KR100350891B1 - 아칼리시제니올리드 ｃ, ｄ, ｅ 및 ｆ - Google Patents

Abstract

본 발명은 강장동물로부터 추출한 신물질인 하기 화학식 1의 아칼리시제니올리드 C와 그 외 아칼리시제니올리드 D, E 및 F를 제공하고, 이 물질의 추출방법과 그 생리활성을 밝혀 그 용도를 제공하고자 하는 것이다.

[화학식 1]

Description

아칼리시제니올리드 Ｃ, Ｄ, Ｅ 및 Ｆ{ACALYCIXENIOLIDE Ｃ, Ｄ, Ｅ AND Ｆ}

본 발명은 강장동물인 아칼리시고르지아 이너미스(Acalycigorgia inermis)로부터 추출된 신규한 물질로서 본 발명자에 의해 명명된 아칼리시제니올리드 (acalycixeniolide) C, D, E 및 F에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 강장동물로부터 추출된 생리활성이 있는 신물질 아칼리시제니올리드(acalycixeniolide) C, D, E 및 F를 제공하고, 이들의 추출방법 및 그 약리학적 용도를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 다음 화학식 1, 2, 3 및 4의 구조를 갖는 아칼리시제니올리드(acalycixeniolide) C, D, E 및 F를 제공한다. 본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F는 아칼리시고르지아 이너미스(Acalycigorgia inermis)라는 강장동물로부터 추출된 물질로서 본 발명자에 의하여 명명된 이름이다.

아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F는 디테르펜(diterpene)계의 화합물이다. 주 대사물질인 아칼리시제니올리드 C의 기본 탄소골격은 9각형의 고리와 긴 곁가지를 가진 제니케인(xenicane) 골격이다. 그러나 이 물질은 일반적인 제니케인계 디테르펜에서 곁가지의 끝부분에 위치해야 하는 이소프로필(isopropyl)기가 절단되어 하나의 탄소를 잃으면서 형성된 알렌(allene)기를 갖고 있는 노르디테르페노이드 (norditerpenoid)이다. 이밖에 아칼리시제니올리드 C는 곁가지가 산화되면서 형성된 6각형의 락톤(lactone) 고리를 갖고 있으며 9각형 고리의 중간 부분에 각각 하나의 에폭시(epoxy)기와 엑소메틸렌(exomethylene)기를 갖는 구조적 특징이 있다.

아칼리시제니올리드 D의 분자식은 C₁₉H₂₄O₃으로, 아칼리시제올리드 C와 동일한 계에 속하는 제니케인 골격의 노르디테르페노이드 화합물이다. 이 물질의 구조는 아칼리시제니올리드 C와 매우 유사하나 6각형 락톤고리와 곁가지가 만나는 4번과 12번 탄소에서 수소가 이탈되어 두 탄소의 연결이 이중결합으로 변화되어 있다는 점에서 아칼리시제니올니드 C와 구분된다.

아칼리시제니올리드 E의 분자식은 C₂₃H₃₀O₆으로, 아칼리시제니올리드 C 및 D와 동일한 제니케인 골격의 노르디테르페노이드 화합물이다. 그러나 이 물질은 아칼리시제니올리드 C와 D에는 존재하지 않았던 두 개의 아세틸기를 갖고 있다. 이 물질에서는 다른 물질에 존재하는 6각형의 락톤고리가 하나의 에놀에테르로 바뀌어 있으며 1번 위치의 옥시메틸렌(oxymethyelene) 탄소와 곁가지의 12번 탄소에 각각 하나의 아세틸기가 결합되어 있다.

아칼리시제니올리드 F의 분자식은 C₂₀H₃₀O₃으로, 구조는 아칼리시제니올리드 C와 유7사하며 9각형의 고리, 6각헝의 락톤, 에폭시기, 엑소메틸렌 등의 작용기의 위치도 동일하다. 그러나 곁가지의 끝부분에 알렌 대신 완전한 이소프로필기를 갖고 있는 디테르펜이라는 점에서 아칼리시제니올리드 C, D 및 E 와 구분된다.

지금까지 구조적으로 유사한 제니케인골격의 디테르펜이나 노르디테르페노이드 물질이 몇 가지 알려져 있으나 문헌조사 결과 모두 작용기의 종류나 위치가 아칼리시제니올리드 C와는 상이하였다. 특히 이 물질은 6각형의 락톤고리와 곁가지의 끝에 알렌기를 갖고 있으며 동시에 각각 하나의 에폭시기와 엑소메틸렌기를 갖고 있다는 점에서 예전에 보고되었던 아칼리시제니올리드 A와 B를 포함하여 모든 기지의 물질과 구분된다. 문헌 조사 결과 아칼리시제니올리드 C와 마찬가지로 아칼리시제니올리드 D, E 및 F도 알려진 물질과는 작용기의 종류나 위치가 다른 신물질인 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 추출방법에 의하여 강장동물 아칼리시고르지아 이너미스로부터 추출된 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F는, 본 발명에 의해 시험관내(in vitro) 실험에서 인체의 백혈병(leukemia) 세포의 성장을 억제하는 역할을 하는 것으로 밝혀짐에 따라 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있게 되었다.또한, 아칼리시제니올리드 E는 인체의 Ras 유전자의 변형에 의한 정상세포의 암세포화 작용에 관여하는 파네실 단백질 전달효소(FPT; farnesyl protein transferase)에 대한 저해활성을 갖고 있음이 본 발명에 의하여 밝혀짐에 따라 항암제 및 이러한 활성과 관련되는 기타 치료제로의 이용이 가능하게 되었다.또한, 아칼리시제니올리드 E가 혈관신생억제 활성(antiangiogeneic activity)을 갖고 있음이 본 발명에 의하여 밝혀짐에 따라, 항암제 내지 이러한 활성과 관여하는 류머티즘, 당뇨병 등에 대한 치료제로의 이용이 가능하게 되었다.즉, 류머티즘은 자가면역질환으로서 과도한 염증 반응에 따라 혈관신생이 일어나게 되는데, 이 때 혈관신생을 억제하게 되면 염증도 억제되고 이에 의해 류머티즘도 완화시킬 수 있게 된다. 또한, 당뇨병의 경우는 그 합병증으로 안구 산소압 저하에 따른 혈관신생으로 인해 안압이 높아지고 시력상실이 올 수가 있는데, 이 때 혈관신생을 억제함으로써 시력상실을 막을 수 있게 된다.

이에 따라, 본 발명에서는 신물질 아칼리시제니올리드 C, D, E, F 및 이를 강장동물로부터 추출, 분리하는 방법을 제공하고, 또한 아칼리시제니올리드 E의 혈관신생억제 작용으로부터 류머티즘, 당뇨병 등 혈관신생억제 효과가 관여하는 제반 질병에 대한 치료제를 제공하는 한편, 동 물질의 파네실 단백질 전달효소 억제 활성으로부터 이 활성이 이용될 치료제를 함께 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F의 추출방법은,추출시료인 강장동물 아칼리시고르지아 이너미스를 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤, 디클로로메탄 또는 이들의 2 가지 이상의 혼합액 등과 같은 유기용매로 추출하여 조추출물을 얻는 단계:상기 조추출물을 감압 하에서 용매를 증발시켜 잔류물을 얻는 단계:상기 잔류물을 극성에 따라 분획하는 단계:분획된 극성물질을 감압 하에서 용매를 증발시켜 잔류물을 얻는 단계: 및상기 잔류물을 크로마토그래피로 분리, 정제하는 단계를 포함하는 것으로 이루어진다.이와 같이 분리된 물질의 분자구조의 동정은 고해상도 질량분석(High-resolution mass), 적외선(IR), 자외선(UV), 수소 핵자기 공명(¹H-NMR), 탄소 핵자기 공명(¹³C-NMR), 수소 COSY(correlation spectroscopy), TOCSY(total correlation spectroscopy), gradient HSQC(gradient heteronuclear single quantum coherence), gradient HMBC(gradient heteronuclear multiple bond coherence) 등의 분석자료를 기초로 하여 결정되었다.

본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 C의 물리적 특성과 분광학적 특성은 다음과 같다:

(1) 분자식: C₁₉H₂₆O₃

(2) 분자량: 302

(3) 녹는점: 91∼93 ℃

(4) 색: 무색

(5) 적외선 흡수대(KBr): 2940, 2860, 1955, 1745, 1640, 1450, 1390, 1145, 1030 cm

(6)¹H 및¹³C-NMR: 하기 표 1 참조

본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 D의 물리적 특성과 분광학적 특성은 다음과 같다:

(1) 분자식: C₁₉H₂₄O₃

(2) 분자량: 300

(3) 녹는점: 87∼90 ℃

(4) 색: 무색

(5) 적외선 흡수대(KBr): 2935, 2870, 1955, 1730, 1645, 1455, 1390, 1255, 1180 cm

(6)¹H 및¹³C-NMR: 하기 표 2 참조

본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 E의 물리적 특성과 분광학적 특성은 다음과 같다:

(1) 분자식: C₂₃H₃₀O₆

(2) 분자량: 402

(3) 녹는점: 상온에서 반고형 액체

(4) 색: 무색

(5) 적외선 흡수대(KBr): 2930, 2860, 1955, 1735, 1665, 1440, 1370, 1235, 1150 cm

(6)¹H 및¹³C-NMR: 하기 표 3 참조

본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 F의 물리적 특성과 분광학적 특성은 다음과 같다:

(1) 분자식: C₂₃H₃₀O₆

(2) 분자량: 318

(3) 녹는점: 상온에서 반고형 액체

(4) 색: 무색

(5) 적외선 흡수대(KBr): 2930, 2860, 1745, 1540, 1455, 1390, 1140

(6)¹H 및¹³C-NMR: 하기 표 4 참조

위치	아칼리시제니올리드 C
	1H	13C
1344a56789101111a12131415161718	4.28(1 H, dd, J = 11.7, 6.3 Hz)3.97(1 H, dd, J = 11.7, 11.7 Hz)2.94(1 H, q, J = 6.4 Hz)2.15(1 H, m)1.78(1 H, ddd, J = 14.1, 3.9, 3.4 Hz)1.12(1 H, dddd, J = 14.1, 13.2, 11.2, 3.4 Hz)2.25(1 H, ddd, J = 13.2, 3.4, 3.4 Hz)1.00(1 H, ddd, J = 13.2, 13.2, 3.9 Hz)2.91(1 H, dd, J = 10.3,4.9 Hz)2.30(1 H, ddd, J = 13.2,9.3,4.9 Hz)1.49(1 H, dddd, J = 13.2,10.3,9.8,1.5 Hz)2.55(1 H, br, J = 12.6, 9.8 Hz)2.13(1 H, m)2.37(1 H, ddd, J = 11.7, 6.3, 2.5 Hz)2.07(1 H, m)1.56(1 H, m)2.09(2 H, m)5.11(1 H, quint, J = 6.8 Hz)4.70(2 H, m)1.37(3 H, s)5.19(1 H, s)5.09(1 H, s)	70.7 t174.9 s41.2 d44.6 d28.6 t39.7 t59.1 s61.8 d25.2 t33.6 t150.6 s48.6 d26.0 t25.7 t89.0 d208.5 s75.5 t16.2 q113.8 t

¹H 와¹³C-NMR 스펙트럼은 클로로포름-d 용매에서 각각 500 ㎒와 125 ㎒에서 측정 되었다. 화학전이는¹H 의 경우에는 테트라메틸실란 피이크( 0 ppm )를 기준으로 하였으며¹³C 의 경우에는 클로로포름-d 에서 잔여용매 피이크(77 ppm)를 기준으로 작성하였다.

위치	아칼리시제니올리드 D
	1H	13C
1344a56789101111a12131415161718	4.16(1 H, dd, J = 11.2, 5.4 Hz)3.65(1 H, dd, J = 11.2, 11.2 Hz)2.98(1 H, dd, J = 10.2, 4.4 Hz)1.64(2 H, m)2.23(1 H, m)1.19(1 H, ddd, J = 13.2, 13.2, 5.4 Hz)2.98(1 H, dd, J = 10.2, 4.4 Hz)2.30(1 H, br ddd, J = 13.9, 8.3, 4.4 Hz)1.50(1 H, m)2.47(1 H, m)2.23(1 H, m)2.47(1 H, m)6.55(1 H, dd, J = 8.1, 7.1 Hz)2.87(2 H, m)5.17(1 H, quint. J = 6.4 Hz)4.77(2 H, m)1.38(3 H, s)5.16(1 H, s)5.00(1 H, s)	71.1 t170.1 s134.9 s42.3 d35.9 t39.6 t59.0 s62.5 d25.3 t32.1 t149.2 s49.0 d137.3 d26.7 t86.7 d208.9 s76.6 t16.6 q115.3 t

¹H 와¹³C-NMR 스펙트럼은 클로로포름-d 용매에서 각각 500 ㎒와 125 ㎒에서 측정되었다. 화학전이는¹H 의 경우에는 테트라메틸실란 피이크( 0 ppm )를 기준으로 하였으며¹³C 의 경우에는 클로로포름-d 에서 잔여용매 피이크(77 ppm)를 기준으로 작성하였다.

위치	아칼리시제니올리드 E
	1H	13C
1344a56789101111a121314151617181-OAc12-OAc	5.96(1 H, d, J = 2.4 Hz)6.54(1 H, d, J = 1.5 Hz)2.26(1 H, br dd, J = 10.8, 2.4 Hz)2.07(1 H, m)1.66(1 H, m)2.22(1 H, ddd, J = 13.2, 3.4, 3.4 Hz)1.14(1 H, ddd, J = 13.2, 3.4, 4.4 Hz)3.00(1 H, dd, J = 10.7, 3.9 Hz)2.28(1 H, m)1.49(1 H, dddd, J = 13.7, 10.3, 9.4, 4.4 Hz)2.42(1 H, m)2.39(1 H, m)2.39(1 H, m)5.33(1 H, t, J = 7.3 Hz)2.44(1 H, m)2.31(1 H, m)4.98(1 H, quint, J = 6.8 Hz)4.69(2 H, m)1.32(3 H, s)5.04(1 H, s)4.92(1 H, s)2.08(3 H, s)2.03(3 H, s)	91.2 d141.3 d115.2 s36.6 d29.7 t39.6 t59.8 s62.5 d24.5 t32.6 t148.4 s47.5 d73.8 d31.8 t85.2 d209.4 s75.5 t16.6 q114.7 t169.4 s21.0 q170.1 s21.4 q

¹H 와¹³C-NMR 스펙트럼은 클로로포름-d 용매에서 각각 500 ㎒와 125 ㎒에서 측정되었다. 화학전이는¹H 의 경우에는 테트라메틸실란 피이크( 0 ppm )를 기준으로 하였으며¹³C 의 경우에는 클로로포름-d 에서 잔여용매 피이크(77 ppm)를 기준으로 작성하였다.

위치	아칼리시제니올리드 F
	1H	13C
1344a56789101111a1213141516171819	4.27(1 H, dd, J = 12.2, 6.8 Hz)3.94(1 H, dd, J = 12.2, 12.2 Hz)2.83(1 H, q, J = 6.4 Hz)2.10(1 H, m)1.79(1 H, br ddd, J = 13.7, 3.9, 3.9 Hz)1.09(1 H, dddd, J = 13.7, 13.7, 10.7, 2.9 Hz)2.25(1 H, ddd, J = 13.2, 3.9, 2.9 Hz)0.99(1 H, ddd, J = 13.7, 13.2, 3.9 Hz)2.90(1 H, dd, J = 10.3, 4.9 Hz)2.30(1 H, br ddd, J = 13.2, 9.7, 4.9 Hz)1.48(1 H, m)2.54(1 H, br dd, J = 12.7, 9.8 Hz)2.13(1 H, ddd, J = 12.7, 9.7, 9.7 Hz)2.35(1 H, ddd, J = 12.2, 6.8, 3.4 Hz)1.97(1 H, m)1.51(1 H, m)2.06(2 H, m)5.09(1 H, t, J = 7.8 Hz)1.73(3 H, s)1.37(3 H, s)5.17(1 H, s)5.02(1 H, s)1.60(3 H, s)	70.7 t175.0 s41.3 d44.4 d28.5 t39.8 t59.1 s61.9 d25.3 t33.6 t150.7 s48.5 d26.8 t25.3 t123.2 d133.0 s25.8 q16.2 q113.6 t17.9 q

¹H 와¹³C-NMR 스펙트럼은 클로로포름-d 용매에서 각각 500 ㎒와 125 ㎒에서 측정되었다. 화학전이는¹H 의 경우에는 테트라메틸실란 피이크( 0 ppm )를 기준으로 하였으며¹³C 의 경우에는 클로로포름-d 에서 잔여용매 피이크(77 ppm)를 기준으로 작성하였다.

본 발명에서 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F의 백혈병 세포에 대한 저해활성은 세포내 환원효소에 의한 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)환원에 의한 생세포수 측정 방법으로 측정하였다. 그 결과, 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F의 ED₅₀은 각각 1.6, 52.0, 4.7, 0.2μg/ml의 값을 나타내었다. 또한 아칼리시제니올리드 E는 혈관신생억제활성(antiangiogenetic activity) 검색 결과, 10 ㎍/㎖의 농도에서 46 %의 세포조직침투활성(invasion activity) 및 74 %의 화학감응활성(chemotaxis activity)을 나타내었다. 또한 아칼리시제니올리드 E는 10 ㎍/㎖의 농도에서 파네실 단백질 전달효소(FPT)에 대하여 82 %의 저해활성을 나타내었다.

이하, 본 발명에 따른 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F 의 추출 방법과 활성 측정에 대한 실험을 구체적인 실시예로 상세히 설명한다.

실시예 1: 아칼리시제니올리드 C, D, F 및 F의 추출 방법

산호 아칼리시고르지아 이너미스(Acalycigorgia inermis) 10 kg(건조중량)을 칼로 2∼3 ㎝ 길이로 자른 다음, 디클로로메탄 10 ℓ를 가하여 48 시간 방치하고 그 용액을 여과하였다. 이 과정을 3 회 반복하였다. 남은 시료에 대하여 메탄올 10 ℓ를 가하여 방치한 후 그 용액을 여과하였다. 이 과정을 2 회 반복하였다. 디클로로메탄과 메탄올 여과액을 합한 후 감압 하에서 용매를 증발 제거하여 조추출물 41.2 g을 얻었다. 이 조추출물을 아세톤 300 ㎖에 녹인 후 진공 실리카 플래시 크로마토그래피(vacuum silica flash chromography)를 이용하여 여러 개의 분획 (fraction)으로 나누었다. 용리액은 100 % 헥산에서 시작하여 에틸아세테이트를 5 %씩 증가시켜 사용하였으며, 모두 16 개의 분획(각 500 ㎖)을 얻었다. 분획 9(40 % 에틸아세테이트/헥산으로 용리), 분획 10(45 % 에틸아세테이트/헥산으로 용리) 및 분획 11(50 % 에틸아세테이트/헥산으로 용리)에 새로운 대사물질들이 함유되어 있다는 것이 수소 핵자기공명분광스펙트럼과 세포독성 측정에 의하여 확인되었다.

분획 9와 10을 합한 후에 감압건조하여 얻어진 유기물질 0.7 g을 30 % 에틸아세테이트/70 % 헥산(3 ㎖)에 녹인 후 여과하여(spartan filter/Aldrich사 제품) 녹지 않는 물질을 제거하였다. 용액을 동일한 용리유체를 이용하여 실리카 반분취 HPLC 컬럼(silica semi-preparative HPLC column)(YMC silica, 입자 직경 5 ㎛, 250×10 ㎜(길이×내경), 용출속도 2 ㎖/분, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피하여 유지 시간 13, 22 및 26 분에 용출되는 반고형 성분을 얻었다. 유지 시간 13 분에 얻어진 반고형 성분을 15 % 물/85 % 메탄올에 녹인 후 다시 동일한 용리유체를 이용하여 C₁₈역상 반-분취 HPLC 컬럼(C₁₈reversed-phase semi-preparative HPLC column)(YMC ODS-A, 입자 직경 5 ㎛, 250×10 ㎜(길이×내경), 용출속도 2 ㎖/분, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피하여 유지 시간 12 분에서 무정형 고체 형태의 물질인 아칼리시제니올리드 C를 71.4 ㎎ 얻었다.또한, 실리카 크로마토그래피에서 유지 시간 26 분에 얻어진 반고형 성분을 전기한 아칼리시제니올리드 C와 동일한 조건에서 역상 크로마토그래피하여 유지 시간 13 분에서 고형성분인 아칼리시제니올리드 D를 28.1 ㎎ 얻었다.또한, 전기한 실리카 크로마토그래피에서 유지 시간 22 분에 얻어진 성분을 아칼리시제니올리드 C와 동일한 조건에서 역상 크로마토그래피하여 유지 시간 9 분에서 무색의 반고형 물질인 아칼리시제니올리드 E를 30.9 ㎎ 얻었다.

진공 실리카 플래쉬 크로마토그래피의 분획 11(50 % 에틸아세케이트/헥산으로 용리)을 감압 건조하여 얻어진 잔류물 0.27 g에 대해서도 10 % 물/90 % 메탄올 (2 ㎖)에 녹인 후 여과하여(spartan filter/Aldrich사 제품), 용액을 동일한 용리유체를 이용하여 C₁₈역상 반-분취 HPLC 컬럼(reversed-phase semi-preparative HPLC column)(YMC ODS-A, 입자직경 5 ㎛, 250×10 ㎜(길이×내경), 용출속도 2 ㎖/분, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피하여 유지 시간 11 분에서 반고형 형태의 성분을 분리하였다. 이 성분을 25 % 물/75 % 메탄올에 녹인 후에 동일한 용매와 동일한 HPLC 컬럼을 이용하여 C₁₈역상 반분취 크로마토그래피를 하여 유지 시간 18 분에서 반고형 물질인 아칼리시제니올리드 F를 11.1 ㎎ 획득하였다.

실시예 2. 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F의 항암 활성 측정 실험

활성 측정시 모든 시료는 디메틸술폭시드(DMSO)에 각 농도별로 적정량씩 녹여 1.5 ㎖ 에펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 분주한 후 사용하였다. 세포배양을 위해서는, 실험에 사용될 암세포를 10 % FBS(Fetal Bovine Serum)과 카나마이신 (kanamicin) 20 ㎍/㎖가 들어있는 RPMI 1640 배양액을 사용하여 25 ㎠의 표면적을 갖는 플라스크에서 37 ℃, 5 % CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 세포독성능 측정시에는 세포를 원심 분리하여 세척한 후 새로운 배양액에 2×10⁴cell/㎖로 부유시켜 사용하였다.

MTT 측정법은 96-웰 플레이트에 대수기에 도달한 암세포 배양액을 0.1 ㎖ 접종하고 시료를 각각 10 배씩 연속 희석하여 0.1 ㎖씩 첨가해서 최종 부피가 0.2 ㎖가 되도록 한 후 37 ℃, 5 % CO₂가 유지되는 배양기에서 4 일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 증류수에 녹인 MTT 용액 1 ㎎/㎖를 50 ㎕씩 각각의 웰에 가해주고 4 시간 동안 추가 배양하였다.

배양 상등액을 제거하고 살아있는 세포의 환원 효소에 의하여 형성된 포르마존(formazone) 결정을 0.15 ㎖의 DMSO에 녹인 다음 540 ㎚의 광학필터(optic filter)를 이용, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 세포에서는 진한 보라색으로 나타나고 세포가 모두 죽은 경우에는 거의 투명한 용액으로 결과가 나타나서, 흡광도에 따라 살아 있는 세포의 수를 측정할 수 있다.

실시예 3. 아칼리시제니올리드 E의 혈관신생억제 활성 측정 실험

혈관내피세포의 배양은, American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 혈관내피세포(HUVEC)를 FBS(fetal bovine serum) 첨가 배지(medium) 199(M199)에서 배양하였다. 분말 상태의 배지를 2 차 증류수에 녹인 후 중탄산나트륨 2.2 g을 첨가하여 염산으로 pH 7.2로 맞춘 후 2 ㎛ 밀리포어 필터(Millipore filter)로 이를 여과한 다음, 사용 직전에 20 %의 FBS, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신 (penicilline-streptomicin, P-S), 3 ng/㎖의 bFGF(혈관신생증식인자), 100 ㎍/㎖의 헤파린(heparin)을 첨가하였다. 배양용기는 T25 플라스크(25 ㎟)에 5∼7 ㎖의 배지로 37 ℃, 포화습도로 유지되는 5 % CO₂배양기에서 단층배양하며, 0.05 % 트립신-EDTA로 계대배양하여 유지하였다. 실험에 사용한 세포는 패시지(passage) 19와 30 사이의 것이다.

(1) 세포조직침투 활성 검색(invasion assay)

포어 사이즈(pore size) 8인 폴리카보네이트 필터(polycarbonate filter)가 있는 인서트 챔버(insert chamber)를 사용하였다. 필터의 아랫부분을 5 ㎍의 타입 Ⅳ 콜라겐(collagen)으로 코팅하고, 필터의 윗부분은 25 ㎍의 마트리겔(matrigel, Collaborative Reserch, Inc., Waltham, MA)로 코팅하였다. 주 챔버(main chamber, 24 well multiplate)에 혈관생성인자를 포함하는 배지 600 ㎕, BSA(100 ㎍/㎖) 6 ㎕, 각 샘플을 농도에 맞게 6 ㎕, SIP 6 ㎕를 첨가하고 인서트 챔버에는 HUVEC(2 ×10⁵cells/well)을 포함하는 배지 400 ㎕를 넣은 후, 인서트 챔버를 주 챔버에 집어넣었다. 37 ℃ 배양기에 넣어 16∼20 시간 배양한 후 인서트 챔버의 폴리카보네이트 필터를 떼어내어 고정하고, 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색하여 마트리겔(Matrigel)은 분해하고 필터를 통과한 세포의 수를 계수하였다. 결과는 웰(well) 당 빠져나온 HUVEC의 수로 나타낸다.

활성 저해도는 다음 수학식 1에 의해 계산된다.

여기에서, bFGF1은 약물처리한 결과, bFGF2는 약물처리하지 않은 결과이다.

무처리군과 아칼리세제니올리드 E를 비교한 결과 bFGF를 처리했을 때 아칼리시제니올리드(10 ㎍/㎖)는 46 %의 저해활성을 보였으며 bFGF를 처리하지 않은 경우에는 저해현상이 거의 나타나지 않았다.

(2) 화학감응 활성(chemotaxis assay)

포어 사이즈 8 ㎛인 폴리카보네이트 필터가 있는 인서트 챔버를 사용하였다. 필터의 양면을 각각 5 ㎍의 타입 Ⅳ 콜라겐으로 코팅하였다. 주 챔버(24 well multiplate)에 혈관생성인자를 포함하는 배지 600 ㎕, BSA(100 ㎍/㎖) 6 ㎕, 각 샘플을 농도에 따라 6 ㎕, SIP 1 μM 등을 첨가하고, 인서트 챔버에는 HUVEC(2×10⁵cells/well)을 포함하는 배지 400 ㎕를 넣은 후, 인서트 챔버를 주 챔버에 집어넣었다. 37 ℃ 배양기에 넣어 4 시간 배양한 후 인서트 챔버의 폴리카보네이트 필터를 떼어내어 고정한 후, 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색하여 케모탁시스(chemotaxis)에 의해 막을 통과한 세포의 수를 계산하였다. 결과는 웰당 빠져나온 HUVEC의 수로 나타낸다.

활성저해도는 다음 수학식 2로 계산된다.

여기에서, bFGF1은 약물처리한 결과, bFGF2는 약물처리하지 않은 결과이다.

무처리군과 아칼리시제니올리드 E(10 ㎍/㎖)를 처리한 것을 비교한 결과, 아칼리시제니올리드 E는 74 %의 저해활성을 나타냈으며 bFGF를 처리하지 않은 것에는 저해현상이 거의 나타나지 않아, 약제 독성은 없으며 bFGF의 케모탁시스 (chemotaxis) 유도활성을 선택적으로 저해하고 있는 것으로 판단된다.

실시예 4. 아칼리시제니올리드 E의 파네실 단백질 전달효소 저해 활성 측정 실험

파네실 단백질 전달효소(FPT)의 효소원으로는, 흰쥐(male Sprague Dowley 100∼150 g)의 뇌를 분리하여 생리식염수로 세척하고 균질화한 후 이 균질액을 원심분리와 Q 세파로즈 패스트 플로우 컬럼(Sepharose Fast Flow column)을 이용하여 부분정제하여 사용하였다. 또한, 효소의 활성은 3H-파네실 파이로포스페이트(3H-Farnesyl pyrophosphate, FPP)를 기질로 하여 신틸레이션 프록시미티 에세이(Scintillation Proximity Assay, SPA) 방법을 이용하여 측정하였다.

즉, FPP를 기질로 하여 브로우(Blow) 등의 방법을 일부 수정하여 사용하였는데, 10 ㎕ 시료액, 10 ㎕ 에세이(assay) 완충용액(50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 25 mM MgC1₂, 2 mM KCl, 5 mM DTT, 5 mM Na₂HPO₄, 0.01 % 트리톤 X-100), 20 ㎕ 희석된³H-FPP, 20 ㎕ 비오틴-라민 B 펩타이드(biotin-lamin B peptide), 40 ㎕ 파네실 단백질 전달효소를 잘 섞은 후 상온에서 30 분간 반응시키고, 150 ㎕의 SPA 구슬과 반응용액(bead/stop reagent solution)를 가한 다음 액체 섬광계수기(scintillation counter)를 이용하여 비오틴 라민 B 펩타이드(biotin lamin B peptide)에 파네실화 정도를 CPM(count per minute) 단위로 측정, 파네실 단백질 전달효소의 저해활성을 다음 수학식 3과 같이 계산하였다.

상기 수학식 3에서, 공시료는 효소 및 저해제 시료가 없는 경우이고, 대조시료는 저해제 시료가 없는 상태에서 최적 조건으로 반응시킨 후 CPM을 측정한 것이다. 이 결과 아칼리시제니올리드E 는 10 ㎍/㎖의 농도에서 82 %의 저해활성을 나타내었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 강장동물 아칼리시고르지아 이너미스로부터 추출된 아칼리시제니올리드 C, D, E 및 F는, 인체의 백혈병 세포의 성장을 억제하는 역할을 하는 것으로 밝혀져 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있을 것이다.특히, 아칼리시제니올리드 E는 인체의 Ras 유전자의 변형에 의한 정상세포의 암세포화 작용에 관여하는 파네실 단백질 전달효소(FPT; farnesyl protein transferase)에 대한 저해활성을 갖고 있어 항암제 및 이러한 활성과 관련되는 기타 치료제로의 이용이 가능할 뿐 아니라, 혈관신생억제 활성(antiangiogeneic activity)을 갖고 있음이 밝혀짐에 따라, 이와 관련된 류머티즘, 당뇨병 등에 대한 치료제로의 이용이 가능하다.

Claims (12)

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5. 하기 구조식의 아칼리시제니올리드(acalycixeniolide) E를 유효성분으로 함유하는 류머티즘용제.

   [화학식 3]
6. 하기 구조식의 아칼리시제니올리드(acalycixeniolide) E를 유효성분으로 함유하는 당뇨병용제.

   [화학식 3]
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