CN110724121B - 铁皮石斛叶中的一种联苄类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

铁皮石斛是一种珍稀药用植物，其药用部位为茎，其叶作为农业副产品直接丢弃，造成了一定的生物资源浪费。本发明涉及一种从铁皮石斛叶中提取的联苄类化合物，以及它的制备方法和在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。所述的联苄类化合物为一个新化合物，命名为denofficin，具有下述结构：

。活性测试结果表明，denofficin对大鼠中性粒细胞呼吸爆发具有强烈的抑制活性，其半数抑制浓度分别为0.22±0.09μM，可进一步用于制备治疗炎症性疾病药物。本发明为综合利用生产铁皮石斛过程的废弃生物资源制备治疗炎症性疾病药物提供了理论基础。

Description

铁皮石斛叶中的一种联苄类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及铁皮石斛叶中的一种联苄类化合物及其制备方法和在制备治疗炎症性疾病药物中的应用。

背景技术

中性粒细胞 (PMNs) 呼吸爆发是指活化的中性粒细胞消耗大量的氧产生活性氧(ROS) 的过程。ROS具有很高的反应性，可以与细胞膜、核酸分子及蛋白质发生氧化还原反应,造成生物细胞损伤和死亡。因此，当外来病原菌入侵时，PMNs作为宿主防御外来病原体入侵的第一道防线被激活，然后通过呼吸爆发释放ROS而发挥杀菌功能。但PMNs 的激活是一把双刃剑，正常时能消灭外源性病原体、清除坏死组织、促进伤口愈合，是机体的“保护者”。但在某些病理条件下 (如严重创伤、烧伤、休克、缺血再灌注等)，PMNs 过度激活却可阻塞微循环、损伤血管内皮细胞和血管外组织细胞、释放和促进释放炎症介质，成为“破坏者”，是导致全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭的重要原因。目前渥曼青霉素(wortmannin)、一些大环内酯类抗生素及非甾体抗炎药等抗生素类药物在临床上被用于一般性炎症疾病的治疗。然而，因PMNs 呼吸爆发所引起的失控性炎性反应与细菌等病原体感染无关，经常导致抗生素治疗无效。因此，发现抑制PMNs呼吸爆发的药物用于控制PMNs呼吸爆发所致的严重炎症反应具有重要意义。

从天然药物中分离鉴定结构新颖、活性显著的天然产物一直是新药发现的主要途径之一。铁皮石斛 (Dendrobium officinale) 为兰科石斛属珍稀药用植物，作为中药品种铁皮石斛的基原植物收载于2010年版《中国药典》，具有“益胃生津，滋阴清热”的功效，被广泛地用作健康食品及补品。在民间，铁皮石斛有“仙草”的美誉，因为过度采挖，野生铁皮石斛资源已濒临枯竭，目前主要以人工栽培来满足市场需求。铁皮石斛的药用部位为其茎，因此在采收时，大量的叶子都作为农业副产品直接丢弃，造成了一定的生物资源浪费。为了综合开发铁皮石斛植物资源，本发明对其叶进行了化学成分研究，并评价了所得单体对PMNs呼吸爆发的抑制活性。

发明内容

本发明的目的是提供具有抑制PMNs呼吸爆发活性的物质，为临床上与PMNs呼吸爆发相关炎症的治疗提供药物。具体涉及铁皮石斛叶中提取的一种联苄类化合物，具有如下所示的化学结构：

。

该化合物是未见文献报道的新化合物，命名为denofficin。

本发明的进一步目的是提供上述化合物在制备抗炎 (与PMNs呼吸爆发相关炎症)药物中的新用途。

本发明所述化合物通过下述方法制备：

a.用体积浓度为50-100%的乙醇对铁皮石斛叶在室温下浸提，浸提使用的药材与溶剂为1:5-1:10，其中药材以千克计，溶剂以升计；重复浸提2-3次，每次10-20天；合并浸提液，减压浓缩，得到浸膏；

b.将步骤 a 得到的浸膏加入10%-20%乙醇分散，其加入的比例为浸膏：蒸馏水为1:2-1:5，其中浸膏以千克计，蒸馏水以升计，得分散液；

c.将步骤 b 得到的分散液上大孔吸附树脂柱, 依次用蒸馏水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇梯度洗脱，每梯度洗脱5个柱体积，得到10个流分frs. H0-H9；

d. 将步骤 c 得到的70%乙醇洗脱流分fr. H7经MCI CHP-20P树脂柱色谱，用20%-90%的乙醇梯度洗脱，得8个流分frs. H7M1-H7M8；

e.将步骤 d 得到的流分fr. H7M6 进一步上Sephadex LH-20柱，用90%甲醇洗脱，得6个流分frs. H7M6L1-H7M6L6；

f.将步骤 e 得到的流分fr. H7M6L6经过制备高效液相色谱 (流动相为50%-80%乙腈) 得到所述的化合物denofficin。

进一步的，步骤c 所述的大孔吸附树脂柱为HP-20大孔吸附树脂柱或D101大孔吸附树脂柱。

活性筛选实验结果显示，本发明所述的化合物denofficin对佛波豆蔻酸乙酯(PMA) 刺激的大鼠中性粒细胞爆发具有显著的抑制作用，半数抑制浓度 (IC₅₀)为0.22±0.09 μM，优于阳性对照维生素C (IC₅₀ = 24.22±1.25 μM)。

本发明具有以下有益效果：

(1) 本发明所述的联苄化合物denofficin结构新颖，抑制PMNs呼吸爆发活性显著，可进一步制备成治疗PMNs呼吸爆发失控所致炎症的药物。

(2) 本发明以生产铁皮石斛药材的农业废弃物—铁皮石斛叶为原料来制备具有药用价值的denofficin，属于变废为宝，延长了铁皮石斛产业的价值链，具有良好的生态效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明所述新化合物denofficin及其结构类似物的化学结构式。

图2为本发明所述新化合物denofficin的核磁共振氢谱(¹H NMR)。

图3为本发明所述新化合物denofficin的核磁共振碳谱(¹³C NMR)。

图4为本发明所述新化合物denofficin的核磁共振DEPT 135谱。

图5为本发明所述新化合物denofficin的核磁共振¹H-¹H COSY谱。

图6为本发明所述新化合物denofficin的核磁共振HSQC谱。

图7为本发明所述新化合物denofficin的核磁共振HMBC谱。

图8为本发明所述新化合物denofficin的主要HMBC (H→C)相关。

具体实施方式

通过以下给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。

实施例1 铁皮石斛叶中联苄类化合物denofficin的制备

取阴干铁皮石斛叶30 kg，粉碎，室温下用150 L 95%乙醇浸提2次，每次20天，滤取浸提液，减压回收溶剂，得黑色浸膏1.7 kg。取1.5 kg浸膏，以3 L 10%乙醇热溶液分散，上HP-20大孔吸附树脂柱 (50 × 15 cm), 依次用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱5个柱体积，得到10个流分frs. H0-H9。

70%乙醇洗脱流分fr. H7 (76.2 g) 经MCI CHP-20P树脂柱色谱，用乙醇-水溶剂系统（20:80~90:10）梯度洗脱，得8个流分frs. H7M1-H7M8。流分fr. H7M6 (8.3 g) 进一步上Sephadex LH-20柱，甲醇-水(9:1) 洗脱，得6个流分frs. H7M6L1-H7M6L6。流分fr.H7M6L6 (521.7 mg) 经过制备高效液相色谱 (65%乙腈) 得到化合物1 (154.8 mg)。流分fr. H7M5 (10.4 g) 进一步上Sephadex LH-20柱，甲醇-水(9:1) 洗脱，得10个流分frs.H7M5L1-H7M5L10。流分fr. H7M5L7 (843.6 mg) 经过制备高效液相色谱 (65%乙腈) 得到化合物2 (402.4 mg)。

60%乙醇洗脱流分fr. H6 (41.5 g) 经MCI CHP-20P树脂柱色谱，用乙醇-水溶剂系统（40:60-90:10）梯度洗脱，得6个流分frs. H6M1-H6M6。流分fr. H6M5 (2.2 g) 进一步上Sephadex LH-20柱，纯甲醇洗脱，得5个流分frs. H6M5L1-H6M5L5。流分frs. H6M5L1(0.9 g) 经过制备高效液相色谱 (70%乙腈) 得到化合物 3 (325.5 mg)。

实施例2 铁皮石斛叶中分离的3个联苄类化合物的结构鉴定

化合物1为一种白色无定型粉末。HR-ESI-MS 给出准分子离子峰m/z 629.2388([M-H]^-，计算值: 629.2392)，确定其分子式为C₃₆H₃₈O₁₀。Denofficin的IR 谱显示了羟基(3519，3445 cm^-1)、甲氧基 (2936，2852 cm^-1)、羰基 (1733 cm^-1) 以及芳环 (1606, 1516,1454 cm^-1) 的特征性吸收。其¹H NMR谱 (600 MHz, CDCl₃) 的低场区域显示了12个来自四个芳环系统的质子信号。其中，8个来自两个互相独立的A₂B₂型芳环自旋耦合体系信号：δ _H7.10 (2 H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.83 (2 H, d, J = 8.5 Hz, 3′, 5′), 7.04(2 H, d, J = 8.3 Hz, H-2′′′, 6′′′), 6.70 (2 H, d, J = 8.3 Hz, 3′′′, 5′′′); 2个来自一套1,3,4,5-对称四取代芳环质子信号：δ _H 6.55 (2 H, s, H-2′′, 6′′); 2个来自一对间位耦合芳香质子信号：δ _H 6.49 (1 H, d, J = 1.6 Hz, H-2) 和6.32 (1 H, d,J = 1.6 Hz, H-6)。其¹HNMR谱的高场区显示如下质子信号：2个氧化次甲基δ _H 4.77 (1 H,d, J = 7.9 Hz, H-7′′), 4.20 (1 H, m, H-8′′); 1个氧化亚甲基δ _H 4.34 (1 H, dd, J= 12.3, 3.1 Hz, H_α-9′′), 4.02 (1 H, dd, J = 12.3, 4.6 Hz, H_β-9′′); 4个甲氧基δ _H3.87 (6 H, s, MeO-3′′, 5′′), 3.84 (3 H, s, MeO-5), 3.79 (3 H, s, MeO-4′)。除此之外，在其氢谱最高场区域中还观察到了8个亚甲基信号：δ _H 2.86-2.79 (6 H, m, H-a,a′, and 7′′′), 2.58 (2 H, m, H₂-8′′′)。其¹³C, DEPT 135 和HSQC NMR谱显示，denofficin含36个碳原子，包括1个羰基、12个sp²杂化的季碳 (其中8个携氧)、12个sp²杂化的次甲基碳、2个sp³杂化的次甲基碳（均携氧）、5个sp³杂化的亚甲基碳 (其中1个携氧) 以及4个甲氧基碳。以上这些¹H and ¹³C NMR 数据与已知联苄衍生物dendrocandin B 的高度相似。二者NMR数据的主要区别在于denofficin多了一套对羟基苯丙酰基的信号：δ _H 7.04(2 H, H-2′′′, 6′′′), 6.70 (2 H, H-3′′′, 5′′′), 2.83 (2 H, H-7′′′), 2.58 (2 H,H-8′′′)；δ _C 132.4 (C-1′′′), 129.4 (C-2′′′, 6′′′), 115.4 (C-3′′′, 5′′′), 154.1(C-4′′′), 29.9 (C-7′′′), 35.9 (C-8′′′), 172.4 (C-9′′′)。这提示denofficin为已知化合物dendrocandin B 的对羟基苯丙酰基化衍生物。Denofficin的HR-ESI-MS给出的分子式C₃₆H₃₈O₁₀支持了这个推测。在denofficin的HMBC谱上观察到了H_α/H_β-9′′ 与C-9′′的相关峰，提示对羟基苯丙酰基取代发生在C-9′′的羟基上。通过分析denofficin的 HSQC和HMBC谱，我们全归属了其一维NMR谱中的所有氢、碳信号 (表1) 并确定了4个甲氧基的取代位置。H-7^′′与H-8^′′的耦合常数为J _{7′′,8′′} = 7.9 Hz （双直立键），可以判断C-7^′′ 和 C-8^′′的相对构型为反式。另外，denofficin的比旋光值为-5.8，与前人合成的一对结构类似的对映异构体 (-)-aiphanol (7^′′ R,8^′′ R) 和 (+)-aiphanol（7^′′ S,8^′′ S）中的 (-)-aiphanol旋光方向一致，因此确定了C-7^′′ and C-8^′′的绝对构型均为S构型。于是，化合物1最终鉴定为(2S,3S)-3-(4-羟基-3,5-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(4-甲氧基苯基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-2-基）甲基 3-（4-羟基苯基）丙酸酯，我们命名为denofficin。其结构式如图1所示。

表1 新化合物denofficin的核磁共振氢谱和碳谱数据

化合物2被鉴定为dendrocandin B，其结构式如图1所示。淡黄色无定型粉末,C₂₇H₃₀O₈。 ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ _H: 7.10 (2 H, d, J = 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.83(2 H, d, J = 8.6 Hz, H-3′, 5′), 6.67 (2 H, s, H-2′′, 6′′), 6.51 (1 H, d, J =1.9 Hz, H-2), 6.32 (1 H, d, J = 1.9 Hz, H-6), 4.95 (1 H, brs, H-7′′), 3.98 (1H, m, H-8′′), 3.90 (1 H, m, H_a-9′′), 3.55 (1 H, m, H_b-9′′), 3.91 (6 H, s, MeO-3′′, 5′′), 3.85 (3 H, s, MeO-5), 3.79 (3 H, s, MeO-4′), 2.86-2.79 (4 H, m,H₂-a, a′); ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃)δ _C: 158.0 (C-4′), 148.6 (C-5), 147.4 (C-3′′,5′′), 144.3 (C-3), 135.4 (C-4′′), 134.7 (C-1), 133.9 (C-1′), 131.1 (C-4),129.5 (C-2′, 6′), 127.5 (C-1′′), 113.9 (C-3′, 5′), 109.7 (C-2), 105.0 (C-6),104.3 (C-2′′, 6′′), 78.4 (C-8′′), 76.6 (C-7′′), 61.7 (C-9′′), 56.6 (MeO-3′′,5′′), 56.2 (MeO-5), 55.4 (MeO-4′), 38.1 (C-a), 37.1 (C-a′)。

化合物3被鉴定为dendrocandin U，其结构式如图1所示。淡黄色无定型粉末,C₂₆H₂₈O₈。¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ _H: 6.96 (2 H, d, J = 7.4 Hz, H-2′, 6′), 6.71(2 H, s, H-2′′, 6′′), 6.69 (2 H, d, J = 7.4 Hz, H-3′, 5′), 6.39 (1 H, s, H-2), 6.34 (1 H, s, H-6), 4.82 (1 H, d, J = 7.8 Hz, H-7′′), 3.99 (1 H, m, H-8),3.88 (6 H, s, MeO-3′′, 5′′), 3.79 (3 H, s, MeO-5), 3.67 (1 H, dd, J = 12.3,2.4 Hz, H_a-9′′), 3.49 (1 H, dd, J = 12.3, 4.8 Hz, H_b-9′′), 2.78-2.72 (4 H, m,H₂-a, a′ )；¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ _C: 156.4 (C-4′), 149.6 (C-5), 149.4 (C-3′′, 5′′), 145.4 (C-3), 135.7 (C-4′′), 132.9 (C-1), 132.4 (C-1′), 131.1 (C-4), 130.5 (C-2′, 6′), 129.5 (C-1′′), 116.0 (C-3′, 5′), 110.7 (C-2), 106.4 (C-6), 105.9 (C-2′′, 6′′), 79.8 (C-8′′), 77.8 (C-7′′), 62.1 (C-9′′), 56.8 (MeO-3′′, 5′′), 56.6 (MeO-5), 39.2 (C-a ), 38.2 (C-a′)。

实施例3 所分离的3个联苄类化合物对大鼠PMNs的细胞毒性评价实验

采用以下实验步骤分离、纯化大鼠PMNs。取清洁级SD大鼠 (江西中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（赣）2018-0003)，眼眶取血9 mL，垂直滴入用1 mL 1％肝素钠抗凝好的玻璃离心管中。以5:1的比例加入4.5%的葡聚糖T-500生理盐水溶液混匀，4°C静置约1 小时。取上清液，按3:1的比例加到预先装有淋巴细胞分离液的离心管内，800转/分钟 (275 g) 离心15分钟，取出离心管，管内分三层，上层是淡黄色血清，中部白色雾状区为单核细胞和淋巴细胞，下层沉降到管底的是PMNs。弃上清液，加入2 mL特殊分离液漂洗一次，振荡后于2500转/分钟 (531 g) 离心5分钟。弃上清液，往每个离心管内加2 mL双蒸水，吹打、振荡20秒 (将红细胞溶胀) 后，立即加入1.8%的NaCl溶液2 mL混匀，2500转/分钟(531 g) 离心5分钟，弃上清，重复此操作，直至无血细胞残留。再以HBSS-FCS缓冲液漂洗1-2次，每次用HBSS-FCS溶液2 mL,均在2500转/分钟 (531 g) 离心3分钟，弃去上清液。分离得PMNs，再次加入HBSS-FCS缓冲液2 mL，混匀，台盼蓝染色法测活力 (3 h内PMNs的活力>95%)，4°C保存作为细胞母悬液备用。

参照标准台盼蓝排除法的相关文献，测定denofficin对PMNs的细胞毒性。取50 μLPMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×10⁶ 个/mL。取1 mL的PMNs细胞稀释液与10 μL DMSO或待测化合物 (用DMSO溶解，终浓度范围从1到1000 μM) 混合，37°C下孵育30分钟。每份样本中加入112 μL 0.4%的台盼蓝染液，高倍显微镜下，通过计数100个细胞吸收台盼蓝的情况来计算样品对PMNs的细胞毒性作用。结果表明，3个联苄类化合物均在120 μM以上才开始表现对PMNs的毒性。

实施例4所分离的3个联苄类化合物对大鼠PMNs呼吸爆发抑制率的测定

采用与实施例3相同的步骤制备大鼠PMNs细胞母悬液。取50 μL PMNs细胞母悬液，用2%小牛血清的HBSS液稀释到细胞浓度为2×10⁶ 个/mL。4°C保存备用。PMNs在受到外源性刺激剂-佛波豆蔻酸乙酯 (佛波醇) (PMA) 激活后发生呼吸爆发，产生大量的活性氧自由基，自由基被发光剂鲁米诺捕获产生化学发光 (Chemiluminesence，CL)，PMN-CL强度与PMNs的细胞数量及PMNs的呼吸爆发和吞噬功能正相关。BPCL-K超微弱发光测量仪(中国科学院北京生物物理研究所，配套BPCL Appl.7.2数据处理工作站) 参数设定为：发光池温度37°C，电压值800 V，最长检测时间1800 s，计数时间间隔5 s。使用前将仪器预热半小时，并走基线。待基线平稳后，取1 ml PMNs细胞稀释液于发光杯中，向其中加入200 μl鲁米诺工作液，置于超微弱发光测量仪中孵育10 min (参数设定：发光池温度37°C，电压800 V，最长检测时间1800 s)，记录自发光过程 (计数时间间隔5 s)。然后加入10 μl 样品溶液 (以10μl DMSO为空白对照) 继续测定5 min，加入8 mg·ml^-1 PMA刺激剂10 μl，继续测定15 min,记录测定结果。PMN-CL强度以发光记数峰高表示。按公式(1)计算PMN-CL抑制率。

(1)

以PMN-CL抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，建立量效关系曲线，通过量效曲线可求算出发光抑制率为50%时样品的浓度 (即IC₅₀值)。以维生素C (V_c) 作为阳性对照。结果表明，所分离的3个联苄类化合物对佛波豆蔻酸乙酯 (PMA) 刺激的大鼠中性粒细胞爆发均有一定的抑制作用，其中denofficin (1) 的活性最强，而dendrocandin B (2) 和dendrocandin U (3)的活性依次次之。各化合物具体的半数抑制浓度 (IC₅₀) 数据见表2。

表2三个联苄类化合物对PMA刺激的大鼠PMNs爆发的抑制活性

注：维生素C为阳性对照药物; 与化合物dendrocandin B (2) 比较，##为P<0.01;与化合物dendrocandin U (3) 比较，§§为P<0.01; 与维生素C比较，^**为P<0.01。

Claims (4)

1.联苄类化合物denofficin，其特征在于该化合物具有以下所示的化学结构：

。

2.如权利要求1所述的联苄类化合物denofficin的制备方法，其特征在于，denofficin的制备方法包括如下具体步骤：

a.用体积浓度为50-100%的乙醇对铁皮石斛叶在室温下浸提，浸提使用的药材与溶剂为1:5-1:10，其中药材以千克计，溶剂以升计；重复浸提2-3次，每次10-20天；合并浸提液，减压浓缩，得到浸膏；

b.将步骤a得到的浸膏加入分散剂分散，分散剂为10%-20%乙醇，其加入的比例为浸膏：分散剂为1:2-1:5，其中浸膏以千克计，分散剂以升计，得分散液；

c.将步骤 b 得到的分散液上大孔吸附树脂柱, 依次用蒸馏水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇梯度洗脱，每梯度洗脱5个柱体积，得到10个流分frs. H0-H9；

d.将步骤 c 得到的70%乙醇洗脱流分fr. H7经MCI CHP-20P树脂柱色谱，用乙醇-水溶剂系统20:80-90:10梯度洗脱，得8个流分frs. H7M1-H7M8；

e.将步骤 d 得到的流分fr. H7M6 进一步上Sephadex LH-20柱，用90%甲醇洗脱，得6个流分frs. H7M6L1-H7M6L6；

f.将步骤 e 得到的流分fr. H7M6L6经过制备高效液相色谱，采用50%-80%乙腈为流动相梯度洗脱，得到所述的化合物denofficin。

3.如权利要求2所述的联苄类化合物denofficin的制备方法，其特征在于，步骤c所述的大孔吸附树脂柱为HP-20大孔吸附树脂柱或D101大孔吸附树脂柱。

4.如权利要求1所述的联苄类化合物denofficin及其药学上可接受的盐在制备治疗炎症性疾病药物中的用途，其特征在于：所述炎症性疾病包括类风湿性关节炎、代偿性抗炎反应综合症、全身性炎症反应综合症。

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