CN102439022A - 新型钠通道阻滞化合物河豚毒素吡喃半乳糖苷 - Google Patents

Abstract

具有式I的新型钠通道阻滞化合物河豚毒素吡喃半乳糖苷通过HPLC被分离和纯化，并且通过IR、NMR、GC以及MS被进一步鉴定。该化合物具有附接到河豚毒素的C11的吡喃半乳糖基部分，并且保留后者的镇痛活性。药物组合物及其医疗用途被进一步公开。

Description

新型钠通道阻滞化合物河豚毒素吡喃半乳糖苷

技术领域

本发明涉及新型钠通道阻滞化合物的纯化和/或分离，以及其使用方法。

背景技术

许多钠通道阻滞化合物先前已被鉴定和纯化。例如，河豚毒素(“TTX”)(又称为替曲朵辛、河豚鱼毒素、章鱼毒素、原豚素、蝾螈毒素、河豚毒素(tetrodontoxin)、东方豚毒素以及TTX(默克索引第12版，第1578页，1996年))是在河豚鱼(tetradontiae)体内发现的生物毒素。化学名称是八氢-12-(羟基甲基)-2-亚氨基-5，9，7，10a-二甲桥-10aH-[1，3]二氧杂(dioxocino)[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇，具有分子式C₁₁H₁₇N₃O₈和319.27的分子量。TTX是有效的非蛋白神经毒素，并且是用于神经生物学和生理学研究的必不可少的工具药品。TTX是海洋有机毒素，主要在河豚鱼的睾丸、卵巢、卵、肝、脾、眼球和血液中，以及在多种的动物物种(包括虾虎鱼、水螈、蛙类以及蓝环章鱼)和甚至海藻中发现。TTX是已知的物质，并且其生产工艺是已知的。通常，TTX提取自海洋生物(例如，JP 270719Goto和Takashi)。众多的提取方法已被公开，例如，在US 6,552,191、US 6,478,966、US 6,562,968以及US 2002/0086997(全部在此通过引用被并入本文)中。TTX的合成也已被描述并且对于本领域技术人员是公知的(Kishi，Y.等，J.Am.Chem.Soc.1994，94：9217-9221；Ohyabu，N.等，J.Am.Chem.Soc.2003，125：8798-8805；以及Hinman，A.等，J.Am.Chem.Soc.2003，125：11510-11511.)。

已知TTX是高效和特异的钠通道阻滞剂。TTX的生物活性和药理学性质已成为众多综述的主题，例如，Kao，Pharmacol.Rev.18：997-1049(1996)；Tu，Anthony(Ed.)天然毒素手册，第3卷：海洋毒素和毒液，185-210页(1988)；以及Narahashi，J.Toxicol.20：67-84(2001)，全部在此通过引用被并入本文。

TTX在疼痛处置(management)和药品上瘾的治疗中的使用已经公开在，例如，WO2002/022129(Dong等)、CN 1,145,225(Wang等)、US 5,846,975(Pan等)以及US 6,326,020(Kohane等)。授予Dong等的美国专利号6,407,088描述了与适合的药物媒介物组合以缓解疼痛的河豚毒素的全身性施用。授予Schwartz等的美国专利号6,030,974描述了在经受上皮组织区域疼痛的哺乳动物体内产生局部麻醉的方法。该方法包括将有效剂量的长效钠通道阻滞化合物(以适合的药物媒介物)局部地给予到所述区域。Adams等(美国专利号4,022,899和4,029,793)涉及河豚毒素或脱氧河豚毒素，以及另一化合物(通常为常规的局部麻醉化合物或具有神经阻滞性质的类似的化合物)的局部麻醉组合物。

尽管TTX在各种类型的疼痛和药品上瘾的治疗中是安全和有效的，但由于其药物学属性，TTX需要谨慎的操作，所述药物学属性包括高水平的毒性以及适于保证TTX的安全和有效治疗的独特的剂量窗口。此外，不是所有的患者对TTX反应良好。因此，具有独特性质以及可能具有不同的药物学属性的可选择的钠通道阻滞化合物将提供有用的替换物，以治疗和/或处置疼痛和/或药品上瘾，并且由此将是合乎期望的。

发明内容

本发明的一个目的是通过纯化先前未鉴定的钠通道阻滞剂来消除或减轻先前的钠通道化合物(包括TTX)的至少一个或更多个缺点，该钠通道阻滞剂已被惊人地发现具有在疼痛处置方面的功用。

在第一方面，本发明提供具有式I的纯化的化合物，或者所述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物形式，其中在C-11的取代基为半乳糖苷。

在另一方面，化合物是如式I-a所表示的D-吡喃半乳糖基-TTX，在又另一方面，化合物是如式I-b所表示的L-吡喃半乳糖基-TTX。在又另一方面，化合物是D-吡喃半乳糖基-TTX和L-吡喃半乳糖基-TTX的混合物。在又另一方面，混合物由摩尔过量的D-吡喃半乳糖基-TTX构成。在又另一方面，混合物由摩尔过量的L-吡喃半乳糖基-TTX构成。在又另一方面中，混合物是外消旋混合物。

本发明中的一种或更多种化合物可以从河豚鱼、虾虎鱼、水螈、蛙类、蓝环章鱼或海藻被分离和纯化。化合物可以用于用以治疗疼痛的药剂的制备，并且可以使用一种或更多种药学上可接受的赋形剂的添加而被配制。

本发明中的一种或更多种化合物可以(可选地与一种或更多种药学上可接受的赋形剂一起)用于针对疼痛(包括神经性疼痛、痛觉过敏(hyperalgesia)、异常性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、肌骨骼疼痛、内脏疼痛、炎症疼痛以及癌症疼痛)的治疗的药剂的制备。本发明中的一种或更多种化合物可以(可选地与种个或更多种药学上可接受的赋形剂一起)用于用以治疗药品依赖的药剂的制备。

当结合附图阅读本发明的具体实施方案的以下描述时，本发明的其他的方面和特征对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图说明

现将参考附图，仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：

图1图示说明钠通道阻滞剂河豚毒素(TTX)及其在稀酸溶液中的互变异构体。

图2图示说明TTX和4，9-酐-TTX之间的互变(inter-conversion)。

图3图示说明11-(D-吡喃半乳糖基)-TTX(半醛糖内酯，hemilactal)及其内酯形式。

图4图示说明典型的一批由河豚鱼分离的河豚毒素药品物质的杂质分布图。

图5图示说明纯化的11-吡喃半乳糖基-TTX的HPLC色谱图。

图6图示说明11-吡喃半乳糖基-TTX的高分辨率质谱图。

图7图示说明11-吡喃半乳糖基-TTX的红外谱图。

图8图示说明(a)11-吡喃半乳糖基-TTX、(b)D-半乳糖以及(c)D-葡萄糖的1H NMR谱图。

图9图示说明来自(a)D-葡萄糖、(b)D-半乳糖、(c)11-吡喃半乳糖基-TTX以及

(d)河豚毒素的降解-衍生产物的GC色谱图。

具体实施方式

定义：

当涉及化合物时，如在本文中所使用的“分离的”意指从其他化学品分离开，无论所述其他的化学品是当化学合成所述化合物时使用的化学品前体，或是与实质上感兴趣的所述化合物一起存在的其他的化学品。

国际疼痛研究协会(IASP)将“疼痛”定义为“与真实或潜在组织损伤相关联，或者以这样损伤的措辞描述的令人不悦的感觉和情感体验”。如在本文所使用的术语“疼痛”意指全部形式的疼痛，包括但不限于急性疼痛、慢性疼痛、中枢和末梢衍生的神经性和非神经性疼痛、躯体疼痛、伤害性疼痛、异常性疼痛、灼痛、疼痛性触觉过敏、痛觉过敏、感觉过敏(hyperesthesia)、神经炎以及或者通俗地或者技术上将被考虑为“疼痛”的其他病况和症状。疼痛处置领域的普通技术人员意识到，疼痛可以由许多不同的原因产生，可以被许多不同的生理机制表示，以及可以以许多不同的方式被患者感知。

“药学上可接受的盐”意指适于药物制剂的化合物盐，并且可以包括酸加成盐，例如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲硫酸盐、延胡索酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等等。所述盐还可以是钙盐、钾盐、镁盐、甲葡胺、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苄星青霉素盐、钠盐、四甲胺盐等等。

“药学上可接受的水合物”是指本发明的化合物或其盐，该化合物或其盐进一步包括由非共价的分子间力结合的化学计量的或非化学计量的量的水。

“药学上可接受的溶剂化物”意指一种或更多种溶剂分子与本发明的化合物的缔合。形成药学上可接受的溶剂化物的溶剂的实施例包括(但不限于)水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸以及乙醇胺。

“纯化的”意指以这样的方式使感兴趣的化合物从其他污染分子(包括其他的小分子(例如TTX)和/或大分子(例如蛋白质、核酸等等))分离，这样的方式即当继这样的分离之后与其他污染分子的百分数比较时提高感兴趣的化合物的百分数，以使当与其他污染分子比较时，感兴趣的化合物以大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％w/w存在。被理解的是，感兴趣的化合物可以包括立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体和/或感兴趣的化合物的任何或全部互变异构体形式，并且当提及如本文所描述的纯化时，这些不是必要考虑的污染分子。

“立体异构纯”意指基本上不含该化合物的其他立体异构体的化合物。例如，本发明的具有一个手性中心的立体异构纯化合物或其组合物将基本上不含有该化合物的相对的对映异构体。本发明的具有两个手性中心的立体异构纯化合物或其组合物将基本上不含有该化合物的其他非对映异构体。典型的立体异构纯化合物包括大于约80％重量的一种立体异构体和小于约20％重量的其他立体异构体，更优选地大于约90％重量的一种立体异构体和小于约10％重量的其他立体异构体，甚至更优选地大于约95％重量的一种立体异构体和小于约5％重量的其他立体异构体，并且最优选地大于约97％重量的一种立体异构体和小于约3％重量的其他立体异构体。如本文所使用的并且除非另外指明的，术语“立体异构富集的”意指本发明这样的化合物或其组合物，即包括大于约60％重量的一种立体异构体，优选地大于约70％重量，更优选地大于约80％重量的一种立体异构体。如本文所使用的并且除非另外指明的，术语“对映异构纯”意指本发明具有一个手性中心的立体异构纯化合物或其组合物。类似地，术语“立体异构富集的”意指本发明具有一个手性中心的立体异构富集的化合物或其组合物。

“治疗有效量”意指活性化合物(一种或多种)或包括活性化合物(一种或多种)的药物组合物的量，所述量引起被研究者、兽医、医师或其他临床医师寻求的组织系统、动物或人体中的生物学或医药响应，所述反应包括正被治疗的疾病或紊乱的症状的缓和。引起生物学或医药响应所需要的活性化合物(一种或多种)或药物组合物的具体的量将取决于许多因素，所述因素包括但不限于正被治疗的疾病或紊乱、正被给予的活性化合物(一种或多种)或药物试剂(一种或多种)、给予的方法以及受试者的病况。

疼痛的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防疼痛，即，使疼痛的临床症状不在可能暴露于或倾向于通常导致疼痛的体验的哺乳动物体内发展；(2)抑制或减少疼痛的量、范围或进展，即，阻止或减少或消除疼痛的量或疼痛的范围或疼痛的一种或更多种症状。

当在本文中使用时，“痕量”意指当与另一化合物的量比较时，含有按重量计小于10％、小于5％、小于3％、小于2％、小于1％。被理解的是，在从河豚鱼分离的天然TTX的制备物中，发现“痕量”的11-吡喃半乳糖基-TTX(包括11-吡喃半乳糖基-TTX的任何同分异构体、立体异构体、对映异构体、非对映异构体和/或任何或全部互变异构体形式)(在本文中也被称为gTTX或11-Gal-TTX)。取决于TTX的制备方法，和/或TTX的来源，gTTX的量可以变化，但gTTX的量仍然小于TTX的量的10％、小于TTX的量的5％、小于TTX的量的3％、小于TTX的量的2％、小于TTX的量的1％。

具体的实施方案

一般地，本发明提供分离的或纯化的新型钠通道阻滞化合物及其药物组合物，以及所述化合物的用途。

具有式I的化合物在本文中被描述：

其中在C-11的同分异构取代基是半乳糖苷，该化合物可以从自然中分离，并且被纯化或部分纯化。

在另一实施方案中，11-糖是D-半乳糖苷(对应于化合物I-a)，其中在C-1’的构型可以是或者R或者S或其混合物，包括其外消旋混合物。

在另一实施方案中，11-糖是L-半乳糖苷(对应于化合物I-b)，其中在C-1，的构型可以是或者R或者S或其混合物，包括其外消旋混合物。

11-吡喃半乳糖基-TTX可以从河豚鱼、虾虎鱼、水螈、蛙类、蓝环章鱼以及海藻纯化。11-吡喃半乳糖基-TTX还可以从本身已从河豚鱼、虾虎鱼、水螈、蛙类、蓝环章鱼以及海藻中的一种分离的TTX纯化。

本发明的一种或更多种化合物可以用于(可选地与一种或更多种药学上可接受的赋形剂一起)针对疼痛的治疗的药剂的制备，所述疼痛尤其是神经性疼痛(包括痛觉过敏和异常性疼痛)、急性疼痛、慢性疼痛、肌骨骼疼痛、内脏疼痛、炎症疼痛或癌症疼痛。

本发明的一种或更多种化合物还可以用于(可选地与一种或更多种药学上可接受的赋形剂一起)针对药品依赖的药剂的制备。

本文预期的化合物参考通式和具体的化合物二者被描述。此外，本发明的化合物可以以许多不同的形式或衍生物存在，全部都在本发明的范围内。这些包括，例如，如本文所描述的互变异构体和立体异构体。

互变异构体和立体异构体

据理解，本发明的化合物可以显示通过TTX表示的互变异构体，如在图1和图2中所见的。由此，本文提供的式仅特别地描绘了可能的互变异构体形式中的一种。因此，要被理解的是，本文提供的式意图代表所描绘的化合物的任何互变异构体形式，并且不只仅限于由式图所描绘的具体的互变异构体形式。

例如，TTX的结构(包括其绝对构型)在1960年代早期被确立(WoodwardR.B.Pureapplied Chem.1964，9：49074；Mosher，H.S.等，Science 1964，144：1100-1110；Tsuda K.S.等，Chem.Pharm.Bull Jpn.1964，12：1357-1374；Goto T.等，Tetrahedron 1965，21：2059-2088.)。在结晶状态，TTX完全以两性离子形式(图1，1a)存在并且是无限稳定的。在稀酸溶液中，TTX以与羟基内酯形式(图1，1c)平衡的质子化的半醛糖内酯形式(图1，1b)存在(MosherH.S.Ann.New York Acad.Sci.1986，479：32-43；Yashumoto，T.等，J.Am.Chem.Soc.1988，110：2344-2345；Yotsu-Yamashita M.，J.Toxicol.2001.20：51-66.)。粉末形式的TTX非常稳定，而在弱酸性溶液中，TTX可以被缓慢地转化到4，9-酐-TTX。转化率可以通过加热或通过增加酸性强度被加快。在碱性溶液中，TTX可以被快速地降解为2氨基-6-羟甲基-8-羟基喹唑啉(C9基)。

同样已知的是，在稀酸溶液中的TTX可以在C4位缓慢地经历羟基基团的差向立体异构化作用，以形成4-表-TTX，该4-表-TTX不稳定并且将经历脱水而成为4，9-酐-TTX(图2)。脱水过程在加热和酸性条件下可以被加快。4-表-TTX和4，9-酐-TTX的分离已被报道，并且它们的化学结构被阐明(Nakamura，M.和Yasumoto T.Toxicon.1985，23：271-276；KaoC.Y.和Yasumoto T.Toxicon 1985，23：725-729)。通过i.p.注射的TTX、4-表-TTX以及9-酐-TTX对小鼠的相对致死效价分别是4500、710以及92小鼠单元/mg(Nakamura和Yasumoto Toxicon.1985，23：271-276.)。

据理解，具有式I、式I-a以及式I-b的化合物进行与以上所描述的溶液中的TTX类似的转化。式I、式I-a以及式I-b意图包括每个和全部互变异构体形式，并且特别地包括11-吡喃半乳糖基-TTX和11-吡喃半乳糖苷-TTX的可能存在的所有互变异构体形式，并且如本领域技术人员将会理解的。通过实施例的形式，预期的是，根据本发明的化合物的互变异构体形式将包括可与那些被TTX采用的互变异构体相比较的互变异构体形式。参见例如图3。

类似地，根据本发明的化合物可以作为立体异构体存在，即它们具有相同的共价键原子序列而原子的空间取向不同。例如，本发明的化合物含有一个或更多个手性中心，并且因此可以以两个或更多个立体异构体形式存在(例如对映异构体或非对映异构体)。由此，这样的化合物可以以单一的立体异构体(即基本上不含其他的立体异构体)、外消旋物和/或对映异构体和/或非对映异构体的其他的混合物和组合存在。在一些实施方案中，本发明的化合物针对至少一个手性中心是立体异构纯的。在其他的实施方案中，本发明的化合物针对至少一个手性中心是立体异构富集的。

包含在本发明内的立体异构体包括D-11-吡喃半乳糖基-TTX、L-11-吡喃半乳糖基-TTX、D-11-吡喃半乳糖基-TTX和L-11-吡喃半乳糖基-TTX的外消旋混合物以及以上任何物质，其中在C-1’的构型是或者R、S或者其混合物。多态晶体形式和溶剂化物同样被包含在本发明的范围内。

据认为，TTX的一些制备物具有痕量的11-吡喃半乳糖基-TTX。11-吡喃半乳糖基-TTX的纯化的制备物包括比如本文所限定的痕量更多的11-吡喃半乳糖基-TTX。

药理学和效用

已被确定的是，类似于TTX，本发明的化合物同样是钠通道阻滞剂，并且对于产生通过阻滞这样的钠通道的功能而调节的治疗效果是有用的。例如，本发明的化合物可以是在哺乳动物体内产生痛觉缺失特别有用的，包括但不限于(1)如本文所限定的疼痛治疗，包括由灼烧、创伤、来自跌倒、骨折、挫伤以及扭伤的损伤导致的各种疼痛，包括针对神经痛、肌痛以及关节痛的疼痛；(2)由癌症导致的疼痛的治疗，这样的癌症例如，肝癌、直肠癌、平滑肌肉瘤、骨癌、胃癌、淋巴癌、食道癌、生殖器官癌、前列腺癌、消化系统癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、呼吸系统癌、肺癌、支气管癌、泌尿系统癌、淋巴瘤以及皮肤癌；(3)产生持久的局部麻醉作用；以及(4)产生持久的系统性效果；以及(5)治疗药品戒除(例如阿片类物质)。

本发明的化合物还可以作为针对冬季皮肤发痒、痒疹、皮脂腺炎、疥癣虫和疥螨的止痒剂；哮喘和百日咳缓和剂；以及针对及肌痉挛、胃痉挛以及其他种类的痉挛(尤其对于破伤风痉挛)的镇痉剂是有用的(US 5,846,975)。

与本发明的化合物组合、对于产生长效的局部麻醉作用有用的试剂可以选自由血管收缩剂、肾上腺素药品、香草类、两亲性溶剂、亲油性溶剂、糖皮质激素以及受控的或长效的释放制剂组成的组；所述肾上腺素药品选自由α受体激动剂、β-阻滞剂以及混合的中枢-末梢的α-2受体激动剂(例如，肾上腺素、苯福林、心得安以及可乐定)组成的组；所述香草类选自由反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺、N-香草基-壬烯酰胺、β-氨乙基-取代的苯基烷酰胺、亚甲基取代的-N-苯甲基烷酰胺、N-[(取代的苯基)甲基]-顺式-单一不饱和烷酰胺、β-氨乙基-取代的苯基化合物、N-[(取代的苯基)甲基]二不饱和酰胺、resinifera化合物以及衍生物及其盐组成的组；所述糖皮质激素选自由氟美松、可的松、氢化可的松、氢化泼尼松、倍氯米松、倍他米松、氟尼缩松、甲基强的松、对位美沙酮、氢化泼尼松、去炎松、阿氯米松、安西缩松、氯倍他索、氟氢可的松、diflurosone双乙酸酯、肤轻松、氟米龙、氟氢缩松、哈西缩松、甲羟松、莫米松及其药学上可接受的盐及其混合物组成的组。

在一个方面，本发明涉及至少一个具有通式I的化合物的用途，其中在C-11的取代基是半乳糖苷。在再另一方面，本发明涉及由式I-a和/或式I-b涵盖的化合物的用途。在再另一方面，本发明的一种或更多种化合物与一种或更多种药学上可接受的赋形剂结合，用于针对疼痛(包括神经性疼痛、痛觉性触觉过敏、异常性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、肌骨骼疼痛、内脏疼痛、炎症疼痛以及癌症疼痛)的治疗的药剂的制备。

在另一方面，本发明涉及具有式I的化合物的使用，其中在C-11的取代基是半乳糖苷，和/或具有式I-a和/或式I-b的化合物以及可选地一种或更多种药学上可接受的赋形剂，用于针对药品/物质上瘾或药品/物质依赖的治疗的药剂的制备，或者改善来自药品/物质的脱瘾治疗的效果，其中所述药品/物质选自吗啡以及其他的阿片类物质、可卡因及其衍生物、印度大麻、尼古丁、苯丙胺以及其他的上瘾性药品，如苯环己呱啶、致幻剂、苯二氮以及巴比妥酸盐。

在又另一方面，本发明提供用于引起神经阻滞的组合物，其中所述神经阻滞剂由下列物质组成：至少一种具有通式I的河豚毒素的类似物，其中在C-11的取代基是半乳糖苷，和/或由式I-a和/或式I-b涵盖的化合物，以及可选地一种或更多种药学上可接受的赋形剂，与选自由血管收缩剂、肾上腺素药品、香草类、两亲性溶剂、亲油性溶剂、糖皮质激素以及受控的或长效的释放制剂组成的组的试剂组合，其中所述组合对于在没有系统性毒性时提供长效的或形态(modality)选择性神经阻滞剂是有效的。

给予方式以及药用制剂

药物组合物的适合的给予方式包括(但不限于)肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、经直肠以及阴道的给予。如本文所使用的术语肠胃外包括皮下注射以及静脉内、鞘内、肌肉内和胸骨内注射或输注技术。优选的给予方式是本发明的化合物全身性给予到受试者。

本文所描述的药学上可接受的载体(例如媒介物、佐剂、赋形剂以及稀释剂)对于本领域技术人员是已知的并且是容易获得的。优选地，载体相对本发明的化合物是化学惰性的，并且在使用条件下不具有有害的副作用或毒性。优选地，药学上可接受的载体不含致热源。可以使用的药学上可接受的载体包括(但不限于)水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶态二氧化硅、马铃薯淀粉以及尿素。

一般地，具有式I(包括具有式I-a和/或式I-b，和/或其混合物)的化合物(其中在C-11的取代基是半乳糖苷)可以以治疗有效量经由任何本领域已知的常见和可接受的方式或者单独地或者与另一治疗性试剂组合被给予。治疗有效量可以取决于治疗的受试者、使用的化合物的效力、特定的给予方式以及其他的因素广泛地变化。例如，具有式I的化合物的治疗有效量可以在从0.02微克每千克体重(μg/kg)每天到20μg/kg每天的范围内，典型地0.1μg/kg/天至5μg/kg/天。因此，对于80kg的病人的治疗有效量可以在从1.6μg/天至1.6mg/天的范围内，典型地8μg/天至0.4mg/天。对于外用给予，活性成分可以在例如0.00001wt％至60wt％，并且优选地从0.001wt％至10wt％重量的范围内配制。此外，药物组合物可以间歇地，即以每天、每半周或每周的间隔给予。然而，将被理解的是，针对特定的受试者的具体剂量水平将取决于多种因素。这些因素包括采用的具体的化合物的活性；受试者的年纪、体重、总体健康状况、性别以及饮食；给予的时间和路径以及药品的排泄率；在治疗中是否采用药物组合；以及寻求治疗的特定的疾病或病况的严重性。

药物组合物可以是可注射的制剂。针对用于可注射组合物的有效载体的要求对于本领域技术人员是已知的(参见，例如药物学和药房实践规范(Pharmaceutics and PharmacyPractice)，J.B.Lippincott公司，费城，宾夕法尼亚州，Banker和Chalmers，eds.，238-250页(1982)以及关于可注射药品的ASHP手册(ASHP Handbood on Injectable Drugs)，Toissel，第四版，622-630页(1986))。优选地，可注射组合物通过静脉给予。适于肠外注射给予的制剂包括水状的和非水状的等渗无菌注射溶液以及水状的和非水状的无菌悬浮液，所述等渗无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与预期的受体的血液等渗的溶质，所述无菌悬浊液可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。

药物组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。可以使用的赋形剂包括一种或更多种载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、色料、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味料、防腐剂、等渗剂及其组合。适合的赋形剂的选定和使用在Gennaro，ed.，Remington：药房的科学和实践规范，第二十版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中教导，其公开通过引用被并入本文。

本发明的实践还可以参考以下实施例理解，所述实施例通过图示说明的方式提供，并且不是限制性的。

纯化

本发明包括用于纯化以如本文所标注的式I和/或式I-a和/或式I-b表示的11-(吡喃半乳糖基)-TTX的方法，其中每种化合物可以以在C-1’的R-或S-对映异构体或其混合物存在。被预期的是，由式I、式I-a或式I-b表示的每种化合物可以作为一种或更多种立体异构体或互变异构体，例如，当在酸性溶液中配制时，由式I、式I-a和式I-b表示的化合物可以以如在半醛糖内酯和内酯形式之间的平衡存在。参见例如图3。

实施例1

从天然TTX分离11-吡喃半乳糖基-TTX

遵循先前描述的步骤(Zhou等，美国专利号6,552,191)从河豚鱼的卵巢提取的天然TTX含有伴随数种次要组分的TTX，所述次要组分包括已知的化合物(例如4-表-TTX和4，9-酐-TTX)和先前未知的化合物(如图4中所示出的在典型的HPLC色谱图中所示的)。被发现在天然TTX中以痕量的标记为“杂质A”的峰已如以下所描述地被分离和表征为11-吡喃半乳糖基-TTX(gTTX)。

方法

11-吡喃半乳糖基-TTX从天然TTX(cTTX)的分离和纯化是通过在Bio-Gel P2柱和Source 15RPC柱上重复数个色谱分级循环进行。

(1)将8.2g cTTX溶解在80mL的2.5％TFA溶液中，并且过滤通过0.22μm的针筒过滤器。

(2)将cTTX溶液上样至自充填的Bio-Gel P2柱上并且在

探测器100MPLC上以0.01％乙酸溶液洗脱。将通过流分收集器收集的流分进行HPLC分析。合并具有富集的gTTX的流分并且通过旋转蒸发仪浓缩。

(3)将来自步骤(2)的浓缩溶液再次通过Bio-Gel P2柱。将具有较高水平gTTX的流分合并和浓缩。再重复数次所述相同的纯化过程，直到gTTX的色谱纯度在70％以上。

(4)将来自步骤(3)的浓缩的样品上样至自充填的Sourse15RPC柱(3.5*27cm)并且以0.5mM的1-庚烷硫酸钠(SHS)和0.03％三氟乙酸(TFA)洗脱。收集与gTTX峰对应的洗脱物，以氨溶液将pH调节到5并且浓缩到约1mL。

(5)浓缩物与6mL甲醇混合，转移到离心管，以氨溶液将pH调节到8.5～9.5，同时搅拌以沉淀gTTX，在-20℃将溶液储存约10分钟。

gTTX在-8℃以下通过离心收集，以甲醇清洗，并且再重复两次离心/清洗过程。沉淀物在真空下室温干燥4小时。

结果

样品通过HPLC-UV(QC-006，rev#005)分析。结果示出gTTX的色谱纯度是99.1％(图5)。如HPLC所确定的，这种纯化的样品中的污染分子包括0.63％的TTX，0.16％的4-表-TTX以及0.11％的4，9-酐TTX。

分离的11-吡喃半乳糖基-TTX的表征

gTTX的结构基于HRMS、IR、¹H-NMR、¹³C-NMR DEPT、gCOSY、gHSQC、TOCSY以及gHMBC光谱分析得以证实。由光谱研究的解释，推断该化合物为11-吡喃半乳糖基-TTX。糖配基通过在酸性条件下降解产物的三甲基硅烷基衍生物的气相色谱分析得以确定。

方法

红外光谱

将1mg样品放入大致为200mg在IR灯下干燥的KBr粉末(200目)中。在玛瑙研钵中将该混合物研磨并均匀混合。将混合物放入压模中，将其设置在压力机中并且以6-7吨的压力加载约1分钟。然后该膜备好待用于IR光谱。

质谱

移出大致1mg的样品并溶解在10mL的稀乙酸中。然后将样品注射到Bruker APEX^TMFT-MS光谱仪中并获取谱图。

NMR谱

将大致为8-10mg样品溶解在0.5mL的4％CD₃COOD溶液中，并且加入小量的四甲基硅烷(TMS)作为内标。将溶液转移到NMR样品管并且在瓦里安INOVA-501NMR光谱仪上进行NMR分析。¹H NMR中CHD₂COOD在2.06ppm的信号以及¹³C NMR中¹³CD₃COOD在22.4ppm的信号被用作NMR谱图归属的参比。

降解和衍生

(a)将1mg TTX、11-吡喃半乳糖基-TTX、D-半乳糖或D-葡萄糖溶解在0.8mL 0.2M的HCl中，并且每种都在室温混合10分钟；(b)随后将溶液冻干并且在0.5mL吡啶中再次悬浮；(c)溶液使用氯化三甲基硅烷(TMSCl)和六甲基二硅氮烷(HMDS)作为衍生物试剂来衍生；(d)在桌上型离心机中以在34,000rpm离心样品2分钟，并且将上层清液进行GC分析。

气相色谱

仪器：安捷伦6820气相色谱；SPH-300氢发生器；PEAK NM20ZA高纯度气体发生器。

GC条件：载气流：高纯度氦，5mL/分钟；入口温度，250℃；分流，1∶20；FID探测器：

温度：280℃；柱：安捷伦DB-1，15m×0.53mm×0.5μm；炉：150℃，5分钟；150-160℃，5℃/分钟；160℃，13分钟；160-250℃，40/分钟；250℃，7分钟。

结果

质谱分析：质谱给出在m/z482.4的(M+H)⁺离子，比TTX的m/z(m/z320)高162，指示该分子不是常见的已知TTX衍生物。高分辨质谱(HRMS)分析证实“杂质A”的离子质量(m/z482.1618，图6)。基于同位素的相对丰度，经由分子离子质量的计算预测三种组成(表1)。分子含有“S”是不太可能的，并且第三种组成具有相对较高的变量。最有可能地，(M+H)⁺离子的组成是C₁₇H₂₈N₃O₁₃，减去TTX的(M+H)⁺离子组成(C₁₁H₁₈N₃O₈)之后，得到额外的C₆H₁₀O₅，表明“杂质A”是TTX的单糖，例如葡萄糖或半乳糖。

表1.由HRMS进行的gTTX组合物的预测

	C	H	N	O	S	质量	误差
								最大	25	50	5	15	1
最小	12	12	1	1	0
								1	24	26	4	5	1	482.1618	8.23e-08
2	17	28	3	13	0	482.1616	4.58e-07
								3	20	26	4	10	0	482.1643	5.10e-06

红外谱图分析：11-吡喃半乳糖基-TTX的红外谱图使用FT-IRNicolet-200分光仪在KBr中记录。样品作为KBr压片在4000～400cm^-1的分辨率之间运行，并且IR谱图在图7中图示说明。得到的IR谱图与TTX的IR谱图类似。除了由若干-OH基团中O-H和N-H的伸缩振动引起的3342nm强吸收以外，1205、1257以及1335nm附近的吸收可以归于聚甲酸结构中缩醛基团的C-O的伸缩振动以及众多羟基中的C-O的非对称伸缩振动。这说明分子中聚甲酸结构的存在。没有鉴定出特别的新官能基团。这个信息符合TTX的单糖。

NMR谱图分析：1H NMR谱图示出共计十四个质子(图8)。它们中的八个可以归属为TTX，而其他六个质子归于糖配基。在5.50ppm(d，J＝9.50Hz)的尖锐二重峰归属为4-H。4α-H信号作为与4.31ppm处的5-H耦合的二重峰(J＝9.50Hz)出现在2.36ppm。在3.91、4.21以及4.32ppm的三个单重峰可以分别归属为9-H、7-H以及8-H。在4.33以及4.24处的两个二重信号(J＝11.5Hz)可以归属为在C-11的偕质子(germinal protons)。在C-11的偕质子的朝向低场的位移表明C₁₁-OH被富电子基团取代。存在数个类似TTX内酯的峰的较小的峰，指示稀乙酸溶液中的11-吡喃半乳糖基-TTX同样以半醛糖内酯和内酯形式之间的平衡存在(图3)。相对峰强度表明11-吡喃半乳糖基-TTX的半醛糖内酯和内酯形式的比率大致是4∶1，类似于TTX的半醛糖内酯和内酯形式的比率。

在3.6-4.2ppm检测到的额外的质子信号归于糖配基。该质子属性类似D-半乳糖的质子属性(图8)，表明“杂质A”是11-吡喃半乳糖基-TTX。该鉴定在一系列附加的NMR研究(包括DEPT、TOCSY、gHMBC、gCOSY以及gHSQC)之后得以证实。

在3.59ppm、3.68ppm以及3.78ppm的三个四重峰归属为半乳糖的2’-H、3’-H以及5’-H。在3.93ppm(d，J＝3.5Hz)和4.48ppm(d，J＝7.5Hz)的尖锐二重峰分别归属为4’-H和1’-H。在3.76和3.80ppm的两个二重信号归于在6’-H的偕质子。11-吡喃半乳糖基-TTX的¹H-NMR和¹³C-NMR数据在表2中列表显示。

表211-吡喃半乳糖基-TTX的¹H NMR归属

注意：1.溶剂：D₂O中4％CD₃COOD

      2.H-8、H-7、H-5以及H-9的质子信号是可互换的

降解-衍生产物的GC分析：“杂质A”、河豚毒素、D-葡萄糖以及D-半乳糖以0.2M HCl处理，接下来以TMSCl和HMDS处理。降解-衍生产物通过GC分析。GC色谱图在图9中示出。全部三个峰均在D-半乳糖中检测到，而仅两个峰在D-葡萄糖中检测到(图9a和图9b)。衍生物GC方法可以清楚地将D-葡萄糖与D-半乳糖区别开。

图9c示出来自“杂质A”的降解-衍生产物的GC色谱图。检测到的峰的数目以及它们的停留时间完全与来自D-半乳糖的GC色谱图(图9b)匹配，表明“杂质A”中的糖配基是半乳糖苷。在用TTX的平行实验中，没有探测到峰，表明检测到的三个峰源自于“杂质A”中的水解的糖配基。研究证实，“杂质A”中的糖配基是半乳糖，不是葡萄糖。这与NMR研究的结果一致。

由于使用的分析方法不能够区别11-吡喃半乳糖苷是是D-半乳糖还是L-半乳糖，“杂质A”中的11-糖配基可以是或者D-吡喃半乳糖苷或L-半乳糖苷，或者可以是其混合物。式I-a和I-b中的结构二者、其混合物以及从天然中分离的11-吡喃半乳糖苷的天然存在的异构体均涵盖在本发明的范围内。

生物活性

实施例2

11-吡喃半乳糖基-TTX在小鼠中对乙酸诱导的扭动测试的效果评价

方法

样品制备：通过将测试样品溶解在0.02％的稀乙酸溶液中来制备原液。通过以0.02％的HOAc稀释原液得到各种浓度的溶液。

使小鼠(雄性和雌性)适应测试环境(透明树脂玻璃盒)15分钟或直到探索性行为停止。小心把持所述动物以使压迫最小化。将小鼠随机地分配到空白负对照组、测试样品组或吗啡正对照组。

测试物品(空白对照、测试样品或吗啡对照)通过单次肌肉注射递送。

注射测试物品后三十分钟，在小鼠左下腹腔，腹腔内注射以0.2ml/小鼠的1％乙酸溶液。

从注射乙酸之后5分钟开始在15分钟期间计数扭动的数目。根据下式计算扭动抑制率：

基于Bliss计算来计算ID₅₀值和95％置信区间。

结果

使用以上方法测试11-吡喃半乳糖基-TTX(gTTX或11-Gal-TTX)的镇痛效果。在测试中使用昆明小鼠(18～22g，雄性和雌性二者)。所述小鼠(一般的洁净度，质量认证书号SCXK-2003-0003)从广西医药大学实验动物中心(中国，广西)获得。小鼠在所有测试之前被禁食12小时，但任意提供水。

在数个浓度(1.19、2.38以及4.75μg/kg，i.m.)测试11-吡喃半乳糖基-TTX。结果在表3中示出。针对11-Gal-TTX计算的ID₅₀值为2.70μg/kg，具有2.0-3.6μg/kg的95％置信区间。

表3.小鼠扭动测试中11-吡喃半乳糖基-TTX的剂量响应

***P＜0.001(对比于对照组)

结果示出11-吡喃半乳糖基-TTX对疼痛具有抑制效果。

本发明的以上描述的实施方案仅意图为实施例。本领域技术人员可以对具体的实施方案进行改动、调整以及变更，而不背离本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。

Claims (13)

1.一种具有式I的分离的或纯化的化合物，或者所述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物形式，

其中在C-11的取代基为半乳糖苷。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物的半乳糖苷的同分异构形式为D-半乳糖苷。

3.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物的半乳糖苷的同分异构形式为L-半乳糖苷。

4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述化合物已经从选自由河豚鱼、虾虎鱼、水螈、蛙类、蓝环章鱼以及海藻组成的组的物种分离。

5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物是从河豚鱼分离的。

6.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述化合物是由河豚毒素(TTX)的制备物纯化，其中所述TTX已经从选自由河豚鱼、虾虎鱼、水螈、蛙类、蓝环章鱼以及海藻组成的组的物种分离。

7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述化合物纯度大于70％。

8.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述化合物纯度大于90％。

9.一种包括权利要求1至8中任一项所述的化合物的药物组合物，进一步与一种或更多种药学上可接受的赋形剂掺和。

10.一种用于治疗疼痛的方法，包括给予治疗有效量的如权利要求1至9中任一项所述的化合物到需要所述化合物的受试者。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述疼痛为神经性疼痛、内脏疼痛或躯体疼痛。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述给予为全身性给予。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述全身性给予是通过肌肉注射、皮下注射或静脉注射进行的。

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