KR101018765B1 - 부추에서 추출한 항암 효과를 갖는 조성물 및 추출 방법 - Google Patents
부추에서 추출한 항암 효과를 갖는 조성물 및 추출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 항암 효과를 갖는 부추 추출물로서 티오설피네이트 성분으로 이루어진 부추 추출물, 이 부추 추출물을 유효 성분으로 함유하는 약리적 조성물 또는 건강식품 및 이 부추 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 비교적 간단한 방법으로 항암 효과를 갖는 부추 추출물을 얻을 수 있어서 암 또는 종양의 치료 및 예방에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
부추(Allium tuberosum L.), 항암 효과, 티오설피네이트(Thiosulfinate), 세포계획사(apoptosis)
Description
본 발명은 부추 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특히 전립선암과 같은 암세포에 대하여 항-종양 효과를 갖는 부추 추출물, 이 부추 추출물을 얻는 방법 및 이 부추 추출물을 유효 성분으로 포함하는 약리적 조성물에 관한 것이다.
최근 노령 인구의 급증 및 생활환경의 악화 등으로 인하여 암 환자의 수가 증가하고 있다. 특히 국내에서는 서구식 식생활로의 전환 등에 따라 위암 및 간암은 물론이고 대장암 및 전립선암 등이 급속하게 증가하고 있다.
일반적으로 항암 치료를 위해서는 외과적 수술 외에도 화학 요법, 생물학적 요법 등이 널리 채택되고 있으나 많은 부작용이 노출되고 있어서 최근에는 식물 또는 미생물로부터 항암 효과를 갖는 추출물을 이용하는 연구가 진행되고 있으나 그 응용에 있어서는 여전히 많은 한계를 가지고 있는 실정이다. 예를 들어 화학 요법의 경우에는 암세포뿐만 아니라 주변 세포를 함께 사멸시키는 문제가 있고 생물학 적 요법의 경우에도 그 응용 범위가 제한되어 있기 때문이다.
한편, 부추(Korean Leek)는 백합과에 속하는 다년생 초본으로 미국, 유럽, 중국, 일본 및 한국을 비롯한 다양한 국가에서 식용으로 많이 소모되고 있다. 특히 한국에서 널리 서식하고 있는 부추(Allium tuberosum L.)의 경우 부추전, 부추김치 등과 같은 식용은 물론이고 향신용 재료로 이용되었다. 특히, 부추는 한방에서 비뇨기성 질환과 건위를 치료하기 위해서 사용되었으며 기양초라 하여 강장제로도 널리 사용되었을 뿐만 아니라, 복통, 설사, 토혈(hematemesis), 천식(asthma) 등의 치료를 위한 민간요법으로 널리 사용되었다. 그러나, 이와 같이 부추가 갖는 다양한 생물학적 활성에도 불구하고 부추가 갖는 항암 효과에 대해서는 거의 연구가 진행되지 못하였을 뿐만 아니라 그 생물학적 기작에 대한 연구는 불분명하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 부추가 갖는 생물학적 활성 내지는 기능 중에서 특히 항암 작용과 관련이 있는 물질을 확인하고 그 생물학적 기작을 규명함으로써 이를 산업적으로 응용하고자 하는데 있다.
즉, 본 발명의 목적은 특히 전립선암을 포함하여 항암 효과를 갖는 부추 추출물, 이를 유효성분으로 함유하는 약리적 조성물 및 항암 효과를 갖는 성분을 추출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 통해서 더욱 분명해질 것이다.
상기와 같은 목적을 갖는 본 발명에 따르면, 항암 효과를 갖는 부추 추출물로서, 티오설피네이트 화합물을 포함하고 있는 부추 추출물이 제공된다.
이때, 상기 티오설피네이트 화합물은 S-메틸 메탄티오설피네이트, S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하고, 상기 부추 추출물은 유방암 세포, 간암 세포, 전립선암 세포, 육종암 종양 세포, 대장암 세포의 세포계획사를 유도하는 것을 특징으로 한다.
한편, 바람직하게는 상기 부추 추출물은 다른 조직으로 전이된 전립선 암세 포 및 다른 조직으로 전이되지 않은 전립선 암세포의 세포계획사를 유도하는 것을 특징으로 한다. 특히 바람직하게는 상기 부추 추출물은 Allium tuberosum L.로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 관점에서는 상술한 티오설피네이트를 함유하는 부추 추출물과; 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하고 있는 항암 효과를 갖는 조성물이 제공된다. 이때, 상기 부추 추출물은 상기 조성물 전체에 대하여 1 ~ 1000 ㎍/㎖의 농도로 함유될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 항암 효과를 갖는 부추 추출물을 제조하는 방법으로서, 디클로로메탄을 사용하여 절단된 부추로부터 조추출물을 얻는 단계; 상기 조추출물을 유기용매와 수용액을 사용하여 여과시키는 단계; 상기 유기용매에 함유되어 있는 상기 조추출물을 크로마토그래피를 통하여 분리하여 티오설피네이트 화합물로 이루어진 정제된 추출물을 얻는 단계를 포함하는 항암 효과를 갖는 부추 추출물을 제조하는 방법이 제공된다.
이때, 상기 유기용매는 디클로로메탄이며, 상기 수용액에는 아세트산염이 용해되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 정제된 추출물을 얻는 단계에서 상기 유기용매에 함유되어 있는 상기 조추출물은 디클로로메탄-헥산이 2:1 내지 4:1의 비율로 혼합된 분획 용매에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 특히 전립선암을 비롯하여 다양한 암 세포에 대하여 세포계획 사(apoptosis)를 유도하여 항-종양 효과 내지는 항암 효과를 갖는 부추 추출물을 얻을 수 있었다.
특히, 본 발명에서는 비교적 간단한 분리 방법을 사용하여 얻은 분획 성분에 항암 효과가 탁월한 성분만으로 실질적으로 구성되었음을 알 수 있었다.
따라서 이 부추 추출물을 유효 성분으로 하고 적절한 담체와 함께 사용하면 건강식품으로서는 물론이고 항암 효과를 갖는 약리적 조성물로도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 부추가 가지는 다양한 생물학적 기능을 연구하던 중 특정한 방법에 의하여 얻어진 추출 성분이 다양한 암 세포의 세포계획사를 유도하는 등 항-종양 효과 내지는 항암 효과를 가지고 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따라 항암 효과를 갖는 부추 추출물을 얻는 과정에 대해서 도 1을 참조하여 설명한다.
도 1에 도시된 것과 같이, 우선 시중에서 용이하게 구입할 수 있는 부추 중에서 특히 뿌리를 제외한 지상 부분(aerial parts)을 미세하게 절단한 뒤 유기용매를 사용하여 조추출물을 얻는다. 본 발명에 따라 부추로부터 항암 효과를 갖는 추출물을 얻기 위하여 사용될 수 있는 유기용매로는 예를 들어 디클로로메탄을 들 수 있다. 본 발명에 따라 확인한 바에 따르면 디클로로메탄을 사용하여 얻어진 조추출 물에도 티오설피네이트 성분이 포함되어 있는데, 얻어진 조추출물은 적절한 유기용매와 수용액의 혼합 용액에 넣어 여과시킨다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 조추출물을 얻기 위하여 유기용매로는 디클로로메탄을 사용할 수 있으며, 수용액은 증류수 또는 적절한 유기염, 예를 들어 아세트산납과 같은 아세트산염이 용해된 것을 사용할 수 있다. 이때, 유기층과 수용액 층에 잔존하는 성분이 각각 여과된 뒤에 수용액 층에 잔류하는 성분은 다시 디클로로메탄을 사용하여 추출되어 동일한 과정이 반복될 수 있다.
한편, 유기층에 잔류하는 성분은 세척 및 건조 과정을 거친 뒤 농축하여 크로마토그래피에 사용될 수 있도록 만들어진다. 특히 항암 효과를 갖는 성분을 얻기 위해서 농축된 조추출물은 디클로로메탄-헥산의 함유량을 달리하는 연속적인 구배를 통하여 칼럼 크로마토그래피에서 각각의 성분으로 분획될 수 있고, 그 중에서 옅은 황색 오일 형태를 갖는 추출물을 얻을 수 있다. 바람직하게는 칼럼 크로마토그래피를 통하여 항암 효과를 얻는 정제된 성분을 얻기 위해서 디클로로메탄-헥산이 5:1 ~ 10:1의 비율로 충전한 뒤, 이동상으로는 디클로로메탄-헥산을 1:1 ~ 10:1, 바람직하게는 2:1 내지 4:1의 비율로 혼합된 용출 용매(elution solvent)를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에 따라 분획된 추출물을 질량 분석기 등을 통하여 분석한 결과 하기 화학식 1의 S-메틸 메탄티오설피네이트(S-methyl methane thiosulfinate) 및 화학식 2의 S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트(S-methyl 2-propene-1-thiosulfinate)와 같은 티오설피네이트 유도체 성분이 함유되었음을 확인하였다.
화학식 1
화학식 2
일반적으로 부추 성분에 포함되는 티오설피네이트(thiosulfinate)는 S-알킬-시스텐 설폭사이드(S-alkyl-cystene sulfoxide) 또는 S-알케닐-시스텐 설폭사이드(S-alkenyl-cystene sulfoxide)가 효소에 의하여 분해되어 생성되는 불안정한 물질로서, 일반적으로 부추에는 다양한 티오설피테이트 성분이 함유되어 있으며 상기 화학식 1의 성분이 대략 73%, 화학식 2의 성분이 9% 가량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 종래 티오설피네이트만을 분리하기 위한 노력에도 불구하고, 기체 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS)에 따르면 티오설피네이트의 약한 황-황(S-S) 결합에 의한 높은 반응성으로 인하여 기체 크로마토그래피에 의하여 분석된 화합물은 인공적일 수 있었으며, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 의한 경우에는 잔류 시간의 변화 및 휘발성 화합물의 분석에서의 문제점 등으로 인하여 분석의 신뢰성이 문제가 되었다.
특히, 본 발명에 따른 추출 방법을 통하여 최종적으로 정제된 부추 추출물 에는 다른 티오설피네이트계의 화합물이 함유되어 있지 않으며 화학식 1 및 화학식 2의 성분이 주요 성분으로 함유되어 있다는 점은 특이할 만한 사실이다. 즉, 본 발명에서는 비교적 간단한 방법을 사용하면서도 부추에 다량 함유되어 있는 티오설피네이트 성분으로 이루어진 정제된 추출 성분을 얻었으며, 이들 정제된 추출 성분이 세포계획사를 유도하는 것은 물론이고 종양 세포로 접종된 생명체의 생존 시간을 연장시키는 등 생체 외에서는 물론이고 생체 내에서도 항-종양 효과 내지는 항암 효과를 갖는다는 점을 확인하였다.
일반적으로, 유전적 질병으로서의 암(cancer)은 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이로 인하여 정상적인 조건에서도 지속적인 세포 성장 및 세포 분열을 야기하는 원발암유전자(proto-oncogene)의 활성이 억제되지 못하여 정상 세포가 암 세포로 분화되기 때문인 것으로 알려져 있다. 이러한 원발암유전자는 제어되지 않은 세포 분열을 위하여 세포들 사이에 시그널을 교환하는 호르몬을 생성하고, 이러한 호르몬은 특정 유전자의 전사 수준을 조절함으로써 단백질의 발현에 관여하는 분열촉진물질(mitogen)의 합성을 유도하는 등의 방법으로 암세포로 진화된다. 이 과정에서 원발암유전자는 종양유전자(oncogene)로 변화되어 세포가 비정상적이고 제어되지 못한 채로 분열하여 암세포로 전환된다. 또는 DNA 손상 등에 관여하는 종양 억제 유전자의 돌연변이에 의하여 암세포로 발전하기도 한다. 이와 같이 비정상적인 세포 성장을 보이는 암세포를 치료하기 위한 방법으로서 암세포에 이른바 '프로그래밍에 의한 세포 죽음'을 의미하는 세포계획사(apoptosis)를 유도하는 방법이 사용되는데, 일반적으로 세포계획사는 미토콘드리아-의존성 경로(mitochondrial-dependent pathway, intrinsic pathway)와 사멸 세포-의존성 경로(death receptor-dependent pathway, extrinsic pathway)로 구분된다.
특히 세포 내에 존재하는 효소인 caspase의 활성을 위해서 미토콘드리아가 관여하는 것으로 알려져 있으며, 화학치료제, UV 방사 등의 많은 자극이 미토콘드리아 경로를 통하여 세포계획사를 유도하는 것으로 알려져 있다. 특히 미토콘드리아(내막에 의하여 둘러싸인 매트릭스, 막간 공간(inter-membrane space), 외막)의 막간-공간(inter-membrance space)에는 사이토크롬-c(cytochrome-c), 프로-caspase(procaspases), AIF(apoptosis inducing factor)를 함유하고 있는데, 이들 물질 중 특히 사이토크름-c가 미토콘드리아의 외막을 통과하여 세포질로 방출되면서 일련의 신호 전달(signal transduction)을 통하여 세포계획사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 즉 사이토크롬-c가 세포질로 방출되면 procaspase-9 및 Apaf-1(Apoptotic protease activating factor)과 결합하여 apoptosome을 형성하여 caspase-9의 활성이 증가된다. 이 과정에서 Bcl-2, Bcl-w와 같은 Bcl-2(B-cell lymphoma 2) 류의 단백질은 사이토크롬-c의 방출을 억제하여 세포계획사를 억제하는 반면, Bax(Bcl-2-associated X protein)와 같은 단백질을 세포계획사를 활성화하는 것으로 알려져 있다.
한편 사멸 세포 의존성 경로에 따르면, 특정 리간드(ligand)가 세포막에 존재하는 종양괴사인자(TNF) 슈퍼패밀리(super family)에 속하는 리셉터와 결합하면 세포질에서 카스파제-3(caspase-3), 카스파제-8(caspase-8)과 같은 다양한 caspase가 연속적으로 활성화되고(caspase cascade), 활성화된 caspase-8이 Bid(BH3 interacting domain death agonist)라는 신호 전달 기작에 관여하는 단백질을 절단한다. 즉, 사멸 세포-의존성 세포계획사에서는 caspase-8의 활성이 증가한다. 이처럼 절단된 Bid(truncated bid, tBid)는 미토콘드리아로 전위(translocation)하여 사이토크롬-c의 세포질로의 방출을 유도하는 것으로 알려져 있다.
특히, 세포계획사를 유도하는 미토콘드리아의 투과성 및 세포계획사-시그널 분자의 방출은 크게 caspase-의존적인 방법(사이토크롬-c의 방출)이거나 또는 caspase-비의존성 방법일 수 있는데, caspase-비의존성 경로에서는 AIF(세포계획사 유인 인자, apoptotic inducing factor) 및 endonuclease G(Endo G)가 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 AIF는 정상적인 환경에서는 미토콘드리아 내부에 남아 있지만, 특정 자극이 있는 경우에는 핵으로 전위(translocation)하여 세포계획사를 유도한다.
그런데, 본 발명에 따라 확인된 바에 따르면 이들 성분이 함유된 부추 추출물은 종양 세포의 세포계획사(apoptosis)를 유도하는 등 세포 독성 및 항-종양 효과와 같은 항암 효과가 특히 탁월한 것으로 확인되었다. 예를 들어 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 유방암 세포, 간암 세포, 육종 세포 및 전립선암 세포에 처리한 결과 다양한 암세포의 증식 또는 생존이 크게 억제되었으며 세포계획사가 유도되는 현상이 발견되었다. 뿐만 아니라, 생쥐에 종양 세포를 접종한 뒤, 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 일정량 투여한 경우에 생쥐의 수명이 현격하게 증가 하였으며, 암 세포에서의 세포계획사가 유도되는 등 항-종양 효과 내지는 항암 효과를 관측할 수 있었다.
아울러, 본 발명에 따라 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트는 사멸 세포 의존성 세포계획사는 물론이고 미토콘드리아 의존성 세포계획사에 모두 관여하는 것으로 확인되었다.
이에 따라, 본 발명에 따라 티오설피네이트 성분으로 이루어진 부추 추출물은 이른바 항암 작용 내지는 항-종양 효과를 가지기 때문에 건강식품 중에 포함되거나 약리적, 약학적 조성물 중에 함유될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 부추 추출물이 졸(sol) 또는 액상 타입의 비경구적인 약제 조성물 중에 함유될 수 있다. 이 경우, 약제 조성물에는 본 발명에 따른 부추 추출물 외에 약학적으로 허용되는 담체가 함께 사용될 수 있으며, 그 약제 조성물은 소장, 비경구적, 국소적인 방법을 통하여 투여될 수 있다.
소장을 통한 투여를 위해서 약제 조성물은 예를 들어 정제, 젤라틴 형태의 캡슐, 시럽, 현탁제, 액제, 과립제, 유제, 조절된 방출이 가능한 마이크로스피어 또는 나노스피어 형태일 수 있으며, 비경구적 투여를 위해서는 그 조성물은 주입용 액제 또는 현탁제의 형태일 수 있다. 한편, 국소 투여를 위해서는 예컨대 연고, 크림, 유제, 산제, 패드, 액제, 겔, 졸, 로션, 현탁제의 형태로 공급될 수 있거나 조절된 방출이 가능한 마이크로스피어 또는 나노스피어 또는 지질 또는 중합체성 소포체, 또는 하이드로겔(hydrogel)의 형태로 제공될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 부추 추출물이 약학적 조성물 중에 함유되는 경우에 그 조성물에는 기능성 첨가제가 더욱 포함될 수 있다. 예를 들어 약학 조성물 중에는 네오마이신, 테트라사이클린 등과 같은 항생제가 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 부추 추출물이 예를 들어 약제 조성물 중에 사용되는 경우에는 부추 추출물은 전체 조성물 총중량에 대하여 0.1~5.0 중량%, 바람직하게는 0.1~2.0 중량%의 농도로 함유될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 부추 추출물이 액제 또는 졸 형태의 조성물 중에 함유되는 경우에는 부추 추출물은 전체 조성물 중에 1~1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 5~100 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 5~50 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 만약 부추 추출물의 함량이 이를 초과하는 경우에는 부추 추출물에 의하여 조성물이 변색되거나 부패할 우려가 있고, 이보다 적은 경우에는 항암 효과를 기대하기 어렵기 때문이다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 구성을 명확히 기술하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
실시예 1: 부추로부터 항암 효과를 갖는 물질 추출
부추의 함황 화합물을 분리하기 위해 CH2Cl2을 사용하여 침지 추출하였다. 즉, 상점에서 직접 구입한 부추(Allium tuberosum L.) 4 kg을 가식부(aerial parts)만 잘 세정하여 0.5 ㎝ 정도로 자른 후 7일 동안 CH2Cl2 15ℓ에 2회 침지 추출하여 솜으로 잘 여과하였으며, CH2Cl2 추출물이 500 ㎖이 될 때까지 감압 농축시킨 뒤, 고 증류수를 500 ㎖ 넣어 녹인 후 분획하고, CH2Cl2층만 취한 것을 감압 농축하였다. 이때, 수용액 층(aqueous layer)은 디클로로메탄을 사용하여 재-추출될 수 있도록 하였으며, 유기층(organic layer)을 식염수(brine)로 세척하고 황산나트륨 무수화물을 사용하여 건조시킨 뒤 농축하여 두꺼운 덩어리(thick mass, 3.92g) 형태의 조추출물이 얻어졌다.
부추 CH2Cl2 추출물을 정제할 목적으로 조추출물에 대해서 open SiO2 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 정제된 화합물을 SiO2 column chromatography(1.5× 25 cm)에 CH2Cl2 : hexane = 8 : 1로 충진 하여 일정량 roading하였으며, 이동상으로는 CH2Cl2 : hexane(8:1→4:1→3:1→2:1→1:1→4:1) elution solvent로 하여 유속1.5~2.0 ㎖/min 로 용출시켜 30~50 ㎖씩 분취하였다. 분취시료는 TLC에 점적하고 ethyl acetate : hexane = 1 : 2 로 전개하였고, TLC plate상에 전개된 spot pattern을 찾기 위해 UV lamp를 조사하여 동일 스폿(spot) {Rf수치: 화합물 1(0.227), 화합물 2(0.432)}으로 확인되면 서로 합쳐 "화합물 1(1600㎎)"과 "화합물 2(240㎎)"을 얻었다.
실시예 2: 부추 추출물 성분의 분광 분석
위 실시예 1을 통하여 얻어진 화합물 1 및 화합물 2에 대한 성분 분석을 수행하였다. 적외선 분광법(Infrared spectroscopy, IR)에 의한 스펙트럼은 히타치사의 27-50 분광기를 사용하여 얻었으며, 질량분석(mass spectrometry, MS) 데이터는 전자 충격(Electron impact ionization, EI) 모드에서 Jeol JMS-700을 사용하여 측정하였다. 한편 1H NMR 및 13C NMR 및 2D-NMR 데이터는 Brucker AM 500 스펙트로미터를 사용하여 얻어졌다. 질량분석 데이터에 의하여 확인한 결과 "화합물 1"및 "화합물 2"는 각각 S-메틸 메탄 티오설피네이트 및 S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트로 확인되었다. 각각의 화합물에 대한 분광 분석 결과가 하기에 표시되어 있다.
화합물 1: EIMS (70 eV) m/z: 110(34), 95(20), 64(100); IR v
max
(KBr) cm
-1
: 2964, 1330, 1088;
1
H-NMR (CDCl
3
, 500MHz) δ: 2.69 (3H, s, S-CH
3
), 3.00 (3H, s, S(O)-CH
3
), 43.1 (S(O)-CH
3
).
화합물 2:EIMS (70 eV) m/z: 136(22), 95(13), 88(35), 41(92); IR v
max
(KBr) cm
-1
: 3056, 2968, 1270, 1088;
1
H-NMR(CDCl
3
, 500MHz) δ: 2.68 (3H, s, S-CH
3
), 3.81 (2H, m, S(O)-CH
2
), 5.46 (2H, m, CH
2
=), 5.92 (1H, m, =CH-);
13
C-NMR (CDCl
3
, 125 MHz) δ: 14.6 (S-CH
3
), 60.4 (S(O)-CH
2
), 124.4, 126.2; HRMS (EI) for C
4
H
8
OS
2
: calcd., 136.0017; found, 136.0013.
실시예 3: 부추 추출 성분의 세포계획사 유도 분석
(1) 암세포의 세포 증식 억제 관측
서울대학교 내의 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)로부터 MCF-7(인간 유방암 세포), SW480, HepG2(인간 간암 세포), LNcaP.FGC(인간 전립선암 세포) 및 육종암 종양 세포(sarcoma-180 tumor cell)를 구입하였다. 이들 세포는 5.5% 이산화탄소 항온기를 갖는 습화된 환경 및 37℃에서 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린(100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖)으로 보충된 RPMI-1640 배지(GIBCO BRL, Life Technologies, Grand Island, NY)에서 배양되었다
세포 증식은 "sulforhodamine B(SRB, 시그마, 세인트루이스, USA)" 방법에 의하여 분석되었다. 각각의 암세포는 48개의 웰(well)을 갖는 조직 배양 플레이트 내에서 5×104 세포/well의 농도로 접종되었으며, 다른 시간 동안 다양한 티오설피네이트의 농도를 사용하여 항온처리되었다. 처리 후에, 각각의 배지에 공기가 공급된 뒤 10% 트리클로로-아세트산이 첨가되었다. 4℃에서 1시간 항온처리 후, 증류수 및 건조 공기를 사용하여 5회 세척되었다. 이어서 각각의 세포는 1시간 동안 상온에서 0.4% (w/v) SRB를 사용하여 염색된 뒤 1% 아세트산을 사용하여 5회 세척되었다. 결합된 SRB는 10 mM Tris를 사용하여 용해되었으며 흡광도는 540㎚에서 측정하 였다. 세포수를 측정하기 위하여, 각각의 세포를 티오설피네이트를 사용하거나 사용하지 않은 상태에서 항온처리한 후, 세포는 2분 동안 37℃에서 0.025% 트립신 EDTA를 사용하여 분리되고 PBS에 다시 현탁되었다. 현탁된 세포의 수는 헤마사이토미터(hemacytometer)를 사용하여 측정하였다. 얻어진 데이터는 유의성 검정을 측정하기 위하여 t-테스트를 사용하여 분석되었으며, P < 0.05인 경우에는 통계적으로 의미가 있는 것으로 간주되었다.
본 실시예에 따라 분석한 바에 따르면, 유방암세포(MCF-7), 간암세포(SW480, HepG2) 및 전립선암세포(LNCaP.FGC)를 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트로 처리한 뒤 SRB 방법에 의하여 분석한 결과 암세포의 생존율이 크게 감소한다. 한편, 하기 표 1에서는 각각의 암세포에 대하여 본 발명에 따라 티오설피네이트를 함유하는 것으로 확인된 부추 추출물로 처리한 뒤에 세포 성장 정도를 측정한 것으로, IC50이란 세포 성장이 50% 억제되는 농도를 의미한다.
표 1. 암세포에 대하여 24시간 동안 부추 추출물을 투여한 IC50 값
| Cell lines | IC50(μg /mL) | ||
| Crude thiosulfinates |
S-Methyl Methanethiosulfinate | S-Methyl 2-Propene-1-thiosulfinate | |
| MCF-7 | 14.23± 0.72 | 17.05± 0.34 (155.0 μM) | 7.51± 1.34 (55.2 μM) |
| SW480 | 10.52± 1.10 | 16.28± 0.55 (148.0 μM) | 7.17±0.71 (52.7 μM) |
| HepG2 | 13.84± 0.38 | 20.2± 1.45 (183.6 μM) | 11.81±0.74 (86.8 μM) |
| LNCap.FGC | 7.90± 7.93 | 11.24± 0.23 (102.2 μM) | 4.04±0.33 (29.7 μM) |
* 조-티오설피네이트(crude thiosulfinate), S-메틸 메탄티오설피네이트, S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트 10㎍은 각각 부추 10.2, 25 및 166.7㎎에 대응.
한편, 도 2a는 본 발명에 따라 부추 추출물에 함유된 티오설피네이트를 유방암 세포주(MCF-7)에 처리하였을 경우, 티오설피네이트를 24시간, 48시간 및 72 시간 동안 처리하였을 경우 암세포의 생존율을 SRB 분석을 통하여 세포 성장 억제를 측정한 그래프이다. MCF-7 세포에 대하여 본 발명에 따라 추출된 티오설피네이트를 0-30 ㎍/㎖로 처리하였으며 그래프에서 *는 P<0.05인 것을 의미하고, **는 P<0.01을 의미한다. 한편, 도 2b는 본 발명에 따라 얻어진 티오설피네이트의 투여 농도에 따라 생존하는 유방암세포 수를 측정한 그래프로서 티오설피네이트의 세포독성 효과를 보여주고 있다. 도면에서 막대는 세포의 수를, 선은 사멸된 세포 비율을 나타낸다. 본 실시예를 통하여 부추로부터 얻어진 조추출물에 함유되어 있는 조-티오설피네이트는 물론이고 최종적으로 정제된 S-메틸 메탄티오설피네이트 및 S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트는 농도 및 시간 의존적으로 암세포의 증식을 억제하고 특히 S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트의 암세포에 대한 세포독성 효과가 우수하다는 점을 확인하였다.
(2) 형태적 세포계획사 탐지
세포계획사에 의한 특징적인 형태적 변화는 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole, 시그마, 세인트루이스, USA) 염색을 사용하는 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 우선 각각의 암세포를 5×105 세포의 접종 농도로 6-웰 플레이트로 접종한 뒤, 24시간 동안 부추 추출물에서 얻은 티오설피네이트(10, 20, 30 ㎍/㎖)로 처리하였다. 채집 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고 세포막에 홀(hole)을 유도하여 투과성을 증가시킬 수 있도록 0.1% Triton X 100을 함유하는 PBS에 현탁시킨 뒤, 얼음 위에서 10분 동안 배양하였다. 5분 동안 1500×g로 원심분리한 뒤, 침전물(precipitate)은 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 10 ㎕/㎖을 함유하는 4% PBS로 완충된 파라-포름알데하이드 용액에 5×105 세포/㎖로 재-현탁되었다. 이 현탁액 10㎕가 글라스 슬라이드 위에 배치되고 커버 슬립으로 덮여졌다. 핵의 분절화(frgmentation) 및 염색질 응축(condensation)을 알아보기 위해서 각각의 세포를 형광 현미경(Olympus Optical Co. Ltd. 일본)을 사용하여 검사하였다. 도 3은 본 발명에 따라 부추로부터 얻어진 추출물을 이루는 티오설피네이트를 유방암 세포주인 MCF-7 세포에 일정 농도로 처리한 뒤 24시간이 경과된 시점에서 각각의 세포에서의 핵의 형태 변화를 측정한 사진이다. 도면에서 알 수 있는 것과 같이 티오설피네이트로 처리하지 않은 암세포는 잘 펼쳐진 평평한 형태를 가지고 있는데 반하여, 티오설피네이트 20㎍/㎖ 및 30㎍/㎖으로 처리한 암세포의 경우에는 많은 세포고사체(apoptotic body)가 관찰되었다. 한편, 티오설피네이트로 처리하지 않은 암세포에서는 정상적인 크기의 핵이 관찰된 반면, 티오설피네이트 20㎍/㎖ 및 30㎍/㎖으로 처리한 암세포에서는 핵의 응축이 관찰되었다. 이를 통하여 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트는 암세포의 세포계획사를 유도한다는 점을 확인하였다.
(2) 세포 주기 분석 및 sub-G1 DNA 측정
위에서 얻어진 각각의 암세포를 6개의 웰을 갖는 플레이트로 1×106 세포의 농도로 접종하고 RPMI-1640 배지에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 티오설피네이트(10, 20, 30 ㎍/㎖)로 처리하였다. 성장 억제 분석 및 sub-G1 DNA 함량을 측정하기 위하여, 각각의 세포를 수집한 뒤 배지 내에서 얼음으로 냉각된 70% 에탄올에 고정하고 4℃에서 밤새 보관하였다. 재-현탁 및 세포를 세척한 뒤, 각각의 암세포를 30분 동안 RNase (1㎎/㎖, 시그마) 1㎕, 프로피디움 요오드화물 (1㎎/㎖, 시그마) 20 ㎕, PBS 500㎖로 37℃에서 항온처리하였다. 염색 처리 후, 세포 주기 및 sub-G1 DNA 함량을 분석하기 위하여 유세포 분류기(flow cytometry)를 사용하였다. 도 4는 본 발명에 따라 부추로부터 얻어진 티오설피테이트를 유방암 세포주인 MCF-7에 처리하였을 경우에 해당 암세포의 세포계획사를 알려주는 지표인 sub-G1기에 포획되어 있는 세포의 빈도를 측정한 그래프이다. 도 4의 측정 결과에서 알 수 있듯이, 티오설피네이트의 농도가 증가함에 따라 sub-G1기의 암세포 빈도가 현격하게 증가하였음을 확인하였다.
실시예 4: 항-종양 활성의 생체 내(in-vivo) 분석
종양 숙주의 생존 시간 증가 비율을 측정하여 생쥐의 육종-180 종양 세포에서의 종양 숙주의 생존에 대하여 본 발명에 따른 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 효과를 살펴보았다. 첫째 날에 9마리의 생쥐로 이루어진 군에 1×106 육종- 180 종양 세포/생쥐의 비율로 생쥐의 복막에 접종하였다. 종양 세포에 접종하고 24시간 경과한 뒤, 티오설피네이트를 각각 10㎎/㎏, 30㎎/㎏, 50㎎/㎏으로 처리하고 7일 동안 연속적으로 동일한 양을 생쥐에 투여하였으며, 대조군은 증류수만으로 처리하였다. 티오설피네이트의 항-종량 활성은 1달 동안 종양을 갖는 생쥐의 생존 시간으로 측정하였다. 하기 표 2는 본 발명에 따라 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 종양 세포인 육종-180 종양 세포로 사전에 처리한 생쥐에 처리하였을 경우, 생쥐의 생존 시간을 측정한 결과를 보여주고 있다. 티오설피네이트의 농도가 증가함에 따라 생쥐의 생존 시간이 증가하였음을 알 수 있다.
표 2. 종양 세포로 처리한 생쥐에 대한 티오설피네이트에 따른 생존 시간
| Treatment | Dose (mg/kg) |
Median survival time (Days) |
Increase survival time (%) |
| Control | - | 16.8 ± 5.02 | - |
| Crude thiosulfinates |
10 | 22.8 ± 6.91** | 35.7 |
| 30 | 26.2 ± 5.2* | 56.0 | |
| 50 | 29.0 ± 2.2* | 72.6 |
*는 P<0.05인 것을 의미하고, **는 P<0.01을 의미한다.
실시예 5 : 대장암 암 세포에 대한 세포계획사 유도 관측
(1) 대장암 세포주에 대한 세포 증식 억제
본 실시예에서는 특히 서구인에 있어서 주요한 암 질환의 하나로서 국내에서도 그 빈도가 증가하고 있는 대장암(colon cancer) 세포주에 대하여 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물의 항암 효과를 분석하였다. 대장암 세포주로서 HT-29 인간 대장암 세포주는 서울 대학교 한국세포주은행에서 구입하였으며, 기본적인 절차는 실시예 3과 동일하였다. 다만, 세포 증식을 측정하기 위해서 trypan blue 분석법을 사용하였다. 즉, 대장암 세포주를 24-웰 조직 배양 플레이트에서 5×105 세포/well의 농도로 접종되었으며, 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 다른 시간 동안 다른 농도로 처리한 뒤 항온처리하여 수집한 뒤 trypan blue 용액으로 염색하였다. 도 5a는 본 실시예에 따라 인간 대장암 세포주인 HT-29 세포주에 대하여 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 10, 20, 40, 80 ㎍/㎖의 농도로 각각 24시간, 48시간, 72시간 처리한 상태에서 세포의 수 및 사멸된 세포의 비율을 측정한 그래프로서, 막대는 세포의 수를, 선은 사멸된 세포 비율을 나타내며, *는 P<0.05, **는 P<0.01의 유의수준을 나타낸다. 도시된 것과 같이 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 농도 및 처리 시간에 따라 대장암 세포주의 증식을 억제하는 것을 알 수 있다.
(2) 대장암 세포주의 세포 주기 및 sub-G1 DNA 측정
대장암 세포주로서 HT-29를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 절차를 반복하여 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 처리에 따른 대장암 세포주의 세포 주기 및 sub-G1기의 포획된 빈도를 측정하였다. 도 5b는 본 실시예에 따른 측정 결과를 도시한 그래프로서, 처리된 티오설피네이트의 농도에 따라 sub-G1기에 포획된 세포의 빈도가 현저하게 증가하여 세포계획사가 유 도되었음을 확인하였다.
(3) 형태적 세포계획사 탐지
세포계획사의 특징적인 형태적 변화를 알아보기 위하여 bis-benzimide (Hoechst 332580) 염색법을 통하여 형광 현미경으로 세포의 형태를 분석하였다. 대장암 세포를 5×105 세포의 밀도로 접종하고 40, 80㎍/㎖의 농도로 티오설피네이트를 24시간 동안 처리하였다. 세포 채집 후에 세포를 PBS로 2회 세척하고 상온에서 10분 동안 200㎕ bis-benzimide(1㎍/㎖)의 농도로 염색하였다. 이 현탁액 10㎍를 글라스 슬라이드로 옮긴 뒤 커버 슬립으로 덮고, 형광 현미경으로 검사하였다. 도 5c는 본 실시예에 따른 세포 형태의 변화를 측정한 사진으로서, A는 대조군, B는 40㎍/㎖, C는 80㎍㎖ 농도의 티오설피네이트로 처리한 세포의 형태를 측정한 사진이다. 도 5c에 도시된 사진에서 알 수 있는 것처럼 본 발명에 따라 제조된 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 처리한 대장암 세포주에서는 핵이 응축된 형태를 보이고 많은 세포고사체가 관측되었다.
(4) DNA 분절화 분석
대장암 세포주인 HT-29 세포를 100㎜ 접시에 2×106 세포의 밀도로 접종하고 RPMI-1640 배지에 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 대장암 세포주에 40, 80㎍/㎖농도의 티오설피네이트를 48시간 동안 처리한 뒤 원심분리에 의하여 세포를 채집하 였다. 펠렛(pellet)은 DNA lysis 버퍼[10mM Tris-HCl (pH 7.5), 10mM EDTA(pH 8.0), 0.5% Triton X-100, 20% SDS, 10㎎/㎖ proteinase K]를 사용하여 용해시킨 뒤(lysed), 다시 원심분리하였다. 현탁액을 얼음-냉각된 70% 에탄올에 고정시킨 뒤 밤새 4℃에 보관하였다. 페놀 버퍼[페놀-클로로포름 및 페놀-클로로포름-이소아밀알코올]을 사용하여 펠렛을 추출하고, 펠렛은 TE 버퍼[10mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM EDTA (pH 8.0)] 및 RNase (2㎎/㎖)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 항온처리되었다. 전기영동은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)를 함유하는 2% 아가로스 상에서 수행되었으며, DNA 밴드는 UV Transilluminator Imaging System을 사용하여 분석되었다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 5d에 도시되어 있는데, 도시된 것과 같이, 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트로 처리한 대장암 세포주에는 많은 DNA 분절이 발견되었다. 이러한 DNA 단편의 존재는 세포의 핵에 존재하는 뉴클레오좀(nucleosome) 사이의 DNA를 절단하는 캐스페이즈-활성 DNase(caspase-activate DNase) 및 endonuclease G의 활성에서 비롯되는 것으로 세포계획사에 의한 세포 사멸의 중요한 특성을 보여주고 있다.
(5) 웨스턴 블로팅
본 실시예에서는 세포 손상에 관여하여 세포의 생존에 크게 관여하는 효소인 PARP의 활성을 분석하였다. PARP는 세포 생존에 중요한 효소로서 PARP의 절단 여부에 따라 세포계획사의 진행 여부를 확인할 수 있다. 우선 대장암 세포주를 100㎜ 접시에 2×106 세포 밀도로 접종하고, RPMI-1640 배지에 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포에 40, 80 ㎎/㎖ 농도의 티오설피네이트를 48시간 처리한 뒤 원심분리하여 채집하였다. 펠렛을 lysis 버퍼[50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM NaF, 30mM Na4P2O7,1mM PMSF, 2㎍/㎖ aprotinin)을 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 용해하였다. 현탁액의 함량은 BSA 단백질 분석 시약(protein assay reagent)을 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플은 한 레인 당 10㎍으로 로딩되었으며, 1시간 30분 동안 100V/slab의 전압에서 12% 겔 내의 SDS-PAGE에 의하여 분리되었다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(membrane)으로 옮겨졌다. 2.5% 및 5% 소혈청 알부민(BSA)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 처리된 후, 멤브레인은 제 1 항체(anti-PARP, anti-Bid, anti-Bas, anti-Bcl2, anti-AIF)를 사용하여 밤새 4℃에서 항온처리되었다. 마지막으로 멤브레인은 4℃에서 1시간 동안 고추냉이의 과산화효소와 연결된 2차 항체에 의하여 처리되었다. 각각의 항체 결합 반응 후에 멤브레인을 T-PBS를 사용하여 세척되었으며, 각각의 단백질을 탐지하기 위해서 ECL 키트가 사용되었다. 도 5e는 본 실시예에 따른 측정 결과를 보여주고 있는데, 절단된 PARP가 상대적으로 진하게 나타나고 있다. PARP가 caspase-3이라는 효소에 의하여 절단되는 것임을 고려해 볼 때, 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트는 caspase-3의 활성을 증가시킨다는 점을 확인하여 티오설피네이트는 특히 caspase-의존성 경로에 의하여 세포계획사를 유도한다는 점을 알 수 있었다.
실시예 6 : 전립선암 세포의 세포계획사 유도 분석
본 실시예에서는 특히 전립선암 세포주에 대하여 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 항암 효과를 알아보았다. 전립선암은 전립선에서의 원발암(primary cancer)에서 신체의 다른 분위로 전이되는데, 전립선에서 암세포가 호르몬을 통하여 성장이 조절되는데 반하여 다른 부위로 전이되는 경우에는 안드로겐(androgen)과 같은 호르몬에 무관하게 전이된 암세포가 성장하기 때문에 다른 부위로 전이된 전립선암에 대한 효율적인 치료가 없었다. 본 실시예에서는 이처럼 다른 부위로 전이된 전립선암 세포주를 중심으로 전립선암 세포에 대해서 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물의 항암 효과를 살펴보았다.
(1) 전립선암 세포주에 대한 세포 증식 억제
전이된 전립선암 세포주로서 PC-3 인간 대장암 세포주는 서울대학교 한국세포주은행으로부터 구입하였다. PC-3 세포주는 그 성장이 안드로겐에 무관하게 이루어지는 인간 전립선 샘암종(adenocarcinoma)로부터 유래된 상피 세포이다. 한편, 텔로머라아제가 소멸되지 않는(telomerase-immortalized) 원발암 인간 전립선 암세포(primary human prostate cancer, RC-58T/h/SA#4; 안드로겐 포지티브)는 분화가 거의 되지 않은 샘종양을 가지고 있는 57세 환자로부터 얻었으며, DU145 세포(안드로겐 네거티브) 및 LNcap.FGC는 서울대학교 한국세포주은행으로부터 구입하였다. 각각의 전립선암 세포주를 10% FBS, 페니실린(100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖)로 보충한 DMEM 배지를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 절차 및 조 건에서 대장암 세포주의 증식을 분석하였다. 하기 표 3은 본 실시예에 따라 다양한 전립선암 세포주에 대하여 본 발명에 따라 티오설피네이트를 함유하는 것으로 확인된 부추 추출물로 처리한 뒤에 세포 성장 정도를 측정한 것으로, IC50이란 세포 성장이 50% 억제되는 농도를 의미한다.
표 3. 전립선암 세포주에 대한 티오설피네이트의 IC50 분석
| Cell lines | IC50 value (μg/mL) | ||
| Thiosulfinates | S-Methyl Methanethiosulfinate |
S-Methyl 2-Propene-1 -thiosulfinate |
|
| RC58T/h/SA#4 | 4.58±5.19 | 10.56± 2.34 (96.06 μM) | 3.52± 1.71 (25.28 μM) |
| LNcap.FGC | 7.90± 7.93 | 11.24± 0.23 (102.18 μM) | 4.04± 0.33 (29.70 μM) |
| PC-3 | 10.07± 2.24 | 18.22± 2.08 (165.63 μM) | 8.56± 2.16 (62.94 μM) |
| DU145 | 15.31± 1.8 | 20.20± 1.45 (183.63 μM) | 11.67± 1.22 (85.80 μM) |
한편, 도 6a는 전이된 인간 전립선 암세포주인 PC-3에 대하여 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 농도를 달리하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 각각 처리한 상태에서 암세포의 생존율을 측정한 그래프이고, 도 6b는 PC-3 세포수 및 사멸수를 측정한 결과를 도시한 그래프이다. *는 P<0.05, **는 P<0.01의 유의수준을 의미하며, 도 6b에서 막대는 세포수를 선은 사멸된 세포의 비율을 각각 나타낸다. 도시된 것과 같이 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 농도 및 처리 시간에 따라 전이된 전립선암 세포주의 증식을 억제하는 것을 알 수 있다.
(2) 전이된 전립선암 세포주에 대한 형태적 분석
암세포주로서 대장암 세포주가 아니라 전이된 전립선 암세포주인 PC-3 세포주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 절차를 반복하여 암세포주에 대한 형태적 분석을 수행하였다. 도 6c는 본 실시예에 따라 전립선 암세포주인 PC-3 세포주의 형태 변화를 측정한 사진으로서, A는 대조군, B는 24시간 동안 티오설피네이트 5㎍/㎖로 처리한 세포, C는 24시간 동안 티오설피네이트 10㎍/㎖로 처리한 세포, D는 24시간 동안 티오설피네이트 20㎍/㎖로 처리한 세포를 나타낸다. 도 6c를 통해서 알 수 있는 것처럼 본 본 발명에 따라 제조된 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 처리한 전이된 전립선암 세포주에서는 핵이 응축된 형태를 보이고 많은 세포고사체가 관측되었다.
(3) 전이된 전립선암 세포주에 대한 세포 주기 및 sub-G1 DNA 측정
전립선암 세포주로서 PC-3 세포주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 절차에 따라 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 처리에 따라 상피 세포로 전이된 전립선암 세포주의 세포 주기 및 sub-G1기에 포획된 세포 빈도를 측정하였다. 도 6d에 도시된 것과 같이, 처리된 티오설피네이트의 농도에 따라 sub-G1기에 포획된 전이된 전립선 암세포의 수가 증가하였다.
(4) DNA 분절화 분석
상피 세포로 전이된 전립선암 세포주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 절차를 반복하였다. 도 6e는 본 실시예에 따라 DNA의 분절화 정도를 측정한 그래프로서, 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 각각 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도로 PC-3 전립선암 세포주에 처리한 결과, 세포계획사의 빈도가 상대적으로 1.3, 1.7, 1.8배 증가하였음을 확인하였다.
(5) 웨스턴 블로팅
상피 세포로 전이된 전립선암 세포주인 PC-3 세포주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 절차를 반복하였으며, 그 측정 결과가 도 6f에 표시되어 있다. 티오설피네이트의 농도에 따라 PARP의 절단이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 7 : 전이된 전립선 암세포에 대한 세포계획사 기작
본 실시예에서는 상피 세포로 전이된 전립선암 세포주인 PC-3를 대상으로 본 발명에 따른 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트에 의한 세포계획사의 기작을 분석하였다.
(1) caspase 활성 분석
본 분석은 caspase가 특정 기질로부터 얻어진 색소포(chromophore)를 절단할 수 있다는 점에 근거하고 있다. 예를 들어 사멸 세포 의존성 세포계획사 경로에 관여하는 caspase-3은 Ac-DEVD-pNA을, caspase-8은 Ac-IETD-pNA를 미토콘드리아 의존성 세포계획사 경로에 관여하는 caspase-9은 Ac-LEHD-pNA를 절단한다. 이를 위하여 상피 세포로 전이된 전립선암 세포주인 PC-3 세포주를 100㎜ 접시에서 2×106 세포 밀도로 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 암세포에 각각 티오설피네이트를 5, 10, 20 ㎍/㎖의 농도로 48시간 동안 처리하고 원심분리하여 채집하였다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 lysis 버퍼 내에서 펩타이드 기질과 함께 항온처리하고 4℃에서 5분 동안 10,000×g의 속도로 원심분리하였다. 현탁액의 단백질 함량은 각각의 caspase 활성을 분석하기 전에 BCA 단백질 분석 시약을 사용하여 측정하였다. 단백질 50㎍을 함유하는 현탁액은 2×반응 버퍼 내에서 DTT와 10μM 농도의 다른 기질과 혼합되었다. 항온 처리 후, p-니트로아닐린의 방출은 405㎚에서 측정되었다. 본 분석에 따른 측정 결과가 도 7a에 도시되어 있는데, A는 caspase-3의 활성을, B는 caspase-8의 활성을, C는 caspase-9의 활성을 각각 나타내고 있다. PC-3 암세포에 티오설피네이트를 10㎍/㎖의 농도로 처리하면 caspase-8, caspase-9, caspase-3의 활성이 각각 1.9배, 2.1배, 1.7배 증가하였다.
(2) caspase 억제제를 이용한 세포계획사 기작 분석
본 분석에서는 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트에 의한 세포계획사가 caspase 의존성 경로를 따라 진행하는지를 알아보았다. 이를 위하여 전립선암 세포주인 PC-3 세포를 5×105의 밀도로 접종하여 24시간 동안 배양한 뒤, caspase의 억제제인 z-VAD-fmk로 2시간 동안 처리하여 사전-항온처리한 뒤, 소정 농도의 티오설피네이트로 48시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 원심분리하여 수집한 뒤, trypan blue 염색약을 사용하여 세포수를 계측하였다. 본 분석에 따른 측정 결과가 도 7b에 도시되어 있는데, 티오설피네이트에 의한 세포계획사의 빈도가 caspase 억제제에 의하여 감소하였음에도 티오설피네이트에 의한 세포 사멸 정도는 티오설피네이트의 농도에 의존하여 현저히 증가하였음을 알 수 있다.
(3) 미토콘드리아에 의한 세포계획사 유도 분석
본 분석에서는 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트가 미토콘드리아 의존성 세포계획사를 유도하는지를 살펴보았다. 우선, 미토콘드리아 의존성 세포계획사를 활성화하는 단백질인 Bax와 미토콘드리아 의존성 세포계획사를 억제하는 단백질인 Bcl-2의 발현 정도를 살펴보았다. 도 7c에 도시된 것처럼 Bax의 발현은 크게 증가한 반면, Bcl-2의 발현은 크게 감소하였다.
한편, 앞서 살펴본 것과 같이 티오설피네이트에 의한 세포계획사는 미토콘드리아 의존성 경로는 물론이고 세포 표면의 리셉터에 의해서도 일어나기 때문에 티오설피네이트는 caspase-8에 의하여 Bid의 절단을 통한 미토콘드리아 의존성 세포계획사 경로를 활성화시키는 것을 확인하였다. 도 7c의 아래 부분에 도시된 것처럼 티오설피네이트로 처리한 암세포에서는 절단된 Bid(t-Bid)의 발현이 크게 증가하였음을 확인하였다.
(4) AIF의 전위 측정
본 분석에서는 세포계획사와 밀접한 관련이 있는 AIF의 핵으로의 전 위(translocation)를 살펴보았다. AIF의 전위 정도는 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. AIF는 caspase-의존성 경로를 통하여 세포계획사를 유도하는 것으로 알려져 있는데, 특정 자극에 반응하여 미토콘드리아 내부의 AIF는 핵으로 전위하여 핵의 응축을 일으킨다. 본 분석에서는 티오설피네이트로 처리한 암세포에서의 AIF의 전위 정도를 살펴보았다. 즉, PC-3 세포를 5×105 세포 밀도로 6-웰 플레이트로 접종한 뒤 티오설피네이트를 각각 10, 20㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 수집한 뒤, 세포를 PBS로 2회 세척하고 1시간 동안 희석 버퍼(blocking buffer, 2% BSA in T-TBS)로 희석하였다. 4℃에서 밤새 AIF 1차 항체로 항온처리하고, 1시간 동안 anti-rabbit 2차 항체로 처리하였다. 본 분석에 따른 측정 결과가 도 7d에 표시되어 있는데, 티오설피네이트가 PC-3 세포의 사멸을 유도하는 경우에는 AIF의 핵으로의 전위가 일어난다는 점을 확인하였다.
실시예 8 : 전이되지 않은 전립선암 세포의 세포계획사 유도 분석
본 실시예에서는 다른 조직으로 전이되지 않은 원발암(primary cancer) 상태의 세포주를 대상으로 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 항암 효과를 살펴보았다. 원발암 상태의 인간 전립선암 세포주로는 RC-58T/h/SA#4(안드로겐 포지티브), DU145(안드로겐 네거티브)가 각각 사용되었다.
(1) 원발암 전립선암 세포주에 대한 세포 증식 억제
원발암 상태의 인간 전립선암 세포주로는 RC-58T/h/SA#4(안드로겐 포지티브), DU145(안드로겐 네거티브)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6과 동일한 절차가 반복되었다. 도 8a는 비전이 전립선암 세포주를 대상으로 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 농도를 달리하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 각각 처리한 상태에서 암세포의 생존율을 측정한 것으로, A는 RC-58T/h/SA#4 세포주를, B는 DU145 세포주를 나타낸다. 한편 도 8b는 RC-58T/h/SA#4 세포주에 티오설피네이트의 농도를 달리한 상태에서 처리 기간에 따른 세포수의 측정 및 사멸된 세포의 비율을 측정한 것이다. 도 8b에서 막대는 세포수를 선은 사멸된 세포의 비율을 나타낸다. 도 8a 및 도 8b에서 *는 P<0.05, **는 P<0.01의 유의수준을 의미한다. 도시된 것과 같이 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트의 농도 및 처리 시간에 따라 전이되지 않은 전립선암 세포주의 증식을 억제하는 것을 알 수 있다.
(2) 전이되지 않은 전립선암 세포주에 대한 형태적 분석
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 절차를 반복하였다. 도 8c는 본 실시예에 따라 원발암 형태의 전립선 암세포주의 형태 변화를 측정한 사진으로서, A는 대조군, B는 24시간 동안 티오설피네이트 5㎍/㎖로 처리한 세포, C는 24시간 동안 티오설피네이트 10㎍/㎖로 처리한 세포, D는 24시간 동안 티오설피네이트 20㎍/㎖로 처리한 세포를 나타낸다. 도 8c를 통해서 알 수 있는 것처럼 본 본 발명에 따라 제조된 부추 추출 물을 이루는 티오설피네이트를 처리한 전이되지 않은 전립선암 세포주에서는 핵이 응축된 형태를 보이고 많은 세포고사체가 관측되었다.
(3) 전이되지 않은 전립선암 세포주에 대한 세포 주기 및 sub-G1 DNA 측정
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 절차를 반복하였다. 도 8d에 도시된 것처럼 처리된 티오설피네이트의 농도에 따라 sub-G1기에 포획된 전이된 전립선 암세포의 수가 증가하였다.
(4) DNA 분절화 분석
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 절차를 반복하였다. 도 8e는 본 실시예에 따라 DNA의 분절화 정도를 측정한 그래프로서, 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 각각 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도로 RC58T/h/SA#4 전립선암 세포주에 처리한 결과, 세포계획사의 빈도가 상대적으로 1.03, 1.13, 1.73배 증가하였음을 확인하였다.
(5) 웨스턴 블로팅
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 절차를 반복하였다. 그 측정 결과가 도 8f에 표시되어 있으며, 티오설피네이트의 농도에 따라 PARP의 절단이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 9 : 전이되지 않은 전립선 암세포에 대한 세포계획사 기작
본 실시예에서는 전이되지 않은 원발암 형태의 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 대상으로 본 발명에 따른 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트에 의한 세포계획사의 기작을 분석하였다.
(1) caspase 활성 분석
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7의 절차를 반복하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 9a에 도시되어 있는데, A는 caspase-3의 활성을, B는 caspase-8의 활성을, C는 caspase-9의 활성을 각각 나타내고 있다. PC-3 암세포에 티오설피네이트를 10㎍/㎖의 농도로 처리하면 caspase-8, caspase-9, caspase-3의 활성이 각각 1.3배, 2.3배, 2.0배 증가하였다.
(2) caspase 억제제를 이용한 세포계획사 기작 분석
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7의 절차를 반복하였다. 본 분석에 따른 측정 결과가 도 7b에 도시되어 있는데, 티오설피네이트에 의한 세포계획사의 빈도가 caspase 억제제에 의하여 감소하였음에도 티오설피네이트에 의한 세포 사멸 정도는 티오설피네이 트의 농도에 의존하여 현저히 증가하였음을 알 수 있다.
(3) 미토콘드리아에 의한 세포계획사 유도 분석
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7의 절차를 반복하였다. 도 9c에 도시된 것처럼 세포계획사를 활성화하는 Bax의 발현은 크게 증가하였고, 세포계획사를 억제하는 Bcl-2의 발현은 크게 감소하였다. 한편, 티오설피네이트로 처리한 암세포에서는 절단된 Bid(t-Bid)의 발현이 크게 증가하였음을 확인하였다.
(4) AIF의 전위 측정
본 분석에서는 전이되지 않은 전립선암 세포주인 RC58T/h/SA#4를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 절차를 반복하였다. 본 분석에 따른 측정 결과가 도 9d에 표시되어 있는데, 티오설피네이트가 RC58T/h/SA#4 세포의 사멸을 유도하는 경우에는 AIF의 핵으로의 전위가 일어난다는 점을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 기술하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야의 평균적 기술자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다 할 것이다. 그러나 그러한 변형과 변경은 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 더욱 분명해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따라 부추로부터 항암 효과를 갖는 티오설피네이트로 이루어지는 부추 추출물을 얻는 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명에 따라 부추 추출물에 함유된 티오설피네이트를 유방암 세 포주인 MCF-7에 처리하였을 경우 처리 시간에 따른 암세포의 생존율을 도시한 그래프이고, 도 2b는 본 발명에 따라 얻어진 티오설피네이트의 투여 농도에 따른 세포수를 측정한 그래프로서 티오설피네이트의 세포독성 효과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명에 따라 부추로부터 얻어진 티오설피네이트를 유방암 세포주인 MCF-7에 처리하였을 경우에 해당 암세포에서 핵의 형태 변화를 측정한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 부추로부터 얻어진 티오설피네이트를 유방암 세포주인 MCF-7에 처리하였을 경우에 해당 암세포의 세포계획사를 알려주는 지표인 sub-G1기의 빈도를 측정한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5b는 본 발명에 따라 얻어진 부추 추출물의 대장암 세포에 대한 항암 효과를 측정한 결과로서, 도 5a는 본 발명에 따라 부추 추출물을 이루는 티오설피네이트를 인간 대장암 세포주인 HT-29에 처리하였을 경우의 세포 증식 억제 정도를 측정한 그래프이고, 도 5b는 세포 주기 및 sub-G1기의 빈도를 측정한 그래프이며, 도 5c는 대장암 세포주의 핵의 분절화 정도를 측정한 사진이고, 도 5d는 웨스턴 블로팅을 수행하여 그 결과를 측정한 사진이다.
도 6a 내지 도 6f는 본 발명에 따른 부추 추출물의 전이된 전립선 암세포에 대한 항암 효과를 측정한 결과로서, 도 6a는 전이된 암세포주인 PC-3의 생존율을 도시한 그래프, 도 6b는 세포수 및 사멸된 세포를 측정한 그래프, 도 6c는 세포의 형태 변화를 측정한 사진, 도 6d는 세포 주기 및 sub-G1에 포획된 세포 빈도를 측정한 그래프, 도 6e는 DNA 분절화 정도를 측정한 그래프, 도 6f는 웨스턴 블로팅의 결과를 측정한 사진이다.
도 7a 내지 도 7d는 본 발명에 따른 부추 추출물의 전이된 전립선암 세포주에 대한 세포계획사의 기작을 측정한 것으로, 도 7a는 세포계획사에 관여하는 caspase의 활성을 측정한 그래프이고, 도 7b는 caspase-억제제를 첨가한 상태에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이며, 도 7c는 세포계획사의 메커니즘 중 신호전달에 관여하는 단백질의 도 7d는 세포계획사의 관여하는 단백질 중에서 AIF의 핵으로의 전위(translocation)를 측정한 사진이다.
도 8a 내지 도 8f는 본 발명에 따른 부추 추출물의 전이되지 않은 전립선 암세포에 대한 항암 효과를 측정한 결과로서, 도 8a는 전이되지 않은 암세포주인 RC58T/h/SA#4 및 DU145 세포주의 생존율을 도시한 그래프, 도 8b는 세포수 및 사멸된 세포를 측정한 그래프, 도 8c는 세포의 형태 변화를 측정한 사진, 도 8d는 세포 주기 및 sub-G1에 포획된 세포 빈도를 측정한 그래프, 도 8e는 DNA 분절화 정도를 측정한 그래프, 도 8f는 웨스턴 블로팅의 결과를 측정한 사진이다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명에 따른 부추 추출물의 전이되지 않은 전립선암 세포주에 대한 세포계획사의 기작을 측정한 것으로, 도 7a는 세포계획사에 관여하는 caspase의 활성을 측정한 그래프이고, 도 7b는 caspase-억제제를 첨가한 상태에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이며, 도 7c는 세포계획사의 메커니즘 중 신호전달에 관여하는 단백질의 도 7d는 세포계획사의 관여하는 단백질 중에서 AIF의 핵으로의 전위(translocation)를 측정한 사진이다.
Claims (10)
- 전립선암 억제 효과를 갖는 부추 추출물로서, S-메틸 메탄티오설피네이트, S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트 또는 이들의 조합인 티오설피네이트 화합물을 포함하고, 상기 티오설피네이트 화합물은 전립선 암세포의 미토콘드리아 의존성 세포계획사를 유도하는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제 효과를 갖는 부추 추출물과;약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 전립선암 억제 효과를 갖는 조성물.
- 전립선암 억제 효과를 갖는 부추 추출물로서, S-메틸 메탄티오설피네이트, S-메틸 2-프로펜-1-티오설피네이트 또는 이들의 조합인 티오설피네이트 화합물을 포함하고, 상기 티오설피네이트 화합물은 전립선 암세포의 카스파제-8(caspase-8)의 활성을 증가시켜, Bid(BH3 interacting domain death agonsit) 단백질을 절단하거나 AIF(apoptosis inducing factor)의 핵내 전위를 유도하는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제 효과를 갖는 부추 추출물과;약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 전립선암 억제 효과를 갖는 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 부추 추출물은 다른 조직으로 전이된 전립선 암세포 및 다른 조직으로 전이되지 않은 전립선 암세포의 세포계획사를 유도하는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제 효과를 갖는 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 부추 추출물은 다른 조직으로 전이된 전립선 암세포 또는 다른 조직으로 전이되지 않은 전립선 암세포의 세포계획사를 유도하는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제 효과를 갖는 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 부추 추출물은 Allium tuberosum L.로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제 효과를 갖는 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,상기 부추 추출물은 상기 조성물 전체에 대하여 1 ~ 1000 ㎍/㎖의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제 효과를 갖는 조성물.
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| KR1020080017739A KR101018765B1 (ko) | 2008-02-27 | 2008-02-27 | 부추에서 추출한 항암 효과를 갖는 조성물 및 추출 방법 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20020086336A (ko) * | 2002-08-30 | 2002-11-18 | 주식회사 제노바이오텍 | 항암효과를 가지는 부추추출물 및 항암 활성성분의 추출방법 |
-
2008
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| KR20020086336A (ko) * | 2002-08-30 | 2002-11-18 | 주식회사 제노바이오텍 | 항암효과를 가지는 부추추출물 및 항암 활성성분의 추출방법 |
Non-Patent Citations (3)
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| " Cytotoxic and antitumor activities of thiosulfinates from Allium tuberosum L.", J Agric Food Chem. 2007 Sep 19;55(19):7957-61. Epub 2007 Aug 22 |
| "부추 첨가 식이가 수컷 생쥐의 암예방 효소계 및 혈중 웅성호르몬 농도에 미치는 영향", 한국식품영양과학회지 제27권 제5호, 1998. 11. |
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