CN107056657B - 一种昆虫特异性多胺类小分子毒素、其纯化方法及其应用 - Google Patents

一种昆虫特异性多胺类小分子毒素、其纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种昆虫特异性多胺类小分子毒素(记为AVTX‑623)，其相对分子量为622.3971；其分子式为C28H50N10O6。本发明还公开了一种上述AVTX‑623的纯化方法，通过超滤、离子交换层析以及反相‑高效液相层析三大步骤，能够从大腹园蛛的毒液中完全纯化出纯净的AVTX‑623，操作步骤简单，损失率低，实用性强。本发明还公开一种上述AVTX‑623的应用，可用于制作杀虫剂或/和神经生物学试剂和药物。

Description

一种昆虫特异性多胺类小分子毒素、其纯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种从大腹园蛛毒液中提取的昆虫特异性多胺类小分子毒素、其纯化方法及其应用。
背景技术
大腹园蛛(Araneus ventricosus)是一种以昆虫为食的中型蜘蛛，在分类上隶属于节肢动物门，蛛形纲，蜘蛛目，圆蛛科，圆蛛属。大腹园蛛是目前世界上分布最广的蜘蛛之一，其毒液中存在大量能麻醉或致死昆虫的毒性成分。探索这些昆虫特异性毒素分子的结构与功能特点，从中筛选出可能用做神经生物学研究工具试剂和药物及杀虫剂的前体分子。
目前，针对大腹园蛛毒液的研究很少，日本Kawai等人通过研磨大腹园蛛毒囊得到毒囊提取物，发现大腹园蛛毒囊提取物能抑制龙虾神经肌肉接头兴奋性突触后电位，对抑制性突触后电位没有影响；此外该毒囊提取物能抑制谷氨酸诱导的突触后膜去极化，而对天门冬氨酸诱导的突触后模去极化没有影响。段志贵等人采用电刺激方法得到纯净的毒液(大腹园蛛毒液)，并对其中的蛋白质成分进行了分析，此外还发现该毒液对昆虫有选择性作用，对脊柱动物无明显毒性。其他未见关于该蜘蛛毒液昆虫特异性小分子毒素分离纯化和功能研究的报道。
因此，设计一种能够从大腹园蛛的毒液中提取有利于制作神经生物学试剂和药物以及制作杀虫剂的毒素具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种从大腹园蛛的毒液中分离纯化出来的昆虫特异性多胺类小分子毒素，。该昆虫特异性多胺类小分子毒素的相对分子量为622.3971；其分子式为C28H50N10O6，其结构式如下：
经过质谱及核磁共振技术确定该昆虫特异性多胺类小分子毒素的分子式、结构式和空间结构。经过对数据库和文献调研发现，一种来自叶金蛛(Argiope lobata)毒液的乙酰多胺类小分子毒素ArgTX-636比本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素(计为AVTX-623)多了一个亚甲基，其分子式为C29H52N10O6，其结构式如下：
ArgTX-636和AVTX-623两者因结构上的差异造成了分子功能上的明显差异：(1)本发明所得AVTX-623能够特异性地作用于昆虫钠离子通道，其对昆虫钠通道的作用剂量比ArgTX-636低十倍；对昆虫的活体毒性结果表明，AVTX-623对昆虫的半有效麻醉剂量比ArgTX-636低20倍；(2)对脊椎动物NMDA受体活性上，本发明所得AVTX-623的作用剂量也比ArgTX-636稍低；(3)本发明所得AVTX-623是一种新的天然分子，其对昆虫的选择性活性比已发现的相似分子ArgTX-636要高得多。
本发明的第二目的在于提供一种上述昆虫特异性多胺类小分子毒素的纯化方法，具体包括以下步骤：
第一步、毒液的超滤，具体是：将电刺激收集到的毒液利用超滤管分离，重复多次，合并滤液，得到含有昆虫特异性多胺类小分子毒素的非蛋白质小分子毒素混合物；
第二步、非蛋白质小分子毒素混合物的离子交换层析，具体是：将非蛋白质小分子毒素混合物采用强阳离子交换柱进行分离，得到洗脱峰；选择经生物质普检测出的目标峰作为反相-高效液相层析的目标峰；
第三步、反相-高效液相层析，具体是：采用C18反相柱将目标峰进行脱盐和进一步纯化，收集经过生物质普确定的目标峰进行冷冻干燥，即得昆虫特异性多胺类小分子毒素。
以上技术方案中优选的，所述第一步中：毒液为大腹园蛛的毒液；所述超滤管中的超滤膜为允许3KDa以下的分子通过的半透膜；分离具体为在转速为8000-12000rpm条件下离心8-10分钟；重复分离三次合并滤液。
以上技术方案中优选的，所述第二步中：强阳离子交换柱的规格为10mm×250mm，其型号为XB-SCX；分离具体是：利用0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液上样，采用含1.2mol/L氯化钠和0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液的混合溶液梯度洗脱，洗脱时的流速2mL/min，检测波长为280nm。
以上技术方案中优选的，所述第三步中：C18反相柱的规格为10mm×250mm，反相柱的型号为XB-SCX；采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱，洗脱液A由质量含量为2％的乙腈、质量含量为0.1％的三氟乙酸以及去离子水混合而成；洗脱液B由质量含量为2％的去离子水、质量含量为0.1％的三氟乙酸以及色谱纯乙腈混合而成；梯度洗脱；洗脱过程中总流速为2mL/min，检测波长为280nm。
应用本发明的纯化方法，具有以下有益效果：本发明通过超滤、离子交换层析以及反相-高效液相层析三大步骤，能够从大腹园蛛的毒液中完全纯化出纯净的昆虫特异性多胺类小分子毒素，操作步骤简单，损失率低，实用性强；本发明将液相层析法引入蜘蛛非蛋白质类多胺类小分子的分离纯化前，采用了3kDa的超滤膜去除蛋白质类成分，同时极大的减少了样品的损失，实现了90％以上的得率；通过分子膜超滤、离子交换层析和基于C18柱的RP-HPLC的组合分离策略，实现了上述毒素蛋白的分离和纯化。
本发明的第三目的提供一种上述昆虫特异性多胺类小分子毒素的应用，用于制作杀虫剂和/或用于制作神经生物学试剂和药物，具体是：用于制作杀虫剂，主要是由于：本发明所得AVTX-623对昆虫具有剧毒，且能抑制蜚蠊DUM神经细胞膜上的电压敏感钠离子通道电流；本发明所得AVTX-623用于制作神经生物学试剂和药物，主要是由于：其对大鼠和小鼠均无明显毒性，且能抑制人谷氨酸受体。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的离子交换层析图；
图2是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的反相-高效液相层析图；
图3是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的质谱图；
图4是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的核磁共振氢谱图；
图5是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的核磁共振碳谱图；
图6是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的H1-H1耦合谱图；
图7是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的核磁共振DEPT谱图；
图8是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的核磁共振HMBC谱图；
图9是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素的核磁共振HSQC谱图；
图10是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对蜚蠊钠离子通道的阻断作用示意图；
图11是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对蜚蠊钠离子通道的半有效剂量示意图；
图12是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对大鼠DRG钠离子通道的影响示意图；
图13是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对红头丽蝇的半有效麻醉剂量示意图；
图14是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对美洲蜚蠊的半有效麻醉剂量示意图；
图15是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对人NMDA受体(NR1/NR2B)的抑制作用示意图；
图16是实施例1中昆虫特异性多胺类小分子毒素对人NMDA受体的抑制作用的半有效抑制剂量示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1：
一种昆虫特异性多胺类小分子毒素，所述昆虫特异性多胺类小分子毒素的相对分子量为622.3971；其分子式为C28H50N10O6，其结构式如下：
上述昆虫特异性多胺类小分子毒素的纯化方法，具体包括以下步骤：
第一步、毒液的超滤，具体是：将电刺激收集到的毒液利用超滤管分离，重复多次，合并滤液，得到含有昆虫特异性多胺类小分子毒素的非蛋白质小分子毒素混合物。此处，毒液为大腹园蛛的毒液；所述超滤管中的超滤膜为允许3KDa以下的分子通过的半透膜；分离具体为在转速为8000-12000rpm条件下离心8-10分钟；重复分离三次合并滤液。
第二步、非蛋白质小分子毒素混合物的离子交换层析，具体是：将非蛋白质小分子毒素混合物采用强阳离子交换柱(采用月旭科技(上海)股份有限公司生产的产品)进行分离，得到10个洗脱峰，详见图1；选择经生物质谱检测出的目标峰作为反相-高效液相层析的目标峰(图1中标有*的峰)。此处，强阳离子交换柱的规格为10mm×250mm，其型号为XB-SCX；分离具体是：利用pH6.0磷酸缓冲液上样，采用氯化钠溶液梯度洗脱，氯化钠溶液洗脱时的流速2mL/min，检测波长为280nm。
第三步、反相-高效液相层析，具体是：采用C18反相柱(采用月旭科技(上海)股份有限公司生产的产品)将目标峰进行脱盐和进一步纯化，详见图2，收集经过生物质谱确定的目标峰(图2中标有*的峰)进行冷冻干燥，即得昆虫特异性多胺类小分子毒素。此处，C18反相柱的规格为10mm×250mm，反相柱的型号为XB-C18；采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱，洗脱液A由质量含量为2％的乙腈、质量含量为0.1％的三氟乙酸以及去离子水混合而成；洗脱液B由质量含量为2％的去离子水、质量含量为0.1％的三氟乙酸以及色谱纯乙腈混合而成；进行梯度洗脱；洗脱过程中总流速为2.0m/min，检测波长为280nm。
鉴定本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素(AVTX-623)的纯度和结构，详情如下：
1、对本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素(AVTX-623)进行质谱分析，具体是：
利用电喷雾生物质谱(ESI-TOFQ-II)测定AVTX-623的分子量，详见图3，从图3中可以看出AVTX-623带1个正电荷，根据电荷数和质荷比可以计算出AVTX-623的分子量为622.3971。同时可以看出，AVTX-623中杂质含量极低，为高纯品。
2、本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素(AVTX-623)进行核磁共振分析及结构解析，具体是：
①、AVTX-623的氢谱和碳谱分析
利用布鲁克VNS-600核磁共振仪上进行了氢谱分析(详见图4)和碳谱分析(详见图5)。500MHz和600MHz用来进行1HNMR分析，125MHz和150MHz用来进行13C NMR分析。化学位移(δ)单位为ppm，耦合常数单位为赫兹(Hz)。
②、二维核磁共振谱采集及谱图分析
所有的二维谱图在相敏感模式下采用时间相递增法加标准脉冲排序和相循坏的方法采集。溶剂峰抑制采用预饱和的方法获得。二维核磁共振谱在室温下记录，包括COSY谱，利用37和73ms的混合时间，COSY的记录数据点为t1和t2是512和2048。利用软件XWINNMR(Bruker)进行被操作和观察。所有的数据被零填充去产生2k和4k实际基质的COSY.傅里叶转换前，采用具有一个1/2的相漂移的正玄波或正玄波平方窗口功能。
根据ESI-MS m/z 623.4015[M+H]计算出质荷比为623.3988，分子式为C28H51O6N10确定该化合物化学式是：C28H50O6N10，其13C-NMR谱图(详见图5)和DEPT谱图(详见图7)谱显示有28个碳信号，包括15个亚甲基碳(δC 48.2,46.7,46.0,45.1,41.7,39.0,38.5,37.4,37.1,29.7,27.4,27.0,25.6,24.0,23.6)，5个次甲基碳(δC 133.0,108.1,103.8,54.2,52.2)，8个季碳(δC 175.5,174.9,173.6,170.6,159.1,158.7,157.3,114.4)，通过1H-NMR谱图(详见图4)、13C-NMR谱图(详见图5)、HSQC谱图(详见图9)和DEPT谱图(详见图7)等波谱数据对所有的H和C进行了归属。
该毒素的核磁共振氢谱图(详见图4)上6.36(1H,d,J＝2.3Hz)，6.31(1H,dd,J＝8.2,2.3Hz)，6.97(1H,d,J＝8.2Hz)，表明存在一个苯环的ABX偶合系统，6.36ppm和6.31ppm的存在显示苯环上存在两个含氧取代，在碳谱上存在159.1和157.3ppm进一步证明苯环上存在两个含氧取代。碳谱上170.6，175.5，173.6和174.9ppm为羰基碳信号，结合该化合物存在10个N，提示是酰胺键的羰基碳，在氢谱高场区(δ<3.5ppm)和碳谱高场区(δ<50.0ppm)存在多个CH2信号，表明该化合物存在多个CH2碳链。碳谱158.7ppm提示存在一个C＝N双键，化合物可能存在一个胍基。综上所述，该化合物含有一个苯环，并且存在4个酰胺键，通过多个CH2碳链相连，还有一个胍基。
该化合物1H-NMR(详见图6)数据与化合物Argtx-636非常相似(参考文献：MartinRADITSCH,Matthias GEYER,Hans Robert KALBITZER.Polyamine spider toxins andmammalian N-methyl-maspartatereceptors Structural basis for channel blockingand binding ofargiotoxin636[J].Eur.J.Biochem.1996,240:416-426.)，表明这两个化合物有相同的骨架，两者最大的区别在于化合物1的13C-NMR少了一个脂肪碳信号，并且化合物1分子质量是622，比Argtx-636的分子质量636少14，表明化合物1少了一个CH2，在HMBC谱(图8)中，H-2(δ3.35,3.18)与C-3(δ23.6)相关，H-5(δ2.95,2.89)与C-3(δ23.6)相关，H-3(δ1.58)与C-4(δ27.0)相关，H-7(δ3.00)与C-5(δ48.1)相关，并结合1H-1H COSY谱中，H-2(δ3.35,3.18)与H-3(δ1.58)相关，H-5(δ2.95,2.89)与H-4(δ1.57)相关，确定C2-C5的碳链，以及N1和N6之间通过4个CH2相连，确定是N1和N6之间比Argtx-636少了一个CH2，其它部分完全相同，综合1DNMR和2DNMR确定该化合物的结构，即该化合物的分子式为C28H50N10O6，结构式如下：
3、分析本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素(AVTX-623)的功能，具体是：
①AVTX-623对昆虫的麻醉和致死作用，详情如下：
经膜片钳分析，毒素AVTX-623在浓度为10μmol/L时能完全阻断蜚蠊的钠离子通道(详见图10)，通过不同浓度的AVTX-623对蜚蠊钠离子通道的作用分析，得出了毒素AVTX-623对昆虫DUM细胞钠通道的半有效浓度。其中半有效溶度为0.84±0.04μmol/L(详见图11)。毒素AVTX-623在浓度100μmol/L时对大鼠钠离子通道没有表现出明显的影响(详见图12，图12中的对照为直接加水的实验)。研究结果表明，AVTX-623能在10μmol/L浓度下完全阻断昆虫的钠离子通道，而在高达100μmol/L浓度下对脊椎动物钠离子通道没有明显作用(详见图12)，表现出很强的选择性。对昆虫的毒理实验显示，AVTX-623对红头丽蝇(C.vicina)的麻醉作用的半有效剂量为4.9±0.6μg/g(详见图13)，而对美洲蜚蠊(蟑螂)的麻醉作用的半有效剂量为3.5±0.5μg/g(详见图14)。这些研究结果提示，毒素分子AVTX-623可以成为一种新型的绿色农药先导分子。而在高达100mg/Kg的腹腔注射剂量下，对小鼠没有表现出明显的毒性。
②AVTX-623对人体谷氨酸受体(NMDAR1/NMDAR2B)通道的作用，详情如下：
经膜片钳分析，毒素AVTX-623在浓度为100nmol/L时能抑制75％的人谷氨酸受体(NMDAR1/NMDAR2B)通道(详见图15)，通过不同浓度的AVTX-623对人的谷氨酸受体通道的作用分析，得出了毒素AVTX-623对人体谷氨酸受体(NMDAR1/NMDAR2B)通道的半有效浓度为8.7±1.3nmol/L(详见图16)。而这种受体通道与癫痫、抑郁症和老年痴呆等疾病直接相关。
③AVTX-623与结构最相近的ArgTX-636相比较：
现有的ArgTX-636主要作用于非脊椎动物和脊椎动物的谷氨酸受体，对不同亚型的受体抑制浓度在0.1μmol/L到3μmol/L范围中。未见这些乙酰多胺类小分子对昆虫钠离子通道有选择性作用的报道。
本发明所得AVTX-623对昆虫钠离子通道的阻断活性较强，半有效剂量低于1μmol/L，而100倍浓度的ArgTX-636只能阻断昆虫钠离子通道的20％。此外，10倍浓度的ArgTX-636人的NMDA受体(NR1/NR2B)的抑制作用还不能达到AVTX-623的作用强度。
综上所述，本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素对昆虫具有剧毒，且能抑制蜚蠊DUM神经细胞膜上的电压敏感钠离子通道电流，用于制作杀虫剂(如用作绿色农药研发先导分子的可能性)；本发明所得昆虫特异性多胺类小分子毒素对大鼠和小鼠均无明显毒性，且能抑制人谷氨酸受体(AVTX-623对谷氨酸受体亚型NMDA受体的极高亲和力)，用于制作神经生物学试剂和药物(如有可能作为一种抗癫痫、脑年痴呆、帕金森和抑郁症的先导分子)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种昆虫特异性多胺类小分子毒素的纯化方法，其特征在于：所述昆虫特异性多胺类小分子毒素的相对分子量为622.3971；其分子式为C28H50N10O6；
所述昆虫特异性多胺类小分子毒素的结构式如下：
；
该纯化方法包括以下步骤：
第一步、毒液的超滤，具体是：将电刺激收集到的毒液利用超滤管分离，重复多次，合并滤液，得到含有昆虫特异性多胺类小分子毒素的非蛋白质小分子毒素混合物；毒液为大腹园蛛的毒液；所述超滤管中的超滤膜为允许3KDa以下的分子通过的半透膜；分离具体为在转速为8000-12000rpm条件下离心8-10分钟；重复分离三次合并滤液；
第二步、非蛋白质小分子毒素混合物的离子交换层析，具体是：将非蛋白质小分子毒素混合物采用强阳离子交换柱进行分离，得到洗脱峰；选择经生物质谱检测出的目标峰作为反相-高效液相层析的目标峰；强阳离子交换柱的规格为10mm×250mm，其型号为Ultimate® XB-SCX；分离具体是：利用0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液上样，采用含1.2mol/L氯化钠的0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液混合液梯度洗脱，洗脱流速为2mL/min，检测波长为280nm；
第三步、反相-高效液相层析，具体是：采用C18反相柱将目标峰进行脱盐和进一步纯化，收集经过生物质谱确定的目标峰进行冷冻干燥，即得昆虫特异性多胺类小分子毒素，其中：C18反相柱的规格为10mm×250mm，反相柱的型号为Ultimate® XB-C18；采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱，洗脱液A由质量含量为2%的乙腈、质量含量为0.1%的三氟乙酸以及去离子水混合而成；洗脱液B由质量含量为2%的去离子水、质量含量为0.1%的三氟乙酸以及色谱纯乙腈混合而成，梯度洗脱，洗脱过程中的总流速为2mL/min，检测波长为280nm。
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