KR100282258B1

KR100282258B1 - 항균작용이 있는 차나무과 수종의 추출물 및 제조방법

Info

Publication number: KR100282258B1
Application number: KR1019980003324A
Authority: KR
Inventors: 최명석; 신금; 권오웅; 손성호
Original assignee: 박홍락; 대한민국
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2001-02-15
Also published as: KR19990069221A

Abstract

본 발명은 인체 독성에 문제가 되고 있는 기존 화학 합성방부제를 대체할 천연방부제를 개발하기 위하여 차나무과 수종으로부터 여러종류의 미생물에 대한 항생작용을 나타내는 유효 항균물질을 추출, 정제하고, 이를 식품첨가물 등으로 이용하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 미생물에 강력한 항균활동을 보이는 직용하는 차나무과 수종을 선발하기 위해 시료를 한천배지 확산법으로 항균활성을 검색하고, 대조구로서 식품보존제로 광범위하게 이용되고 있는 폴리라이신과 DF-100, 히노키티올 등을 사용하여 항미생물활성을 비교하였다.

차나무과 수종 중 항균활성이 뛰어났던 스키마 류큐엔시스의 잎과 줄기, 껍질을 물 및 70% 에틸알콜로 추출하고 이 추출액을 헥산층과 에틸아세테이트로 재추출하여 버리고 메탄올가용부를 클로로포름으로 다시 추출하여 조추출물을 얻는다. 보다 순수한 물질을 얻기 위해 실리카겔을 충진한 칼럼 크로마토그라피를 행하여 비교적 순수한 항균물질을 분리하고, 기기분석을 통하여 분자량을 측정하였다.

액체고속크로마토그라피로 얻어진 항균물질은 식품보존제로 광범위하게 이용되고 있는 폴리라이신보다 월등한 항균력을 보여 천연보존제 등으로 이용될 수 있다.

Description

항균작용이 있는 차나무과 수종의 추출물 및 제조방법

본 발명은 차나무과 수종으로부터 추출한 유효 향균물질 및 그것을 추출, 정제하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 차나무과 수종으로부터 물 및 저급알콜로 추출한 조추출물의 항균활성 조사 및 효모 등에 강력하게 작용하는 수용성 항균물질을 추출, 정제하여 경제적으로 이용할 수 있는 항균물질에 관한 것이다.

인류는 질병을 일으키는 병원체(기생충, 세균, 바이러스, 진균, 원충류)를 박멸하기 위해 자연환경에 존재하는 동물, 식물, 광물 등 모든 방법을 이용하여 왔다. 질병을 일으키는 가장 큰 요인은 미생물로서 이들과는 투쟁이 현재에도 계속되고 있다.

기존에 사용되고 있는 합성보존료로는 솔빈산칼륨(K-sorbate), 안식향산나트륨(Na-benzoate) 그리고 프로피온산나트륨(Na-propionate) 등이 있다. 식물에서 유래한 천연보존료와 수종을 보면 쓴풀추출물에서 추출된 안식향산, 사철추출물에서 유래한 capillene, 생선에서 유래한 염기성 단백질, 편백 추출물의 thujaplicin, 목련추출물인 magnolol, 개나리 추출물인 phillyrin등이 있지만 아직은 그다지 종류가 많지 않다. 그러나, 이러한 천연항균성 물질은 항균효과가 인공합성보존료에 비교가 되지 못하기 때문에 아직까지 실용적으로 식품산업등에 이용되는 경우가 별로 없는 실정이다.

차나무과 식물은 전세계적으로 40속 600종이 열대, 아열대, 난·온대지방에 분포하며 우리나라에서는 5속 6종이 자란다. 차나무과(차나무속, 茶屬, Tea, Tea plant)는 10종이 아시아에 분포하며 많은 재배 품종이 있다. 일반적으로 차나무는 충치예방, 입냄새 제거, 혈압상승억제, 혈중콜레스테롤 상승억제, 바이러스 감염저지작용 등을 하며, 그 밖에 항암작용도 동물실험으로 확인되고 있으며, 최근 우리나라를 비롯한 선진국에서도 녹차의 각종 생리활성에 관한 연구가 활발히 수행되고 있다. 차나무에서 생리활성을 나타내는 주요성분은 폴리페놀류, 에피카테친, 에피갈로카테친 갈레이트 등으로 알려져 있다. 최근에는 차나무를 이용하여 음료(대한민국 특허 출원번호 92-5544, 94-17951, 93-18222), 세정제(대한민국 특허출원번호 94-36008, 94-8887), 화장품첨가물(대한민국 특허 출원번호 92-14444, 91-10742, 89-12435), 치약조성물(대한민국 특허 출원번호 91-10742), 식품첨가물(대한민국 특허 출원번호 95-701285), 탈취용(대한민국 특허 출원번호 95-43736, 95-43503) 등이 있으나, 항균용으로 사용된 예는 거의 없으며, 특허 전부가 차나무에 국한되어 있는 실정이다.

현재까지 상업적으로 이용되고 있는 항생제는 대부분이 단일구조의 유기화합물 합성제로써 다소 불용성이며 독성이 있고, 항진균제로서의 작용범위가 좁은 것이 한계로 지적되고 있다. 따라서 인체에 독성이 없고 광범위한 적용효과를 나타내는 천연항진균물질의 탐색이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 차나무를 포함한 각종 차나무과 수종의 잎, 줄기, 수피 조직을 물 및 저급 알콜로 추출하여, 조추출물이 효모, 세균, 곰팡이 등 각종 미생물의 생육을 강하게 억제시키는 수종을 선발하고, 강력한 활성을 나타내는 수종으로부터 항생물질을 추출, 정제하고, 이를 식품첨가물 등으로 이용하기 위한 것이다.

제1도는 차나무과 수종에서 분리된 항균물질의 액체고속크로마토그라피 분석.

제2도는 항균물질 SC-1의 질량분석 크로마토그램.

제3도는 항균물질 SC-1의 효모균에 대한 항균력.

제4도는 항균물질 SC-1을 햄에 처리했을 때의 보존력.

좌: 폴리라이신 500ppm처리, 중앙: 무처리, 우: SC-1 50ppm처리.

본 발명은 차나무과 수종으로부터 유효 항균물질을 분리하는데 있어서, 건조시료를 70% 에탄올로 추출하고, 이 추출액을 핵산층과 에틸아세테이트로 재추출하고, 메탄올가용부를 클로로포름으로 추출하여 조추출물을 얻는다. 순수한 물질을 얻기 위해 실리카겔을 충진한 칼럼에서 클로로포름:메틸알콜:물을 혼합한 용매를 사용하여 칼럼 크로마토그라피를 행하여 비교적 순수한 항균물질을 취할 수 있고 이 물질을 식품 첨가물 등 천연보조제로 이용할 수 있다. 이하 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같으며 이 실시예는 본 밟명의 예시를 보이는 것이며 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

항균활성 검정을 위해 차나무과 수종 5g을 파쇄하여 에틸알콜/물(7:3, v/v) 혼합용액에서 1시간 동안 초음파 추출하고, 2 일간 상온에서 침적 후 3회 반복추출하여 이들을 혼합한 액을 감압농축기를 사용하여 농축하고 HPLC급 메탄올 3ml로 추출한다.

추출된 시료의 항균력을 확인하기 위한 방법으로 한천배지 확산법(disk-agar plate diffusion method)으로 측정하였다. 먼저 45℃로 조절된 멸균배지 10ml에 균주배양액 0.1ml를 마이크로 피펫을 이용하여 무균적으로 옮겨 잘 혼합시킨 후 지름이 9cm인 무균사레에 넣고 응고시킨다. 균주배양액은 활력있는 세포를 분리한 다음 현미경으로 균액의 균수를 측정하고, 균액을 배지 1ml당 1×10⁶세포 농도가 되도록 한다. 여기에 종이 디스크 당 2000㎍의 시료를 점적하고, 건조된 종이 디스크를 올려 놓고 이를 박테리아의 경우 37℃, 효모의 경우 25℃, 곰팡이의 경우 24℃의 인큐베이터에서 24시간 배양하여 종이 디스크 주위에 형성된 저해환(inhibition zone)을 관찰함으로써 항균활성을 검색한다. 본 실시예에 사용한 균주는 KIST 생명공학연구소 유전자원센터에서 KTCC 균주를 분양받아 사용하였으며, 효모균주로는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 팔랍실로시스(Candida parapsilosis), 캔디다 길리어몬딜(Candida guilliermondil)들이었고, 박테리아 균주로서 그람(gram) 양성균으로서는 에스쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 스트립토코코스 티피무리움(Stryptococus typhimurium), 그람(gram)음성균으로는 스트립토코코스 아우레우스(Streptpcocus aureus)를, 곰팡이 균주로서는 아스퍼길러스 카보나리우스(Aspergillus carbonarius), 보트료트니아 푸켈리아나(Botryotinia fuckeliana)등이다. 생육저해환의 직경이 8.0~8.4mm는 `-', 8.5~9.0mm는 `-/+', 9.0~9.9mm는 `+', 10.0~11.9mm는 `++', 그리고 12.0mm이상인 것은 `+++'로 표시하여 항균력을 비교하였다. 대조구로서는 식품보존제로 광범위하게 이용되고 있는 폴리라이신을 사용하여 항미생물활성을 비교하였다.

그 결과 표1과 같이 세균에는 커트 리프 카멜리아(cut-leaf camellia), 스키마류큐엔시스(Schima liukiuensis), 비쭈기나무가, 효모에는 스키마 류쿠엔시스(Schima liukiuensis)와 우묵사스레나무가, 곰팡이에서는 투모로우스 다와 커먼 카멜리아(Tomorrow's dawa common camellia)가 대조구인 폴리라이신보다 강한 항균활성을 나타낸다.

선별과정 중 가장 높은 항균활성을 보였던 스키마 류큐엔시스(Schima liukiuensis)를 대상으로 활성물질의 특성을 조사하기 위하여 추출 및 정제를 행한 결과 항균활성은 주로 스키마 류큐엔시스(Schima liukiuensis)의 에탄올 추출물에서 나타났으며 활성 및 활성물질의 수율은 추출횟수가 증가함에 감소하는 양상을 보인다.

[실시예 2]

활성 획분의 조제를 위해 스키마 류큐엔시스(Schima liukiuensis)의 수피와 잎조직 1kg을 파쇄하여 에틸알콜/물(7:3, v/v) 혼합용액에서 1시간 동안 초음파추출하고, 2일간 상온에서 침적 후 3회 반복추출한 다음 합한 추출액을 감압농축기를 사용하여 농축한 후 초저온냉동고에 보관한다. 이 농축물을 분액깔대기에 n-헥산과 메틸알콜로 층분리하여 상층의 헥산가용부를 취한 후 농축하여 헥산 분획을 얻었다. 하층의 메틸알콜층을 농축하여 이 농축액을 에틸아세테이트와 물로 다시 분획하고 에틸아세테이트로 3회 반복추출하여 혼합한 후 농축하여 에틸아세테이트 분획을 얻고, 상기와 동일하게 클로로포름으로 추출하여 클로로포름분획을 얻고, 클로로포름 불용부를 농축하여 물로 분획을 얻는다.

[실시예 3]

활성분획을 TLC에 의해 결정된 용매(클로로포름:메틸알콜:물, 64:50:10)로 평형화한 실리카겔 60(입자크기 0.040~0.063mm)이 충진된 칼럼(3.6×40cm)에서 칼럼 크로마토그라피를 행하고, 얻어진 물질들은 간단한 항균력 검색법에 따라 활성분획을 얻는다.

실리카 크로마토그라피에 의해 얻어진 주요 활성분획은 메틸알콜:물(7:3, v/v)로 평형화된 세파덱스 LH-20(파마시아, 스웨덴)이 충진된 컬럼(2.8×60㎝)을 사용하여 겔여과를 행한다.

상기 실시예 2에서 얻어진 항균 조추출물을 다량 분리하기 위해 고속액체크로마토그라피를 하면 흰색 분말의 항균물질을 다량분리할 수 있다.

○ 분석조건

검출기 자외선 검출기

칼럼 JAIGEL GS-320(300㎜×10㎜, 5um)

이동상 메틸알콜(70), 물(30)

유속 5ml/min

흡광도 210nm

또한, 분리된 유효성분의 정성적 확인을 위해 실시예2에서 얻은 분말은 질량분석한 결과 액체크로마토그라피에서 얻은 체류시간 9분대의 주 유효 항균물질의 분자량은 1,360으로 나타나고, 9.6분대에 나타나는 항균물질은 1,364로 각각 나타났고, 주요 활성물질의 자외선분광분석 결과 최대흡광도가 210nm로 나타났다.

박층크로마토그라피는 70% 에틸알콜로 추출한 시료를 실리카 플레이트에 접정하여 클로로포름:메틸알콜:물을 64:50:10의 비율로 만든 전개용매로 하여 분리한다. 그 결과 장파장(365nm)에서는 발색정도에 따라 크게 20여가지 이상의 분획으로 나눌 수 있었다. 장파장(365nm)에 의해 L0, L1, L2, L3, L4 부분으로 나누었을 때, L0는 형광빛의 파란색을 띠고, L4는 형광빛의 오렌지색을 나타낸다. 그리고 단파장(254nm)으로 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11로 분획을 나누어 활성을 조사한다. 16개의 분획중 활성은 S5로 나타났는데, 이 분획의 Rf 값은 0.45-0.56였다. 이 분획은 드라겐드로프용액에서는 발색이 되지 않아 알칼로이드계 물질은 아닌 것으로 추정되고, 닌하이드린용액에도 발색이 되지 않아 아미노산계열은 아닌 것으로 추정된다. 그러나 바닐린-인산(VPA)에서는 진홍색으로 발색이 되어 사포닌계 물질임을 대략적으로 추정할 수 있다.

[실시예 4]

보존제가 첨가되지 않은 햄을 시중에서 구입한 후 1㎤크기로 잘라 37℃ 인큐베이터에서 2주간 방치하여 부패된 햄을 멸균수 10ml을 가한 후 파쇄기에서 파쇄하고, 균질화된 햄을 멸균된 3겹의 거즈를 통해 여과시킨 후 적절히 희석하여 미리 조제된 영양배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 먼저 콜로니(colony)의 크기와 색깔, 모양에 따라 분리를 하여 순수배양하였으며, 이들 균주를 H1, H2, H3로 표시하였다. 모든 분리균주는 살균 혹은 제균된 분리원에 재접종하여 pH, 산도 및 부패 확인시와 같은 관능검사를 통하여 부패현상을 재확인하여 이들이 부패균임을 확인하였다.

분리된 세균을 PDA배지에 넣고 37℃ 인큐베이터에 1일간 배양한 후, 자란 미생물을 실시예 1에서 언급한 방법으로 항균력을 측정한다. 이때 대조구로서는 식품보존제로 광범위하게 이용되고 있는 폴리라이신(poly-lysine)을 사용하여 항미생물활성을 비교한다.

시중에 판매되고 있는 무방부제 햄을 구입하여 분쇄기로 마쇄한 후 이 분쇄된 물질에 항균성을 나타내는 SC-1을 농도별(1,000, 5,000, 10,000 ppm)로 넣어서 잘 혼합한 후 이들의 부패정도를 관찰하였다. 부패정도의 판정은 냄새와 육안관찰에 의한 판단을 행한다. 그 결과 대조구인 폴리라이신보다 월등한 항균력을 보였으므로 천연보존제 등으로 이용될 수 있음을 확인하였다.

도 4는 식품보존제로서의 가능성을 조사하기 위하여 시중에 판매되고 있는 무방부제햄에 순수 정제된 항균물질 SC-1을 처리하였을 때의 보존력을 나타내고 있다. 도면 왼쪽은 식품산업에서 많이 이용되고 있는 합성방부제인폴리라이신 500ppm 처리구이고, 중앙는 무처리구이고, 오른쪽은 스키마 류큐엔시스(Schima liukiuensis)로부터 추출 정제된 항균물질 SC-1를 50ppm 처리했을 때의 모습이다.

본 발명은 인체 독성에 문제가 되고 있는 기존의 화학 합성방부제를 대체할 천연방부제를 개발하기 위하여 차나무과 수종으로부터 여러종류의 미생물에 대한 항생작용을 나타내는 유효 항균물질을 추출, 정제하고, 이를 식품첨가물 등으로 이용하기 위한 방법이다. 대장균, 효모, 곰팡이 등 여러 미생물에 강력한 항균활성을 보이는 작용하는 차나무과 수종을 선별하여 항균활성물질을 추출하여 기존의 식품보존제로 광범위하게 이용되고 있는 폴리라이신과 DF-100, 히노키티올 등 보다 뛰어난 항균효과를 나타내고 있다. 특히 차나무과 수종 중 Schima liukiuensis의 잎과 줄기, 껍질을 물 및 70% 에틸알콜로 추출하고 이 추출액을 헥산층과 에틸아세테이트로 재추출하여 버리고 메탄올가용부를 클로로포름으로 다시 추출한 물질은 식품 보존제로 광범위하게 이용되고 있는 폴리라이신보다 월등한 항균력을 보여 천연보존제 등으로 이용될 수 있다.

Claims

차나무과 수종으로 부터 추출한 추출물에 있어서, 차나무과 수종을 파쇄하여 에틸알콜과 물을 7:3으로 혼합한 용액에서 1시간 동안 초음파 추출하고, 다시 2일간 상온에서 침적하고 3회 반복추출하여 얻은 추출액을 혼합한 후 가압농축 및 메탄올로 추출하여 얻은 추출물이 항균작용이 있는 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물.
제1항에 있어서, 차나무과 수종은 커트 리프 카멜리아(cut-leaf camellia), 스키마 류큐엔시스(Schima liukiuensis) 또는 비쭈기나무인 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물.
제1항에 있어서, 차나무과 수종은 스키마 류큐엔시스, 우묵사스레피나무인 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물.
제1항에 있어서, 차나무과 수종은 투모로우스 다와 커먼 카멜리아(Tomorrow's dawa common camellia)인 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물.
차나무과 수종은 스키마 류큐엔시스로서 스키마 류큐엔시스의 잎과 줄기, 껍질로부터 70% 에틸알콜로 추출한 후 이 추출액을 헥산층과 에틸아세테이트로 정제하고, 메탄올가용부를 클로로포름으로 다시 추출하는 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물의 제조방법.
제5항에 있어서, 조추출물을 실리카겔로 충진한 칼럼에서 클로로포름, 메틸 알콜, 물을 64, 50, 10으로 혼합한 용매를 사용하여 칼럼 크로마토그라피를 행하여 백색의 순수한 항균물질을 얻는 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 추출물의 분자량이 1,360 또는 1,364인 것을 특징으로 하는 차나무과 수종의 추출물의 제조방법.
청구항 1의 방법으로 얻은 추출물을 유효성분으로 하는 항균제.