CN109824686B

CN109824686B - 鸟巢烷型二萜类化合物、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN109824686B
Application number: CN201910132318.8A
Authority: CN
Inventors: 高锦明; 唐丹; 刘玲丽; 高宇琪
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: CN109824686A

Abstract

本发明公开了鸟巢烷型二萜类化合物、制备方法及其应用，具体涉及6个鸟巢烷型二萜类化合物、制备方法及其在治疗神经退行性疾病方面的活性应用，公开了上述化合物的化学结构式、理化性质以及相应的核磁数据。上述化合物分离自一株胡克黑蛋巢菌(Cyathus hookeri)的发酵液，该菌株购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，编号为CGMCC 5.1116。

Description

鸟巢烷型二萜类化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及鸟巢烷型二萜类化合物、制备方法及其应用，特别是6个鸟巢烷型二萜类化合物、制备方法及其在神经营养活性方面的应用。

背景技术

微生物作为自然界里多样性最为丰富的物种之一，早已被人们作为开发治疗和预防疾病的药物重要来源。自1928年青霉素由弗莱明发现以来，微生物天然产物便展现出了其在人类健康领域的巨大作用及发展潜力。据David J.Newman于2016年统计[1]，1981年1月1日到2014年12月31日之间全世界范围内共有1562个新药被批准上市，其中直接由天然产物成为药物的化合物仅占总量的4％，但是与天然产物相关的新药(N、ND、S*、S*/NM和S/NM等)共占总量的比例高达51％。2004年Berdy对上市药物进行了统计[2]，发现超过160种最重要的药物来源于微生物，在抗感染和抗肿瘤药物中，微生物药物的比例超过了50％。微生物所蕴含的基因多样性以及代谢产物多样性等都是难以估量的[3]，值得我们当下以及未来对这一巨大宝库进行持久的深入研究和挖掘。

神经退行性疾病(Neurodegenerative disease，NDD)是指由中枢和周围神经组织产生退行性变形的疾病，包括阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森症(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease，HD)和肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。神经退行性疾病已逐渐发展成了世界性的卫生保健难题。神经营养因子，如神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)，能治疗多种神经退行性疾病[4,5]。但NGF是大分子蛋白质，存在半衰期短、药代动力学不理想、不易通过血脑屏障等弊端，极大限制了其在临床上的应用。因而研究者们便采用了一套辅助策略[6,7]，通过寻找小分子化合物与NGF共同作用于PC-12细胞，特异性地激活细胞表面的受体，进而引发胞内的一系列信号通路，最终影响PC-12细胞的神经突起生长。

蛋巢菌属于真菌界担子菌亚门蛋巢菌科(Nidulariaceae)，目前已有多种具有鸟巢烷型骨架的二萜类化合物从蛋巢菌中分离出来[8-11]，这类鸟巢烷型二萜类化合物(Cyathane diterpenoids)的结构特征在于具有5/6/7三环骨架结构。研究发现[12-15]，部分鸟巢烷型二萜类化合物具有良好的抗菌、细胞毒活性以及神经营养活性，这使其在开发治疗和预防神经退行性疾病药物方面具有巨大的潜在价值和应用前景。

参考文献：

[1]Newman D.J.,Cragg G.M.Natural products as sources of new drugsfrom 1981to 2014.Journal of Natural Products.2016,79:629-661.

[2]Berdy,J.Bioactive microbial metabolites.The Journal ofAntibiotics,2005,58(1):p.1-26.

[3]Kyrpides,N.C.,et al.,Genomic encyclopedia of bacteria and archaea:sequencing a myriad of type strains.PLOS Biology,2014,12(8):p.e1001920.

[4]Allen S.J.,Watson J.J.,Shoemark D.K.,Barua N.U.,Patel N.K.GDNF,NGFand BDNF as therapeutic options for neurodegeneration.Pharmacology&Therapeutics.2013,138:155-175.

[5]Tiwari S.K.,Chaturvedi R.K.Peptide therapeutics inneurodegenerative disorders.Current Medicinal Chemistry.2014,21:2610-2631.

[6]Granholm A.C.,Albeck D.,

C.,Curtis M.,Ebendal T.,Friden P.,Henry M.,Hoffer B.,Kordower J.,Rose G.M.,

S.,Bartus R.T.A non-invasive system for delivering neural growth factors across the blood-brainbarrier:a review.Reviews in the Neurosciences.1998,9:31-55.

[7]Yoshikawa K.,Matsumoto Y.,Hama H.,Tanaka M.,Zhai H.,Fukuyama Y.,Arihara S.,Hashimoto T.Russujaponols G-L,illudoidsesquiterpenes,and theirneurite outgrowth promoting activity from the fruit body of Russulajaponica.Chemical&Pharmaceutical Bulletin.2009,57:311-314.

[8]Wang B.T.,Han J.J.,Xu W.,Chen Y.H.,Liu H.W.Production of bioactivecyathanediterpenes by a bird's nest fungus Cyathusgansuensis growing oncooked rice.Food Chemistry.2014,152:169-176.

[9]Zhang Y.T.,Liu L.,Bao L.,Yang Y.L.,Ma K.,Liu H.W.Three newcyathanediterpenes with neurotrophic activity from the liquid cultures ofHericiumerinaceus.The Journal of Antibiotics.2018,71:818-821.

[10]Shi X.W.,Liu L.,Gao J.M.,Zhang A.L.Cyathanediterpenes fromChinese mushroom Sarcodonscabrosus and their neurite outgrowth-promotingactivity.European Journal of Medicinal Chemistry.2011,46:3112-3117.

[11]Liu L.,Shi X.W.,Zong S.C.,Tang J.J.,Gao J.M.Scabronine M,a novelinhibitor of NGF-induced neurite outgrowth from PC12cells from the fungusSarcodonscabrosus.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters.2012,22:2401-2406.

[12]Zhang C.C.,Yin X.,Cao C.Y.,Wei J.,Zhang Q.,Gao J.M.Chemicalconstituents from Hericiumerinaceus and their abilityto stimulate NGF-mediated neurite outgrowth on PC12cells.Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters.2015,25:5078-5082.

[13]Rupcic Z.,Rascher M.,Kanaki S.,

R.W.,Stadler M.,WittsteinK.Two New CyathaneDiterpenoids from Mycelial Cultures of the MedicinalMushroom Hericiumerinaceus and the Rare Species,Hericiumflagellum.International Journal of Molecular Sciences.2018,19(3):740.

[14]Kou R.W.,Du S.T.,Li Y.X.,Yan X.T.,Zhang Q.,Cao C.Y.,Yin X.,GaoJ.M.Cyathanediterpenoids and drimanesesquiterpenoids with neurotrophicactivity from cultures of the fungus Cyathusafricanus.The Journal ofAntibiotics.2019,72:15-21.

[15]Wei J.,Cheng Y.Y.,Guo W.H.,Wang D.C.,Zhang Q.,Li D.,Rong J.H.,GaoJ.M.Molecular Diversity and PotentialAnti-neuroinflammatory ActivitiesofCyathaneDiterpenoids from theBasidiomycete Cyathusafricanus.ScientificReports.2017,7(1):8883.

发明内容

本发明从一株胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116的发酵液中分离得到6个鸟巢烷型二萜类化合物，统称为鸟巢烷型二萜类化合物(cyahookerin)，编号为鸟巢烷型二萜类化合物1、2、3、4、5和6。

本发明的化学结构式为：包括式(一)和式(二)的结构，

式(一)和式(二)中的△_12，13和Δ_11，12表示双键所在的位置。

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物1的理化性质为：

C₂₄H₃₈O₅，白色晶体(甲醇)。

mp 147.1–149.3℃；

[α]_D ²⁰＝–25(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3451,2941,2865,2312,1717,1454,1370,1217,1145,1104,1035cm^-1；

HRESIMS:m/z405.2628[M-H]^-；

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物2的理化性质为：

C₂₄H₃₆O₄，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–73(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3397,2939,2869,2312,1716,1454,1370,1230,1090,1047cm^-1；

HRESIMS:m/z389.2668[M+H]⁺；

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物3的理化性质为：

C₂₃H₃₄O₅，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–96(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3397,2938,2864,2313,1736,1454,1369,1228,1130,1048cm^-1；

HRESIMS:m/z408.2744[M+NH₄]⁺；

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物4的理化性质为：

C₂₀H₂₈O₄，白色晶体。

mp95.5–97.2℃；

[α]_D ²⁰＝–84(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3453,3000,2956,2870,1732,1439,1367,1219,1048cm^-1；

HRESIMS:m/z350.2313[M+NH₄]⁺；

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物5的理化性质为：

C₂₃H₃₈O₄，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–16(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3409,2933,2312,1723,1451,1367,1217,1076cm^-1；

HRESIMS:m/z401.2670[M+Na]⁺；

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物6的理化性质为：

C₂₁H₃₀O₃，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–16(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝2935,2867,2312,1704,1454,1368,1226cm^-1；

HRESIMS:m/z 353.2078[M+Na]⁺；

所述的鸟巢烷型二萜类化合物1、鸟巢烷型二萜类化合物2、鸟巢烷型二萜类化合物3、鸟巢烷型二萜类化合物4、鸟巢烷型二萜类化合物5和鸟巢烷型二萜类化合物6由胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116发酵产生，具体的，鸟巢烷型二萜类化合物1、鸟巢烷型二萜类化合物2、鸟巢烷型二萜类化合物3、鸟巢烷型二萜类化合物4、鸟巢烷型二萜类化合物5和鸟巢烷型二萜类化合物6于胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116的发酵液中分离得到。

所述的胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116的发酵液是有胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116于添加了终浓度为0.1mM阿扎胞苷的YES液体培养基中培养得到的，培养温度为28℃，转速为130rpm，培养时间为14天。

具体的制备方法，包括将胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116发酵产生的发酵液浓缩后，依次经有机溶剂萃取和柱层析分离依次得到17个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分A、馏分B···馏分Q，馏分I再经过硅胶柱柱层析分离得到14个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分I1、馏分I2···馏分I14，馏分I5经纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物3；馏分I10经纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物4；馏分J经凝胶柱柱层析分离得到馏分J1和J2；馏分J2经高速逆流色谱法得到馏分J2.1、馏分J2.2···馏分J2.10；馏分J2.3经纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物2和鸟巢烷型二萜类化合物1；馏分J2.6经纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物6；馏分J2.8经纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物5。

本发明所述的鸟巢烷型二萜类化合物用于制备治疗神经退行性疾病药物的应用。

可选的，所述的神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症和肌萎缩侧索硬化症。

本发明所述的鸟巢烷型二萜类化合物的制备方法制备得到的鸟巢烷型二萜类化合物用于制备治疗神经退行性疾病药物的应用。

一种药物，所述药物的有效成分为本发明所述的鸟巢烷型二萜类化合物，所述药物用于治疗神经退行性疾病，神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症和肌萎缩侧索硬化症。

本发明的优点为：

本发明6个鸟巢烷型二萜类化合物有明显的促进PC-12神经细胞突起生长的活性，其中鸟巢烷型二萜类化合物3在10μM时能显著促进PC-12神经细胞突起生长。本发明的化合物在治疗神经退行性疾病方面具有开发应用潜力。

附图说明

图1为馏分A-Q的流出顺序示意图；

图2为馏分I1-I14的流出顺序示意图；

图3为馏分J1-J2的流出顺序示意图；

图4为鸟巢烷型二萜类化合物1的氢谱图；

图5为鸟巢烷型二萜类化合物1的碳谱图；

图6为鸟巢烷型二萜类化合物2的氢谱图；

图7为鸟巢烷型二萜类化合物2的碳谱图；

图8为鸟巢烷型二萜类化合物3的氢谱图；

图9为鸟巢烷型二萜类化合物3的碳谱图；

图10为鸟巢烷型二萜类化合物4的氢谱图；

图11为鸟巢烷型二萜类化合物4的碳谱图；

图12为鸟巢烷型二萜类化合物5的氢谱图；

图13为鸟巢烷型二萜类化合物5的碳谱图；

图14为鸟巢烷型二萜类化合物6的氢谱图；

图15为鸟巢烷型二萜类化合物6的碳谱图；

图16为10μM的化合物1-6对PC-12细胞神经突起生长的影响。

其中图1-3中的箭头表示流动相的流动方向，标号代表各个馏分的编号；

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

本发明的6个鸟巢烷型二萜二萜类化合物1-6是从一株胡克黑蛋巢菌(CyathushookeriBerk)CGMCC 5.1116的发酵液中分离得到的。购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，编号为CGMCC 5.1116；菌种保藏于西北农林科技大学化学与药学院天然药物化学研究中心，编号为No.CA20150822。本发明中的神经营养活性测试的是化合物促进NGF诱导的PC-12细胞神经突起生长的活性。

该胡克黑蛋巢菌的保种及活化培养条件为:保藏菌种所用培养基为PDA斜面培养基。活化菌种：将菌种划线于PDA平板上，于28℃倒置培养7d至平板中长满菌丝体。PDA培养基配方：葡萄糖，2％，马铃薯，20％，琼脂，2％，pH自然。菌株发酵：将活化好的新鲜菌株接种于添加了总浓度为0.1mM阿扎胞苷的YES液体培养基中，于28℃，130rpm培养14d。YES培养基配方：葡萄糖，3％，酵母提取物，0.5％，pH自然。

一、本发明中化合物的提取方法、鉴定及神经营养和抗神经炎症的活性测定及应用：

1、实验材料

培养基：PDA培养基：葡萄糖，2％，马铃薯，20％，琼脂，2％，pH自然。

YES培养基：葡萄糖，3％，酵母提取物，0.5％，pH自然。

灭菌条件：115℃灭菌30min。

试剂与仪器：常用有机溶剂：丙酮、甲醇、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等均为工业级试剂，使用前需重蒸。有机溶剂：正己烷、色谱甲醇、色谱乙腈等据实际使用情况使用分析纯或色谱纯试剂。以下除特殊说明外，试剂用量均为体积比。

常用仪器：紫外光谱仪：Thermo Evolution-300型；旋光仪Rudolph AutopolⅢ型；红外光谱仪：Bruker Tensor 27FT-IR型；高效液相色谱仪：Waters 1525；增强版300mL半制备型高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司)；低分辨质谱仪：Thermo Fisher LTQ Fleet型；高分辨质谱仪：AB SCIEX Triple TOF 5600+分光仪(AB SCIEX,Boston,MA,USA)；旋转蒸发仪：BüchiRotavapor R-101、R-3HB型；低温冷却液循环泵：DLSB-10/20型(郑州长城科工贸有限公司)；循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型(郑州长城科工贸有限公司)；核磁共振：Bruker AvanceⅢ 500(以TMS为内标)；立式蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；超净工作台：SW-OJ-2F型(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)。柱层析硅胶(100-200目、200-300目及300-400目)及薄层层析硅胶(硅胶H)均为青岛海洋化工厂生产；液相色谱柱：Hypersil BDS 5μm C18(250×4.6；250×10；Thermo)；羟丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20和RP-C18反向硅胶均为Merck公司生产。

1.1胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116的发酵培养：

胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116的活化方法：从试管斜面中挑取CGMCC 5.1116菌丝体接种于PDA平板上，于28℃倒置培养7d，至平板上长满菌丝体。PDA培养基：葡萄糖，2％，马铃薯，20％，琼脂，2％，pH自然。

胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116的发酵培养条件包括：取活化好的胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116菌饼(约7mm²)接种于装有250mL，且添加了终浓度为0.1mM阿扎胞苷的YES液体培养基的500mL锥形瓶中，于28℃转速为130rpm的摇床中培养14d，发酵总体积为63L。YES培养基配方：葡萄糖，3％，酵母提取物，0.5％，pH自然。

1.2化合物提取分离：

将1.1中得到的发酵液浓缩后，依次经有机溶剂萃取和柱层析梯度洗脱处理得到馏分A-Q(按流出顺序依次命名)，共计17个。具体地，有机溶剂包括石油醚和乙酸乙酯，层析柱为RP-18，梯度洗脱条件为甲醇-水(10％-100％)；馏分I经硅胶柱层析后得到馏分I1-I14；馏分I5和馏分I10再分别经半制备型HPLC纯化的到鸟巢烷型二萜类化合物3和4。结构式分别为：

化合物3和

化合物4。

馏分J经凝胶柱LH-20(甲醇)洗脱后得到J1和J2。馏分J2经高速逆流色谱法分离得到馏分J2.1-J2.10，其中馏分J2.3再经半制备型HPLC纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物2和1；结构式分别为

化合物2和

化合物1。

馏分J2.6和馏分J2.8分别经过半制备型HPLC纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物6和5；结构式分别为

化合物6和

化合物5。

具体的鸟巢烷型二萜类化合物的提取纯化方法包括：

1.1中的发酵结束后，用6层脱脂纱布过滤将菌液和菌体分开。菌体用甲醇/丙酮为3/1(体积比)的混合溶液对菌体进行超声破碎，过滤后将滤液用旋转蒸发仪浓缩至只剩下水相；菌液部分用旋转蒸发仪浓缩至5L。菌体和菌液均分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取、浓缩，将菌体和菌液的乙酸乙酯相粗提物合并，共计23.6g。用RP-18柱划段，洗脱溶剂为甲醇：水(10％-100％)，依次得到17个馏分A-Q(具体见图1)。馏分I(4.9g)通过硅胶色谱柱，用氯仿：甲醇(200:1→1:1)进行洗脱，依次得到14个馏分(I1-I14)(具体见图2)，馏分I5经半制备型HPLC(75％，甲醇-水，2mL/min)进一步纯化，得到鸟巢烷型二萜类化合物3(t_R＝36.3min，5.6mg)。馏分I10经半制备型HPLC(72％，甲醇-水，2mL/min)进一步纯化，得到鸟巢烷型二萜类化合物4(t_R＝46.1min，28.6mg)。馏分J(817.8mg)经凝胶柱LH-20(溶剂为甲醇)洗脱后得到两个馏分，J1和J2(具体见图3)；馏分J2(604.6mg)经高速逆流色谱得到馏分J2.1-J2.10(按流出顺序依次命名)，其中高速逆流色谱法的溶剂体系是正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体积比为9:1:9:1。馏分J2.3经半制备型HPLC(85％，甲醇-水，2mL/min)进一步纯化，得到鸟巢烷型二萜类化合物2(t_R＝28.7min，2.9mg)和鸟巢烷型二萜类化合物1(t_R＝35.6min，27.8mg)。馏分J2.6经半制备型HPLC(85％，甲醇-水，2mL/min)制备纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物6(t_R＝30.2min，3.0mg)。馏分J2.8经半制备型HPLC(85％，甲醇-水，2mL/min)进一步纯化得到鸟巢烷型二萜类化合物5(t_R＝37.5min，5.0mg)。

1.3六个鸟巢烷型二萜类化合物的理化性质分别为:

表1胡克黑蛋巢菌1-3的¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR(CDOD₃)数据

表2胡克黑蛋巢菌4-6的¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR(CDOD₃)数据

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物1的理化性质为：

C₂₄H₃₈O₅，白色晶体(甲醇)。

mp 147.1–149.3℃；

[α]_D ²⁰＝–25(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3451,2941,2865,2312,1717,1454,1370,1217,1145,1104,1035cm^-1；

HRESIMS:m/z405.2628[M-H]^-；

¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据见表1，图谱见图4和图5。

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物2的理化性质为：

C₂₄H₃₆O₄，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–73(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3397,2939,2869,2312,1716,1454,1370,1230,1090,1047cm^-1；

HRESIMS:m/z389.2668[M+H]⁺；

¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据见表1，图谱见图6和图7。

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物3的理化性质为：

C₂₃H₃₄O₅，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–96(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3397,2938,2864,2313,1736,1454,1369,1228,1130,1048cm^-1；

HRESIMS:m/z408.2744[M+NH₄]⁺；

¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据见表1，图谱见图8和图9。

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物4的理化性质为：

C₂₀H₂₈O₄，白色晶体。

mp95.5–97.2℃；

[α]_D ²⁰＝–84(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3453,3000,2956,2870,1732,1439,1367,1219,1048cm^-1；

HRESIMS:m/z350.2313[M+NH₄]⁺；

¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据见表2，图谱见图10和图11。

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物5的理化性质为：

C₂₃H₃₈O₄，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–16(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝3409,2933,2312,1723,1451,1367,1217,1076cm^-1；

HRESIMS:m/z401.2670[M+Na]⁺；

¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据见表2，图谱见图12和图13。

本发明的鸟巢烷型二萜类化合物6的理化性质为：

C₂₁H₃₀O₃，白色粉末。

[α]_D ²⁰＝–16(c 0.25,MeOH)；

IR(KBr)ν_max＝2935,2867,2312,1704,1454,1368,1226cm^-1；

HRESIMS:m/z 353.2078[M+Na]⁺；

¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据见表2，图谱见图14和图15。

1.4神经营养活性测定

按照文献[16]报道的方法对所得6个鸟巢烷型二萜类化合物进行NGF诱导的PC-12细胞神经突起生长的活性测试。其中PC-12细胞购买自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所(上海，中国)。具体地，将PC-12细胞培养于DMEM中，培养基中加10％HS(Gibco,GrandIsland,NY,USA)、5％FBS(Hyclone,Logan,UT,USA)和1％青霉素/链霉素双抗(上海源培生物科技有限公司，上海，中国)。于37℃，含有5％CO₂的培养箱中培养至对数生长期，提前用25μg/mL poly-L-lysine(PLL)溶液(Sigma-Aldrich,MO,USA)将24孔板于37℃静置包被过夜，使用之前吸出PLL溶液，用PBS缓冲液洗涤2次，在紫外灯下照射1h，晾干备用。以2×10⁴个/孔的密度将PC-12细胞接种于该24孔板中，培养24h以待细胞贴壁；更换成低血清(2％HS和1％FBS)的培养基对PC-12细胞饥饿培养14h。NGF原液(20μg/mL)用低血清培养基稀释至20ng/mL，待测化合物原液用含有20ng/mL NGF的低血清培养基稀释至终浓度为10μM，并分别加入到饥饿处理后的PC-12细胞中。实验中以0.1％DMSO为空白对照，以20ng/mL NGF+0.1％DMSO为阳性对照，设置3个平行复筛孔。化合物作用48h后，于倒置显微镜下观察PC-12细胞的形态变化，选取10个随机视野进行照片采集，每个视野中至少有100个细胞。计数时，将含有一个或多个神经突起，并且至少有一个神经突起的长度大于或等于胞体直径的细胞视为阳性细胞。细胞分化率计算公式：细胞分化率＝有效细胞数/总细胞数×100％。三个平行复筛孔统计所得数据表示为均值±标准差(means±SD)，用SPSS软件进行统计分析。图16为测定结果。

参考文献：

[16]Bai R.,Zhang C.C.,Yin X.,Wei J.,Gao J.M.Striatoids A-F,CyathaneDiterpenoids with Neurotrophic Activityfrom Cultures of the Fungus Cyathusstriatus.Journal of Natural Products.2015,78:783–788.

由图16可以看出，在有NGF(20ng/mL)协同作用时，鸟巢烷型二萜类化合物1-6(10μM)对PC-12细胞的神经轴突生长很明显的促进作用，促进率在17.3％-29.8％之间。相对于阳性对照NGF(20ng/mL)，1、2、3和5(10μM)对PC-12细胞的神经轴突生长有显著的促进作用，而化合物4和6(10μM)则与阳性对照的活性相当。其中化合物3对PC-12细胞神经轴突生长的促进效果最为显著，高达29.8±0.7％，而NGF(20ng/mL)的促进率15.7±0.1％，提高了1.9倍。结果表明化合物1、2、3和5，尤其是3，在开发治疗神经退行性疾病的药物方面有很大的潜力和应用前景。

Claims

1.鸟巢烷型二萜类化合物，其特征在于，包括式(一)、式(二)或式(三)的结构，

式(一)中的Δ_12，13表示双键所在的位置。

2.权利要求1所述的鸟巢烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述的鸟巢烷型二萜类化合物由胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116发酵产生；

所述的胡可黑蛋巢菌CGMCC 5.1116发酵产生的发酵液是由胡克黑蛋巢菌CGMCC5.1116于添加了终浓度为0.1mM阿扎胞苷的YES液体培养基中培养得到的，培养温度为28℃，转速为130rpm，培养时间为14天；

包括将胡克黑蛋巢菌CGMCC 5.1116发酵产生的发酵液浓缩后，依次经有机溶剂萃取和柱层析分离依次得到17个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分A、馏分B···馏分Q，馏分I再经过硅胶色谱柱分离得到14个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分I1、馏分I2···馏分I14，馏分I5经纯化得到

馏分I10经纯化得到

馏分J经过凝胶柱分离得到2个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分J1和馏分J2。馏分J2经高速逆流色谱法分离得到10个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分J2.1、馏分J2.2···馏分J2.10，馏分J2.3经纯化得到

馏分J2.6经纯化得到

馏分J2.8经纯化得到

3.权利要求1所述的鸟巢烷型二萜类化合物用于制备治疗神经退行性疾病药物的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症或肌萎缩侧索硬化症。

5.一种药物，其特征在于，所述药物的有效成分为权利要求1所述的鸟巢烷型二萜类化合物，所述药物用于治疗神经退行性疾病，神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症或肌萎缩侧索硬化症。