CN111170967B - 酰基间苯三酚类衍生物及其药物组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了去芳化的异戊烯基酰基间苯三酚类衍生物及其制备方法、具有神经退行性疾病的药物组合物及其应用，属于药物技术领域。本发明提供的化合物hypatone A具有新的罕见的笼状结构，是目前最强的Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活剂，在阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型具有潜在的药用价值。

Description

酰基间苯三酚类衍生物及其药物组合物和应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，尤其涉及具有Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活作用的新化合物hypatone A及其制备方法，以及其在治疗神经退行性疾病阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型的药物中的应用。

背景技术

金丝桃属(Hypericum)是藤黄科(Guttiferae)的一个大属，全世界约400种。我国约有55种8亚种，全国均有分布，主产于在西南地区。该属植物在国内外民间被广泛作为药用植物，具有悠久的历史。例如我国金丝桃属植物有25种在民间作为药物用，具有抗抑郁、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等多种药理活性。到目为止，从金丝桃属植物中已经发现了多种类型的活性成分，其中异戊烯基化的酰基间苯三酚是其特征性的化学成分，因具有复杂的结构和多样的生物活性而受到广泛的关注。

金丝梅(Hypericum patulum)别名土连翘，芒种花。生于海拔2700m的山坡、草地、林下、灌丛中或空旷处，具有清热利湿解毒，疏肝通络，祛瘀止痛等功效。文献报道该植物的化学成分主要有黄酮，口山酮类化学成分。然而迄今为止现有的技术中未见有去芳化异戊烯基间苯三酚衍生物类化合物hypatone A及其活性的报道。

Ca_v3.1属于低压门控Ca²⁺通道的一个亚家族，在大脑中广泛表达。在生理上，Ca_v3.1在调节神经元的回返式放电(burst firing)中起着至关重要的作用。Ca_v3.1功能的缺失或获得与神经系统疾病相关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、特发性全身性癫痫、脊髓小脑性共济失调42型(SCA42)和儿童期小脑萎缩，因此，Ca_v3.1成为了研发治疗中枢神经系统相关疾病的热门靶点。研究表明ST101和SAK3通过增强Ca_v3.1减少乙酰胆碱释放和β样淀粉的产生从而提高尔茨海默氏病小鼠模型的认知功能，或为制药业提供先导合物。

发明内容

本发明的目的在于提供从金丝梅(H.patulum)中分离得到的去芳化异戊烯基间苯三酚类化合物hypatone A，其制备方法，在药物中特别是在治疗神经退行性疾病阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型中的应用。本发明提供的新化合物hypatone A具有显著Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活活性，可以用于制备预防和/或治疗阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型的药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了下述结构所示的去芳化异戊烯基间苯三酚类化合物hypatone A：

本发明提供了上述技术方案所述化合物hypatone A的制备方法，包括以下步骤：用甲醇对干燥金丝梅全草进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分再用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过MCI柱，依次收集得到5个组分A～E，将B组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为A1～A5组分；A2组分经过HPLC分离纯化得到化合物hypatone A。

一种药物组合物，其由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为化合物hypatone A。

本发明提供了一种具有Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活活性的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为上述技术方案所述化合物hypatoneA或上述技术方案所述制备方法制备得到的化合物hypatone A。

一种新型的Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活剂，其以酰基间苯三酚类衍生物hypatone A为活性成分。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。

本发明提供了上述技术方案所述化合物或药物组合物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

优选地，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型。

优选地，所述预防和/或治疗神经退行性疾病的药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。

本发明提供的化合物hypatone A对Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活活性，以所述化合物为有效成分的药物组合物可用于制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物，具有潜在临床应用价值。

本发明提供的化合物hypatone A的制备方法，金丝梅经甲醇提取后利用MCI柱分离、正相和反相柱层析以及高效液相色谱分离技术，能够得到具有显著而强效Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活活性的目标化合物，操作方便。

如所述的去芳化异戊烯基间苯三酚类化合物hypatone A或其药用盐，其中所述的药用盐是指药学上可接受的盐，包括与有机酸和无机酸形成的盐，所述的有机酸为酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、草酸、马来酸、琥珀酸、乙二酸、藻酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、烟酸、2-萘磺酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫代氰酸、对-甲苯磺酸盐和十一烷酸盐，所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸。

附图说明

图1为化合物hypatone A的氢谱(600MHz,CDCl₃)；

图2为化合物hypatone A的碳谱(150MHz,CDCl₃)；

图3为化合物hypatone A的高分辨质谱图；

图4为化合物hypatone A的X-射线的衍射图；

图5为化合物hypatone A对鼠源Ca_v3.1 Arg1723His突变体电生理特性的影响。A、B：稳态激活曲线，Ca_v3.1(蓝色,n＝7)、Ca_v3.1(R-H)(黑色,n＝8)、10μM(hypatone A)作用于Ca_v3.1(R-H)(红色,n＝8)的半激活电压和斜率因子。C、B：稳态激失活曲线，Ca_v3.1(蓝色,n＝8)、Ca_v3.1(R-H)(黑色,n＝8)、10μM(hypatone A)作用于Ca_v3.1(R-H)(红色,n＝8)的半激活电压和斜率因子。E：Ca_v3.1(蓝色虚线)、Ca_v3.1(RH)(黑色虚线)和10μM(hypatone A)作用于Ca_v3.1(RH)(红色虚线)的激活和稳态失活曲线的重叠。这些曲线由实验数据通过波尔茨曼方程拟合，数据表示为平均值±SEM。通过T-检验对两组数据进行差异性分析，通过单因素方差分析进行多重比较，*P＜0.05,**P＜0.01；

图6为化合物hypatone A的结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了去芳化异戊烯基间苯三酚类化合物hypatone A结构式如图6所示。

本发明提供了上述技术方案所述化合物hypatone A的制备方法，包括以下步骤：用甲醇对干燥金丝梅全草(12kg)进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分在用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过MCI柱，依次收集得到5个组分A～E，将A(16.4g)组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为A1～A5组分；A2组分经过HPLC分离纯化得到化合物hypatone A。

在本发明中，上述硅胶柱层析以及MCI柱分离的过程中，所用洗脱剂的体积没有特殊限定，根据实际需要进行选择即可。

在本发明中，上述进行硅胶柱层析和过MCI柱分离的过程中，优选采用薄层色谱法检视分段收集得到多个相应组分(即A～E组分、A1～A5组分)。

本发明提供了一种具有Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活活性的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为上述技术方案所述化合物hypatoneA或上述技术方案所述制备方法得到的化合物中的至少一种。

本发明对于所述药学上可接受的辅料没有特殊的限定，具体的，所述药学上可接受的辅料优选包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。本发明对于上述辅料中的具体种类没有特殊的限定，根据实际需要选择即可。

本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型中的应用。

本发明对于所述预防和/或治疗神经退行性疾病的药物的剂型没有特殊的限定，根据实际需要选择即可，具体可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。本发明对于不同剂型药物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。

在本发明中，所述预防和/或治疗神经退行性疾病的药物所给予的剂量将随着所使用的化合物、给予方式、所希望的治疗和所指示的障碍而变化。例如，口服给药，所述化合物hypatone A或其药学上可接受的盐的每日剂量可以在0.01微克/千克体重(μg/kg)至100毫克/千克体重(mg/kg)的范围内。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

化合物hypatone A的制备方法，包括以下步骤：

本发明提供了上述技术方案所述化合物hypatone A的制备方法，包括以下步骤：用甲醇对干燥金丝梅全草(12kg)进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分在用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过MCI柱，依次收集得到5个组分A～E，将A(16.4g)组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为A1～A5组分；A2组分经过HPLC分离纯化得到化合物hypatone A。

化合物hypatone A的结构解析(表征图如图1～3所示)具体如下：

化合物hypatone A，无色晶体。HRESIMS表面其分子式为C₃₃H₄₀O₄([M+H]⁺m/z501.3004,calcd:501.2999)。分析其¹³C NMR和DEPT数据，该化合物有7个甲基、5个亚甲基、9个次甲基以及12个季碳。特别是有一个孤立的羰基，一个耦合的羰基，一个1，3-二酮以及两个化学位移分别为62.0ppm和71.1ppm的季碳表明该化合物是在C-3位有两个异戊烯基取代的去芳化异戊烯基的间苯三酚衍生物。HMBC谱中Me-17,18与C-15；Me-22,23与C-20,以及H₂-14,H₂-19与C-3,C-4和C-2的相关证实了这一推论。另外，H-1′/H-6′/H-5′/H-4′/H-3′的¹H-¹H COSY相关和Me-10′和Me-9′与C-8′,C-5′和C-5以及Me-7′与C-2′,C-1′和C-3′的HMBC相关证实了剩下的10个碳原子为一个单萜单元。去芳化异戊烯基酰基间苯三酚母核与单萜单元通过C-5/C-8′以及C-5/C-1′连接可以通过H-1′与C-4,C-5,和C-6以及H-5′,Me-9′,和Me-10′与C-5的HMBC相关可以得到证实。C-2′的低场的化学位移以及不饱和度确定了五元氧环的存在。

通过上述波谱数据的分析，化合物hypatone A的平面结构得到确定。最后通过X-射线的单晶衍射分析，并确定了其立体构型(图4)最终确定了化合物hypatone A的结构，其¹H和¹³C NMR数据如表1所示。

表1化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(CDCl₃)

化合物hypatone A的理化性质及结构数据：

colorless crystals；mp 135–137℃；

-79(c 0.24,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)202(4.30),253(4.20)nm；IR(KBr)ν_max 3058,2968,2926,2858,1679,1618,1449,1361cm^-1。

实施例2：

本发明去芳化异戊烯基间苯三酚类衍生物hypatone A对Ca_v3.1及突变体Ca_v3.1(Arg1723His)激活活性实验方法和结果如下：

1、细胞制备与表达

以添加10％小牛血清(Gibco)和青霉素(100单位/毫升)、链霉素(0.1毫克/毫升)(Biological Industries)双抗的DMEM(HyClone)培养基培养人胚胎肾(HEK)293细胞。将处于对数生长期的293细胞用LipoD293^TM(SignaGen Laboratories)转染试剂将鼠源pCDNA3.1-Ca_v3.1、pCDNA3.1-Ca_v3.1(Arg1723His)和pCDNA3.1-EGFP质粒转染入细胞。转染的人胚胎肾(HEK)293细胞需在48小时内使用。

2、电生理学实验

所有实验均在室温(22-25℃)下进行。利用微电极拉制仪(P-1000,SutterInstrument)和加热抛光将硼硅酸盐玻璃制备移液管(World Precision Instruments)制备为阻抗在2～4MΩ的玻璃电极并用于全细胞电流记录。电流通过Axopatch 200B进行放大，然后Digidata 1440A(Molecular Devices)进行数据转化。电流以2kHz通过低能滤波器，然后在10kHz进行采样。pCLAMP 10(Molecular Devices)被用来进行数据采集和分析。细胞外溶液中包含(in mM)142CsCl,1MgCl₂,2CaCl₂,10Glucose和10HEPES(pH＝7.4，用CsOH来调节)。细胞内溶液中包含(in mM)127Cs-methanesulphonate,2MgCl₂,2Na₂ATP,10HEPES和11EGTA(pH＝7.4，用CsOH来调节)。

峰值电流记录程序为：将细胞膜钳制在-100mV电位，用150ms的-30mV去极化电压刺激细胞，每次刺激间隔为4s。

激活曲线记录程序为：将细胞膜钳制在-100mV电位，以150ms步阶去极化电压从-80mV至40mV刺激细胞，电压间隔为10mV，刺激时间间隔为4s，记录不同电压下的峰值电流。

失活曲线记录程序为：将细胞膜钳制在-100mV电位，首先对其施加300ms从-120至45mV的条件电压刺激，然后用150ms的-30mV去极化电压获得峰值电流，电压间隔为5mV，刺激时间间隔为4s。

3、数据分析与统计

数据的收集和统计分析均采用GraphPad 8.0.1(GraphPad Software,San Diego,CA USA)。*P<0.05，**P<0.01为差异有统计学意义；用t检验比较两组数据间的差异，用单因素方差分析比较三组数据差异。所有数据均以均数±标准差表示。

EC₅₀值和希尔系数通过希尔方程Y＝S_Min+(S_Max-S_Min)/[1+10(LogEC₅₀-C)×Hillslope]用收集得到的数据计算得出。这里EC₅₀是在激活电流是最大激发电流一半时的浓度，C是化合物的浓度，S_Min是最小激活率，S_Max是最大激活率，Hillslope是希尔系数。所有数据均为平均值±标准差。

激活曲线通过拟合Boltzmann方程：G/G_max＝1/(1+exp((V_1/2-V)/k))获得，其中G_max通道电导的最大值。通道电导通过方程G＝I/(V-V_rev)获得，V是测试电压，V_rev是反转电压，I是测试电压激发的峰值电流。V_1/2是通道开放一半时的刺激电压值。k是曲线的斜率。

失活曲线通过拟合Boltzmann方程：I/I_max＝1/(1+exp((V_1/2-V)/k))获得，I是测试电压激发的峰值电流，V_1/2是通道失活一半时的条件电压值。k是曲线的斜率。

4、化合物hypatone A对Ca_v3.1及突变体Ca_v3.1(Arg1723His)的激活活性实验，如表2和表3所示。

表2.Hypatone A作用于Ca_v3.1峰电流的剂量效应关系

结果表明，在上述实验条件下化合物hypatone A表现出了显著的Ca_v3.1钙离子通道激活活性，IC₅₀＝4.80μM，希尔系数为1.3。在最高测试浓度下可以增强Ca_v3.1钙离子通道电流高达92％，激活作用远远超过了合成的Ca_v3.1钙离子通道激活剂ST101和SAK3。这两个分子在饱和浓度下对Ca_v3.1钙离子通道激活作用仅为15％左右。值得指出的是活性分子ST101在与多奈哌齐联合用药治疗阿尔茨海默症的Ⅱ期临床研究中表现出了良好的耐受性和有效性，而hypatone A的活性远远超过ST101，代表一种新型的以Ca_v3.1为靶点治疗阿尔茨海默症的先导化合物。

表3.Hypatone A作用于Ca_v3.1(Arg1723His)峰电流的剂量效应关系

实验结果表明，在上述实验条件下化合物hypatone A对Ca_v3.1钙离子通道突变体Ca_v3.1(Arg1723His)同样具有显著的激活活性，IC₅₀＝9.60μM，希尔系数为0.9。脊髓小脑性共济失调42型是一类近期发现的具有家族性遗传特征的罕见神经退行性疾病。Ca_v3.1钙通道1715位精氨酸突变为组氨酸(在鼠源基因中对应的是1723位精氨酸突变为组氨酸)是这一类疾病的病理基础。鼠源Ca_v3.1(Arg1723His)通道特性与人源Ca_v3.1(Arg1715His)一致，且基因突变小鼠同样表现出了脊髓小脑性共济失调42型病人行为表型和小脑浦肯野细胞退化的表型，为研究这类疾病提供很好的模型支持。脊髓小脑性共济失调42型病人Ca_v3.1钙通道生理活性与正常人Ca_v3.1钙通道相比最大的区别在于通道开放的电压依赖性向去极化方向移动，致使通道窗口电流向右移动，从而诱发疾病的产生。如图5所示，化合物hypatone A可以使Ca_v3.1(Arg1723His)通道的激活曲线向超级化方向移动，但不影响通道的失活，最终使病理状态下右移的窗口电流向左移动到了正常范围。到目前为止针对脊髓小脑性共济失调42型药物研发尚处于空白，hypatone A的发现为这类疾病小分子药物研发提供了新的结构模板和设计思路。

实施例3

片剂的制备：

按实施例1的方法先制得化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠橡酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液制剂的制备：

按实施例1的方法先制得化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠橡酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂、颗粒剂或冲剂的制备：

按实施例1的方法先制得化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠橡酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.下述结构式所示的酰基间苯三酚类衍生物hypatone A，

2.权利要求1所述化合物hypatone A的制备方法，采用甲醇对干燥金丝梅全草进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分在用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过MCI柱，依次收集得到5个组分A～E，将A组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为A1～A5组分；A2组分经过HPLC分离纯化得到化合物hypatone A。

3.一种药物组合物，其特征在于，其由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为权利要求1所述化合物hypatone A或权利要求2所述制备方法制备得到的化合物hypatone A。

4.一种用于预防和治疗阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型的药物组合物，其特征在于，其由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为权利要求1所述化合物hypatone A或权利要求2所述制备方法制备得到的化合物hypatone A。

5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。

6.权利要求1所述的酰基间苯三酚类衍生物hypatone A或权利要求3或4任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默症和脊髓小脑性共济失调42型。

8.根据权利要求6或7任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗神经退行性疾病的药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。

9.一种Ca_v3.1低电压门控钙离子通道激活剂，其以权利要求1所示的酰基间苯三酚类衍生物hypatone A为活性成分。

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