JPH01500516A - グアイアズレン誘導体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グアイアズレン誘導体及びその使用方法発明の分野 本発明は抗腫瘍活性、免疫調節活性および抗真菌活性を有する新規な有機化合物 に関する。加えて、本発明は海洋生物であるゴルゴニアン属のアカリチゴルギア 種（ｍａｒｉｎｅｇｏｒｇｏｎｉａｎ　ｇｅｎｕｓ　Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉ ａ、ｓｐ、）から得られる既知および新規な化合物について、新たに見出された 抗腫瘍剤、免疫調製剤および抗真菌剤としての用途およびその使用方法に関する 。

発明の背景 腫瘍に関連した種々の疾患がヒトを襲う。腫瘍学および抗腫瘍法には多大の研究 がなされている。種々の哺乳類において腫瘍は共通しており、哺乳類における腫 瘍の予防、成長抑制および縮小を研究することは、ヒトにとっても重要である。

「腫瘍」の用語は、新しく成長した組織の異常な塊であって、元の組織または宿 主全体と調和しないものを言う。

哺乳類およびヒトにおいては、癌および最終的には癌性悪液質の種々の形態を含 む多種多用な病気および症状が、腫瘍によって惹起される。「癌性悪液質」とは 、腫瘍に冒された哺乳類に伴われる病状を言う。これらの病状には、例えば履患 した哺乳類の体重減少に見られるような衰弱が含まれる。

癌の深刻さはよく知られており、例えばヒトの死因としては心臓血管系の病気に 次いで第二位である。

腫瘍成長の抑制、制限あるいは制御を助ける一定効果をもった方法および化学物 質が提供されてきてはいるが、腫瘍を抑制するための方法および化学物質は今な お更に必要とされている。

免疫調節は、免疫薬理学における発展中の分野である。免疫調節剤という名称は 、温血動物における免疫機能の調節または正常化に有用な薬剤を意味する。免疫 調節剤は、一定の疾患または病気に対する免疫を構築し、その治癒を開始させる ための免疫刺激剤であってもよく、また異物に対する生体の望ましくない免疫反 応を阻止する免疫抑制剤であってもよい。免疫調節剤は、リウマチ炎、腫瘍性疾 患、感染病、アレルギー反応、全身性狼ｆＭ　ＦＭ　、エリテマト−スス（ｅｒ ｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ　）のような自己免疫疾患および免疫不全症等の免疫病 の治療に有用であることが分っている。更に、このような薬剤は癌の免疫療法、 または腎臓や心臓等の臓器移植における拒否反応を防止するために有用である。

ムラミン酸ジペプチド誘導体、レバミゾール（Ｉｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、ニリダ ゾール（ｎｌｒＬｌ”ａｚｏｌｅ）　、オキシスラン（ｏｘｙｓｕｒａｎ）　； フラギール（ｆｌａｇｙｌ）及びその他のインターフェロン群；インターロイキ ン；ロイコトリエン（Ｉｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ）　；及びコルチコステロイド を含む種々の免疫調節剤が見出されている。

これら多くの化合物が知られているが、何れも望ましくない副作用および／また は高い毒性を有している。従って、特定の領域において広範な免疫調節作用を有 し、且つ望ましくない副作用は最小であるような新しい免疫調節剤が必要とされ ている。

真菌類の成長、哩乳類および植物に対する感染、およびそのために惹起される疾 患の防止は、ヒトにとっても又重要である。真菌類の存在は、例えば肺カンジダ 症、肺プラストミセス症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｂｌａｓｔｏｍｙｓｉｓ　）の ような種々の真菌性の病気および感染をヒトにもたらす。イースト様の成る種の 微生物、例えばクリプトコツカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ　）は、中枢神経系に深刻な感染を惹き起こす。ヒト 及び哺乳類において更によく知られている真菌感染としては、皮膚における抵抗 性感染と同様、毛髪および爪の領域における真菌感染である自縛が含まれる。多 くの他の感染が、ヒト及び動物の皮膚、粘膜、腸管、膣、肺に生じる。

植物も種々の真菌によって侵される。農業における真菌感染による被害は年間１ 千万ドルに達する。真菌に対しては、無機および有機の物質からなる種々の静菌 剤および殺菌剤が試されてきたが、限られた成功が得られているにすぎない。

勿論、真菌に対する静菌剤または殺菌剤が真菌を殺す一方、植物は殺さず且つ植 物から得られる食物には同等毒性を残さないことが重要である。農業において真 菌感染と闘うために、葉殺菌剤（この方法では植物を予防性の耐候性真菌殺菌剤 で被覆する）を含む種々の方法が利用されてきた。種子処理および土壌処理は、 種子にとって安全で且つ土壌および土壌微生物による分解に対して抵抗性のある 真菌殺菌剤を必要とする方法である。化学療法剤は、植物を透過して新生を保護 し、または既に植物中に生じている感染を排除する真菌殺菌剤である。農業にお ける真菌静菌剤、真菌殺菌剤およびこれらの適用は、例えば合衆国では、既に制 定された極めて厳重な要求および規制にも合致しなければならない。

抗腫瘍剤、免疫調節剤および抗真菌剤のために、相当の研究および資金が投入さ れてきた。腫瘍を抑制し、免疫を調節し、また真菌の拡大を抑制するために、種 々の抗腫瘍剤、免疫調節剤、抗真菌剤および方法が開発されてはいるが、更にそ のような方法および化学療法剤がめられている。

有用な有機化合物の有力な供給源は海洋植物および海洋動物であり、特に興味深 いのは海洋ゴルゴニアンである。ヤギ類（Ｇｏｒｇｏｎａｃｅａ）は、分枝して 広がった扇状または羽根状のコロニーを形成する角質の珊瑚である。ゴルゴニア ン・アカリチゴルギア種（ｍａｒｌｎｅ　ｇｏｒｇｏｎｌａｎ　ｇｅｎｕｓ　Ａ ｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｌａ。

ｓｐ、　）の抽出物から得られる成る種の有機化合物は、有用な抗腫瘍活性、免 疫調節活性および抗真菌活性を有することが見出されている。

興味のある幾つかの化合物が、海洋ゴルゴニアンから単離されている。これらの 化合物はグアイアズレン、リンデラアズレンと命名され、下記の文献中に報告さ れている。

０Ｆｕｓｅｔａｎｉ、　Ｎ、　、　ａｔｓｕｎａｇａ、　Ｓ、　、　Ｋｏｎｏｓ ｕ、　Ｓ、　；Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ。

３７．６８０（１９８１） 一１ｍｒｅ、Ｓ、　、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｒ，Ｈ，、Ｙａｌｈｉ　、Ｂ、　；Ｅｘ ｐｅｒｉｅｎｔｔａ。

３７．４４２（１９８１） ０Ｌｉ、Ｍ、に、Ｗ、、５ｃｈｅｕｅｒ、Ｐ、Ｊ、；Ｔｅｔｒａｈｃｄｒｏｎ　 Ｌｅｔｔｅｒｓ。

・Ｉｂ１ｄ、、２５．２１０９（１９８４）・Ｔａｋｅｄａ　、　Ｋ、　、　Ｍ ｉｎａｔｏ、　Ｈ，、Ｉ　ｓｈｉｋａｗａ、　Ｍ、　；　Ｊ　、Ｃｈｅｍ、Ｓｏ ｃ、　。

・Ｔａｋｅｄａ、に、、Ｎａｇａｔａ、Ｗ、；Ｃｈｅｎ＋、Ｐｈａｒｏ、ＢＩｌ 、、１．１６４（１９５３）これらの文献は、これらの化合物の抗腫瘍活性、免 疫調節活性および抗真菌活性について何も開示していない。これら文献の全体の 開示内容は、参考として以下の既述に組入れられている。従って、海洋ゴルゴニ アン及び他の海洋生物は人間にとって有用な原料供給源となり得る。

発明の要約 従って、本発明の目的は、抗腫瘍剤、免疫調節剤および抗真菌剤として有用な化 合物を提供し、またこのような化合物を製造する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、新規の免疫調節剤、抗腫瘍剤および抗真菌剤を利用 して免疫を調節し、また腫瘍および真菌の成長とこれによって惹起される感染お よび疾患を抑制する方法を提供することである。

本発明は、更なる目的および利点を提供する。その一部は以下の記述に示され、 また一部はこの記述から、或いは本発明の実施によって明らかとなる。

本発明の目的および利点は、特許請求の範囲に記載の化合物または組成物、製法 、方法および結合という手段によって実現され、また達成される。

本発明の目的を達成するために、ここにに具体的に且つ充分に記述される発明は 、次の一般式に示される化合物からな但し、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または 相互に異なる置換基であって、夫々水素または低級アルキル基を示す。

本発明の好ましい実施例においては、上記の化合物は実質的に純粋である。

本発明の好ましい実施例において、前記低級アルキル基は１〜５の炭素原子を含 む。本発明の更に好ましい実施例においては、前記Ｒ１〜Ｒ３は夫々メチル基で ある。

ここにに具体的に且つ充分に記述）れる発明は、活性成分として、本発明の化合 物の一種以上を抗腫瘍剤、免疫調節剤または抗真菌剤として有効な量だけ含み、 且つ毒性のない調剤的に許容され得るキャリア又は稀釈剤を含む抗腫瘍剤組成物 、免疫調節剤組成物または抗真菌剤組成物である。

ここにに具体的に且つ充分に記述される更なる発明は、腫瘍細胞を、抗腫瘍剤と して有効な量の次式１〜ｍに示される一種以上の化合物に接触させることを含み 腫瘍細胞を抑制する方法である。

但し、Ｒ１−Ｒ５は同一または相互に異なる置換基であって、夫々水素または低 級アルキル基を示す。

ここにに具体的に且つ充分に記述される更なる発明は、免疫調節剤として有効な 量の式Ｉ　−Ｉ［Ｉに示される一種以上の化合物を、部位領域（ｓｉｔｅ　ａｒ ｅａ　）に用いることを含む免疫調節方法である。

ここにに具体的に且つ充分に記述される更なる発明は、真菌を、抗真菌剤として 有効な量の弐Ｉ〜■に示される一種以上の化合物に接触させることを含む真菌の 成長を抑制しまたは真菌を殺す方法である。

ここにに具体的に且つ充分に記述されるように、本発明はまた式Ｉ〜ｍの化合物 を製造する新規な製造方法である。

この製法は、海洋ゴルゴニアン属のアカリチゴルギア種（ｍａｒｉｎｅ　ｇｏｒ ｇｏｎｌａｎ　ｇｅｎｕｓ　Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉａ、ｓｐ、）を収集する 工程と、該ゴルゴニアンを所定の有機溶媒に接触させて前記ゴルゴニアンの抽出 物を得る工程と、該の抽出液を分画する工程と、該分画された抽出液から式Ｉ〜 ■の化合物を分離する工程とを含む。

なお、上記の一般的既述および以下の詳細な既述は、何れも例示的ないし説明的 な意味しかもたず、特許請求の範囲のように本発明を限定しようとするものでは ない。

発明の好ましい実施態様の詳細な説明 法に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。

なお、その実施例は後記に纏めて例示する。

本発明によれば、以下に具体的かつ詳細に説明するように、本発明の目的を達成 するための新規化合物が提供される。この発明は、下記一般式Ｉの化合物からな る。

但し　Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または相互に異なる置換基であって、夫々水 素または低級アルキル基を示す。

本発明の好ましい実施例においては、上記の化合物は実質的に純粋である。

本発明の好ましい実施例において、前記低級アルキル基は１〜５の炭素原子を含 む。本発明の更に好ましい実施例においては、前記Ｒ１〜Ｒ３は夫々メチル基で ある。

ここにに具体的に且つ充分に記述するように、本発明はま免疫調節剤または抗真 菌剤として夫々有効な量だけ含み、且つ調剤的に許容され得る無毒なキャリア又 は稀釈剤を含む抗腫瘍剤組成物、免疫調節剤組成物または抗真菌剤組成物からな る。

ここにに具体的に且つ充分に記述されるように、更なる発明は、腫瘍細胞を、抗 腫瘍剤として有効な量の次式１〜■に示される一種以上の化合物に接触させるこ とからなる腫瘍を抑制する方法である。

但し　Ｒ１−Ｒ５は同一または相互に異なる置換基であって、夫々水素または低 級アルキル基を示す。

本発明に従い、腫瘍を、抗腫瘍剤として有効な量の式１〜■の化合物の一種以上 と接触させることからなる宿主中の腫瘍を抑制する方法が提供される。本発明の 抗腫瘍方法に従い、抗腫瘍剤として有効な量の式１〜■の化合物の一種以上が、 毒性のない調剤的に許容され得るキャリア又は稀釈剤と混合される。抗腫瘍剤組 成物が使用される条件に応じて有効量は変化するが、活性を得るために必要な最 小投与量は、一般的に腫瘍細胞１０５個に対して１〜１００μ９である。毒性の ない調剤的に許容され得る有用なキャリア又は稀釈剤の例としては、エタノール 、ジメチルスルホキシド及びグリセロールが含まれる。しかし、これらに限定さ れるものではない。

式Ｉ−Ｉ［１の化合物は、種々の腫瘍の抑制に有効である。

例えば、肺カルチノー７Ａ５４９　（ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｌｎｏｍ　Ａ３４９） 、回腸アデノカルチノーマＨＣＴ８　（ｉｌｅｏｃｅｃａｌ　ａｄｅｎｏｃａｒ ｃｆｎｏｍａ）１ｃＴ８　）およびヒト胸肉アデノカルチノーマ細胞ＭＤＡ−Ｍ Ｂ−２３１（ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅ ｌｌｓ　ＭＤＡ−ＭＢ−２３りのようなヒトの肺癌、結腸癌および乳癌が挙げら れるが、これらに限定されるものではない。腫瘍抑制のための本発明の化合物の 効果は、これら化合物が哺乳類を含む宿主中の腫瘍の制御および癌性悪液質の治 療に有用であることを示している。

ここに具体的かつ充分に記述するように、更なる発明は、免疫調節剤として有効 な量の式Ｉ〜ｍに示される一種以上の化合物を、温度自動物（哺乳類）の望まし い免疫応答部位、即ち免疫刺激部位または免疫阻止部位に用いることからなる免 疫調節方法である。

式Ｉ〜■の免疫調節化合物の有効量が、毒性のない調剤的に許容され得るキャリ ア又は稀釈剤と混合される。免疫調節剤組成物の有効量は免疫調節剤の目的とす る機能、補乳類宿主のタイプ及び大きさ、目的とする免疫調節部位、式Ｉ〜ｍの 化合物が使用される際のその他の条件に応じて広範囲に変化する。一般的に、免 疫調節活性を得るために必要な最小投与量は５〜５０μ９である。

本発明に従い、真菌を、抗真菌剤として有効な量の本発明による一種以上の化合 物に接触させることからなる真菌の成長を抑制する方法が提供される。式Ｉ〜■ で表わされる一種以上の化合物の抗真菌剤としての有効量が、毒性のない調剤的 に許容され得るキャリア又は稀釈剤と混合される。抗真菌剤が用いられる条件の 変化に従って有効量は変化するが、活性を得るために必要な最小投与量は、例え ばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）のような真菌 については、細胞数１０３個／ｒＩＬＩ！の真菌接種量に対して１〜１００μ７ である。

毒性のない調剤的に許容され得る有用なキャリア又は稀釈剤の例としては、エタ ノール、ジメチルスルホキシド及びグリセロールが含まれる。しかし、これらに 限定されるものではない。

真菌の抑制にみられる本発明の化合物の効果は、これらの化合物が、咽乳類を含 む宿主における真菌および真菌に関連した疾患の制御に有用であることを示して いる。更に、式１〜旧の化合物は、農業における真菌殺菌剤として有用である。

本発明に従い、式１〜■の化合物を製造する製造方法が提供される。この製法は 、海洋ゴルゴニアン属のアカリチゴルギア種（ｍａｒｉｎｅ　ｇｏｒｇｏｎｌａ ｎ　ｇｅｎｕｓ　Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉａ、ｓｐ、）のサンプルを収集する 工程と、該海洋ゴルゴニアンを溶媒抽出に適した所定の有機溶媒に接触させて前 記ゴルゴニアンの抽出物を得る工程と、該の抽出液を分画する工程と、前記抽出 液から幾つかのフラクションを得る工程と、該分画された抽出液から弐１−ｍの 化合物を分離する工程とからなる。

本発明の好ましい実施態様において、抽出に適した有機溶媒はアセトン、酢酸エ チル、メタノール、トルエン、クロロホルム、塩化メチレン、メチルエチルケト ン、エタノール、メチルイソブチルケトン、及びこれらの混合物からなる溶媒群 から選択される。特に好ましい抽出溶媒は、アセトン及び酢酸エチルである。

本発明において上記に挙げたこれらの溶媒を用いることは、現在のところ好まし い選択である。しかし、溶媒抽出に適した他の溶媒で置換えてもよい。ふされし い溶媒システムは、ゴルゴニアンの他の成分から式１〜ｍの化合物を抽出できる ものでなければならない。この技術分野の当業者に知られているように、本発明 の溶媒システムにおいては、複数の溶媒の異なる比率および如何なる組合せを用 いてもよい。

本発明に従う化合物は、種々の分画法およびクロマトグラフィー技術を用いるこ とにより、得られた抽出物から調製及び／又は単離される。当業者に知られてい る如何なる分画法およびクロマトグラフィー技術も、本発明の製法に従って利用 することができる。適当な単離技術には、例えばヘプタン及び／又は酢酸エチル のような適当な溶媒で流出される当業者に知られた適当なカラム（例えばシリカ ゲル、Ｌｏｂａｒ又はＯＤＳカラム）を用いた逆相クロマトグラフィー、高速液 体クロマトグラフィー　（ＩＩＰＬＣ）のような、種々のクロマトグラフィー技 術が含まれる。

本発明のマクロライド化合物を製造するための、本発明の製造方法における好ま しい実施態様に関するより詳細な記述および説明は、以下の実施例において行な う。

式Ｉの新規化合物、式Ｉ−ＩＩＩの化合物の製造方法、並びに式Ｉ〜■の化合物 を腫瘍および真菌を抑制するために、また免疫調節を与えるために用いる方法は 、本発明の目的を充分に満すものである。

実施例 以下、この発明を実施例によって説明する。実施例は、この発明の範囲を制限す ることを意図するものではない。上述した詳細かつ一般的な記載と共に、実施例 はこの発明のより深い理解をもたらし、かつこの発明の化合物の製造方法を概説 する。

以下の実施例は、この発明における記述の目的を満たす化合物、工程および方法 の好ましい態様を示す。実施例において、調製方法が示されていない出発物質お よび試薬は、化学品供給業者等の当業者に公知の供給源から商業的に利用した。

実施例１−３ ゴルゴニアン属アカリチゴルギア種（８００９）を沖縄ザンバ岬で採集した。採 集したゴルゴニアンは、アセトン（３Ｌ）に浸すことによって抽出した。アセト ン抽出液を濃縮し、得られた水性懸濁液をエチルアセテートで抽出して３．４ｇ の油。

状物を得た。油状物の一部（２，７ｇ）を、シリカゲルカラムで、ヘプタンおよ びエチルアセテートの混合液（１０：１）を用いて溶出させることによってクロ マトグラフィーをおこない、２つの部分に分離した。青い色素を含む第１の部分 （１，０２ｇ）を逆相吸着材（ＲＰ　−８）のベッドに置き、メタ、ノールおよ びアセトンを用いて連続的に溶出した。メタノール溶出で同様のろ過を再び繰り 返し、青い色素を含む混合物３２０ｎを得た。ローパー（Ｌｏｂａｒ）　Ｓ　１ −６０カラム（ヘプタン：エチルアセテート−１９：１）での混合物の分離で、 ５つの分画を得た。３つの色素含有分画のそれぞれを、まずシリカゲルを用いた 予備のＴＬＣ（ヘプタン：エチルアセテート−ｓｏ：ｉないし１０：１）によっ て分離し、その後ノ＼イバー（Ｈｉｂａｒ）　Ｓ　１−８０カラムを用いたＨＰ ＬＣ（ヘプタン−エチルアセテート　４０：工ないし２０：ｌ）によって精製し 、油状物としてジヒド、ロリンデラアズＩノン（１）４７ｍｇ、［αコｏ　＋８ ００　（ｃ　Ｏ，０５、ＣＨＣｌ３）、油状物としてグアイアズレン（２）９３ 即、結晶固体としてリンデラアズレン（３）７．８η、融点１０５．５Ｃを得た 。

化合物２および３は、それらのスペクトルデータを以前に報告されたもの［例え ば、（２）に対してり−（Ｌｉ’）、Ｍ、に、Ｗ、、ショイア−（Ｓｃｈｅｕｅ ｒ）　、Ｐ、Ｓ、；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２５、第６号 、第５８７−５９０頁（１９８４年）および（３）に対してイムレ（Ｉｍｒｅ　 ）　、Ｓ、；トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）　、Ｒ，Ｈ，：ヤルヒー（Ｙａｌｈｉ ）、Ｂ、；　Ｅｘｐｅｒｅｎｔｉａ　ｓ　３７、第４４２−４４３頁（１９８１ 年）を参照］と比較することによって同定した。ジヒドロリンデラアズレン（１ ）の構造は、以下のスペクトルデータによって決定した：　ＨＲＥ　ＩＭＳ　ｍ ／ｚ　２１２．１２０２　（Ｃ１ｓ　Ｍｌ　６０２１２．１２０１に基づいて計 算した）　；　ＬＲＥ　ＩＭＳ　ｍ／ｚ　２１２（Ｍ＋　、ｔｏｏ　）、１９７ 　（６０）、１８２　（２２）、１６９　（１９）、１６５　（９）、１５４　 （１１）、１５３　（１１）、１．４１　（８）、１２８（８）、１１５　（８ ）　、および１０Ｂ　（１３ｒｃ１％）、Ｉ　Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）　 ６８．１０　（ＩＨ，ｓ）　、７．２６　（ＩＨ。

ｄ、　Ｊ−３，８１１ｚ”）　、７．１５　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ−３，８Ｈｚ）　 、Ｅｉ、６９（ＩＨ，ｓ）　、４．８９　（ＩＨＳｄｄ、Ｊ＝８．８．８．８　 Ｈｚ）　、４．１４（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ−８，８，８，８１ｉｚ）、８．７２（Ｉ Ｈ，ｍ）、２．７８（３Ｈ，ｓ）　、２．５７　（３Ｈ，ｓ）　、および１．４ ０　（３ＨＳ、　ｄ。

Ｊ　＝６．８　Ｈｚ）　；　’３Ｃ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）　１８６．２３ （ｓ）　、１４Ｇ、１４　（ｓ）　、１３４．１６　（ｓ）　、１３２Ｊ８　（ ｓ）　、１３１．９７　（ｄ）　、１２９．５４　（ｄ）　、１２６．７５　（ ｓ　）　、１２４．４７　（ｓ）、１１５．７４　（ｄ）　、１０９．５３　（ ｄ）、　７７．９３　（ｔ　）、　３９．９８（ｄ）、２４．４０　（Ｑ　）、 ２０．８８　（ｑ）　、および１２．８３　（ｑ）。１の構造は、そのＰｄ／Ｃ を用いた脱水素化により、リンデラアズレン（３）と同一の試料を生じることに よって確められた。

この発明の化合物の抗腫瘍活性 実施例の化合物１−３に相当する式１−ＩＩＩの化合物の抗腫瘍効果を説明する ために、以下の検定方法を用いた。

Ｐ３８８マウス白血病細胞検定 細胞系の維持 Ｐ３８８マウスの白血病細胞を、１０％のウマ血清、グルタミン４ｍＭ、および ゲンタマイシン（バイオロゴス社製）２０％ｇ／ｍを添加したデニルベッコ（Ｄ 　ｕｌｂｅｃｃｏ　）　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地で培養した。細胞は、ＣＯ２１０％中で インキュベートシ、毎週２回継代培養を行なった。

手　順 １．２４−ウェル・プレートの各ウェルまたはチューブに化合物を添加し、溶媒 を蒸発させて乾燥させる。

２、各ウェルまたはチューブに細胞２ｍ１（１，２Ｘ１０５　’）を添加し、混 合する。

３、Ｃ０２１０％中において、３７Ｃで、４８時間インキュベートする。

４、倒立顕微鏡を用いてプレートを読み取り、活性を以下のように１＋から４＋ まで評価する。即ち、対照増殖の〉９０％をＮＤ（検出不能）、７５〜９０％を １＋、５０〜７４％を２＋、２５〜４９％を３＋、＜２５％を４＋とする。代わ りに、プレート上の細胞の５０％の増殖を阻害するに必要な化合物の最少濃度を 表わす１Ｃ５ｏとして、評価は表現される。細胞の計数は各チューブごとに行な われ、結果は対照の百分率として報告される。

ヒト腫瘍細胞系の検定 細胞系の維持 ＨＣＴ−８１：：ト結ｍ腫瘍細胞をＲＰＭ１１Ｂ４０培地（ＧＩＢＣＯ）におい て増殖させた。Ａ３４９ヒト肺癌細胞をデュルベツコ培地（バイオロガス社製） において培養した。

すべての培地には１０％のウシ胎児血清を追加し、ゲンタマイシン５０ｕｇ／　 ｍＪ！を含有させた。すべてのヒト腫瘍細胞系はＣＯ２５％で３７でインキュベ ートし、週１回縫代培養した。

手　順 １、細胞（５０００ＨＣＴ−８，８０００Ａ　５４９．１２０００ＭＣＦ−７） １ｍｚを２４−ウェル・プレートの各ウェルに接種する。

２、ＣＯ２インキュベーターで４８時間インキュベートする。

３、各ウェルに化合物を添加し、さらに１２０時間インキュベートする。

４、培地を廃棄し、メチレンブルー（ＨＣＴ−８）またはクリスタルバイオレッ ｌ−（Ａ　５４９およびＭＣＦ　−７）を用いて染色する。

５、以下のようにして、薬物処理したつ；、ルの細胞密度を対照（薬物無添加） のウェルと比較する。その際、対照増殖の〉９０％はＮＤ（検出不能）とし、７ ５〜９０２６は１＋とじ、５０〜７４％は２＋とし、２５〜４９％は３＋とし、 ２５％を４＋と判定する。

溶液濃度　添加量　試験における最終濃度５　％／ｍｌ　２　ｕｌ　５　ｕｇ／ ｍＪ！１　１１！ｉ／ｉｆ　２　ｕｌ　１　ｕｇ／ｍｉＯ，１１ｒ３／Ｗ　２　 ｕｌ　Ｏ，１ｕｇ／Ｍヒト胸腺癌細胞、ＭＤＡ−＆ｉＢ、−２３１を用いた検定 は、実質的に前述の手順に従って行なった。

リンパ球混合反応（ＭＬＲ）検定 この検定法は、試料化合物１〜３に対応する式１〜ｍの化合物の免疫応答ｍｌ剤 を同定するために用いた。

ネズミリンパ球の調製 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスから無菌的に取り出した肺 臓を、別々に、１０％のウシ胎児の血清、２％のＬ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ１ ５ｍＭ、１％の抗生物質ないし抗真菌剤溶液およびゲンタマイシン（Ｇ　Ｉ　Ｂ ＣＯ）　２５υｇ／ＩＩＬｌを添加したＲＰＭ１１６４０培地とホモジネートし た。その後、赤血球の溶血および完全培地中での連続的な細胞洗浄の後、分画遠 心によってリンパ球を得た。細胞を等濃度（２，５Ｘ１０６細胞／ヒ）に調製し 、ネガティブコントロール用の一定量を除去した後、合体させた。細胞のインキ ュベーション条件は、３７℃で５％のＣＯ２，９５％の空気である。

手　順 １、組成物を９６−ウェル・プレートの各ウェルに添加し、水性でない場合には 、溶媒を蒸発させて乾燥させる。

２、各ウェルに混合リンパ球（ＢＡＬＢ／ｅ＋ｃ５７ＢＬ／　６）０．２ｇを添 加して混合する。

３、ＣＯ２５％において３７℃で８６時間インキュベ、−卜する。

５、Ｃｏ２５％において３７℃で６時間インキュベートする。

６、プレートを回収し、フィルター板を有する各バイアルに蛍光溶液（ｓｃｉｎ ｔｉｌｌａｎｔ　）　２ｇｇを添加する。

７、液体シンチレーションカウンター（ベックマン）中でバイアルの計数を行な う。

８、繰り返し行なった計数の平均をとり、データをポジティブコントロールにつ いての百分率として記録する。免疫促進効果の基準は、培地中の混合リンパ球に 対する上述のコントロールの値の１５０％以上の値である。

この発明の化合物の抗真菌活性 以下の検定法は、第３表に示したこの発明の実施例の化合物１−３に相当する式 Ｉ−ｍの化合物の工１　ｖｌｔｒｏにおける抗真菌効果を説明するために用いた 。

ローデキストロース寒天上で増殖させて単独のコロニーを形成させ、その１つを サブローデキストロースブロスへの接種に用いた。ブロスを２０Ｏｒｐｍで振と うさせながら３７℃で１８時間インキュベートし、得られた培養株を１０％（容 量／容量）グリセリンと共に一８０Ｃで冷凍して抗カンジダ検定についての接種 物として使用した。

Ｃ，アルビカンスを、細胞密度が約１０００細胞／　ｍ　Ｍとなるように、溶け たサブローデキストロース寒天中に４５℃で接種した。１０α×１０Ｇのペトリ 皿に、接種した寒天を用いたプレートを調製した。これらのプレートを検定に必 要となるまで４℃で貯蔵した。

ベイパーディスク（６，３５ｍ＋＋＋）に試験物質をしみ込ませ、乾燥させた。

その後、それらを上述したように調製した試験プレートの表面に置いた。プレー トを３７℃で一晩インキユベートした。この後には、増殖阻害領域を読み取るこ とが可能であり、これらはミリメートルで表わした領域の直径として表現した。

２、最少阻害濃度（ＭＩＣ） ９６−ウェル微小滴定プレートを用いて、容積５０μＬのサブローデキストロー スブロス中において薬物の２倍希釈液を調製した。Ｃ，アルビカンスの接種物を 、約１０００細胞／ｇの細胞密度となるように小容量を添加した。プレートを３ ７℃で一晩インキユベートした。その後、塩化トリフェニルテトラゾリウム（１ ％重量／容量）１０μＬを各ウェルに添加した；さらに２時間インキュベートシ た結果、微生物が深く着色された。ＭＩ　Ｃは、完全に増殖を阻害する薬物の最 少濃度である。

上述の検定の結果は第３表にまとめた。

第　１　表 ５　ＮＤ　ＮＤ　３＋ ｌ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＤ グアイアズレン　３５　５０　４＋　４＋　４＋ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ リンデラアズレン　５０　５０　４＋　４＋　４＋Ｉ　ＮＴ　ＮＤ　ＮＤ 化合物（１）　５０　１ 化合物（２）　５０　３５１ 化合物（３）　５０　．１９ Ｃ，アルビカンスＭ　Ｉ　Ｃ（ｕｇ／ａｆ）化合物（１１，５０ 化合物（２）　２５ 化合物（３）　１２．５ 第１−３表に与えられたデータは、抗腫瘍、免疫調整および抗真菌剤としての式 １−Ｉ１１の化合物のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける効果を記録している。これらの 結果は、これらの化合物が、温血動物を含む宿主もしくは噴孔動物の宿主に関し て、１ｎｖｉｔｒｏで腫瘍および真菌の増殖または免疫応答の調整に有効である ことを示している。

この発明の範囲は、ここでの記述、実施例および示唆された用途によって限定さ れるものではなく、この発明の精神から離れることなく修正を加えることが可能 である。この発明は、この発明の修正物として、かつ発明の範囲内で、式Ｉの化 合物の誘導体を意図するものである。例えば、上述の好ましい態様と類似の抗腫 瘍、免疫調整もしくは抗真菌活性を有する、化合物１のハロゲンまたはスルホニ ル置換誘導体のような実施例１の化合物の他の誘導体が調製されることが挙げら れる。さらに、ここに記載した化合物は、例えば、鎮痛薬としての使用または他 の化合物の調製のための出発物質のような他の有益な適用を有する。この発明の 化合物の治療における使用は、現在もしくは将来当業者に公知の適切な治療法お よび技術によって達成することができる。したがって、この発明は、それらがか かる特許請求の範囲の領域およびそれらの均等物であるという条件で、この発明 の修正体および変形体を包含することを意図するものである。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次式に示される化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または相互に異なる置換基であって、夫々水 素または低級アルキル基を示す。 （２）Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は、夫々がメチル基である請求項第１項に記載の化 合物。 （３）低級アルキル基が１〜１０個の炭素原子を有する、請求項第１項に記載の 化合物。 （４）実質的に純粋である、請求項第１項に記載の化合物。 （５）活性成分として、請求項第１項に記載の化合物の一種以上を抗腫瘍剤とし て有効な量だけ含み、且つ毒性のない調剤的に許容され得るキャリア又は稀釈剤 を含む抗腫瘍剤組成物。 （６）活性成分として、請求項第１項に記載の化合物の一種以上を免疫調節剤と して有効な量だけ含み、且つ毒性のない調剤的に許容され得るキャリア又は稀釈 剤を含む免疫調節剤組成物。 （７）活性成分として、請求項第１項に記載の化合物の一種以上を抗真菌剤とし て有効な量だけ含み、且つ毒性のない調剤的に許容され得るキャリア又は稀釈剤 を含む抗真菌剤組成物。 （８）腫瘍を、抗腫瘍剤として有効な量の次式に示す化合物の一種以上と接触さ せることを含む、宿主中の腫瘍を抑制する方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、表等があります▼；ｏｒ ▲数式、化学式、表等があります▼； 但し、Ｒ１〜Ｒ５は同一または相互に異なる置換基であって、夫々水素または低 級アルキル基を示す。 （９）腫瘍を、抗腫瘍剤として有効な量の請求項第１項に記載の化合物の一種以 上と接触させることを含む、宿主中の腫瘍を抑制する方法。 （１０）腫瘍を、抗腫瘍剤として有効な量の請求項第８項に記載の化合物の一種 以上と接触させることを含む、哺乳類宿主中の腫瘍を抑制する方法。 （１１）調節部位を、免疫調節剤として有効な量の請求項第８項に記載の化合物 の一種以上と接触させることを含む、免疫調節方法。 （１２）調節部位に、免疫調節剤として有効な量の請求項第１項に記載の化合物 の一種以上を適用することを含む、免疫調節方法。 （１３）調節部位に、免疫調節剤として有効な量の請求項第８項に記載の化合物 の一種以上を適用することを含む、哺乳類宿主における免疫調節方法。 （１４）真菌類を、抗真菌剤として有効な量の請求項第８項に記載の化合物の一 種以上と接触させることを含む、真菌類の成長を抑制する方法。 （１５）真菌類を、抗真菌剤として有効な量の請求項第１項に記載の化合物の一 種以上と接触させることを含む、哺乳類宿主中の真菌類の成長を抑制する方法。 （１６）真菌類を、抗真菌剤として有効な量の請求項第８項に記載の化合物の一 種以上と接触させることを含む、哺乳類宿主中の真菌類の成長を抑制する方法。 （１８）海洋ゴルゴニアン属のアカリチゴルギア種（ｍａｒｉｎｅｇｏｒｇｏｎ ｉａｎ　ｇｅｎｕｓ　Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉａ，ｓｐ．）を収集する工程と 、該ゴルゴニアンを所定の有機溶媒に接触させる工程と、前記ゴルゴニアンの溶 媒抽出液を得る工程と、該の抽出液を分画する工程と、該分画された抽出液から 請求項第８項に記載の化合物を分離する工程とを含む、請求項第８項に記載の化 合物の製造方法。 （１９）海洋ゴルゴニアン属のアカリチゴルギア種（ｍａｒｉｎｅｇｏｒｇｏｎ ｉａｎ　ｇｅｎｕｓ　Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉａ，ｓｐ．）を収集する工程と 、該ゴルゴニアンを所定の有機溶媒に接触させる工程と、前記ゴルゴニアンの溶 媒抽出液を得る工程と、該の抽出液を分画する工程と、該分画された抽出液から 請求項第１項に記載の化合物を分離する工程とを含む、請求項第１項に記載の化 合物の製造方法。 （２０）腫瘍細胞を、抗腫瘍剤として有効な量の請求項第８項に記載の化合物の 一種以上と接触させることを含む、宿主中に存在する腫瘍細胞によって引起され る癌性悪液質の治療方法。 （２１）腫瘍細胞を、抗腫瘍剤として有効な量の請求項第１項に記載の化合物の 一種以上と接触させることを含む、宿主中に存在する腫瘍細胞によって引起され る癌性悪液質の治療方法。