチドが、具体的に作製するためのプロセスの対象として適した候補となる。上述の配列、以下に記述される配列、および配列表の配列は、特に、具体的に作製できる適格なペプチドであり、これらの内一部は、以下の実施例に示される結果と共に、本発明に従い、具体的に作製されている。
本明細書の実施例は、本発明の限定を意図しておらず、および限定のために用いられてはならず、本発明の解説のためにのみ、提示されている。
上述のように、多くのペプチドが、ＰＩＰとしての植物発現のためのプロセスの対象として適した候補となる。上述の配列、以下に記述される配列、および配列表の配列は、特に、ＰＥＰとして植物で発現され得る適格なペプチドであり、ＰＥＰとして植物で発現されたこれらの内一部は、以下の実施例に示される結果と共に、本発明に従い、具体的に作製されている。
配列番号１０４２（１文字コード）
ＧＳＱＹＣ ＶＰＶＤＱ ＰＣＳＬＮ ＴＱＰＣＣ ＤＤＡＴＣ ＴＱＥＲＮ ＥＮＧＨＴ ＶＹＹＣＲ Ａ
「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられた。５−２０、１２−２５、１９−３９の位置でジスルフィド架橋を有している。分子量は、４５６４．８５である。
ＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質の他の例は、配列番号１０１０である。
配列番号６６１（１文字コード）
ＱＹＣＶＰ ＶＤＱＰＣ ＳＬＮＴＱ ＰＣＣＤＤ ＡＴＣＴＱ ＥＲＮＥＮ ＧＨＴＶＹ ＹＣＲＡ
配列番号６６１は、「ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられ、３−１８、１０−２３、１７−３７の位置でジスルフィド架橋を有する。分子量は４４２６．８４ダルトンである。
配列番号５９３（１文字コード）
ＳＰＴＣＩ ＰＳＧＱＰ ＣＰＹＮＥ ＮＣＣＳＱ ＳＣＴＦＫ ＥＮＥＮＧ ＮＴＶＫＲ ＣＤ
配列番号５９３（３文字コード）
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｓｐ
「ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられた。４−１８、１１−２２および１７−３６の位置でジスルフィド架橋を有している。分子量は４０９６である。
配列番号６５０（１文字コード）
ＧＳＳＰＴ ＣＩＰＳＧ ＱＰＣＰＹ ＮＥＮＣＣ ＳＱＳＣＴ ＦＫＥＮＥ ＮＧＮＴＶ ＫＲＣＤ
配列番号６５０（３文字コード）
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｓｐ
「ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ＋２」と名付けられた。６−２０、１３−２４および１９−３８の位置でジスルフィド架橋を有している。分子量は４１９９である。
配列番号６５１（１文字コード）
ＧＳＡＩＣ ＴＧＡＤＲ ＰＣＡＡＣ ＣＰＣＣＰ ＧＴＳＣＫ ＡＥＳＮＧ ＶＳＹＣＲ ＫＤＥＰ
配列番号６５１（３文字コード）
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
「ｒκ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃ」と名付けられた。５−１９、１２−２４、１５−１６および１８−３４の位置でジスルフィド架橋を有している。分子量は３９１２．１５である。
配列番号６５２（３文字コード）
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ
「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（「ハイブリッド」）＋２」と名付けられた。５−２０、１２−２５および１９−３９の位置でジスルフィド架橋を有している。分子量は４５７０．５１である。
他のＩＣＫペプチドは、配列表に提示する。配列番号５３４〜７０７は、ＩＣＫペプチド配列であり、「カッパ」／「オメガ」毒素および「ハイブリッド」毒素を含有する。配列番号５９３はオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである。配列番号６６１は、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである。
［セクションＩＩ．ＴＭＯＦモチーフペプチドまたはＴＭＯＦペプチド］
「ＴＭＯＦモチーフ」または、「ＴＭＯＦタンパク質」は、トリプシン介在型オースタティック因子ペプチド（ｔｒｙｐｓｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）を意味する。多くの例および変異体が提示される。配列番号７０８は、野生型ＴＭＯＦ配列である。他の非限定的な変異体を、配列番号７０９〜７２１に提示する。他の例は、当業者に公知であり、または当業者により作製することができる。
［セクションＩＩＩ．Ｂｔタンパク質］
Ｂｔは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと呼ばれる細菌に対するイニシャルである。Ｂｔ菌は、多くの昆虫に対して毒性を有するペプチドのファミリーを産生する。Ｂｔ毒性ペプチドは、２つの主な毒素の種類（細胞溶解素（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎｓ、Ｃｙｔ）および血漿Ｂｔタンパク質（Ｃｒｙ））に分類される、パラスポラル（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）結晶性タンパク質封入体（通常、結晶と呼ばれる）を産生するその能力に関して、良く知られている。１９８０年代初頭の、最初の結晶性タンパク質遺伝子のクローニングおよび配列解析が行われて以来、他についても特徴が明らかとなり、今では、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）の学名命名法に従い分類されている。通常、Ｃｙｔタンパク質は、昆虫のＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ（甲虫）および、Ｄｉｐｔｅｒａ（ハエ）の目に対して毒性があり、Ｃｒｙタンパク質は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎｓ（ガおよびチョウ）を標的とする。Ｃｒｙタンパク質は、中腸（上皮）細胞膜上の固有の受容体に結合し、それら細胞の崩壊をもたらす。もしＣｒｙタンパク質が、結合する上皮細胞上の固有受容体を見つけることができない場合、毒性は無い。Ｂｔ株は、ＣｙｔおよびＣｒｙタンパク質の異なる相補体を有することができ、ゆえに、その宿主の範囲を規定することができる。多くのＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子が同定されている。
現在のところ、目（ｏｒｄｅｒ）特異性に基づき、殺虫性Ｂｔパラスポラルペプチドの４つの主な病原系が存在する。Ｌｅｐｉｄｏｔｅｒａ−特異的（ＣｒｙＩ、今ではＣｒｙ１）、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ−特異的（ＣｒｙＩＩＩ、今ではＣｒｙ３）、Ｄｉｐｔｅｒａ−特異的（ＣｒｙＩＶ、今ではＣｒｙ４、Ｃｒｙ１０、Ｃｒｙ１１；およびＣｙｔＡ今ではＣｙｔ１Ａ）およびＣｒｙＩＩ（今ではＣｒｙ２）、二重の特異性（ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａおよびＤｉｐｔｅｒａ）を有することが当時知られていた唯一のファミリー。目交差活性は、今では多くのケースで明らかになっている。
命名法により、正基準配列（ｈｏｌｏｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に、およそ９５％、７８％および４５％の同一性を表す、１次（アラビア数字）、２次（大文字）、および３次（小文字）ランクと共に、分岐の程度に基づくランクを組み込む、固有の名称が付与される。４次ランク（他のアラビア数字）を用いて、同一または、わずかに異なる配列を有する正基準毒素遺伝子の独立した単離株を示す。現在のところ、命名法により、５５のｃｒｙおよび２ｃｙｔファミリーにグループ分けされる、１７４の正基準配列が識別されている（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ， Ｎ．， Ｚｅｉｇｌｅｒ， Ｄ．Ｒ．， Ｓｃｈｎｅｐｆ， Ｅ．， Ｖａｎ Ｒｉｅ， Ｊ．， Ｌｅｒｅｃｌｕｓ， Ｄ．， Ｄａｕｍ， Ｊ， Ｂｒａｖｏ， Ａ．， Ｄｅａｎ， Ｄ．Ｈ．，Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素命名法）。それらを産生する、これら任意の結晶性タンパク質および遺伝子を用いて、本発明に適したＢｔ関連毒素を作製しても良い。
また、本発明の記述には、他の細菌により産生される、高度に関連した結晶性タンパク質のファミリーが含まれる：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のＣｒｙ１６およびＣｒｙ１７（Ｂａｒｌｏｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６， １９９８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ由来のＣｒｙ１８（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓ由来のＣｒｙ４３（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、および、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓに産生されるバイナリーＣｒｙ４８／Ｃｒｙ４９（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。本明細書に含まれる、他の結晶性または分泌型の殺虫性タンパク質（例えば、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質（Ｐｅｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）は、１アミノ酸置換を介して改変されたものを除き、通常、変化した結晶性タンパク質である（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。任意のこれらの遺伝子を用いて、本発明に適したＢｔ関連毒素を産生しても良い。
（Ｂｔの例）
特に、Ｂｔタンパク質核酸配列に対応する、単離核酸分子を提示する。さらに、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸も包含される。特に、本発明により、２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号に示される、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子を提示し、その全ては、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、および具体的に番号により特定される全ての配列は、参照により組み込まれる。配列番号９、１１、１３、１５もしくは１８、または、配列番号１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６もしくは１７に明記されるヌクレオチド配列、ならびに、その変異体および断片。本発明のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、または本発明の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた、包含される。
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列には、２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号、配列番号１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６もしくは１７またはその変異体、断片および相補物に明記される配列を含む。「相補物」とは、所与のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それにより安定的な二本鎖を形成することができるような、所与のヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列が意図される。このヌクレオチド配列にコードされるＢｔタンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号３３〜５３３に明記される。
ヌクレオチドをコードするこれらＢｔタンパク質の断片である核酸分子もまた、本発明に包含される（例えば、２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号は、その全てが、全体で参照により本明細書に組み込まれ、数字で具体的に特定される全ての配列は参照により組み込まれる。配列番号８は配列番号４および１２の断片であり、配列番号４は配列番号２の断片である）。「断片」とは、Ｂｔタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部が意図される。ヌクレオチド配列の断片は、Ｂｔタンパク質の生物学的に活性な部分をコードしても良く、または、以下に開示される方法を用いたハイブリダイゼーションのプローブまたはＰＣＲのプライマーとして用いられる断片であっても良い。Ｂｔタンパク質ヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、意図される使用目的に応じて、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８８５の連続的なヌクレオチドを含有し、または、本明細書に開示されるヌクレオチド配列をコードする全長Ｂｔタンパク質に存在するヌクレオチドの数（例えば２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号については１８９０ヌクレオチドであり、これらは、本明細書において、配列番号１および２として提示され、配列番号４については１８０６ヌクレオチド、配列番号６、７、８および１６については１７４３ヌクレオチド、配列番号１０については１８０９ヌクレオチド、および配列番号１２および１４については１７５２ヌクレオチドとして、配列表において提示される）まで、含有する。「連続的な」ヌクレオチドとは、互いにすぐに隣接するヌクレオチド残基が意図される。本発明のヌクレオチド配列の断片は、Ｂｔタンパク質の生物学的活性を維持するタンパク質断片をコードし、それゆえに、殺虫活性を保持している。「活性を保持する」とは、Ｂｔタンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上高い殺虫活性を有する断片が意図される。殺虫活性を測定するための方法は当分野に公知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ （１９９０） Ｊ． Ｅｃｏｎ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． ８３：２４８０−２４８５； Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５２：１９９−２０６； Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号を参照のこと（それらは全て、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列は、参照により具体的に組み込まれる）。
本発明のタンパク質の生物学的に活性である部分をコードするヌクレオチド配列をコードするＢｔタンパク質の断片は、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５６０、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００の連続したアミノ酸をコードし、または、本発明の全長Ｂｔタンパク質に存在するアミノ酸の総数まで、コードする（例えば、配列番号４１については５８０アミノ酸、配列番号４３については６０２アミノ酸、配列番号４５および４７について５８３アミノ酸）。
本発明の好ましいＢｔタンパク質は、２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号（その全ては、参照により全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列（配列１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６または１７）は、参照により具体的に組み込まれる）のヌクレオチド配列に対して十分に同一であるヌクレオチド配列によりコードされる。「十分に同一」とは、標準的なパラメータを用いた、本明細書に記述されるアライメントプログラムの内の１つを使用して、参照配列と比較し、少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチドの配列が意図される。当業者であれば、これらの値が、コドン縮退、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付け等を考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の相当する同一性を決定するために、適切に調節することができることを認識するであろう。
本発明はまた、変異型核酸分子（例えば、２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号（その全ては、参照により全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列は、参照により具体的に組み込まれる）で、配列２は、配列１の変異型；配列７および８は、配列６の変異型；配列１０は配列４および１２の変異型；ならびに、配列１４は配列１２の変異型）を包含する。ヌクレオチド配列をコードするＢｔタンパク質の「変異型」には、本明細書に開示されるＢｔタンパク質をコードするが、遺伝子コドンの縮退のために保存的に異なる、それら配列、ならびに、上述のものと十分に同一であるものが含まれる。
自然発生の対立遺伝子多型は、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション法等の、以下に概略が解説される、良く知られた分子生物学的技術を用いて、特定することができる。変異型ヌクレオチド配列にはまた、例えば、特定部位の突然変異誘発を用いることにより作製され、ただし以下に記述される本発明で開示されるＢｔタンパク質をまだコードしている、合成的に誘導されたヌクレオチド配列が含まれる。本発明に包含される変異型タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、天然型タンパク質の所望される生物学的活性（すなわち、殺虫活性）を保持し続けている。「活性を維持する」とは、その変異型が、天然型タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有していることが意図される。殺虫活性を測定する方法は当分野に公知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ （１９９０） Ｊ． Ｅｃｏｎ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． ８３：２４８０−２４８５； Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５２：１９９−２０６； Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号を参照のこと（それらは全て、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列は、参照により具体的に組み込まれる）。
（合成による作製例および変異型Ｂｔ遺伝子）
本発明の１つの態様において、合成ａｘｍｉ−００４配列（例えば、２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号のｓｙｎａｘｍｉ−００４、それらは全て、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列、（配列１）およびｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ（配列２）は、参照により具体的に組み込まれる）を作製した。これらの合成配列は、米国特許第７，３５５，０９９号（それらは全て、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列は、参照により具体的に組み込まれる）に列挙されるａｘｍｉ−００４配列（配列３）に関連する改変ＤＮＡ配列を有しており、および、オリジナルのＡＸＭＩ−００４タンパク質をコードしている。同様に、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−２Ｍ（配列４）が指定され、元々は米国特許出願第１０／７８２，０２０号で特定された、ａｘｍｉ−００４代替開始部位（本明細書において、ａｘｍｉ−００４Ｂ−２Ｍと呼称され、配列５に明記される）をコードする。
本発明の他の対応において、第三の開始部位が、ａｘｍｉ−００４コード配列に特定された。このコード領域は、ａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ（２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号、それらは全て、参照によりその全体で本明細書に組み込まれ、数字で特定される全ての配列（配列１６）は、参照により具体的に組み込まれる）と指定され、配列９に明記されるＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍアミノ酸配列をコードする。これらの合成ヌクレオチド配列は、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｃ−３Ｍおよびｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｄ−３Ｍと指定され、それぞれ、配列６、７および８に明記される。本発明の他の態様において、コードされるタンパク質に追加のＮ末端残基が付加されるように、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変版が設計された。これらの配列は、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ１（２００９年４月１８日に公開された米国特許出願公開第２００９／００９９０８１号、配列１０）、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ２（配列１２）、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ３（配列１４）、およびｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ４（配列１７）と指定される。コードされるタンパク質は、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ１（配列１１）、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ２（配列１３）、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ３（配列１５）およびＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ４（配列１８）と指定される。
他のＢｔタンパク質および遺伝子の記述は、以下に見出すことができる。公表文献が言及するＢｔ毒素についての注釈と共に以下に言及されるあらゆる特許出願公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。これらの文献はまた公開されており、それら、およびその配列は、公知のものである。
それらを記述するＢｔ遺伝子、タンパク質および特許文献のさらなる例を、以下の表４、５および６に示す。表４、５、６の特許文献、特に米国特許および米国特許出願は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表には、Ｂｔ配列、配列番号３３〜５３３が含まれる、これらの配列は、Ｂｔタンパク質、ＣｒｙおよびＣｙｔタンパク質配列の例が含まれる。非常に多くの例があり、当業者であれば、本開示のものの代わりに適した様々なＢｔ配列の他の多くの例を知っている。
［セクションＩＶ．殺虫組成物および植物産生量の増加］
本発明の活性成分は、組成物の形態に正常に適用され、他の化合物と同時に、または連続して、処置される農作物の地域または植物へと適用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、抗凍結剤、界面活性剤、合成洗剤、殺虫性石鹸、ドルマント油（ｄｏｒｍａｎｔ ｏｉｌｓ）、ポリマー類および／または、製剤の単回適用の後で、標的領域に長期間にわたり投与が続くような、徐放性担体製剤もしくは生分解性担体製剤であっても良い。また、それらは選択性除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺菌剤（ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅｓ）、抗アメーバ剤、殺虫剤、防カビ剤、殺菌剤（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｄｅｓ）、抗線虫剤、軟体動物駆除剤、または、所望の場合にはさらに製剤分野で習慣的に用いられている農業的に受容可能な担体、界面活性剤もしくは、適用促進アジュバントとの、これらの製剤のいくつかの混合物であっても良い。適切な担体およびアジュバントは、固形または液体であっても良く、および、製剤法に通常に用いられている物質に相当するものであっても良い（例えば、天然もしくは再生無機物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料等）。同様に、製剤は、食用の「餌」へと調製されても良く、または害虫の「トラップ」へと形作られても良く、それにより殺虫製剤の標的害虫による摂食または摂取が可能となる。
本発明の細菌株により産生される殺虫性タンパク質の内の少なくとも１つを含有する本発明の活性成分、または本発明の農役組成物の適用法としては、葉への塗布、種子のコーティングおよび土壌への適用が挙げられる。適用の回数および適用率は、対応する害虫の侵入度に依存する。
組成物は、粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド、溶液等として処方されても良く、および、ポリペプチドを含有する細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジネーション、抽出、ろ過、遠心、沈殿または濃縮等の従来法により調製されても良い。そのような殺虫性ポリペプチドを少なくとも１つ含有する、そのような組成物全てにおいて、ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在しても良い。
鱗翅目または鞘翅目の害虫は、本発明の方法により、所与の領域における数を減少もしくは殺されても良く、または、感受性のある害虫によるまん延を防止するために、予防的に周囲の地域に予防的に適用されても良い。好ましくは、害虫は、ポリペプチドの殺虫有効量と接触または、殺虫有効量を摂取する。「殺虫有効量」とは、少なくとも１つの害虫に対し死をもたらすことができる殺虫剤の量が意図され、または、害虫の増殖、摂食行動または正常な生理学的発達を著しく妨げることができる殺虫剤の量が意図される。この量は、例えば、制御される特定の標的外流、特定の環境、位置、植物、農作物、処置される農業用地、環境条件、ならびに方法、比率、濃度、安定性および殺虫有効ポリペプチド組成物の適用量などの因子に依存して変化する。この製剤はまた、気候条件、環境への配慮、および／または、適用頻度、および／または害虫まん延の重大度に関して、変化しても良い。
記述される殺虫性組成物は、細菌細胞、結晶および／もしくは胞子懸濁液、または、所望される農業的に受容可能な担体を有する単離タンパク質成分のいずれかを製剤化することにより作製されても良い。組成物は、例えば凍結乾燥、凍結および乾燥、乾燥等の適切な手段で投与される前に、または、水溶性担体、培地もしくは適切な希釈剤（例えば生理食塩水または他の緩衝液）で投与される前に、製剤化されても良い。製剤化された組成物は、細粒または顆粒状物質の形態、または油（植物性または鉱物性）の懸濁液、または水もしくは油／水エマルション、または可溶性粉末、または農業的な適用に適切な他の担体物質との組み合わせであっても良い。適切な農業用担体は、固形または液体であっても良く、当分野に公知である。「農業的に受容可能な担体」という用語は、全てのアジュバント、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤等、殺虫製剤技術で通常に用いられているもの全てを包含し、これらは殺虫製剤分野の当業者に公知である。製剤は、１以上の固形または液体のアジュバントと混合されても良く、および、普遍的な製剤技術を用いた、適切なアジュバントと殺虫成分の、例えば均質な混合、調合および／または破砕等の様々な手段により調製されても良い。適切な製剤および適用法は、米国特許第６，４６８，５２３号に記述され、参照により本明細書に組み込まれる。
（植物産生量を増加させる方法）
植物産生量を増加させる方法を提示する。この方法には、植物または植物細胞に、本明細書に記述される殺虫性配列を含有するポリヌクレオチドを導入することが含まれる。本明細書に定義されるよに、植物の「産生量」とは、植物により産生されるバイオマスの質および／または量を指す。「バイオマス」とは、任意の測定された植物の産物が意図される。バイオマス産生における増加は、測定される植物産物の産生量における、任意の改善である。植物産生量の増加は、いくつかの商業上の応用を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトまたは動物の消費のために、葉からできた野菜の産生量を増加させることでも良い。さらに、葉バイオマスの増加を用いて、植物誘導医薬品または工業品の産生を増加させることができる。産生量の増加は、限定されないが、殺虫性配列を発現しない植物と比較して、少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％以上の産生量の増加を含む、任意の統計学的に有意な増加を含む。
特定の方法において、植物産生量は、本明細書に開示される殺虫性タンパク質を発現する植物の害虫抵抗性の改善の結果として増加する。殺虫性タンパク質の発現により、植物への害虫の侵入または摂食能力が減少され、それにより植物産生量が改善される。
［セクションＶ．植物形質転換］
ＩＣＫモチーフタンパク質、および、または、ＴＭＯＦモチーフタンパク質、およびＢｔタンパク質の主要な成分の任意の組み合わせを、ＰＩＰにおいて組み合わせても良い。また、我々は、より優れたＰＩＰ（植物組込み型保護剤、Ｐｌａｎｔ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を作製するために、ＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）および翻訳安定化タンパク質および介在リンカーの添加を開示し、および、ＢｔおよびＩＣＫモチーフタンパク質の両方の最小限が用いられる限りで、ＰＥＰ（植物発現ペプチド）として発現された場合は、これら２つのペプチドをＥＲＳＰとの組み合わせで用いることが好ましい。ＴＭＯＦモチーフはまた、ＩＣＫと共に、またはＩＣＫモチーフを置換して用いることができる。これらの組成物を、作製することができ、ＰＥＰとして用いることができ、および、ＰＩＰとして発現することができる。
我々は、植物発現の効率を増加させる方法、植物発現タンパク質の蓄積を増加させる方法、および、植物発現タンパク質の殺虫活性を劇的に増加させる方法を記述する。我々は、殺虫活性に必要とされる、必須の三次元ＩＣＫモチーフ構造を作り出す、ペプチドジスルフィド架橋の正確な共有結合架橋をもたらすために、植物における小胞体シグナルタンパク質（ＥＲＳＰ）により、小胞体（ＥＲ）へとＩＣＫモチーフタンパク質を標的化することを記述する。我々はさらに、植物におけるペプチド蓄積を増加させる、ＩＣＫ融合タンパク質の結果として得られるサイズを増加させるための、翻訳安定化タンパク質ドメインの付加と共に、植物におけるＥＲＳＰにより、ＥＲへとＩＣＫモチーフタンパク質を標的化することを記述する。我々はさらに、殺虫活性を有するＩＣＫモチーフタンパク質の活性形態の回収および、潜在的な開裂を可能とする、介在ペプチド配列の添加と、翻訳安定化タンパク質の上述の付加と共に、植物におけるＥＲＳＰにより、ＥＲへのＩＣＫモチーフタンパク質の標的化を記述する。
本発明は、植物で発現され、殺虫活性を有し、昆虫の損害から植物または農作物を成功裏に防御することができる、ＩＣＫモチーフタンパク質を記述する。本明細書に教示される方法により、植物におけるペプチドの発現が可能となるのみならず、ペプチドが適切に発現およびフォールディングされることが可能となり、植物で発現した後でさえも、その殺虫活性が保持される。
我々は、ＩＣＫモチーフペプチドの植物発現の後でも、所望される生物活性が保持されるために、標的ペプチド（例えばＩＣＫモチーフペプチド）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をどのように改変するべきかを記述する。１つの実施態様において、我々は、活性殺虫性タンパク質を発現する植物組込み型保護剤、またはＰＩＰを記述する。ＰＩＰ殺虫性タンパク質は、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）またはインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質に操作可能に連結される小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）から構成され、ここで、ＥＲＳＰは、連結されたＥＲＳＰ＋ＩＣＫモチーフタンパク質のＮ末端である。ＰＩＰ殺虫性タンパク質は、次いで、選択された植物へと組み込まれ、植物に昆虫抵抗性を与える。植物細胞は適切にフォールディングされるＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質を発現および蓄積する。昆虫が植物細胞を摂取した際、適切にフォールディングされたＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質は、昆虫の体内へと送達され、そこで、殺虫活性を発揮し、摂食行動を停止させるか、または減じさせるか、動きを遅くさせ、および、繁殖を遅くさせるか、または停止させることのいずれかをもたらし、その全てにより、昆虫の損害から植物が保護される。
我々は、様々な植物発現カセットを発現するための一過性の発現システムを記述する。我々が用いる１つの発現導入遺伝子は、緑色蛍光タンパク質またはＧＦＰであり、ＵＶ光で励起された場合、可視的に検出することができる。我々が、植物トランスジェニックタンパク質の評価のために用いたＧＦＰ一過性発現システムは、全ての現実的な目的のためであり−これらのタイプの評価のための安定トランスジェニック植物システムの使用に相当する。
（ＣＲＩＰ、ＩＣＫ、ＴＭＯＦ、イソギンチャクモチーフはＥＲＳＰに連結することができる）
トランスジェニック植物から発現された際に適切にフォールディングされるＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質のために、ＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質を有するフレームに融合されたＥＲＳＰを有しなければならない。これはまた、ＴＭＯＦモチーフでも行うことができる。これは、いくつかの方法で達成することができる。図１、２および３を参照のこと。タンパク質は、適切なジスルフィド結合形成のための、正しい共有結合連結が形成される、ＥＲを通らなければならない。学説に拘らないが、我々は、ＥＲ経路により、ＩＣＫモチーフタンパク質の正しい三次元構造がもたらされると考えている。そのような経路は、シグナル認識粒子と呼ばれる細胞性成分により得られるということが一般に仮定されている：シグナル認識粒子は、タンパク質を翻訳するリボソームに結合し、翻訳を止め、リボソーム／ｍＲＮＡ複合体をＥＲの輸送体孔へと移送し、そこで、リボソームは翻訳を継続させ、得られたタンパク質をＥＲへと通す。ＥＲ内で、ＥＲＳＰは開裂され、タンパク質は、ＥＲ内での翻訳後修飾プロセスによる影響を受ける。いったんそのようなプロセスによりタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ジスルフィド結合の形成を触媒するタンパク質の種類）が巻き込まれると、追加の保持タンパク質シグナルが何も無くとも、タンパク質は、ＥＲを通過してゴルジ装置へと移送され、そこで最後には細胞膜からアポプラストの空間へと分泌される。学説に拘らないが、我々は、例えば殺虫性タンパク質等のＩＣＫモチーフを有するタンパク質は、植物で発現される場合、正しいジスルフィド結合形成をタンパク質が有するためには、ＥＲを経由する必要があると考えている。
（ＥＲＳＰ（小胞体シグナリングタンパク質））
以下の文章に加え、パート１−Ｉを参照のこと（ＥＥＲＳＰまたはＰＥＰのｅｒｓｐ成分）
ＥＲＳＰは、ＥＲＳＰ＋ＩＣＫモチーフタンパク質複合体のＮ末端領域であり、ＥＲＳＰ部分は、約３〜６０アミノ酸から構成される。一部の実施態様においては、５〜５０アミノ酸である。一部の実施態様においては１０〜４０アミノ酸であるが、ほとんどの場合は、通常、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０アミノ酸から構成される。ＥＲＳＰは、いわゆるシグナルペプチドであり、タンパク質の移送を指示する。シグナルペプチドはまた、標的化シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）または局在シグナル（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ）とも呼ばれる。ＥＲ標的化に対するシグナルペプチドは多くの場合、１５〜３０アミノ酸残基の長さがあり、三部構成を有し、正荷電のアミノ末端および、極性ではあるが電荷をおびていないカルボキシ末端領域に隣接する疎水性残基のコアから構成される。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｒｉｃｈａｒｄ； Ｅｙｒｉｓｃｈ， Ｓｕｓａｎｎｅ； Ａｈｍａｄ， Ｍａｚｅｎ ａｎｄ Ｈｅｌｍｓ， Ｖｏｌｋｈａｒｄ： “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ＥＲ ｍｅｍｂｒａｎｅ” Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８０８ （２０１１） ９１２−９２４， Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照のこと。
およそ半分、多くの場合はそれ以上のＥＲＳＰが、通常は、疎水性アミノ酸から構成されるが、疎水性であるＥＲＳＰ中のアミノ酸のパーセンテージは変化し得る。本発明がどのように作用するか、いずれの学説に拘らないが、我々は、疎水性アミノ酸が翻訳後にＥＲ膜に突き刺さり、これにより、シグナルペプチドペプチダーゼが、ＥＲＳＰを翻訳タンパク質から開裂させ、ＩＣＫモチーフタンパク質をＥＲへと放出させると考えている。多くのＥＲＳＰが公知である。多くの植物ＥＲＳＰが公知である。植物ＥＲＳＰから誘導されるＥＲＳＰ、非植物ＥＲＳＰが、本明細書に記述される手順と共に作用する必要は無い。しかしながら、多くの植物ＥＲＳＰが知られており、我々は本明細書に、一部の植物誘導ＥＲＳＰを記述する。例えば、ＢＡＡＳは、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ植物から誘導される。
本明細書に用いられるＥＲＳＰの一例は、ＢＡＡＳであり、ＢＡＡＳの配列は、ＭＡＮＫＨ ＬＳＬＳＬ ＦＬＶＬＬ ＧＬＳＡＳ ＬＡＳＧ（配列番号１０３５、１文字コード）である。
「ＢＡＡＳ」と名付けられたこのペプチドは、タンパク質のＥＲへの翻訳で、ＩＣＫモチーフから開裂される。分子量は２４４２．９４ダルトンである。図１〜３に、ＥＲＳＰに連結されるＩＣＫモチーフの代表例を示す。これらの図は、ＥＲＳＰに連結されるＴＭＯＦモチーフタンパク質も同様に表しうる。
植物のアポプラストの空間へと発現および放出されることが知られているタンパク質のゲノム配列から選択される植物ＥＲＳＰのいくつかの例はＢＡＡＳ、ニンジンエクステンシン、タバコＰＲ１である。以下の参照文献において、さらなる記述が提示され、それらは本明細書にその全体で参照により組み込まれる。Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｌｌｏｗｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ” Ｇｅｎｅ， ９９ （１９９１） ９５−１００。Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ， Ｍ．らは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ由来のエクステンシンコード遺伝子の構造分析を記述し、その配列には、小胞体へのタンパク質輸送のための典型的なシグナルペプチドが含まれている。Ｃｈｅｎ， Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｐｌａｓｔｉｄｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ” Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２００４ Ｊｕｌ； １３５（３）： １３６７−７７． Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊｕｌ ２。Ｃｈｅｎ， Ｍ．Ｈ．らは、トランスジェニックタバコにおいて、シグナルペプチドの有無でα−アミラーゼの発現を分析することにより、植物細胞におけるα−アミラーゼの細胞内局在を研究した。これらの参照文献および他の文献により、本明細書に記述される本方法、手順ならびにペプチド、タンパク質およびヌクレオチド複合体および構築物に用いることができる翻訳安定化タンパク質が教示および提示される。
（翻訳安定化タンパク質）
以下の文章に加え、パート１−ＩＩＩ（翻訳安定化タンパク質成分、ＳＴＡまたはｓｔａ）を参照のこと。
上述の手順は、ＥＲＳＰ＋ＣＲＩＰが、ＥＲＳＰ＋ＩＣＫ、ＥＲＳＰ＋非ＩＣＫ、ＥＲＳＰ＋Ａｖ（イソギンチャク）である、ＥＲＳＰ＋ＣＲＩＰを提示し、または、手順は、ＥＲＳＰ＋ＴＭＯＦを言及し、またはＥＲＳＰ＋ＣＲＩＰを言及し、植物を作製するのに十分なＴＭＯＦは、適切にフォールディングされたペプチドを産生する。我々はまた、一部の昆虫からより完全に植物を防御するためには、単に適切にフォールディングすること以上のことが求められる場合があることを示す。適切に構築された発現カセットと共に、植物を、毒性ペプチドをより多い量で作製および蓄積させることができる。植物が、適切にフォールディングされた毒性ＣＲＩＰまたはＴＭＯＦペプチドをより多い量で蓄積した場合、植物に攻撃および食害を与える昆虫に対し、より容易に抵抗し、または殺すことができる。ＰＩＰの殺虫活性を増加させる１つの方法は、翻訳安定化タンパク質を含ませることである。翻訳安定化タンパク質を用いて、植物中の毒性ペプチドの蓄積を劇的に増加させることができ、それによって、ＰＩＰの有効性を高めることができる（特に、ＰＩＰがそれ自身の翻訳安定化タンパク質を有している場合）。本明細書に記述される手順により、適切にフォールディングされたトランスジェニック植物タンパク質を多量に植物中に蓄積することができる。ＩＣＫモチーフ殺虫性タンパク質および翻訳安定化タンパク質の両方を発現するトランスジェニック植物は、翻訳安定化タンパク質の無いシステムを大幅に超える毒性ＩＣＫペプチドの蓄積の改善を示す。翻訳安定化タンパク質を有するＰＩＰの代表例を、本明細書に記述する。
翻訳安定化タンパク質の有る無し両方での、植物発現ペプチドを比較する実験においては、著しい差異が現れる。翻訳安定化タンパク質の無いＩＣＫモチーフタンパク質のタンパク質発現は、非常に低くなるであろう。翻訳安定化タンパク質がＩＣＫモチーフタンパク質に融合される場合、検出可能な蓄積レベルは高くなる。翻訳安定化タンパク質は、他のタンパク質のドメインであっても良く、または、タンパク質配列全体を含有しても良い。翻訳安定化タンパク質は、タンパク質分解の細胞プロセスにより標的化されることなく、細胞中に蓄積することができる十分な３次元構造を有するタンパク質である。このタンパク質は、５〜５０ａａ（例えば、他のＩＣＫモチーフタンパク質）、５０〜２５０ａａ（ＧＮＡ）、２５０〜７５０ａａ（例えば、キチナーゼ）、および７５０〜１５００ａａ（例えば、エンハンシン）の間であっても良い。
翻訳安定化タンパク質（またはタンパク質ドメイン）は、翻訳安定化以外の有用な特徴は持たないタンパク質を含有しても良く、または、翻訳安定化に加えて、他の有用な特徴を有するものタンパク質を含有しても良い。翻訳安定化タンパク質の１つの実施態様においては、縦一列になった複数のＩＣＫモチーフタンパク質であっても良い。有用な特徴としては以下が挙げられる：例えば囲食膜を破壊する活性、腸壁を破壊する活性、および／または、腸壁を横切ってＩＣＫモチーフタンパク質を能動的に移送させる活性等の、さらなる殺虫活性。翻訳安定化タンパク質の１つの実施態様においては、ＩＣＫモチーフタンパク質を含む融合タンパク質のポリマーであっても良い。翻訳安定化タンパク質の１つの実施態様においては、ＴＭＯＦモチーフタンパク質を含む融合タンパク質のポリマーであっても良い。翻訳安定化タンパク質の具体的な例を本明細書に提示し、翻訳安定化タンパク質の用途を解説する。この例は、本開示またはクレームを決して限定する意図は無い。有用な翻訳安定化タンパク質は当分野に公知であり、このタイプの任意のタンパク質を本明細書に開示されるように用いることができるであろう。ペプチド産生を評価および検証する手順は両方とも当分野に公知であり、本明細書に記述される。ある翻訳安定化タンパク質の一例は、以下に示す配列番号１０３６である（１文字コード）。
配列番号１０３６（１文字コード）。
ＡＳＫＧＥ ＥＬＦＴＧ ＶＶＰＩＬ ＶＥＬＤＧ ＤＶＮＧＨ ＫＦＳＶＳ ＧＥＧＥＧ ＤＡＴＹＧ ＫＬＴＬＫ ＦＩＣＴＴ ＧＫＬＰＶ ＰＷＰＴＬ ＶＴＴＦＳ ＹＧＶＱＣ ＦＳＲＹＰ ＤＨＭＫＲ ＨＤＦＦＫ ＳＡＭＰＥ ＧＹＶＱＥ ＲＴＩＳＦ ＫＤＤＧＮ ＹＫＴＲＡ ＥＶＫＦＥ ＧＤＴＬＶ ＮＲＩＥＬ ＫＧＩＤＦ ＫＥＤＧＮ ＩＬＧＨＫ ＬＥＹＮＹ ＮＳＨＮＶ
ＹＩＴＡＤ ＫＱＫＮＧ ＩＫＡＮＦ ＫＩＲＨＮ ＩＥＤＧＳ ＶＱＬＡＤ ＨＹＱＱＮ ＴＰＩＧＤ ＧＰＶＬＬ ＰＤＮＨＹ ＬＳＴＱＳ ＡＬＳＫＤ ＰＮＥＫＲ ＤＨＭＶＬ ＬＥＦＶＴ ＡＡＧＩＴ ＨＧＭＤＥ ＬＹＫ
配列番号１０３６は「ＧＦＰ」と名付けられている。分子量は、２６７３６．０２ダルトンである。
翻訳安定化タンパク質のさらなる例は、以下の参照文献（参照によりその全体で組み込まれる）に見出すことができる：Ｋｒａｍｅｒ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｎｄ ｇｕｔ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｏｆ Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ” Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２３， Ｉｓｓｕｅ ６， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９３， ｐｐ． ６９１−７０１。Ｋｒａｍｅｒ， Ｋ．Ｊ．らは、タバコイモムシ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａから、キチナーゼをコードするｃＤＮＡを単離し、および配列解析を行った。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． “Ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， （１９９１）， ７２， ２６４５−２６５１。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．らは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓウイルスのウイルス増強因子をコードする遺伝子をクローニングし、完全なヌクレオチド配列を決定した。Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ， Ｅ．Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｎｏｗｄｒｏｐ （Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌ．） ｌｅｃｔｉｎ” Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０２， ２３−３０ （１９９１）。Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ， Ｅ．Ｊ．Ｍ．らは、スノードロップレクチンの熟成した子房からＰｏｌｙ（Ａ）リッチＲＮＡを単離し、小麦胚芽セルフリーシステムでの翻訳で、単一１７ｋＤａレクチンポリペプチドを得た。これらのおよび他の参照文献により、本明細書に記述される本方法、手順、ならびにペプチド、タンパク質およびヌクレオチド複合体ならびに構築物に用いることができる翻訳安定化タンパク質が教示および開示される。
（介在リンカー）
以下の文章に加え、パート１−ＩＶ（介在リンカーペプチド成分、ＬＩＮＫＥＲ、リンカー、Ｌまたはもしポリヌクレオチドである場合には、ＰＥＰのリンカーまたはｌ）を参照のこと。
本発明はまた、ＩＣＫモチーフタンパク質と翻訳安定化タンパク質の間に介在リンカーを組み込む。介在リンカーは１〜３０アミノ酸の間である。開裂部位が無いか、または、セリン、スレオニン、システインおよびアスパラギンプロテアーゼもしくはメタロプロテアーゼに特異的なプロテアーゼ開裂部位を有するかのいずれかであっても良い。開裂可能なリンカーは、鱗翅類腸環境および／または鱗翅類血リンパ環境で見出されるプロテアーゼにより消化される場所であっても良い。本発明を解説するための追加成分の例を以下に示すが、この例に限定はされない。
介在リンカーの例は、ＩＧＥＲ（配列番号１０３７）である。
「ＩＧＥＲ」と名付けられる、この介在リンカーの分子量４７３．５３ダルトンである。
介在リンカーの他の例は、以下の参照文献（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に見出すことができる：６つの異なるリンカーを介した、緑色蛍光タンパク質のフォールディングの振る舞いは、Ｃｈａｎｇ， Ｈ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． “Ｄｅ ｎｏｖｏ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ＧＦＰ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００５ Ｏｃｔ ２１； ３５３（２）： ３９７−４０９に比較されている。ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔｓファミリーのアイソフォーム、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、 Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物で発現された場合でも、その局在および機能を維持していることが示された（Ｄａｓｋａｌｏｖａ， Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ． ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１０ Ａｕｇ ２４； １０： ６２）。内因性色素体タンパク質が、ストロミュールを通り移動する能力は、Ｋｗｏｋ， Ｅ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． “ＧＦＰ−ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｒｕｂｉｓｃｏ ａｎｄ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｐｌａｓｔｉｄ ｓｔｒｏｍｕｌｅｓ ａｎｄ ｔｒａｆｆｉｃ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｔｉｄｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ， ２００４ Ｍａｒ； ５５（３９７）： ５９５−６０４． Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊａｎ ３０に示されている。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）表面の蚊デカペプチドホルモン（トリプシン介在オースタティック因子、ＴＭＯＦ）での遺伝子操作、ビリオン、は、Ｂｏｒｏｖｓｋｙ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｅｄｅｓ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｏｆ ＴＭＶ： Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｌａｒｖｉｃｉｄｅ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２００６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １２； １０３（５０）： １８９６３−１８９６８により作製された。これらのおよび他の参照文献により、本明細書に記述される方法、手順、ならびにペプチド、タンパク質およびヌクレオチド複合体、ならびに構築物に用いることができる翻訳安定化タンパク質が教示および開示される。
（他の植物形質転換が、さらに良く知られている）
本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入することを含む。「導入すること」とは、構築物が、細胞内部へのアクセスを得るような方法で、ヌクレオチド構築物を植物へ送ることが意図される。本発明の方法は、植物へヌクレオチド構築物を導入するための特定法を用いる必要は無く、植物の少なくとも１つの細胞の内部に、ヌクレオチド構築物をアクセスさせるだけで良い。ヌクレオチド構築物を植物へと導入させる方法は当分野に公知であり、限定されないが、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス介在法が挙げられる。
「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば、葉、幹、根等）、種子、植物細胞、珠芽、胚およびその子孫が意図される。植物細胞は、分化しても良く、分化していなくても良い（例えば、カルス、培養細胞懸濁液、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉等）。
「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定形質転換された」植物もしくは細胞もしくは組織は、植物細胞に外来性核酸配列またはＤＮＡ断片が組み込まれた、または結合された植物を指す。これらの核酸配列は、外因性であるものを含み、または、非形質転換植物細胞には存在しないものを含み、ならびに、内因性または非形質転換植物細胞に存在するものを含む。「異種の」とは、一般的に、それが存在する天然型ゲノムの一部、または細胞に対して内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクション等により細胞に添加される核酸配列を指す。
植物細胞の形質転換は、当分野に公知のいくつかの技術の内の１つにより達成することができる。本発明のＢｔタンパク質遺伝子は、植物細胞での発現を得る、または発現を増強させるために改変されても良い。典型的には、そのようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を活発化させるプロモーター、ならびに、転写の停止およびポリアデニル化を行わせる３’非翻訳領域を含有する。そのような構築物の組織化は、当分野に公知である。一部の例においては、得られるペプチドが分泌されるように、遺伝子を操作することが便利であり、または、植物細胞内に標的化されるように遺伝子を操作することが便利である。例えば、遺伝子を遺伝子操作して、小胞体へのペプチド移送を促進するためのシグナルペプチドを含有させることができる。また、植物発現カセットを遺伝子操作してイントロンを含有させ、イントロンのｍＲＮＡプロセッシングを発現に必要とさせることが好ましい。
典型的には、この「植物発現カセット」を、「植物形質転換ベクター」へと挿入させる。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要とされる、１以上のＤＮＡベクターから構成されても良い。例えば、２以上の連続したＤＮＡ断片から構成される植物形質転換ベクターを利用することが、当分野に一般的な方法である。これらベクターは多くの場合、当分野で、「バイナリーベクター」と呼称される。バイナリーベクター、ならびに、ヘルパープラスミドを有するベクターは、アグロバクテリウム介在形質転換に最も良く用いられるものであり、効果的な形質転換を得るために必要とされるＤＮＡ断片のサイズおよび複雑度は非常に大きく、別のＤＮＡ分子上に機能を分離させるほうが好都合である。バイナリーベクターは通常、Ｔ−ＤＮＡ移転に必要とされるｃｉｓ活性化配列（左縁配列および右縁配列など）、植物細胞で発現することができるように操作された選択マーカー、および「対象の遺伝子」（トランスジェニック植物の作製を希望する植物細胞において発現することができるように操作された遺伝子）を含有するプラスミドベクターを含有する。また、このプラスミドベクター上には、細菌複製に必要とされる配列が存在する。ｃｉｓ活性化配列は、植物細胞への効果的な移転およびその中での発現がなされるように配置される。例えば、選択マーカー遺伝子およびＢｔタンパク質は、左右の境界の間に位置付けられる。第二のプラスミドベクターは多くの場合、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移転を調節するｔｒａｎｓ活性化因子を含有する。このプラスミドは多くの場合、毒性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含有し、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染および、境界配列での開裂によるＤＮＡの移転をもたらし、ウイルス介在性ＤＮＡ移転をもたらすと当分野で理解されている（Ｈｅｌｌｅｎｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５等）を植物形質転換に用いることができる。第二のプラスミドベクターは、他の方法（例えばマイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール等）による植物形質転換には必要ではない。
概して、植物形質転換法には、標的植物細胞（例えば、未成熟または成熟胚、培養懸濁液、未分化カルス、プロトプラスト等）への異種ＤＮＡの移転、次いで、最大閾値レベルの適切な選択（選択マーカー遺伝子による）を適用して形質転換された植物細胞を、非形質転換植物細胞の集団から回収することが含まれる。多くの場合、外殖片を、新しく供給した同じ培地へと移し、規定通りに培養する。引き続き、形質転換した細胞を、最大閾値レベルの選択剤を補充した再生培地上に置いた後、新芽（ｓｈｏｏｔ）へと分化させる。次いで、新芽を、発芽した新芽または植物体を回収するための選択発根培地へと移す。次いで、トランスジェニック植物体を、成熟植物へと成長させ、繁殖力のある種子を産生させる（例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２； Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０）。多くの場合、外殖片を、新しく供給した同じ培地へと写し、規定通りに培養する。トランスジェニック植物作製の技術および方法の一般的な記載は、Ａｙｒｅｓ ａｎｄ Ｐａｒｋ （１９９４） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：２１９−２３９ ａｎｄ Ｂｏｍｍｉｎｅｎｉ ａｎｄ Ｊａｕｈａｒ （１９９７） Ｍａｙｄｉｃａ ４２：１０７−１２０にある。形質転換された物質は多くの細胞を含有するため、形質転換された、および形質転換されていない細胞の両方が、対象となったどの標的カルスにも、またはどの組織にも、またはどの細胞群にも存在する。非形質転換細胞を殺し、形質転換された細胞を増殖させる能力により、形質転換された植物培養物を得ることができる。多くの場合、非形質転換細胞の除去能が、形質転換植物細胞の早急な回収およびトランスジェニック植物作製の成功の制約である。
形質転換プロトコールならびに、植物にヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールは、形質転換のターゲットとした植物または植物細胞のタイプ（すなわち、単子葉植物または双子葉植物）により変化しうる。トランスジェニック植物の作製は、いくつかの方法（限定されないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接遺伝子移転、アグロバクテリウムによる異種ＤＮＡの植物細胞への導入（アグロバクテリウム介在形質転換）、粒子に付着した異種外来性ＤＮＡを有する植物細胞の照射、弾道粒子加速、エアロゾルビーム形質転換（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号、米国特許第４，９４５，０５０号、国際特許出願公開第９１／００９１５号、米国特許出願公開第２００２０１５０６６号）、Ｌｅｃ１形質転換、およびＤＮＡを移転させるための様々な他の非粒子直接介在法）の内の１つにより実施されても良い。
葉緑体の形質転換のための方法は当分野に公知である。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０； Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：９１３−９１７； Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２：６０１−６０６を参照のこと。この方法は、選択可能なマーカーおよび相同組換えを介した、色素体ゲノムに対するＤＮＡ標的化を含有する、粒子銃デリバリーに依存する。さらに、色素体形質転換は、核にコードされ、色素体指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織好適発現による、サイレントな色素体担持導入遺伝子のトランス活性化により達成することができる。そのようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
異種外来性ＤＮＡの植物細胞への組込みの後で、非形質転換細胞を殺すために培地中の適切な選択の最大閾値レベルを適用し、この選択処理を生き延びた、形質転換したと推測される細胞を定期的に新鮮な培地へと移すことにより増殖させる。連続継代および適切な選択のチャレンジにより、プラスミドベクターで形質転換された細胞を特定し、増殖させる。次いで、分子生化学法を用いてトランスジェニック植物のゲノムへと組み込まれた対象の異種遺伝子の存在を確認することができる。
形質転換された細胞を、従来法に従い、植物へと成長させても良い。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照のこと。次いで、これらの植物を成長させても良く、および、同じ形質転換株、または異なる株のいずれかと受粉させ、所望の特定表現型の特徴を構造的に発現するハイブリッドを得る。２以上の世代を成長させ、所望の表現型の特徴の発現が安定的に維持され、遺伝的に受け継がれたことを確認し、次いで、採取された種子が、所望の表現型の特徴を発現していることを確認する。この方法において、本発明により、本発明のヌクレオチド構築物（例えば、そのゲノム内に安定的に組み込まれた本発明の発現カセット）を有する形質転換された種子（または「トランスジェニック種子」と呼称される）が提示される。
（植物におけるＩＣＫおよびＴＭＯＦ発現）
上述のように、ＥＲＳＰ、ＩＣＫモチーフタンパク質、ＴＭＯＦモチーフ、翻訳安定化タンパク質、および介在リンカーの成分に用いることができる、多くの代替物がある。
（植物形質転換の評価）
異種外来性ＤＮＡの植物細胞への導入の後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換または組込みが、例えば、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝物の分析等の様々な方法により確認される。
ＰＣＲ分析は、土に植える前の早期の段階で、形質転換された細胞、組織または新芽を、組み込まれた遺伝子の存在に対して、スクリーニングするための迅速法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。ＯＣＲは、対象の遺伝子またはアグロバクテリウムベクターのバックグラウンド等の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。
植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により確認されても良い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１、上述）。通常、トータルＤＮＡが形質転換体から抽出され、適切な制限酵素で消化され、アガロースゲルで分画化され、ニトロセルロース膜またはナイロン膜へとトランスファーされる。膜または「ブロット」は、次いで、例えば、放射性標識された３２Ｐ標的ＤＮＡ断片等でプローブされ、標準法に従い、植物ゲノムへの導入遺伝子の組込みを確認する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１、上述）。
ノーザンブロット分析において、当分野において日常的に用いられている標準的な手順に従い、ＲＮＡは、形質転換体の特定の組織から単離され、ホルムアルデヒドアガロースゲル中にて分画化され、ナイロンフィルター上へとブロッティングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１、上述）。Ｂｔタンパク質によりコードされるＲＮＡの発現を、次いで、当分野の公知の方法により、Ｂｔタンパク質から誘導された放射性プローブへのフィルターのハイブリダイゼーションにより検証する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１、上述）。
標準法により、Ｂｔタンパク質上に存在する１以上のエピトープに結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット、生化学分析等をトランスジェニック植物に行い、Ｂｔタンパク質遺伝子にコードされたタンパク質の存在を確認しても良い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１、上述）。
（植物における殺虫活性）
本発明の他の態様において、殺虫活性を有するＢｔタンパク質を発現するトランスジェニック植物を作製しても良い。例示の目的で上述される方法を利用して、トランスジェニック植物を作製しても良いが、トランスジェニック植物細胞を作製する方法は、本発明にとって重要ではない。例えばアグロバクテリウム介在形質転換、遺伝子重形質転換、および非粒子介在法等の当分野に公知の方法を用いても良い。例えばカルスの形質転換、形質転換カルスの選択、およびそのようなトランスジェニックカルスからの繁殖力のある植物の再生等の、当分野に公知の一般的な方法により、Ｂｔタンパク質を発現する植物を単離しても良い。そのようなプロセスにおいて、（植物細胞におけるその発現により、形質転換細胞の特定または選択能力が付与されるのであれば）、選択マーカーとして任意の遺伝子を用いても良い。
多くのマーカーが、植物細胞での使用のために開発されている（例えば、クロラムフェニコール耐性、アミノグリコシドＧ４１８耐性、ハイグロマイシン耐性等）。葉緑体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた、選択マーカーとしても用いても良い。例えば、植物除草剤（例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノン等）に対する抵抗性を与える遺伝子には特定の用途がありうる。そのような遺伝子が報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：６３１０−６３１４（ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子）；およびＳａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子））。さらに、本明細書に開示される遺伝子は、細菌または植物細胞の形質転換を分析するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、幹、根等）、種子、植物細胞、無性芽、胚または同子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は、当分野に公知である。１つの実施態様において、導入遺伝子の存在は、殺虫活性に対する検証により検出される。
Ｂｔタンパク質を発現する繁殖力のある植物を、殺虫活性に対して検証しても良く、さらなる繁殖のために選択される最適活性を示す植物を検証しても良い。通常、タンパク質は混合され、給餌分析において用いられる。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３、を参照のこと。
［セクションＶＩ．ＣＲＩＰおよびＢｔタンパク質の組み合わせの記述および例］
ＢｔおよびＩＣＫペプチドは、毒素の組み合わせが適切に昆虫の存在場所へと送達された場合に、昆虫の増殖を阻害し、動きを損ない、または殺虫さえし得る。ＳＤＰ １２３４６０４、１２３４６０５および６０９は、ハイブリッド＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチド（本明細書において「Ｈｖ１ａペプチド」）のスプレードライの粉末調製物である。スプレードライのＨｖ１ａペプチド粉末は、ペプチド、様々な賦形剤および発酵副産物から作製される。‘６０４および‘６０５製剤は同じペプチドを用いているが、賦形剤のみが異なる。活性ハイブリッドペプチドの濃度は、‘６０４および‘６０５粉末の両方で、約２６％重量／重量で計測された。活性ハイブリッドペプチドの濃度は、６０９粉末で、約３５％重量／重量で計測された。各粉末におけるＨｖ１ａペプチドは、当業者公知のＣ１８ｒｐＨＰＬＣ法を用いて計測された。
インヒビトリーシステインノットまたはＩＣＫペプチドは、環境へと曝された際に、際立った安定性を有している。多くのＩＣＫペプチドが毒性動物（例えばクモ、サソリおよびヘビ等）から単離されている。Ｂｔタンパク質は、その特異的な殺虫活性により良く知られている。驚くべきことに、我々は、Ｂｔタンパク質は、ＩＣＫペプチドと選択的に混合されると、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの組み合わせにより、予期されたものよりずっと高い効能を有する、高い有効性の殺虫剤が作製されることを見出した。
我々は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質；および殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチドの両方を含有する、殺虫性組み合わせペプチド組成物を記述する。この組成物は、ＩＣＫに対するＢｔの比率が、乾重量ベースで、およそ以下の比率のいずれか、または全てであっても良い：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、および１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。また、我々は、ＩＣＫに対するＢｔの比率が、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される組成物を記述する：０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および、０．０１：９９．９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。
本明細書に記述される手順は、任意のＰＦＩＰまたはＣＲＩＰペプチドに適用することができる。ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰペプチドの組み合わせとしては、２以上の異なるタイプ、または、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰペプチドの内の１つもしくは両方のいずれかに対する細菌株起源から誘導される、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰペプチドのいずれかまたは両方が挙げられる。細菌株起源とは、多くのＢｔタンパク質を含む、多くのＰＦＩＰペプチドがまた、それらはもはや、細菌株から全て発現されたものではないという意味で、人工的であるということを理解しつつ、ペプチドを発現する細菌株により発現されている、とされうるペプチドを意味する。
他の実施態様において、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰペプチドの組み合わせは、例えば、２以上の異なるタイプまたは、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内の１つもしくは両方のいずれかに対する細菌株起源から誘導される、ＩＣＫ、非ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドとの組み合わせにあるＢｔ等のＰＦＩＰのいずれかまたは両方を含む。細菌株起源とは、それらはもはや、細菌株から全て発現されたものではないという意味で、多くのＢｔタンパク質がまた人工的であるということを理解しつつ、ペプチドを発現する細菌株により発現されている、とされうるペプチドを意味する。
我々はまた、ＩＣＫ、非ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドとの組み合わせにあるＢｔ等のＰＦＩＰの内のいずれか、または両方が、２および５、２−１５、２−３０、５−１０、５−１５、５−３０、５−５０の間、および様々な他の異なるタイプ、または、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドの内の１つまたは両方のいずれかの細菌株起源から誘導される、組成物を開示する。我々は、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれかまたは両方が、２〜１５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの内の１つまたは両方のいずれかの細菌株起源によりコードされる、組成物を開示する。２−５、２−１５、２−３０、５−１０、５−１５、５−３０、５−５０の間、および様々な他の異なるタイプのこれらの組み合わせの内の任意のもの、ならびに、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの混合物は、組成物の各タイプの株の少なくとも１％超を構成することができる。
我々は、例えばＩＣＫ、非ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドとの組み合わせのＢｔ等の、ＰＦＩＰの組成物中の総濃度が、以下のパーセント濃度から選択される、請求項３３〜３８に記載のＢｔおよびＩＣＫペプチドの組成物を開示する：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、またはこれらの値の内の任意の２つの間の任意の範囲であり、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、ＩＣＫ、非ＩＣＫおよび／またはＴＭＯＦペプチド殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される、組成物を開示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されている。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結され、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。
我々は、前記組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているジペプチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されており、および、ここで、前記ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸、およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成され、ジペプチドがグリシン−セリンである実施態様が含まれ、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが昆虫の電位依存性カルシウムチャネルおよびカルシウム活性化カリウムチャネルの両方を阻害する任意の殺虫性ペプチドである実施態様が含まれ、前記殺虫性ＩＣＫペプチドがオーストラリアジョウゴグモの任意の種に由来する実施態様が含まれ、前記クモが、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅの属のオーストラリアジョウゴグモから選択される実施態様が含まれ、前記クモが、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモから選択される実施態様が含まれ、前記クモが、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａから選択される実施態様が含まれ、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである実施態様が含まれ、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが２０〜１００アミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有する実施態様が含まれ、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが、本明細書に開示される任意のＩＣＫ配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである実施態様が含まれ、前記殺虫性ＩＣＫペプチドが、参照により組み込まれる公表文献から選択される実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、任意の殺虫性Ｂｔタンパク質である実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質がＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質である実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２の組み合わせ、ならびにバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から選択される実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質の組み合わせである実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８または３４と少なくとも９０％の同一性であるアミノ酸配列を含有する実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、Ｄｉｐｅｌである実施態様が含まれ、前記Ｂｔタンパク質が、Ｔｈｕｒｉｃｉｄｅである実施態様が含まれる。
我々は、形質転換植物または植物ゲノム中で、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質；および殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）タンパク質のヌクレオチドを含有する組成物を開示し、ここで、ＩＣＫに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、および１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。
我々は、ＰＦＩＰの比率、例えば、ＩＣＫ、非ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドに対するＢｔ、好ましくはＩＣＫに対するＢｔまたは、Ａｎｏｍｏｎｅ毒素に対するＢｔが、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される、形質転換植物または植物ゲノムを開示する：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。形質転換植物または植物ゲノムは、ＢｔおよびＩＣＫの両方もしくはいずれかを有していても良く、または、Ａｎｏｍｏｎｅタンパク質は、２以上の異なるタイプ、またはＢｔもしくはＩＣＫタンパク質の細菌株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質のいずれかもしくは両方は、２〜５の異なるタイプの間、またはＢｔまたはＩＣＫタンパク質のいずれかの細菌株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質は両方とも、２〜５の異なるタイプまたは株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質のいずれかまたは両方は、２〜１５の異なるタイプまたは、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質のいずれかまたは両方、ならびに、ＢｔまたはＩＣＫのいずれかの少なくとも１つの株、またはＢｔもしくはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーによりコードされるＢｔおよびＩＣＫタンパク質の両方、の細菌株の起源から誘導され、または、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質のいずれかまたは両方は、２以上の異なるタイプ、または、Ｂｔおよび／またはＩＣＫタンパク質の細菌株起源から誘導され、Ｂｔおよび／またはＩＣＫタンパク質の株全ては、前記組成物の各タイプの株の少なくとも１％超を構成し、または、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質のいずれかまたは両方は、２〜５の異なるタイプまたはＢｔおよびＩＣＫタンパク質のいずれかまたは両方、およびＢｔまたはＩＣＫまたはＩＣＫ遺伝子のＢｔの２以上のコピーによりコードされるＢｔとＩＣＫタンパク質の両方の少なくとも１つの株の細菌株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＩＣＫタンパク質の組成物中の総濃度は、以下のパーセント濃度から選択されても良い：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
本明細書に記述される組成物および植物は、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造された殺虫性組み合わせタンパク質を含有し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されている。他の実施態様において、殺虫性組み合わせペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結され、ここで、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。他の実施態様においては、本明細書に記述されるヌクレオチド由来の組み合わせペプチドを組込み、発現するトランスジェニック植物であり、ここで、前記組み合わせペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているジペプチドを発現するヌクレオチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造されており、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されており；ならびに、ここで、ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される。他の実施態様において、トランスジェニック植物は、グリシン−セリンであるジペプチドを有している。他の実施態様において、トランスジェニック植物は、ＩＣＫおよびＢｔタンパク質の殺虫性ペプチドの組み合わせから構成される、発現される殺虫性ＩＣＫペプチドを有している。トランスジェニック植物は、オーストラリアジョウゴグモの任意の種、または、ＡｔｒａｘまたはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅの属のオーストラリアジョウゴグモ、およびオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、から誘導される殺虫性ＩＣＫペプチドを有していても良い。
我々は、発現される殺虫性ＩＣＫペプチドが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａであり、および、または、発現される殺虫性ＩＣＫペプチドが、２０〜１００アミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有し、および、または、殺虫性ＩＣＫペプチドが、本明細書に開示される任意のＩＣＫペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである、トランスジェニック植物を記述およびクレームする。開示されるトランスジェニック植物は、Ｂｔタンパク質ががＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質である、および／または、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２の組み合わせ、ならびにバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、ペプチドを含む、任意の公知のＢｔタンパク質を含有しても良い。Ｂｔタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質もしくはＣｒｙ１Ｆタンパク質、または、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質の組み合わせ、から選択されても良く、または、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８または３４と少なくとも９０％の同一性であるアミノ酸配列を含有する。我々は、前記Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌであるトランスジェニック植物を記述し、および、我々は、前記Ｂｔタンパク質が、Ｔｈｕｒｉｃｉｄｅであるトランスジェニック植物を記述する。
我々は、形質転換植物の平均的な葉におけるＢｔおよびＩＣＫペプチドの平均濃度が、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲にある、本明細書に記述されるペプチドを発現する形質転換植物を具体的に記述およびクレームする。我々は、形質転換植物で適切にフォールディングされた毒素ペプチドを発現する形質転換植物を具体的に記述およびクレームする。我々は、形質転換植物において適切にフォールディングされた組み合わせ毒性ペプチドを発現し、前記植物において、発現および適切にフォールディングされた毒性ペプチドの蓄積をもたらし、および、植物の産生量または昆虫の損害に対する抵抗性を増加させる形質転換植物を具体的に記述およびクレームし、それらにより、農作物および林業における害虫を制御する。我々は、本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物を記述する。
我々は、本明細書に記述される任意のペプチドを発現する任意のヌクレオチドを含有する発現カセットを記述し、それには、本明細書に開示される任意のペプチドをコードするヌクレオチドが含有され、本明細書に開示される教示により当業者により作製されることができる、形質転換植物へと組み込まれた機能的発現カセットを有する実施態様が含まれる。我々は、本明細書に記述される任意のペプチドを有する、または発現する形質転換植物の作製のための手順を記述およびクレームする。
我々は、本明細書に記述される任意のペプチドまたはヌクレオチドの、植物を作製するための、または、これらのペプチドまたはヌクレオチドを植物へと形質転換するための使用を記述し、ならびに、任意のペプチドを含有する植物および／または発現カセットにおいてこれらタンパク質を作製するための方法および技術を開示し、ならびに、植物ゲノムへそれらを形質転換するための方法を開示し、ならびに、任意の記述されるペプチドまたはヌクレオチドを植物へと使用、作製、形質転換する任意の方法を開示し、ならびに、開示されるペプチドおよびその対応するヌクレオチドの任意のものを含有する、植物における機能的発現カセットおよびペプチドの任意のものを有する、または発現する形質転換植物を作製するための方法および技術を開示し、ならびに、本明細書に記述される産物およびプロセスにより作製される任意の植物を開示する。
一部の実施態様において、我々は、本明細書に記述される核酸または発現カセットに操作可能に連結されている、植物において活性となるプロモーターを含有するキメラ遺伝子を開示する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを作製、製造、または使用する方法を開示する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを含有する組換えベクターを開示する。我々は、組換えベクターを作製、製造または使用する方法を開示する。我々は、本明細書に記述される組み合わせ遺伝子を含有するトランスジェニック宿主細胞を開示し、および、トランスジェニック宿主細胞（トランスジェニック植物細胞であっても良い）を作製、製造または使用する方法を開示し、および、そのようなトランスジェニック植物細胞ならびにトランスジェニック植物細胞を含有するトランスジェニック植物を作製、製造または使用する方法を開示し、ならびに、トランスジェニック植物をどのように作製および使用するかを開示する。我々は、トウモロコシ、大豆、綿花、イネ、モロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモまたはトマトから誘導される、本明細書に記述される特性を有するトランスジェニック植物および種子を開示する。このトランスジェニック種子は、我々が本明細書に記述するキメラ遺伝子を有していても良い。我々は、本開示のトランスジェニック植物および、または種子を作製、製造または使用する方法を開示する。
また、我々は、本発明の使用方法を記述し、新規製剤を提示する。本発明は、昆虫の制御に最も有用である。我々は、以下を含む昆虫を制御する方法を記述する：Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質を前記昆虫に適用すること；および殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチドを前記昆虫に適用すること。本方法は、Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチドが、同じ組成物中で同じ時間に、共に適用されて使用されても良く、または、異なる組成物中で異なる時間に、別々に適用されて使用されても良い。Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチドは、連続的に適用されても良く、および、（Ｂｔタンパク質）抵抗性昆虫に対して適用されても良い。ＩＣＫに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、少なくともおよそ以下の比率から選択されても良い：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。ＩＣＫに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択されても良い：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれか、または両方は、２以上の異なるタイプまたはＢｔおよびＩＣＫペプチドの細菌株起源から誘導される。ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれか、または両方は、２〜５の間の異なるタイプ、またはＢｔまたはＩＣＫペプチドまたはＢｔとＩＣＫペプチドの両方のいずれかの細菌株起源から誘導される。ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれかまたは両方は、２〜１５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれかまたは両方の細菌株起源から誘導され、ならびに、ＢｔまたはＩＣＫまたはＢｔとＩＣＫペプチドのいずれかの内の少なくとも１つの株は、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーによりコードされる。ＢｔおよびＩＣＫペプチドの内の１または両方のいずれかは、２以上の異なるタイプ、または、Ｂｔおよび／もしくはＩＣＫペプチドの細菌株起源から誘導され、Ｂｔおよび／またはＩＣＫペプチドの全ての株は、前記組成物中の各タイプの株由来のペプチドの少なくとも１％超を構成する。ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれか、または両方は、２〜５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれか１つまたは両方の細菌株起源から誘導され、および、ＢｔまたはＩＣＫまたはＢｔとＩＣＫペプチドの両方の内の少なくとも１つの株は、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーによりコードされる。組成物中のＢｔおよびＩＣＫペプチドの総濃度は、以下のパーセント濃度から選択される：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
この方法は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される場合に用いられても良く、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されている。一部の実施態様においては、殺虫性組み合わせペプチドは、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結され、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。
本明細書に記述される任意のペプチドおよび植物を用いて、昆虫を制御することができ、その増殖および損傷、特に植物に対するその損傷を制御することができる。Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチドの組み合わせは、植物へのスプレー、または昆虫のいる場所、または防御の必要がある植物の場所にスプレーすることにより、適用されても良い。
また、我々は、本開示により当業者により作製されることができる任意の組成物、または本明細書に記述される任意の組成物を含有することができる、Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチドを含有する製剤を記述する。記述される製剤の一部は、極性非プロトン性溶媒、および、もしくは水の使用を含み、ならびに、または、極性非プロトン性溶媒が１〜９９ｗｔ％の量で存在する場合、極性プロトン性溶媒は、１〜９９ｗｔ％の量で存在し、水は、０〜９８ｗｔ％の量で存在する。この製剤には、Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌであり、殺虫性ＩＣＫペプチドがハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドである製剤が含まれる。極性非プロトン性溶媒製剤は、ＭＳＯを含有する場合、特に有効である。以下の例は、解説の意図であり、いかなる場合でも本発明を限定するものではない。
［セクションＶＩＩ．ＴＭＯＦおよびＢｔ組み合わせの記述および例］
ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドは、毒素の組み合わせが、昆虫が存在する場所へ適切に送達された場合に、昆虫の増殖を阻害し、動きを損ない、さらには昆虫を殺しうる。スプレードライ粉末は、ペプチド、様々な賦形剤および発酵副産物から作製される。
我々は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質；および殺虫性ＴＭＯＦペプチドの両方を含有する殺虫性組み合わせペプチド組成物を記述する。この組成物は、ＴＭＯＦに対するＢｔの比率が、乾重量ベースで、およそ以下の比率の内の任意のものまたは全てであっても良い：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。ＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される組成物を記述する：０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。
他の実施態様において、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの組み合わせには、２以上の異なるタイプまたは、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれか１つまたは両方に対する細菌株起源から誘導される、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれかまたは両方が含まれる。細菌株起源とは、それらはもはや、細菌株から全て発現されたものではないという意味で、多くのＢｔタンパク質がまた人工的であるということを理解しつつ、ペプチドを発現する細菌株により発現されている、と記述されうるペプチドを意味する。
我々はまた、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれかまたは両方が、２および５、２−１５、２−３０、５−１０、５−１５、５−３０、５−５０の間、および様々な他の異なるタイプ、または、ＢｔもしくはＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは両方のいずれかの細菌株起源から誘導される、組成物を開示する。我々は、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれかまたは両方が、２〜１５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは両方のいずれかの細菌株起源によりコードされる、組成物を開示する。２−５、２−１５、２−３０、５−１０、５−１５、５−３０、５−５０および様々な他の異なるタイプのこれらの組み合わせの内の任意のもの、ならびに、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの混合物は、組成物の各タイプの株の少なくとも１％超を構成することができる。
我々は、組成物中のＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの総濃度が、以下のパーセント濃度から選択される、ＢｔおよびＴＭＯＦの組成物を開示する：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、またはこれらの値の内の任意の２つの間の任意の範囲であり、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結されている。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結され、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。
我々は、前記組み合わせペプチドが、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているジペプチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結されており、および、ここで、前記ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸、およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成され、ジペプチドがグリシン−セリンである実施態様が含まれ、殺虫性ＴＭＯＦペプチドが、本明細書に開示される任意のＴＭＯＦ配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性である、任意の実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、任意の殺虫性Ｂｔタンパク質である実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質がＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質である実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２の組み合わせ、ならびにバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から選択される実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質の組み合わせである実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８または３４と少なくとも９０％の同一性であるアミノ酸配列を含有する実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、Ｄｉｐｅｌである実施態様が含まれ、Ｂｔタンパク質が、Ｔｈｕｒｉｃｉｄｅである実施態様が含まれる。
我々は、形質転換植物または植物ゲノム中で、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質；および殺虫性ＴＭＯＦペプチドのヌクレオチドを含有する組成物を開示し、ここで、ＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、および１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。
我々は、ＴＭＯＦに対するＢｔの比率が、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される、形質転換植物または植物ゲノムを開示する：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。形質転換植物または植物ゲノムは、２以上の異なるタイプまたはＢｔもしくはＴＭＯＦペプチドの細菌株起源から誘導される、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの両方もしくはいずれかを有していても良く、または、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれかまたは両方は、２〜５の異なるタイプまたは、ＢｔもしくはＴＭＯＦペプチドのいずれかの細菌株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの両方は、２〜５の異なるタイプまたは株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれか、または両方は、２〜１５の異なるタイプまたは、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれかまたは両方の細菌株起源から誘導され、ならびに、ＢｔまたはＴＭＯＦまたはＢｔとＴＭＯＦペプチドの両方のいずれかの内の少なくとも１つの株は、ＢｔまたはＴＭＯＦ遺伝子の内の２以上のコピーによりコードされ、または、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれかもしくは両方は、２以上の異なるタイプまたは、Ｂｔおよび／もしくはＴＭＯＦペプチドの細菌株起源から誘導され、ここで、Ｂｔおよび／またはＴＭＯＦペプチドの全ての株は、前記組成物に対する各タイプの株の少なくとも１％超を構成し、または、ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれかもしくは両方は、２〜５の異なるタイプまたはＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれかまたは両方の細菌株起源から誘導され、ならびに、ＢｔもしくはＴＭＯＦもしくはＢｔとＴＭＯＦペプチドのいずれかの内の少なくとも１つの株は、ＴＭＯＦ遺伝子のＢｔの２以上のコピーによりコードされ、または、組成物中のＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの総濃度は、以下のパーセント濃度から選択されても良い：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
本明細書に記述される組成物および植物は、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造された殺虫性組み合わせタンパク質を含有し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結されている。他の実施態様において、殺虫性組み合わせペプチドは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結され、ここで、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。他の実施態様においては、本明細書に記述されるヌクレオチド由来の組み合わせペプチドを組込み、発現するトランスジェニック植物であり、ここで、前記組み合わせペプチドは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているジペプチドを発現するヌクレオチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造されており、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結されており；ならびに、ここで、ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される。他の実施態様において、トランスジェニック植物は、グリシン−セリンであるジペプチドを有している。他の実施態様において、トランスジェニック植物は、ＴＭＯＦおよびＢｔタンパク質の殺虫性ペプチドの組み合わせから構成される、発現される殺虫性ＴＭＯＦペプチドを有している。トランスジェニック植物は、任意のＴＭＯＦ種から誘導される殺虫性ＴＭＯＦペプチドを有しても良い。
我々は、発現される殺虫性ＴＭＯＦペプチドが、２０〜１００アミノ酸を含有し、および、または、殺虫性ＴＭＯＦペプチドが、本明細書に記述される任意のＴＭＯＦペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである、トランスジェニック植物を記述およびクレームする。開示されるトランスジェニック植物は、Ｂｔタンパク質ががＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質である、および／または、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２の組み合わせ、ならびにバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、ペプチドを含む、任意の公知のＢｔタンパク質を含有しても良い。Ｂｔタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質もしくはＣｒｙ１Ｆタンパク質、または、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質の組み合わせ、から選択されても良く、または、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８または３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する。我々は、前記Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌであるトランスジェニック植物を記述し、および、我々は、前記Ｂｔタンパク質が、Ｔｈｕｒｉｃｉｄｅであるトランスジェニック植物を記述する。
我々は、形質転換植物の平均的な葉におけるＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの平均濃度が、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲にある、本明細書に記述されるペプチドを発現する形質転換植物を具体的に記述およびクレームする。我々は、形質転換植物で適切にフォールディングされた毒素ペプチドを発現する形質転換植物を具体的に記述およびクレームする。我々は、形質転換植物において適切にフォールディングされた組み合わせ毒性ペプチドを発現し、前記植物において、発現および適切にフォールディングされた毒性ペプチドの蓄積をもたらし、および、植物の産生量または昆虫の損害に対する抵抗性を増加させる形質転換植物を具体的に記述およびクレームし、それらにより、農作物および林業における害虫を制御する。我々は、本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物を記述する。
我々は、本明細書に記述される任意のペプチドを発現する任意のヌクレオチドを含有する発現カセットを記述し、それには、本明細書に開示される任意のペプチドをコードするヌクレオチドが含有され、本明細書に開示される教示により当業者により作製されることができる、形質転換植物へと組み込まれた機能的発現カセットを有する実施態様が含まれる。我々は、本明細書に記述される任意のペプチドを有する、または発現する形質転換植物の作製のための手順を記述およびクレームする。
我々は、本明細書に記述される任意のペプチドまたはヌクレオチドの、植物を作製するための、または、これらのペプチドまたはヌクレオチドを植物へと形質転換するするための使用を記述し、ならびに、任意のペプチドを含有する植物および／または発現カセットにおいてこれらタンパク質を作製するための方法および技術を開示し、ならびに、植物ゲノムへそれらを形質転換するための方法を開示し、ならびに、任意の記述されるペプチドまたはヌクレオチドを植物へと使用、作製、形質転換する任意の方法を開示し、ならびに、開示されるペプチドおよびその対応するヌクレオチドの任意のものを含有する、植物における機能的発現カセットおよびペプチドの任意のものを有する、または発現する形質転換植物を作製するための方法および技術を開示し、ならびに、本明細書に記述される産物およびプロセスにより作製される任意の植物を開示する。
一部の実施態様において、我々は、本明細書に記述される核酸または発現カセットに操作可能に連結されている、植物において活性となるプロモーターを含有するキメラ遺伝子を開示する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを作製、製造、または使用する方法を開示する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを含有する組換えベクターを開示する。我々は、組換えベクターを作製、製造または使用する方法を開示する。我々は、本明細書に記述される組み合わせ遺伝子を含有するトランスジェニック宿主細胞を開示し、および、トランスジェニック宿主細胞（トランスジェニック植物細胞であっても良い）を作製、製造または使用する方法を開示し、および、そのようなトランスジェニック植物細胞ならびにトランスジェニック植物細胞を含有するトランスジェニック植物を作製、製造または使用する方法を開示し、ならびに、トランスジェニック植物をどのように作製および使用するかを開示する。我々は、トウモロコシ、大豆、綿花、イネ、モロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモまたはトマトから誘導される、本明細書に記述される特性を有するトランスジェニック植物および種子を開示する。このトランスジェニック種子は、我々が本明細書に記述するキメラ遺伝子を有していても良い。我々は、本開示のトランスジェニック植物および、または種子を作製、製造または使用する方法を開示する。
また、我々は、本発明の使用方法を記述し、新規製剤を提示する。本発明は、昆虫の制御に最も有用である。我々は、以下を含む昆虫を制御する方法を記述する：Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質を前記昆虫に適用すること；および殺虫性ＴＭＯＦペプチドを前記昆虫に適用すること。本方法は、Ｂｔタンパク質および殺虫性ＩＣＫペプチドが、同じ組成物中で同じ時間に、共に適用されて使用されても良く、または、異なる組成物中で異なる時間に、別々に適用されて使用されても良い。Ｂｔタンパク質および殺虫性ＴＭＯＦペプチドは、連続的に適用されても良く、および、（Ｂｔタンパク質）抵抗性昆虫に対して適用されても良い。ＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、少なくともおよそ以下の比率から選択されても良い：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。ＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択されても良い：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれか、または両方は、２以上の異なるタイプまたはＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの細菌株起源から誘導される。ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれか、または両方は、２〜５の間の異なるタイプ、またはＢｔまたはＴＭＯＦペプチドまたはＢｔとＴＭＯＦペプチドの両方のいずれかの細菌株起源から誘導される。ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれかまたは両方は、２〜１５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれかまたは両方の細菌株起源から誘導され、ならびに、ＢｔまたはＴＭＯＦまたはＢｔとＴＭＯＦペプチドのいずれかの内の少なくとも１つの株は、ＢｔまたはＴＭＯＦ遺伝子の２以上のコピーによりコードされる。ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内の１または両方のいずれかは、２以上の異なるタイプ、または、Ｂｔおよび／もしくはＴＭＯＦペプチドの細菌株起源から誘導され、Ｂｔおよび／またはＴＭＯＦペプチドの全ての株は、前記組成物中の各タイプの株由来のペプチドの少なくとも１％超を構成する。ＢｔおよびＴＭＯＦペプチドのいずれか、または両方は、２〜５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれか１つまたは両方の細菌株起源から誘導され、および、ＢｔまたはＴＭＯＦまたはＢｔとＴＭＯＦペプチドの両方の内の少なくとも１つの株は、ＢｔまたはＴＭＯＦ遺伝子の２以上のコピーによりコードされる。組成物中のＢｔおよびＴＭＯＦペプチドの総濃度は、以下のパーセント濃度から選択される：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲、および組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
前記方法は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される場合に用いられても良く、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結されている。一部の実施態様においては、殺虫性組み合わせペプチドは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＴＭＯＦペプチドのＮ末端に連結され、前記ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。
本明細書に記述される任意のペプチドおよび植物を用いて、昆虫を制御することができ、その増殖および損傷、特に植物に対するその損傷を制御することができる。Ｂｔタンパク質および殺虫性ＴＭＯＦペプチドの組み合わせは、植物へのスプレー、または昆虫のいる場所、または防御の必要がある植物の場所にスプレーすることにより、適用されても良い。
また、我々は、本開示により当業者により作製されることができる任意の組成物、または本明細書に記述される任意の組成物を含有することができる、Ｂｔタンパク質および殺虫性ＴＭＯＦペプチドを含有する製剤を記述する。記述される製剤の一部は、極性非プロトン性溶媒、および、もしくは水の使用を含み、ならびに、または、極性非プロトン性溶媒が１〜９９ｗｔ％の量で存在する場合、極性プロトン性溶媒は、１〜９９ｗｔ％の量で存在し、水は、０〜９８ｗｔ％の量で存在する。この製剤には、Ｂｔタンパク質がＤｉｐｅｌであり、殺虫性ＴＭＯＦペプチドが、配列表に提示される任意のＴＭＯＦペプチド様のペプチドである製剤が含まれる。極性非プロトン性溶媒製剤は、ＭＳＯを含有する場合、特に有効である。以下の例は、解説の意図であり、いかなる場合でも本発明を限定するものではない。
要約のために、パート３を以下に記述する。
少なくとも２つのタイプの殺虫性タンパク質またはペプチドを含有する組成物であって、ここで、１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）および他方のタイプは、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）である。この組成物が、少なくとも２つのタイプの殺虫性ペプチドを含有できる場合で、１つのタイプが孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、前記ＰＦＩＰがＢｔタンパク質であり、他方のタイプがシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、前記ＣＲＩＰがＩＣＫタンパク質であり、前記ＩＣＫタンパク質が、ジョウゴグモから誘導される。我々は、ａ）昆虫または昆虫の試料を評価し、および任意の評価を行って、昆虫がＰＦＩＰに対して抵抗性を示すかどうかを測定する、およびｂ）前記評価の結果から、前記昆虫の試料がＰＦＩＰに抵抗性であるという結論が導かれる場合、次いで、ｃ）１以上のＣＲＩＰＳの適用、および任意選択的にＣＲＩＰＳは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは突然変異体もしくは変異体として知られる毒素を含む、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ由来のＩＣＫ、またはブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓ由来のＩＣＫであっても良く、または、ＣＲＩＰは、イソギンチャク由来、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉと名付けられるイソギンチャク由来の非ＩＣＫ（Ａｖ２およびＡｖ３と名付けられるペプチド、特に、配列表にあるこれらに類似のペプチド）であっても良い。我々は、Ｂｔ抵抗性昆虫を含む、昆虫を制御する方法を記述し、この方法には、少なくとも２つのタイプのペプチドの組成物を生成することであって、ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他方のタイプのペプチドはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰタンパク質は、本明細書に記述される任意の組成物から選択され、および、配列表に提示される任意のタンパク質から選択され、次いで、前記組成物を昆虫のいる場所に適用することが含まれる。我々は、Ｂｔ抵抗性昆虫を含む昆虫を制御する方法を記述し、この方法には、少なくとも２つの適切にフォールディングされたペプチドの組み合わせを発現する植物を作製することを含む、Ｂｔ抵抗性昆虫から植物を防御することが含まれ、ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他のペプチドのタイプはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰタンパク質は、本明細書に記述される任意の組成物から選択され、および、配列表に提示される任意のタンパク質から選択される。我々は、ａ）昆虫または昆虫試料の評価および任意の評価を行って、昆虫がＰＦＩＰに対して抵抗性を示すかどうかを測定する、およびｂ）前記評価の結果から、前記昆虫試料がＰＦＩＰに対して抵抗性であるという結論が導かれた場合、次いで、ｃ）１以上のＣＲＩＰを適用し、および任意選択的に、ｄ）ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰの組み合わせを、同時に、または連続適用のいずれかで適用することを含むプロセスを記述する。
我々は、少なくとも２つのタイプの殺虫性タンパク質またはペプチドを含有する組成物を記述し、ここで、１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他のタイプはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）である。ＣＲＩＰがＩＣＫであり、および、任意選択的に、前記ＩＣＫが、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは突然変異体もしくは変異体として知られる毒素を含む、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａから誘導される、または由来のＩＣＫ、またはブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓから誘導される、または由来するＩＣＫである、組成物。ＣＲＩＰが、非ＩＣＫ ＣＲＩＰであり、および、任意選択的に、前記非ＩＣＫ ＣＲＩＰが、例えばイソギンチャク、ウニ、およびウミウシ等（任意選択的に、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉと名付けられるイソギンチャクを含む）の非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳ（Ａｖ２およびＡｖ３と名付けられるペプチド、特に、配列表にあるようなペプチドを含む、Ａｖ２およびＡｖ３に類似のペプチドまたは突然変異体もしくは変異体）を有する動物から誘導される、または由来する、組成物。少なくとも２つのタイプのペプチドの組成物を生成し、次いで、前記組成物を昆虫のいる場所に適用することを含有する、Ｂｔ抵抗性昆虫を含む、昆虫制御組成物を使用する方法であって、ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他方のタイプのペプチドはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰタンパク質は、請求項１および本明細書に記述される任意の組成物、および、配列表に提示される任意のタンパク質から選択される、方法。Ｂｔ抵抗性昆虫を含む、昆虫制御方法であって、この方法には、少なくとも２つの適切にフォールディングされたペプチドの組み合わせを発現する植物を作製することを含む、Ｂｔ抵抗性昆虫から植物を防御することが含まれ、ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他のペプチドのタイプはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰおよびＣＲＩＰタンパク質は、本明細書に記述される任意の組成物および、配列法に提示される任意のタンパク質から選択される、方法。Ｂｔ抵抗性昆虫を含む、昆虫の制御法であって、ＣＲＩＰは、ＰＦＩＰが昆虫の腸の内膜に影響を及ぼす任意のときに投与される、方法。Ｂｔ抵抗性昆虫を含む、昆虫の制御法であって、ＣＲＩＰは、昆虫をＢｔ抵抗性に関して検証した後に投与され、ここで、前記検証された昆虫がＢｔ抵抗性陽性である、方法。本明細書に記述される任意の化合物を、固形または液体の形態で、昆虫、昆虫のいる場所に適用または送達されること、または、植物組込み型防御剤として適用または送達されること。
我々は、少なくとも２つのタイプの殺虫性ペプチドを含有する組成物を記述し、ここで、１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、ここで、前記ＰＦＩＰは、ｃｒｙタンパク質であり、他のタイプはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ここで、前記ＣＲＩＰはＩＣＫタンパク質であり、ここで、前記ＩＣＫタンパク質はジョウゴグモ由来である。我々は、少なくとも２つのタイプの殺虫性ペプチドを含有する組成物を記述し、ここで、１つのタイプは孔形成殺虫性ペプチド（ＰＦＩＰ）であり、ここで、前記ＰＦＩＰは、その起源としてＢｔタンパク質を有しており、他のタイプは、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ここで、前記ＣＲＩＰは非ＩＣＫタンパク質である。我々は、少なくとも２つのタイプの殺虫性ペプチドを含有する組成物を記述し、ここで、１つのタイプは孔形成殺虫性ペプチド（ＰＦＩＰ）であり、他のタイプはＴＭＯＦである。我々は、Ｂｔ抵抗性昆虫を含む昆虫から植物を防御する方法を記述し、この方法には、少なくとも２つの異なるタイプのペプチドの組み合わせを組み込む植物を作製することが含まれ、ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性ペプチド（ＰＦＩＰ）であり、他のタイプはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）である。我々は、Ｂｔ抵抗性昆虫を含む昆虫から植物を防御する方法を記述し、この方法には、少なくとも２つの適切にフォールディングされたペプチドの組み合わせを発現する植物を作製することが含まれ、ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性ペプチド（ＰＦＩＰ）であり、他のペプチドのタイプはシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、ＰＦＩＰとＣＲＩＰタンパク質は、本明細書に記述される任意の組成物、および配列表に提示される任意のタンパク質から選択される。
我々は、システインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）；例えば、クモペプチド様の殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチド、またはイソギンチャク毒素様の非ＩＣＫと組み合わされた、Ｂｔペプチド様の孔形成殺虫性タンパク質（ＦＰＩＰ）（例えば、ｃｒｙ、ｃｙｐまたはＶＩＰ）；または、システインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）；例えば、殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチドと組み合わされたＴＭＯＦ（トリプシン介在オースタティック因子）ペプチド等、を含有する殺虫性組み合わせペプチド組成物を記述する。ＣＲＩＰはイソギンチャクペプチド（例えばＡｖ２およびＡｖ３）様の非ＩＣＫタンパク質および配列表にある他の類似の配列であっても良いことに注意されたい。我々は、ＣＲＩＰに対するＢｔの比率、ＩＣＫに対するＢｔの比率、非ＩＣＫ ＣＲＩＰに対するＢｔの比率、ＴＭＯＦに対するＢｔに比率、またはＩＣＫとＴＭＯＦに対するＢｔの比率が、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択されるような組成物を記述する：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および、１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。あるいは、ＣＲＩＰに対するＢｔの比率、ＩＣＫに対するＢｔの比率、非ＩＣＫ ＣＲＩＰに対するＢｔの比率、ＴＭＯＦに対するＢｔに比率、およびＴＭＯＦ、およびイソギンチャクの比率が、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される：５０：５０、４５：５５、０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および、０．０１：９９．９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ。あるいは、ＣＲＩＰに対するＢｔの比率、ＩＣＫに対するＢｔの比率、非ＩＣＫ ＣＲＩＰに対するＢｔの比率、ＴＭＯＦに対するＢｔの比率、または、ＩＣＫとＴＭＯＦに対するＢｔの比率、およびイソギンチャクペプチドは、２以上の異なるタイプ、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドの内の１つまたは両方のいずれかの細菌株起源から誘導される。あるいは、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドは、２〜５の間の異なるタイプ、またはＢｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドの内の１つまたは両方のいずれかの細菌株起源から誘導され、およびＴＭＯＦペプチドは２〜５の間の異なる株から誘導される。あるいは、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは両方のいずれかは、２〜５の異なるタイプまたは、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは全てのいずれかの細菌株起源から誘導される。あるいは、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの内のいずれかまたは両方は、２〜1５の異なるタイプまたは、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは全てのいずれかの細菌株起源によりコードされる。あるいは、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは全ては、２〜１５の異なるタイプまたは、Ｂｔ、ＩＣＫ、およびＴＭＯＦペプチドの内の１つまたは全てのいずれかの細菌株起源により誘導され、および、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドのいずれかの内の少なくとも１つの株、または、Ｂｔ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの両方、ならびに、ＢｔとＩＣＫ、ＢｔとＴＭＯＦ、またはＢｔとＩＣＫ＋ＴＭＯＦペプチドは、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の内の２以上のコピーによりコードされる。あるいは、Ｂｔ、ＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチド、およびＴＭＯＦペプチドのいずれかまたは両方は、２〜１５の株、またはＢｔおよび／またはＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの細菌型（Ｂｔおよび／またはＩＣＫペプチドの株全ては、前記組成物の各タイプの株の少なくとも１％超を構成する）から誘導される。
我々は、１〜９番のＢｔおよびＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドおよびＴＭＯＦペプチドの組成物を記述し、ＢｔおよびＣＲＩＰペプチドの組成物中の総濃度は、以下のパーセント濃度から選択される：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％、またはこれらの値の内の任意の２つの間の任意の範囲、および組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。我々は、殺虫性生み合わせペプチドが、殺虫性ＣＲＩＰペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される、組成物を記述し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＣＲＩＰペプチドのＮ末端に連結されている。我々は、殺虫性生み合わせペプチドが、殺虫性ＣＲＩＰペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される、組成物を記述し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＣＲＩＰペプチドのＮ末端に連結され、ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。我々は、前記組み合わせペプチドが、殺虫性ＣＲＩＰペプチドに操作可能に連結されているジペプチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される、組成物を記述し、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＣＲＩＰペプチドのＮ末端に連結されており；および、ここで、ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される。我々は、前記ジペプチドがグリシン−セリンである組成物を記述する。
我々は、殺虫性ＣＲＩＰペプチドが、昆虫の電位依存性カルシウムチャネルおよびカルシウム活性化カリウムチャネルの両方を阻害する任意の殺虫性ペプチドである、組成物を記述し、ここで殺虫性ＣＲＩＰペプチドは、オーストラリアジョウゴグモの任意の種に由来し、および、ここで、前記クモは、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅの属のオーストラリアジョウゴグモから選択され、および、ここで、前記クモは、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａから選択され、および、ここで、殺虫性ＣＲＩＰペプチドは、ハイブリッド−ＡＶＴＸ−Ｈｖ１ａであり、および、ここで、前記殺虫性ＣＲＩＰペプチドは、２０〜１００のアミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有し、ここで、前記殺虫性ＣＲＩＰペプチドは、配列表の任意のペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである。
我々は、殺虫性ＣＲＩＰペプチドが、Ｂｔタンパク質由来であり、Ｂｔタンパク質が、ＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質、またはＣｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２の組み合わせ、ならびにバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択されることを記述する。我々は、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から選択されるＢｔタンパク質を記述する。我々は、前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質、ＤｉｐｅｌまたはＴｈｕｒｉｃｉｄｅの組み合わせであり、Ｂｔタンパク質が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｋｕｒｓｔａｋｉ由来であることを記述する。
我々は、形質転換植物または植物ゲノムで、ＰＦＩＰ（例えば、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質）；およびＣＲＩＰ（例えば、殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチド）、または非ＩＣＫペプチドのヌクレオチドを含有する組成物を記述し、ＩＣＫに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およぼ以下の比率から選択される：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および、１：９９、またはこれらの値の内の任意の２つの任意の組み合わせ、または、形質転換植物もしくは植物ゲノムで、乾重量ベースで、ＩＣＫに対するＢｔの比率が、およそ以下の比率から選択される、番号３３の組成物を記述する：０：５０、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および０．０１：９９．９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。
我々は、コードされるＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれかまたは両方が、２以上の異なるタイプ、または、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドの細菌株起源から誘導され、コードされるＢｔおよびＩＣＫペプチドの内のいずれかまたは両方が、２〜５の間の異なるタイプ、または、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドのいずれかの細菌株起源から誘導され、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドの両方が、２〜５の間の異なるタイプ、または、細菌株起源から誘導され、コードされるＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方が、２〜１５の間の異なるタイプ、または、ＢｔもしくはＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方の細菌株起源から誘導され、ならびに、ＢｔまたはＩＣＫまたはＢｔとＩＣＫペプチドの両方の内の少なくとも１つの株が、ＢｔまたはＩＣＫ遺伝子の２以上のコピーによりコードされ、コードされるＢｔおよびＩＣＫペプチドの内いずれかまたは両方が、２以上の異なるタイプ、またはＢｔおよび／またはＩＣＫペプチドの細菌株起源から誘導され、Ｂｔおよび／またはＩＣＫペプチドの全ての株が、前記組成物に対する各タイプの株の少なくとも１％超を構成し、コードされるＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方が、２〜５の異なるタイプ、またはＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれかまたは両方の細菌株起源から誘導され、ならびに、ＢｔもしくはＩＣＫのいずれか、またはＢｔとＩＣＫの両方の内の少なくとも１つの株が、ＩＣＫ遺伝子のＢｔの２以上のコピーによりコードされる。
我々は、組成物から生じる、一過性発現されたＢｔおよびＩＣＫペプチドの総濃度が、以下のパーセント濃度から選択される、組成物を記述する：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、またはこれらの値の内の任意の２つの間の任意の範囲であり、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。我々は、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＩＣＫペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＩＣＫペプチドのＮ末端に連結されており、ならびに、殺虫性組み合わせペプチドが、殺虫性ＣＲＩＰペプチドに操作可能に連結されているＥＲＳＰ（小胞体シグナルペプチド）をさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造される組成物を開示し、ここで、前記ＥＲＳＰは、殺虫性ＣＲＩＰペプチドのＮ末端に連結され、ＥＲＳＰはＢＡＡＳである。
我々は、本明細書に開示される組み合わせペプチドを組込み、および発現するトランスジェニック植物を記述し、前記組み合わせペプチドは、殺虫性ＣＲＩＰ（ペプチド）に操作可能に連結されているジペプチドを発現するヌクレオチドをさらに含有する遺伝的カセットを用いて製造され、ここで、前記ジペプチドは、殺虫性ＣＲＩＰのＮ末端に共有結合されるようにコードされ；ならびに、ジペプチドは、ジペプチドのＮ末端上の１つの非極性アミノ酸、およびジペプチドのＣ末端上の１つの極性アミノ酸から構成される。我々は、形質転換ペプチドが、Ｎ末端グリシン−セリンを有するジペプチドを含む、トランスジェニック植物を記述する。我々は、発現される殺虫性ペプチドが、ペプチドを昆虫の腸内に侵入させ、次いで、電位依存性カルシウムチャネルおよびカルシウム活性化カリウムチャネルの両方を阻害させる、ＣＲＩＰおよびＰＦＩＰ（またはＢｔペプチド）の任意の殺虫性ペプチドの組み合わせである、トランスジェニック植物を記述する。
我々は、相同組換えで製造された殺虫性ＣＲＩＰペプチドが、オーストラリアジョウゴグモまたはイソギンチャク由来である、トランスジェニック植物を記述し、および、我々は、Ａｔｒａｘまたは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅの属のオーストラリアジョウゴグモから選択されるクモ、または、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉｓから選択されるイソギンチャク由来のＣＲＩＰで形質転換された、形質転換植物の実質的なまたは概念的な例のいずれかを記述および提示する。トランスジェニック植物は、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである、発現される殺虫性ＩＣＫペプチドを有していても良い。ＣＲＩＰは、発現される際、２０〜１００アミノ酸および２〜４ジスルフィド結合を含有する、ＩＣＫまたは非ＩＣＫであっても良い。ＰＩＰペプチドは、配列番号３３および、または、配列番号３３〜１０３２から選択されるペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有していても良い。
我々は、Ｂｔタンパク質が、任意の殺虫性Ｂｔタンパク質であり、および、Ｂｔタンパク質がＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質であり、および、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２の組み合わせ、ならびにバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択され、および、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から選択され、Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａタンパク質および／またはＤｉｐｅｌおよび、または、Ｔｈｕｒｉｃｉｄｅの組み合わせである、トランスジェニック植物を記述する。
我々は、形質転換植物の平均的な葉における、ＢｔおよびＩＣＫ／非ＩＣＫペプチドの平均濃度が、総回収可溶性タンパク質の約：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲である形質転換植物を記述し、形質転換植物は、形質転換植物で適切にフォールディングされた毒性ペプチドを発現し、および、それにより、前記植物で発現され、適切にフォールディングされた毒性ペプチドの蓄積がもたらされ、昆虫の損害に対する植物の抵抗性または植物の産生量の増加がもたらされる。我々は、昆虫を制御するためのこれらの組成物および手順を記述する。
我々は、本明細書に言及される任意のペプチドを発現する任意のヌクレオチドを含有する発現カセットを記述する。我々は、本明細書に開示される任意のペプチドをコードするヌクレオチド、または本明細書の教示により当業者により作製されうるヌクレオチドを含有する、形質転換植物に組み込まれた、機能的発現カセットを記述する。我々は、本明細書に記述される任意の組み合わせペプチドを有する、または発現する形質転換植物の作製手順を記述する。我々は、本明細書に記述される任意の産物およびプロセスにより作製される植物を記述する。
我々は、本明細書に記述される任意のペプチドまたはヌクレオチドの、植物を作製、またはこれらのペプチドもしくはヌクレオチドを植物へと形質転換するための用途、および、任意のペプチドを含有する植物および／または発現カセットにおいてこれらタンパク質を作製するための技術、および、植物ゲノムへとそれらを形質転換するための方法、および、植物へと任意の記述されるペプチドまたはヌクレオチドを使用、作製、形質転換する任意の方法、および、任意の開示されるペプチドおよびその対応するヌクレオチドを含有する植物において任意のペプチドおよび機能的発現カセットを有する、または発現する形質転換植物を作製するための技術、および、本明細書に記述される産物およびプロセスにより作製される任意の植物を記述する。
我々は、本明細書に記述される核酸または発現カセットに動作可能に連結されている植物において活性となるプロモーターを含有するキメラ遺伝子、および、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを作製、製造または使用する方法を記述する。我々は、本明細書に記述される遺伝子の組み合わせを含有する組換えベクターを記述する。我々は、組換えベクター、遺伝子の組み合わせを含有するトランスジェニック宿主細胞、、トランスジェニック植物細胞である、トランスジェニック宿主細胞、トランスジェニック植物、およびトウモロコシ、大豆、綿花、イネ、モロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモまたはトマトである、トランスジェニック植物、ならびに、これらおよび他の植物に対する種子（種子はキメラ遺伝子を含有する）を作製、製造、または使用する方法を記述する。
我々は、以下を含有する、昆虫または昆虫が存在する場所を制御する方法を記述する：Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質様のＰＦＩＰを前記昆虫に適用すること；次いで、以下の任意のもの、または任意の組み合わせを適用すること：システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）の前記昆虫に対する適用、および、組み合わせて、または別の方法で、殺虫性ＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ペプチドを前記昆虫に対して適用すること、および、組み合わせて、または別の方法で、非ＩＣＫ ＣＲＩＰペプチドを前記昆虫に適用すること、および、組み合わせて、または別の方法で、ＴＭＯＦペプチドを前記昆虫に適用すること、イソギンチャクペプチドを前記昆虫に適用すること。
我々は、Ｂｔタンパク質および殺虫性ＣＲＩＰ、ＩＣＫおよび、または、ＴＭＯＦペプチドが、共に作用するように適用されるが、同時には適用されないことを説明する。Ｂｔタンパク質様のＰＦＩＰおよび殺虫性ＣＲＩＰ、ＩＣＫおよび、または、ＴＭＯＦペプチドは、同時に、または連続的に適用されても良い。
我々は、以下の量を説明する：ＣＲＩＰに対するＢｔ、ＩＣＫに対するＢｔ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰに対するＢｔ、ＴＭＯＦに対するＢｔ、またはＩＣＫおよびＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される：９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９、または、これらの値の任意の２つの任意の組み合わせ；あるいは、ＣＲＩＰに対するＢｔ、ＩＣＫに対するＢｔ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰに対するＢｔ、ＴＭＯＦに対するＢｔ、またはＩＣＫおよびＴＭＯＦに対するＢｔの比率は、乾重量ベースで、およそ以下の比率から選択される：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９および、０．０１：９９．９９、またはこれらの値の任意の２つの任意の組み合わせ。
我々は、Ｂｔ＋ＣＲＩＰ；Ｂｔ＋ＩＣＫ、Ｂｔ＋非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、Ｂｔ＋ＴＭＯＦまたはＢｔ＋ＩＣＫ＋ＴＭＯＦの両方または全てが、２以上の異なるタイプ、またはＢｔ、ＩＣＫ、およびＴＭＯＦペプチドの細菌株起源から誘導されること、ならびに、または、ＢｔおよびＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、ＢｔおよびＴＭＯＦもしくはＢｔおよびＩＣＫ＋ＴＭＯＦ；Ｂｔ＋イソギンチャクペプチドは、２〜５の異なるタイプ、または、１、２またはそれ以上のＢｔ、ＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドもしくはＴＭＯＦペプチドの細菌株起源のいずれかから誘導されること、ならびに、または、１、２のいずれかまたは全てのＢｔ、ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドは、２〜１５の異なるタイプ、または、ＢｔおよびＩＣＫペプチドのいずれか、もしくは両方の細菌株起源から誘導されること、ならびに、１、２のいずれかまたは全てのＢｔ、ＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチドもしくはＴＭＯＦペプチドの内の少なくとも１つの株は、Ｂｔ、ＣＲＩＰ、ＩＣＫ、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ、イソギンチャクペプチド、またはＴＭＯＦ遺伝子の内の１つ、２つ、または全ての、２以上のコピーによりコードされること、を説明する。
我々は、１、２または全てのＢｔ、ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドが、２以上の異なるタイプ、または、１、２もしくは全てのＢｔ、ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドの細菌株起源から誘導され、１、２または全てのＢｔ、ＩＣＫおよびＴＭＯＦペプチドが、前記組成物中の各タイプの株由来のペプチドの少なくとも１％超を構成することを説明する。組成物中のＢｔおよびＣＲＩＰペプチドの総濃度は、以下のパーセント濃度から選択される：１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲であり、組成物の残りのパーセンテージは、賦形剤から構成される。
我々は、当業者が以下を含有する製剤を作製するのに十分な情報を提示する：例えばＢｔタンパク質等のＰＦＩＰ；および例えば殺虫性ＩＣＫまたは非ＩＣＫペプチド等のＣＲＩＰ；および／または、ＴＭＯＦペプチド。我々は、そのような製剤が、極性非プロトン性溶媒および極性プロトン性溶媒を用いて作製され、さらに水を含有することを説明する。一部の製剤において、極性非プロトン性溶媒は、１〜９９ｗｔ％の量で存在し、極性プロトン性溶媒は、１〜９９ｗｔ％の量で存在し、および水は、０〜９８ｗｔ％の量で存在し、さらにＭＳＯを含有しても良い。
＜実施例１＞
［Ｍｕｄ Ｌａｋｅｓ Ｆａｒｍｓ Ｒｏｍａｉｎｅ Ｌｅｔｔｕｃｅでの、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａに対する、ＳＤＰ １２３４６０４および１２３４６０５を用いた葉のバイオアッセイ］
目的：本実験は、葉のディスクバイオアッセイにおいて、１、２、３および４虫齢の幼虫に対してＳＤＰ １２３４６０４（ｗｐ製剤）および６０５（ｐｒｅ ｇｒａｎ製剤）をスプレーした場合に、Ｓ．ｅｘｉｇｕａに発生する死亡率の割合を測定することが目的である。
アッセイの調製および処置製剤：Ｓ．ｅｘｉｇｕａの卵を、Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから受け取った。卵を、１０℃のワインクーラー内で、２日間静置し、次いで、２８℃、２〜３０％相対湿度にセットした、ＶＷＲ低温インキュベーター、ＬＥＤ光の下のラックへと移し、最初の実験のため、新たに孵化した幼虫を約２４時間齢となるまで置いた。Ｍｕｄ Ｌａｋｅ Ｆａｒｍｓ Ｌｅｔｔｕｃｅ（レタス）は、２０１２年７月９日に受け取り、使用するまで４℃の冷蔵庫に保存した。２４時間後、各齢に対し、幼虫をインキュベーター内で、ｍｕｄ ｌａｋｅｓ ｆａｒｍｓ ｌｅｔｔｕｃｅ上に置いた。レタスの葉を切断し、中角ポリエチレン容器内へと置き、幼虫を、容器内へと落とした。２４時間後、幼虫を古いレタスから取り除き、新しいレタスを置き、幼虫を品質の落ちた組織上で育てないようにした。これを１日に１回、３日間行い、幼虫は９６時間齢となった。レタスの葉は、７０％エタノールで消毒された２ １／４インチのアーチを用いてディスクへと切断され、前のアッセイからの葉の組織を全て取り除くために綺麗にした。本物の竹の切断ボード上で葉のディスクに穴を開けた。１２ｐｐｍの極希釈漂白剤溶液（６ｐｐｔ次亜塩素酸｛Ｃｌｏｒｏｘ Ｂｌｅａｃｈ｝保存液の１／５００倍希釈）を用いて、４回のすすぎの前に、葉のディスクを痛めることなく、葉の組織を消毒した。葉のディスクを、切断葉ディスクを、大きな長方形のポリエチレン容器（蓋で覆われている）内の１２ｐｐｍの漂白剤溶液中に置くことにより、葉のディスクを、１２ｐｐｍ漂白処置に供し、１．５分間、軌道振とう器上で、３５００ｒｐｍで振とうした。次いで、漂白剤溶液を瓶から捨て、そしてｄＨ２Ｏで４回、瓶の中で葉をリンスし、軌道振とう器上で、ｄｉＨ２Ｏ中で少しかき混ぜることにより残りの漂白剤を除去した。葉のディスクを、ペーパータオル上に置き、さらにペーパータオルで覆って、乾かないようにした。最も平たく、円形で均一なディスクのみを、キムワイプで乾燥させ、残りの水を除去し、葉の裏側を上にして、スプレーのために、ラべリングしたタッパー容器へと置いた。この間、正確に集めたスプレードライ粉末の量を添加する前に、葉ディスクへのスプレードライ粉末のスプレー溶液のための製剤を、脱イオン化Ｈ２Ｏで確実にチューブが満たされた、５０ｍＬファルコンチューブで、作製した（以下の表に記述される）。Ｅ２０７のＬａｂｃｏｎｃｏドラフト内で、葉ディスクの前面から開始して、スプレーを行った。スプレーについては、エアラインを備えた二方向（ｄｏｕｂｌｅ ａｃｔｉｏｎ）の内部混合エアブラシ（Ｐａａｓｃｈ Ａｉｒｂｒｕｓｈ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）を、２００μＬ／秒（２０ｐｓｉ）の速度にセットした。葉ディスクを、葉の表面に対して垂直にエアブラシで輪状にスプレーして、霧状のミストが葉の表面全体を均一に覆うようにした（約３〜４秒）。各スプレー処置の間、スプレー溶液を入れたカップを、ｄＨ２Ｏでリンスして、前の処置からの残留物を全て除去した。スプレーの後、１時間乾燥させて、次いで、タッパー容器の中で、ディスクを、向軸面（葉の表面）が今度は仰向けになるように、ひっくり返し、同じようにスプレーした。スプレーの後、向軸面を、１時間乾燥させ、葉のディスクを、ラべリングし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｒｅｐｅａｔｅｒ Ｐｌｕｓと２５ｍＬチップを用いて、４ｍＬのｄｉＨ２Ｏで濡らしたペトリ皿（２９０ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ ３ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐａｐｅｒｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＨＰ７ ９ＮＡ， ＵＫ））の底に置いた。ペトリ皿を覆い、ランダム化して、その後、ホワイトボートを使って、２４、４８、７２、または９６時間の幼虫をそこに出すことにより、約７〜９の新たに孵化したＳ．ｅｘｉｇｕａの幼虫を各葉のディスクに＃０の細かい毛のブラシを用いて置いた。プレートは、パラフィルムで封をして、２７℃で、統計目的のために、ラックにランダムに置いた。翌日、１８、２４、４０および４８時間にわたり、死亡率を観察し、未処置と処置した葉の間の任意の差異を記録することにより、アッセイをスコア化した。
図１９に、１８、２４、４０および４８時間での各実験に対して記録された、４つの実験の結果の死亡率パーセントを示す。スプレーせずに乾燥させた対照処置群は、処置群の中で最も低い死亡率を示した。昆虫の死亡のほとんどは、１８時間のスコアリング時で観察され、次の死亡は４０および４８時間で観察された（４０および４８時間スコアリングにより示される）。健康な昆虫は葉緑素様の色である、目立つ緑であり、絵筆でつつくと、素早い回避応答を示し、４８時間で平均的な成長をする。７２時間および９６時間の幼虫の死亡率パーセントの結果は、２４時間および４８時間齢の幼虫と比較すると、有意に減少していた。Ｂｔタンパク質およびハイブリッドペプチド単独の処置は両方とも、大人の昆虫の制御には効果が無いことがはっきりとしている。
＜実施例２＞
［Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａに対する、Ｍｕｄ Ｌａｋｅｓ Ｆａｒｍｓ Ｒｏｍａｉｎｅ ＬｅｔｔｕｃｅでのＳＤＰ１２３４６０５を用いた葉バイオアッセイ］
目的：本実験は、葉のディスクバイオアッセイにおいて、７２時間齢の幼虫に対してＳＤＰ １２３４６０５をスプレーした場合に、および、Ｄｉｐｅｌ ＤＦをＳＤＰ１２３４６０５と共にスプレーした場合に、Ｓ．ｅｘｉｇｕａに発生する死亡率の割合を測定することが目的である。
アッセイの調製および処置製剤：実施例１の調製を参照のこと。Ｓ．ｅｘｉｇｕａの卵を、Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから受け取った。ペトリ皿を覆い、ランダム化して、その後、ホワイトボートを使って、７２時間齢の幼虫をそこに出すことにより、約７〜９の新たに孵化したＳ．ｅｘｉｇｕａの幼虫を各葉のディスクに＃０の細かい毛のブラシを用いて置いた。プレートは、パラフィルムで封をして、２７℃で、統計目的のために、ラックにランダムに置いた。翌日、１８、２４、および４８時間にわたり、死亡率を観察し、未処置と処置した葉の間の任意の差異を記録することにより、アッセイをスコア化した。図２０に、１８、２４、および４８時間での実施例２のデータ（カラムグラフ）を示す。製剤‘６０５中のハイブリッドペプチドの１０００分の１０部（ｐｐｍ）、および百万分の３００部（ｐｐｍ）でのＤｉｐｅｌは、個々では、未処置対照または界面活性剤死亡率のいずれにも、ほとんど改善を示していない。しかしながら、組み合わせた場合、４８時間で得られた死亡率は、個々の処置（２９．１％）の相加効果から期待されるものをはるかに超える、８４．４％であった。個々の成分の相乗効果は、少なくとも２．９倍（８４．４／２９．１）である。敗血症を介して殺すような殺虫性タンパク質が、ＣＮＳにおけるイオンチャネルを調節するような殺虫性ペプチドとの相乗効果を有するとは、全くの予想外であった。
＜実施例３＞
我々は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）タンパク質およびイソギンチャク由来のＡｖ２ペプチドの組み合わせの相加的な効果および／または相乗的な効果の可能性を調査した。我々は、Ｂｔ産物：Ｄｉｐｅｌ ＤＦ（市販品）および市販のＡｖ２毒性イソギンチャクペプチドを用いた。
方法：地域の食料品店で購入したキャベツの内側の葉を、小さな葉ディスク（約２ｃｍ）に切断した。ディスクを、４００μＬの処置物へと浸し、約４．５ｃｍの調味カップの底の、４．２５ｃｍの＃４フィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）上い置いた。４つのディスクを、処置毎に調製した。７５μＬの水を、大きなフィルターディスク上の、第二の、小さな３．２ｃｍの＃１フィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）に注いだ。葉ディスクをおよそ１０分乾燥させ、その後、４つの１２０時間齢のＣｒｙ１ａ抵抗性Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａを、葉ディスク毎に加えた。調味カップを、穴の開いてない蓋で密封した。処置物をインキュベーター内に置き、２４時間および４８時間での死亡率および摂食障害をスコアリングした。多くの処置物において、葉ディスクの消費が大きかったため、追加の３．２ｃｍの未処置葉ディスクを、２４時間で加え、幼虫に飢餓が発生しないようにした。
２４時間および４８時間で、葉ディスクの写真を、Ｉｐｈｏｎｅ ４Ｓ（Ａｐｐｌｅ Ｉｎｃ．）を用いて撮影し、保存した。個々の葉ディスクの写真を、処置群の写真から切り出し、ランダムに数値を割り当てた。ＩｍａｇｅＪのプログラムを用いて、食べられた葉の面積を算出した。画像をＩｍａｇｅＪで開き、写真にスケールをセットした。スケールをセットするために、セグメントラインツールを用いて、写真中にセンチメーター（ｃｍ）で、距離の分かっているものを書き入れ、ピクセル単位で測定した。この実験に関して、フィルターペーパーディスクの既知の直径は、＃１のフィルターディスクについては１．５ｃｍであり、＃４のＷｈａｔｍａｎフィルターディスクについては４．５ｃｍである。この、ｃｍで長さの分かっているものを用いて、画像中のピクセル単位を、センチメーターに変換した。スケールがセットされると、フリーハンドの選択ツールを用いて、葉組織が残っている領域周辺を描画する。このプロセスを、全ての写真に対して繰り返し、実験室のノートブックでＩｍａｇｅＪにより算出された記録面積を確実なものとした。この実験に関して、未食の葉ディスクの対象面積は、２．５４ｃｍ２であり、食された面積の％を測定するために計算が行われた。
処置物：
１５０ＰＰＭ Ｄｉｐｅｌ ＤＦ： ２００μＬ ３００ＰＰＭ Ｄｉｐｅｌ ＤＦ＋２００μＬ 水
１ＰＰＴ Ａｖ２：１００μＬの水に溶解した０．１ｍｇ Ａｖ２（４００μＬの処置物に必要な、１ＰＰＴのＡｖ２の４つのバイアルと組み合わされた）
１５０ＰＰＭ Ｄｉｐｅｌ ＤＦ＋１ＰＰＴ Ａｖ２：１００μＬ １５０ＰＰＭ Ｄｉｐｅｌ ＤＦを、０．１ｍｇのＡｖ２に添加した。（４００μＬの処置物に必要な４つのバイアルを組み合わせた）
図２１に、Ｂｔタンパク質抵抗性コナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）の幼虫（１２０時間齢）から得られた、キャベツ葉ディスクへの食害のパーセントを示す。２４時間および４８時間の両方でのスコアリングから、Ｄｉｐｅｌ単独での処置を超える、有意な改善が示される。これらの昆虫はＢｔに抵抗性である一方、死亡することなく、限定的ではあるが、いまだに食餌を続けている。組み合わせ処置により、葉物質への防御が有意に改善される。さらに、Ａｖ２単独での処置では、食害に対して効果は無く、Ｂｔタンパク質と組み合わせた場合にのみ、その効果が現れる。これは、Ｂｔタンパク質によって可能となるＡｖ２の生体利用可能性の増加と一致する。
＜実施例４＞
［Ｅａｒｔｈｂｏｕｎｄ Ｆａｒｍｓ Ｒｏｍａｉｎｅ ＬｅｔｔｕｃｅでのＳＤＰ１２３４６０９およびＤｉｐｅｌ ＤＦを用いた葉バイオアッセイ］
目的：本実験は、葉のディスクバイオアッセイにおいて、１２０時間齢の幼虫に対してＳＤＰ １２３４６０９をスプレーした場合に、および、Ｄｉｐｅｌ ＤＦをＳＤＰ１２３４６０９と共にスプレーした場合に、Ｂｔ抵抗性（ＨＤ−１）Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに発生する死亡率の割合を測定することが目的である。
アッセイの調製および処置製剤：実施例１の調製を参照のこと。図２２に、２４および４８時間での実施例４のデータ（カラムグラフ）を示す。製剤‘６０９中の１０００分の１部（ｐｐｔ）でのハイブリッドペプチド、および百万分の１５０部（ｐｐｔ）でのＤｉｐｅｌは、個々では、未処置対照または界面活性剤死亡率のいずれにも、改善はほとんど示さない。しかしながら、組み合わされた場合、４８時間で得られた死亡率は、個々の処置での相加的な結果（２１．８％）から予測されるものを大きく超える、６２．５％である。個々の成分の相乗効果は、少なくとも２．８６倍（６２．５／２１．８）である。繰り返すが、敗血症を介して殺すような殺虫性タンパク質が、ＣＮＳにおけるイオンチャネルを調節するような殺虫性ペプチドとの相乗効果を有するとは、全くの予想外であった。

Claims (25)

  1. 少なくとも２つのタイプの殺虫性タンパク質またはペプチドを含有する組成物であって、
    ここで、１つのタイプが、孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他方のタイプが、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、
    前記ＣＲＩＰが、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質であり、
    前記ＰＦＩＰが、Ｂｔタンパク質である、組成物。
  2. 前記ＩＣＫが、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは殺虫性の突然変異体もしくは殺虫性の変異体として知られる毒素を含有する、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、またはブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓから誘導される、または由来する、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｂｔ抵抗性昆虫を制御するための、請求項１に記載の組成物の使用方法であって、
    少なくとも２つのタイプのペプチドの組成物を作製することを含み、
    ここで、１つのペプチドのタイプは、孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他方のタイプのペプチドは、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、
    次いで、前記組成物を、昆虫がいる場所へと適用すること、を含む方法。
  4. 少なくとも２つの適切にフォールディングされたペプチドの組み合わせを発現する植物を作製することを含む、Ｂｔ抵抗性昆虫から植物を防御することを含む、Ｂｔ抵抗性昆虫を制御する請求項３に記載の方法であって、
    ここで、ペプチドの１つのタイプは孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他方のペプチドのタイプは、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）である、方法。
  5. 前記ＰＦＩＰが、昆虫の腸内膜に影響を及ぼしている間の任意のときにＣＲＩＰが投与される、請求項３に記載の方法。
  6. Ｂｔ抵抗性について昆虫を検証した後で、ＣＲＩＰが投与される、請求項５に記載の方法であって、前記検証された昆虫が、Ｂｔ抵抗性である、方法。
  7. 固体または液体の形態にある、少なくとも２つのタイプの殺虫性タンパク質またはペプチドを含有する組成物であって、ここで、１つのタイプが、孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）であり、他方のタイプが、システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）であり、
    前記ＣＲＩＰが、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質であり、
    前記ＰＦＩＰが、Ｂｔタンパク質である、組成物の、昆虫への適用、昆虫のいる場所への適用、または植物組込み型防御剤としての適用。
  8. 前記ＩＣＫが、２０〜１００のアミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有し、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドである、請求項２に記載の組成物。
  9. 前記ＩＣＫが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドである、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記Ｂｔタンパク質が、ＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質であり、および／または、前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２を有する殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７の組み合わせ、およびバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記ＰＦＩＰが、Ｂｔタンパク質のＣｒｙまたはＣｙｔタイプであり、前記Ｂｔタンパク質のタイプが、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０もしくはＴＩＣ８１２を有する殺虫性タンパク質ＥＴ２９もしくはＥＴ３７の組み合わせ、およびバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
  12. 前記Ｂｔタンパク質が、ＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質であり、および／または、前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、バイナリー殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、バイナリー殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２を有する殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７の組み合わせ、およびバイナリー殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択され、
    前記組成物は、さらに、トリプシン介在型オースタティック因子またはＴＭＯＦペプチドを含み、前記ＴＭＯＦペプチドは、配列番号７０８〜７２１から選択される、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記ＩＣＫが、２０〜１００のアミノ酸および２〜４のジスルフィド結合を含有し、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドである、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１として知られるタンパク質であり、前記ＩＣＫが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドである、請求項９に記載の組成物。
  15. 前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１として知られるタンパク質であり、前記ＩＣＫが、「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられ、また「ハイブリッド＋２」と名付けられた、配列番号６５２を有するペプチドである、請求項９に記載の組成物。
  16. 昆虫を制御するための製剤にされる、請求項１，２，８〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 昆虫を制御するための散布可能な製剤にされる、請求項１，２，８〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 請求項１７に記載の組成物の散布可能な製剤を用い、前記製剤を植物、または昆虫のいる位置、または保護が必要な植物の位置へ散布する方法。
  19. 前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＣｒｙＥＴ７０、およびＣｒｙ２２からなる群から選択され、Ｃｒｙ１および前記ＩＣＫが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドである、請求項７に記載の適用。
  20. 前記ＩＣＫが、「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられ、また「ハイブリッド＋２」と名付けられた、配列番号６５２を有するペプチドである、請求項１９に記載の適用。
  21. 前記システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）が、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは殺虫性の突然変異体もしくは変異体として知られる毒素を含む、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａまたはブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓからなる群から選択され、誘導され、または由来し、
    前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＣｒｙＥＴ７０、およびＣｒｙ２２からなる群から選択されるタンパク質であり、Ｃｒｙ１および前記ＩＣＫが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドであり、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、および「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と名付けられ、また「ハイブリッド＋２」と名付けられた、配列番号６５２を有するペプチドから選択されるペプチドを含む、請求項２に記載の組成物。
  22. 前記システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）が、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは殺虫性の突然変異体もしくは殺虫性の変異体からなる群から選択され、誘導され、または由来し、
    前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＣｒｙＥＴ７０、およびＣｒｙ２２からなる群から選択されるタンパク質であり、Ｃｒｙ１および前記ＩＣＫが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドであり、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、および、配列番号６５２を有する、「ハイブリッド＋２」とも名付けられた「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」を含む、請求項２に記載の組成物。
  23. 前記システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）が、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂまたは殺虫性の突然変異体もしくは殺虫性の変異体からなる群から選択され、誘導され、または由来し、
    前記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＣｒｙＥＴ７０、およびＣｒｙ２２からなる群から選択されるタンパク質であり、Ｃｒｙ１および前記ＩＣＫが、ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対し、少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドであり、配列番号６５２を有する、「ハイブリッド＋２」とも名付けられたペプチド「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」を含む、請求項２に記載の組成物。
  24. 前記孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）が、配列番号３３〜５３３を含む配列表に記載の配列を有するＢｔタンパク質のいずれかから選択され、
    前記システインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）が、配列番号３３〜５３３、配列番号５３４〜７０７、および、配列番号６５２を有するペプチドを含む配列表に記載の配列を有するタンパク質のいずれかから選択されるＣＲＩＰである、請求項１に記載の組成物。
  25. 前記孔形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）が、ａ）Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａタンパク質、ｂ）Ｄｉｐｅｌならびにｃ）Ｔｈｕｒｉｃｉｄｅの組み合わせから選択され、
    前記ＣＲＩＰが、ａ）Ｈｖ１ａペプチド、ｂ）ハイブリッド−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチド、ｃ）ハイブリッド＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ペプチド、およびｄ）配列番号６５２を有する、「ハイブリッド＋２」とも名付けられたペプチド「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」から選択される、請求項１に記載の組成物。
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