CN117777156A - 大籽蒿中倍半萜三聚体及其药物组合物与其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大籽蒿中倍半萜三聚体及其药物组合物与其制备方法和应用，属于药物技术领域。本发明提供结构式(I)所示8个新的倍半萜三聚体，Artemsieverolactones A‑H(1‑8)对人肝星状细胞(HSC‑LX2)具有明显的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝纤维化药物。
Description
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及倍半萜三聚体化合物artemsieverolactones A-H(1-8)，及其制备方法、以其为活性成分的药物组合物及其在制药中的应用。
背景技术：
流行病学的调查结果表明全球平均每年因肝脏疾病死亡人数约200万人，约占全世界死亡人数的3.5％，已经成为造成人类死亡的主要原因之一。肝纤维化(Hepaticfibrosis，HF)是由多种病因(病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、胆汁淤积、酒精中毒或自身免疫性疾病)引起的肝损伤以及炎症引发的慢性肝病共同的病理过程，肝纤维化是一个动态过程，具体表现为肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)异常活化、肝内纤维组织异常增生、细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)过量沉积，进而影响人体肝脏的正常生理结构和功能，如果该进程不得到抑制，则可能进一步发展为肝硬化或肝癌。肝纤维化是多数肝病共同的病理过程，即在各种致病因子作用下肝脏内细胞外基质发生过度沉积，从而影响肝脏的生理结构和功能，如不及时抑制或逆转，则会加速肝硬化或肝癌的发生，严重影响人体的生存质量。目前单一控制病因或中药保肝是治疗肝纤维化的主要方式，临床上无针对肝纤维化治疗的化学合成药物。尽管近年来抗纤维化药物的研发取得了一定的进展，但一些候选药物在临床试验中难以达到预期的治疗效果或出现副作用。肝星状细胞是肌成纤维细胞的主要来源。正常肝脏中，HSC增殖很慢，其通过调节细胞外基质的合成和降解而维持其动态平衡。当肝脏受到外界致病因子的持续刺激时，一系列复杂机制被启动，最终结果导致HSC由静息型转化为激活型，并分泌TGF-β、PDGF等各种促纤维因子，产生大量无序堆积的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，促进纤维化的发生和发展。因而，HSC是抗肝纤维化治疗的一个潜在靶点，当前许多抗肝纤维化在研药物通过抑制HSC的增殖及纤维形成能力、促进HSC的凋亡等途径以期达到治疗目的。本发明旨在基于人肝星状细胞(hepatic stellate cells line LX2,HSC-LX2)筛选模型，从天然产物中寻找新的抗肝纤维化活性成分。
大籽蒿(A.sieversiana)为菊科蒿属多年生草本植物，生于海拔3500米地区以下的山坡、草原、疏林及林缘等地。主要分布于黑龙江、辽宁、内蒙古、甘肃、四川、云南、西藏等地。据《中药大辞典》记载，大籽蒿性甘苦，主治风寒、痢疾、黄疸等。蒙药和藏药记载其具有消肿、止血、清热消暑的功效，用水煎服后可治疗腹泻、感冒、黄疸等，可用于治疗紫外线辐射引发的皮肤灼伤。现代药理学研究表明，大籽蒿具有显著的祛痰平喘、消炎抑菌功效。经文献调研发现，大籽蒿中主要成分为倍半萜类(愈创木烷型、吉玛烷型、缪肉烷型、倍半萜二聚体)、木脂素类、黄酮类、挥发油等类型化合物。药理研究表明大籽蒿中分离得到的化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗菌以及抗氧化等活性。
迄今为止，现有技术无倍半萜三聚体artemsieverolactones A-H(1-8)的报道，也没有化合物1-8及其药物组合物作为抗肝纤维化药物的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的倍半萜三聚体，artemsieverolactones A-H(1-8)，及其制备方法和应用，含artemsieverolactones A-H的药物组合物及其应用，在本发明前期工作中发现，大籽蒿乙醇提取物具有显著的HSC-LX2细胞毒活性(浓度为100μg/mL时其抑制率达58.0％)，活性导向分离得到8个新的倍半萜三聚体，artemsieverolactones A-H(1-8)，该类化合物对肝星状细胞具有明显的细胞毒活性，能够用于制备抗肝纤维化药物。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一系列倍半萜三聚体类化合物，artemsieverolactones A-H(1-8)，具有如下式(I)所示结构：
本发明提供了上述倍半萜三聚体类化合物1-8的制备方法，大籽蒿的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，5:95,10:90,20:80,30:70和100:0为洗脱剂，梯度洗脱得到Fr.A-Fr.E(149g,101g,98g,153g和164g)五个流分；流分Fr.D经过硅胶柱层析用甲醇-氯仿以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.D1-Fr.D5(25g,10g,60g,30g和25g)；流分Fr.D4(30g)经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1(22mg),2(4mg),3(9mg),4(10mg),5(5mg),6(6mg),7(3mg),8(5mg)。
本发明提供了上述技术方案所述倍半萜三聚体类化合物1-8在制备抗肝纤维化药物的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述的倍半萜三聚体类化合物1-8中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。
并此，还提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。以及，该药物组合物的制备方法，按上述化合物的制备方法先制得化合物1-8，然后取化合物1-8其中一种或其任意组合，再加上可药用载体。
当所述化合物1-8中的至少一种用于制备抗肝纤维化药物时，本发明优选将所述化合物1-8直接使用，或以药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物1-8中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1-8中的至少一种与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝纤维化药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1-8中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.本发明提供了一系列新的倍半萜三聚体类化合物，artemsieverolactones A-H(1-8)。
2.本发明提供了制备新化合物1-8的新的方法，该方法原料易得，易于操作，适于工业化生成。
3.本发明提供了新化合物1-8作为有效成分的药物组合物，为新的抗肝纤维化药物提供了具有较好药用作用的新的药物。
4.本发明的化合物1-8对肝星状细胞(HSC-LX2)的细胞毒活性均具有较强活性，化合物1,2和4具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为49.2,37.8和64.7μM,活性为阳性药物水飞蓟宾的2-4倍；化合物3和7亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为94.4和117.1μM，活性优于阳性药物水飞蓟宾,其余化合物具有一定的HSC-LX2细胞毒活性，浓度为200μg/mL时其抑制率在25.1-40.6％之间。
附图说明：
图1为本发明化合物1-8，artemsieverolactones A-H(1-8)的结构式；
图2为本发明化合物1，artemsieverolactones A的X-单晶衍射结构示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明倍半萜类三聚体化合物，artemsieverolactones A-H(1-8)及其制备方法、结构鉴定、药理作用，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他技术方案，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明倍半萜类三聚体化合物，artemsieverolactones A-H(1-8)的制备：
大籽蒿(A.sieversiana)的干燥地上部分(33kg)，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，5:95,10:90,20:80,30:70和100:0为洗脱剂，梯度洗脱得到Fr.A-Fr.E(149g,101g,98g,153g和164g)五个流分；流分Fr.D经过硅胶柱层析用甲醇-氯仿以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.D1-Fr.D5(25g,10g,60g,30g和25g)；流分Fr.D4(30g)经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1(22mg),2(4mg),3(9mg),4(10mg),5(5mg),6(6mg),7(3mg),8(5mg)。
化合物1-8的结构数据：
熔点采用X-4B显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)测定；比旋光度由Autopol VI旋光仪(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,USA)测定；红外光谱采用ATR衰减全反射-金刚石晶体(ATR ITX-DIAMOND)方法，通过NICOLET iS10型红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific,Madison,USA)测定；紫外光谱由UV-2401PC型紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；ECD谱由Applied Photophysics圆二色谱仪(AppliedPhotophysics,Surrey,UK)测定；核磁共振谱使用Avance III 600(Bruker,Bremerhaven,Germany)超导核磁共振仪测定，使用TMS(四甲基硅烷)作为内标；高分辨质谱采用岛津LC-MS-IT-TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)，安捷伦UPLC/Q-TOF和G6230质谱仪(AgilentTechnologies,Santa Clara,USA)测定；薄层层析硅胶板HSGF254购自烟台江友硅胶开发有限公司；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；柱层析葡聚糖凝胶LH-20购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；高效液相色谱仪购自岛津公司，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)；色谱纯乙腈购自迈瑞达公司，去离子通道水通过MingCheTM-D 24UV Merk Millipore系统纯化而得；中压液相(Dr Flash-Ⅱ)为上海利穗公司产品，MCI柱日本三菱公司，型号为CHP-20P(75～150μm)；分析纯甲醇和乙腈购自天津大茂化学试剂厂；显色剂为10％ H2SO4-EtOH溶液。
Artemsieverolactone A(1)
分子式：C45H58O9
分子量：742
性状：无色针晶
旋光：(c 0.071,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值787.4063[M+HCOO]–,计算值787.4063[M+HCOO]–。
IR vmax:3438,1758,1631,1454,1381,1241,1176,1055cm–1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1。
Artemsieverolactone B(2)
分子式：C45H58O9
分子量：742
性状：白色粉末
旋光：(c 0.041,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值787.4051[M+HCOO]–,计算值787.4063[M+HCOO]–。
IR vmax:3439,1757,1631,1455,1381,1225,1178,1031cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):201(+13.95),227(–1.16)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1。
Artemsieverolactone C(3)
分子式：C45H58O10
分子量：758
性状：白色粉末
旋光：(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值803.4017[M+HCOO]–,计算值803.4012[M+HCOO]–。
IR vmax:3438,1760,1632,1454,1297,1178,1003cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):213(+19.22)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1。
Artemsieverolactone D(4)
分子式：C45H58O9
分子量：742
性状：白色粉末
旋光：(c 0.065,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值787.4063[M+HCOO]–,计算值787.4063[M+HCOO]–。
IR vmax:3436,1761,1633,1454,1382,1318,1178,1148,1000cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(+36.29),225(–5.97)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1。
Artemsieverolactone E(5)
分子式：C45H58O10
分子量：758
性状：白色粉末
旋光：(c 0.051,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值803.4016[M+HCOO]–,计算值803.4012[M+HCOO]–。
IR vmax:3437,1764,1632,1455,1381,1319,1240,1150,993cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2。
Artemsieverolactone F(6)
分子式：C45H58O9
分子量：742
性状：白色粉末
旋光：(c 0.069,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值787.4053[M+HCOO]–,计算值787.4063[M+HCOO]–。
IR vmax:3436,1767,1632,1455,1382,1315,1178,1141cm–1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2。
Artemsieverolactone G(7)
分子式：C45H58O9
分子量：742
性状：白色粉末
旋光：(c 0.073,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值787.4052[M+HCOO]–,计算值787.4063[M+HCOO]–。
IR vmax:3438,1760,1635,1457,1382,1319,1176cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2。
Artemsieverolactone H(8)
分子式：C45H58O9
分子量：742
性状：白色粉末
旋光：(c 0.053,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值787.4063[M+HCOO]–,计算值787.4063[M+HCOO]–。
IR vmax:3462,1755,1638,1457,1382,1176,1117cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2。
表1.化合物1-4的1H和13C-NMR数据(600MHz,δin ppm,J in Hz,CDCl3)
“ol”表示信号重叠，耦合常数无法计算
表2.化合物5-8的1H和13C-NMR数据(600MHz,δin ppm,J in Hz,CDCl3)
“ol”表示信号重叠，耦合常数无法计算
实施例2：
倍半萜类三聚体化合物，artemsieverolactones A-H(1-8)对HSC-LX2的细胞毒活性。
1.材料和方法
1.1材料
人肝星状细胞系(hepatic stellate cells line LX2,HSC-LX2)购自上海纪宁生物科技有限公司；RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Gibco BRL(NY,USA)；MTT购自广州赛国生物科技有限公司。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
采用MTT法测定样品对HSC-LX2细胞的毒活性。HSC-LX2细胞于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。取对数期生长的细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，24h后将其维持液替换为含不同浓度供试样品的培养基，同时设置只加维持液的细胞对照组，并以水飞蓟宾做阳性药物对照。培养48h后，弃掉培养液并加入100μL MTT溶液(浓度为1mg/mL)；置于37℃恒温箱孵育4h，弃掉MTT溶液并加入100μL DMSO溶解甲躜晶体；最后，在490nm处用酶标仪检测每孔吸光度值。HSC-LX2细胞抑制率计算公式为抑制率(％)＝[A(空白)–A(样品)]/A(空白)×100％。其半数抑制浓度(50％inhibitory concentration,IC50)利用Graphpad Prism 5软件计算。
2.结果
对分离得到的所有化合物评价了其体外的HSC-LX2细胞毒活性(表3)。化合物1-8对肝星状细胞(HSC-LX2)的细胞毒活性均具有较强活性，化合物1,2和4具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为49.2,37.8和64.7μM,活性为阳性药物水飞蓟宾的2-4倍；化合物3和7亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为94.4和117.1μM，活性优于阳性药物水飞蓟宾,其余化合物具有一定的HSC-LX2细胞毒活性，浓度为200μg/mL时其抑制率在25.1-40.6％之间。
表3.化合物的HSC-LX2细胞毒活性
抑制率和IC50均从三次独立的实验中得到。
3.结论
实验结果显示，化合物1-8对肝星状细胞(HSC-LX2)的细胞毒活性均具有较强活性，化合物1,2和4具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为49.2,37.8和64.7μM,活性为阳性药物水飞蓟宾的2-4倍；化合物3和7亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为94.4和117.1μM，活性优于阳性药物水飞蓟宾,其余化合物具有一定的HSC-LX2细胞毒活性，浓度为200μg/mL时其抑制率在25.1-40.6％之间。
以上结果表明大籽蒿中倍半萜类三聚体化合物，artemsieverolactones A-H(1-8)可作为药物用于制备抗肝纤维化疾病的药物。
制剂实施例1-7：
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本制剂实施例仅体现本发明所述化合物1-8中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将化合物1-8中的至少一种，用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5-5mg/mL。
2.将化合物1-8中的至少一种，用DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将化合物1-8中的至少一种，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将化合物1-8中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将化合物1-8中的至少一种，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将化合物1-8中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将化合物1-8中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一种大籽蒿中新的倍半萜类化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的8种新的倍半萜类化合物，对人肝星状细胞HSC-LX2具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝纤维化药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.如下结构式(I)所示的倍半萜三聚体化合物1-8，
2.权利要求1所述的结构式(I)所示的倍半萜三聚体化合物1-8的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：大籽蒿的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，5:95,10:90,20:80,30:70和100:0为洗脱剂，梯度洗脱得到Fr.A-Fr.E五个流分；流分Fr.D经过硅胶柱层析用甲醇-氯仿以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.D1-Fr.D5；流分Fr.D4经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1,2,3,4,5,6,7,8。
3.权利要求1所述的结构式(I)所示的倍半萜三聚体化合物1-8在制备抗肝纤维化药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的结构式(I)所示的化合物1-8的至少一种和药学上可接受的载体。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
6.权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：大籽蒿的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，5:95,10:90,20:80,30:70和100:0为洗脱剂，梯度洗脱得到Fr.A-Fr.E五个流分；流分Fr.D经过硅胶柱层析用甲醇-氯仿以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.D1-Fr.D5；流分Fr.D4经MCI gel CHP20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1,2,3,4,5,6,7,8；然后取化合物1-8其中一种或其任意组合，再加上可药用载体。
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