CN101717437A - 苏云金芽孢杆菌Cry9E基因，蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“苏云金芽孢杆菌Cry9E基因，蛋白及其应用”，属于生物技术领域。杀虫蛋白，具有如如SEQNO.5或SEQNO.6所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选所述基因的核苷酸序列如SEQ NO.2或SEQ NO.3所示。上述基因对鳞翅目害虫具有高毒力，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

Description

苏云金芽孢杆菌Cry9E基因，蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及对小菜蛾、玉米螟高效的苏云金芽孢杆菌CRY9EE基因，蛋白，以及它们的应用。

背景技术

虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14％，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10％、小麦减产20％、棉花减产30％以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报，2005，(5)：56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。

1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2007年，全球转基因作物种植面积增长率达12％，即增加1230万hm2，达到1.143亿hm2(2.824亿英亩)。第一个12年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种对新的对小菜蛾、棉铃虫、粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌CRY9E基因和晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.5所示。

编码该杀虫蛋白的基因。

该基因为Cry9Ee1，其核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

该杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.6所示。

编码该杀虫蛋白的基因。

该基因为Cry9Eb2，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

上述杀虫蛋白在杀灭鳞翅目害虫中的应用。

一种杀虫剂，其特征在于；含有有效量的杀虫蛋白。

上述基因在抗鳞翅目害虫中的应用。

所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。

本发明从菌株T03B001(保藏号：BGSC No.4AP1，公众可以从中国农业科学院植物只护研究所取得)，得到三个不同基因的阳性克隆，即pEB1，pEB2，pEB3，对其进行测序分析，发现克隆pEB 1中含有3453个碱基，见SEQ NO.1，编码1151个氨基酸，见SEQ NO.4。与已发表的基因相比，与cry9Da1相似性最高，相似性为99％，有一个氨基酸差异。是一个新基因，命名为Cry9Da4；克隆pEB 2中含有3417个碱基，见SEQ NO.2，编码1139个氨基酸，见SEQ NO.5。与已发表的基因相比，与cry9Ed相似性最高，相似性为81％。是一个新模式基因，命名为Cry9Ee1；克隆pEB 3中含有3405个碱基，见SEQ NO.3，编码1135个氨基酸，见SEQ NO.6。与已发表的基因相比，与cry9Eb1相似性最高，相似性为98％，有15个氨基酸差异。是一个新基因，命名为Cry9Eb2。分别从上述阳性克隆提取质粒，转入受体菌，得到表述菌株，测定基因的表达蛋白的活性，发现，基因Cry9Ee1和Cry9Eb2表达的蛋白对小菜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为100％，而基因Cry9Da4表达的蛋白对小菜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为0。通过杀虫活性区的氨基酸序列比对发现，SEQ NO.4与SEQ NO.5的相似性为52％，而SEQ NO.6与SEQ NO.5的相似性为62％。

基因Cry9Ee1和Cry9Eb2可按生物技术的常规方法转化微生物、植物，表现出对相关鳞翅目害虫的毒性。

将上述基因转化菌株，表达得到的蛋白可以制成生物农药用于杀死鳞翅目的害虫。

本发明的Cry9Ee1和Cry9Eb2表现出对鳞翅目害虫的高毒力性，特别是对小菜蛾、玉米螟有高活性，是很好的生物杀虫基因，有很广泛的应用前景。

附图说明

图1菌株T03B001中cry9全长基因的PCR扩增，

其中1，菌株T03B001中cry9全长基因的PCR产物，长度约为3.5kb；2，阴性对照；M，λ/Eco130I

图2克隆筛选过程中的溶解峰曲线，

图3新基因在Rosetta(DE3)中表达分析，

1，pEB1；2，高分子量标准3，pEB2；4，pEB3。

具体实施方式实施方案

1、菌株T03B001杀虫活性测定

将菌株接种到LB固体培养基上，培养72小时，至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体用灭菌水洗下来，悬浮起来，稀释到1亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、棉铃虫、玉米螟为例，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。

1.1筛选对棉铃虫试验方案

首先采用表面涂抹法对Bt菌株进行初筛。将配制好的人工饲料用连续移液器加入96孔培养板中，每孔加200ul饲料，饲料冷却凝固后加入20ul的菌液，待菌液风干后，接虫。每种菌液(每个处理)加到8个孔中(96孔板上的1排)，同一个板上同时设清水(或Na₂CO₃缓冲液)和HD73菌株为阴、阳性对照。接棉铃虫的初孵幼虫，将幼虫直接抖落在96孔板中，每孔接虫3-4头，用封口膜封住每孔。将接好虫的各个处理放到温度27±2℃、相对湿度75±10％、光照14∶10(L∶D)h的养虫室中培养，3天后检查结果。

1.2筛选对亚洲玉米螟试验方案

首先采用饲料混合法对Bt菌株进行初筛。将待测菌液和饲料按900∶1(mL∶g)配制成测试饲料，配制好的测试饲料分装48孔培养板中，每孔加约0.3毫克饲料。每1测试饲料分装到6个孔中(48孔板上的1排)，同一块板上同时设清水(或Na₂CO₃缓冲液)和HD73菌株为阴和阳性对照。接亚洲玉米螟虫初孵幼虫，每孔接虫3头，用封口膜封盖。将接好虫的各个处理放到温度28±2℃、相对湿度80±10％、光照16∶8(L∶D)h环境箱中培养，7天后检查结果。

1.3筛选对小菜蛾试验方案

采用浸叶法对Bt菌株进行初筛。将待测孢晶混合液加入千分之一的Triton-100混匀，均匀涂布于菜叶表面。菜叶采用实验室在温室种植的未喷洒农药的新鲜菜叶。每个样品一个菜叶，接虫20头。将接好虫的各个处理放到温度26±2℃、相对湿度80±10％、光照16∶8(L∶D)h环境箱中培养，3天后检查结果。

结果显示该浓度的芽孢晶体混合物对小菜蛾、玉米螟具有高活性。两种试虫的死亡率都为100％。

2、菌株T03B001中基因的克隆：

设计了1组全长通用引物(P1\P2)

全长通用引物(P1\P2)序列：

P1-ATGAATCGAAATAATCAAAATGAATATG

P2-TTCACTCACCTCTACCCACAT

2、1扩增全长基因

以菌株T03B001的总DNA为模板，用pfuDNA聚合酶，进行PCR扩增，结果(见附图1)显示扩增出约3.5Kb的条带。

用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。。

10×PCR buffer         5μL

dNTP(10mM)             1μL

引物对(10mM)           1μL/个

模板                   1uL

pfuDNA聚合酶(5U/μL)   0.5μL

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。

将纯化片段与载体pEB连接转化大肠杆菌JM110，按照以下方案进行连接转化。

2.2连接方案

载体                   0.1-0.2μg

目的片段DNA            0.5-1.0μg

5×Ligation Buffer     2μL

T4DNALigase            1μL

用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。

2.3转化方案

1.挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；

2.按1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；

3.4℃，4,000rpm离心10min；

4.弃上清，加入预冷的0.1M CaCl₂ 50ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；

5.4℃，4,000rpm离心10min，回收细胞；

6.用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，分装成200μl/0.5mL离心管中，于4℃保存(可保存一周)。

7.取200μl感受态细胞与5μL连接产物充分混匀，冰浴30min。

8.42℃热激1.5min，冰浴3min。

9.加入800μl LB培养基37℃培养45min。

10.取200μl涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X-gal，37℃培养。

2.4克隆筛选

根据菌株保守可变区设计一对鉴定引物(P3/P4)，对转化大肠杆菌JM110获得的克隆进行筛选。

鉴定引物(P3/P4)序列：

P3-GGTCCAGGATTTACAGGA

P4-TCTTATGCGATATCGTTGTGTTA

先用鉴定引物(P3/P4)对获得的克隆的DNA进行PCR扩增。

用下列PCR反应体系(50μL)扩增

10×PCR buffer          2μL

MgCl₂(20mM)             2μL

dNTP(10mM)              1μL

引物对(10mM)            1μL/个

模板                    1uL

Taq聚合酶(5U/μL)       0.5μL

饱和型荧光燃料          2μL

超纯水补至20μL，混匀离心，加石蜡油20μL。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。

进一步利用高分辨率DNA熔点分析仪(Idaho/LightScanner)测定PCR扩增产物的溶解曲线，通过比较溶解曲线的有无与异同来确定阳性克隆的存在与所含有的基因的种类，结果见图2，溶解峰曲线显示克隆中所含基因分为3类。

对这三种克隆进行测序分析，结果显示：

克隆pEB 1，Type 1，含有3453个碱基，见SEQ NO.1，编码1151个氨基酸，见SEQ NO.4。与已发表的基因相比，与cry9Da1相似性最高，相似性为99％，有一个氨基酸差异。是一个新基因，命名为Cry9Da4。该基因属于cry9Da基因。通过利用在线分析工具

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，使用蛋白保守结构域数据库比对(ConservedDomain Database)分析，该蛋白氨基酸序列SEQ NO.4的70至668位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。

克隆pEB 2，Type 2，含有3417个碱基，见SEQ NO.2，编码1139个氨基酸，见SEQ NO.5。与已发表的基因相比，与cry9Ed相似性最高，相似性为81％。是一个新模式基因，命名为Cry9Ee1。通过利用在线分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，使用蛋白保守结构域数据库比对(Conserved Domain Database)分析，该蛋白氨基酸序列SEQ NO.4的70至657位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。

克隆pEB 3，Type 3，含有3405个碱基，见SEQ NO.3，编码1135个氨基酸，见SEQ NO.6。与已发表的基因相比，与cry9Eb1相似性最高，相似性为98％，有15个氨基酸差异。是一个新基因，命名为Cry9Eb2。通过利用在线分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，使用蛋白保守结构域数据库比对(Conserved Domain Database)分析，该蛋白氨基酸序列SEQ NO.4的70至652位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。

3、基因表达与活性测定

3.1在上述克隆提取质粒DNA，转入受体菌Rosetta(DE3)中，获得表达菌株。

IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。

诱导表达过程如下：

1)活化菌种(37℃、12hr)；

2)10％接种于LB培养基中(37℃、2hr)；

3)加入诱导物IPTG，150rpm，18-22℃低温诱导4-20h；

4)离心收集菌体，加入10mM Tris.Cl(pH 8.0)悬浮；

5)破碎菌体(超声波破碎完全)；

离心12,000rpm 10min 4℃；

收集上清及沉淀各10-15μL，分别电泳检测。

聚丙烯酰胺凝胶配置如下。

                          分离胶8％(ml)       堆积胶5％(ml)

Distilled water           4.6                 2.7

30％Degassed Acrylamide   2.7                 0.67

1.5M Tris(pH8.8)          2.5

1.0M Tris(pH6.8)                              0.5

10％SDS                   0.1                 0.04

10％APS                   0.1                 0.04

TEMED                     0.006               0.004

上样：上样10-15μl，电泳：130-150V恒压。

染色与脱色：电泳后取出凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，60rpm振荡染色1hr左右，脱色液中脱色2hr左右，脱色至凝胶背景透明，清水中漂洗至蛋白带清晰。

检测结果表明表达的蛋白分子量约为130kD，结果见图3。

3.2基因编码蛋白的杀虫活性测定

将新基因表达蛋白，用水稀释到不同浓度，以小菜蛾、玉米螟为例，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性，结果见表1。结果显示，pEB 2，pEB 3对鳞翅目害虫非常好的杀虫活性。

表1新Cry蛋白对鳞翅目害虫生测结果

3.3SEQ NO.4，SEQ NO.5，SEQ NO.6序列相似性比较

利用序列比较软件分析SEQ NO.5与SEQ NO.4，SEQ NO.6杀虫活性区的氨基酸的相似性(表2)。结果显示，和SEQ NO.5氨基酸序列的蛋白有相似的杀虫活性的蛋白，杀虫活性区的氨基酸相似性是62％。而相似新在52％的具有SEQ NO.4序列特征的蛋白没有杀虫活性。

表2SEQ NO.5与SEQ NO.4，SEQ NO.6杀虫活性区的氨基酸的相似性

	SEQ NO.4	SEQ NO.6
			SEQ NO.5	52％	62％

附录

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>苏云金芽孢杆菌Cry9E基因，蛋白及其应用

<130>P09477/ZWB

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3453

<212>DNA

<213>克隆pEB 1的基因序列

<400>1

atgaatcgaa ataatcaaaa tgaatatgaa gttattgatg ccccacattg tgggtgtccg    60

gcagatgatg ttgtaaaata tcctttgaca gatgatccga atgctggatt gcaaaatatg   120

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gagacaaaac atatgtgggt agaggtgagt gaa                                 3453

<210>2

<211>3417

<212>DNA

<213>克隆pEB 2的基因序列

<400>2

atgaatcgaa ataatcaaaa tgaatatgaa attattgatg cccctcattg tggatgtccg    60

tcagatgatg ttgtgaaata tcctttggca agtgacccaa atgcagcgtt acaaaatatg   120

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ttaagtttta caactaatca ggctggatcc atagccaatg cagggcgcgt ccctacttat  1500

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gatgttacta tccgtttagt gagacaggac acccaaagta atataggaag cataaactta  1800

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ctaaatgcaa gtgtagatca gggcatttgg gttgtattaa aagttcgaac aacagatggg  2700

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gaacgcgaac aaagagataa tgcgaaatgg aatgcagagc taggaagaaa gcgtgcagaa  2820

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<210>3

<211>3405

<212>DNA

<213>克隆pEB 3的基因序列

<400>3

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ctaggatttc taggtgttcc atttgctggt cagttagtta ctttctatac ttttctttta   300

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gcaaatccac agcttacacg tgaaatatat acggatccaa tcgtatataa tccaccagct     960

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<210>4

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<212>PRT

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341     AsnAlaPheIleArgProProHisLeuPheAspArgLeuAsnArgLeuThrIleSerArg

361     AsnArgTyrThrAlaProThrThrAsnSerTyrLeuAspTyrTrpSerGlyHisThrLeu

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1121    ValPheHisProGluThrGlnHisMETTrpValGluValSerGlu

Claims (10)

1.一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.5所示。

2.编码权利要求1所述的杀虫蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，所述基因为Cry9Ee1，其核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

4.一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.6所示。

5.编码权利要求4所述的杀虫蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，该基因为Cry9Eb2，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

7.权利要求1或4所述的杀虫蛋白在杀灭鳞翅目害虫中的应用。

8.一种杀虫剂，其特征在于；含有有效量的权利要求1或4所述的杀虫蛋白。

9.权利要求2、3、5或6所述基因在抗鳞翅目害虫中的应用。

10.权利要求9所述应用，是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋白。

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