CN101003789B - 蜘蛛毒肽基因重组的工程菌菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蜘蛛毒肽基因重组的工程菌。本发明以苏云金杆菌4.0718菌株为宿主菌，经过可调控表达载体，构建带有cryl基因强启动子序列和含有domainII序列及融合了一种或两种蜘蛛毒素基因的工程菌，经发酵生产制备的高效生物杀虫剂的效价均在6000国际单位/μg以上，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目与直翅目昆虫的杀虫率都达到90％；在相同的浓度下，双价工程菌的杀虫效果要比单价的高3～6倍以上，三价工程菌高5～8倍以上。工程菌制剂为绿色农药，无残毒，对人、畜安全，有利保护生态环境。

Description

蜘蛛毒肽基因重组的工程菌菌剂

技术领域

本发明涉及基因重组，具体涉及蜘蛛毒肽基因重组的工程菌。

背景技术

据统计，节肢动物类害虫破坏了全球农作物年产量的四分之一，自从1940年DDT的发明开始，节肢动物类害虫主要依靠化学杀虫剂来控制。为了实现农作物单位面积的高产出，我国每年要向种植的作物喷洒大量化学杀虫剂。这些杀虫剂在食物和农业环境中造成了超标量的残留，侵害着人们的肌体，影响人体健康。并且，各种昆虫逐渐对很多化学杀虫剂产生了抗性，人们也日益认识到这些化学物质对生态环境，以及对人类的生存健康带来的不可小觑的影响，因此迫切需要发展新的杀虫剂，确定新型的分子靶标以及寻找更多有效的生物防治措施。其中，微生物防治尤其受到人们的重视。

杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)。苏云金芽孢杆菌是对鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(dipteran)和鞘翅目(coleopteran)等多种害虫具有毒杀作用的微生物，其生长代谢过程中会形成芽孢，同时能够产生伴孢晶体，其中含有一种或几种杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，简称ICPs)，δ-内毒素(delta-endotoxin)。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后就会被幼虫的碱性肠溶液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒肽，与昆虫消化道缘膜囊泡上的受体高亲和性结合，快速而不可逆地插入细胞质膜，破坏细胞渗透平衡，从而导致细胞裂解，最终使幼虫死亡。苏云金杆菌属于生物杀虫剂，因其无环境污染，使害虫难以产生抗药性，同时对人畜安全无害，因而越来越受到人们的重视。Bt制剂的高效性和安全性，以及在农产品安全性和保护农业生态环境上的重要意义，已使其发展成为目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。

但是由于Bt杀虫剂在长期使用过程中仍存在一些缺点，如杀虫谱较窄，毒力较化学杀虫剂弱，残效期偏短等。

为解决这些问题，国内外研究者们从抗性管理、定点突变、构建高效重组质粒和重组菌株、构建融合基因等方面来探索改进的方法。

蜘蛛毒液是生物进化用来杀死或致瘫节肢类猎物的复杂化学混合物，它展示出了一 个巨大的之前未被引起注意的杀虫化合物库。蜘蛛毒液是由无机盐，低分子量的有机分子(1kDa)，多肽(3-8kDa)，高分子量蛋白(10kDa)组成的混合物。多肽组分是以组合的形式产生的，而且往往是大多数蜘蛛毒液的主要成分。专利号为01114592.7的发明专利公开了虎纹捕鸟蛛毒蛋白基因HWTX-I与Bt毒蛋白基因融合构建的工程菌提高了苏云菌杆菌的杀虫能力。采用蜘蛛毒液中其它的一种或几种毒素的组合并与苏云金杆菌cry基因重组以进一步解决Bt杀虫剂杀虫谱窄，毒力弱、残效期偏短等问题是值得研究的重要课题。

发明内容

本发明旨在将一种或两种外源蜘蛛毒肽基因导入苏云金杆菌来获得不同的蜘蛛毒肽基因重组的工程菌，以进一步解决Bt杀虫剂存在的上述问题。

实现上述发明目的的技术方案为：工程菌为苏云金杆菌4.0718菌株的Cry1Ac基因与一种或两种蜘蛛毒肽基因进行融合表达，构建双效或三效杀虫工程菌株。

所述的外源蜘蛛毒肽基因包括：澳大利亚漏斗网蜘蛛毒素ω-ACTX-Hv1a，虎纹捕鸟蛛毒素HWTX-XI。

下面结合附图进一步详述本发明。

附图说明

图1(1)蛛毒基因ω-ACTX-Hv1a合成片段连接示意图；

(2)hwtx-XI合成片段的连接示意图；

图2重组质粒pHACL15的构建流程图；

图3中间载体pUAXI的构建流程图；

图4穿梭表达载体pHT315的载体图谱；

图5含有Cry1Ac全长基因的重组质粒pH5AXI的构建流程图；

图6含有截短Cry1Ac基因的重组质粒pH5AXIT1的构建流程图；

图7重组质粒pH5ACXI的构建流程图；

图8工程菌发酵流程示意图。

蜘蛛毒液中ω-ACTX-1家族毒素是最早从澳大利亚漏斗网蜘蛛毒液中分离出来具有选择性杀伤昆虫活力的多肽。ω-ACTX-1家族毒素首先被表达成约80个氨基酸的前体，然后再加工生成36～37个氨基酸的成熟毒素肽，其中含有6个保守的半胱氨酸，形成三对二硫键。在此毒素家族中，ω-ACTX-Hv1a是至今发现的最有效的杀伤昆虫的毒素， 它对烟草蚜虫的PD50小于0.25nmol/g。与其他大部分蜘蛛、蝎子等的毒素不同的是，ω-ACTX-Hv1a是对昆虫的中枢神经系统产生阻滞作用，对外围神经突触并没有影响。ω-ACTX-Hv1a具有广泛的杀虫谱，包括鞘翅目、鳞翅目和双翅目，特别是对直翅目也有较强的杀虫毒力；并且通过对新生小鼠等的临床验证证实对脊椎动物无害。

另一种蜘蛛毒素HWTX-XI是从我国今年发现的蜘蛛新种虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离得到的一个肽类神经毒素。相对分子量为6.16kD，理论pI值为9.45，是一个碱性的小分子蛋白，由55个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸残基，能形成3对二硫键。生物活性测定发现HXTX-XI蛋白对小鼠的中枢神经系统有作用外，还具有胰蛋白酶抑制活性。因此，利用cry基因表达量高和形成伴孢晶体的能力，在苏云金杆菌中分别高效表达中央神经毒素ω-ACTX-Hv1a和兼具神经毒性和胰蛋白酶抑制活性的蜘蛛毒素XI基因，并利用晶体在昆虫中肠道的溶解模式，可在昆虫中肠内将融合表达的毒素蛋白降解成有活性的Cry毒肽和ω-ACTX-Hv1a蛋白或HWTX-XI蛋白，从而使得杀虫晶体蛋白和蜘蛛毒素蛋白共同发生作用，导致昆虫的快速致死。

本发明以蜘蛛毒素基因ω-ACTX-Hv1a、hwtx-XIg与苏云菌杆菌4.0718菌株的Cry1Ac构建了双效或三效工程菌。

1、含澳大利亚漏斗网蜘蛛毒素基因ω-ACTX-Hv1a的苏云金杆菌融合工程菌的构建：

(1).化学合成蛛毒基因ω-ACTX-Hv1a：

根据文献资料[Australian funnel-web spiders：master insecticide chemists；Hugo W.Tedford，Brianna L.Sollod；Toxicon 43(2004)601-618]查阅获得澳大利亚漏斗网蜘蛛毒素成熟肽ω-ACTX-Hv1a的一级结构序列以及肠激酶位点序列(简称EK)，用Bt菌株的偏爱密码子优化设计这两段序列，3’端加上终止密码子，再在两个末端端加上Bgl II和Nco I酶切位点，然后分为六个片段合成：

①GATCTGATGATGATGATAAAAGTCCAACATGTATTCCAAGTGGACA

②ACCATGTCCATATAATGAAAATTGTTGTAGTCAAAGTTGTACAT

③TTAAAGAAAATGAAAATGGAAATACAGTAAAAAGATGTGATTGAC

④ACTACTACTACTATTTTCAGGTTGTACATAAGGTTCACCTGTTGGT

⑤ACAGGTATATTACTTTTAACAACATCAGTTTCAACATGTAAATTT

⑥CTTTTACTTTTACCTTTATGTCATTTTTCTACACTAACTGGTAC

按照图1(1)的方式进行组合连接。其中，②、③、④、⑤片段的5’端需磷酸化(如黑色方框所标位置)。将①和④、②和⑤、③和⑥进行退火结合，再将退火连接好的片段 用T₄DNA连接酶16℃连接过夜，然后乙醇沉淀得到完整的带有Bgl II和Nco I酶切位点和肠激酶位点的ω-ACTX-Hv1a蛛毒片段。

(2).PCR扩增Btδ-内毒素Cry1Ac基因的下游终止序列(简称TTS)：

以之前构建好的重组质粒pHUAccB5(在PHT315载体基础上构建的含有Cry1Ac全长基因4.2kb片段和几丁质酶基因片段的重组载体，见图2，)为模板，用F-5’(5’GCG CAGATC TAT GAG GCT TAG AGA ATT CA 3′)、R-5’(5’ACG CCC ATG GTC ACA TAG TAT CGA CTAAA 3’为引物进行PCR扩增。扩增出的基因两端带有Nco I和Xma I两个酶切位点。

(3).融合蛛毒基因ω-ACTX-Hv1a和下游终止序列基因TTS：

将PCR扩增的TTS片段用Nco I和Xma I进行双酶切，纯化后与合成后连接好的完整ω-ACTX-Hv1a片段混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，然后以这个连接产物为模板(引物F-5′GAT CTG ATG ATG ATG ATA AAA GTC CA；引物R-5′ACG CGG ATC CCA AAA ACA CCC TAT TAG T)扩增蛛毒基因和Cry1Ac终止子基因构成的融合基因。

(4).酶切获得含有Cry1Ac基因(3.9kb)的PHT315载体(在PUC19载体的基础上加入红霉素抗性基因和Bt复制子基因改建而成)片段：

将重组质粒pHUAccB5进行Bgl II和Xma I双酶切，获得10.4kb的大片段(包括Cry1Ac基因启动子和orf及PHT315载体片段)，并进行回收，得到纯化的含有Cry1Ac基因(3.9kb)的PHT315载体片段(图4)。

(5).重组质粒pHACL15的构建：

将(3)中PCR扩增的融合基因片段进行BglII和Xma I双酶切，并纯化，与(4)中酶切后纯化好的10.4kb片段混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下连接过夜，形成重组质粒pHACL15(图2)，转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选阳性转化子。

(6).工程菌的鉴定与检测：

挑选(5)中转化子进行菌落PCR扩增，碱裂解法提取转化子的质粒，进行酶切和测序鉴定，确定为目的重组质粒，然后对无晶体突变株XBU001进行电转化。电转化感受态的制备和电转化参照文献[胡宏源，夏立秋，史红娟，等.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究.生物工程学报，2004，20(5)：656-661]，电转化条件：1.8KV、200Ω、25μF。通过红霉素抗性平板初步筛选转化子，采用菌落PCR进一步鉴定和SDS-PAGE检测。

2、含虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-XI的苏云金杆菌融合工程菌的构建：

(1).化学合成蛛毒基因hwtx-XI：

根据文献资料(《虎纹捕鸟蛛毒素基因的克隆、表达及结构与功能关系的研究》，刘君梁硕士论文，2004)查阅获得虎纹捕鸟蛛毒素成熟肽HWTX-XI的一级结构序列以及肠激酶位点序列，并用Bt菌株的偏爱密码子优化设计这两段序列，3′端加上终止密码子以及Cry1Ac基因的终止下游部分序列(带4.2kbCry1Ac基因的载体pUA19由于BglII/Xma I双酶切而会缺失这一部分)，再在两个末端端加上Bgl II和Mun I酶切位点，然后分为8个片段合成。合成片段序列为：

a.GATCTGATGATGATGATAAAATTGATACATGTAGATTACCAAGTGATAGAGGAAG

b.ACTACTACTACTATTTTAACTATGTACATCTAATGGTTCACTATCTCCTTCTACA

c.ATGTAAAGCTAGTTTTGAAAGATGGTATTTTAATGGAAGAACATGTGCTAAATTTATT

d.TTTCGATCAAAACTTTCTACCATAAAATTACCTTCTTGTACACGATTTAAATAAATAC

e.TATGGAGGATGTGGAGGAAATGGAAATAAATTTCCAACACAAGAAGCTTGTATGAAAA

f.CTCCTACACCTCCTTTACCTTTATTTAAAGGTTGTGTTCTTCGAACATACTTTTCTAC

g.GATGTGCTAAAGCTTAGTCTCATGCAAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTCAAATC

h.ACGATTTCGAATCAGAGTACGTTTGAGTCCAAATTTATAGCAAAAGTTTAGTTAA

合成后的退火连接操作与上述蛛毒基因ω-ACTX-Hv1a的基本一致。其中，b、c、d、e、f、g片段的5’端需磷酸化(如黑色方框所标位置)。将a和b、c和d、e和f、g和h进行退火结合，再将退火连接好的片段用T₄DNA连接酶16℃连接过夜，然后乙醇沉淀得到完整的带有Bgl II和Mun I酶切位点和肠激酶位点的HWTX-XI蛛毒片段。

(2).构建中间载体pUAXI：

对之前已构建好的pUA19质粒进行Bgl II和Mun I双酶切，回收载体片段并纯化，与(1)中的HWTX-XI基因片段混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下16℃连接过夜，形成新的中间载体pUAXI(图3)，转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选阳性转化子。

(3).酶切获得Cry1Ac-HWTX-XI融合基因片段：

碱裂解法提取构建好的pUAXI质粒，进行BamH I和Sal I的双酶切，获得Cry1Ac-HWTX-XI融合基因片段，并纯化。

(4).构建表达载体pH5AXI：

将已有的E.coli-B.t.穿梭表达载体pHT315进行BamH I和Sal I的双酶切，回收载体片段，与(3)中的Cry1Ac-HWTX-XI融合基因片段混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下16℃连接过夜，获得新的重组表达载体pH5AXI(图5)，转化E.coli DH5α，Amp 抗性筛选阳性转化子。

(5).表达载体pH5AXIT1的构建：

从E.coli中提取(4)当中构建好的pH5AXI质粒，进行XhoI和Bgl II双酶切，切除了Cry1Ac基因C端1.7kb的片段，回收大片段。然后将大片段一部分用T₄DNA聚合酶将两端补平；一部分用绿豆芽核酸酶将两末端突出部分切除，均实现末端平滑化。两部分片段均用BamHI进行单酶切，各自回收其一端的片段，将两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下16℃连接过夜，则形成带有截短1.7kb的Cry1Ac-HWTX-XI磁合基因片段的新表达载体pH5AXIT1(图6)。将其转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选阳性转化子。

考虑到Bt工程菌在形成晶体的过程中，融合蛋白的C-端被暴露在外，易被蛋白酶降解，致使融合蛋白C-端的HWTX-XI蛋白先被降解，使其产量降低，从而影响HWTX-XI蛋白对Cry1Ac在杀虫上的协同作用。有文献表明：cry1Ac的C-端影响晶体的形成，使其晶体的形状不规则，但对其自身的毒力并没有影响。因此，对cry1Ac的C-端进行适当的截短，保留融合基因合适长度的C-端，以期望消除融合基因过长的C-端对融合基因表达产量的影响，尤其是对hwtx-XI基因产量的影响。这样，在进行表达时，减少融合蛋白的C-端暴露在外的长度，有可能部分消除蛋白酶对融合蛋白的降解，尤其是对C-端的HWTX-XI蛋白的降解，从而提高融合蛋白中HWTX-XI蛋白的表达量，有利于充分发挥HWTX-XI蛋白对Cry1Ac在杀虫上的协同作用。

(6).工程菌的鉴定与检测：

挑选转化子进行菌落PCR扩增，碱裂解法提取转化子的质粒，进行酶切和测序鉴定，确定为目的重组质粒，然后对无晶体突变株XBU001进行电转化。电转化感受态的制备和电转化参照文献[胡宏源，夏立秋，史红娟，等.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究.生物工程学报，2004，20(5)：656-661]，电转化条件：1.8KV、200Ω、25μF。通过红霉素抗性平板初步筛选转化子，采用菌落PCR进一步鉴定和SDS-PAGE检测。

3、含澳大利亚漏斗网蜘蛛毒素基因及虎纹捕鸟蛛毒素基因的三效杀虫工程菌的构建：

(1).获得双价蛛毒基因片段：

重新合成澳大利亚漏斗网蜘蛛毒素基因ω-ACTX-Hv1a合成片段中的①、④、③、⑥，将①的5’末端、④的3’末端序列修改成Bgl II酶切位点序列；将③、⑥中的终止密码子序列去除。重新合成虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-XI合成片段中的a、b，将a的5’末端、 b的3’末端序列修改成Nco I酶切位点序列。将修改后的片段分别与各自未修改的片段连接起来(方法与上述一致)，获得新的末端带有不同酶切位点的ω-ACTX-Hv1a和hwtx-XI片段。两者混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下16℃连接过夜，则形成双价的蛛毒基因片段。

(2).构建表达载体pH5ACXI：

提取已构建好的表达载体pH5AXI，进行Bgl II和Mun I双酶切，回收载体片段，与(1)中的双价蛛毒基因片段混合，用T₄ DNA连接酶在ATP存在的条件下16℃连接过夜，形成重组的三价杀虫蛋白表达质粒pH5ACXI(图7)。将其转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选阳性转化子。

(3).工程菌的鉴定与检测：

挑选转化子进行菌落PCR扩增，提取转化子的质粒，进行酶切和测序鉴定，确定为目的重组质粒，然后对无晶体突变株XBU001进行电转化。电转化感受态的制备和电转化参照文献[胡宏源，夏立秋，史红娟，等.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究.生物工程学报，2004，20(5)：656-661]，电转化条件：1.8KV、200Ω、25μF。通过红霉素抗性平板初步筛选转化子，采用菌落PCR进一步鉴定和SDS-PAGE检测。

4、杀虫工程菌的发酵生产：

图7是杀虫工程菌发酵工艺流程示意图，主要包括菌种活化、一级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养。

(1).菌种活化

将保藏的高效广谱杀虫工程菌划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28～35℃条件下培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种。

(2).种子罐发酵

先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液。

(3).生产发酵罐培养

先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气。

(4).浓缩

发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩、补加增效添加剂、随后装瓶，即可投放市场。

(5).灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3～0.5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在28～35℃条件下培养36～48小时，通气量1～2Vols/vol/min，氧气含量30～40％。种子罐培养液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O0.01～0.06％，K₂HPO₄0.01％～0.06％，MnSO₄0.02％～0.08％，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.8。

发酵罐培养液配方：黄豆粉2～8％，玉米淀粉0.3～1.5％，NaOH0.2～0.8％，在121℃水解20min后，过滤去除杂质，按体积补加葡萄糖1.3～2.0％，KH₂PO₄0.08～0.22％，K₂HPO₄0.10～2.2％，CaCO₃0.1～2.20％，FeSO₄·7H₂O0.001～0.005％，搅拌均匀，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5。

双效生物杀虫剂增效添加剂配方：茶皂素0.05～25％，二甲苯0.5～3％，山梨醇1～4％，吐温801～4％，甘油3～8％，蜂蜜3～8％。

(6).发酵液要求

发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5％时放罐，pH值7.0～8.0，无杂菌污染。

本发明与现有的生物农药相比具有以下优点：

(1).杀虫效果好：由于工程菌株分别带有多种杀虫毒素CrylAa、CrylAb、CrylAc、Cry2Ac、ω-ACTX-Hvla，HWTX-XI，除了自身的杀虫能力外还具有显著的正协同作用，能对害虫产生胃毒及触杀双重效果，因此杀虫效价更高，效价能达到6000国际单位/μg以上。在应用上具有很强的竞争力。

(2).杀虫谱广：工程菌自身带有多种杀虫毒素，同时由于ω-ACTX-Hvla，HWTX-XI。蜘蛛毒素肽类毒素基因与改造后的ICPs domainII区域以融合蛋白形式表达，使其可识别的范围增大，同时能对鳞翅目、双翅目、鞘翅目及直翅目等多类害虫有效，因此在使用上防治面很广，成本相对较低。

(3).安全性更高：由于工程菌所携带的毒素均为天然毒素，容易为自然界中的微生物 所降解和易受阳光紫外线破坏、不形成残留；同时，各种毒素对人、畜均无害。因此，在生态环境保护、出口创汇及促进人类健康等方面形成极大的优势。

<110>湖南师范大学 

<120>蜘蛛毒肽基因重组的工程菌菌剂 

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<213>合成ω-ACTX-Hv1a的一级结构序列以及肠激酶位点序列的六个片段 

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gatctgatga tgatgataaa agtccaacat gtattccaag tggaca                     46 

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<213>合成ω-ACTX-Hv1a一级结构序列以及肠激酶位点序列的六个片段 

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<213>合成ω-ACTX-Hv1a一级结构序列以及肠激酶位点序列的六个片段 

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acgatttcga atcagagtac gtttgagtcc aaatttatag caaaagttta gttaa           55 

Claims (1)

1.一种蜘蛛毒肽基因重组的工程菌，其特征在于该工程菌为由苏云金杆菌4.0718菌株的CrylAc基因与澳大利亚漏斗网蜘蛛毒素基因ω-ACTX-Hvla和虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-XI两种外源蜘蛛毒素基因融合构建的三效工程菌。

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