KR100460133B1 - 생열귀나무 추출물로부터 항산화활성이 우수한 카테킨의 생산방법 - Google Patents
생열귀나무 추출물로부터 항산화활성이 우수한 카테킨의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 활성이 있는 생열귀나무 추출물 및 이를 이용한 카테킨의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생열귀나무로부터 알코올로 추출하거나 혹은 이로부터 에틸아세테이트 등의 유기용매로 분획한 생열귀나무 추출물 및 이로부터 항산화 활성이 높은 플라반계 화합물인 카테킨(Catechin)을 단리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 생열귀나무로부터 메탄올등의 알코올로 추출하거나, 이로부터 에틸아세테이트 등의 유기용매로 분획한 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 생열귀나무 추출물은 다량의 플라반계 화합물인 카테킨을 함유하고 있으며, 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DDPH; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 자유라디칼 소거활성, 지질과산화 억제활성 및 저밀도지방단백질(Low density lipoprotein)의 산화에 대한 항산화 활성으로 인하여 의약품 및 의약부외품, 화장품 첨가물, 식품 첨가물, 음료 첨가물 및 기능성 건강보조식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 생열귀나무 추출물에 함유된 카테킨을 유효성분으로 하는 항산화제에 관한 것이다. 보다 더 구체적으로 설명하자면, 생열귀나무로부터 메탄올등의 알코올로 추출하거나, 이로부터 에틸아세테이트 등의 유기용매로 분획한 추출물로서, 지질과산화 억제활성 및 저밀도지방단백질 억제활성을 포함하는 항산화제로서 사용될 수 있는 추출물 및 이로부터 항산화 활성이 높은 카테킨(catechin) 화합물을 단리하는 방법에 관한 것으로서, 의약품 및 의약부외품, 화장품 첨가물, 식품 첨가물, 음료 첨가물, 및 건강보조식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
생열귀나무(Rosa davuricaPall.)는 장미과에 속하는 다년생 식물로서 우리나라 중부 및 북부, 일본, 만주, 및 시베리아 등에 분포하는 낙엽활엽관목이다. 높이 1∼1.5 m이며 줄기는 곧게 서고, 적갈색이며 가시가 있다. 잎은 우상복엽(羽狀複葉)으로 나며 타원형 또는 장타원형으로 양끝이 뾰족하며 길이 1∼3 cm로서 가장자리에 잔 톱니가 있고 뒷면에 선점(腺點)이 있다. 꽃은 장미색으로 향기가 짙다. 과실은 구형이며 9월에 황홍색으로 익는다. 꽃잎은 광도란형이며 끝이 오므라든다. 민간에서는 식용으로 쓰이고 있으며, 뿌리와 열매는 건위이기와 양혈조경에 쓰이며, 소화불량, 기대복사, 위통, 월경부조 등의 치료[육창수, (1989) 원색한국약용식물도감, p272]에 사용되어 왔다. 또한, 민간에서는 비타민 결핍증과 여러 질병들에 대한 저항성 증가, 열물내기약, 간기능 보호약 등으로도 사용하여 왔다. 최근의 연구결과에 의하면, 생열귀 열매 및 잎에는 다량의 비타민 C를 함유하고 있는 것으로 보고[신국현 등, (1998) 한국약용작물학회, 6, 6-10]되어 약용식물 자원으로 주목을 받고 있다. 그러나 현재까지 어떠한 생리활성 성분이 들어 있어서 이러한 생리활성을 나타내는지 알지 못하였다.
최근, 노화(aging)와 각종 성인병 질환의 원인이 활성산소종에 기인된 것이라는 학설이 인정됨에 따라, 산소로부터 유래된 활성산소종을 조절할 수 있는 천연 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 활성산소종(superoxide anio n, hydroxyl radical, peroxyl radical, alkoxyl radical 등)을 조절할 수 있는 물질을 항산화제(antioxidants)라고 하는데, 여기에는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sup eroxide dismutase), 글루타치온 퍼옥시다제( glutathione peroxidase), 카탈라제( catalase) 등의 항산화계 효소와 토코페롤(tocopherol), 글루타치온(glutathione), 아스코르브산(ascorbate), 플라보노이드(flavonoid)계 화합물 등의 저분자 유래의 비효소계 항산화제(antioxidants)가 존재하고 있다. BHT(bytylated hydroxytoluen e), BHA(butylated hydroxyanisole) 등의 합성항산화제도 개발되어 식품분야에서 이용되고 있으나, 변이원성 및 독성이 지적되면서, 보다 안전하고 활성이 우수한 천연 항산화제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다[Richard, M. J.,et al., (1992) J. Chromarography, 577, 9-18 ; Lissi, E.,et al., (1995) Free Rad ic. Biol. Med., 18, 153-158 ; Ghiselli, A.,et al., (1995) Free Radic. Biol. Med., 18, 29-36 ; Hsiao, G.,et al., (1996) Biochim. Biophys. Acta, 1298,119-130 ; Frei, B.,et al., (1998) 85, 9748-9752]. 그러나 현재까지 개발된 항산화제는 효력이나 비용면에서 기존의 합성 항산화제를 능가하지 못하고 있는 실정으로서 항산화 활성이 탁월하면서도 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 식물자원으로부터 새로운 천연 항산화제를 개발하고자 계속 연구한 결과, 생열귀나무로부터 강력한 항산화 활성을 확인하였고, 이를 메탄올로 추출한후, 추출물을 물에 현탁시킨후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매로 분획한후, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물로부터 항산화 활성이 탁월한 카테킨 화합물을 분리하고, 구조를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 항산화 활성을 가지는 생열귀나무로부터 알코올로 추출하거나, 이 추출물을 유기용매로 분획한, 항산화 활성을 지니는 플라반계 화합물인 카테킨의 제조방법 및 이들 추출물을 유효성분으로 하는 항산화제, 지질과산화 억제제, 혹은 저밀도지방단백질 산화 억제제(동맥경화 억제제)용의 식품첨가제, 의약품 및 의약부외품, 화장품첨가제, 음료첨가제, 또는 기능성 건강보조식품 등의 원료로 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 명세서내의 화학식 1의 자외선 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 2는 명세서내의 화학식 1의 수소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 3은 명세서내의 화학식 1의 탄소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 4는 명세서내의 화학식 1의 고압액체크로마토그래피(HPLC)의 크로마토그램을 나타낸 것이고,
도 5는 저밀도지방단백질(LDL) 산화에 대한 생열귀나무 추출물의 항산화 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 강원도내에 자생하는 식물자원으로부터 천연 항산화제를 개발하기 위한 과정에서, 생열귀나무 추출물 및 분획물에서 항산화 활성을 확인하고, 이로부터 항산화 물질을 분리하였다. 구체적으로, 본 발명은 생열귀나무를 메탄올로 추출하고, 이 추출물을 다시 물에 현탁시킨후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매로 순차적으로 분획하여, 추출물 및 분획물을 얻었다. 상기 생열귀 나무의 추출물 및 분획물을 사용하여 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 자유라디칼 소거활성 측정법에 의한 항산화 활성을 조사하였다. 이때, 생열귀나무 추출물중, 생열귀 뿌리가 항산화 활성이 가장 뛰어났으며, 분획물중에서는 생열귀 뿌리의 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물이 가장 탁월한 항산화 활성을 나타내었다. 또한, 본 발명은 생열귀나무 뿌리의 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 순차적으로 흡착크로마토그래피, Sephadex LH-20, 및 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 항산화 활성이 탁월한 하기 화학식 1의 화합물을 분리, 정제하였다.
(화학식 1)
이때 생열귀나무 추출물의 경우, 흡착 크로마토그래피인 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이 바람직하고, 전개용매로 클로로포름:메탄올의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 생열귀나무 추출물의 경우는 에틸아세테이트 등의 유기용매로 분획한 다음, 고압액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 상기 화학식 1의 화합물을 정제하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화학식 1의 물리, 화학적 성질은 분광광도계, 탄소핵자기 공명 스펙트럼, 수소핵자기 공명 스펙트럼 등으로 조사하여 상기 화합물이 catechin임을 확인하였다. 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 및 생열귀 추출물의 항산화 활성을 조사하기 위하여, 자유라디칼(free radical)을 함유하는 1.1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydra zyl, DPPH)을 사용하여 항산화 활성을 측정하는 방법과, 치오바비츄릭산 반응물질( thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)을 측정하는 지질과산화물 억제활성 측정법과, 구리(copper)에 의한 저밀도지방단백질(low density lipoprotein)의 산화에 대한 항산화효과를 측정하는 방법을 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 화합물 및, 생열귀나무 추출물은 DPPH 자유라디칼 소거활성과, 지질과산화 억제활성과, 더불어 저밀도지방단백질에 대한 강력한 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 과정을 통하여 제조된 본 발명의 추출물이 치료용 약제로 이용되기 위해서는, 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른유효 성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게는 1일에 30∼300mg 정도를 투여하나, 50∼200mg 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 단위투여형 제제는 전술한 유효량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질을 20∼100mg의 함량이 되도록 제조한다. 바람직하게는 10∼50mg 정도를 함유하도록 제형화하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예 및 실험예를 상세히 기재한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>: 생열귀나무 추출물의 제조
본 발명은 생열귀나무를 이용하여 천연 항산화제를 개발하기 위하여, 강원도 정선군 일대에서 자생하는 생열귀나무를 채취하고, 잘게 세절하여 음건한 다음, 부위별로 20g을 환류냉각기를 부착시킨 플라스크에 넣은 뒤, 시료중량의 20배의 물, 에탄올, 메탄올, 및 클로로포름 용매를 각각 넣고, 수욕상에서 24시간 가온추출 하였다. 여과한 다음, 감암농축하여 얻어진 각각의 추출물을 대상으로, 수율 및 DPPH 자유라디칼 소거법에 의한 항산화 활성을 예비로 실험하였으며, 그 결과를 다음 표1 및 2에 기재하였다. 생열귀나무 추출물의 항산화 활성은 자유라디칼(free radical)인 1.1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH )을 사용하여 항산화 활성을 조사하였다[Yoshida, T.,et al., (1989) Chem. Phar m. Bull., 37, 1919-1921]. 유리시험관에 추출물을 적당한 농도로 희석시킨(0∼0. 2mg) 메탄올용액 4ml 용액에 상기 DPPH(0.2 mM in methanol) 용액 1ml를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨후, 514nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 항산화 활성 [IC50 :㎍/ml]은 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 50% 감소시키는 화합물의 농도로 나타내었다. 그 결과, 생열귀나무 뿌리의 메탄올 추출물의 항산화 활성[IC50: 2.9㎍]이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 생열귀 줄기, 잎, 열매 순으로, 모든 추출물이 매우 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 생열귀나무 클로르포름 추출물을 제외하고, 물 추출물 및 에탄올 추출물에서도 모두 높은 항산화 활성을 지닌 것으로 나타났다.
표 1. 용매에 의한 생열귀나무 부위별 추출 수율.
| 용매 | 추출수율(%, weight/weight) | |||
| 열매 | 잎 | 줄기 | 뿌리 | |
| 에탄올 | 3.1 | 15.2 | 3.7 | 7.5 |
| 메탄올 | 4.2 | 23.3 | 7.3 | 15.3 |
| 클로로포름 | 0.9 | 5.5 | 0.8 | 0.4 |
| 물 | 8.6 | 26.0 | 8.0 | 13.0 |
표 2. DPPH 자유라디칼 소거활성 측정법에 의한 생열귀나무 추출물의 항산화 효과.
| 추출물 | 항산화 활성 [IC50: ㎍/ml]* | |||
| 에탄올 | 메탄올 | 클로르포름 | 믈 | |
| 열매 | 21.5 | 13.9 | 〉200.0 | 9.6 |
| 잎 | 11.5 | 6.4 | 〉200.0 | 4.8 |
| 줄기 | 5.6 | 3.9 | 21.2 | 5.6 |
| 뿌리 | 3.7 | 2.9 | 76.9 | 5.2 |
| 항산화제 | ||||
| BHT | 5.4 | |||
| 비타민 C (Vitamin C) | 1.7 | |||
| 알파-토코페롤 (α-Tocopherol) | 4.2 |
*항산화 활성[IC50 :㎍/ml]은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도로 나타내었다.
<실시예 2>: 유기용매에 의한 생열귀나무 추출물의 용매분획
생열귀나무로 추출물로부터 항산화 활성이 있는 새로운 물질을 얻기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 과정으로, 항산화 활성이 가장 탁월한 생열귀나무 뿌리의 메탄올 추출물을 얻었다. 즉, 잘게 세절하여 음건한 생열귀나무 뿌리(1kg)를 메탄올 20리터(L)를 가하여 3일간 냉침 추출하고, 다시 잔사를 메탄올 20리터(L)로 추출한 뒤, 추출물을 모두 감압농축하여 메탄올 추출물(MeOH ext.)을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 물로 현탁시킨 후, 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올 순서로 용매분획하여 각 분획물을 얻고, 상기 실시예 1에 명시된 DPPH 자유라디칼 소거법에 의해, 각 분획물의 항산화 활성을 조사하였으며, 그 결과는 다음 표 3에 나타내었다. 그 결과, 에틸아세테이트 분획물의 항산화 활성[IC50: 1.7㎍]이 가장 높았으며, 그 다음이 부탄올 분획물[IC50: 2.0㎍]로 나타났다. 에틸아세테이트 분획물의 경우, 잘 알려진 항산화제 BHT, 비타민 C, 혹은 알파-토코페롤과 유사하거나 우수한 항산화 활성을 나타내었다.
표 3. DPPH 자유라디칼 소거활성 측정법에 의한 생열귀나무 분획물들의 항산화 효과.
| 분획물 | 항산화 활성 [IC50: μg/ml]* |
| BHT | 5.4 |
| 비타민 C (Vitamin C) | 1.7 |
| 알파-토코페롤 (α-Tocopherol) | 4.2 |
| 메탄올 추출물 | 2.9 |
| 헥산 분획물 | >400.0 |
| 클로로포름 분획물 | 8.0 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 1.7 |
| 부탄올 분획물 | 2.0 |
| 물 분획물 | 11.3 |
*항산화 활성[IC50 :㎍/ml]은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도로 나타내었다.
<실시예 3>: 항산화 활성성분 카테킨 화합물의 분리
생열귀나무로부터 항산화 활성성분을 분리하기 위하여, 상기 실시예 2에서 얻은 에틸아세테이트 분획물(40.52g)중 10.38g을 대상으로 클로로포름:메탄올 혼합용매를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 4개의 분획을 얻었으며, 이중 하나의 활성분획(0.32g)을 대상으로 메탄올을 용매로 사용한 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로서, 상기 화학식 1의 화합물을 210mg 얻었다. 이활성 물질의 구조는 기 발표된 문헌치[Davis, A. L.,et al., (1996) Magnetic Resonance in Chemistry, 34, 887-890 ; 권용수 등, (1997) 한국약용작물학회지, 5(4), 302-306 ; 최용화 등, (1998) 생약학회지, 29(2), 79-85 ; 방면호 등, (199 9) 한국농화학회지, 42, 170-175]와 비교하여 플라반계 화합물인 catechin으로 동정하였으며, 이 물질의 핵자기 공명 스펙트럼, 물리, 화학적 성질 등의 결과들은 다음과 같다.
(1) 화학식 1의 화합물 : 3',4',5,7-테트라하이드록시플라반-3-올
(3',4',5,7-tetrahydroxyflavan-3-ol)
(2) 물질의 성상 : 흰색 분말상
(3) 분자량 : 290
(4) 분자식 : C15H14O6
(5) 자외선 흡수 스펙트럼 : UVλmaxMeOHnm : 212, 280
자외선 흡수 스펙트럼은 도면 1에 나타낸 바와 같다.
(6) 수소 핵자기 공명 스펙트럼 :1H NMR (200 MHz, acetone-d 6 )δ : 6.92 (1H, J=1 .6 Hz, H-2'), 6.83(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 6.72(1H, dd, J=8.4Hz, 1.9 Hz, H-6' ), 6.05(1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 5.90(1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 4.58(1H, d, J=7.4 Hz, H-2), 4.02(1H, m, H-3), 2.93(1H, dd, J=16.2 Hz, 5.1 Hz, H-4a), 2.55(1H, dd , J= 16.2 Hz, 8.4 Hz, H-4b).
듀아세톤(acetone-d 6 )을 용매로 사용하고, 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 사용하여 수소핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼을 조사하였다. 그 결과는 도면 2에 나타낸 바와 같다.
(7) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 :13C-NMR (acetone-d 6 ) δ 156.08 (C-9), 155.58 (C-5), 155.28 (C-7), 144.06 (C-4'), 143.98 (C-3'), 130.52 (C-1'), 118.44 (C-6'), 114.07 (C-5'), 113.59 (C-2'), 98.98 (C-10), 94.43 (C-6), 93.76 (C-8), 81.02 (C-2), 66.65 (C-3), 28.96 (C-4).
듀아세톤(acetone-d 6 )을 용매로 사용하고, 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 사용하여 탄소핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 조사하였다. 그 결과는 도면 3에 나타낸 바와 같다.
(8) 용해성 : 메탄올, 아세톤 등에 잘 녹는다.
(9) 박층 크로마토그래피(TLC)에 의한 Rf치 : 흡착제로 실리카겔(Kieselgel 60F254, Merk 사)를 사용하고, 전개용매로 클로로포름:메탄올(5:1) 혼합용매를 사용했을 때 Rf치는 0.31이다.
(10) 화학식 : 전기와 동일
<실시예 4>: 활성성분 카테킨의 정량방법
이 물질은 고압액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 생열귀(뿌리, 줄기, 잎, 열매) 추출물 로부터 정량할 수 있었으며, 정량조건은 다음과 같다. 생열귀를 각 부위별로 분쇄기로 갈은 다음 얻은 시료 20g을 메탄올 400ml를 가해주고 3일간 상온에서 추출한 뒤 여과, 농축, 건조한 후 추출물을 얻은 다음 추출물 약 10mg을 취하여 이동상(H2O-CH3CN-TFA=80:20:0.1) 용매 10ml를 가하여 용해시키고, 여과한뒤, HPLC의 검액으로 하였다. 이때 컬럼은 μ BondapakTMC18(3.9×300mm), 이동상은 H2O-CH3CN-TFA=80:20:0.1, 검출기는 UV 280 nm, 유량은 1.0ml/min으로 실시하였다. 이때 표준품 catechin 및 상기 화학식 1의 화합물은 4.223 분의 유지시간을 나타내었다. 상기 화학식 1의 HPLC 크로마토그램 결과를 도면 4에 나타내었다.
<실시예 5>: 생열귀나무 추출물중 HPLC를 이용한 활성성분 카테킨의 함량분석
상기 실시예 4에 명시한 방법을 이용하여 생열귀나무(뿌리, 줄기, 잎, 및 열매) 추출물 및 분획물내의 활성성분의 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었는데, 주로 생열귀나무 줄기와 뿌리의 메탄올 추출물과 에탄올 추출물에서 활성성분 catechin을 다량 함유하고 있었다. 생열귀나무의 줄기와 뿌리 메탄올 추출물중, 활성성분 catechin이 각각 18.1±0.3, 25.0±1.5%로 매우 많은 양을 함유하고 있었다. 특히, 생열귀나무 에틸아세테이트 분획물의 경우, 33.4±0.2%로 매우 많은 양의 catechin이 함유되어 있음을 확인하였다. 그러므로 생열귀나무의 주된항산화 활성성분은 상기 화학식 1일 것으로 추정된다.
표 4. 생열귀나무 추출물중 활성성분 Catechin의 함량
| 추출물 | % 함량, 평균±표준편차 | ||
| 메탄올 | 에탄올 | 물 | |
| 열매 | 0.0±0.0 | 0.0±0.0 | 0.0±0.0 |
| 잎 | 0.0±0.0 | 1.4±0.1 | 0.0±0.0 |
| 줄기 | 18.1±0.3 | 8.9±0.2 | 3.8±0.3 |
| 뿌리 | 25.0±1.5 | 13.3±1.1 | 0.0±0.0 |
| 에틸아세테이트분획물 | 33.4±0.2 | ||
| 부탄올 분획물 | 10.5±0.1 |
<실험예 1>: 화학식 1의 DPPH 자유라디칼 소거활성에 의한 항산화 효과
본 발명의 화학식 1의 화합물이 나타내는 항산화 활성을 자유라디칼(free radical)인 1.1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH )을 사용한 항산화 활성 측정방법으로 조사하였다. 유리시험관에 시료 화합물을 적당한 농도로 희석시킨(0∼0.1mg) 메탄올용액 4ml 용액에 상기 DPPH(0.2mM in metha nol) 용액 1ml를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨후, 514nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 항산화 활성[IC50 :㎍/ml]은 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 50% 감소시키는 화합물의 농도로 나타내었다. 그 결과, 표 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 비교시약인 BHT(butylated hydroxytoluene), 알파-토코페롤(α-tocopherol), 카테친(catechin)보다 높은 활성을 나타내었고, 특히, BHT보다는 3.2배, 알파토코페롤보다는 2.5배 높은 항산화 활성을 나타냄을 확인하였다.
표 5. 화학식 1의 화합물의 DPPH 자유라디칼 소거활성에 의한 항산화 효과
| 화합물 | 항산화 활성 [IC50: μg/ml]* |
| 화학식 1의 화합물 | 1.7 |
| BHT | 5.4 |
| 비타민 C (Vitamin C) | 1.7 |
| 알파-토코페롤 (α-Tocopherol) | 4.2 |
| 카테친(Catechin) | 2.5 |
*항산화 활성[IC50: μg/ml]은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도로 나타내었다.
<실험예 2>: 생열귀나무 뿌리 추출물 및 분획물의 지질과산화 억제효과
위에서 얻은 생열귀나무 뿌리 추출물 및 분획물이 나타내는 지질과산화 억제활성을 TBA (thiobarbituric acid)가 측정방법으로 조사하였다[Buege, J. A., and Aust, S. D., (1978) in Methods in Enzymology, 52, 302-310 ; Ohkawa, H., et al ., (1979) Anal. Biochem., 95, 351-358]. 추출물 혹은 분획물(0∼300㎍)을 1mM Fe SO4와 1mM ascorbate를 포함하는 반응계에 흰쥐의 간균등액(1mg/ml) 0.2ml 및 완충용액을 첨가하여 반응액을 1ml가 되도록 처가한 다음, 37℃에서 1시간 반응시, 생성되는 지질과산화물을 TCA-TBA-HCl(15% trichloroacetic acid; 0.375% thiobarbit uric acid; 0.25N HCl)용액 3ml를 첨가하여, 95℃에서 15분간 반응시킨 뒤, 원심분리하여 상등액을 취한 뒤, 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지질과산화 억제효과[IC50 :㎍/ml]는 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도로 나타내었다. 그 결과, 표 6에서 나타낸 바와 같이 생열귀나무 뿌리 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물에서 강력한 지질과산화 억제효과를 나타내었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물[IC50 :25㎍]의 경우, 잘 알려진 천연항산화제 비타민 C에 대하여 8.8배, 알파-토코페롤에 비해 6.5배 높은 지질과산화 억제효과를 확인하였다.
표 6. 생열귀나무 뿌리 추출물 및 분획물의 지질과산화 억제효과
| 분획물 | 지질과산화 억제효과[IC50: ㎍/ml]* |
| BHT | 0.33 |
| 비타민 C (Vitamin C) | 221 |
| 알파-토코페롤 (α-Tocopherol) | 162 |
| 메탄올 추출물 | 58 |
| 헥산 분획물 | 129 |
| 클로로포름 분획물 | 154 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 25 |
| 부탄올 분획물 | 121 |
| 물 분획물 | >300 |
*지질과산화 억제효과[IC50: ㎍/ml]는 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도로 나타내었다.
<실시예 3>: 저밀도지방단백질 산화에 대한 생열귀나무 추출물의 항산화 효과
탁월한 항산화 효과를 나타낸 생열귀나무 뿌리의 메탄올 추출물의 동맥경화 억제효과를 알아보기 위하여, 위에서 얻은 생열귀나무 추출물 및 분획물을 대상으로 저밀도지방단백질(LDL) 산화에 대한 항산화 효과를 측정하였다[Yan, L.-J., et al., (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm., 212, 360-366]. 저밀도지방단백질(LDL, 65㎍), CuSO4(20μM), 및 추출물 혹은 분획물(0 ∼ 100㎍)에 전체부피가 1ml가 되도록 완충용액(phosphate buffer, pH 7.4)을 첨가한 뒤, 37℃에서 8시간 반응시킨 뒤, EDTA(1mM)를 20㎕ 첨가하여 반응을 중시시켰다. 이때 LDL내의 산화지질량( malondialdehyde의 양)을 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)방법으로 측정하였다. 생열귀나무 분획물의 저밀도지방단백질에 대한 항산화 효과를 측정한 결과를 도면 5에 기재하였다. 그 결과, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물이 가장 높은 항산화 효과를 나타내었다. 분획물 30㎍/ml 농도에서, 부탄올 분획물은 93.2%(2.6nmol/mg), 에틸아세테이트 분획물은 85.3%(5.6nmol/mg), 클로르포름 분획물은 84.0%(6.1nmol/mg)의 산화억제율(MDA값)을 나타내었다. 소량의 분획물농도에서도 LDL 산화에 대한 강력한 항산화 효과를 나타내었다. 이 결과는, 생열귀나무 추출물이 강력한 DPPH 자유라디칼 소거활성과, 지질과산화 억제효과 및 저밀도지방단백질에 대한 항산화 효과를 가지고 있음을 보여주고 있다.
본 발명의 생열귀나무 추출물은 다량의 플라반계 화합물인 카테킨을 함유하고 있으며, DPPH 자유라디칼 소거활성, 지질과산화 억제효과, 및 저밀도지방단백질 산화에 대한 항산화 효과(동맥경화억제효과)를 동시에 나타내면서, 기존의 항산화제보다 높은 활성을 나타내므로 의약품 및 의약부외품, 식품 첨가물, 화장품 첨가물, 음료 첨가물, 및 기능성 건강보조식품 등으로 유용하게 널리 사용될 수 있다.
Claims (7)
- (1) 생열귀 나무의 줄기 또는 뿌리의 메탄올 추출물을 얻는 단계; (2) 상기 단계1에서 얻은 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; (3) 단계2의 에틸아세테이트 분획물에 대하여 클로로포름:메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획물을 얻는 단계; 및 (4) 단계3의 활성분획물에 메탄올을 용매로 사용하여 세파덱스 엘에이치 컬럼크로마토그래피를 수행하여 하기 화학식의 카테킨을 얻는 단계를 포함하는 항산화활성이 우수한 카테킨의 생산방법
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