KR20030030332A

KR20030030332A - 우묵사스레피의 추출물을 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20030030332A
Application number: KR1020010062203A
Authority: KR
Inventors: 강희경; 박수영; 이남호; 양홍철; 유은숙; 김상철; 이혜자
Original assignee: 제주대학교
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2003-04-18

Abstract

본 발명은 우묵사스레피(Eurya emarginata) 잎으로부터 얻은 항암효과를 갖는 추출물 및 이를 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로 본 발명의 추출물은 우묵사스레피의 잎을 유기용매로 추출하여 얻을 수 있으며 암세포의 아폽토시스를 유도함으로써 항암효과를 나타낸다.

Description

우묵사스레피의 추출물을 포함하는 항암용 조성물{ANTI-CANCER COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT OF EURYA EMARGINATA}

최근 식생활 습관의 변화와 환경오염 등으로 암 환자의 수가 전 세계적으로 계속 증가하고 있어 효과적인 치료법이 절실히 요망되고 있다. 이러한 암 질환의 치료를 위하여 수술요법, 방사선요법 및 항암 화학요법이 주로 사용되고 있다(Ahn B. Z. 등,J. Kor. Cancer Assoc.,24, 795(1992), Kim J. H. 등,J. Kor. cancer Assoc.,25, 225(1993)). 항암 화학요법의 이용으로 암 치료 효과가 많이 개선된 것은 사실이나 지금까지의 치료 성적에 비추어 볼 때 만족할 만한 치료효과를 얻기에는 한계에 이르렀다고 할 수 있다. 항암 화학요법 한계성의 주된 원인은 현재 사용되고 있는 모든 항암제가 암세포와 정상세포에 대한 선별력이 부족하여 암세포의 완전제거를 위해 대량 투여하였을 때 정상세포에도 독성을 유발한다는 점이다(Parker S. L. 등,Cancer J.Clin., 46, 5(1996); Bailer J. C. and Gorrick H. L.,N. Eng.J. Med., 336, 1569(1997); Astrow A. B.,The LANCET, 343, 494(1994)).

항암 화학요법의 한계를 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 오랫동안 사용되고 있는 천연물에서 항암물질을 찾으려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 유럽에서는 만성적 코감기, 관절통, 습관성 유산 등에 민간에서 오랫동안 사용되고 있는 겨우살이(Viscum album)의 추출물을 종양치료에 사용하는 것을 시도하고 있으며, 폐종양, 유방암, 대장암 등에서 항암효과를 나타낸다고 보고되어 있다(Khwaja T. A. 등,Oncology,43 ,42-50(1986); Kuttan G., 등,Carcinogenesis, 17 ,1107-1109(1996); Antony S. 등,J. Exp. Clin. Cancer Res.,16, 159-162(1997)). 또한, 천식성 기침 및 변비 등에 민간에서 사용하고 있는 행인(살구나무 씨)의 주 성분인 아미그달린(Amygdalin)도 림프구 백혈병(lymphocytic leukemia)과 비만세포 백혈병(mast-cell leukemia) 등에서 항암효과가 있음이 입증되었다(Chitnis M. P. 등,J. Cancer Res. Clin. Oncol.,109, 208-209(1985)). 이미 주목나무에서 유래된 택솔(taxol)은 임상에서 많이 사용되고 있다(Nicolaou K. C. 등,Nature, 364(6436), 464-466(1993)). 녹차잎 등에서 얻어지는 페놀 화합물인 EGCG((-)-epigallocatechin gallate)는 피부, 폐, 위장관, 간, 췌장 등에서의 발암을 효과적으로 억제하는 발암 예방의 효과가 탁월하다는 것이 알려져 있다(Fujita Y. 등,Jpn. J. Cancer Res.,80 ,503-505(1989); Wang Z. Y. 등,Mutat. Res.,223, 273-285(1989); Xu Y. 등,Cancer Res.,52, 3875-3879(1992); Yang C. S. and Wang Z. Y.,Natl. Cancer Inst.,85, 1038-1049(1993); Wang Z. Y. 등,Cancer Res.,54, 3428-3435(1994)). 그리고 평지과 식물에서 얻을 수 있는 이소티오시안산염(isothiocyanate)과 마늘에 함유되어 있는 디알릴 황화물(diallyl sulfide)의 항암효과 및 작용에 대한 연구결과가 보고되어 있다(Yang C. S. 등,Cancer Res., 54,1982s-1986s(1994)).

아폽토시스(apoptosis)는 생명체의 정상적인 생명유지와 발생과정에 필수적이며, 병리학적인 요인에 의한 세포의 죽음인 괴사에 비하여 다양한 세포내의 인자들에 의한 신호전달과정을 통한 능동적인 세포 자멸현상이다(Nagata S.,Cell, 88,355-365(1997); Barr P. J. and Tomei L. D.,Biotechnology, 12,487-493(1994); Ellis R. E. 등,Ann. Rev. cell Bio., 7,663-698(1991); Raff M. C.,Nature,365,397-400(1992)). 특히 아폽토시스는 개체 발생과정에서의 정상적인 조절, 조직의 항상성 유지에 중요한데(Barr P. J. and Tomei L. D.,Biotechnology, 12,487-493(1994)), 아폽토시스가 일어난 세포에서 볼 수 있는 가장 특징적인 변화로서 형태학적으로 크기가 축소되며, 핵의 응집과 DNA의 단편화가 나타난다(Ellis R. E. 등,Ann Rev cell Bio., 7,663-698(1991); Gaido M. I. and Cidlowski J. A.,J. Biol. Chem., 226, 18580-18585(1991)).

본 발명자들은 민간에서 오랫동안 사용되고 있는 천연물로부터 새로운 항암성분을 얻고자 연구를 계속하던 중 우묵사스레피 추출물이 우수한 항암효과를 나타냄을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 우묵사스레피는 제주도와 같은 도서지역의 해안산지에서만 자생하는 식물로 민간에서 그 잎을 거담 및 이뇨의 목적으로 사용하고 있다. 그러나, 그 잎의 성분 및 생리활성에 관한 보고는 미미한 실정이며(Kahn I. A. 등,J. Nat. Prod., 55,1270-1274(1992)), 특히 우묵사스레피의 종양 증식 억제효과에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.

본 발명의 목적은 종양 증식 억제효과를 갖는 우묵사스레피 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 우묵사스레피 추출물을 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 용매 분획화와 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 우묵사스레피 추출물을 얻기 위한 방법의 모식도를 나타낸 것이고,

도 2는 우묵사스레피 추출물의 HL-60 세포 성장에 대한 억제효과를 나타낸 것이고,

도 3은 우묵사스레피 에틸아세테이트 추출물 및 이로부터 분리된 각 분획의 HL-60 세포 성장에 대한 억제효과를 나타낸 것이고,

도 4는 HL-60 세포에서 우묵사스레피 추출물에 의한 DNA 단편화를 나타낸 것이고,

도 5는 우묵사스레피의 에틸아세테이트 추출물이 HL-60 세포의 성장에 미치는 억제효과를 형태학적으로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 6은 우묵사스레피 추출물의 세포주기에 대한 효과를 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 종양 증식 억제효과를 갖는 우묵사스레피의 유기용매 추출물이 제공된다.

본 발명의 우묵사스레피 추출물은 우묵사스레피, 바람직하게는 우묵사스레피의 잎을 유기용매로 추출하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 우묵사스레피 추출물은 우묵사스레피의 잎에 2배 내지 20배, 바람직하게는 10배의 유기용매를 가하고, 15 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 25 ℃에서 10시간 내지 48시간, 바람직하게는 20시간 내지 30시간 동안 추출한 후에, 이를 통상의 방법에 따라 여과, 농축 및 건조하여 얻을 수 있다.

본 발명에 사용 가능한 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물을 예시할 수 있으며, 메탄올 및 에틸아세테이트가 바람직하다.

특히, 건조한 우묵사스레피 잎을 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻은 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 얻어지고 EtOAc/MeOH(10:1 v/v)을 전개용매로 한 박층 크로마토그래피에서 Rf치가 0.45 내지 0.23인 분획이 바람직하다.

본 발명의 우묵사스레피 추출물은 암세포의 아폽토시스를 유도하여 세포의 크기 축소, 핵내 크로마틴의 응집 및 크로마틴 DNA의 단편화 등의 변화를 일으켜 세포 증식 억제효과를 나타낸다.

따라서, 우묵사스레피의 추출물을 포함하는 약학 조성물은 각종 암, 특히 골수성 백혈병의 예방 및 치료제로서 매우 유용하다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분인 우묵사스레피 추출물만으로 구성될 수 있으나, 기타의 약제학적 담체, 부형제 및 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 또한, 목적에 따라 다른 활성성분과 혼합하여 효과를 증진시킬 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 임상적으로 투여시에 약제학적으로 허용되는 담체와 우묵사스레피 추출물을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일수 있으며 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 중의 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물로부터 제조되는 제제의 예로는 정제, 환제, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 우묵사스레피 추출물의 통상적인 1일 투여량은 10 내지 60 mg/kg 체중, 바람직하게는 30 내지 40 mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

참조예 1: 항암활성 측정

(단계 1) 세포배양

급성 전골수성 백혈병 환자의 혈액에서 유래한 HL-60 세포주(한국세포주은행(KCLB) 기탁번호 10240)를 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 및 10 % 우(牛)태아혈청(FBS)을 함유한 RPMI 1640배지에 접종하여 37 ℃로 5 % CO₂항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 내지 4일에 한번씩 시행하였다.

(단계 2) 항암활성 측정

HL-60 세포를 3 × 10⁵세포/㎖의 농도로 96 웰 플레이트(96 well plate)의 각 웰에 넣고, 시료를 각각 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 이를 37 ℃에서 4일간 배양한 다음, 각 웰에 2 ㎎/㎖의 3-(4,5-디메틸티아졸)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT, 시그마) 50 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 더 배양하였다. 플레이트를 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide(DMSO), 시그마) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔(formazan) 침전물을 용해시킨 후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, Cat. No.:ELX 800, BIO-TEK, 미국)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값과 추출물을 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값을 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.

실시예: 우묵사스레피 추출물의 제조

제주도에 자생하고 있는 우묵사스레피의 잎을 채집하여 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료 175.8 g에 80 % 메탄올 2 ℓ를 가한 후 상온에서 24시간 동안 교반하였으며, 진공여과에 의해 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모으고 감압농축하였다. 농축한 메탄올 추출물 58.210 g을 물 1 ℓ에 현탁시킨 후에 헥산(1 ℓ×3), 에틸아세테이트(1 ℓ×3), 부탄올(1 ℓ×3)로 각각 추출하여 각각의 분획을 진공건조하였다. 이들 추출물 분획 중에서 참조예의 방법으로 조사하여 항암활성이 높게 나타난 에틸아세테이트 추출물 분획 9.976 g을 10 ㎖의 EtOAc에 용해시킨 후 실리카 겔(Kiesel gel 60)을 이용한 컬럼 크로마토그래피(컬럼 크기: 3 ×25 cm, 용출액: EtOAc/MeOH(10:1 v/v), 유속: 10 ㎖/분)로 분리하였으며, 동시에 동일용매로 TLC를 실시하여 TLC 상의 스팟(spot)의 Rf치 약 0.1 간격으로 8개의 분획을 분리하였다. 각 분획의 Rf치는 각각 분획 1은 0.81, 분획 2는 O.74, 분획 3은 0.45, 분획 4는 0.33, 분획5는 0.23, 분획 6은 0.15, 분획 7은 0.1 및 분획 8은 0.09이었다. 이상의 과정을도 1에 나타내었다.

여기서 얻은 각각의 분획물을 이용하여 다음과 같이 항암효과를 검색하고 항암기전을 밝혔다.

시험예 1: 우묵사스레피 추출물의 암세포 증식 억제효과

실시예에서 얻은 우묵사스레피의 각 추출물 및 추출분획을 이용하여 참조예의 방법으로 암세포 증식 억제효과를 확인하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 80 % 메탄올 추출물 처리에 의해 HL-60 세포의 증식이 66 % 저해됨을 관찰할 수 있었으며, 용매극성에 따른 분획물 중에서는 에틸아세테이트 추출물을 처리한 HL-60 세포의 성장증식이 75 % 억제된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 헥산 추출물, 부탄올 추출물 및 수용액 분획물을 처리한 HL-60 세포에서는 세포증식 억제효과가 크지 않았다.

한편, 에틸아세테이트 추출물로부터 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻은 8개의 하위 분획물의 HL-60 세포 증식 억제정도는도 3에 나타냈으며, 특히, A3, A4, A5의 하위 분획물에서 HL-60 혈액종양 세포의 증식이 80 % 이상 저해되었다.

시험예 2: DNA 단편화 검색

우묵사스레피 추출물의 항암효과가 아폽토시스 유도에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 아폽토시스가 유도되어 크로마틴의 고차 구조가 바뀐 뒤 크로마틴 DNA가 엔도뉴클리아제에 의해 100 내지 200 bp로 절단되는 DNA 단편화 현상이 우묵사스레피 추출물 처리에 의해 나타나는지 조사하였다.

HL-60 세포(3 × 10⁶세포/㎖)에 100 ㎍/㎖의 농도로 우묵사스레피 추출물을 가한 다음 37 ℃에서 12시간 동안 배양하였다. 세포를 수확한 후 프로메가 위저드^R지노믹 DNA 정제 키트(Promega Wizard^RGenomic DNA Purification Kit)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.5 % 아가로스 겔에서 50 V로 4시간 동안 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator, 제작사: Spectroline, 미국)를 이용하여 DNA 단편화 현상을 관찰하였다. 그 결과, 우묵사스레피 잎의 80 % 메탄올 추출물에서 DNA 단편을 관찰할 수 있었으며, 메탄올 추출물의 용매 분획화에 따른 각 추출물 중에서는 에틸아세테이트 추출물 처리에 의한 DNA 단편화 현상이 가장 뚜렷하게 관찰되었다(도 4).

시험예 3: 핵의 형태학적 변화

HL-60 세포(3 × 10⁶세포/㎖)에 100 ㎍/㎖의 농도로 우묵사스레피 추출물을 가한 다음 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 포스페이트 완충식염수(phosphate-buffered saline(PBS))용액으로 2회 세척한 후에, 2 × 10⁶개의 세포에 2 % 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 1 ㎖를 가하여 실온에서 1시간 동안 고정하였다. 세포를 고정시킨 다음, PBS로 2회 세척하고 2.5 ㎍/㎖의 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 시그마) 용액을 가하여 상온 암 조건하에서 30분간 염색하였다. 이를 다시 PBS로 2회 세척한 후 형광 현미경하에서 핵의 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과도 5에서 보는 바와 같이 우묵사스레피의 추출물을 처리하지 않은 HL-60 세포의 핵은 정상적인 둥근 형태를 갖추고 있으나, DNA의 단편화 현상이 명확히 관찰되었던 우묵사스레피의 에틸아세테이트 추출물로 처리한 HL-60 세포의 핵은 아주 밝은 초승달 또는 작은 구슬같은 형태로 관찰되었다. 이 같은 결과는 우묵사스레피의 에틸아세테이트 추출물 처리에 의해 HL-60 세포핵의 크로마틴이 고도로 응축되었다는 것을 나타내며, 우묵사스레피의 에틸아세테이트 추출물 처리에 의하여 HL-60 세포의 아폽토시스가 유도됨을 알 수 있다.

시험예 4: 세포주기 분석

HL-60 세포(3 × 10⁶세포/㎖)에 100 ㎍/㎖의 농도로 우묵사스레피 추출물을 가한 다음 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 PBS로 2회 세척한 다음, 1 × 10⁷개의 세포를 70% MeOH로 -20 ℃에서 1시간 동안 고정하였다. 세포를 다시 PBS로 세척하고, PBS 1 ㎖에 녹인 RNase 100ug을 가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음에 요오드화 프로피디움(propidium iodide)을 50 ㎍/㎖ 농도로 가하여 염색하였다. 30분 후 FACScan 유동 세포계수기(flow cytometer (Coulter EPICS-XL, 미국))를 이용하여 세포주기를 분석하였으며, 우묵사스레피 추출물 처리에 의한 아폽토시스 유도여부를 조사하였다. 그 결과도 6에서 보는 것과 같이 우묵사스레피의 80% 메탄올 추출물과 그의 에틸아세테이트 추출물 및 그의 하위 분획(A3)의 처리에 의하여 사멸된 세포의 비율이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과들로부터 제주 자생식물인 우묵사스레피의 잎이 급성 전골수성 백혈병 세포인 HL-60 세포의 성장을 강력하게 저해하며, 그 같은 증식 억제 효과는 HL-60 세포의 아폽토시스 유도에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 우묵사스레피 추출물은 암세포의 아폽토시스를 유도함으로써 성장을 저해하므로 독성이 적고 우수한 효과를 나타내는 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

우묵사스레피(Eurya emarginata)의 잎을 유기용매로 추출하여 제조되고 항암활성을 갖는 우묵사스레피 추출물.
제 1항에 있어서,

상기 유기용매가 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 추출물.
제 1항에 있어서,

건조한 우묵사스레피 잎을 분말화한 후 메탄올에 침적하고 상온에서 20시간 내지 30시간 동안 교반한 후 상층액을 여과 및 감압 농축하여 얻은 것임을 특징으로 하는 추출물.
제 1항에 있어서,

건조한 우묵사스레피 잎을 에틸아세테이트에 침적하고 상온에서 20시간 내지 30시간 동안 교반한 후 상층액을 여과 및 감압 농축하여 얻은 것임을 특징으로 하는 추출물.
제 1항에 있어서,

건조한 우묵사스레피 잎을 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻은 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 얻어지고 EtOAc/MeOH(10:1 v/v)을 전개용매로 한 박층크로마토그라피에서 Rf치가 0.45 내지 0.23인 분획임을 특징으로 하는 추출물.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항의 추출물을 포함하는 항암용 조성물.
제 6항에 있어서,

골수성 백혈병 치료효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.