MX2014010739A

MX2014010739A - Produccion de peptidos toxicos, expresion de peptido en plantas y combinaciones de peptidos ricos en cisteina.

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Publication number: MX2014010739A
Application number: MX2014010739A
Authority: MX
Inventors: William Tedford; Robert M Kennedy; Christopher Hendrickson; Robert Venable; Catherine Foune; John Mcintyre; Alvar Carlson; Lin Bao
Original assignee: Vestaron Corp
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2015-06-22
Also published as: US9567381B2; WO2013134734A3; EP3766978A1; JP2018111714A; US11472854B2; CA2866166C; AU2020201747A1; US20230257427A1; KR102384047B1; US20150148288A1; CN112400900A; HK1204630A1; AU2013229777A1; KR20210005283A; JP6308955B2; MX2020012620A; AU2018200652B2; KR102195193B1; IL272522A; CN104411714A

Abstract

Nuevos nucleótidos, péptidos y proteínas insecticidas su expresión en plantas, métodos para producir los péptidos nuevos procesos, técnicas de producción, nuevos péptidos, nuevas formulaciones y nuevos organismos, un proceso que aumenta el rendimiento de producción de péptido insecticida a partir de sistemas de expresión de levadura. La presente invención también se refiere y describe endotoxinas seleccionadas denominados péptidos insecticidas ricos en cisteína (CRIPS) que son péptidos derivados de Bacillus thuringiensis (Bt) y sus genes de endotoxinas junto con péptidos tóxicos conocidos como péptidos y genes del nudo inhibidor de cistina (ICK), así como otros de péptidos insecticidas, tales como secuencias del péptido del factor oostático modulador de tripsina (TMOF) usadas en varias formulaciones y combinaciones de ambos genes y péptidos, útiles para el control de insectos.

Description

PRODUCCION DE PEPTIDOS TOXICOS, EXPRESION DE PEPTIDOS EN PLANTAS Y COMBINACIONES DE PEPTIDOS RICOS EN CISTEINA CAMPO DE LA INVENCION Se describen y reivindican nuevos nucleótidos, péptidos, proteínas insecticidas, su expresión en plantas, métodos para producir los péptidos, nuevos procesos, téenicas de producción, nuevos péptidos, nuevas formulaciones y combinaciones de organismos nuevos y conocidos que producen mayores rendimientos a los esperados de los péptidos relacionados para el control de insectos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La seguridad a nivel mundial del alimento producido por la agricultura y horticultura moderna se ve afectada por plagas insecticidas. Los agricultores dependen de los insecticidas para suprimir el daño de los insectos, sin embargo, las opciones comerciales de insecticidas seguros y funcionales disponibles para los agricultores se están disminuyendo mediante la eliminación de químicos peligrosos comercialmente disponibles y la evolución de cepas de insectos que resisten a la mayoría de las clases de insecticidas químicos y biológicos. Los agricultores necesitan nuevos insecticidas para mantener la protección del cultivo .

Los péptidos insecticidas son péptidos que son tóxicos Ref.250732 para sus dianas, comúnmente insectos o aráenidos de algún tipo y, a menudo, los péptidos pueden tener origen artrópodo, como escorpiones o arañas. Se pueden administrar internamente, por ejemplo, administrando la toxina directamente al intestino u órganos internos del insecto mediante inyección o inducción al insecto a consumir la toxina de su alimento, por ejemplo, un insecto que se alimenta de una planta transgénica, y/o pueden tener la capacidad de inhibir el crecimiento, afectar el movimiento o incluso matar a un insecto cuando se administra la toxina al insecto diseminando la toxina en el sitio habitado por el insecto o en el ambiente del insecto mediante pulverización, u otro medio, y entonces el insecto entra en algún tipo de contacto con el péptido.

Sin embargo, los péptidos insecticidas presentan grandes problemas para llegar al mercado comercial y, hasta ahora, se han aprobado y comercializado en el mercado comercial muy pocos o ningún péptido insecticida, con una excepción destacada, péptidos derivados de Bacillis thuringiensis o Bt. Además, actualmente preocupa el aumento de la resistencia de los insectos a las proteínas de Bt.

Las proteínas de Bt, o péptidos de Bt, son insecticidas eficaces utilizados para la protección de cultivos en forma de protectores incorporados a la planta y pulverizadores foliares. Las formulaciones comerciales de proteínas de Bt se utilizan mucho para controlar a los insectos en etapa de larva. Los péptidos de ICK incluyen muchas moléculas que presentan actividad insecticida. A menudo, los péptidos de ICK son tóxicos para las especies diana biológicas de origen natural, comúnmente insectos o aráenidos de algún tipo. A menudo, los péptidos de ICK pueden ser de origen artrópodo, como los venenos de escorpiones o arañas. Bt es el único organismo fuente de péptidos insecticidas comercialmente útiles. Se han identificado otras clases y tipos de péptidos posibles, como los péptidos del factor oostático modulador de Tripsina (TMOF, por sus siglas en inglés). Los péptidos de TMOF se tienen que administrar a su sitio de acción fisiológico de varias maneras, y se han identificado los péptidos de TMOF como posibles larvicidas, con gran potencial, ver D. Borovsky, Journal of Experimental Biology 206, 3869-3875, pero como casi todos los demás péptidos insecticidas, el TMOF no se ha comercializado ni ha sido muy utilizado por los agricultores y existen motivos para ello.

La capacidad de producir péptidos insecticidas de forma satisfactoria a escala comercial, con formación y plegamiento de péptidos reproducible, a un precio económico y razonable, puede suponer un desafío. La gran variedad, propiedades únicas y naturaleza especial de péptidos insecticidas, combinada con la gran variedad de posibles técnicas de producción, puede presentar una cantidad abrumadora de enfogues a la aplicación y producción de péptidos, pero pocos o ninguno son comercialmente satisfactorios.

Hay varias razones por las que tan pocos de la mayoría de los péptidos insecticidas que se han identificado han logrado llegar al mercado. En primer lugar, la mayoría de los péptidos insecticidas son demasiado delicados o no son los suficientemente tóxicos para que sean utilizados comercialmente. En segundo lugar, los péptidos insecticidas son difíciles y costosos para producirse comercialmente. En tercer lugar, muchos péptidos insecticidas se degradan rápidamente y tienen una semivida corta. En cuarto lugar, muy pocos péptidos insecticidas se pliegan adecuadamente cuando son expresados por una planta, por lo tanto, pierden su toxicidad en los organismos genéticamente modificados (G O, por sus siglas en inglés). En quinto lugar, la mayoría de los péptidos insecticidas identificados tienen bloqueada la distribución sistémica en el insecto y/o pierden su naturaleza tóxica cuando son consumidos por los insectos. Las proteínas de Bt son una excepción a este último problema y, dado que interrumpen la alimentación del insecto, se han utilizado mucho.

En la presente se proporcionan varias soluciones a estos problemas importantes que han prevenido la comercialización y el uso extendido de péptidos insecticidas. En la primera sección, se describe el modo para crear casetes y sistemas de expresión especiales que permiten que las plantas generen y expresen los péptidos insecticidas con plegamiento adecuado que conservan su toxicidad para los insectos.

En la segunda sección, se describe el modo para realizar un cambio relativamente pequeño de la composición de un péptido y, en consecuencia, aumentar drásticamente la velocidad y cantidad que se puede realizar mediante fermentación. Este proceso también disminuye simultáneamente el costo de producción de péptido industrial y comercial. Esta sección indica el modo en que se puede "convertir" una proteína en un péptido distinto y más económico, que se puede producir con mayor rendimiento y que, sorprendentemente, es tan tóxico como antes de haberse convertido. En la tercera y última sección, se describe el modo de combinar distintas clases de péptidos insecticidas, de modo que puedan funcionar juntos de manera sinérgica para cambiar y aumentar drásticamente la toxicidad y actividad de los péptidos componentes, en comparación con sus componentes individuales. Esta sección también proporciona detalles y datos para respaldar nuestro sistema, métodos y combinaciones de péptidos y formulaciones para lidiar con una amenaza inminente del desarrollo y la distribución de insectos resistentes a Bt. Los insectos resistentes a Bt representan la próxima gran amenaza al suministro mundial de alimento y les indicamos a los expertos en la téenica sobre cómo abordar y vencer esta amenaza.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención describe el modo de producir péptidos insecticidas tóxicos en plantas, de modo que se plieguen adecuadamente cuando las plantas los expresan. Describe el modo de producir péptidos con alto rendimiento en ambientes de producción comercial y en laboratorio usando varios vectores. Describe una clase de péptidos insecticidas tóxicos denominados CRIPS, que significa péptidos insecticidas ricos en cisteína (CRIPS, por sus siglas en inglés). Describe otra clase de péptidos insecticidas tóxicos denominados PFIPS, que significa proteínas insecticidas que forman poros (PFIPS, por sus siglas en inglés). Y describe el modo de elaboración conjunta y uso de combinaciones sinérgicas y nuevas de CRIPS y PFIPS con varios propósitos, que incluyen la protección de cultivos contra insectos resistentes a péptidos de Bt o Bacillus thuringiensis. Se describe el modo de elaboración y uso de combinaciones de CRIPS y PFIPS para matar y controlar insectos, incluso insectos resistentes a Bt, a cada dosis baja. Sin la intención de limitarse a la teoría, la comprensión de los péptidos y proteínas de Bt o Bacillus thuringiensis, nos permite indicar a un experto en la técnica el modo para crear métodos, composiciones, compuestos (proteínas y péptidos) y procedimientos novedosos para proteger a las plantas y controlar a los insectos.

Se describe y reivindica una proteína compuesta por un péptido señal de retículo endoplasmático (ERSP, por sus siglas en inglés) unido operativamente a una proteína insecticida rica en cisteína (CRIP), tal como un motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína (ICK, por sus siglas en inglés), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína (ERSP-ICK). Un péptido, donde el ERSP es cualquier péptido señal que dirige la CRIP expresada al retículo endoplasmático de las células vegetales. Un péptido donde la CRIP es una proteína del nudo inhibidor de cisteína (ICK, por sus siglas en inglés). Un péptido donde la CRIP es una proteína que no es de ICK. Un péptido donde el ERSP es un péptido de entre 5 y 50 aminoácidos de longitud, que se origina de una planta. Un péptido unido operativamente a una proteína de estabilización traduccional (STA, por sus siglas en inglés), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y una proteína de estabilización traduccional (STA) puede estar en el lado del N-terminal de la CRIP, que es opcionalmente un motivo proteico de ICK (ERSP-STA-ICK) o motivo proteico que no es de ICK (ERSP-STA que no es de ICK) o en el lado del C-terminal del motivo proteico de ICK o que no es de ICK (ERSP-ICK-STA) o (ERSP que no es de ICK -STA).

Se describe y reivindica un péptido con un dipéptido del N-terminal que se agrega y une operativamente a un péptido conocido, donde el dipéptido del N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, donde el péptido se selecciona de un CRIP (péptido insecticida rico en cisteína), tal como de un péptido de ICK, o un péptido que no es de ICK. Un péptido con un dipéptido del N-terminal que se agrega y une operativamente a un péptido conocido, donde el dipéptido del N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. Un péptido en el que el aminoácido no polar del aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina. Un péptido en el que el aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se selecciona de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina. Un péptido de conformidad con la reivindicación 8, donde el aminoácido no polar del aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y el aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se selecciona de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina. Un péptido donde el dipéptido está compuesto por glicina-serina.

Se describe una composición que comprende al menos dos tipos de proteínas o péptidos insecticidas, donde un tipo es una proteína insecticida que forma poros (PFIP, por sus siglas en inglés) y el otro tipo es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP). Una composición en la que el CRIP es un ICK y, opcionalmente, el ICK deriva o se origina de, Hadronyche versuta, o araña de Sídncy con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis, Atrax infensus, que incluye toxinas conocidas como polipéptidos de U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb o mutantes o variantes. Una composición en la que el CRIP no es de ICK y, opcionalmente, el CRIP que no es de ICK se origina o deriva de animales que tienen CRIP que no son de ICK, como anemonas, erizos de mar y babosas marinas, que incluyen opcionalmente la anémona denominada Anemonia viridi, que incluye opcionalmente los péptidos denominados Av2 y Av3 , particularmente los péptidos similares a Av2 y Av3, que incluyen los péptidos enumerados en el listado de secuencias o mutantes o variantes.

Se describe un método para utilizar la composición de conformidad con la reivindicación 13 para controlar los insectos resistentes a Bt que comprende crear una composición de al menos dos tipos de péptidos, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la reivindicación 1 y en la presente y de cualquiera de las proteínas proporcionadas en el listado de secuencias y luego aplicar la composición al locus del insecto. Un método para controlar los insectos resistentes a Bt que comprende proteger a una planta de insectos resistentes a Bt que comprende crear una planta que exprese una combinación de al menos dos péptidos con plegamiento adecuado, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la presente y de cualquiera de las proteínas proporcionadas en el listado de secuencias. Un método en el que se administra la CRIP en cualquier momento durante el cual la PFIP afecta el revestimiento del intestino del insecto. Un método en el que se administra la CRIP luego de analizar al insecto para determinar la resistencia a Bt y, donde el análisis del insecto dio positivo para resistencia a Bt. Se describe la aplicación de cualquiera de los compuestos descritos en la presente en forma sólida o líquida al insecto, el locus del insecto o como un protector incorporado a la planta.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un diagrama de la invención de fusión en el N-terminal de ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático en franjas diagonales) con una CRIP (proteína insecticida rica en cisteína), como el motivo ICK (nudo inhibidor de cisteína) en franjas verticales).

La figura 2 es un diagrama de la invención de fusión en el N-terminal de ERSP (franjas diagonales) con una proteína insecticida del motivo de CRIP (franjas verticales) que se fusiona con una STA (proteína de estabilización traduccional en franjas horizontales). Hay dos orientaciones posibles que se muestran en la figura 2.

La figura 3 es un diagrama de la invención de fusión en el N-terminal de ERSP (franjas diagonales) fusionado con un motivo de CRIP (franjas verticales) que se fusiona con una proteína de estabilización traduccional (STA) que se muestra en franjas horizontales. La STA está separada del motivo de CRIP mediante una secuencia intermedia denominada péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) que se muestra en el tablero. Se muestran dos orientaciones posibles en la figura 3 .

La figura 4 es un diagrama similar a la figura 3 con el motivo (ENLAZADOR-CRIP) con la letra "N" subíndice para mostrar que el motivo de ENLAZADOR-CRIP se puede usar una sola vez o de forma repetida varias veces, son posibles preferentemente de 1-10 repeticiones e incluso más, hasta 15, 20 o 25 veces.

La figura 5 es un diagrama que muestra que el grupo CRIP-ENLAZADOR o ICK -ENLAZADOR también puede funcionar como un grupo STA-ENLAZADOR. En otras palabras, la combinación de CRIP-ENLAZADOR o ICK-ENLAZADOR puede funcionar como STA-ENLAZADOR. En otras palabras, se pueden usar dos motivos de ICK con un ENLAZADOR y se puede obviar la necesidad de una proteína de estabilización traduccional o STA.

La figura 6 es un diagrama de un reticulador covalente de las cisteínas en un motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína (ICK). Las flechas en el diagrama representan hojas b, los números representan los aminoácidos de cisteína que forman motivos de ICK, numerados en el orden de su aparición en la estructura principal del N-terminal al C. La línea curva ancha representa la estructura principal de la proteína, las líneas derechas delgadas representan la reticulación covalente de las cisteínas específicas para crear un motivo de ICK. A veces, la hoja b que abarca la cisteína número 2 no está presente.

La figura 7 es una gráfica de los niveles detectados mediante ELISA de ACTX (como un porcentaje de la proteína soluble total (% de TSP) que resulta de la expresión a partir de transgenes vegetales que codifican ACTX como fusión traduccional con los varios elementos estructurales adicionales.

La figura 8 es una gráfica del % de TSP de U-ACTX-Hvla fusionado con GFP expresado transitoriamente en tabaco con distinto sitio de acumulación, que se detecta mediante iELISA. APO: sitio de apoplasto; CYTO: sitio de citoplasma; ER: sitio del retículo endoplasmático.

La figura 9 es una gráfica de iELISA del % de TSP de hojas de tabaco que expresan transitoriamente U-ACTX-Hvla fusionado con GFP usando los vectores de expresión de FECT que codifican las fusiones traduccionales con tres secuencias de ERSP distintas: péptido señal de BAAS (BG1H), péptido señal de extensina (EG1H) y péptido señal de extensina modificada (E*GIH).

La figura 10 es un diagrama del proceso de concentración de la proteína Omega-ACTX-Hvla fusionada con Jun a 3 tratada con tripsina y no tratada con tripsina, extraída de las hojas de tabaco transformadas transitoriamente.

Las figuras 11A-11C son cromatografías de HPLC para las muestras que contienen omega-ACTX-Hvla. Las muestras cargadas en el sistema de HPLC para producir las cromatografías fueron las siguientes: fig.11A. 25 mg de omega-ACTX-Hvla sintético; fig. 11B. 500 mL de muestra B de fracción retenida de filtración de 1 kD; fig.11C. 500 pL de muestra A de fracción retenida de filtración de 1 kD.

La figura 12 es una representación gráfica de la distribución de los rendimientos de péptidos normalizados tanto de U+2-ACTX-Hvla (denominado a veces en la presente "U+2") y U-ACTX-Hvla natural (denominado a veces en la presente "U natural"), producidos en cepas de Kluyveromyces lactis ( K. lactis) . Los datos de U+2 se muestran en negro y los datos de U natural en gris. El eje x muestra el rendimiento normalizado en unidades de miligramos por litro por unidad de absorbencia de luz a una longitud de onda de 600 nm (mg/L.A.). La escala y a la izquierda muestra la fracción de cepas de U+2. La escala y a la derecha muestra la fracción de cepas de U natural.

La figura 13 es otra representación gráfica de la distribución de los rendimientos de péptidos normalizados de cepas de K. lactis U+2 y U-ACTX-Hvla natural. En la presente, el eje y muestra el rendimiento normalizado (normalizado para la densidad celular en los cultivos respectivos como se describe a continuación) en miligramos por litro por unidad de absorbencia de luz a una longitud de onda de 600 nm (mg/L.A.) para las cepas individuales, y el eje x corresponde al intervalo de percentil del rendimiento observado para cada cepa, con respecto al rendimiento observado para todas las otras cepas de K. lactis modificadas genéticamente para producir la misma isoforma de péptido.

La figura 14 es una representación gráfica de la respuesta a la dosis de los bioensayos de inyección de mosca doméstica con U+2 y U-ACTX-Hvla natural. Los datos de U+2 se marcan con puntos circulares negros y los datos de U natural se marcan con triángulos grises. La escala x muestra la dosis en unidades de picomoles por gramo de mosca doméstica. La escala y muestra el porcentaje de mortalidad.

La figura 15 es una representación gráfica de la distribución de los rendimientos de péptidos de cepas de Pichia pastoris (P. pastoris) U+2 y U-ACTX-Hvla natural. Los datos de U+2 se muestran en negro y los datos de U natural en gris. El eje x muestra el rendimiento en miligramos por litro y la escala y muestra la fracción de producción de cepas de P. pastoris U+2 o U natural total.

La figura 16 es otra representación gráfica de la distribución de los rendimientos de péptidos de cepas de P. pastoris U+2 y U-ACTX-Hvla natural. En este caso, el eje y muestra el rendimiento en miligramos por litro para cepas individuales, y el eje x corresponde al intervalo de percentil del rendimiento observado para cada cepa (con respecto a los rendimientos observados para todas las otras cepas de P. pastoris modificadas genéticamente para producir la misma isoforma del péptido).

La figura 17 es una representación gráfica de la distribución de los rendimientos de péptidos de toxinas de anémona, Av3 y Av3+2, producidas a partir de las cepas de expresión de K. lactis. La toxina natural se denomina Av3 a partir de la anémona denominada Anemonia viridis. La toxina modificada en la presente se etiqueta Av3 + 2. Al igual que el ejemplo que antecede, se produjeron péptidos tóxicos en las cepas de Kluyveromyces lactis o K. lactis. El eje x muestra el rendimiento del péptido en mAu.seg/A para cepas individuales, y el eje y muestra la fracción de las cepas. En la figura 17, se muestra la cepa Av3 natural en gris claro, la cepa de producción alta modificada Av3 +2 se muestra en negro.

La figura 18 muestra la diferencia en los rendimientos de los péptidos de Av3+2 y Av3 natural producidos a partir de las cepas de K. lactis correspondientes, graficando los rendimientos de péptidos en función del intervalo de percentil de los transformados que producen el mismo péptido. En este caso, el eje y muestra el rendimiento normalizado en mAu.seg/A para cepas individuales, y el eje x corresponde al intervalo de percentil del rendimiento observado para cada cepa, con respecto al rendimiento observado para todas las otras cepas de K. lactis modificadas genéticamente para producir la misma isoforma del péptido.

La figura 19 muestra una gráfica de un bioensayo foliar de mortalidad porcentual a las 24 horas vs. edad de larvas luego de la aplicación y exposición a péptidos de ICK o proteínas de Bt.

La figura 20 muestra una gráfica de un bioensayo foliar que mide el porcentaje de mortalidad a las 18, 24 y 48 horas luego de la aplicación usando proteínas de Bt o péptidos de ICK o combinación de Bt + péptidos de ICK en larvas a las 72 horas.

La figura 21 muestra una gráfica de un bioensayo de alimentación foliar que mide el daño a las hojas por parte de insectos resistentes a Bt, a las 24 horas y 48 horas luego de la exposición a las proteínas de Bt o CRIP que no es de ICK o sus combinaciones.

La figura 22 muestra una gráfica de un bioensayo de alimentación foliar que mide el porcentaje de mortalidad a las 24 y 48 horas luego de la aplicación usando proteínas de Bt o péptidos de ICK o su combinación en larvas de P. xylostella resistentes a la proteína de Bt.

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS La presente invención incluye un listado de secuencias de 1593 secuencias.

Las SEQ ID NO: 1-28, 1553-1570 y 1593 se mencionan en la Parte 1.

Las SEQ ID NO: 29-32 y 1571-1592 se mencionan en la Parte 2.

Las SEQ ID NO: 33- 1042 se mencionan en la Parte 3.

Las SEQ ID NO: 1043- 1221 son secuencias que tienen o se derivan de un origen aráenido.

Las SEQ ID NO: 1222- 1262 son secuencias que tienen o se derivan de un origen de anémona.

Las SEQ ID NO: 1263- 1336 son secuencias que tienen o se derivan de un origen de escorpión.

Las SEQ ID NO: 1337- 1365 son secuencias que tienen o se derivan de un origen de escorpión.

Las SEQ ID NO: 1366- 1446 son secuencias que tienen o se derivan de un origen de Cry o Cyt.

Las SEQ ID NO: 1447- 1552 son secuencias que tienen o se derivan de un origen de VIP.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION DEFINICIONES "ACTX" o "péptido ACTX" se refieren a una familia de péptidos de ICK insecticidas que se ha aislado de arañas de Sídncy con tela en embudo, que pertenecen a la subfamilia Atracinae . Una de las arañas es conocida como la araña de Sídney con tela en embudo, con el nombre científico Hydronyche versuta . Dos ejemplos de péptidos ACTX de esta especie son los péptidos Omega y U.

"Agroinfección" se refiere a un método de transformación de plantas donde se introduce el ADN en una célula vegetal mediante el uso de Agrobacteria A. tumefaciens o A. rhizogenes .

"BAAS" se refiere al péptido señal de alfa-amilasa de cebada. Es un ejemplo de ERSP.

"Vector binario" o "vector de expresión binario" se refiere a un vector de expresión que se puede replicar a sí mismo tanto en cepas de E. coli como en cepas de Agrobacterium. Además, el vector contiene una región de ADN (a menudo denominado ADN-t) encerrado por las secuencias de borde izquierdo y derecho que es reconocido por los genes de virulencia que se deben copiar y administrar a una célula vegetal mediante Agrobacterium.

"Bt", también denominado Bacillus thuringiensis o B. thuringi ensis, se refiere a una bacteria de suelo gram-positiva que se ha utilizado a nivel mundial durante más de sesenta años para controlar las plagas de insectos agrícolas, forestales y de salud pública.

"Proteínas de Bt" y "péptidos de Bt" se refieren a lo mismo en la presente y son péptidos producidos por Bt. Los péptidos se escriben a menudo como proteínas "cry", "cyt" o "VIP" codificadas por los genes cry, cyt y vip. Las proteínas de Bt se atribuyen más comúnmente a las proteínas insecticidas cristalinas codificadas por los genes cry. Las proteínas de Bt son ejemplos de PFIPS (proteínas insecticidas que forman poros), ver la definición a continuación. En el listado de secuencias se proporcionan ejemplos de PFIPS y otras proteínas de Bt.

"Gen quimérico" se refiere a una secuencia de ADN que codifica un gen derivado de partes de una o más secuencias de codificación para producir un nuevo gen.

"Enlazador escindióle " se refiere a una secuencia de péptido corta en la proteína que es el sitio diana de las proteasas que pueden escindir y separar la proteína en dos partes o una secuencia de ADN corta que se coloca en el marco de lectura en el ORF y codifica una secuencia de péptido corto en la proteína que es el sitio diana de proteasa que puede escindir y separar la proteína en dos partes.

"Medio acondicionado" se refiere al medio de cultivo celular que ha sido utilizado por las células y se enriquece con materiales derivados de células pero no contiene células.

"Conversión" o "convertido" se refieren al proceso de elaborar un péptido de HP.

"CRIP" y "CRIPS" es una abreviatura para proteína/s insecticida/s rica/s en cisteína. Los péptidos insecticidas ricos en cisteína (CRIPS) son péptidos ricos en cisteína que forman enlaces de disulfuro. Las CRIPS contienen al menos cuatro (4), a veces seis (6) y, a veces ocho (8) aminoácidos de cisteína entre proteínas o péptidos con al menos 10 aminoácidos, donde las cisteínas forman dos (2), tres (3) o cuatro (4) enlaces de disulfuro. Los enlaces de disulfuro contribuyen al plegamiento, estructura tridimensional y actividad del péptido insecticida. Los enlaces de disulfuro cisteína-cisteína y la estructura tridimensional que forman cumplen una función considerable en la toxicidad de estos peptidos insecticidas. Se ejemplifica una CRIP tanto mediante péptidos del nudo inhibidor de cisteína o ICK (comúnmente con 6-8 cisteínas) como mediante ejemplos de péptidos tóxicos que tienen enlaces de disulfuro pero que no se consideran péptidos de ICK (CRIPS que no son de ICK). Los ejemplos de un ICK serían un péptido de ACTX de una araña y se definen anteriormente. Los ejemplos de una CRIP que no son de ICK sería un péptido como Av2 y Av3, que son péptidos que se identifican en primer lugar a partir de anémonas. Estos péptidos son ejemplos de una clase de compuestos que modulan los canales de sodio en el sistema nervioso periférico (PNS) de insectos. Las CRIPS que no son de ICK pueden tener 4-8 cisteínas que forman 2-4 enlaces de disulfuro. Estos péptidos tóxicos estabilizados con enlaces de disulfuro cisteína-cisteína (CRIPS) pueden presentar una estabilidad notable cuando se exponen al ambiente. Muchas CRIPS se aíslan de animales venenosos, como arañas, escorpiones, serpientes, babosas marinas y anémonas y son tóxicos para los insectos. A continuación se proporciona una descripción adicional.

"Medio definido" se refiere a un medio compuesto por componentes químicos conocidos pero no contiene extractos proteináceos brutos ni derivados, tales como extracto de levadura o peptona.

"Enlace de disulfuro" se refiere a un enlace covalente entre dos aminoácidos de cisteína derivados mediante el acoplamiento de dos grupos tiol en sus cadenas laterales.

"Vector de expresión de péptido transgénico doble" o "vector de expresión transgénico doble" se refiere a un vector de expresión de levadura que contiene dos copias del casete de expresión de péptido insecticida.

"ELISA" o "iELISA" se refiere a un protocolo de biología molecular en el cual las muestras se fijan a la superficie de una placa y luego se detectan de la siguiente manera: se aplica un anticuerpo principal seguido de un segundo anticuerpo conjugado con una enzima que convierte un sustrato incoloro en un sustrato con color que se puede detectar y cuantificar en las muestras. Durante el protocolo, los anticuerpos se retiran por lavado, de modo que solamente permanecen los que se unen a sus epítopos para la detección. Las muestras en cuestión son proteínas aisladas de plantas, y ELISA permite la cuantificación de la cantidad de proteína transgénica expresada que se recupera.

"ORF de expresión" se refiere a un nucleótido que codifica un complejo proteico y se define como los nucleótidos en el ORF.

"ER" o "retículo endoplasmático" es un organelo subcelular común a todos los eucariotas en los que ocurren algunos procesos de modificación postraduccional.

"ERSP" o "péptido señal de retículo endoplasmático" es una secuencia del N-terminal de aminoácidos que, durante la traducción proteica de la molécula de ARNm transgénico, se reconoce y une mediante una partícula de reconocimiento de señales de célula hospedadora, que mueve el complejo de ARNm/ribosoma de traducción proteica al ER en el citoplasma. El resultado es una pausa en la traducción proteica hasta que se acople con el ER y allí continúa y la proteína resultante se inyecta en el ER. "ersp" se refiere a un nucleótido que codifica el péptido, ERSP.

"Tráfico de ER" se refiere al transporte de una proteína expresada en célula a ER para la modificación, clasificación y transporte postraduccional.

"FECT" se refiere a un sistema de expresión vegetal transitoria usando virus del mosaico del pasto setaria con eliminación de gen proteico de recubrimiento y bloque de gen triple .

"GFP" se refiere a una proteína fluorescente verde de la aguamala Aequorea victoria . Es un ejemplo de una proteína de estabilización traduccional.

"Péptido de producción alta" o "péptido HP" se refiere a un péptido que puede elaborarse, o se "convierte", de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente y que, una vez convertido se puede producir con mayor rendimiento, o mayor velocidad de producción, o en cantidades superiores a las normales, en un sistema biológico. Las velocidades de producción superiores pueden ser de 20 a 400 % o más de las que se pueden lograr con un péptido antes de la conversión, usando los mismos métodos de producción o similares a los que se usaron para producir el péptido antes de la conversión.

"Péptido híbrido", también denominado "toxina de híbrido", también denominado "híbrido-ACTX-Hvla", también denominado "híbrido-ACTX-Hvla natural", así como "péptido U", también denominado "toxina U", también denominado "U natural", también denominado "U-ACTX-Hvla", también denominado "U-ACTX-Hvla natural", los cuales se refieren a un péptido de ACTX, descubierto a partir de una araña conocida como araña de Sídncy con tela en embudo, Hydronyche versuta, y es un antagonista dual para los canales de Ca2+ dependientes del voltaje y canales de K+ dependientes del voltaje de insectos .

"IGER" se refiere a un nombre para un péptido corto, en función de su secuencia real de códigos de una letra. Es un ejemplo de enlazador intermedio.

"Motivo de ICK" "motivo proteico de ICK" "motivo del nudo inhibidor de cistina" "péptidos de ICK de insectos tóxicos" "péptidos de ICK" "péptidos de "CK"" "motivo del nudo de cistina" o "péptidos del nudo de cistina" se refieren a un péptido de 16 a 60 aminoácidos con al menos 6 aminoácidos nucleares de cistina media con tres puentes disulfuro, donde los 3 puentes disulfuro son enlaces covalentes y de los seis residuos de cistina media, los enlaces de disulfuro covalentes están entre la primera y la cuarta, la segunda y la quinta y la tercera y la sexta cistina media, de los seis aminoácidos de cistina media del núcleo empezando desde el aminoácido del N-terminal. En general, este tipo de péptido comprende una estructura secundaria de horquilla-beta, normalmente compuesta por los residuos ubicados entre la cuarta y la sexta cistina media nuclear del motivo, donde la horquilla se estabiliza por la reticulación estructural proporcionada por los tres enlaces de disulfuro del motivo. Cabe destacar que los aminoácidos de cisteína/cistina o cistina media adicionales pueden estar presentes dentro del motivo del nudo inhibidor de cistina. Se proporcionan ejemplos en el listado de secuencias. " ick" se refiere a un nucleótido que codifica un motivo proteico de ICK.

"ORF de expresión del motivo proteico de ICK" u "ORF de expresión" se refiere a un nucleótido que codifica un complejo del motivo proteico de ICK y se define como los nucleótidos en el ORF.

"El vector de expresión del motivo proteico de ICK" o "vector de expresión de ICK" o "vector de expresión del motivo de ICK" se refiere a un vector binario que contiene un ORF de expresión. El vector binario también contiene el promotor de transcripción necesario y la secuencia terminadora que rodea el ORF de expresión para promover la expresión del ORF y la proteína que codifica.

"Insecto" se refiere a cualquier artrópodo y nematodo, que incluye acáridos e insectos que se sabe que infestan todos los cultivos, vegetales y árboles e incluye insectos que se consideran plagas en los campos de silvicultura, horticultura y agricultura. Los ejemplos de cultivos específicos que se pueden proteger con los métodos descritos en la presente son soja, maíz, algodón, alfalfa y los cultivos vegetales. Hacia el final de este documento consta una lista de cultivos e insectos específicos.

"Ambiente del intestino del insecto" o "ambiente del intestino" se refiere a las condiciones de pH y proteinasa específicas que se encuentran dentro del intestino anterior, medio o posterior de un insecto o larva de insecto.

"Ambiente de hemolinfa del insecto" se refiere a las condiciones de pH y proteinasa específicas que se encuentran dentro de un insecto o larva de insecto.

"Actividad insecticida" significa que en el momento de la exposición del insecto a los compuestos o péptidos, o luego de esta, el insecto se muere, detiene o enlentece su movimiento o alimentación, detiene o enlentece su crecimiento, no crisálida, no se puede reproducir o no puede producir descendencia fértil.

"Péptido insecticida", "proteína insecticida", "péptido tóxico" o "proteína tóxica" se refiere a una proteína con actividad insecticida cuando se la digiere, se encuentra en contacto con, o se inyecta en un insecto.

"Evaluación de cepa de producción de péptido insecticida" se refiere a un proceso de evaluación que identifica las cepas de levadura de producción de péptido insecticida con mayor rendimiento de las cepas con menor rendimiento. En los métodos descritos en la presente, se refiere a evaluaciones que utilizan la HPLC de fase inversa o el bioensayo de inyección de mosca doméstica.

"Vector de expresión integrativo o vector integrativo" se refiere a un vector de expresión de levadura que puede insertarse en un locus específico del genoma de la célula de levadura y se convierte de forma estable en una parte del genoma de levadura.

"Enlazador intermedio" se refiere a una secuencia de péptido corta en la proteína que separa distintas partes de la proteína, o una secuencia de ADN corta que se coloca en el marco de lectura en el ORF para separar las secuencias de ADN dirección 5' y dirección 3', de modo que durante la traducción proteica las proteínas codificadas en el ADN puedan alcanzar la formación de su estructura secundaria y terciaria independiente. El enlazador intermedio puede ser resistente o susceptible a la escisión en ambientes celulares vegetales, en el ambiente del intestino del insecto y/o lepidóptero y en el ambiente de hemolinfa del insecto y hemolinfa del lepidóptero.

"Péptido conocido" se refiere a un péptido conocido por presentar actividad biológica y puede ser un péptido maduro o cualquier versión o fragmento de este, incluyendo los pre y pro péptidos y conjugados de los péptidos activos. Un péptido conocido preferido es uno que presenta actividad insecticida.

"L" en el contexto adecuado se refiere a un péptido enlazador intermedio, que enlaza una proteína de estabilización traduccional con un motivo proteico de ICK o múltiples dominios del motivo proteico de ICK y enlaza el mismo u otros múltiples motivos proteicos de ICK. Cuando se hace referencia a los aminoácidos, "L" también puede referirse a leucina.

"Enlazador, ENLAZADOR" o, en algunos contextos, "L" se refiere a un péptido enlazador intermedio, que enlaza una proteína de estabilización traduccional con un motivo proteico de ICK o múltiples dominios del motivo proteico de ICK y enlaza los mismos u otros múltiples motivos proteicos de ICK. El enlazador puede tener una de (al menos) tres funciones: escindirse en el ambiente del intestino del insecto, escindirse en la célula vegetal o se puede diseñar para que no se escinda de forma intencional. 1" o " enlazador " se refiere a un nucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio.

"Ambiente del intestino del lepidóptero" se refiere a las condiciones de pH y proteinasa específicas que se encuentran dentro del intestino anterior, medio o posterior de un insecto o larva de lepidóptero.

"Ambiente de hemolinfa del lepidóptero" se refiere a las condiciones de pH y proteinasa específicas que se encuentran dentro de un insecto o larva de lepidóptero.

"Múltiples dominios del motivo proteico de ICK" se refiere a una proteína compuesta por múltiples motivos proteicos de ICK que están unidos por múltiples péptidos enlazadores intermedios. Los motivos proteicos de ICK en los múltiples dominios del motivo proteico de ICK pueden ser iguales o distintos, y los péptidos enlazadores intermedios en este dominio también pueden ser iguales o distintos.

"CRIPS que no son de ICK" pueden tener 4-8 cisteínas que forman 2-4 enlaces de disulfuro. Los péptidos que no son de ICK incluyen péptidos del nudo de cistina que no son péptidos de ICK. Los péptidos que no son de ICK pueden tener distintos órdenes de conexión de los enlaces de cistina que los ICK. Los ejemplos de un CRIP que no es de ICK son péptidos como Av2 y Av3, que son péptidos que se identificaron en primer lugar a partir de anémonas. Estos péptidos de anémonas son ejemplos de una clase de compuestos que modulan los canales de sodio en el sistema nervioso periférico (PNS, por sus siglas en inglés) del insecto.

"Aminoácido no polar" es un aminoácido que es poco hidrofóbico e incluye glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina. Glicina o gly es el aminoácido no polar más preferido para los dipéptidos de la presente invención.

"Rendimiento de péptido normalizado" se refiere al rendimiento de péptido en el medio acondicionado dividido entre la densidad celular correspondiente en el momento en que se mide el rendimiento del péptido. El rendimiento del péptido se puede representar mediante la masa del péptido producido en una unidad de volumen, por ejemplo, mg por litro o mg/L, o mediante el área máxima de absorbencia UV del péptido producido en la cromatografía de HPLC, por ejemplo, mAu.seg. La densidad celular se puede representar mediante absorbencia de luz visible del cultivo a una longitud de onda de 600 nm (OD600).

"Código de una letra" se refiere a la secuencia de péptidos que se enumera en su código de una letra para distinguir los varios aminoácidos en la estructura principal de una proteína. alanina=A, arginina=R, asparagina=N, ácido aspártico=D, asparagina o ácido aspártico=B, cisteína=C, ácido glutámico=E, glutamina=Q, glutamina o ácido glutámico=Z, glicina=G, histidina=H, isoleucina=I, leucina=L, lisina=K, metíonina=M, fenilalanina=F, prolina=P, serina=S, treonina=T, triptófano=W, tirosina=Y, valina=V.

"Péptido de omega", también denominado "toxina omega", también denominado "omega-ACTX-Hvla", también denominado "omega-ACTX-Hvla natural" se refieren a un péptido de ACTX que se aisló en primer lugar a partir de una araña conocida como araña de Sídncy con tela en embudo, Hydronyche versuta, y que es un antagonista del canal de Ca2+ dependiente del voltaje de insectos.

"ORF", "marco de lectura abierto" o "ORF de expresión de péptido" se refiere a la secuencia de ADN que codifica una proteína que comienza con un codón de inicio ATG y finaliza con un codón de terminación TGA, TAA o TAG. ORF también se puede referir a la proteína traducida codificada por el ADN.

"Unido operativamente" significa que las dos secuencias de ADN adyacentes se ubican juntas de modo que la activación transcripcional de una pueda actuar sobre la otra.

"PEP" significa péptido expresado en la planta.

"Casete de expresión de péptido" o "casete de expresión" se refiere a una secuencia de ADN compuesta por todos los elementos de ADN necesarios para completar la transcripción de un péptido insecticida en un sistema de expresión biológico. En los métodos descritos en la presente, se incluye un promotor de transcripción, una secuencia de ADN para codificar una secuencia de señal del factor de apareamiento a y un sitio de escisión Kex 2, un transgén del péptido insecticida, un codón de terminación y un terminador de transcripción.

"Vector de expresión de péptido" se refiere a un vector de expresión del organismo hospedador que contiene un transgén del péptido insecticida heterólogo.

"Cepa de la levadura de expresión de péptido", "cepa de expresión de péptido" o "cepa de producción de péptido" se refiere a una cepa de levadura que puede producir un péptido insecticida heterólogo.

"Péptido que se vuelve especial" se refiere a un péptido que anteriormente tenía un rendimiento de péptido bajo de un sistema de expresión biológica que se vuelve un péptido HP mediante los métodos descritos en la presente utilizados para aumentar su rendimiento.

"Transgén de péptido" o "transgén de péptido insecticida" se refiere a una secuencia de ADN que codifica un péptido insecticida y se puede traducir en un sistema de expresión biológica.

"Rendimiento peptídico" se refiere a la concentración de péptido insecticida en el medio acondicionado que se produce a partir de las células de una cepa de levadura de expresión de péptido. Se puede representar mediante la masa del péptido producido en una unidad de volumen, por ejemplo, mg por litro o mg/L, o mediante el área máxima de absorbencia UV del péptido producido en la cromatografía de HPLC, por ejemplo, Au.seg.

"Membrana peritrófica" se refiere a un recubrimiento dentro del intestino del insecto que atrapa partículas grandes de alimento que puede ayudar en su movimiento a través del intestino, a la vez que permiten la digestión, pero que también protege la pared del intestino.

"PFIP" se refiere a una proteína que puede formar un poro o canal en las células que revisten el intestino de un insecto, como las células del epitelio intestinal. Los ejemplos de PFIPS son proteínas de Bt, tales como cry, crt y VIP, se pueden encontrar otros ejemplos de PFIP en el listado de secuencias. r?r 0 "protector incorporado a la planta" se refiere a una proteína insecticida producida por plantas transgénicas, y el material genético necesario para que la planta produzca la proteína.

"Enlazador escindible por la planta" se refiere a un péptido enlazador escindible o un nucleótido que codifica un péptido enlazador escindible que contiene un sitio de reconocimiento de proteasa vegetal y se puede escindir durante el proceso de expresión de la proteína en la célula vegetal.

"Medio de regeneración vegetal" se refiere a cualquier medio que contiene los elementos y vitaminas necesarios para el crecimiento de la planta y las hormonas vegetales necesarias para promover la regeneración de una célula en un embrión que puede germinar y generar una plántula derivada de cultivo de tejido. A menudo, el medio contiene un agente seleccionable con respecto al cual las células transgénicas expresan un gen de selección que otorga resistencia al agente.

"Proteína transgénica vegetal" se refiere a una proteína de una especie heteróloga que se expresa en una planta luego de administrar el ADN o ARN que codifica una o más de las células vegetales.

"Aminoácido polar" es un aminoácido que es polar e incluye serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano y tirosina; los aminoácidos polares preferidos son serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina, serina es el que más se prefiere.

"Silenciamiento génico postranscripcional" o "PTGS" se refiere a un proceso celular dentro de las células vivas que suprime la expresión de un gen.

"Proteína" tiene el mismo significado que "péptido" en este documento.

"Vector recombinante" se refiere a un vector de plásmido de ADN en el que se ha insertado ADN foráneo.

"Gen de selección" se refiere a un gen que otorga una ventaja para que crezca un organismo genómicamente modificado bajo presión selectiva.

"STA ", "proteína de estabilización traduccional ", "proteína de estabilización" o "proteína de fusión" se refiere a una proteína con estructura terciaria suficiente que se puede acumular en una célula sin ser la diana del proceso celular de degradación de proteína. La proteína puede ser de entre 5 y 50aa (p. ej., otro motivo proteico de ICK), 50 a 250aa (GNA), 250 a 750aa (p. ej., quitinasa) y 750 a 1500aa (p. ej., enhancin). La proteína de estabilización traduccional se codifica mediante una secuencia de ADN para una proteína que se fusiona en el marco con una secuencia que codifica una proteína insecticida en el ORF. La proteína de fusión puede estar dirección 5' o dirección 3' de la proteína insecticida y puede tener cualquier secuencia intermedia entre las dos secuencias, con la condición de que la secuencia intermedia no dé como resultado un cambio de marco de cualquiera de las secuencias de ADN. La proteína de estabilización traduccional también puede tener una actividad que aumenta la administración del motivo proteico de ICK en la pared intestinal y en la hemolinfa del insecto. La administración se puede lograr mediante el tráfico activo del ORF total en la pared intestinal, o mediante escisión dentro del ambiente del intestino para separar el motivo proteico de ICK, mientras que la proteína de estabilización traduccional daña la membrana peritrófica y/o la pared intestinal para aumentar la difusión del motivo proteico de ICK en la hemolinfa. " sta" se refiere a un nucleótido que codifica una proteína de estabilización traduccional.

"TMOF" "motivo de TMOF" o "proteínas de TMOF" se refiere a secuencias de la proteína "del factor oostático modulador de tripsina" . Se proporcionan ejemplos en el listado de secuencias. En la presente se proporcionan varios ejemplos y variantes. SEQ ID NO: 708 es la secuencia de TMOF de tipo salvaje. Otras variantes no taxativas se proporcionan en las SEQ. ID. NO: 709 - 721. Un experto en la téenica puede conocer o generar otros ejemplos.

MTSP" o "proteína soluble total" se refiere a la cantidad total de proteína que se puede extraer de una muestra de tejido vegetal y se puede solubilizar en el amortiguador de extracción.

"Transgén" se refiere a una secuencia de ADN heterólogo que codifica una proteína que se transforma en una planta.

"Célula hospedadora transgénica" se refiere a una célula que se transforma con un gen y se ha seleccionado para determinar su estado transgénico mediante un gen de selección adicional .

"Planta transgénica" se refiere a una planta que se ha derivado de una única célula que se transformó con ADN foráneo, de modo que cada célula de la planta contenga el transgén.

"Sistema de expresión transitoria" se refiere a un sistema basado en Agrobacterium tumefaciens que administra ADN que codifica un virus vegetal desarmado a una célula vegetal en la que se expresa. El virus vegetal se ha modificado genéticamente para expresar una proteína de interés a altas concentraciones, hasta 40 % de la TSP. En la prueba téenica, se utilizan dos sistemas de expresión transitoria, un sistema TRBO y FECT y las células vegetales son de tejido de hoja de una planta de tabaco "Nicotiana benthamiana" .

"TRBO" se refiere a un sistema de expresión vegetal transitoria usando virus del mosaico del tabaco con eliminación del gen proteico de recubrimiento viral.

"Escisión de tripsina" se refiere a un ensayo in vitro que utiliza la enzima de proteasa tripsina (que reconoce los residuos de aminoácidos de lisina y arginina expuestos) para separar un enlazador escindible en el sitio de escisión. También se refiere al acto de escisión de el sitio mediante la enzima tripsina.

"Péptido U", "proteína U", también denominado "toxina U", también denominado "U natural", también denominado "U-ACTX-Hvla", también denominado "U-ACTX-Hvla natural", así como "péptido híbrido", también denominado "toxina híbrida", también denominado "híbrido-ACTX-Hvla", también denominado "híbridoACTX-Hvla natural", se refieren a una proteína natural o toxina natural que se puede encontrar en la naturaleza o se conoce de otro modo, en el caso de "U-ACTX-Hvla" también denominado "U-ACTX-Hvla natural", la proteína es una toxina de araña natural, que se descubrió en primer lugar a partir de una araña con orígenes en las montañas azules de Australia y es un antagonista dual contra los canales de Ca2+ y canales de K+ regulados por voltaje de insectos. La araña a partir de la cual se descubrió la toxina es conocida como la araña de Sídncy con tela en embudo, con el nombre científico Hydronyche versuta .

"Péptido U+2", "proteína U+2", "toxina U+2", "U+2" o "U+2-ACTX-Hvla, " se refieren a una toxina, que tiene un dipéptido adicional unido operativamente al péptido natural, y se puede referir a la toxina de araña que a veces se denomina péptido U u otros términos que se mencionan anteriormente. El dipéptido adicional que se une operativamente al péptido U y, por lo tanto, se indica como "+2" o "más 2" se puede seleccionar entre varios péptidos, cualquiera de los cuales puede dar como resultado un "péptido U+2" con propiedades únicas, como se menciona en la presente. Estos también se denominan a veces "péptidos de producción alta". Cuando se utiliza el término "U+2-ACTX-Hvla", se refiere a un péptido tóxico de producción alta específico, que comprende un péptido de origen natural de la araña de Sídney con tela en embudo, con el nombre científico Hydronyche versuta.

Las proteínas "VIP" se descubrieron a partir del análisis del sobrenadante de cepas de Bt cultivadas de forma vegetativa para determinar la posible actividad insecticida. Tienen poca o ninguna similitud con las proteínas cry y se denominaron proteínas insecticidas vegetativas o VIP. De uso y preferencia particular para su uso con este documento son las denominadas VIP3, proteínas Vip3 o toxinas Vip, que presentan actividad de lepidóptero. Se cree que tienen un modo de acción similar a los péptidos cry de Bt. En este documento, las proteínas VIP se categorizan como un tipo de proteína PFIP.

"Vector de expresión de levadura", "vector de expresión" o "vector" se refiere a un plásmido que puede introducir un gen heterólogo y/o casete de expresión en células de levadura que se transcriben y traducen.

"Rendimiento" se refiere a la producción de un péptido, y los mayores rendimientos pueden referirse a mayores cantidades de producción, mayores velocidades de producción y un mayor rendimiento promedio o medio y mayor frecuencia a mayores rendimientos.

Sección 1. PÉPTIDOS INCORPORADOS A LA PLANTA O PÉPTIDOS EXPRESADOS EN LA PLANTA "PIPS" Y "PEPS" Los protectores incorporados a la planta o "PIPs" han presentado una solución a la dificultad que suponen los insectos para los agricultores. La agricultura moderna emplea genes de Bacillus thuringiensis expresados como proteínas transgénicas vegetales para actuar como PIP, pero se han detectado cepas de insectos resistentes naturales en el campo y amenazan esta clase. Es necesario desarrollar PIP adicionales con modos de acción novedosos para manejar el desarrollo de resistencia. Una clase novedosa de proteínas con actividad insecticida con el potencial de convertirse en PIP se denominan proteínas insecticidas ricas en cisteína (CRIPS); estas proteínas tienen 4, 6 u 8 cisteínas y 2, 3 o 4 enlaces de disulfuro. Se dice que un ejemplo de esta clase de compuestos es el tipo denominado motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína (ICK). Los motivos proteicos de ICK que presentan actividad insecticida tienen potencial de ser proteínas insecticidas y PIP.

Los motivos proteicos de ICK son una clase de proteínas con al menos seis residuos de cisteína que forman una estructura terciaria de ICK específico. La reticulación covalente de los residuos de cisteína en los motivos proteicos de ICK forman puentes de disulfuro que dan como resultado estructuras terciarias que hacen que la proteína sea relativamente resistente a las proteasas y, a veces, a condiciones físicas extremas (pH, temperatura, luz UV, etc.), y otorgan actividad contra los canales de iones, que pueden ser específicos de los insectos. Han evolucionado muchos motivos proteicos de ICK en el veneno de invertebrados y vertebrados que utilizan los motivos proteicos de ICK como toxina para inmovilizar o matar a sus predadores o presas. Los péptidos insecticidas a menudo tienen origen de escorpión, araña y, a veces, serpiente. En la naturaleza, los péptidos tóxicos se pueden dirigir al intestino del insecto o a los órganos internos, mediante inyección. En el caso de un PIP, la administración a menudo se realiza mediante el consumo de una proteína transgénica expresada en el tejido vegetal por parte del insecto. Luego de este consumo de la toxina de su alimento, por ejemplo, un insecto que se alimenta de una planta transgénica, el motivo proteico de ICK puede inhibir el crecimiento, afectar el movimiento o incluso matar un insecto.

Sin embargo, los péptidos tóxicos a menudo pierden su toxicidad cuando se expresan en las plantas. A menos que se exprese un motivo proteico de ICK como proteína con plegamiento adecuado no puede proteger exitosamente una planta o cultivo del daño del insecto. En algunos casos, se deberá activar un péptido expresado por la planta mediante escisión dentro del insecto o durante el proceso de expresión en una planta para que sea activo. Existe la necesidad de métodos y péptidos y ácidos nucleicos modificados que permiten que los péptidos no solamente se expresen en una planta sino que también se expresen, plieguen adecuadamente y, en algunos casos, se escindan adecuadamente, de modo que el péptido conserve su actividad contra un insecto, incluso luego de la expresión en una planta. En esta sección, se presentan varias formas de producir péptidos activos adaptados para la expresión en plantas.

Se describen varias combinaciones de distintos péptidos unidos operativamente para generar complejos proteicos novedosos. Se describen los siguientes complejos proteicos. Un péptido compuesto por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente al péptido insecticida rico en cisteína (CRIP), tal como un motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), que se designa ERSP-ICK, donde el ERSP es el N-terminal de el péptido, y donde el péptido ERSP tiene entre 3 y 60 aminoácidos de longitud, entre 5 y 50 aminoácidos de longitud, entre 20 y 30 aminoácidos de longitud y/o donde el péptido es BAAS, o péptido señal de extensina de tabaco, o un péptido señal de extensina de tabaco modificada, o péptido señal Jun a 3 de Juniperus ashei o J ashei .

Un péptido compuesto por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP), tal como un motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), que se designa ERSP-ICK, donde el motivo proteico de ICK tiene entre 16 y 60 aminoácidos de longitud, entre 26 y 48 aminoácidos de longitud, entre 30 y 44 aminoácidos de longitud y/o donde el motivo proteico de ICK es U-ACTX-Hvla, Omega-ACTX-Hvla o Kappa-ACTX-Hvlc.

Un péptido compuesto por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), designado ERSP-ICK, donde el ERSP y motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) son combinaciones de cualquiera de los tamaños y longitudes descritos en la presente y/o están compuestos por cualquiera de las secuencias identificadas que se mencionan en el presente documento.

Un nucleótido que codifica cualquiera de los péptidos que se describen en la presente como péptidos de señal del retículo endoplasmático (ERSP) y/o péptido insecticida rico en cisteína (CRIP), como motivos proteicos del nudo inhibidor de cistina (ICK). Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que codifica estos péptidos. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que codifican estos péptidos transformados en un genoma de planta transgénica. Un péptido donde el motivo proteico de ICK es una proteína insecticida. Un péptido donde el péptido insecticida es cualquiera de los motivos proteicos de ICK o péptido descrito en la presente. Un péptido donde el péptido insecticida es cualquier péptido que se selecciona de cualquiera de los péptidos o fuentes de péptidos que incluyen Atrax o Hadronyche. Un péptido insecticida que se selecciona de cualquiera de los péptidos en el listado de secuencias y fragmentos de estos que incluye versiones de pre y propéptidos o péptidos maduros de los péptidos y números de secuencia. Un péptido donde el péptido insecticida es cualquier péptido que se selecciona, descrito o seleccionado de una proteína de ACTX. Una proteína de TMOF.

El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en la presente para elaborar o transformar una planta o genoma vegetal para expresar péptidos con plegamiento adecuado en una planta transformada. El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en la presente para generar o transformar una planta o genoma vegetal para expresar péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada y para provocar la acumulación de los péptidos tóxicos con expresión y plegamiento adecuado en la planta y para provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto.

Un método para utilizar los nucleótidos de cualquiera de los péptidos u ORF de expresión en vectores de expresión de motivo proteico de CRIP, ICK, que no es de ICK, para crear plantas transgénicas . Un vector de expresión del motivo proteico de ICK que comprende cualquiera de los nucleótidos que expresan cualquier péptido descrito en la presente. Un vector de expresión del motivo proteico de ICK incorporado en una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican cualquiera de los péptidos descritos en la presente o que podría generar un experto en la téenica de acuerdo con la descripción de la presente. Un procedimiento para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos descritos en la presente. Una planta generada por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Una proteína compuesta por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) o péptido rico en cisteína, unido operativamente a un péptido enlazador intermedio (L o enlazador), que se designa ERSP-enlazador-ICK, (ERSP-L-ICK) o ERSP-ICK-enlazador (ERSP-ICK-L), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y el L o enlazador, puede estar en el lado del N-terminal (dirección 5') del motivo proteico de ICK o en el lado del C-terminal (dirección 3') del motivo proteico de ICK. Una proteína designada ERSP-L-ICK, o ERSP-ICK-L, que comprende cualquiera de los motivos proteicos de ERSP o ICK, descritos en la presente, y donde el L puede ser un péptido enlazador no escindible o un péptido enlazador escindible, que se puede escindir en células vegetales durante el proceso de expresión de la proteína o se puede escindir en ambientes intestinales y ambiente de hemolinfa del insecto, y puede estar compuesto por cualquier péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) descrito o que se menciona en el presente documento, que incluye las siguientes secuencias: IGER (SEQ ID NO. 1) EEKKN, (SEQ ID NO. 2) y ETMFKHGL (SEQ ID NO.3).

Un nucleótido que codifica cualquiera de los péptidos descritos como péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y todos y cualesquiera de los nucleótidos que codifican cualquiera de estas proteínas que se utilizan para crear plantas transgénicas .

El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en una planta transformada. El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o péptido enlazador intermedio para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada y para provocar la acumulación de los péptidos tóxicos con expresión y plegamiento adecuado en la planta y para provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto.

Un método para usar los nucleótidos u ORF de expresión que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) para crear plantas transgénicas. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que se encuentran en un vector de expresión de ICK expresan cualquiera de los péptidos descritos en la presente. ERSP, motivo proteico de ICK y/o ENLAZADOR. Un ORF de expresión funcional en un vector de expresión del motivo proteico de ICK incorporado en una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican cualquiera de los péptidos descritos en la presente que codifican ERSP, un motivo proteico de ICK y/o ENLAZADOR o que podría generar un experto en la téenica de acuerdo con la descripción de la presente. Un procedimiento para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos descritos en la presente. ERSP, motivo proteico de ICK y/o ENLAZADOR. Una planta generada por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Una proteína compuesta por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) unido operativamente a u_na pro_teína de estabilización transcripcional (STA), que se designa ERSP-STA-ICK o ERSP-ICK-STA, donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y el STA, puede estar en el lado del N-terminal (dirección 5') del motivo proteico de ICK o en el lado del C-terminal (dirección 3') del motivo proteico de ICK. Una proteína designada ERSP-STA-ICK o ERSP-ICK-STA, que comprende cualquiera de los ERSP o motivos proteicos de ICK que se describen en la presente y donde la STA está compuesta por cualquiera de las proteínas de estabilización traduccional descritas, o que se mencionan en el presente documento que incluyen GFP (proteína fluorescente verde), GNA (lectina de campanilla de invierno), Jun a 3 ( Juniperus ashei) y muchos otros motivos proteicos de ICK.

Un nucleótido que codifica cualquiera de los péptidos descritos como péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cisterna (ICK) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) y todos y cualesquiera de los nucleótidos que tienen cualquiera de estos grupos funcionales que codifican cualquiera de estas proteínas que se utilizan para crear plantas transgénicas.

El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en una planta transformada. El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada y para provocar la acumulación de los péptidos tóxicos con expresión y plegamiento adecuado y para provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto.

Un método para usar los nucleótidos u ORF de expresión que codifican un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) en un vector de expresión de ICK para crear plantas transgénicas. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que expresan ERSP, motivo proteico de ICK y/o STA. Un ORF de expresión funcional en un vector de expresión del motivo proteico de ICK que se incorpora a una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican ERSP, un motivo proteico de ICK y/o STA o que podría generar un experto en la téenica de acuerdo con la descripción de la presente. Un procedimiento para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan ERSP, un motivo proteico de ICK y/o STA. Una planta generada por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Una proteína compuesta por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) unido operativamente a una proteína de estabilización traduccional (STA) unida operativamente a un péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR), que se designa ERSP-STA-ENLAZADOR-ICK, ERSP-ICK-ENLAZADOR-STA, , ERSP-STA-L-ICK o ERSP-ICK-L-STA, donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y la STA, puede estar en el lado del N-terminal (dirección 5') del motivo proteico de ICK del lado del C-terminal (dirección 3') del motivo proteico de ICK y el ENLAZADOR se encuentra entre STA y el motivo proteico de ICK. Una proteína designada ERSP-STA-ENLAZADOR-ICK o ERSP-ICK- ENLAZADOR-STA, que comprende cualquiera de los ERSP, motivos proteicos de ICK, péptidos enlazadores intermedios y proteínas de estabilización traduccional que se describen en la presente.

Un nucleótido que codifica cualquiera de los péptidos descritos como péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK) y/o péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) todos y cualesquiera de los nucleótidos que codifican cualquiera de estas proteínas que se utilizan para crear plantas transgenicas.

El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en una planta transformada. El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada y para provocar la acumulación de los péptidos tóxicos con expresión y plegamiento adecuado en la planta y para provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto.

Un método para usar los nucleótidos u ORF de expresión en un vector de expresión de ICK que codifica un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para crear plantas transgénicas. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos en un vector de expresión de ICK que expresan ERSP, motivo proteico de ICK, ENLAZADOR y/o STA. Un ORF de expresión funcional en un vector de expresión de ICK que se incorpora a una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican ERSP, un motivo proteico de ICK, ENLAZADOR y/o STA o que podría generar un experto en la téenica de acuerdo con la descripción de la presente. Un procedimiento para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan ERSP, un motivo proteico de ICK, ENLAZADOR y/o STA. Una planta generada por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Una proteína compuesta por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a múltiples dominios del motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), que están unidos operativamente mediante péptidos enlazadores intermedios (ENLAZADOR), unidos operativamente a una proteína de estabilización traduccional (STA) unida operativamente a un péptido enlazador intermedio, designado ERSP-STA-(ENLAZADORi-1CKj)N o ERSP-(ICKj-ENLAZADORi)N-STA y, a veces, ERSP-STA-(Li-1CKj)N o ERSP-(ICKj-LÍ)N-STA, donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y la STA puede estar en el lado del N-terminal (dirección 5') de los múltiples dominios del motivo proteico de ICK ((ENLAZADORi-ICKj)N) O en el lado del C-terminal (dirección 3') de los múltiples dominios del motivo proteico de ICK ((ICKj-ENLAZADORi)N) y los múltiples péptidos intermedios (ENLAZADORi) se encuentra entre STA y los múltiples dominios proteicos del motivo proteico de ICK y entre los motivos proteicos de ICK en los múltiples dominios del motivo proteico de ICK. Una proteína designada ERSP-STA-(ENLAZADORi-ICKj)N o ERSP-(ICKj-ENLAZADORi)N-STA, que comprende cualquiera de los ERSP, motivos proteicos de ICK, péptidos enlazadores intermedios y proteínas de estabilización traduccional que se describen en la presente.

Un nucleótido que codifica cualquiera de los péptidos descritos como péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), múltiples dominios del motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) todos y cualesquiera de los nucleótidos que codifican cualquiera de estas proteínas que se utilizan para crear plantas transgénicas.

El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), múltiples dominios del motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en una planta transformada. El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos que codifican el peptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), múltiples dominios del motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para generar o transformar una planta o genoma de planta para expresar los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada y para provocar la acumulación de los péptidos tóxicos con expresión y plegamiento adecuado en la planta y para provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto.

Un método para usar los nucleótidos u ORF de expresión que codifican el péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP), múltiples dominios del motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) y/o proteína de estabilización traduccional (STA) para crear plantas transgénicas. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que expresan ERSP, múltiples dominios del motivo proteico de ICK, L o ENLAZADOR y/o STA. Un ORF de expresión funcional incorporado a una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican ERSP, múltiples dominios del motivo proteico de ICK, ENLAZADOR y/o STA o que podría generar un experto en la téenica de acuerdo con la descripción de la presente. Un procedimiento para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan ERSP, múltiples dominios del motivo proteico de ICK, ENLAZADOR y/o STA. Una planta generada por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Un gen quimérico que comprende un promotor activo en plantas unido operativamente a los ácidos nucleicos u ORF de expresión de los nucleótidos descritos en la presente. Un método para elaborar, producir o usar estos genes quiméricos que se describen en la presente. Un vector recombinante que comprende los genes quiméricos descritos en la presente. Un método para elaborar, producir o usar los vectores recombinantes que se describen en la presente. Una célula hospedadora transgénica que comprende los genes quiméricos descritos en la presente. Un método para elaborar, producir o usar la célula hospedadora recombinante que se describe en la presente. Una célula hospedadora transgénica como la que se describe en la presente que es una célula de planta transgénica. Un método para elaborar, producir o usar la célula de planta transgénica que se describe en la presente. Una planta transgénica que comprende la célula de planta transgénica que se describe en la presente. Un método para elaborar, producir o usar las plantas transgénicas que se describen en la presente. Una planta transgénica como se describe en la presente derivada de maíz, soja, algodón, arroz, trigo, sorgo, pasto varilla, caña de azúcar, alfalfa, patatas, tomates, tabaco, cualquier vegetal de hoja verde o cualquier árbol frutáceo. Una semilla de una planta transgénica como se describe en la presente, donde la semilla comprende un gen quimérico como se describe en la presente. Un método para elaborar, producir o usar la planta transgénica que se describe en la presente. Un método para elaborar, producir o usar las semillas que se describen en la presente.

Se han descrito motivos proteicos del nudo inhibidor de cisteína (ICK) de arañas y escorpiones expresados en la planta (Khan et ál, Transgenic Res., 2006, 15: 349-357; Hernández-Campuzano et ál, Toxicon. ene 2009;53(1):122-8.). Se describe el modo para elaborar una planta que expresa motivos proteicos de ICK que son activos y se acumulan en plantas hasta niveles de dosis insecticidas. Se muestra que las descripciones anteriores de plantas que expresan motivos proteicos de ICK en realidad eran descripciones de proteínas inactivas que habían perdido su toxicidad natural . Se describen métodos para aumentar la eficacia de la expresión de la planta, para aumentar la acumulación de proteínas expresadas en la planta y para aumentar drásticamente la actividad insecticida de las proteínas expresadas en la planta. Se describe el modo de inducir los motivos proteicos de ICK expresados en la planta para que ingresen al retículo endoplasmático (ER) dirigido mediante proteína de señalización del retículo endoplasmático (ERSP) en células vegetales, para la reticulación covalente correcta de puentes de disulfuro de péptido que generan la estructura del motivo de ICK terciaria esencial necesaria para la actividad insecticida. Se describe adicionalmente la planta expresada, complejo del motivo proteico de ICK con tráfico en el ER con adición de un dominio de la proteína de estabilización traduccional (STA) para aumentar el tamaño de la proteína de fusión de ICK resultante que potencia la acumulación de péptido en la planta. Se describe adicionalmente la planta expresada, motivo proteico de ICK con tráfico en el ER, con adición de una proteína de estabilización traduccional como se menciona anteriormente, y con adición de un péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR), donde este último puede permitir la posible escisión y la recuperación de la forma activa del motivo proteico de ICK con actividad insecticida. Se describe adicionalmente el polipéptido expresado en la planta, que contiene un dominio del motivo proteico de ICK con tráfico en el ER con múltiples motivos proteicos de ICK separados por los péptidos enlazadores intermedios (ENLAZADOR), con adición de un péptido enlazador intermedio, con adición de una proteína de estabilización traduccional, donde esta última permite que se acumule el motivo proteico de ICK plegado correctamente en la planta hasta la dosis insecticida .

La presente invención describe el motivo proteico de ICK con actividad insecticida que se expresa en la planta y que puede proteger satisfactoriamente una planta o cultivo del daño de los insectos. El ORF de expresión del motivo proteico de ICK descrito en la presente es un nucleótido que permite que los péptidos traducidos en la planta no solamente se expresen en una planta sino que también se expresen y plieguen adecuadamente, y se acumulen hasta la dosis insecticida en la planta. Un ejemplo de un ORF de expresión de proteína puede ser un ORF de expresión del motivo proteico de ICK que se describe a continuación como ecuación y se muestra como diagrama en las figuras o figuras. ersp-sta- (enlazador -crip ) o ersp- (crip -enlazadon) -sta La expresión que antecede es simplemente un ejemplo, y expresiones similares podrían escribirse para otros tipos de ORF de expresión de CRIP, por ejemplo, un ORF de expresión de ICK podría escribirse como: ersp-sta- (enlazadori-ickj)N o ersp-(ickj-enlazadori)N-sta Estas expresiones, ecuaciones o diagramas lineales describen un marco de lectura abierto (ORF) de polinucleótido para un tipo de CRIP, que expresa el complejo del motivo proteico de ICK, que se puede describir como ERSP-STA- (ENLAZADORI-ICKJ)N O ERSP-(ICKJ-ENLAZADORI)N-STA, O como ERSP-STA- (LI-ICKJ)N o ERSP-(ICKJ-LI)N-STA, que contiene cuatro componentes de péptidos posibles con guiones para separar cada componente. En los diagramas que anteceden, el componente de nucleótido de ersp es un segmento de polinucleótido que codifica un péptido señal de tráfico en el retículo endoplasmático (ERSP) de la planta. El componente de sta es un segmento de polinucleótido que codifica una proteína de estabilización traduccional (STA) que ayuda a la acumulación del motivo proteico de ICK expresado en plantas, pero que puede no ser necesaria en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK. El componente de enlazadon es un segmento de polinucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio (L 0 ENLAZADOR) para separar los motivos proteicos de ICK unos de otros y de la proteína de estabilización traduccional, y el subíndice "i" indica que distintos tipos de péptidos enlazadores se pueden usar en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK o CRIP. En el caso de que no se use sta en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK, se puede unir ersp directamente al polinucleótido que codifica el motivo proteico de ICK sin un enlazador. El componente de ick es un segmento de polinucleótido que codifica un motivo proteico de ICK (ICK), y el subíndice "j" indica distintos motivos proteicos de ICK; " (enl azad n - i ck ) " indica que la estructura del nucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio y un motivo proteico de ICK se pueden repetir "N" veces en el mismo marco de lectura abierto en el mismo ORF de expresión del motivo proteico de ICK, donde N puede ser cualquier número entero de 1 a 10. N puede ser de 1 a 10, específicamente, N puede ser 1, 2, 3, 4 o 5 y, en algunas modalidades, N es 6, 7, 8, 9 o 10. Las repeticiones pueden contener segmentos de polinucleótido que codifican distintos enlazadores intermedios (ENLAZADOR) y distintos motivos proteicos de ICK. Los distintos segmentos de polinucleótido que incluyen las repeticiones dentro del mismo ORF de expresión del motivo proteico de ICK se encuentran dentro del mismo marco de traducción.

Se puede usar cualquier combinación de los cuatro componentes principales, ersp, sta, enlazador y crip o ick como en el diagrama del ORF de expresión del motivo proteico de ICK, para crear un ORF de expresión del motivo proteico de ICK tipo PEP, en la medida en que se use un mínimo de ersp y al menos una copia de crip o ick.

I. El componente ERSP o ersp de los PEP El ORF de expresión del motivo proteico de ICK comienza con un ersp en su extremo 5'. Para que el motivo proteico de ICK sea funcional y se pliegue adecuadamente cuando se expresa a partir de una planta transgénica, debe tener un nucleótido de ersp fusionado en el marco con el polinucleótido que codifica un motivo proteico de ICK. Durante el proceso de traducción celular, el ERSP traducido puede dirigir el motivo proteico de ICK que se traduce para que se inserte en el retículo endoplasmático (ER) de la célula vegetal mediante la unión con el componente celular denominado partícula de reconocimiento de señales. Dentro del ER, el péptido de ERSP se escinde mediante la peptidasa de señales y se libera el motivo proteico de ICK en el ER, donde el motivo proteico de ICK se pliega adecuadamente durante el proceso de modificación postraduccional, por ejemplo, la formación de enlaces de disulfuro. Sin ninguna señal de la proteína de retención adicional, se transporta la proteína a través del ER hacia el aparato de Golgi, donde se secreta finalmente fuera de la membrana plasmática y dentro del espacio apoplástico. El motivo proteico de ICK se puede acumular en el espacio apoplástico de forma eficaz para alcanzar la dosis insecticida en las plantas. La Figura 1 muestra un diagrama representativo de un péptido o nucleótido simple de dos componentes compuesto por un ERSP unido funcionalmente a un motivo de ICK. El ICK podría ser un CRIP adecuado. En las Figuras 2-5 se diagraman más proteínas y polinucleótidos complejos que utilizan ERSP y estas figuras se describen adicionalmente en la descripción de la STA o proteína de estabilización traduccional.

El péptido de ERSP se encuentra en la región del N-terminal del complejo del motivo proteico de ICK traducido en la planta y la parte de ERSP está compuesta por alrededor de 3 a 60 aminoácidos. En algunas modalidades, es de 5 a 50 aminoácidos . En a1gunas moda 1idades, es de 10 a 40 aminoácidos, pero más a menudo está compuesta por 15 a 20, 20 a 25 o 25 a 30 aminoácidos. El ERSP es un péptido señal denominado así porque dirige el transporte de una proteína. Los péptidos de señal también se pueden denominar señales dirigidas, secuencias de señal, péptidos de tránsito o señales de localización. Los péptidos de señal para el tráfico en el ER a menudo son residuos de 15 a 30 aminoácidos de longitud y tienen una organización tripartita, compuesta por un núcleo de residuos hidrofóbicos flanqueados por una región aminoterminal con carga positiva y una región carboxiterminal polar pero sin carga. (Zimmermann, et ál, "Protein translocation across the ER membrane", Biochimica et Biohysica Acta, 2011, 1808: 912-924).

Se conocen muchos ERSP. Se conocen muchos ERSP de planta. NO es necesario que el ERSP se obtenga de un ERSP vegetal, los ERSP no vegetales funcionarán con los procedimientos descritos en la presente. Sin embargo, muchos ERSP vegetales son conocidos y en la presente se describen algunos ERSP derivados de plantas. BAAS, por ejemplo, se obtiene de la planta Hordeum vulgare, que tiene la secuencia de aminoácidos que figura a continuación: MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4) ERSP vegetales, que se seleccionan de la secuencia genómica de proteínas que se sabe que se expresan y liberan en el espacio apoplástico de plantas, y unos pocos ejemplos son BAAS, extensina de zanahoria, tabaco PR1. Las siguientes referencias proporcionan descripciones adicionales y se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad. De Loose, M. et ál. "The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts" Gene, 99 (1991) 95-100. De Loose, M. et ál. describen el análisis estructural de una extensina que codifica un gen de Nicotiana plumbagini folia, cuya secuencia contiene un péptido señal típico para la translocación de la proteína al retículo endoplasmático. Chen, M.H. et ál. "Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells" Plant Physiology, jul 2004; 135(3): 1367-77. Pub ele.2 jul 2004. Chen, M.H. et ál. estudiaron la localización subcelular de a-amilasas en células vegetales mediante el análisis de la expresión de a-amilasa, con o sin su péptido señal, en tabaco transgénico. Estas y otras referencias ilustran y describen el péptido señal que se puede utilizar en los métodos, procedimientos, y complejos y construcciones de péptido, proteína y nucleótido descritos en la presente.

II. El componente del motivo proteico de ICK y CRIP o crip e ick de los PEP En nuestro diagrama de ORF de expresión del motivo proteico de ICK, " ick" se refiere a un polinucleótido que codifica un "motivo proteico de ICK", "motivo proteico de ICK" o "motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína" que es un péptido de 16 a 60 aminoácidos con al menos 6 aminoácidos nucleares de cisteína media con tres puentes de disulfuro, donde los 3 puentes de disulfuro son enlaces covalentes y de los seis residuos de cistina media, los enlaces de disulfuro covalentes están entre la primera y la cuarta, la segunda y la quinta y la tercera y la sexta cistina media, de los seis aminoácidos de cisteína media del núcleo empezando desde el aminoácido del N-terminal. El motivo proteico de ICK también comprende una estructura secundaria de horquilla-beta, normalmente compuesta por residuos ubicados entre la cuarta y la sexta cisteína media nuclear del motivo, la horquilla se estabiliza mediante la reticulación estructural proporcionada por los tres enlaces de disulfuro del motivo. Cabe destacar que puede haber aminoácidos de cisteína/cisteína o cistina media adicionales dentro del motivo del nudo inhibidor de cisteína, como se muestra en la Figura 6. Se puede repetir el motivo de ICK o CRIP para aumentar la acumulación de péptido tóxico en la planta. Véase la Figura 4 y la Figura 5. Esta capacidad de repetir el motivo de ICK o CRIP, de 1 a 10 veces y, a veces, hasta 15, 20 o 25 veces también se muestra en el diagrama tipo ecuación de un ORF de expresión de proteína de ICK o CRIP descrito en la presente como ersp-sta- (enlazadon- ick ) u o ersp- (ick -enlazadon) n-sta, donde la cantidad de motivos de ENLAZADOR-ICK repetidos se determina mediante el número subíndice N y N es comúnmente 1-10, pero puede ser incluso superior en algunas plantas.

Se podría escribir una expresión similar tipo ersp- sta-{enlazadon- ick ) u o ersp- (icJcj- enlazados) N-sta y describiría otros péptidos CRIP. En esta sección, un ejemplo de un ORF de expresión es uno que se utiliza para aumentar la expresión de péptidos en plantas y se ejemplifica de forma más adecuada con una proteína de ICK. En el diagrama que antecede, se usa un marco de lectura abierto (ORF) de polinucleótido, que expresa un complejo del motivo proteico de ICK, que se puede describir como ERSP-STA- (ENLAZADORI-ICKJ)N o ERSP-(ICK-ENLAZADORi)N-STA, O como ERSP-STA-(LI-ICKJ)N o ERSP-(ICKJ-LI)N-STA, que contiene cuatro componentes de péptidos posibles con guiones para separar cada componente. En las figuras se puede encontrar un método alternativo para mostrar este tipo de construcción. En el diagrama y las figuras, el componente de nucleótido de ersp es un segmento de polinucleótido que codifica un péptido señal de tráfico en el retículo endoplasmático (ERSP) de la planta. El componente de sta es un segmento de polinucleótido que codifica una proteína de estabilización traduccional (STA) que ayuda a la acumulación del motivo proteico de ICK expresado en plantas, pero que puede no ser necesario en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK. El componente de li es un segmento de polinucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio (L O ENLAZADOR) para separar los motivos proteicos de ICK unos de otros y de la proteína de estabilización traduccional y el subíndice "i" indica que los distintos tipos de péptidos enlazadores se pueden usar en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK. En el caso de que no se use sta en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK, se puede unir ersp directamente al polinucleótido que codifica el motivo proteico de ICK sin un enlazador. El componente de ick es un segmento de polinucleótido que codifica un motivo proteico de ICK (ICK), y el subíndice "j" indica distintos motivos proteicos de ICK; " {enlazadon- ick ) N" indica que la estructura del nucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio y un motivo proteico de ICK se pueden repetir MNM veces en el mismo marco de lectura abierto en el mismo ORF de expresión del motivo proteico de ICK, donde N puede ser cualquier número entero de 1 a 10, pero puede ser incluso superior a 15, 20 y 25; estas repeticiones pueden contener segmentos de polinucleótido que codifican distintos enlazadores intermedios y distintos motivos proteicos de CRIP o ICK. Los distintos segmentos de polinucleótido que incluyen las repeticiones dentro del mismo ORF de expresión del motivo proteico de CRIP o ICK se encuentran dentro del mismo marco de traducción.

Este motivo es común en los péptidos aislados del veneno de varias especies. Las especies de invertebrados incluyen arañas, escorpiones, caracoles cónicos, anémonas, etc.), hay varios ejemplos adicionales, incluso se sabe que el veneno de serpiente tiene péptidos con motivo de ICK. Un ejemplo utilizado dentro de las arañas es de una clase de péptidos de ACTX de la araña de Sídncy con tela en embudo, pero los procedimientos que se describen en la presente son útiles y se pueden aplicar a cualquier proteína con el motivo de ICK.

Los ejemplos de toxinas de péptido con el motivo de ICK se pueden encontrar en las siguientes referencias. La w-Conotoxina de bloqueo del canal de calcio tipo N fue estudiada por Lew, M.J. et ál. "Structure-Fuñetion Relationships of w-Conotoxin GVIA" Journal of Biological Chemistry, tomo 272, N.° 18, publicación del 2 de mayo, pp. 12014-12023, 1997. Se estudió un resumen de varios péptidos tóxicos de artrópodos de distintas especies de arañas y escorpiones en Quintero-Hernandez, V. et ál. "Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene Cloning and Peptide Expression" Toxicon, 58, pp.644-663, 2011. Se identificó la estructura tridimensional de Hanatoxinal usando espectroscopia de NMR como motivo proteico de cisteína inhibidor en Takahashi, H. et ál. "Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins" Journal of Molecular Biology, tomo 297, publicación 3, 31 marzo 2000, pp.771-780. Se publicó el aislamiento e identificación de ADNc que codifica un péptido de toxina de ICK de veneno de escorpión, Opicalcinel, por Zhu, S. et ál. "Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides" FASEB J., 17 de set de 2003, (12):1765-7, pub ele. 3 jul 2003. Se describió la asignación específica de la secuencia y la identificación de la estructura secundaria de BgK, una toxina de bloqueo del canal de K+ de la anémona Bunodosoma granulifera por Dauplais, M. et ál. "On the convergent evolution of animal toxins" Journal of Biological Chemistry. 14 feb 1997; 272(7): 4302-9. Se publicó una revisión de la composición y farmacología de venenos de araña con énfasis en la estructura, modo de acción y evolución molecular de la toxina de polipéptido, que muestra puentes de cisterna, formaciones del nudo de cisteína y el plegamiento "tipo nudo" por Escoubas, P. et ál. "Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins" Biochimie, tomo 82, publicaciones 9-10, 10 septiembre 2000, pp. 893-907. Se describió el péptido purificado, iberiotoxina, un inhibidor del canal de K+ activado por Ca2+, de veneno de escorpión ( Buthus tamulus) en Galvez, A. et ál. "Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus" Journal of Biological Chemistry, 5 jul 1990; 265(19): 11083-90. Se describió el péptido purificado, caribdotoxina, un inhibidor del canal de K+ activado por Ca2+, del veneno de escorpión Leiurus quinquestriatus en Giménez-Gallego, G. et ál. "Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels" Proc Nati Acad Sci, mayo 1988; 85(10): 3329-3333. De estas y otras publicaciones, un experto en la téenica debería poder identificar fácilmente proteínas y péptidos con lo que se describe como motivo de ICK, motivo proteico de ICK o "motivo del nudo inhibidor de cistina".

El motivo proteico de ICK puede ser cualquier proteína con el motivo de ICK y tiene entre 16 y 60 aminoácidos de longitud, con al menos 6 residuos de cisteína que generan enlaces de disulfuro covalentes de reticulación en el orden adecuado. Véase la Figura 6. Algunos péptidos del motivo de ICK tienen entre 26-60 aminoácidos de longitud. Algunos motivo proteicos de ICK tienen entre 16-48 aminoácidos de longitud. Algunos motivo proteicos de ICK tienen entre 26-48 aminoácidos de longitud. Algunos motivo proteicos de ICK tienen entre 30-44 aminoácidos de longitud. Los motivos proteicos de ICK con actividad insecticida natural son preferidos pero los expertos en la técnica conocen motivos proteicos de ICK con otros tipos de actividad, tal como resistencia a la sal y escarcha y se reivindican en la presente. Los ejemplos de motivos proteicos de ICK insecticidas incluyen los péptidos y genes de ACTX e incluyen todos los péptidos y sus genes de codificación conocidos como Magi6.

Un ejemplo de un ORF de expresión de proteína podría ser un ORF de expresión del motivo proteico de ICK diagramado a continuación como: ersp- sta- (enlazadon- ick ) o ersp- {ick -enlazadon) u- sta Se podría escribir una expresión similar para otros péptidos de CRIP. En esta sección, este ejemplo de un ORF de expresión se utiliza para expresión de péptido alta y se ejemplifica de forma más adecuada con una proteína de ICK. En el diagrama que antecede, se usa un marco de lectura abierto (ORF) de polinucleótido, que expresa un complejo del motivo proteico de ICK, que se puede describir como ERSP-STA- (ENLAZADORI-ICKJ)N O ERSP-(ICKJ-ENLAZADORI)N-STA, O como ERSP-STA- (LI-ICKJ)N o ERSP-(ICKJ-LX)N-STA, que contiene cuatro componentes de péptidos posibles con guiones para separar cada componente. En este diagrama, el componente de nucleótido de ersp es un segmento de polinucleótido que codifica un péptido señal con tráfico en el retículo endoplasmático (ERSP) de la planta. El componente de sta es un segmento de polinucleótido que codifica una proteína de estabilización traduccional (STA) que ayuda a la acumulación del motivo proteico de ICK expresado en plantas, pero que puede no ser necesario en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK. El componente de 1 ± es un segmento de polinucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio (L O ENLAZADOR) para separar los motivos proteicos de ICK unos de otros y de la proteína de estabilización traduccional, y el subíndice "i" indica que los distintos tipos de péptidos enlazadores se pueden usar en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK. En el caso de que no se use sta en el ORF de expresión del motivo proteico de ICK, se puede unir ersp directamente al polinucleótido que codifica el motivo proteico de ICK sin un enlazador. El componente de ick es un segmento de polinucleótido que codifica un motivo proteico de ICK (ICK), y el subíndice "j" indica distintos motivos proteicos de ICK; " (enlazador - ick ) N" indica que la estructura del nucleótido que codifica un péptido enlazador intermedio y un motivo proteico de ICK se pueden repetir MN" veces en el mismo marco de lectura abierto en el mismo ORF de expresión del motivo proteico de ICK, donde N puede ser cualquier número entero de 1 a 10, y las repeticiones pueden contener segmentos de polinucleótido que codifican distintos enlazadores intermedios y distintos motivos proteicos de CRIP o ICK. Los distintos segmentos de polinucleótido que incluyen las repeticiones dentro del mismo ORF de expresión del motivo proteico de CRIP o ICK se encuentran dentro del mismo marco de traducción.

Los ejemplos de motivos proteicos de ICK insecticidas incluyen los péptidos y genes de ACTX e incluyen todos los péptidos y sus genes de codificación según se describen en las referencias proporcionadas anteriormente y en la presente. Los ejemplos de péptidos y motivos proteicos de ICK específicos descritos a los efectos de proporcionar ejemplos y sin intención de limitar la presente, son los péptidos y sus homologías como se describieron en la presente y, en particular, péptidos y nucleótidos que se originan de los venenos de arañas de Sídncy con tela en embudo. Los siguientes documentos se incorporan mediante esta referencia en los Estados Unidos en su totalidad, son conocidos por los expertos en la téenica, y se han publicado. Describen varios motivos proteicos de ICK cuya secuencia de péptidos completa y secuencia de nucleótidos completa se describen específicamente y se incorporan mediante esta referencia y además, las descripciones totales se incorporan mediante referencia incluyendo todos sus listados de secuencias. Ver las siguientes: US 7,354,993 B2, emitida el 8 de abril de 2008, específicamente, las secuencias de péptidos y nucleótidos enumeradas allí como secuencias 1 - 39, de 7,354,993 B2, y los denominados polipéptidos U-ACTX, y estas y otras toxinas que pueden formar 2 a 4 puentes de disulfuro intercatenarios, y variantes de estos, y los péptidos que figuran en las columnas 4 a 9 y en la Figura 2 de 7,354,993 B2 . Se pueden encontrar otras secuencias específicas en la patente EP 1812 464 Bl, publicada y otorgada 08.10.2008, ver boletín 2008/41, específicamente las secuencias de péptidos y nucleótidos enumeradas en el listado de secuencias, y las otras toxinas que pueden formar 2 a 4 puentes de disulfuro intercatenarios, y las secuencias enumeradas allí como 1-39 y las secuencias denominadas polipéptidos U-ACTX, y variantes de estas, y los péptidos que figuran en los párrafos 0023 a 0055, y figuran en la Figura 1 de la patente EP 1812 464 Bl.

Se describen e incorporan mediante referencia a los péptidos identificados en la presente variantes homologas de las secuencias mencionadas, con homología a las secuencias o i mencionadas en la presente, que también se identifican y reivindican como adecuadas para volver especiales de acuerdo con los procesos que se describen en la presente, que incluyen todas las secuencias homologas con al menos cualquiera de los siguientes porcentajes de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en la presente o con cualquier secuencia incorporada mediante esta referencia: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor identidad o 100 % de identidad con todas y cualesquiera de las secuencias identificadas en las patentes mencionadas anteriormente y con cualquier otra secuencia identificada en la presente, que incluye cada una de las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud. Cuando el término homólogo u homología se utiliza en la presente con un número tal como 50 % o mayor, se refiere al porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre los dos péptidos. Cuando se usa homólogo u homología sin un porcentaje numérico, se refiere a dos secuencias de péptidos que están muy relacionadas en el aspecto evolutivo o del desarrollo en que comparten aspectos físicos y funcionales comunes, como toxicidad tópica y tamaño similar (es decir, el homólogo tiene una longitud de 100 % más o 50 % menos que la del péptido que se menciona específicamente en la presente o se identifica mediante referencia en la presente como antecede).

Se describen e incorporan mediante referencia a los péptidos identificados en la presente los péptidos tóxicos que incluyen los siguientes: péptidos y sus variantes que se encuentran, aíslan o derivan de arañas del género Atrax o Hadronyche, que incluyen las especies de género Hadronyche versuta, o la araña de Sídncy con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis , Atrax infensus , que incluye toxinas conocidas como polipéptidos U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb, o mutantes o variantes, especialmente los péptidos de cualquiera de estos tipos y especialmente los de menos de alrededor de 200 aminoácidos pero más de alrededor de 10 aminoácidos, y especialmente los péptidos de menos de alrededor de 150 aminoácidos pero más de alrededor de alrededor de 20 aminoácidos, especialmente los péptidos de menos de alrededor de 100 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 65 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 55 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de alrededor de 37 o 39 o alrededor de 36 a 42 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 55 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 45 aminoácidos pero más de alrededor de 35 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 115 aminoácidos pero más de alrededor de 75 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 105 aminoácidos pero más de alrededor de 85 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 100 aminoácidos pero más de alrededor de 90 aminoácidos, incluyendo toxinas de péptidos de cualquiera de las longitudes mencionadas en la presente que pueden formar 2, 3 y/o 4 o más puentes de disulfuro intercatenarios, incluyendo las toxinas que interrumpen las corrientes del canal de calcio, incluyendo las toxinas que interrumpen las corrientes del canal de potasio, especialmente las toxinas que interrumpen los canales de calcio de insectos o U de estas, especialmente toxinas o variantes de estas de cualquiera de estos tipos y cualquier combinación de cualquiera de los tipos de toxinas descritas en la presente que tienen actividad insecticida oral o tópica, se pueden volver especiales mediante los procesos descritos en la presente.

Los péptidos U de la araña de Sídncy con tela en embudo, género Atrax y Hadronyche son particularmente adecuados y funcionan bien cuando se tratan mediante los métodos, procedimientos o procesos descritos en la presente invención. Los ejemplos de los péptidos adecuados analizados y con datos se proporcionan en la presente. También se sabe específicamente que las siguientes especies transportan péptidos tóxicos adecuados para la expresión en plantas como PIP mediante el proceso de la presente invención. Se mencionan específicamente las siguientes especies: Atrax formidabillis, Atrax infensus, Atrax robustus, Hadronyche infensa, Hadronyche versuta. Cualquier péptido tóxico derivado de cualquiera de los géneros enumerados anteriormente y/o especies de géneros y homólogos del péptido U son adecuados para la expresión en plantas como PIP, de acuerdo con el proceso en la presente invención.

Los Ejemplos en esta descripción no pretenden ni se deberían utilizar para limitar la invención, estos se proporcionan solamente para ilustrar la invención.

Como se indicó anteriormente, muchos péptidos son candidatos adecuados como objeto del proceso para la expresión en plantas como PIP. Las secuencias que se indican previamente, a continuación y en el listado de secuencias son péptidos especialmente adecuados que se pueden expresar en plantas como PIP y algunos de estos se expresaron en plantas como PIP de acuerdo con la presente invención, con los resultados que se muestran en los ejemplos a continuación.

GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO.5) Tiene el nombre "U+2-ACTX-Hvla" y cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 5-20, 12-25, 19-39. El peso molecular es de 4564,85 Daltons. Otro ejemplo de una proteína insecticida del motivo de ICK: QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA (SEQ ID NO: 6) Tiene el nombre "U-ACTX-Hvla" y cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 3-18, 10-23, 17-37. El peso molecular es de 4426,84 Daltons.

Los ejemplos adicionales incluyen muchas secuencias en el listado de secuencias.

III. El componente de proteínas de estabilización traduccional, STA o ata Uno de los ORF de expresión del motivo proteico de ICK, ERSP-ICK, es suficiente para expresar un péptido del motivo de ICK con plegamiento adecuado en la planta transformada, pero para la protección eficaz de una planta del daño de plagas, el motivo proteico de ICK expresado en la planta se debe acumular hasta el nivel insecticida. Con la transformación de un ORF de expresión del motivo proteico de ICK con plegamiento adecuado, se puede expresar una planta transgénica y puede acumular cantidades mayores del motivo proteico de ICK con plegamiento correcto. Cuando una planta acumula cantidades mayores de péptidos tóxicos con plegamiento adecuado, puede resistir o matar más fácilmente los insectos que atacan y comen las plantas. Se puede usar la proteína de estabilización traduccional para aumentar considerablemente la acumulación del péptido tóxico en la planta y, por lo tanto, la potencia del PIP, especialmente cuando el PIP tiene una proteína de estabilización traduccional propia. Ver varias representaciones del modo de utilización de STA en ORF de expresión en las Figuras 2-5 y en varios diagramas lineales o expresiones tipo ecuación utilizados a continuación. La proteína de estabilización traduccional puede ser un dominio de otra proteína o puede comprender una secuencia de proteína total. La proteína de estabilización traduccional es una proteína con estructura terciaria suficiente que se puede acumular en una célula sin ser la diana del proceso celular de degradación de proteína. La proteína puede ser de entre 5 y 50aa (p. ej., otro motivo proteico de ICK), 50 a 250aa (GNA), 250 a 750aa (p. ej., quitinasa) y 750 a 1500aa (p. ej., enhancin).

Además de las Figuras 2-5, el diagrama lineal que figura a continuación describe uno de los ejemplos del ORF de expresión del motivo proteico de ICK que codifica una proteína de estabilización fusionada al motivo proteico de ICK: ersp-sta-l-ick La proteína, o dominio de proteína puede contener proteínas que no tienen características útiles sin ser la estabilización traduccional, o pueden presentar otros rasgos útiles distintos, además de la estabilización traduccional. Los rasgos útiles pueden incluir: actividad insecticida adicional, tal como actividad que es destructiva para la membrana peritrófica, actividad que es destructiva para la pared intestinal y/o actividad que transporta de forma activa el motivo proteico de ICK en la pared intestinal. Una modalidad de la proteína de estabilización traduccional puede ser un polímero de proteínas de fusión que implica motivos proteicos de ICK. Se proporciona en la presente un ejemplo específico de una proteína de estabilización traduccional para ilustrar el uso de una proteína de estabilización traduccional. El ejemplo no pretende limitar la descripción o las reivindicaciones de modo alguno. Las proteínas de estabilización traduccional útiles son conocidas en la téenica y se podría utilizar cualquier proteína de este tipo, como se describe en la presente. Los procedimientos para evaluar y analizar la producción de péptidos son conocidos en la téenica y se describen en la presente. Un ejemplo de una proteína de estabilización traduccional es SEQ ID NO:7, código de una letra, como figura a continuación: ASKGE ELFTG W PIL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT GKLPV PWPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK (SEQ ID NO: 7). Denominada "GFP". El peso molecular es de 26736,02 Daltons.

En algunas modalidades, la STA puede ser incluso CRIP o ICK, como se muestra en la Figura 5. En estas modalidades, no hay proteína STA separada, la proteína STA es la misma que CRIP o ICK utilizado. Podría ser el ICK idéntico que está unido al ENLAZADOR, o podría haber distintos ICK, un tipo unido al ENLAZADOR y el otro tipo que actúa como STA. Estas disposiciones alternativas también se describen en la sección ENLAZADORES .

Se pueden encontrar ejemplos adicionales de proteínas de estabilización traduccional en las siguientes referencias, que se incorporan en su totalidad mediante esta referencia: Kramer, K.J. et ál. "Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta" Insect Biochemistry and Molecular Biology, tomo 23, publicación del 6 septiembre 1993, pp.691-701. Kramer, K.J. et ál. aislaron y secuenciaron un ADNc que codifica quitinasa del gusano del tabaco, Manduca sexta . Hashimoto, Y. et ál. "Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus" Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651. Hashimoto, Y. et ál. clonaron el gen que codifica el factor potenciador viral de una Trichoplusia en el virus de granulosis y determinaron la secuencia de nucleótidos completa. Van Damme, E.J.M. et ál. "Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop (Galanthus nivalis L.) lectin" European Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991). Van Damme, E.J.M. et ál. aislaron ARN rico en Poli (A) de ovarios maduros de lectina de campanilla de invierno (GNA), que proporciona un único polipéptido de lectina de 17-kDa luego de la traducción en un sistema sin células de germen de trigo, denominado aglutina. Estas y otras referencias ilustran y describen proteínas de estabilización traduccional que se pueden utilizar en los métodos, procedimientos y complejos y construcciones de péptido, proteína y nucleótido descritos en la presente.

IV. El componente de p'ptido enlazador intermedio.

ENLAZADOR, enlazador, L o si es polinucleótido: enlazador o 1 de los PEP El ORF de expresión del motivo proteico de ICK descrito en la presente invención también incorpora secuencias de polinucleótido que codifican péptidos enlazadores intermedios entre las secuencias de polinucleótidos que codifican el motivo proteico de ICK ( ick ) y la proteína de estabilización traduccional (sta) o entre secuencias de polinucleótidos que codifican múltiples dominios de motivos proteicos de ICK ((1-ick) N o (ick-DN) si el ORF de expresión implica la expresión de múltiples dominios del motivo proteico de ICK. Los péptidos enlazadores intermedios (ENLAZADORES) separan las distintas partes del complejo del motivo proteico de ICK expresado y ayudan al plegamiento adecuado de las distintas partes del complejo durante el proceso de expresión. En el complejo del motivo proteico de ICK expresado, puede haber distintos péptidos enlazadores intermedios implicados para separar distintos dominios funcionales. Se muestran varias representaciones de proteínas con ENLAZADORES en las Figuras 3-5. El ENLAZADOR se une a un CRIP, tal como un ICK, y este grupo bivalente se puede repetir hasta 10 (N=l-10) e incluso posiblemente más de 10 veces para facilitar la acumulación de péptido insecticida con plegamiento adecuado en la planta que se debe proteger.

El péptido enlazador intermedio comúnmente tiene entre 1 y 30 aminoácidos de longitud. No se requiere un componente esencial en el complejo del motivo proteico de ICK expresado en las plantas. Se puede diseñar un péptido enlazador escindible para que el ORF de expresión del motivo proteico de ICK libere el motivo proteico de ICK con plegamiento adecuado del complejo del motivo proteico de ICK expresado en la planta transformada para aumentar la protección del motivo proteico de ICK de la planta del daño de plagas. Un tipo de péptido enlazador intermedio es el péptido enlazador escindible de la planta. Este tipo de péptidos enlazadores se puede retirar por completo del complejo de expresión del motivo proteico de ICK expresado durante el proceso de expresión postraduccional en las células vegetales. Por lo tanto, el motivo proteico de ICK con plegamiento adecuado unido por este tipo de péptidos enlazadores intermedios se puede liberar en las células vegetales del complejo del motivo proteico de ICK expresado durante el proceso de expresión postraduccional. En la presente se muestran varios ejemplos de ENLAZADORES.

No se escinde otro tipo de péptido enlazador intermedio escindible durante el proceso de expresión en plantas. Sin embargo, tiene un sitio de escisión de proteasa específico para proteasas o metaloproteinasas de serina, treonina, cisteína, aspartato. Se puede digerir el tipo de péptido enlazador escindible mediante las proteasas que se encuentran en el ambiente del intestino del insecto y/o lepidóptero y/o en el ambiente de hemolinfa del insecto o hemolinfa del lepidóptero para liberar el motivo proteico de ICK en el intestino o hemolinfa del insecto. En la presente se muestran varios ejemplos de ENLAZADORES. Estos enlazadores se presentan como ejemplos únicamente y no deberían considerarse como limitaciones de la invención. Utilizando la información ilustrada por la presente descripción, debería ser cuestión de rutina para el experto en la téenica elaborar o encontrar otros ejemplos de ENLAZADORES que serán útiles en la presente invención.

Se ilustra un ejemplo de un tipo escindible de enlazador intermedio que ilustra la invención en la SEQ ID NO: 1, pero los enlazadores escindibles no están limitados a este ejemplo. La SEQ ID NO: 1 (código de una letra) es IGER y en la presente se denomina "IGER". El peso molecular de este enlazador o ENLAZADOR intermedio es de 473,53 Daltons.

Un péptido enlazador intermedio (ENLAZADOR) también puede ser uno sin ningún tipo del sitio de escisión de proteasa, es decir, un péptido enlazador intermedio no escindible. Un ejemplo de esto es el enlazador ETMFKHGL (SEQ ID NO.3).

Se pueden encontrar otros ejemplos de péptidos enlazadores intermedios en las siguientes referencias, que se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia: Se descubrió que un precursor inhibidor de proteinasa serina expresado en planta contenía cinco inhibidores de proteína homólogos separados por seis péptidos enlazadores iguales en Heath et ál. "Characterization of t he protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata" European Journal of Biochemistry, 1995; 230: 250-257. Se analiza una comparación del comportamiento de plegamiento de proteínas fluorescentes verdes mediante seis enlazadores distintos en Chang, H.C. et ál. "De novo folding of GFP fusión proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria" Journal of Molecular Biology, 21 oct 2005; 353(2): 397-409. Se demostró que una isoforma de la familia GalNAc-Ts humana, GalNAc-T2, conserva su localización y funcionalidad luego de la expresión en plantas de N. benthamiana, en Daskalova, S.M. et ál. "Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins" BMC Biotechnology, 24 ago 2010; 10: 62. Se demostró la capacidad de las proteínas de plástidos endógenos de trasladarse a través de los estrómulos en Kwok, E.Y. et ál. "GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids" Journal of Experimental Botany, mar 2004; 55(397): 595-604. Pub ele.30 ene 2004. Se realizó un informe sobre la modificación genética de la superficie del virión del virus del mosaico del tabaco (TMV), con una hormona decapéptido del mosquito, factor oostático modulador de tripsina (TMOF) por Borovsky, D. et ál. "Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide" Proc Nati Acad Sci, 12 diciembre 2006; 103(50): 18963-18968. Estas y otras referencias ilustran y describen los enlazadores intermedios que se pueden utilizar en los métodos, procedimientos y complejos y construcciones de péptido, proteína y nucleótido descritos en la presente.

El ORF de expresión del motivo proteico de ICK descrito anteriormente se puede clonar en cualquier vector de expresión en plantas para la expresión del motivo proteico de ICK en plantas transitoria o establemente.

Sistemas de expresión transitoria en plantas Los sistemas de expresión transitoria en plantas se pueden usar para optimizar adecuadamente la estructura del ORF de expresión del motivo proteico de ICK para la expresión del motivo proteico de ICK específica en las plantas, que incluye la necesidad de algunos componentes, optimización de codones de algunos componentes, optimización del orden de cada uno de los componentes, etc. A menudo se deriva un vector de expresión transitoria en plantas de un genoma de virus de la planta. Los vectores de virus vegetales proporcionan ventajas en niveles rápidos y altos de expresión génica foránea en plantas debido a la naturaleza de la infección de los virus vegetales. La longitud completa del genoma viral de la planta se puede usar como vector pero a menudo se elimina un componente viral, por ejemplo, la proteína de recubrimiento y los ORF transgénicos se subclonan en el lugar. El ORF de expresión del motivo proteico de ICK se puede subclonar en el sitio para crear un vector viral. Estos vectores virales se pueden introducir en la planta por medios mecánicos, dado que son en sí mismo infecciosos, por ejemplo, mediante lesión en la planta, aspersión, etc. También se pueden transformar en plantas mediante agroinfección clonando el vector viral en el ADN-T de la bacteria de agalla de corona, Agrobacterium turne faciens, o la bacteria de raíces pilosas, Agrobacterium rhizogenes. Se controla la expresión del motivo proteico de ICK en este vector mediante la replicación del virus de ARN, y se controla la traducción del virus al ARNm para la replicación mediante un promotor viral potente, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. Los vectores virales con ORF de expresión del motivo proteico de ICK comúnmente se clonan en la región de ADN-T en un vector binario que se puede replicar tanto en cepas de E. coli como en cepas de Agrobacterium. La transformación transitoria de una planta se puede realizar mediante infiltración de las hojas de planta con célula de Agrobacterium que contienen el vector viral para lograr la expresión del motivo proteico de ICK. En la planta transformada transitoriamente es común que la expresión de la proteína foránea cese en un período de tiempo corto debido al silenciamiento génico postranscripcional (PTGS). A veces es necesario un gen de proteína supresora de PTGS para que se transforme conjuntamente en la planta de forma transitoria con el mismo tipo de vector viral que impulsa la expresión con el ORF de expresión del motivo proteico de ICK. Esto mejora y extiende la expresión del motivo proteico de ICK en la planta. La proteína supresora de PTGS que se utiliza con mayor frecuencia es la proteína P19 que se descubrió a partir del virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV).

Se puede encontrar una demostración de la expresión transitoria en la planta, en la Figura 7.

La Figura 7 muestra la proteína transgénica de la planta expresada transitoriamente. En la Figura 7 se indica la acumulación relativa de las proteínas de ICK en comparación con el % de TSP, según se detecta mediante ELISA. Hay cuatro variaciones de ORF de expresión de ICK en la Figura 7 que ilustran la necesidad de ERSP de obtener el plegamiento adecuado del ICK y la STA para obtener la acumulación de la proteína. La barra A indica un sistema de expresión de FECT que expresa la SEQ ID NO: 8, el péptido de omega (ICK) sin fusiones. La barra B indica un sistema de expresión de TRBO que expresa la SEQ ID NO: 9, una ERSP BAAS fusionada con el péptido de omega (ICK). La barra C indica un sistema de expresión de FECT que expresa la SEQ ID NO: 10, una GFP (STA) fusionada con IGER (Enlazador) fusionado con la toxina híbrida (ICK). La barra D indica un sistema de expresión de FECT que expresa la SEQ ID NO:11, una BAAS (ERSP) fusionada con GFP (STA) fusionada con IGER (Enlazador) fusionado con la toxina híbrida (ICK). Los niveles de detección para las barras A y B muestran detección insignificante de la proteína. En la Barra A, esto se debe probablemente a la falta de plegamiento adecuado del ICK que ocurre en el ER y en la Barra B esto se debe probablemente a la falta de acumulación debido a la falta de STA. Hay niveles detectables en las Barras C y D. Cuando se realizó el experimento para la Barra C [(SEQ ID NO: 10) una GFP (STA) fusionada con IGER (Enlazador) fusionado con la toxina híbrida (ICK)], se registró un nivel alto de fluorescencia de GFP detectada (no se muestran los datos) lo que indica que gran parte de TSP era la proteína de fusión, sin embargo, cuando se realizó ELISA solamente se detectó el 0,01 % del TSP, y esto probablemente se debe a la falta de plegamiento adecuado que no ocurrió, ya que esta proteína no se dirigía al ER cuando ocurre el plegamiento. Los anticuerpos utilizados en ELISA solamente detectaron la estructura terciaria de una proteína con plegamiento adecuado. Cuando se realizó el experimento para la Barra D [SEQ ID NO:11, una BAAS (ERSP) fusionada con GFP (STA) fusionada con IGER (Enlazador) fusionado con la toxina híbrida (ICK)], se detectó algo de fluorescencia de GFP y una acumulación de 0,1 % del TSP el péptido de ICK fusionado con GFP. Cuando se toman en conjunto los datos de las Barras A, B, C y D, es evidente que se requiere una ERSP en el ORF de expresión de ICK para obtener el plegamiento adecuado y que se requiere una STA para aumentar la acumulación del péptido.

Se ha demostrado y documentado la emisión de GFP de la fluorescencia verde de construcciones de proteína de fusión híbrida de GFP en hojas de tabaco transformadas de forma transitoria usando distintos vectores de FECT diseñados para la expresión dirigida. Se ha logrado utilizar el vector pFECT-BG1H para la acumulación de APO (sitio de apoplastos), el vector pFECT-G1H para la acumulación de CYTO (sitio de citoplasma) y el vector pFECT-BGIH-ER para la acumulación de ER (sitio del retículo endoplasmático). No se muestran los datos .

Se ha demostrado y documentado la emisión de GFP de la fluorescencia verde de construcciones de proteína de fusión híbrida de GFP en hojas de tabaco transformadas de forma transitoria usando distintos tipos de ERSP. Se ha logrado demostrar la expresión con el vector pFECT-BGIH, expresión con el vector pFECT-EGIH y expresión con el vector pFECT- E*GIH. No se muestran los datos.

Se han medido los niveles de acumulación del péptido y esto se muestra en las Figuras 8 y 9. La figura 8 es una gráfica del % de TSP de U-ACTX-Hvla fusionado con GFP expresado transitoriamente en tabaco con distinto sitio de acumulación, que se detecta mediante iELISA. APO: sitio de apoplasto; CYTO: sitio de citoplasma; ER: sitio del retículo endoplasmático. La figura 9 es una gráfica de % de TSP de hojas de tabaco que expresan transitoriamente U-ACTX-Hvla fusionado a GFP que se detecta mediante iELISA usando los vectores de expresión de FECT que codifican las fusiones traduccionales con tres secuencias de ERSP distintas: péptido señal de BAAS (BG1H), péptido señal de extensina (EG1H) y péptido señal de extensina modificada (E*GIH).

Integración de ORF de expresión de proteina en el genoma de la planta usando teenología de transformación estable en la planta El ORF de expresión del motivo proteico de ICK también se puede integrar en el genoma de la planta usando tecnología de transformación estable en la planta y, por lo tanto, se pueden expresar establemente los motivos proteicos de ICK en las plantas y se pueden proteger las plantas transformadas de generación en generación. Para la transformación estable de las plantas, el vector de expresión del motivo proteico de ICK puede ser circular o lineal. Se deben incluir unos pocos componentes fundamentales en el ADN del vector. El ORF de expresión del motivo proteico de ICK para la transformación estable de la planta se debería diseñar cuidadosamente para obtener la expresión óptima en las plantas, en función del estudio de expresión transitoria en plantas, como se describe anteriormente. Comúnmente se controla la expresión del motivo proteico de ICK mediante un promotor que fomenta la transcripción en algunas de las células de la planta transgénica. El promotor puede ser un promotor viral potente en la planta, por ejemplo, el promotor 35S constitutivo del virus del mosaico de la coliflor (CaMVj, también puede ser un promotor potente en la planta, por ejemplo, el promotor de liasa de hidroperóxido (pHPL) de Arabidopsis thaliana, el promotor de poliubiquitina de Glycine max (Gmubi) de soja, los promotores de ubiquitina de distintas especies vegetales (arroz, maíz, patata, etc.), etc. A menudo ocurre un terminador transcripcional de la planta luego del codón de terminación del ORF para interrumpir la polimerasa de ARN y transcripción del ARNm. Para evaluar la expresión del motivo proteico de ICK, se puede incluir un gen informante en el vector de expresión del motivo proteico de ICK, por ejemplo, el gen beta-glucuronidasa (GUS) para el ensayo de tinción con GUS, gen de proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) para la detección de la fluorescencia verde en luz UV, etc. Para la selección de las plantas transformadas, comúnmente se incluye un gen marcador de selección en el vector de expresión del motivo proteico de ICK. El producto de expresión del gen marcador puede proporcionar la planta transformada con resistencia a antibióticos específicos, por ejemplo, kanamicina, higromicina, etc., o herbicida específico, por ejemplo, glifosato, etc. Si se adopta teenología de agroinfección para la transformación de la planta, también se incluyen secuencias de borde izquierdo y borde derecho de ADN-T en el vector de expresión del motivo proteico de ICK para transportar la parte de ADN-T en la planta. Se puede transformar el vector de expresión del motivo proteico de ICK construido en células o tejidos vegetales usando muchas tecnologías de transformación. La agroinfección es una forma muy popular de transformar una planta usando una cepa de Agrobacterium tumefaciens o una cepa de Agrobacterium rhizogenes. También se utiliza comúnmente la tecnología de bombardeo de partículas (también denominada biolística) para la transformación de la planta. Otros métodos de transformación utilizados con menor frecuencia incluyen electroporación de tejido, agitación de carburo de silicio, inyección directa de ADN, etc. Luego de la transformación, las células o tejidos vegetales transformados que se colocan en el medio de regeneración de plantas para la regeneración transformaron satisfactoriamente las células o tejidos vegetales en las plantas transgénicas. Se puede realizar la evaluación de la integración y expresión del ORF de expresión del motivo proteico de ICK en la planta transformada, de la siguiente manera.

Evaluación de una planta transformada La evaluación de una planta transformada se puede realizar a nivel del ADN, nivel del ARN y nivel de proteína. Una planta transformada de forma estable se puede evaluar en todos estos niveles y una planta transformada de forma transitoria normalmente solo se evalúa a nivel de las proteínas. Para asegurarse de que el ORF de expresión del motivo proteico de expresión de ICK se integre en el geno a de una planta transformada de forma estable, se puede extraer el ADN genómico de los tejidos de la planta con transformación estable para la evaluación mediante PCR o la aplicación de transferencia Southern. La expresión del motivo proteico del ICK en la planta con transformación estable se puede evaluar a nivel del ARN, es decir, el ARNm total se puede extraer de los tejidos de plantas transformadas y se puede aplicar la téenica de transferencia northern y la tecnología de RT-PCR para evaluar el nivel de ARNm del motivo proteico de ICK de forma cualitativa o cuantitativa. La expresión del motivo proteico de ICK en la planta transformada también se puede evaluar directamente a nivel de las proteínas. Hay muchas formas de evaluar el motivo proteico de ICK expresado en una planta transformada. Si se transforma un gen indicador en la planta junto con el ORF de expresión del motivo proteico del ICK, se puede realizar el ensayo del gen indicador para evaluar inicialmente la expresión del ORF de expresión del motivo proteico de ICK transformado, por ejemplo, ensayo de tinción con GUS para determinar la expresión del gen informante GUS, ensayo de detección de fluorescencia verde para determinar la expresión del gen informante GFP, ensayo de luciferasa para determinar la expresión del gen informante de luciferasa, etc. Adicionalmente, se puede extraer la proteína total expresada de los tejidos de la planta transformada para evaluación directa de la expresión del motivo proteico de ICK en las plantas transformadas. La muestra de proteína expresada total extraída se puede utilizar en el ensayo Bradford para evaluar el nivel proteico total en la muestra. Se puede adoptar la teenología de cromatografía HPLC analítica, la técnica de Western blot o el ensayo iELISA para evaluar de forma cualitativa o cuantitativa el motivo proteico de ICK en la muestra de proteína total extraída de los tejidos de la planta transformada. También se puede evaluar la expresión del motivo proteico de ICK usando la muestra de proteína total extraída de los tejidos de la planta transformada en un bioensayo en insecto. Finalmente, el tejido de la planta transformada o toda la planta transformada se pueden analizar en los bioensayos en insectos para evaluar la expresión del motivo proteico de ICK y su protección para la planta.

Se proporciona una descripción detallada y resu men de la Parte I de la siguiente forma: Se describe una proteína compuesta por un péptido señal de retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a una proteína insecticida rica en cisteína (CRIP), tal como un motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína (ICK), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína (ERSP-ICK). El ERSP es cualquier péptido señal que dirige la CRIP expresada al retículo endoplasmático de las células vegetales. La CRIP puede ser una proteína del nudo inhibidor de cisteína (ICK) o una proteína que no sea del ICK. El ERSP es un péptido de entre 5 y 50 aminoácidos de longitud que se origina de una planta y unido operativamente a una proteína de estabilización traduccional (STA), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y puede haber una secuencia de STA intermedia en el lado del N-terminal de la CRIP, que es opcionalmente un motivo proteico del ICK (ERSP-STA-ICK) o motivo proteico que no es de ICK (ERSP-STA que no es de ICK) o en el lado del C-terminal del motivo proteico de ICK o que no es de ICK (ERSP-ICK-STA) o (ERSP -STA que no es de ICK). El ERSP es un péptido de entre 3 y 60 aminoácidos de longitud o un péptido de entre 5 y 50 aminoácidos de longitud o un péptido de entre 20 y 30 aminoácidos de longitud. Se puede originar en una planta, péptido señal de alfa-amilasa de cebada (BAAS) con una SEQ ID NO: 4. El ERSP puede ser un péptido que es péptido señal de extensina de tabaco con una SEQ ID NO: 18. El ERSP puede ser un péptido señal de extensina de tabaco modificado con una SEQ ID NO: 19. o un péptido señal de Jun a 3 de Juniperus ashei con una SEQ ID NO: 27.

Se describe un ejemplo de CRIP que es un motivo proteico de ICK de entre 16 y 60 aminoácidos de longitud, entre 26 y 48 aminoácidos de longitud, entre 30 y 44 aminoácidos de longitud, donde este se selecciona de cualquiera de los péptidos o las fuentes de péptidos con motivo del nudo inhibidor de cisteína o un péptido insecticida y donde es cualquiera de los péptidos o las fuentes de péptidos que incluyen Atrax o Hadronyche, cualquiera de los péptidos que se originan de Hadronyche versuta, un péptido de ACTX. El motivo proteico de ICK es cualquier péptido insecticida y fragmentos de este que incluye versiones maduras, pre- y pro-peptídicas de los péptidos y números de secuencia, así como cualquier mutación, eliminación o adición de segmentos péptidos, pero manteniendo la estructura del nudo inhibidor de cisteína. El motivo proteico de ICK puede ser U-ACTX-Hvla con la SEQ ID NO: 6, Omega-ACTX-Hvla con la SEQ ID NO:24, Kappa-ACTX-Hvlc. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que codifican los péptidos. Un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que codifican los péptidos integrados en un genoma de planta transgénica. El uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en la presente para realizar o transformar una planta o genoma vegetal para expresar péptidos insecticidas con plegamiento adecuado en una planta transformada y/o para realizar o transformar una planta o genoma vegetal para expresar péptidos insecticidas con plegamiento adecuado en la planta transformada y para provocar la acumulación de los péptidos insecticidas expresados y con plegamiento adecuado en la planta y para provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto. Se describen procedimientos para utilizar nucleótidos para crear plantas transgénicas y plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos descritos en la presente. Se describe una planta transformada realizada mediante cualquiera de estos productos y procesos.

Se describe una proteína compuesta por un péptido señal de retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a una CRIP que es opcionalmente un motivo proteico del nudo inhibidor de cisterna (ICK) o proteína que no es de ICK unida de forma operativa a una proteína de estabilización traduccional (STA), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y puede haber una secuencia de proteína de estabilización traduccional en el lado del N-terminal del motivo proteico de ICK (ERSP-STA-ICK) u opcionalmente una (ERSP-STA que no es de ICK) o el lado del C-terminal del motivo proteico de ICK (ERSP-ICK-STA) o (ERSP-STA- que no es de ICK).

Se describe la STA con un peso molecular de 12 kD y superior, donde la STA puede ser muchas proteínas, incluyendo el motivo proteico de ICK con un peso molecular de 12 kD y superior, o múltiples motivos proteicos de ICK conectados con péptidos enlazadores (L) con un peso molecular de 12 kD y superior, por ejemplo, ERSP-ICK-(Li-ICKj)N o ERSP-(ICKj-Li)N-ICK. Se explica que los péptidos enlazadores pueden ser iguales o diferentes. Se expresa que una STA es una proteína de fluorescencia verde (GFP) que se origina de aguamala con la SEQ ID NO: 13 y la STA puede ser una lectina de campanilla de invierno, aglutinina Galanthus nivalis (GNA), con la SEQ ID NO 28 y esa STA puede ser una proteína de Juniperus ashei, Jun a 3, con la SEQ ID NO 26.

Se describe un ENLAZADOR que es cualquier péptido con 4 - 20 aminoácidos de longitud. Se describe un ENLAZADOR que es cualquier péptido con un sitio de reconocimiento de proteasa. Se describe un ENLAZADOR como cualquier péptido con un sitio de escisión de proteasa vegetal. Se describe un ENLAZADOR que es un péptido con una secuencia de aminoácidos de IGER (SEQ ID NO:1), EEKKN (SEQ ID NO:2) y (SEQ ID NO: 3). Se describe un ENLAZADOR como cualquier péptido que se puede escindir en el sistema digestivo del insecto o en la hemolinfa del insecto. Se describe un ENLAZADOR donde el ENLAZADOR es un péptido con un sitio de escisión de tripsina.

Se describe un nucleótido que codifica cualquiera de las proteínas descritas, incluyendo los ORF de expresión que comprenden cualquiera de los nucleótidos que codifican los péptidos, así como los ORF de expresión que comprenden cualquiera de los nucleótidos que codifican los péptidos, integrados en un genoma de planta transgénica, así como transformados en una planta o genoma vegetal para expresar péptidos insecticidas con plegamiento adecuado en una planta transformada, así como transformados en una planta o genoma vegetal para expresar péptidos insecticidas con plegamiento adecuado en la planta transformada y provocar la acumulación de los péptidos insecticidas expresados y con plegamiento adecuado en la planta y provocar un aumento de la resistencia de la planta al daño del insecto. Se describen plantas transgénicas que resultan de estas descripciones y plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos descritos en la presente.

Se explica y describe un ORF de expresión que comprende cualquiera de los nucleótidos que codifican los péptidos de la presente, así como un ORF de expresión integrado en un genoma de planta transgénica y un motivo por el cual se hace esto es para realizar o transformar una planta o genoma vegetal para expresar péptidos insecticidas con plegamiento adecuado en una planta transformada y un motivo por el cual se hace esto es para que la planta transformada provoque la acumulación de los péptidos insecticidas con plegamiento adecuado y expresados en la planta y para provocar un aumento en la resistencia de la planta al daño del insecto. Se muestra cómo realizar plantas transgénicas utilizando estos procedimientos y expresando los péptidos en la presente y cualquier otro péptido que utilizaría el experto en la téenica en función de las enseñanzas de la presente y utilizando cualquiera de los productos y procesos que se describen en la presente.

Se enseña cómo hacer una proteína compuesta por un péptido señal de retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína (ICK) unido operativamente a la proteína de estabilización traduccional (STA), unida operativamente a un péptido enlazador intermedio (L), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y el ENLAZADOR se encuentra entre la STA y el motivo proteico de ICK y la proteína de estabilización traduccional puede encontrarse ya sea en el lado del N-terminal (dirección 5') del motivo proteico de ICK o el lado del C-terminal (dirección 3') del motivo proteico de ICK y descrita como ERSP-STA-L-ICK o ERSP-ICK-L-STA. Se explica también que el ERSP, la CRIP y el ICK, ENLAZADOR y la STA antelos pueden ser cualquiera de los péptidos tal como se describen en la presente y cualquier otro péptido que utilizaría el experto en la téenica en función de las enseñanzas de la presente y utilizando cualquiera de los productos y procesos que se describen en la presente.

Se enseña cómo realizar una proteína compuesta por un péptido señal de retículo endoplásmico (ERSP) unido operativamente a un dominio de múltiples motivos proteicos del nudo inhibidor de cisteína (ICK) donde los motivos proteicos de ICK se unen entre sí mediante péptidos enlazadores intermedios (L), unidos operativamente a una proteína de estabilización traduccional (STA) unida operativamente a un péptido enlazador intermedio (L), donde el ERSP es el N-terminal de la proteína y el ENLAZADOR se encuentra entre la STA y el dominio de múltiples motivos proteicos de ICK y la STA puede encontrarse en el lado del N-terminal (dirección 5') del dominio de múltiples motivos proteicos de ICK o el lado del C-terminal (dirección 3') del dominio de múltiples motivos proteicos de ICK y se describe como ERSP-STA-(Li-ICKj)N o ERSP-(ICKj-Li)N-STA.

Se enseña cómo realizar los nucleótidos que codifican estas proteínas, los ORF de expresión, a realizar e integrar a un genoma de planta transgénica los genes quiméricos, vectores recombinantes, células hospedadoras transgénicas, células de plantas transgénicas, plantas transgénicas que son maíz, soja, algodón, arroz, trigo, sorgo, pasto varilla, caña de azúcar, alfalfa, patatas, tomates, tabaco, cualquier vegetal de hoja verde o cualquier árbol frutáceo o cualquier planta y especie tal como se menciona en la presente y una semilla de una planta transgénica de acuerdo con estos procedimientos, donde la semilla comprende el gen quimérico.

Ejemplos Los Ejemplos en esta descripción no pretenden ni se deberían utilizar para limitar la invención, estos se proporcionan solamente para ilustrar la invención.

Ejemplo 1 Comparación de la expresión entre dos sistemas de expresión en plantas transitorias Se adoptaron las teenologías de transformación de plantas transitorias para optimizar rápidamente el ORF de expresión del motivo proteico de ICK para la expresión vegetal. En este caso se utilizó tecnología de agroinfección con un vector viral vegetal para la transformación transitoria de la planta debido a que es altamente eficaz, fácil y económico. En este caso se evaluaron dos sistemas de expresión de plantas transitorias virales para determinar la expresión del motivo proteico de ICK en plantas. Uno fue un sistema de sobreexpresión del virus del mosaico del tabaco (TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007, V145: 1232-1240.). El vector de ADN del TRBO tiene una región de ADN-T para la agroinfección que contiene un promotor CaMV 35S que impulsa la expresión del ARN del virus del mosaico del tabaco sin el gen que codifica la proteína de recubrimiento viral. El otro sistema de expresión de plantas transitorias virales fue el sistema de expresión FECT (Liu Z & Kearncy CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88). El vector de FECT también contiene una región de ADN-T para la agroinfección que contiene un promotor CaMV 35S que impulsa la expresión del ARN del virus del mosaico del pasto setaria sin los genes que codifican la proteína de recubrimiento viral y el triple bloque génico. Ambos sistemas de expresión utilizan el geno a del virus "desarmado", por lo tanto, se puede prevenir de forma eficaz la transmisión de planta viral a planta. Para expresar de forma eficaz el gen heterólogo introducido, el sistema de expresión FECT necesita adicionalmente expresar conjuntamente P19, una proteína supresora de silenciamiento de ARN del virus del enanismo arbustivo del tomate, para evitar el silenciamiento génico post-traduccional (PTGS) del ADN-T introducido. (El sistema de expresión TRBO no necesita expresar conjuntamente P19). Los dos sistemas de expresión de plantas transitorias se analizaron y compararon mediante expresión transitoria del motivo proteico del ICK en tabaco (Nicotiana benthamiana ) como se describe a continuación.

El ORF de expresión del motivo proteico de ICK se diseñó para codificar una serie de motivos estructurales con fusión traduccional que se puede describir de la siguiente forma: N'-ERSP-Sta-L-ICK-C'. En este caso, el motivo proteico del ICK para la expresión es U-ACTX-Hvla, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (N1 a C , código de una letra): QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO: 12) El motivo del ERSP que se utilizó en este caso es el péptido señal de alfa-amilasa de cebada (BAAS), que está compuesto por 24 aminoácidos como se muestra a continuación (N' a C , código de una letra): MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4) La proteína de estabilización (Sta) en este ORF de expresión fue la proteína fluorescente verde (GFP), que tiene la secuencia de aminoácidos que obra a continuación (N' a C', código de una letra): MASKGEELFTGW PILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLP VPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFE GDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSV QLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELY K (SEQ ID NO: 13) El péptido enlazador entre la GFP y el U-ACTX-Hvla contiene el sitio de escisión de tripsina y tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica a continuación (N' a C , código de una letra): IGER (SEQ ID NO: 1) De acuerdo con la fórmula del ORF de expresión del motivo de ICK, este ORF de expresión de ICK específico se puede describir como BAAS-GFP-IGER-híbrido o BG1H. El ORF de BG1H se sintetizó químicamente mediante adición del sitio de restricción Pac I en su extremo 5' y el sitio de restricción Avr II en su extremo 3'. A continuación se muestra la secuencia del BGIH sintético: TTAATTAAATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGG GTTATCTGCTTCACTTGCAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTC CCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGG GTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACT ACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGT TATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTAC AGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTT TGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGA AACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAG ACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATC CGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTA CCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTG ACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCT CTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACT CAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTT ATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 14) El ORF del BGIH se clonó en los sitios de restricción Pac I y Avr II del vector de expresión de FECT para crear un vector de expresión de BGIH para el sistema de expresión transitoria de la planta FECT (pFECT-BG1H). Para maximizar la expresión de BG1H en el sistema de expresión FECT, se generó un vector de FECT que expresa la proteína supresora de silenciamiento del ARN P19 (pFECT-P19) para la transformación conjunta. Para crear un vector de expresión de BGIH para el sistema de expresión transitoria de la planta TRBO, se realizó un procedimiento de PCR de rutina para agregar un sitio de restricción Not I al extremo 3' del ORF de BGIH descrito anteriormente. El nuevo ORF de BGIH luego se clonó en los sitios de restricción Pac I y Not I del vector de expresión de TRBO para crear un vector de expresión de BGIH para el sistema de expresión transitoria de la planta TRBO (pTRBO-BGIH).

Se utilizó una cepa de Agrobacterium tumefaciens, GV3101, para la expresión transitoria de BGIH en hojas de tabaco mediante los sistemas de expresión FECT y TRBO. Para realizar células GV3101 competentes se utilizó el siguiente procedimiento: se usó un cultivo de GV3101 durante toda la noche para inocular 200 mL de medio Luria-Bertani (LB). Luego se dejó que las células crecieran hasta la fase logarítmica con OD600 entre 0,5 y 0,8. Luego las células se pelotillaron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Las células luego se lavaron una vez con 10 mL de amortiguador TE previamente enfriado (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) y luego se volvieron a suspender en 20 mL de medio LB. La resuspensión de células GV3101 luego se separó en alícuotas en fracciones de 250 mL en microtubos de 1,5 mL. Luego las alícuotas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C en un congelador para la transformación posterior.

Los vectores pFECT-BG1H y pTRBO-BG1H luego se transformaron en las células GV3101 competentes utilizando un método de congelación-descongelación como se indica a continuación: las células GV3101 competentes almacenadas se descongelaron en hielo y luego se mezclaron con 1 - 5 mg de ADN puro (vector pFECT-BGIH o pTRBO-BGIH). Luego la mezcla de células-ADN se mantuvo en hielo durante 5 minutos, tras lo cual se transfirió a -80 °C durante 5 minutos y luego se incubó en un baño de agua a 37 °C durante 5 minutos. Las células tratadas con congelamiento-descongelamiento luego se diluyeron en 1 mL de medio LB y se agitaron en una mesa de agitación durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Luego se esparció una alícuota de 200 pL de la mezcla de células-ADN en placas de agar LB con los antibióticos adecuados (se utilizaron 10 mg/mL de rifampicina, 25 pg/mL de gentamicina y 50 pg/mL de kanamicina tanto para la transformación de pFECT-BGIH como la transformación de pTRBO-BGIH) y se incubó a 28 °C durante dos días. Las colonias de transformantes resultantes luego se tomaron y cultivaron en alícuotas de 6 mL de medio LB con los antibióticos adecuados para análisis de ADN transformado y la modalidad de soluciones madre de glicerol de las células GV3101 transformadas.

La transformación transitoria de hojas de tabaco se realizó utilizando inyección en las hojas con una jeringa de 3 mL sin aguja. Las células GV3101 transformadas se estriaron en una placa LB con los antibióticos adecuados (como se describió anteriormente) y se incubaron a 28 °C durante dos días. Se inoculó una colonia de células GV3101 transformadas con 5 mi de medio LB-MESA (medio LB complementado con 10 mM de MES, 20 mM de acetosiringona) y los mismos antibióticos descritos anteriormente y se dejó crecer durante la noche a 28 °C. Las células del cultivo nocturno se recolectaron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos y se volvieron a suspender en el medio de inducción (10 mM de MES, 10 mM de MgC12, 100 mM de acetosiringona) a una OD600 final de 1,0. Luego las células se incubaron en el medio de inducción durante 2 horas hasta durante toda la noche a temperatura ambiente, tras lo cual se encontraban listas para la transformación transitoria de las hojas de tabaco. Las células tratadas se infiltraron en el lado inferior de las hojas unidas de plantas de Nicotiana benthamiana mediante inyección, usando una jeringa de 3 mL sin aguja. Para la transformación transitoria de FECT, las células GV3101 transformadas con pFECT-BG1H y células GV3101 transformadas con pFECT-P19 se mezclaron en cantidades iguales para infiltrar hojas de tabaco mediante inyección con una jeringa de 3 mL. Para la transformación transitoria de TRBO, solamente se infiltraron células GV3101 transformadas con pTRBO-BG1H en hojas de tabaco. Se evaluó la expresión del motivo proteico de ICK en hojas de tabaco a los 6-8 días tras la infiltración.

El ORF de expresión de BG1H contiene una proteína de fusión de la GFP (STA) y U-ACTX-Hvla (ICK) con un péptido enlazador (ENLAZADOR) de IGER (SEQ ID NO: 1) entre ellos. Tal como se muestra en la Fig. 3, se detectó la fluorescencia verde de la parte de GFP expresada de los transgenes con luz U.V. en hojas de tabaco transformadas tanto con vectores de FECT como de TRBO. De manera interesante, la fluorescencia verde apareció distribuida de forma uniforme en las hojas de tabaco transformadas con el vector de FECT (con la excepción de los tejidos vasculares), mientras que la fluorescencia verde en las hojas de tabaco transformadas con el vector de TRBO pareció acumularse en los tejidos vasculares, lo cual se debe a que el TRBO retiene su proteína de movimiento viral y el FECT no.

Para evaluar de forma cuantitativa la expresión del motivo proteico de ICK, se extrajeron las proteínas expresadas en las hojas de tabaco transformadas mediante el siguiente procedimiento descrito en la presente. Se recolectaron discos de 100 mg de tejido de hoja transformada mediante punción de hojas con la abertura mayor de una punta de pipeta de 1000 pL. El tejido de hoja recolectado se colocó en un microtubo de 2 mL con bolas de molienda de acero inoxidable de 5/32'' de diámetro, se congeló a -80 °C durante 1 hora y luego se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alto rendimiento Troemner-Talboys. Se agregaron 750 mL de soluciones de extracción TSP-SE1 heladas (50 M de solución de fosfato sódico, cóctel de inhibidor de proteasa diluido 1:100, 1 mM de EDTA, 10 mM de DIECA, PVPP al 8 %, pH 7,0) en el tubo y se agitaron en un vórtex. Luego el microtubo se dejó inmóvil a temperatura ambiente durante 15 minutos, tras lo cual se centrifugó a 16.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Se tomaron 100 pL del sobrenadante resultante y se cargaron en una columna cargada con pre-Sephadex G-50 en placas de microtitulación de filtro Millipore MultiScreen de 0,45 pm con una placa de microtitulación Costar de recepción vacía en la parte inferior. Luego las placas de microtitulación se centrifugaron a 800 g durante 2 minutos a 4 °C. La solución de filtrado resultante, que en la presente se denomina extracto de proteína soluble total (extracto de TSP) de las hojas de tabaco, se encontraba lista para el análisis cuantitativo.

La concentración de proteína soluble total del extracto de TSP se calculó usando el ensayo de proteína con Coomassie Plus de Pierce. Se usaron estándares de proteína BSA con concentraciones conocidas para generar una curva estándar de cuantificación de proteína. Se mezclaron 2 mL de cada extracto de TSP en 200 pL del reactivo cromogénico (reactivo de CPPA) de los kits del ensayo de proteína con Coomassie Plus y se dejaron reaccionar durante 10 minutos. La reacción cromogénica luego se evaluó mediante lectura del OD595 usando un lector de placas SpectroMax-M2 con Soft ax Pro como software de control. Las concentraciones de proteínas solubles totales fueron 0,788 ± 0,20 mg/pL y 0,533 ± 0,03 pg/pL en el extracto de TSP de las hojas de expresión de FECT-BG1H y hojas de expresión de TRBO-BG1H, respectivamente. Estos resultados se utilizaron para el cálculo del porcentaje del U-ACTX-Hvla expresado en la TSP (% de TSP) en el ensayo iELISA.

Se realizó un ensayo ELISA indirecto (iELISA) como se indica a continuación para evaluar de forma cuantitativa el motivo proteico de ICK en las hojas de tabaco con transformación transitoria con los sistemas de expresión FECT y TRBO. Se diluyeron 5 pL del extracto de TSP de la hoja en una solución de 95 ml de CB2 (Immunochemistry Technologies) en el pocilio de una placa Immulon 2 HD de 96 pocilios, con diluciones en serie realizadas según la necesidad. Las proteínas de hoja se tomaron de las muestras de extracto y se dejaron recubrir las paredes del pocilio durante 3 horas en la oscuridad a temperatura ambiente, tras lo cual se retiró la solución de CB2 y cada pocilio se lavó dos veces con 200 pL de PBS (Gibco). Luego se agregaron 150 mL de solución de bloqueo (BSA de bloqueo en PBS con 5 % de leche seca descremada) en cada pocilio y se realizó incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego de retirar la solución de bloqueo y un lavado de los pocilios con PBS, se agregaron 100 pL de anticuerpo anti-U-ACTX-Hvla de conejo (anticuerpo principal) (dilución 1: 250 en solución de bloqueo) a cada pocilio y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego se retiró el anticuerpo principal y se lavó cada pocilio con PBS 4 veces. Luego se agregaron 100 pL de anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP (anticuerpo secundario, utilizado a una dilución de 1: 1000 en la solución de bloqueo) a cada pocilio y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego de retirar el anticuerpo secundario y lavar los pocilios con PBS, se agregaron 100 pL de solución de sustrato (una mezcla 1:1 de solución de sustrato de peroxidasa ABTS A y solución B, KPL) a cada pocilio y se dejó que la reacción cromogénica siguiera hasta que se volviera evidente la aparición de un color suficiente. Luego se agregaron 100 pL de solución de detención de peroxidasa a cada pocilio para detener la reacción. La absorbencia de cada mezcla de reacción en la placa se lcyó a 405 nm utilizando un lector de placa SpectroMax-M2, con SoftMax Pro como software de control. Se trataron concentraciones conocidas de muestras de U-ACTX-Hvla puro diluidas en serie de la misma forma que se describió anteriormente en el ensayo iELISA para generar una curva estándar de absorbencia de masa para el análisis de las cantidades. El U-ACTX-Hvla expresado se detectó mediante iELISA a 3,09 ± 1,83 ng/pL en los extractos de TSP de hoja del tabaco transformado de FECT-BG1H y 3,56 ± 0,74 ng/pL en el extracto de TSP de hoja del tabaco transformado de TRBO-BG1H. O el U-ACTX-Hvla expresado es 0,40 % de la proteína soluble total (% de TSP) para los transformantes de FECT-BGIH y 0,67 % de TSP en los transformantes de TRBO-BGIH.

En conclusión, se pueden utilizar tanto los sistemas de expresión de plantas transitorias FECT y TRBO para expresar el motivo proteico de ICK en plantas. El nivel de expresión del motivo proteico de ICK en ambos sistemas es muy similar. No obstante, la expresión en el sistema FECT se distribuye de forma uniforme en las hojas agroinfiltradas, mientras que la expresión en el sistema TRBO se acumula en el tejido vascular de las hojas agroinfiltradas.

Ejemplo 2 Expresión transitoria del motivo proteico de ICK en hojas de tabaco con acumulación en diferentes objetivos subcelulares El motivo proteico de ICK expresado en plantas se debe acumular hasta determinado nivel en la planta para proteger de forma eficaz a la planta del daño de los insectos. El nivel de acumulación del motivo proteico de ICK expresado en planta se puede ver afectado por su sitio final en las células vegetales. En este ejemplo, se investigaron los efectos de sitios subcelulares diferentes del motivo proteico de ICK expresado en la planta en el nivel de acumulación de la proteína en la planta (usando el sistema de expresión transitoria de la planta FECT). En este ejemplo se investigaron tres objetivos subcelulares, el apoplasto de la pared celular vegetal (APO), el retículo endoplasmático (ER) y el citoplasma (CYTO).

El ORF de expresión del motivo proteico de ICK dirigido al APO se diseñó para codificar una serie de motivos estructurales con fusión traduccional que se puede describir de la siguiente forma: N'-ERSP-Sta-L-ICK-C'. Nuevamente, el motivo proteico de ICK en este estudio fue U-ACTX-Hvla y se usó el ORF de expresión de BG1H en el ejemplo 1. En este caso se utilizó el mismo vector que en el ejemplo 1, pFECT-BG1H.

El ORF de expresión del motivo proteico de ICK dirigido al CYTO se diseñó para codificar una serie de motivos estructurales con fusión traduccional que se puede describir de la siguiente forma: N'-Sta-L-ICK-C'. En este estudio, se retiró la secuencia de ADN que codifica el péptido señal de a-amilasa de cebada del ORF de expresión de BGIH y se convirtió en el ORF de expresión de GIH, con la siguiente secuencia de marco de lectura abierto: ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAAT TAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTAC ATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCA ACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGA AACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATC TTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTT GTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACA AACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGG AATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACC TGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCT TGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAA AGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATG ATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCTTA A (SEQ ID NO: 15) El ORF de expresión del G1H se clonó en los sitios de restricción Pac I y Avr II del vector de expresión FECT para crear un vector de expresión de G1H para el sistema de expresión transitoria de la planta FECT (pFECT-GIH) para la expresión de U-ACTX-Hvla dirigida al CYTO.

El ORF de expresión del motivo proteico de ICK dirigido al ER se diseñó mediante la adición de una secuencia de ADN que codifica al péptido señal que se dirige al ER en el C-terminal ' del ORF de expresión de BGIH que se denominó ORF de expresión de BG1H-ER. El péptido señal que se dirige al ER que se utiliza en este caso tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (código de una letra para aminoácidos): KDEL (SEQ ID NO: 16) La secuencia de ADN del ORF de expresión de BG1H-ER es la siguiente: ATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCAC TTGCAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGA ATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCT ACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGC CAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATAT GAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATA TCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCC TTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACA CAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAAT GGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAG ACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTA CCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTT CTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTG AAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTATTAATACTCAACCATGTTGTGA TGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAGAGCT AAAGATGAGCTCTAA (SEQ ID NO: 17) El ORF de expresión de BGIH-ER se clonó en los sitios de restricción Pac I y Avr II del vector de expresión FECT para crear un vector de expresión de BGIH-ER para el sistema de expresión transitoria de la planta FECT (pFECT-BG1H-ER) para la expresión de U-ACTX-Hvla dirigida al ER.

Los tres vectores, pFECT-BG1H, pFECT-GIH y pFECT-BGIH-ER, se transformaron en la cepa de Agrobacterium, GV3101 y las células GV3101 transformadas resultantes se utilizaron para la transformación transitoria en las hojas de Nicotiana benthamiana usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los tres ORF de expresión deben expresar de forma transitoria una proteína de fusión que comprende el U-ACTX-Hvla fusionado a la GFP con un enlazador escindible de tripsina entre los dos dominios estructurales.

Luego de 6 días de transformación transitoria de tabaco, se examinó inicialmente la expresión de U-ACTX-Hvla fusionado con GFP mediante detección de fluorescencia verde en lüz UV. Se detectó la fluorescencia verde a diversos niveles en todas las hojas de tabaco transformadas. Las hojas transformadas con acumulación de U-ACTX-Hvla fusionado con GFP dirigida al CYTO mostraron la fluorescencia verde más intensa y las hojas con acumulación de proteína de fusión dirigida al APO o ER mostraron la fluorescencia verde más débil. Por lo tanto, los resultados indican que la expresión dirigida al CYTO puede facilitar una mayor acumulación de la proteína U-ACTX-Hvla fusionada con GFP transgénica que la expresión dirigida al APO y ER en hojas de tabaco. En tres repeticiones de este experimento, las hojas de tabaco transformadas con expresión dirigida al CYTO siempre mostraron una fluorescencia verde similar o más intensa a la de las hojas con expresión dirigida al APO y la fluorescencia verde más débil se detectó en las hojas de tabaco transformadas con las construcciones dirigidas al ER. Estos resultados iniciales indicaron que la expresión dirigida al CYTO puede acumular tanta o más proteína de fusión transgénica que la expresión dirigida al APO y que la expresión dirigida al ER proporcionó la menor acumulación.

Se extrajeron muestras de proteína soluble total se hojas de tabaco transformadas con los diferentes vectores de FECT (el protocolo se describió detalladamente en el Ejemplo 1) . Se realizó un ensayo de proteína con Coomassie Plus de Pierce como se describió en el Ejemplo 1 para determinar las concentraciones de la proteína soluble total en los extractos de TSP, lo cual proporcionó los siguientes cálculos de concentración: 0,31 ± 0,04 mg/pL, 0,31 ± 0,03 pg/pL y 0,34 ± 0,05 pg/pL para la expresión dirigida al APO, dirigida al CYTO y dirigida al ER, respectivamente (N = 3).

Luego se realizó el protocolo de ELISA indirecto usando los extractos de TSP tal como se describió en el Ejemplo 1 para cuantificar el nivel de expresión de la proteína U-ACTX-Hvla como un porcentaje de la proteína soluble total (% de TSP) , lo cual proporcionó los siguientes cálculos porcentuales: 0,126 ± 0,032 %, 0,049 ± 0,085 % y 0,025 ± 0,018 % para la expresión dirigida al APO, dirigida al CYTO y dirigida al ER, respectivamente (N = 3). La Fig. 8 resume esta cuantificación del U-ACTX-Hvla expresada (como valores de % de TSP) para las diversas hojas de tabaco transformadas que se describieron anteriormente. Estos resultados indicaron que la expresión transgénica dirigida al APO provocó la mayor acumulación del motivo proteico de ICK con plegamiento correcto que se expresa en las hojas.

En términos generales, si bien las hojas de tabaco transformadas para producir U-ACTX-Hvla fusionado con GFP transgénica dirigida al CYTO presentaron la señal de fluorescencia verde más potente, los resultados del iELISA detectaron el menor péptido U-ACTX-Hvla en estas hojas de tabaco transgénicas, de hecho, considerablemente menos de lo que se detectó para hojas transformadas para la expresión dirigida al ER (que tuvo la señal de fluorescencia verde más débil). En los ensayos de iELISA, el anticuerpo principal (anticuerpo anti-U-ACTX-Hvla de conejo) solo se puede unir en el péptido U-ACTX-Hvla con plegamiento correcto.

Ejemplo 3 Péptidos de señal alternativos para expresión de motivos proteicos de ICK en plantas Debido a que el péptido señal del ER puede tener incidencia en el nivel de expresión de proteína, se analizaron otros dos ERSP usando el sistema de expresión FECT descrito en los ejemplos previos. Los dos candidatos del ERSP fueron el péptido señal de extensina de tabaco, abreviado como "E" en este estudio (Memelink et ál, the Plant Journal, 1993, V4: 1011-1022.) y una de sus variantes abreviadas como "E*" (Pogue GP et ál, Plant Biotechnology Journal, 2010, V8: 638-654.). A continuación se indican sus secuencias de aminoácidos (N' a C , código de una letra, con los residuos que no son idénticos en negrita): Péptido señal de extensina (EMGKMASLFASLLW LVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 18) Variante del péptido señal de extensina (E*): MGKMASLFATFLW LVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 19) Se diseñó una secuencia de ADN que codifica E para la expresión en tabaco como se indica a continuación: ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGT CTCTGGCTTCTGAATCTTCTGCT (SEQ ID NO: 20).

La secuencia de ADN E se generó usando PCR de oligo-extensión con cuatro cebadores de ADN sintéticos. Luego, para agregar un sitio de restricción Pac I en su extremo 5' y agregar parte de la secuencia de ADN del extremo 51 de la GFP en su extremo 3', se realizó una PCR adicional utilizando la secuencia de ADN E como plantilla, lo cual proporcionó un fragmento de ADN de 117 pb. Este fragmento luego se utilizó como el cebador directo de la PCR para amplificar la secuencia de ADN que codifica el OFR del GFP-enlazador IGER- U-ACTX-Hvla del vector de pFECT-BG1H (consultar el Ejemplo 1 y Ejemplo 2) y así produjo un ORF de expresión de U-ACTX-Hvla que codifica (desde el N-terminal1 al C ) péptido señal de extensina-GFP-enlazador IGER -U-ACTX-Hvla, seguido por uno de nuestros diseños de ORF de expresión del motivo proteico de ICK como ERSP-Sta-L-ICK. Este ORF de expresión, denominado "EG1H", tiene un sitio de restricción Pac I en su extremo 5' y un sitio de restricción Avr II en su extremo 3'. EGIH tiene la siguiente secuencia de ADN: TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGT TTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGA GTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTG GAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGG AAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTT TCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTT ATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGT CAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAA GATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCA CGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGA TGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTC CTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAA AGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGA TGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTT AATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATA CTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 21).

La secuencia de ADN de EG1H se clonó en los sitios de restricción Pac I y Avr II del vector de FECT para generar el vector de pFECT-EG1H para la expresión transitoria de proteína U-ACTX-Hvla fusionada con GFP en plantas.

Se diseñó una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de extensina variante (E*) para la expresión en tabaco como se indica a continuación: ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGT CTCTGGCTTCTGAATCTTCTGCT (SEQ ID NO: 22).

Se creó una secuencia de ADN "E*GIH" que codifica una fusión traduccional (desde N' hasta C ) de péptido señal de extensina variante-GFP-enlazador IGER-proteína U-ACTX-Hvla utilizado las mismas téenicas que se describieron anteriormente para el ORF de EGIH. El ORF resultante para E*GIH tiene la siguiente secuencia de ADN: TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGT TTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGA GTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTG GAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGG AAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTT TCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTT ATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGT CAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAA GATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCA CGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGA TGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTC CTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAA AGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGA TGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTT AATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATA CTGTTTATTATTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 23).

La secuencia de ADN de E*G1H se clonó en los sitios de restricción de Pac I y Avr II del vector FECT para generar el vector de pFECT-E*G1H para la expresión transitoria de proteína U-ACTX-Hvla fusionada con GFP en plantas.

Se usaron tres vectores de expresión de FECT diferentes, pFECT-BGIH, pFECT-EGIH y pFECT-E*GIH, para expresar de forma transitoria la proteína U-ACTX-Hvla fusionada con GFP en plantas de tabaco para evaluar cómo los diferentes ERSP afectan el nivel de expresión de proteína. Los tres vectores de expresión de FECT se transformaron en Agrobacterium, GV3101 y luego el GV3101 transformado se inyectó en hojas de tabaco para expresión transitoria de la proteína U-ACTX-Hvla fusionada con GFP en hojas de tabaco usando las téenicas descritas en el Ejemplo 1.

Los niveles de expresión de U-ACTX-Hvla fusionada con GFP de tres vectores de expresión de FECT diferentes descritos anteriormente se evalúan en primer lugar visualmente mediante detección de fluorescencia verde en luz UV. La fluorescencia verde de las hojas de tabaco con transformación transitoria de los tres vectores de FECT diferentes se puede observar a simple vista. Todas las hojas mostraron niveles similares de fluorescencia verde, lo cual sugiere que ninguno de los tres ERSP analizados contribuyó a un aumento considerable en el nivel de expresión de proteína U-ACTX-Hvla fusionada con GFP.

Se extrajeron muestras de proteína soluble total de hojas de tabaco transformadas con los tres vectores de FECT del ERSP como se describió anteriormente (el protocolo se describió detalladamente en el Ejemplo 1). Luego se realizó un ensayo de proteína con Coomassie Plus de Pierce (como se describió en el Ejemplo 1) para determinar la concentración de la proteína soluble total en las muestras de TSP resultante, lo cual proporcionó valores de 0,85 ± 0,68 mg/pL, 0,70 ± 0,47 pg/pL y 0,76 ± 0,77 pg/pL para las muestras que corresponden a los ORF de expresión de BG1H, EG1H y E*GIH, respectivamente (N = 4).

Luego se realizó un ELISA indirecto utilizando los extractos de TSP (como se describió en el Ejemplo 1) para cuantificar el nivel de expresión de la proteína U-ACTX-Hvla como un porcentaje de la proteína soluble total (% de TSP), que proporcionó valores de 0,39 ± 0,17 % (N=3, como un punto de datos tomado como punto de referencia), 0,48 ± 0,26 % (N=4), y 0,62 ± 0,38 % (N=4) para muestras que corresponden a los vectores de FECT con los ORF de expresión de BG1H, EG1H y E*GIH, respectivamente. La Fig. 9 resume los niveles calculados de U-ACTX-Hvla como porcentaje en la proteína soluble total (% de TSP) para todas las muestras tomadas de las hojas de tabaco transformadas con los tres ORF de los ERSP descritos anteriormente. Si bien los datos del % de TSP de la transformación con los tres vectores de FECT parecían diferentes, estos no fueron estadísticamente diferentes en la prueba t de Student. El en otras palabras, los tres ERSP no representaron una diferencia en el nivel de expresión de U-ACTX-Hvla en las hojas de tabaco con transformación transitoria.

Ejemplo 4 La proteína de estabilización expresada como proteína de fusión para el motivo proteico de ICK ayuda a la acumulación del motivo proteico de ICK en plantas transformadas El motivo proteico de ICK para la expresión vegetal en este ejemplo fue omega-ACTX-Hvla, proveniente de la araña de Sídncy con tela en embudo, Hadronyche versuta. Omega-ACTX-Hvla tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (código de una letra): SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24).

Se usó el sistema de expresión FECT para expresar omega-ACTX-Hvla en la planta de tabaco, Nicotiana benthamiana. Se modificaron dos vectores de FECT que codifican ORF de expresión de omega-ACTX-Hvla diferentes. Uno de estos ORF de expresión codificó omega-ACTX-Hvla con péptido señal de alfa-amilasa de cebada (BAAS) en su N-terminal1 sin ninguna proteína de estabilización. Este ORF de expresión, denominado en la presente como "BO", se subclonó para proporcionar el vector de expresión de FECT pFECT-BO. El otro ORF de expresión de omega-ACTX-Hvla codifica una fusión traduccional de omega-ACTX-Hvla con la proteína Jun a 3. La Jun a 3 madura es una proteína de defensa vegetal de ~30 kDa que también es un alérgeno para algunas personas. La producen los árboles Juniperus ashei y se utiliza en este ORF como proteína de estabilización (STA) traduccional. A continuación se indica su secuencia de aminoácidos (código de una letra): MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGW KFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQ TWTVNLAAGTASARFWGRTGCTFDASGKGSCQTGDCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQD YYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADINAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCR NAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO:25) .

A continuación se proporciona la proteína Jun a 3 madura en la SEQ ID NO: 26.

KFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWGRTGCTFDASG KGSCQTGDCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPA CKADINAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYA KDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO: 26).

El ERSP codificado en el ORF de la SEQ. ID.25 es un péptido señal de la Jun a 3 natural que se muestra a continuación como la SEQ. ID 27. MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGW SEQ. ID.27.

En el Ejemplo 1 se describe de forma detallada el enlazador IGER, codificado por la secuencia entre el dominio de omega-ACTX-Hvla y los dominios de Jun a 3 que se codifican en el ORF. De forma conjunta, este ORF de expresión de omega-ACTX-Hvla se denomina S-Juna3-IGER-Omega o SJIO. De la misma forma, el vector de FECT en el que se insertó el ORF de expresión SJIO se denominó pFECT-SJIO.

Se utilizaron los dos vectores de expresión de FECT de omega-ACTX-Hvla, pFECT-BO y pFECT-SJIO, para expresar de forma transitoria la proteína omega-ACTX-Hvla en plantas de tabaco. Los dos vectores de expresión de FECT se transformaron en la cepa de Agrobacterium GV3101 y el transformante GV3101 resultante se inyectó en hojas de tabaco para expresión transitoria de omega-ACTX-Hvla en hojas de tabaco usando las téenicas descritas detalladamente en el Ejemplo 1.

Al día 6 luego de la transformación de tabaco, se recolectaron las hojas de tabaco transformadas y se extrajeron las proteínas de hoja solubles totales de las hojas (consultar el Ejemplo 1 para encontrar métodos detallados) . Luego se realizó un ensayo de proteína con Coomassie Plus de Pierce para determinar las concentraciones de la proteína de hoja soluble total, lo cual proporcionó valores de 3,047 ± 0,176 mg/pL (N=2) y 2,473 ± 0,209 pg/pL (N=2) para las hojas transformadas con construcciones que codifican pFECT-SJIO y pFECT-BO, respectivamente.

Luego se realizó el protocolo de ELISA indirecto utilizando los extractos de TSP anteriores como se describió en el Ejemplo 1 para evaluar de forma cuantitativa el nivel de expresión de la proteína omega-ACTX-Hvla como porcentaje de la proteína soluble total (% de TSP), lo cual proporcionó valores de 0,133 ± 0,014 % (N=2) y 0,0004 ± 0,0003 % (N=2) para las hojas transformadas con los vectores pFECT-SJIO y pFECT-BO, respectivamente. Estos datos indicaron que omega-ACTX-Hvla expresada como una fusión traduccional con Jun a 3 se acumuló hasta un nivel estacionario más de 300 veces superior al de omega-ACTX-Hvla expresada sin fusión traduccional con la proteína Jun a 3.

En el ejemplo 4 precedente, la función de la STA también se podría haber realizado con lectina de campanilla de invierno (GNA) con la siguiente secuencia: DNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCFLS MQTDGNLW YNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNW IYGTDRWATG (SEQ ID NO: 28).

Ejemplo 5 Un enlazador escindible entre el dominio de la prot ína de estabilización y los dominios del motivo proteico de ICK en un ORF de expresión del motivo proteico de fusión de ICK potencia la actividad insecticida del motivo proteico de ICK resultante expresado en una planta transgénica Debido a que la mayoría de los insectos ordedores secretan tripsina en sus intestinos para digerir el alimento, se diseñó un ORF de expresión de la proteína de fusión que codifica un enlazador escindible de tripsina entre el dominio de la proteína de estabilización y el dominio del motivo proteico de la fusión de ICK, para facilitar la liberación del dominio del motivo de ICK desde la proteína de fusión intacta en el intestino del insecto.

En este caso, el motivo proteico de ICK para la expresión vegetal fue omega-ACTX-Hvla, con la siguiente secuencia de aminoácidos (código de una letra): SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24).

El ORF de expresión de omega-ACTX-Hvla que se usó codifica una proteína de fusión que comprende los siguientes dominios (N1 a C ): péptido señal de Jun a 3:: Jun a 3:: enlazador IGER:: omega-ACTX-Hvla, como en la fórmula estructural ERSP-Sta-L-ICK descrita anteriormente. El origen y la secuencia de Jun a 3 son como se describió anteriormente en el Ejemplo 4.

El ERSP que se utilizó en este caso fue el péptido señal de Jun a 3 natural, como se describió anteriormente en el Ejemplo 4.

En el Ejemplo 1 se describe de forma detallada el enlazador IGER, codificado por la secuencia entre el dominio omega-ACTX-Hvla y los dominios de Jun a 3 que se codifican en el ORF. De forma conjunta, este ORF de expresión de omega-ACTX-Hvla se denomina S-Juna3-IGER-0mega o SJIO. De la misma forma, el vector FECT en el que se insertó el ORF de expresión SJIO se denominó pFECT-SJIO.

Luego se utilizó el vector, pFECT-SJIO, para expresar de forma transitoria la proteína omega-ACTX-Hvla en plantas de tabaco. El vector se transformó en Agrobacterium, GV3101 y luego el GV3101 transformado se inyectó en hojas de tabaco para expresión transitoria de omega-ACTX-Hvla en las hojas usando las téenicas descritas detalladamente en el Ejemplo 1.

Al día 6 después de la transformación de la hoja de tabaco, se recolectaron 3,3 g de hoja de tabaco transformada y se molieron en nitrógeno líquido. Se utilizaron 50 mL de amortiguador TSP-Sel para extraer las proteínas solubles totales (TSP) de las hojas molidas siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Se recuperó un total de 26 mL de extracto del procedimiento de extracción de TSP que luego se separó de forma uniforme en dos muestras, A y B, con 13 mL de extracto para cada grupo. La muestra A se trató con tripsina para liberar omega-ACTX-Hvla de la proteína Jun a 3 fusionada agregando 1,3 mL de 1 mg/mL de tripsina en 1 mM de HCl a 37 C durante 1 hora. La muestra B no se trató mediante escisión de tripsina. Para obtener omega-ACTX-Hvla en el intervalo de concentración de bioactividad, ambos grupos se concentraron de la misma forma como se indica a continuación. En primer lugar, las extracciones se cargaron en un concentrador con una membrana de filtro de corte de 10 kD y se centrifugaron a 3200 g durante 2 horas. Luego se guardaron 1,4 mL de las fracciones retenidas de la muestra A y 1,1 mL de las fracciones retenidas de la muestra B para pruebas posteriores. El filtrado de 12,5 mL de la muestra A y el filtrado de 12,5 mL de la muestra B se concentraron adicionalmente mediante centrifugación en concentradores con membranas de filtro de corte de 1 kD a 3200 g durante 16 horas. Se recuperaron 1,3 mL de la fracción retenida de la muestra A y 1,1 mL de la fracción retenida de la muestra B. Se guardaron las dos fracciones retenidas de filtración de corte de 1 kD para pruebas posteriores. Este procedimiento de concentración de muestras se resume en la Fig. 10. La extracción de TSP total de las hojas de tabaco transformadas con pFECT-SJIO se separó de forma uniforme en dos muestras. Una muestra (A) se trató mediante escisión de tripsina y la otra (B) no. Ambos grupos se concentraron mediante centrifugación en los concentradores con membranas de filtro de corte de 10 kD y luego 1 kD y las fracciones retenidas de la filtración con corte de 10 kD y 1 kD se guardaron para pruebas adicionales.

El OEF de expresión de SJIO expresó la siguiente proteína de fusión, Jun a 3 ::IGER::Omega-ACTX-Hvla, que comprende un total de 226 residuos de aminoácidos y tiene un peso molecular previsto de 28.204,28 Da. La escisión de tripsina de esta proteína de fusión debería liberar una omega-ACTX-Hvla con un peso molecular de 4049,2 Da y una proteína de fusión Jun a 3::IGER con un peso molecular de 24.155,1 Da. Por lo tanto, si se completa la reacción de escisión de tripsina en el tratamiento, entonces los componentes principales anticipados de las muestras de filtración son los siguientes: Fracción retenida de la filtración de 10 kD de la muestra A: Fusión de Jun a 3::IGER.

Fracción retenida de la filtración de 1 kD de la muestra A: Omega-ACTX-Hvla.

Fracción retenida de la filtración de 10 kD de la muestra B: Fusión de Jun a 3::IGER::Omega-ACTX-Hvla.

Fracción retenida de la filtración de 1 kD de la muestra B: ningún SJIO expresó proteínas.

Para cuantificar el péptido de omega-ACTX-Hvla en las muestras de fracción retenida, se realizó un iELISA como se describió en el Ejemplo 1. Las concentraciones de omega-ACTX-Hvla detectadas en las muestras fueron las siguientes: Fracción retenida de la filtración de 10 kD de la muestra A: 1,328 ng/pL de omega-ACTX-Hvla, total de 1,86 mg.

Fracción retenida de la filtración de 1 kD de la muestra A: 2,768 ng/pL de omega-ACTX-Hvla, total de 3,60 mg.

Fracción retenida de la filtración de 10 kD de la muestra B: 12,656 ng/pL de omega-ACTX-Hvla, total de 13,92 U9- Fracción retenida de la filtración de 1 kD de la muestra B: 0,752 ng/pL de omega-ACTX-Hvla, total de 0,83 mg.

Tal como se indicó, se detectó Omega-ACTX-Hvla en todas las muestras de filtración analizadas. La omega-ACTX-Hvla detectada en la fracción retenida de filtración de 10 kD del Grupo A se debe en gran parte posiblemente a la retención física de la proteína de fusión sin escindir. De la misma forma, la omega-ACTX-Hvla detectada en la muestra de fracción retenida de la filtración de 1 kD del Grupo B se podría deber a una baja velocidad de filtración espúrea de la proteína de fusión sin escindir a través de la membrana de filtración de corte de 10 kD.

Para confirmar que la reacción de escisión de tripsina era exitosa, se realizó una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (rpHPLC) para analizar los componentes en las muestras de filtración reservadas. La HPLC se realizó usando un sistema de HPLC Varían E218 con una columna Cis monolítica Onyx 100 (4,6 x 100 mm), usando agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético (solvente A) y acetonitrilo con 0,1 % de ácido trifluoroacético (solvente B) como componentes de fase móvil. El péptido de omega-ACTX-Hvla se eluyó de la columna a una velocidad de flujo de 2 mL por minuto usando un gradiente lineal de 10 - 20 % de solvente B durante 10 minutos. Las muestras de omega-ACTX-Hvla sintético 99 % puro se utilizaron en la rpHPLC para producir una curva estándar (que vincula el área pico con la masa del péptido inyectado). Las Pigs. 11A-11C muestran tres perfiles de elución separados, 11A, 11B, 11C. Tal como se muestra en la Fig. 11A, el péptido de omega-ACTX-Hvla se eluyó a los 6,5 minutos después de la inyección. Al cargar una muestra de 500 pL de la fracción retenida de la filtración de 1 kD del Grupo B en el sistema de HPLC, no hubo pico de proteína entre los 6 y 7 minutos después de la inyección en la cromatografía HPLC correspondiente (Figura 11B). Al cargar una muestra de 500 pL de la fracción retenida de la filtración de 1 kD del Grupo A en el sistema de HPLC, hubo un pico a un tiempo de retención de 6,3 minutos (ver la línea punteada en la Fig.11) en la cromatografía correspondiente, lo cual representa la omega-ACTX-Hvla liberada desde la proteína de fusión mediante escisión de tripsina (Figura 11C). El área de este pico correspondió a una concentración de omega-ACTX-Hvla entre 16 - 70 ng/pL en la fracción retenida de la filtración de 1 kD de la Muestra A (dependiendo del enfoque que se utilice para integrar el pico).

Se usaron las muestras de filtración reservadas para realizar bioensayos de inyección de mosca doméstica para analizar la actividad de la o ega-ACTX-Hvla en la forma de la proteína de fusión y en la forma liberada de la proteína de fusión. Se compraron las pupas de la mosca doméstica ( Musca domestica) a Benzon Research, Inc. y se mantuvieron a 25 “C en una caja de plástico con orificios de ventilación en la tapa de la caja y alimento para moscas (proporción de 1:1 de azúcar y leche en polvo) y bolas de algodón sumergidas en agua en la caja. El día posterior a la aparición de la mosca doméstica adulta, las moscas se inmovilizaron utilizando una línea de CO2 y luego se mantuvieron inmóviles usando una almohadilla de infusión de CO2. Se seleccionaron las moscas con un peso de 12-18 mg para el bioensayo de inyección. Para realizar la inyección de la mosca doméstica, se usó un icroaplicador cargado con una jeringa de vidrio de 1 cc con una aguja de calibre 30, donde se cargó la solución de inyección, para administrar dosis de 0,5 mL en la cara dorsal del tórax de las moscas. Luego las moscas inyectadas se colocaron en cajas etiquetadas con orificios de ventilación y se registró la mortalidad 24 horas después de la inyección. Se inyectaron las siguientes muestras en las moscas domésticas (se usaron grupos de 10 moscas para cada muestra): - Inyección de agua como control negativo.

- Fracción retenida de la filtración de 10 kD del Grupo A.

- Fracción retenida de la filtración de 1 kD del Grupo A.

- Fracción retenida de la filtración de 10 kD del Grupo B.

- Fracción retenida de la filtración de 1 kD del Grupo B.

Solución de 0,13 mg/mL de tripsina como control negativo.

A las 24 horas de la inyección, la fracción retenida de la filtración de 10 kD de la Muestra A y la fracción retenida de la filtración de 1 kD de la Muestra A provocaron un 100 % de mortalidad de la mosca doméstica, mientras que se observó una mortalidad de 0 % para las moscas inyectadas con las otras muestras. La secuencia natural pura omega-ACTX-Hvla mostró una LD5o de 100 pmol/gramo de mosca doméstica en este bioensayo de inyección de moscas domésticas. Por lo tanto, para generar un 100 % de mortalidad en este paradigma, la concentración de omega-ACTX-Hvla que se inyecte debe ser de al menos 25 ng/pL. Esto es coherente con los resultados del bioensayo, dado que el análisis de HPLC de la fracción retenida de la filtración de 1 kD de la Muestra A indicó una concentración de omega-ACTX-Hvla de 16 - 70 ng/pL. Las muestras de filtración que no comprendían material tratado con escisión de tripsina no generaron mortalidad en el bioensayo de inyección de moscas domésticas, lo cual indicó que la omega-ACTX-Hvla fusionada con Jun a 3 era considerablemente menos activa que la secuencia natural omega-ACTX-Hvla escindida de la construcción de fusión mediante tripsina. Por lo tanto, la región enlazadora de un ORF de expresión del motivo proteico de ICK vegetal puede mostrar una mayor función insecticida cuando se diseña para que sea escindible, de forma que el dominio del motivo de ICK de la proteína de fusión de ICK se pueda liberar desde los otros dominios estructurales de la proteína mediante proteólisis.

Parte II. Péptidos de gran producción La capacidad de producir de forma exitosa péptidos insecticidas a escala comercial, con plegamiento y formación de péptido reproducibles y con controles de costo puede ser un desafío. La gran variedad, propiedades únicas y naturaleza especial de los péptidos, combinadas con la gran variedad de posibles téenicas de producción, pueden presentar una cantidad abrumadora de enfoques para la producción de péptidos .

No obstante, en caso de existir son pocas las descripciones que describen cómo cambiar un péptido de forma que se produzca en un sistema biológico a una velocidad de producción mucho mayor de la que se produce típicamente el péptido antes de su cambio. En este caso se presenta una forma de cambiar la composición de un péptido. Al hacerlo, se aumenta la velocidad y cantidad y, de forma simultánea, se disminuye el costo de la producción peptídica. Se describen formas novedosas de cambiar o "convertir" un péptido en un péptido diferente y más rentable, pero que sorprendentemente es tan tóxico como antes de su conversión.

Se describen ejemplos de estos péptidos convertidos novedosos y se muestra cómo estos métodos para alterar o convertir un péptido pueden representar una mejora considerable en el suministro de péptidos sin cambios considerables en su actividad. Los nuevos procesos, nuevos péptidos, nuevas formulaciones y nuevos organismos para producir estos péptidos se describen y reivindican en la presente. Se describe un proceso que aumenta el rendimiento de producción de péptidos insecticidas a partir de sistemas de expresión de levadura mediante adición de un dipéptido en el N-terminal de los péptidos insecticidas. La adición de un dipéptido no afecta de forma adversa las actividades insecticidas de los péptidos insecticidas.

Se describen ejemplos de estos péptidos convertidos novedosos y se muestra cómo estos métodos para alterar o convertir un péptido pueden representar una mejora considerable en el suministro de péptidos sin cambios considerables en su actividad. Los nuevos procesos, nuevos péptidos, nuevas formulaciones y nuevos organismos para producir estos péptidos se describen y reivindican en la presente.

Procedimientos detallados para realizar péptidos de gran producción.

Se describe un proceso y péptido que pueden aumentar la producción peptídica. Cuando se siguen estas téenicas, se proporciona un péptido convertido mediante la adición de un dipéptido en el N-terminal del péptido natural que tiene una mejor velocidad de producción que el péptido natural de tres formas diferentes. En primer lugar, el rendimiento promedio general de las cepas de dipéptido-péptido natural es mejor que la de las cepas naturales. En segundo lugar, el rendimiento mediano de las cepas de dipéptido-péptido natural es mejor que el del natural. Y en tercer lugar, hay más cepas de dipéptido en un intervalo de rendimiento superior que para las cepas de péptido natural. El proceso descrito en la presente se puede utilizar en diversos sistemas in vivo, incluyendo plantas, animales y microbios. La invención requiere la adición de un dipéptido al N-terminal del péptido natural, que es el péptido que se conocía antes de la adición del dipéptido. Luego el péptido conocido se "convierte", tras lo cual se puede realizar con rendimientos mayores de lo que se pensaba posible previamente. En una modalidad, los péptidos insecticidas se enlazan a un dipéptido. Estos sistemas de dipéptido-péptido natural se pueden utilizar en plantas que pueden producir los péptidos. Los péptidos producidos por plantas tienen una variedad de usos desde producción hasta simplemente hacer que un péptido tóxico se encuentre disponible para que lo consuma un insecto dañino y así proteger las plantas o posiblemente brindar otros beneficios.

En una modalidad se describe un proceso para aumentar el rendimiento de producción de péptidos insecticidas en sistemas de expresión de levadura mediante la adición de cualquier dipéptido al N-terminal del péptido insecticida. El dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar y un aminoácido polar. El aminoácido no polar se puede seleccionar de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina. Glicina es el aminoácido no polar preferido. El aminoácido polar se puede seleccionar de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófno y tirosina. Serina es el aminoácido polar preferido. Se describen el proceso y los aminoácidos donde el aminoácido no polar se encuentra en el N-terminal del dipéptido y, en una modalidad, el N-terminal preferido del dipéptido es glicina. Se describen el proceso y los aminoácidos donde el aminoácido polar se encuentra en el C-terminal del dipéptido y, en una modalidad, el C-terminal preferido del dipéptido es serina.

En una modalidad de la invención, el dipéptido es glicina-serina, gly-ser o GS . Estos aminoácidos están codificados típicamente por los siguientes codones: Gly puede estar codificado por codones como GGT, GGC, GGA, GGG y Ser puede estar codificado por codones como TCT, TCC, TCA, TCG, AGT y AGC.

Los transgenes de los péptidos insecticidas se diseñan de forma que se optimicen sus secuencias transgénicas para la expresión específica que pueden necesitar. Por ejemplo, los transgenes de los péptidos insecticidas se pueden optimizar para la expresión en levadura, plantas, bacterias y virus. Los ejemplos de los usos de la invención incluirían la transformación genética y optimización de transgenes para cultivos como maíz y soja, con la finalidad de protegerlos de plagas de insectos. En un ejemplo se diseñan transgenes de péptidos insecticidas de forma que se optimicen sus secuencias transgénicas para la expresión específica en sistemas de expresión de levadura usando, por ejemplo, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae . En la téenica se conocen otros sistemas de expresión de levadura adecuados. Se agregan los codones de nucleótidos para un dipéptido, como glicina-serina (gly-ser) al extremo 5' de las secuencias transgénicas de los péptidos insecticidas maduros. Las secuencias transgénicas luego se ligaron en vectores de expresión adecuados que pueden proporcionar marcadores de selección adecuados, conjuntos fuertes de promotor-terminador para sistemas de expresión de levadura específicos, secuencias de señal para secreción y sitios de escisión entre las secuencias de señal y secuencias peptídicas maduras respectivas. Los vectores de expresión de péptidos insecticidas luego se transforman en células de levadura a través de medios conocidos por el experto en la téenica, incluyendo métodos de electroporación o transformación química, para generar cepas de levadura de expresión peptídica estable. Cuando estas cepas de levadura crecen en medios adecuados, producen péptidos insecticidas modificados mediante la adición de una secuencia de dipéptido, glicina-serina, al N-terminal de los péptidos insecticidas maduros, que se secretan en el medio de crecimiento. La adición del dipéptido glicina-serina al N-terminal de los péptidos insecticidas maduros mejora de forma considerable el rendimiento de los péptidos insecticidas sin efectos adversos en las actividades insecticidas de los péptidos .

Nuestros datos muestran que se puede hacer que cualquier péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) crezca a rendimientos considerablemente superiores de lo que sería posible de otra forma utilizando los procedimientos que se describen en la presente. Se ha demostrado que se pueden mejorar dramáticamente los rendimientos tanto de los tipos de ICK como no de ICK de los CRIP usando las técnicas de gran producción que se describen. En la presente se proporciona evidencia de aumentos dramáticos y sorprendentes en los rendimientos de dos tipos de CRIPS muy diversos.

Los péptidos insecticidas que se pueden convertir se pueden seleccionar de veneno insecticida, por ejemplo, el veneno de una araña. La araña puede ser una araña de Sídncy con tela en embudo. Los péptidos del género de Atrax o Hadronyche son U-ACTX-Hvla y sus análogos, y se pueden volver especiales fácilmente usando los procedimientos que se describen en la presente. Los ejemplos de péptidos específicos de arañas se describen en el listado de secuencias que se proporciona en la presente. Estos y otros péptidos se pueden convertir usando los procedimientos descritos en la presente.

Los péptidos insecticidas que se pueden convertir se pueden seleccionar de toxinas de anémonas como la Anemone viridis tal como se describió en el Ejemplo 3. En su hábitat normal, las anémonas se encuentran muy alejadas de las arañas con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche y el veneno de la Anemone viridis no se considera un tipo de veneno de ICK, como los péptidos venenosos de Atrax o Hadronyche, pero pese a eso el veneno del erizo de mar, como los péptidos tóxicos U-ACTX-Hvla y otros venenos insecticidas todos son un tipo de veneno que se denomina péptido insecticida rico en cisterna o CRIP y se identifican por primera vez como tales en la presente. Se espera y cree que los procedimientos descritos en la presente, en todas las secciones, funcionen con todos los péptidos en los listados de secuencias y todos los péptidos relacionados con las secuencias que el experto en la téenica comprendería que son un péptido insecticida rico en cisteína o CRIP. Todos estos y otros péptidos se pueden convertir usando los procedimientos descritos en la presente.

Además del proceso, también se describen péptidos de gran producción novedosos, en la presente "péptidos HP", que comprenden un dipéptido unido a un extremo de un péptido. En nuestras modalidades, el péptido es un péptido insecticida. En una modalidad el dipéptido se agrega al N-terminal del péptido. Se demostró el éxito en la producción de cepas de alto rendimiento con péptidos CRIP tanto de ICK como no de ICK. En una modalidad adicional, el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar y un aminoácido polar. En una modalidad adicional, el aminoácido no polar se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y el aminoácido polar se selecciona del serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano y tirosina. En una modalidad específica, un péptido HP está compuesto por un péptido que se modifica para tener el dipéptido de glicina-serina como los dos primeros aminoácidos de un péptido maduro que de otra forma se encuentra sin modificar. Los péptidos HP se pueden producir mediante adición de glicina-serina al péptido U y sus análogos para crear péptidos HP.

Los péptidos modificados realizados mediante los procesos descritos en la presente son nuevos y se reivindican por separado. Estos péptidos se describen en todas sus propiedades y no simplemente su secuencia. Estos péptidos son novedosos y tienen propiedades exclusivas. En la presente se describen y reivindican tanto los péptidos HP como el proceso para realizarlos.

Se conocen y pueden encontrar ejemplos de péptidos útiles en diversas referencias. Una clase de péptidos útiles son los péptidos insecticidas. Los péptidos insecticidas se pueden identificar mediante su naturaleza peptídica y su actividad, normalmente actividad insecticida de inyección u oral. Se proporcionan en la presente algunos ejemplos para describir e ilustrar mejor la invención, pero la misma no se limita a estos ejemplos. Todos estos ejemplos y otros que no se muestran en la presente describen materiales nuevos, descritos y reivindicados por primera vez en la presente.

Los péptidos HP (de gran producción) se definen en la presente como cualquier péptido que se puede producir a velocidades de producción superiores a las normales usando las téenicas descritas en la presente. Estos péptidos pueden tener actividad insecticida. Típicamente, los péptidos insecticidas presentan actividad cuando se inyectan a insectos, pero la mayoría no presenta una actividad considerable cuando se aplica a un insecto por vía tópica. La actividad insecticida de los péptidos HP se mide de diversas formas. Los expertos en la téenica conocen ampliamente los métodos comunes de medición. Estos métodos incluyen, de modo no taxativo, determinación de dosis de respuesta mediana (p. ej., LDso, PD50, LC50, ED50) mediante ajuste de gráficas de respuesta a la dosis según el registro de diversos parámetros como: parálisis, mortalidad, imposibilidad de aumentar de peso, etc. Las mediciones se pueden realizar para cohortes de insectos expuestos a diversas dosis de la formulación insecticida en cuestión. El análisis de los datos se puede realizar creando curvas definidas mediante análisis de función probit y/o la ecuación Hill, etc. En estos casos, las dosis se administrarían mediante inyección hipodérmica, mediante infusión hiperbárica, mediante presentación de la formulación insecticida como parte de una muestra de alimento o cebo, etc.

Los ejemplos específicos de péptidos HP descritos a los efectos de proporcionar ejemplos y sin intención de limitar la presente son los péptidos U y sus homologías que se originan de los venenos de arañas de Sídncy con tela en embudo. La descripción de estos péptidos se puede encontrar en secciones anteriores de este documento.

Como se indicó anteriormente, muchos péptidos son candidatos adecuados como objeto del proceso para volverse especiales. Las secuencias que se indican previamente, a continuación y en el listado de secuencias son péptidos especialmente adecuados que se pueden volver especiales y algunos de estos se volvieron especiales de acuerdo con la presente invención, con los resultados que se expresan en los ejemplos a continuación.

GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A SEQ ID NO: 5 (código de una letra).

Tiene el nombre "U+2-ACTX-Hvla" y cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 5-20, 12-25, 19-39. El peso molecular es de 4564,85 Daltons.

GSRSC CPCYW GGCPW GQNCY PEGCS GPKV SEQ ID NO: 29 (código de una letra). Tiene el nombre "Av3+2" y cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 5-19, 6-13, 8-24. El peso molecular es de 3076,47 Daltons.

Preparación de los péptidos HP Los péptidos HP descritos en la presente se pueden preparar como se indica a continuación. Se diseñan los marcos de lectura abiertos (ORF) de los péptidos insecticidas de forma que se optimicen sus secuencias de nucleótidos para la expresión específica de la especie. A continuación se muestra un ejemplo específico de un proceso para aumentar el rendimiento de producción de péptidos insecticidas en sistemas de expresión de levadura mediante la adición de un dipéptido al N-terminal del péptido insecticida. El dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar y un aminoácido polar. El aminoácido no polar se puede seleccionar de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y glicina es el aminoácido no polar preferido. El aminoácido polar se puede seleccionar de serina, treonina, cisteína, histidina, triptófano, tirosina, asparagina y glutamina y serina es el aminoácido polar preferido. En el ejemplo a continuación, el aminoácido no polar se encuentra en el N-terminal del dipéptido y es glicina. En el ejemplo a continuación, el aminoácido polar se encuentra en el C-terminal del dipéptido y es serina.

El ORF del péptido insecticida se diseña para la secreción desde las células de levadura hospedadoras de la siguiente forma: el ORF comienza con una secuencia del péptido señal, seguida por una secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión de Kex 2 (lisina-arginina), seguida por el transgén del péptido insecticida con adición de codones de glicina-serina en el extremo 5' y, por último, finaliza con un codón de detención en el extremo 3'. Todos estos elementos se expresan a un péptido de fusión en células de levadura como un único marco de lectura abierto. Se utiliza más frecuentemente una secuencia de señal del factor de a-apareamiento para facilitar el procesamiento metabólico de los péptidos insecticidas recombinantes a través de la vía de secreción endógena de la levadura recombinante, es decir, el péptido de fusión expresado ingresa típicamente en el retículo endoplasmático, donde se retira la secuencia de señal del factor de a-apareamiento mediante actividad de peptidasa de señal y luego el péptido pro- insecticida resultante se trafica hasta el aparato de Golgi, donde el dipéptido de lisina-arginina mencionado previamente se retira por completo mediante la endoproteasa Kex 2, luego de lo cual se secreta el péptido insecticida HP maduro que comprende el dipéptido glicina-serina no natural adicional en su N-terminal desde las células.

Para potenciar el nivel de expresión del péptido insecticida en las células de levadura recombinantes, normalmente se optimizan los codones del ORF del péptido insecticida para la expresión en las especies de levadura hospedadoras específicas. Las frecuencias de origen natural de codones observadas en marcos de lectura abiertos endógenos de un organismo hospedador dado no se optimizan necesariamente para una expresión de gran eficacia. Adicionalmente, especies de levadura diferentes (por ejemplo, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae, etc.) tienen codones óptimos diferentes para la expresión de gran eficacia. Por lo tanto, se debería considerar la optimización de codones para el ORF peptídico, incluyendo los elementos de secuencia que codifican la secuencia de señal, el sitio de escisión de Kex2 y los péptidos insecticidas, debido a que se traducen inicialmente como un péptido de fusión en las células de levadura recombinantes.

Luego se ligan los ADN de expresión de péptidos con codones optimizados en vectores de expresión adecuados para la expresión de levadura. Hay muchos vectores de expresión disponibles para la expresión de levadura, incluyendo vectores episomales y vectores de integración y estos normalmente se diseñan para cepas específicas de levadura. Se debe elegir con cuidado el vector de expresión adecuado según el sistema de expresión de levadura específico que se utiliza para la producción peptídica. En la presente se utilizan vectores de integración, que se integran en cromosomas de las células de levadura transformadas y son estables en los ciclos de proliferación y división celular.

Los vectores de expresión normalmente contienen algunos elementos de E. coli para la preparación de ADN en E. coli , por ejemplo, origen de replicación de E. coli , marcadores de selección de antibióticos, etc. Los vectores también contienen una serie de los elementos de secuencia necesarios para la expresión del transgén de interés, por ejemplo, promotores de transcripción, terminadores, marcadores de selección de levadura, homólogos de secuencias de ADN de integración para ADN de levadura hospedadora, etc. Hay muchos promotores de levadura adecuados, incluyendo promotores naturales y modificados genéticamente. En nuestros esfuerzos, se usaron promotores de levadura como pLAC4, pAOXl, pUPP, pADHl, pTEF, pGall, etc. También se utilizaron los siguientes marcadores de selección de levadura de uso común: selección para prototrofía de acetamida, selección para resistencia a zeocina, selección para resistencia a geneticina, selección para resistencia a nourseotricina, selección para deficiencia de uracilo. También se pueden utilizar otros marcadores conocidos por los expertos en la téenica. Las secuencias de ADN de integración son homologas a locus de ADN genómico dirigido en las especies de levadura transformada y las secuencias de integración incluyen pLAC4, 25S rDNA, pAOXl y TRP2, etc. Las ubicaciones de transgenes de péptidos insecticidas pueden ser adyacentes a la secuencia de ADN de integración (vectores de inserción) o dentro de la secuencia de ADN de integración (vectores de remplazo).

Para obtener más copias del ORF del péptido insecticida integrado en los cromosomas de levadura hospedadora, los vectores de expresión se pueden diseñar y generar para contener dos o tres copias del casete de expresión del péptido insecticida. Cada copia del casete de expresión del péptido insecticida en el vector de expresión debería contener estructuras de expresión independientes y completas incluyendo promotor, secuencia de señal, secuencia de escisión de Kex2 y el terminador de transcripción del codón de detención del transgén del péptido insecticida.

Los vectores de expresión peptídica luego se transforman en células de levadura. En primer lugar, los vectores de expresión se linealizan normalmente mediante escisión enzimática de restricción específica para facilitar la integración de cromosomas a través de recombinación homologa. Luego el vector de expresión lineal se transforma en células de levadura mediante un método químico o de electroporación de transformación y se integra en los locus diana del genoma de levadura mediante recombinación homologa. La integración puede producirse en el mismo locus cromosómico muchas veces, por lo tanto, el genoma de una célula de levadura transformada puede contener múltiples copias de transgenes de péptidos insecticidas. Los transformantes exitosos se pueden identificar usando condiciones de crecimiento que favorecen un marcador selectivo modificado en el vector de expresión y co-integrado en cromosomas de levadura con los transgenes de péptidos insecticidas. Los ejemplos de los marcadores incluyen, de modo no taxativo, prototrofía de acetamida, resistencia a zeocina, resistencia a geneticina, resistencia a nourseotricina y prototrofía de uracilo.

Debido a la influencia de factores variables e impredecibles -como modificación epigénica de genes y redes de genes y variación en la cantidad de eventos de integración que tienen lugar en células individuales en una población que se somete a un procedimiento de transformación-transformantes de levadura individuales de un proceso de transformación dado diferirán en sus capacidades de producir un péptido insecticida transgénico. Por lo tanto, los transformantes de levadura que llevan los transgenes de péptidos insecticidas se deben analizar para determinar las cepas de alto rendimiento. Dos métodos eficaces para el análisis, cada uno dependiente del crecimiento de cultivos a pequeña escala de los transformantes para proporcionar muestras de medio acondicionado para análisis posteriores, utilizan HPLC de fase inversa o procedimientos de inyección de mosca doméstica para analizar muestras de medio acondicionado de los transformantes.

Los cultivos transformantes se realizan normalmente en tubos de cultivo de polipropileno de fondo redondo de 14 mL con 5 - 10 mL de medio definido agregado a cada tubo o en placas de cultivo de pocilios profundos de 48 pocilios con 1 - 2 mL de medio definido agregado a cada pocilio. El medio definido, que no contiene extractos proteináceos brutos o subproductos como extracto de levadura o peptona, se utiliza para los cultivos para reducir el fondo de proteína en el medio acondicionado cosechados durante las etapas de análisis posteriores. Los cultivos se realizan a la temperatura óptima, por ejemplo, 23,5 °C para K. lactis, durante 5-6 días, hasta alcanzar la densidad celular máxima. A continuación se producen los péptidos insecticidas a partir de los transformantes y se secretan de células al medio de cultivo. Para preparar las muestras para el análisis, las células se retiran de los cultivos mediante centrifugación y los sobrenadantes se recogen como el medio acondicionado que luego se limpia mediante filtración a través de una membrana de filtro de 0,22 mm y luego se deja listo para el análisis de la cepa de producción del péptido insecticida. A continuación se describen algunos ejemplos de los métodos de análisis .

Uno de los métodos de análisis es análisis HPLC de fase inversa (rpHPLC) de transformantes. En este método de análisis, se utiliza una columna analítica de HPCL con fase unida de C18. Se utilizaron agua y acetonitrilo como solventes de fase móvil y se usa un conjunto de detector de absorbencia de UV a 220 nm para la detección peptídica. Se cargan cantidades adecuadas de las muestras de medio acondicionado en el sistema de rpHPLC y se eluyen con un gradiente lineal de solventes de fase móvil. El área pico correspondiente del péptido insecticida en la cromatografía HPCL se utiliza para cuantificar las concentraciones de péptido insecticida en el medio acondicionado. Las cantidades conocidas de péptido insecticida puro se procesan en la misma columna de rpHPLC con el mismo protocolo de HPLC para confirmar el tiempo de retención del péptido y para producir una curva de HPLC de péptido estándar para la cuantificación.

Un segundo método de análisis es el ensayo de inyección de la mosca doméstica. El péptido insecticida puede matar moscas domésticas cuando se inyecta en dosis medidas a través de las paredes corporales de la cara dorsal del tórax. La eficacia del péptido insecticida se puede definir según la dosis letal mediana del péptido (LD50), que provoca una mortalidad del 50 % de las moscas domésticas inyectadas. El péptido insecticida puro se utiliza normalmente en el ensayo de inyección de moscas domésticas para generar una curva estándar de respuesta a la dosis, de la que se puede determinar un valor de LD50. Utilizando un valor de LD50 del análisis de una curva estándar de respuesta a la dosis del péptido insecticida puro en cuestión, se puede lograr la cuantificación del péptido insecticida producido mediante un transformante de levadura usando un ensayo de inyección de moscas domésticas realizado con diluciones en serie del medio acondicionado correspondiente.

El análisis de cepa de producción de péptido insecticida puede identificar las cepas de levadura de alto rendimiento de cientos de transformantes. Estas cepas se pueden fermentar en un biorreactor para lograr un rendimiento de hasta 6 g/L de los péptidos insecticidas cuando se usan condiciones de fermentación y medios de fermentación optimizados. Las tasas de producción más elevadas pueden encontrarse en cualquiera de 20 a 400, 20 a 100, 20 a 200, 20 a 300, 40 a 100, 40 a 200, 40 a 300, 40 a 400, 60 a 100, 60 a 200, 60 a 300, 60 a 400, 80 a 100, 80 a 200, 80 a 300, 80 a 400, 100 a 150, 100 a 200, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 250 a 350, 250 a 400, 300 a 350, 300 a 400 % y 350 a 400 o cualquier intervalo de cualquier valor proporcionado o rendimientos incluso mayores de los que se pueden lograr con un péptido antes de la conversión, usando métodos de producción iguales o similares a los que se usaron para producir el péptido antes de la conversión.

Se puede utilizar cualquiera de las secuencias del listado de secuencias y, según se entiende, cualquier CRIP para realizar péptidos de gran producción similares a cualquiera de los motivos de ACTX de la araña de Sídncy con tela en embudo que a continuación se denomina péptido "U+2", o el péptido Av3+2 de la anémona tóxica, Anemone viridis, que se enseñan y describen en los ejemplos a continuación usando procedimientos que se enseñan en la presente y el conocimiento del experto en la téenica. Adicionalmente, se puede utilizar cualquier otro péptido CRIP adecuado de una forma similar para producir un péptido de gran producción o más 2, es decir, + 2.

Ejemplos de péptidos de gran producción Los Ejemplos en esta descripción no pretenden ni se deberían utilizar para limitar la invención, estos se proporcionan solamente para ilustrar la invención.

Ejemplo 1 Expresión del U y U+2-ACTX-Hvla natural en Kluyveromyces lactis ( K . lactis) Péptidos insecticidas que se desea expresar: U+2-ACTX-Hvla: GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO:5) y U-ACTX-Hvla natural: QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO:6).

Para expresar los dos péptidos insecticidas precedentes en K. lactis, se utilizaron el vector de expresión, pKLACl, y la cepa de K. lactis, YCT306, que se encuentran disponibles en New England Biolabs, Ipswich, MA, E.U.A. El vector pKLACl es un vector de expresión de integración. Luego de clonar los transgenes U+2 y U-ACTX-Hvla natural en pKLACl y transformar en YCT306, su expresión se controló mediante el promotor LAC4 . Los transformantes resultantes produjeron pre-propéptidos que comprenden un péptido señal del factor de a- apareamiento, un sitio de escisión de Kex2 y péptidos insecticidas maduros. El péptido señal del factor de a-apareamiento guía los pre-propéptidos para que pasen por la vía de secreción endógena y, finalmente, se liberan los péptidos insecticidas maduros en el medio de crecimiento.

La optimización de codones para la expresión de U+2-ACTX-Hvla se realizó en dos ciclos. En el primer ciclo, basándose en algunas características comunes de las secuencias de ADN de alta expresión, se diseñaron 33 variantes del ORF peptídico que expresan un péptido señal del factor de a-apareamiento, un sitio de escisión de Kex2 y el péptido U+2-ACTX-Hvla, y se evaluaron sus niveles de expresión en la cepa YCT306 de K-lactis, lo cual produjo un algoritmo de expresión de K. lactis inicial. En el segundo ciclo de optimización, se diseñaron otros cinco ORF del péptido U+2-ACTX-Hvla variante según el algoritmo de expresión de K. lactis inicial para ajustar adicionalmente el algoritmo de expresión de K. lactis y se identificó el mejor ORF para la expresión del péptido U+2-ACTX-Hvla en K. lactis. Esta secuencia de ADN tiene un marco de lectura abierto que codifica un péptido señal del factor de a-apareamiento, un sitio de escisión de Kex2 y un péptido U+2-ACTX-Hvla. La secuencia de ADN optimizada se clonó en el vector pKLACl usando los sitios de restricción Hind III y Not I, lo cual produjo el vector de expresión de U+2-ACTX-Hvla, pLB10V5.

Para permitir la integración de más copias del transgén de U+2-ACTX-Hvla optimizado en el genoma K. lactis durante la transformación, se procesó la generación de un vector de expresión de U+2-ACTX-Hvla que contenía dos copias del casete de expresión de U+2-ACTX-Hvla de la siguiente forma: Se sintetizó una secuencia de ADN del casete de expresión del U+2-ACTX-Hvla intacto de 3.306 pb que comprende un elemento promotor de LAC4 intacto, un elemento de ORF del péptido U+2-ACTX-Hvla con codón optimizado y un elemento terminador de pLAC4. Este casete de expresión intacto luego se ligó en el vector pLB10V5 entre los sitios de restricción Sal I y Kpn I, dirección 3' del terminador pLAC4 de pLB10V5, lo cual produjo el vector de expresión U+2-ACTX-Hvla del transgén doble, pLB10V5D.

Para generar un vector de expresión de U-ACTX-Hvla natural, el vector pLB10V5 se sometió a mutagénesis mediante eliminación de los codones glicina-serina en el extremo 5’ de la región del transgén U+2-ACTX-Hvla, usando un kit de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene. Esta mutagénesis produjo un nuevo vector, pLB12, que contenía una única copia del casete de expresión U-ACTX-Hvla natural con codón optimizado. Para generar un vector de expresión de U-ACTX-Hvla natural de doble transgén, se utilizó nuevamente un kit de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene para retirar los codones de glicina-serina en el extremo 5’ de la región del transgén U+2-ACTX-Hvla en el transgén del casete de expresión U+2-ACTX-Hvla de 3.306 pb, seguido por ligación para insertar el casete de mutagénesis en el vector pLB12 entre los sitios de restricción Sal I y Kpn I, lo cual produjo el plásmido, pLB12D, un vector de expresión que comprende dos copias intactas del casete de expresión de U-ACTX-Hvla natural con codón optimizado.

Luego los vectores de transgén dobles, pLB10V5D y pLB12D, se linealizaron usando endonucleasa de restricción de Sac II y se transformaron químicamente en la cepa YCT306 de K. lactis, de acuerdo con las instrucciones que se proporcionan con un kit de expresión de proteína K. lactis. Los transformantes resultantes crecieron en una placa de agar YCB complementada con 5 mM de acetamida, que solamente podrían usar eficazmente los transformantes que expresan acetamidasa como una fuente metabólica de nitrógeno.

Para las evaluaciones de rendimiento del péptido insecticida, se tomaron 316 colonias de las placas de transformantes pLB10V5D y se tomaron 40 colonias de las placas de transformantes pLB12D. Cada una de las inoculaciones de las colonias se cultivó en 6 mL del medio K. lactis definido con 2 % de glicerol puro agregado como una fuente de carbono. Los cultivos se incubaron a 23,5 °C, con agitación a 280 rpm, durante seis días, cuando las densidades celulares en los cultivos habían alcanzado sus niveles máximos tal como se indicó mediante absorbencia de luz a 600 nm (OD600). Las células luego se retiraron de los cultivos mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. Los sobrenadantes resultantes (medio acondicionado) se filtraron a través de membranas de 0,2 miki para el análisis de rendimiento mediante HPLC.

Para la evaluación del rendimiento peptídico, las muestras de medio acondicionado filtrado se analizaron en un sistema de HPLC Agilent 1100 equipado con una columna de HPLC analítica de fase inversa C18 de 4,5 x 100 m monolítica Onyx y un auto-inyector. El agua y acetonitrilo de grado de HPLC, ambos con 0,1 % de ácido trifluoroacético, constituyeron los dos solventes de fase móvil que se utilizaron para los análisis de HPLC. Las áreas pico tanto del U+2-ACTX-Hvl como U natural se midieron usando cromatografías HPLC y luego se usaron para calcular la concentración peptídica en el medio acondicionado, que luego se normalizó adicionalmente hasta las densidades celulares finales correspondientes (según se determinó mediante mediciones de OD600) como rendimiento peptídico normalizado.

Se usó un bioensayo de inyección de mosca doméstica para evaluar la actividad insecticida de los péptidos. El medio acondicionado se diluyó en serie para generar curvas completas de respuesta a la dosis a partir del bioensayo de inyección de moscas domésticas. Antes de la inyección, las moscas domésticas adultas ( Musca domestica) se inmovilizaron con CO2 y se seleccionaron las moscas domésticas de 12-18 mg para la inyección. Se usó un microaplicador cargado con una jeringa de 1 cc y una aguja de calibre 30 para inyectar dosis de 0,5 ml por mosca de muestras de medio acondicionado diluido en serie en moscas domésticas en toda la pared corporal de la cara dorsal del tórax. Las moscas domésticas inyectadas se colocaron en recipientes cerrados con papel filtro para humedad y orificios de ventilación en las tapas y se las examinó mediante registro de mortalidad a las 24 horas después de la inyección.

Se calcularon los rendimientos normalizados. Rendimiento peptídico significa la concentración de péptidos en el medio acondicionado en unidades de mg/L. Pero los rendimientos peptídicos no siempre son suficientes para comparar correctamente la velocidad de producción de la cepa. Las cepas individuales pueden tener relaciones de crecimiento diferentes , por lo tanto, cuando se cosecha un cultivo, los cultivos diferentes pueden variar en la densidad celular. Un cultivo con una densidad celular elevada puede producir una concentración mayor del péptido en el medio, incluso si la velocidad de producción peptídica de la cepa es menor a la de otra cepa que tiene una mayor velocidad de producción. Por lo tanto, el término "rendimiento normalizado" se crea dividiendo el rendimiento peptídico con la densidad celular en el cultivo correspondiente y esto permite comparar mejor la velocidad de producción peptídica entre las cepas. La densidad celular se representa mediante la absorbencia de luz a 600 nm con una unidad de "A" (unidad de absorbencia).

La Tabla 1, la Fig. 12 y la Fig. 13 resumen las distribuciones de rendimiento peptídico normalizado de U+2-y U-ACTX-Hvla natural de las cepas K. lactis . El rendimiento peptídico normalizado general promedio de U+2-ACTX-Hvla de las cepas . lactis fue de 4,06 + 3,05 mg/L.A, lo cual fue considerablemente superior en términos estadísticos que el rendimiento peptídico normalizado promedio del U-ACTX-Hvla natural, 2,73 ± 1,25 mg/L.A, mediante la prueba t de Student con un nivel de confianza del 99 %. El rendimiento peptídico normalizado mediano de las cepas . lactis del U+2-ACTX-Hvla fue de 9,36 mg/L.A, lo cual fue tres veces superior que el rendimiento mediano de las cepas del U-ACTX-Hvla natural (3,35 mg/L.A). Las cepas de expresión peptídica del U+2-ACTX-Hvla tuvieron proporciones muy superiores de los conteos de la cepa a un nivel de rendimiento superior que las cepas de U-ACTX-Hvla natural. Todos estos resultados indicaron que la adición del dipéptido de glicina-serina al N-terminal del péptido U-ACTX-Hvla contribuye a una mejora considerable del rendimiento previsto para los transformantes de levadura que expresan este péptido.

/ La Tabla 1 muestra una comparación de los rendimientos peptídicos de las cepas K. lactis.

Tabla 1. Comparación del rendimiento peptídico de U+2 y U-ACTX-Hvla natural La Fig. 12 muestra los histogramas de las distribuciones del rendimiento peptídico normalizado para las cepas U+2 y U natural. La escala X muestra el espectro del rendimiento peptídico normalizado. La escala Y a la izquierda muestra la frecuencia de las cepas que producen U+2 en el intervalo específico del rendimiento normalizado y la escala Y a la derecha muestra la frecuencia de las cepas que producen U natural en el intervalo específico de rendimiento normalizado. Las barras de color negro representan la distribución del rendimiento de U+2 y las barras de color gris representan la distribución del rendimiento de U natural. Por ejemplo, la primera barra de color negro indica que alrededor del 0,03 (3 %) del total de cepas que producen U+2 tienen rendimientos normalizados entre 0 y 0,5 mg/L.A. Los conteos de las cepas son diferentes entre la cepa natural y +2 debido a que se analizaron 316 cepas de U+2 y 40 cepas del péptido natural.

La Fig.13 muestra la distribución de los rendimientos peptídicos de U+2 y U-ACTX-Hvla natural producidos de las cepas K. lactis. Los datos de U+2 se muestran en negro y los datos de U natural en gris. El eje x muestra el rendimiento en miligramos por litro y la escala y muestra la fracción de producción de U+2 o U natural total de cepas K. lactis. El rendimiento de las cepas U+2 y la cantidad de cepas U+2 disponibles que pueden producir rendimientos elevados es muy superior para las cepas U+2 en comparación a las cepas U naturales.

Normalmente se esperaría que la modalidad de cambios en la secuencia peptídica que mejoran dramáticamente su rendimiento afecte su toxicidad. De manera sorpresiva, eso no sucedió con los dipéptidos de la presente descripción.

Nuestros datos indican que la adición del dipéptido y, especialmente, el dipéptido de glicina-serina al N-terminal del péptido U-ACTX-Hvla no disminuye la eficacia de las actividades insecticidas del péptido. La Fig.14 muestra dos curvas de respuesta a la dosis para los bioensayos de inyección de moscas domésticas realizados con las muestras de medio acondicionado con U+2-ACTX-Hvla y natural. El U+2-ACTX-Hvla tiene una dosis letal mediana (LD50) de 76,8 pmol/g, que es coherente con la LD50 del U-ACTX-Hvla natural, 77,6 pmol/g.

Ejemplo 2 Se estudiaron los rendimientos peptídicos de los transformantes de la levadura, Pichia pastoris ( P. pastoris) , que expresan U+2-ACTX-Hvla o U-ACTX-Hvla Se usaron dos vectores de P. pastoris, pJUGaKR y pJUZaKR, para la expresión peptídica del U+2-ACTX-Hvla o U-ACTX-Hvla natural en P. pastoris . pJUGaKR y pJUZaKR se pueden adquirir de Biogrammatics, Carlsbad, California, E.U.A. Ambos vectores son vectores de integración y utilizan el promotor de fosforibosiltransferasa de uracilo (pUPP) para potenciar la expresión del transgén heterólogo. La única diferencia entre los vectores es que pJUGaKR proporciona resistencia contra G418 a la levadura hospedadora, mientras que pJUZaKR proporciona resistencia a la zeocina.

Se diseñaron pares de oligonucleótidos complementarios que codifican el U-ACTX-Hvla natural y U+2-ACTX-Hvla, respectivamente, y se sintetizaron para la subclonación en los dos vectores de expresión de levadura. Las reacciones de hibridación se realizaron mezclando los oligonucleótidos complementarios correspondientes hasta una concentración final de 20 mM en 30 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl (todas concentraciones finales), pH 8 e incubando luego a 95 °C durante 20 min, seguido por una incubación de 9 horas que inicia a 92 °C y finaliza a 17 °C, con descensos de 3 “C en la temperatura cada 20 min. Las reacciones de hibridación proporcionaron dos fragmentos de ADN que codifican los péptidos U+2-ACTX-Hvla y U-ACTX-Hvla natural, respectivamente. Los dos vectores de P. pastoris se digirieron con enzimas de restricción Bsal-HF y los productos bicatenarios de las reacciones de Uización se subclonaron luego en los vectores linealizados de P. pastoris usando procedimientos estándar. Luego de verificar las secuencias de los cuatro subclones, se transfornaron alícuotas de plásmido mediante electroporación en la cepa P. pastoris, Bg08. La levadura transformada resultante, seleccionada según la resistencia a la Zeocina o G418 que le confirieron los elementos con transformación genética en vectores pJUZaKR y pJUGaKR se cultivaron y analizaron como se describe a continuación. Debido a que ninguna cepa de transformante tenía más de un marcador de resistencia antibiótica y debido a que los procedimientos de transformación se realizaron de igual forma para las células de levadura transformadas con el transgén de U+2-ACTX-Hvla que para las transformadas con el transgén de U-ACTX-Hvla natural, resulta razonable suponer que las distribuciones de la cantidad de copias transgénicas fueron comparables para las dos poblaciones de transformantes que se comparan a continuación.

Las recetas para los medios y soluciones madre que se utilizaron para los cultivos de P. pastoris se describen de la siguiente forma: Receta del medio MSM 2 g/L de dihidrato de citrato de sodio 1 g/L de dihidrato de sulfato de calcio (0,79 g/L de sulfato de calcio anhidro) 42,9 g/L de fosfato de potasio monobásico 5,17 g/L de sulfato de amonio 14,33 g/L de sulfato de potasio 11,7 g/L de heptahidrato de sulfato de magnesio 2 mL/L de solución salina traza PTM1 0,4 ppm de biotina (de 500X, solución madre de 200 ppm) 1-2 % de glicerol puro u otra fuente de carbono Solución de sales traza PTM1: 6.0 g de sulfato cúprico-5H2O 0,08 g de yoduro de sodio 3.0 g de sulfato de manganeso-H20 0,2 g de molibdato de sodio-2H2O 0,02 g de ácido bórico 0,5 g de cloruro de cobalto 20.0 g de cloruro de cinc 65.0 g de sulfato ferroso-7H20 0,2 g de biotina 5.0 mi de ácido sulfúrico Agregar agua hasta un volumen final de 1 litro Se utilizaron placas de pocilios profundos de 48 pocilios, selladas luego de la inoculación con cinta estéril permeable al aire, para cultivar los transformantes P. pastoris del péptido insecticida. Se tomaron las colonias en las placas de transformante P. pastoris y se inocularon las placas de pocilios profundos con 1 mL de medio por pocilio, compuesto por MSM + 0,2 % de PTM1 + biotina (500X diluido de 200 ppm de solución madre) + 1 % de glicerol (puro). Las placas inoculadas se cultivaron 5 días a 23,5 °C con agitación a 220 rpm en un agitador-incubadora con refrigeración. Se agregaron 100 mL de glicerol al 5 % a cada pocilio de las placas a los 2, 3 y 4 días después de la inoculación. Al día 5 después de la inoculación, el medio acondicionado se cosechó mediante centrifugación a 3700 rpm durante 15 minutos, seguido por filtración usando una placa de filtro con una membrana de 0,22 mM. Se almacenó medio filtrado a -20 °C para análisis adicionales .

Se analizaron alícuotas de 0,3 mL de medio de P. pastoris acondicionado preparado como se describió anteriormente usando rpHPLC descrita en el EJEMPLO 1 para determinar las concentraciones del péptido U-ACTX-Hvla natural o U+2-ACTX-Hvla presente en el medio. Los resultados de este análisis se resumen en la Tabla 2 y las Fig. 15 y Fig.16. Los rendimientos peptídicos promedio con una desviación estándar y media común son 67,0 ± 27,9 mg/L para las cepas P. pastoris de U+2-ACTX-Hvla y 42,9 ± 18,3 mg/L para las cepas de U-ACTX-Hvla natural. Una prueba t de Student indicó que la probabilidad de distribuciones de rendimientos tan diferentes se encuentra muy por debajo del 1 %. El rendimiento mediano de las cepas de U+2-ACTX-Hvla fue de 79,0 mg/L, muy superior al de las cepas de U-ACTX-Hvla natural (44,7 mg/L). Se observa que las cepas de U+2-ACTX-Hvla tuvieron proporciones de los conteos de la cepa a un nivel de alto rendimiento peptídico muy superiores a las cepas de U-ACTX-Hvla natural. Todos estos resultados avalan la conclusión de que el dipéptido de glicina-serina extra en el N-terminal del U+2-ACTX-Hvla mejoró considerablemente la capacidad de los transformantes de levadura de producir este péptido y secretarlo en medio acondicionado.

La Tabla 2 muestra una comparación de los rendimientos peptídicos de las cepas P. pastoris .

Tabla 2. Comparación del rendimiento peptídico de U+2 y U-ACTX-Hvla natural EJEMPLO 3 Expresión de una de las toxinas de anémona tipo 3 descubiertas a partir de la Anemone viridis , Av3 natural y Av3+2 en la cepa de levadura Kluyveromyces lactis Péptidos insecticidas que se desea expresar: Av3+2: GSRSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NO.29) Av3 natural: RSCCPCYWGGCPWGQNCYPEGCSGPKV (SEQ ID NO.30).

Para expresar los dos péptidos CRIP que no son de ICK precedentes en Kluyveromyces lactis, se usaron el vector pKLACl y la cepa Kluyveromyces lactis, YCT306, como en el ejemplo 1.

El ORF del péptido Av3 y Av3+2, que codifica a-MF: :sitio de escisión de Kex2::Av3 (o Av3+2) se sometió a optimización de codones usando el algoritmo de expresión de K. lactis determinado previamente.

La secuencia del ORF de expresión de Av3+2 optimizada es la siguiente: AAGCTTGAAAAAAATGAAATTTTCCACTATTTTAGCAGCATCTACAGCTTTAATC AGTGTTGTCATGGCTGCACCTGTGAGTACCGAAACAGATATAGACGACCTTCCAATCTCTG TTCCAGAAGAGGCTTTGATAGGATTCATCGATTTGACTGGTGATGAAGTTTGATTGTTACC AGTGAATAATGGTACCCATACTGGTATTTTGTTCCTAAACACCACAATTGCTGAAGCTGCT TTTGCAGATAAGGATGATTTGGAGAAAAGAGGTTCTAGATCATGCTGCCCTTGTTACTGGG GTGGTTGTCCATGGGGACAAAACTGTTATCCTGAAGGATGTTCTGGTCCAAAGGTATGAGC GGCCGC (SEQ ID NO.31).

Esta secuencia de ADN optimizada se clonó en el vector pKLACl usando los sitios de restricción Hind III y Not I, lo cual produjo el vector de expresión de Av3+2, pLB102.

La secuencia del ORF de expresión de Av3 natural optimizada es la siguiente: AAGCTTGAAAAAAATGAAATTTTCCACAATCTTAGCTGCAAGTACTGCTCTTATT TCTGTTGTGATGGCTGCTCCAGTATCTACCGAAACAGATATCGATGATTTGCCAATTTCAG TCCCTGAAGAGGCACTAATCGGATTCATTGACTTAACCGGTGATGAAGTGAGTTTGTTGCC AGTTAACAACGGTACTCATACAGGTATATTGTTTTTGAATACCACTATAGCTGAAGCAGCA TTCGCTGATAAAGATGACTTAGAAAAGAGAAGATCATGCTGCCCTTGTTACTGGGGTGGTT GTCCATGGGGTCAAAATTGTTATCCAGAGGGTTGTTCTGGACCTAAGGTTTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO.32).

Esta secuencia de ADN optimizada se clonó en el vector pKLACl usando los sitios de restricción Hind III y Not I, lo cual produjo el vector de expresión de Av3 natural, pLB103.

Los vectores de expresión, pLB102 y pLB103, luego se linealizaron usando endonucleasa de restricción de Sac II y se transformaron en la cepa YCT306 de K. lactis usando el método de transformación por electroporación. Los transformantes resultantes crecieron en una placa de agar YCB complementada con 5 mM de acetamida, que solamente podrían usar eficazmente los transformantes que expresan acetamidasa como una fuente metabólica de nitrógeno.

Para las evaluaciones del rendimiento del péptido insecticida, se tomaron 48 colonias de transformantes de pLB102 y 48 colonias de transformantes de pLB103 y se inocularon con 2,2 mL del medio de K. lactis definido con 2 % de sorbitol agregado como fuente de carbono en placas de pocilios profundos de 48 pocilios con una capacidad de 5 mL de volumen de cada pocilio. Los cultivos se procesaron a 23,5 °C con agitación a 280 rpm durante seis días, cuando se determinaron las densidades celulares en los cultivos mediante absorbencia de luz a 600 nm (OD600). Las células luego se retiraron de los cultivos mediante centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos. Los sobrenadantes resultantes (medio acondicionado) se filtraron a través de membranas de 0,2 mm para el análisis de rendimiento mediante HPLC.

Para la evaluación del rendimiento peptídico, las muestras de medio acondicionado filtrado se analizaron en un sistema de HPLC Agilent 1100 equipado con una columna de HPLC analítica de fase inversa C18 de 4,5 x 100 mm monolítica Onyx y un auto-inyector. El agua y acetonitrilo de grado de HPLC, ambos con 0,1 % de ácido trifluoroacético, constituyeron los dos solventes de fase móvil que se utilizaron para los análisis de HPLC. Las áreas pico del Av3 natural o Av3+2 en las cromatografías HPLC resultantes se usaron como indicación de la concentración peptídica en el medio acondicionado, que luego se normalizaron adicionalmente hasta las densidades celulares finales correspondientes (según se determinó a través de mediciones de OD600) como rendimiento peptídico normalizado.

La Tabla 3, la Fig. 17 y la Fig. 18 resumen las distribuciones de rendimiento peptídico normalizado de Av3+2 y Av3 natural de las cepas K. lactis. El rendimiento peptídico normalizado se representa mediante el área pico UV del péptido en la cromatografía HPLC dividida entre la densidad celular correspondiente (representada por la OD600) al final del cultivo celular. El rendimiento peptídico normalizado general promedio de cepas de Av3+2 fue de 117,5 ± 50,1 mAu.seg/A, lo cual fue considerablemente superior en términos estadísticos que el del Av3 natural, 29,8 ± 16,1 mAu.seg/A, mediante la prueba t de Student con un nivel de confianza del 99 %. El rendimiento peptídico normalizado mediano de las cepas de K. lactis Av3+2 fue de 106,7 mAu.seg/A, más de tres veces superior al de las cepas de Av3 natural (31,7 mAu.seg/A). Las cepas de expresión de Av3+2 tuvieron proporciones muy superiores de los conteos de la cepa a un nivel de rendimiento elevado que las cepas de Av3 natural (tabla 3). Y como se muestra en la Figura 18, en líneas generales en cualquier percentil de rendimiento peptídico, las cepas de Av3+2 tuvieron un rendimiento superior a las cepas de Av3 natural. Todos estos resultados indicaron que la adición del dipéptido de glicina-serina al N-terminal del péptido Av3 contribuye a una mejora considerable del rendimiento peptídico de los transformantes de levadura que expresan este péptido.

Tabla 3. Comparación del rendimiento peptídico de Av3+2 y Av3 natural Cultivos e insectos Los cultivos e insectos específicos que se pueden controlar con estos métodos incluyen los siguientes: La presente invención se puede usar para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, de modo no taxativo, monocotiledónea y dicotiledónea. Los cultivos para los cuales un enfoque transgénico o PEP sería un enfoque especialmente útil incluyen, de modo no taxativo: alfalfa, algodón, tomate, maíz, trigo, cereales, maíz dulce, soja, sorgo, guisante forrajero, linaza, cártamo, colza, arroz, soja, cebada, girasol, árboles (incluyendo coniferas y de hoja caduca), flores (incluyendo aquellas que se cultivan de forma comercial y en invernaderos), lupinos silvestres, pasto varilla, caña de azúcar, patatas, tomates, tabaco, cruciferas, pimientos, remolacha, cebada y colaza, Brassica sp. , centeno, mijo, cacahuates, batatas, mandioca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, banana, palta, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, vegetales, plantas ornamentales y coniferas.

"Plaga" incluye, de modo no taxativo: insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares.

Las plagas de insectos incluyen, de modo no taxativo, insectos que se seleccionan de los órdenes coleóptero, díptero, himenóptero, lepidóptero, malófago, homóptero, hemíptero, ortóptero, tisanóptero, dermáptero, isóptero, anopluros, sifonáptero, tricóptero y similares. De manera más particular, las plagas de insectos incluyen Coleópteros, Lepidópteros y Dípteros.

Los insectos de importancia agrícola, doméstica y/o médica/veterinaria adecuada para el tratamiento con los polipéptidos insecticidas incluyen, de modo no taxativo, miembros de las siguientes clases y órdenes: El orden de Coleópteros incluye los subórdenes Adéfagos y Polífagos. El suborden de Adéfagos incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea. El suborden de Polífagos incluye las superfamilias de Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae . La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae . La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

Los ejemplos de Coleópteros incluyen, de modo no taxativo: gorgojo del frijol americano Acanthoscelides obtectus, el escarabajo de la hoja Agelastica alni , escarabajos de resorte ( Agriotes lineatus , Agriotes obscurus, Agriotes bicolor) , el escarabajo foráneo de los granos Ahasverus advena, el abejorro de junio Amphimallon solstitialis , el escarabajo de la madera Anobium punctatum, Anthonomus spp. (gorgojos), la atomaria de la remolacha Atomaria linearis, escarabajos de las alfombras (Anthrenus spp., Attagenus spp.), el gorgojo del guisante Callosobruchus maculates , el escarabajo de la fruta seca Carpophilus hemipterus, el gorgojo de las silicuas Ceutorhynchus assimilis , el gorgojo de la yema terminal Ceutorhynchus picitarsis, los gusanos de elatéridos Conoderus vespertinus y Conoderus fallí, el gorgojo negro del banano Cosmopolites sordidus, el escarabajo de pastizal de Nueva Zelanda Costelytra zealandica, el escarabajo verde de junio Cotinis nítida, el gorgojo del tallo de girasol Cylindrocopturus adspersus, el escarabajo de las despensas Dermestes lardarius, los gusanos alfilerillos del maíz Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, y Diabrotica barberi, el escarabajo mexicano del frijol Epilachna varivestis, el Capricornio doméstico Hylotropes bajulus, el gorgojo de la alfalfa Hypera postica, el escarabajo araña brillante Gibbium psylloides , el gorgojo del tabaco Lasioderma serricorne, el escarabajo de la patata de Colorado Leptinotarsa decemlineata, escarabajos Lyctus (Lyctus spp.), el escarabajo del polen Meligethes aeneus, el aherrojo común Melolontha melolontha, el escarabajo araña americano Mezium americanum, el escarabajo araña dorado Niptus hololeucus, los gorgojos forasteros de los granos Oryzaephilus surinamensis y Oryzaephilus mercator, el gorgojo negro de la vid Otiorhynchus sulcatus , el escarabajo de la mostaza Phaedon cochleariae, el escarabajo pulgón Phyllotreta cruciferae, la pulguilla bandeada de las cruciferas Phyllotreta striolata, la pulguilla de la colza Psylliodes chrysocephala, Ptinus spp. (escarabajos araña), el pequeño barrenador de los granos Rhizopertha dominica, la sitona de las leguminosas Sitona lineatus , los gorgojos del arroz Sitophilus oryzae y Sitophilus granar es, el picudo rojo de la semilla de girasol Smicronyx fulvus, el gorgojo del pan Stegobium paniceum, el gusano amarillo de la harina Tenehrio molitor, los falsos gorgojos de la harina Tribolium castaneum y Tribolium confusum, escarabajos de almacén y cabinete (Trogoderma spp.) y el escarabajo del girasol Zygogramma exclamationis .

Los ejemplos de Dermápteros (tijeretas) incluyen, de modo no taxativo: la tijereta europea Forfícula auricularia y la tijereta rayada Labidura riparia .

Los ejemplos de Dictiópteros incluyen, de modo no taxativo: la cucaracha oriental Blatta orientalis , la cucaracha alemana filatelia germánica, la cucaracha de Madeira Leucophaea maderae, la cucaracha americana Periplaneta americana, y la cucaracha café ahumada Periplaneta fuliginosa .

Los ejemplos de Diplópodos incluyen, de modo no taxativo: el milpiés serpiente manchado Blaniulus guttulatus , el milpiés de espalda plana Brachydesmus superus, y el milpiés de invernadero Oxidus gracilis .

El orden de Dípteros incluye los subórdenes Nematóceros, Braquíceros y Ciclorrafos. El suborden de nematóceros incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, y Cecidomyiidae . El suborden de braquíceros incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, y Dolichopodidae. El suborden de ciclorrafos incluye las divisiones Aschiza y Aschiza. La división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae y Drosophilidae . La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

Los ejemplos de Dípteros incluyen, de modo no taxativo: la mosca doméstica ( Musca domestica) , la mosca tumbu africana (Cordylobia anthropophaga) , mosquitos mordedores (Culicoides spp .), piojo de las abejas (Braula spp.), la mosca de la remolacha Pegomyia betae, moscas negras (Cnephia spp. , Eusimulium spp., Simulium spp.), tábanos (Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Oestrus spp.), típulas (Típula spp.). jejenes de los ojos (Hippelates spp.), moscas de la inmundicia (Calliphora spp., Fannia spp. , Hermetia spp., Lucilia spp., Musca spp., Muscina spp., Phaenicia spp., Phormia spp.), moscas de la carne (Sarcophaga spp., Wohlfahrtia spp.); la mosquita de la cebada y la avena Oscinella frit, moscas de la fruta (Dacus spp., Drosophila spp.), moscas de cabeza (Hydrotea spp.), la mosca de Hess Mayetiola destructor, moscas de los cuernos y búfalos (Haematobia spp.), moscas de los caballos y venados (Chrysops spp., Haematopota spp., Tabanus spp.), moscas araña (Lipoptena spp., Lynchia spp., y Pseudolynchia spp.), mosca de la fruta del Mediterráneo (Ceratitus spp.), mosquitos (Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Psorophora spp.), moscas de arena (Phlebotomus spp., Lutzomyia -spp. ) , mosca gusanera (Chtysomya bezziana y Cochliomyia hominivorax) , garrapatas de las ovejas (Melophagus spp.); moscas de establo (Stomoxys spp.), moscas tse-tse (Glossina spp.) y moscas de los barros (Hypoderma spp.).

Los ejemplos de Isópteros (termitas) incluyen, de modo no taxativo: especies de las familias Hodotennitidae , Kalotermitidae, Mastotermitidae, Rhinotennitidae, Serritermitidae, Termitidae, Termopsidae.

Ejemplos de Heterópteros incluyen, de modo no taxativo: la chinche Cimex lectularius , chinche tintóreo Dysdercus intermedius, la plaga sunn Eurygaster integriceps, la chinche opaca de las plantas Lygus lineolaris, la chinche verde del arroz Nezara antennata, la chinche verde Nezara viridula y las vinchucas Panstrogylus megistus, Rhodnius ecuadoriensis, Rhodnius pallescans, Rhodnius prolixus, Rhodnius robustus, Triatoma dimidiata, Triatoma infestans y Triatoma sórdida.

Los ejemplos de Homópteros incluyen, de modo no taxativo: el piojo rojo de California Aonidiella aurantii , el pulgón negro de las habas Aphis fabae, el pulgón del algodón Aphis gossypii, el pulgón verde del manzano Aphis pomi, la mosca blanca espinosa de los cítricos Aleurocanthus spiniferus, el piojo blanco Aspidiotus hederae, la mosca blanca del boniato Bemesia tabaci, el pulgón ceniciento de la col Brevicoryne brassicae , el psílido del peral Cacopsylla pyricola, el pulgón del grosellero Cryptomyzus ribis, la filoxera de la vid Daktulosphaira vitifoliae, el psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, la chicharrita de la papa Empoasca fabae, la chicharrita del frijol Empoasca solana, el mosquito verde de la vid Empoasca vitis, el pulgón lanígero del manzano Eriosoma lanigerum, la cochinilla ostreiforme Eulecanium corni, el pulgón verde harinoso del ciruelo Hyalopterus arundinis, el pequeño saltahojas del arroz Laodelphax striatellus , el pulgón de la patata Macrosiphum euphorbiae, el pulgón verde del durazno Myzus persicae, el pulgón verde del melocotonero Nephotettix cinticeps , el saltahojas del arroz Nilaparvata lugens, áfidos de la raíz (Pemphigus spp.), el pulgón del lúpulo Phorodon humuli, el pulgón de la avena Rhopalosiphum padi, la caparreta negra Saissetia oleae, el pulgón verde de los cereales Schizaphis graminum, el pulgón de la espiga Sitobion avenae y la mosca blanca de los hinvernaderos Trialeurodes vaporari orum .

Los ejemplos de Isópodos incluyen, de modo no taxativo: la cochinilla píldora Armadillidium vulgare y la cochinilla común Oniscus asellus.

El orden de Lepidópteros incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, y Tineidae.

Los ejemplos de Lepidópteros incluyen, de modo no taxativo: Adoxophyes orana (oruga de la piel de los frutos), Agrotis ipsolon (gusano cortador grasiento), Archips podana (tortrícido de los frutales), Bucculatrix pyrivorella (desfoliador de las hojas del peral) , Bucculatrix thurberiella (perforador de las hojas de algodón), Bupalus piniarius (geómetra del pino), Carpocapsa pomonella (gusano de la pera y la manzana), Chilo suppressalis (barrenador del arroz), Choristoneura f miferana (mariposa tortrícida del este), Cochylis hospes (polilla rayada del girasol), Diatraea grandiosella (perforador del maíz), Earias insulana (gusano de las cápsulas de algodón), Euphestia kuehniella (mariposa mediterránea de la harina), Eupoecilia ambiguella (polilla de la vid), Euproctis chrysorrhoea (oruga de zurrón), Euproctis subflava (polilla oriental de la hierba), Gallería mellonella (polilla de la cera), Helicoverpa armígera (larva de mariposa de algodón) , Helicoverpa zea (gusano de la bellota) , Heliothis virescens (larva de mariposa del tabaco) , Hofmannophila pseudopretella (polilla doméstica parda) , Homeosoma electellum (mariposa del girasol), Homona magnánima (mariposa tortrícida oriental del árbol de té), Lithocolletis blancardella (minador punteado), Lymantria dispar (polilla gitana), Malacosoma neustria (oruga de libreaj, Mamestra brassicae (polilla de la col), Mamestra configurata (gusano de polilla Bertha), los gusanos picudos Manduca sexta y Manuduca quinquemaculata, Operophtera brumata (polilla invernal), Ostrinia nubilalis (perforador de maíz europeo), Panolis flammea (polilla de la belleza del pino) , Pectinophora gossypiella (gusano rosado), Phyllocnistis citrella (minador de los cítricos), Pieris brassicae (oruga blanca de la col), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Rachiplusia ni (oruga medidora), Spilosoma virginica (gata peluda norteamericana), Spodoptera exigua (rosquilla verde), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero del maíz) , Spodoptera littoralis (rosquilla negra) , Spodoptera litura (gusano gris del tabaco) , Spodoptera praefica (gusano trozador del algodón), Sylepta derogata (cigarrero del algodón), Tineola bisselliella (mariposa tejedora), Tineola pellionella (polilla del estuche), Tortrix viridana (lagarta verde del encinar), Trichoplusia ni (oruga del repollo) e Yponomeuta padella (arañuelo del ciruelo).

Los ejemplos de Ortópteros incluyen, de modo no taxativo: el grillo común Acheta domesticus, saltamontes (Anacridium spp.), la langosta migratoria Locusta migratoria, el saltamontes de dos rayas Melanoplus bivittatus , el saltamontes diferencial Melanoplus dfferentialis, el saltamontes de patas rojas Melanoplus femurrubrum, el saltamontes migratorio Melanoplus sanguinipes, el grillo topo del norte Neocurtilla hexadectyla, la langosta roja Nomadacris septemfasciata, el grillo topo de alas cortas Scapteriscus abbreviatus, el grillo topo del sur Scapteriscus borellii , el grillo topo Scapteriscus vicinus, y la langosta del desierto Schistocerca gregaria .

Los ejemplos de Ftirápteros incluyen, de modo no taxativo: el piojo del pelo de los bovinos Bovicola bovis, los piojos mordedores (Damalinia spp.), el piojo del gato Felicola subrostrata, el piojo azul de cabeza corta Haematopinus eloysternus , el piojo de la cola del ganado Haematopinus quadriperiussus , el piojo del cerdo Haematopinus suis, el piojo del cuerpo de las ovejas Linognathus ovillus, el piojo de la pezuña de las ovejas Linognathus pedalis, el piojo chupador del perro Linognathus setosus , el piojo azul de cabeza larga Linognathus vituli, el piojo del cuerpo de la gallina Menacanthus stramineus , el piojo del raquis de la gallina Menopon gallinae, el piojo del cuerpo humano Pediculus humanus, la ladilla Phthirus pubis, el piojo del ganado vacuno Solenopotes capillatus y el piojo canino Trichodectes canis.

Los ejemplos de Psocópteros incluyen, de modo no taxativo: los piojos de los libros Liposcelis bostrychophila, Liposcelis decolor, Liposcelis entomophila y Trogium pulsatorium.

Los ejemplos de Sifonápteros incluyen, de modo no taxativo: la pulga de las aves Ceratophyllus gallinae, la pulga del perro Ctenocephalides canis, la pulga del gato Ctenocephalides fells, la pulga humana Pulex irritans y la pulga de la rata oriental Xenopsylla cheopis .

Los ejemplos de Sínfilos incluyen, de modo no taxativo: la escutígera Scutigerella immaculate.

Los ejemplos de Tisanuros incluyen, de modo no taxativo: el pececillo de plata gris Ctenolepisma longicaudata, el pececillo de plata de cuatro franjas Ctenolepisma quadriseriata, el pececillo de plata común Lepisma saccharina y el insecto de fuego Thennobia domestica .

Los ejemplos de Tisanópteros incluyen, de modo no taxativo: el trips del tabaco Frankliniella fusca, el trips de las flores Frankliniella intonsa, el trips occidental de las flores Frankliniella occidentalis, el trips del tomate Frankliniella schultzei , el trips de la platanera Hercinothrips femoralis , el trips de la soja Neohydatothrips variabilis, trips de los cítricos Pezothrips kellyanus, el trips de la palta Scirtothrips perseae, el trips del melón Thrips palmi y el trips de la cebolla Thrips tabaci .

Los ejemplos de Nematodos incluyen, de modo no taxativo: nematodos parásitos como nematodos de anguilulosis, quiste y lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; en particular los miembros de los nematodos de quistes, incluyendo, de modo no taxativo: Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja) ; Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la papa). Los ejemplos de nematodos de lesión incluyen, de modo no taxativo: Pratylenchus spp.

En una modalidad, las composiciones insecticidas que comprenden polipéptidos, polinucleótidos, células, vectores, etc. se pueden utilizar para tratar ectoparásitos . Los ectoparásitos incluyen, de modo no taxativo: pulgas, garrapatas, sarna, ácaros, mosquitos, moscas molestas y mordedoras, piojos y combinaciones que comprenden uno o más de los ectoparásitos precedentes. El término "pulgas" incluye las especies habituales o accidentales de pulgas parasitarias del orden de Sifonápteros y, en particular, las especies Ctenocephalides , en particular C fells y C. cams, pulgas de ratas ( Xenopsylla cheopis) y pulgas de humanos (Pulex irritans) .

Las plagas de insectos de la invención para los cultivos principales incluyen, de modo no taxativo: Maíz: Ostrinia nubilalis, taladro del maíz; Agrotis ípsilon, gusano cortador; Helicoverpa zea, gusano elotero; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea grandiosella, gusano barrenador del maíz; Elasmopalpus lignosellus , gusano saltarín; Diatraea saccharalis , barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano alfilercillo del maíz; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz; Diabrotica undec impune tata howardi , doradilla; Melanotus spp., eláteros; Cyclocephala borealis, escarabajo enmascarado norteño (larva blanca); Cyclocephala immaculata, escarabajo enmascarado sureño (larva blanca); Popillia japónica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulga negra del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón del follaje; Anuraphis maidiradicis , pulgón radicular del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los granos de cereales; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, gusano de las semillas en germinación; Agromyza parvicornis , minador de la hoja de maíz; Anaphothrips obscrurus, trips del césped; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae , ácaro de dos puntos; Sorgo: Chilo partellus , perforador manchado del tallo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano elotero; Elasmopalpus lignosellus , gusano saltarín; Feltia subterr nea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, gallina ciega; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., eláteros; Oulema melanopus, babosilla de la hoja; Chaetocnema pulicaria, pulga negra del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón del follaje; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los granos de cereales; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus c innabar inus , arañuela roja común; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus , gusano saltarín; Agrotis orthogonia, gusano cortador pálido; Elasmopalpus lignosellus , gusano saltarín; Oulema melanopus, babosilla de la hoja; Hypera punctata, picudo del trébol; Diabrotica undec impune tata howardi , gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, pulgón del follaje del trigo; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga del trigo; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca del trigo; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, mosca del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, avispa del tallo del trigo; Acería tulipae, ácaro del trigo rizo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de la yema del girasol; Homoeosoma electellum, palomilla de la cabeza del girasol; Zygogramma exclamationis , escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquita del girasol; Algodón : Heliothis virescens , larva de mariposa del tabaco; Helicoverpa zea, larva de mariposa del algodón; Spodoptera exigua, gardama; Pectinophora gossypiella, gusano rosado del algodonero; Anthonomus granáis, picudo del algodonero; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltona del algodonero; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de alas manchadas; Lygus lineolaris, Chinche lygus; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci , trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus , arañuela roja común; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Arroz: Diatraea saccharalis , barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, larva de mariposa del algodón; Colaspis brunnea, esqueletonizador de la vid; Lissorhoptrus oryzophilus, picudo acuático del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix. nigropictus , chicharrita del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los granos de cereales; Acrosternum hilare, chinches apestosas verdes; Soja: Pseudoplusia includens, falso medidor de la soja; Anticarsia gemmatalis , gusano terciopelo; Plathypena scabra, gusano verde de la soja; Ostrinia nubilalis , barrenador europeo del maíz; Agrotis Ípsilon, gusano cortador; Spodoptera exigua, gardama; Heliothis virescens, larva de mariposa del tabaco; Helicoverpa zea, larva de mariposa del algodón; Epilachna varivestis, Capricornio doméstico; Myzus persicae, pulgón verde del melocotonero; Empoasca fabae, chicharrita de la papa; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, gusano de las semillas en germinación; Sericothrips variabilis , trips en soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña roja de la fresa; Tetranychus urticae, ácaro de dos puntos; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ípsilon, gusano cortador; Schizaphis graminu , pulgón del follaje del trigo; Blissus leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los granos de cereales; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Euschistus servus, chinche apestosa café; Delia platura, gusano de las semillas en germinación; Mayetiola destructor, mosca del trigo; Petrobia latens , araña café del trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgón del repollo; Phyllotreta cruciferae, pulguilla de las cruciferas; Mamestra configurata , gusano de polilla Bertha; Plutella xylostella, palomilla dorso de diamante; Delia ssp., mosca de la raíz.

En algunas modalidades, las composiciones insecticidas se pueden utilizar para tratar combinaciones que comprenden uno o más de los insectos anteriores.

Los insectos susceptibles a los péptidos de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, los siguientes: Las toxinas Cyt afectan familias como: Blattaria, Coleóptera, Collembola, Díptera, Echinostomida, Hemiptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Neuroptera, Orthoptera, Rhabditida, Siphonoptera, Thysanoptera. Los géneros-especies se indican a continuación: Actebia-f ennica, Agrotis- ípsilon, A. -sege tum, Anticarsia-gemmatalis , Argyrotaenia-citrana, Artogeia-rapae , Bombyx - morí, Busseola- fusca, Cacyreus-marshall , Chilo-suppressalis , Christoneura-fumiferana, C. -occidentalis , C. -pinus pinus, C. -rosacena, Cnaphalocrocis-medinalis , Conopomorpha-cramerella, Ctenopsuestis-obliquana, Cydia-pomonella, Danaus- plexippus , Diatraea- saccharallis , D. -grandiosella, Earias-vittella, Elasmolpalpus-lignoselius , Eldana-saccharina, Ephestia-kuehniella, Epinotia-aporema, Epiphyas -pos tvit tana, Galleria-mellonella, Genero - Especie, Helicoverpa- zea , H. -punctigera, H. -armígera, Heliothis-virescens , Hyphantria- cunea, Lambdina-fiscellaria, Legu inivora-glycinivorella, Lobesia-botrana, Lymantria-dispar, Malacosoma-disstria, Mamestra-brassicae , M. configurata, Manduca- sexta, Marasmia-patnalis , Maruca-vitrata, Orgyia-leucostigma, Ostrinia-nubilalis , O. -furnacalis, Pandemis-pyrusana, Pectinophora-gossypiella, Perileucoptera-coffeella, Phthorimaea-opercullela, Pianotortrix-octo, Piatynota-stultana, Pieris-brassicae, Plodia-interpunctala, Plutella-xylostella, Pseudoplusia-includens, Rachiplusia-nu, Sciropophaga-incertulas , Sesamia-calamistis , Spiloso a- virginica, Spodoptera- exigua, S. -frugiperda, S. -littoralis, S. -exempta, S. -litura, Tecia-solanivora, Thaumetopoea-pityocampa, Trichoplusia-ni , Wiseana-cervinata, Wiseana- copular is , Wiseana- jocosa, Blattaria-Blattella, Collembola-Xenylla, C. -Folsomia, Echinostomida-Fasciola, Hemiptera-Oncopeltrus , He. -Bemisia, He . -Macrosiphum, He . -Rhopalosiphum, He . -Myzus, Hymenoptera-Diprion, Hy. -Apis, Hy. -Macrocentrus , Hy. -Meteorus , Hy. - - Rhabitida-Acrobeloides , R. -Caenorhabditis, R. -Distolabrellus, R. -Panagrellus, R. -Pristionchus , R. -Pratylenchus , R. -Ancylostoma, R. -Nippostrongylus , R . -Panagrellus , R. - Haemonchus, R. -Meloidogyne y Siphonaptera-Ctenocephalides .

Se describe la Parte II con la siguiente descripción y resumen: Se describe un péptido con un dipéptido en el N-terminal que se agrega y une operativamente a un péptido conocido, donde el dipéptido en el N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, donde el péptido se selecciona de un CRIP (péptido insecticida rico en cisteína), tal como un péptido de ICK, o un péptido que no es de ICK. El dipéptido del N-terminal que se agrega y une operativamente a un péptido conocido, donde el dipéptido del N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. El dipéptido del N-terminal tiene un aminoácido no polar como aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal que se puede seleccionar de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y un aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se puede seleccionar de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina.

El dipéptido del N-terminal puede tener un aminoácido no polar como aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal que se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y el aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se selecciona de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina. El dipéptido del N-terminal puede estar y preferentemente está compuesto por glicina-serina.

Se describe un péptido con un dipéptido en el N-terminal que se agrega y une operativamente a un péptido conocido, donde el dipéptido en el N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, donde el péptido se selecciona de una PFIP (proteína insecticida formadora de poros) o se puede seleccionar de un CRIP (péptido insecticida rico en cisteína), tal como un péptido de ICK, o un péptido que no es de ICK. El péptido que no es de ICK podría ser un origen peptídico de anémona tipo Av2 o Av3 y el dipéptido preferido está compuesto por glicina-serina. El péptido de ICK podría ser de una araña como los péptidos de ACTX y el dipéptido preferido está compuesto por glicina-serina. La PFIP podría ser una proteína de Bt, como cualquiera de las descritas en la presente, en el listado de secuencias y conocidas por el experto en la téenica que lee la presente descripción y el dipéptido preferido está compuesto por glicina-serina.

Tal como se indicó anteriormente, se explica que el dipéptido del N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido y el aminoácido no polar del aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal se puede seleccionar de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y, preferentemente, el aminoácido no polar es glicina. Asimismo se explica y reivindica que cualquiera de los péptidos en el párrafo a continuación y cualquiera de los péptidos en el presente párrafo pueden actuar de forma independiente y se deberían tratar de forma independiente; todas las combinaciones posibles se reivindican de forma independiente.

Tal como se indicó anteriormente, se explica que el dipéptido del N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido y el aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se puede seleccionar de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina y, preferentemente, el aminoácido polar es serina. Asimismo se explica y reivindica que cualquiera de los péptidos en el párrafo precedente y cualquiera de los péptidos en el presente párrafo pueden actuar de forma independiente y se deberían tratar de forma independiente; todas las combinaciones posibles se reivindican de forma independiente.

El péptido al que se une el dipéptido del N-terminal puede ser cualquier péptido, cualquier péptido tóxico, cualquier péptido insecticida, cualquier PFIP, cualquier CRIP, un CRIP que es un péptido de ACTX (que es un ejemplo de un péptido de ICK), CRIP es un péptido de anémona (que es un ejemplo de un péptido de no es de ICK), puede ser una PFIP, la PFIP puede ser una proteína de Bt y la proteína de Bt puede ser cry, cyt, VIP y puede ser como cualquiera de estos péptidos tal como se describe en la presente o en el listado de secuencias o sabe el experto en la téenica que lee las presentes descripciones y comprende el documento.

Se hace referencia de forma específica a que estos procedimientos son útiles y se reivindican los procedimientos en sí mismos así como los productos de los procedimientos, en ambos casos como reivindicaciones independientes y como reivindicaciones de subproducto del proceso para realizar cualquier péptido insecticida y, en particular, cualquier péptido seleccionado de cualquiera de los péptidos o fuentes peptídicas incluyendo Atrax o Hadronyche, como se describe en la presente o en otro punto, así como cualquier péptido insecticida con fragmentos de estos, incluyendo versiones de pre y pro péptidos, así como péptidos maduros de los péptidos y números de secuencia y el péptido de la SEQ. ID. NO 5.

Estos péptidos son útiles y todos los procedimientos se pueden realizar y utilizar cuando hay un aminoácido no polar en el N-terminal terminal y un aminoácido polar en el C-terminal terminal, y el dipéptido de el aminoácido no polar se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y es preferentemente glicina o gly, y el aminoácido polar se selecciona de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano y tirosina y es preferentemente serina o ser. El dipéptido gly-ser es el más preferido. El dipéptido puede estar unido operativamente a cualquier péptido conocido, cualquier péptido tóxico, cualquier péptido insecticida, cualquiera de los péptidos incluyendo Atrax o Hadronyche, descritos en la presente, cualquier péptido insecticida con fragmentos de estos, incluyendo versiones pre y pro peptídicas y maduras de los péptidos y números de secuencia, cualquier péptido insecticida maduro, donde el péptido tóxico comprende la SEQ. ID. NO:6, o el péptido tóxico comprende GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO: 5) .

También se describe y reivindica el dipéptido Gly-Ser, nucleótidos que codifican el dipéptido Gly-Ser seleccionado de GGT, GGC, GGA, o GGG, cualquiera de los cuales codifica Gly, y TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, y AGC, cualquiera de los cuales codifica Ser y los nucleótidos enlazados a cualquiera de las proteínas y los procesos y productos de los procesos. Se describen y reivindican estos nucleótidos que codifican estos péptidos unidos operativamente al extremo 51 de la secuencia de ADN que codifica cualquier péptido descrito en la presente.

Se explica y describe un proceso para aumentar el rendimiento de péptidos insecticidas que se producen a partir de sistemas de expresión de levadura que comprenden la adición de cualquier dipéptido al N-terminal de cualquier péptido insecticida. El proceso y producto del proceso para aumentar el rendimiento utilizan el dipéptido tal como se indicó en los párrafos precedentes.

Se indican específicamente los procedimientos, productos, procesos y productos de procesos con cualquier péptido insecticida que inhibe tanto los canales de calcio regulados por voltaje como los canales de potasio activados con calcio en insectos, con orígenes peptídicos de cualquier especie de araña de Sídncy con tela en embudo, una araña que se selecciona de las arañas de Sídney de tela de embudo de los géneros Atrax o Hadronyche, incluyendo Hadronyche versuta. También se describen y reivindican específicamente péptidos insecticidas que no son péptidos del motivo de ICK como péptidos con orígenes de cualquier especie de anémona venenosa. Se hace referencia a las proteínas como ejemplos de péptidos del motivo de CRIP, que no son de ICK. Se han analizado y ahora se describen y muestra que los procedimientos funcionan con proteínas del género de anémonas A nemonia y, específicamente, de especies seleccionadas, Anemonia viridis . Se cree con determinada certeza científica que los métodos funcionarán con péptidos insecticidas que contienen 20 - 100 aminoácidos y 2 - 6 enlaces de disulfuro, así como con péptidos insecticidas que son cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, Av2 y Av3.

Se describen y reivindican de forma específica los procedimientos cuando se utilizan con cualquier especie de levadura, incluyendo, de modo no taxativo, cualquier especie de los géneros S aechar omyces, Pichia, Kluyveromyces , Hansenula, Yarrowia o Schizosacchar omyces y la especie Saccharomyces incluye cualquier especie de Saccharomyces , y preferentemente se describe la especie de Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae . Se describe específicamente la especie Saccharomyces cerevisiae seleccionada de las siguientes cepas: INVScl, YNN27, S150-2B, W303-1B, CG25, W3124, JRY188, BJ5464, AH22, GRF18, W303-1A y BJ3505. Se describe específicamente la especie Pichia incluyendo cualquier especie de Pichia y preferentemente la especie de Pichia, Pichia pastoris, y preferentemente Pichia pastoris se selecciona de las siguientes cepas: Bg08, Y-11430, X-33, GS115, GS190, JC220, JC254, GS200, JC227, JC300, JC301, JC302, JC303, JC304, JC305, JC306, JC307, JC308, YJN165, KM71, MC100-3, SMD1163, SMD1165, SMD1168, GS241, MS105, cualquier cepa que no exprese pep4 y cualquier cepa que no exprese prbl, y Pichia pastoris se selecciona de las siguientes cepas: Bg08, X-33, SMD1168 y KM71. Se describe específicamente la especie Kluyveromyces que incluye cualquier especie de Kluyveromyces, y preferentemente Kluyveromyces lactis, y se enseña que la cepa de Kluyveromyces lactis puede pero no es necesario que se seleccione de las siguientes cepas: GG799, YCT306, YCT284, YCT389, YCT390, YCT569, YCT598, MW98-8C, MSI, CBS293.91, Y721, MD2/1, PM6-7A, WM37, K6, K7, 22AR1, 22A295-1, SD11, MGl/2, MSK110, JA6, CMK5, HP101, HP108 y PM6-3C, además de la especie Kluyveromyces lactis que se selecciona de GG799 y YCT306.

Se describen y reivindican específicamente los procedimientos cuando se utilizan con cualquier especie de levadura, incluyendo, de modo no taxativo, cualquier especie de la especie Hansenula incluyendo cualquier especie de Hansenula y, preferentemente, Hansenula polymorpha . Se describen y reivindican específicamente los procedimientos cuando se utilizan con cualquier especie de levadura, incluyendo, de modo no taxativo, cualquier especie de la especie Yarrowia incluyendo cualquier especie de Yarrowia y, preferentemente, Yarrowia lipolytica . Se describen y reivindican específicamente los procedimientos cuando se utilizan con cualquier especie de levadura, incluyendo, de modo no taxativo, cualquier especie de la especie Schizosaccharomyces incluyendo cualquier especie de Schizosaccharomyces y, preferentemente, Schizosaccharomyces pombe.

PARTE 3. En esta parte se describen combinaciones de "CRIPS" y "PFIPS " Se caracterizaron una gran cantidad de péptidos venenosos como "insecticidas". No obstante, pese a los diversos informes, pocos han encontrado alguna utilidad en el mercado como insecticidas reales o eficaces. De hecho, solamente se ha indicado a w-ACTX-Hvla como tóxico mediante administración oral con respecto a la garrapata estrellada americana Amblyomma americanum. No se han indicado otras toxinas de aráenidos con actividad oral incluso en el intestino modificado de las garrapatas. Hay un informe que indica que se puede aumentar la biodisponibilidad de estos péptidos acoplándolos a una proteína portadora como la lectina de campanilla de invierno (aglutinina Galanthus nivalis, GNA). Mukherjee, A.K.: Sollod, B.L.; Wikel, S.K.; King, G.F. "Orally active acaricidal peptide tosins from spider venom." Toxicon 2006, 47, 182-187. Se indicó que las lectinas de ajo aumentan la absorción de toxinas en el intestino medio del insecto Fitches, E et. ál. Insect Sci . , 2008, 15, 483-495, Fitches, E., et. ál., Insect Biochem. Mol . Biol . 2008, 38, 905-915. Firches, E. et. ál.,J. Insect Physiol. 2004, 50, 61-71. Por ejemplo, la fusión de la toxina de aráenido insecticida U2-SGTX-Sfla (SFI1) con la GNA aumentó considerablemente su toxicidad oral con respecto a la oruga del tomate Laconobia olerácea Down, R.E. et. ál., Pest Manag. Sci . 2006, 62,77-85, así como el saltahojas café del arroz Nilaparvata lugens y el pulgón verde del melocotonero Myzus persicae. De manera sorprendente, se encontró que la proteína de fusión tiorredoxina-co-HXTX-Hvla era insecticida para las orugas Helicoverpa armígera y Spodoptera littoralis mediante aplicación tópica Khan, S. A. Transgenic Res.2006, 15, 349-357. (Si bien la proteína de fusión se aplicó de forma tópica en una solución que contenía niveles elevados de imidazol, un compuesto que se sabe que tiene actividad insecticida al contacto; Pence, R. J. California Agrie. 1965, 13-15. Estos intentos y hallazgos indican claramente la importancia del desarrollo de medios para potenciar la biodisponibilidad oral de toxinas venenosas. Se cree que estos intentos también se encuentran mal direccionados. En la presente descripción se enseña que la fusión de péptidos insecticidas con proteínas portadoras que se unen al intestino de insectos es innecesaria. Se describe una mejor forma para administrar la "toxina" en los péptidos insecticidas a insectos. Sin deseo de limitarse por la teoría, la teoría de los inventores es que las PFIP o proteínas insecticidas formadoras de poros actúan uniéndose de forma selectiva a receptores en el intestino del insecto. Luego, en eventos posteriores, las PFIP actúan alterando el potencial de la membrana de las células epiteliales que recubren el intestino. Cuando se introduce de forma oportuna también una CRIP o un TMOF adecuados en el intestino al mismo tiempo que las PFIP actúan en el intestino del insecto, el resultado es la apoptosis y muerte de las células que recubren el intestino. Por lo tanto, se perfora el recubrimiento intestinal y, de forma simultánea, los péptidos venenosos, a menudo péptidos grandes aislados del veneno, pueden pasar a través del intestino y enfermar o matar el insecto diana. De manera sorprendente, los insectos que desarrollaron resistencia a las proteínas de Bt no tienen defensas y no muestran resistencia en absoluto incluso a niveles bajos de Bt, cuando se administra una PFIP como Bt a un insecto en combinación con CRIP o TMOF, que es un péptido tóxico, pero uno con propiedades que no actúan como PFIP como Bt. Se proporcionan datos que muestran que determinadas combinaciones de CRIP y PFIP administrados de forma conjunta pueden proporcionar más del doble de potencia de muerte y detención de lo que se esperaría de aplicaciones de concentraciones similares de una CRIP o PFIP aplicada de forma individual.

Los ejemplos de una PFIP incluyen las proteínas cry y VIP de organismos de Bt. Las proteínas de Bt como las proteínas cry alteran la membrana intestinal del insecto y permiten la infección adventicia (sepsis) del insecto mediante la flora intestinal. En ausencia de microbios intestinales, Bt no es insecticida. Broderick, Nichole PNAS tomo 103, No.41 (2006). Por lo tanto, se esperaría que se mitiguen los mecanismos que se demuestra que provocan mortalidad de Bt (infección) en los insectos que presentan resistencia a Bt, y se mitiga en estos insectos. Los insectos resistentes a Bt muestran poca alteración intestinal incluso cuando se los alimenta con niveles elevados de proteínas de Bt, como cry. Lo que se descubrió de forma sorpresiva es que, de alguna forma, incluso si los intestinos de estos insectos ya no presentan los efectos dramáticos de Bt en el intestino, es decir que son verdaderamente resistentes, al exponerlos a péptidos insecticidas de un tipo determinado, como las CRIP y TMOF que tienen un modo de acción muy diferente a las PFIP como Bt, entonces estos insectos muy resistentes no tienen absolutamente nada de resistencia. La desaparición de resistencia en un insecto "resistente a Bt" es sorprendente y se muestra que esto sucede con nuestros datos en los ejemplos proporcionados en la presente. Este resultado fue completamente inesperado. Por el contrario, ahora se comprende que es posible usar este conocimiento para explicar cómo las cantidades subletales de una proteína PFIP como Bt se pueden "convertir" en un cóctel letal de forma que si se administran dos (2) o más cantidades subletales de proteína insecticida, entonces la combinación de proteínas se vuelve letal para insectos que de otra forma se considera que son demasiado grandes, o demasiado resistentes para ser susceptibles a péptidos tóxicos.

Es sorprendente que la resistencia de los insectos a PFIP solas no confiere resistencia a la combinación de PFIP con CRIP y/o TMOF. Debido al mecanismo de acción de las PFIP, se esperaría que la PFIP, como una proteína de Bt, ya no contribuya a los efectos tóxicos de la combinación de PFIP con CRIP y/o TMOF. Por el contrario, sucede lo opuesto y la combinación tiene un nivel de actividad más elevado de lo que se esperaba tal como muestran nuestros datos.

Los insectos desarrollaron resistencia a Bt. Los intentos de combatir esta resistencia produjeron el uso de muchos subtipos diferentes de Bt. Se enseña en la presente que la resistencia de los insectos se puede superar mediante aplicación conjunta de péptidos venenosos. Debido a que el modo más común de resistencia (modo 1, referencia previa) Pence, R. J. "The antimetabolite imidazole as a pesticide." California Agrie. 1965, 13-15. es la regulación por disminución de los receptores de Bt que recubren el intestino, se esperaría que la resistencia de los insectos se mantenga en los insectos resistentes a Bt debido a que la cantidad de receptores es insuficiente para hacer que los insectos sean vulnerables a la sepsis mediante la flora intestinal. Lo que los inventores descubrieron y creen y avalan con datos de forma dramática (ver los ejemplos a continuación) es que incluso con insectos con resistencia a Bt sigue habiendo suficientes anormalidades de membrana que la exposición a niveles incluso bajos de Bt, al combinarse con un determinado péptido insecticida "tóxico" pequeño, con un tipo diferente de modo de acción que Bt, provocará de forma sorprendente que los insectos resistentes a Bt dejen de alimentarse o mueran. Se cree que esto se debe a que el recubrimiento intestinal sigue estando alterado en estos insectos resistentes, solo lo suficiente para permitir el pasaje de los péptidos venenosos mucho más pequeños característicos de cualquiera de los tipos de CRIP y TMOF de los péptidos insecticidas.

En este documento no se considera a los péptidos de TMOF o péptidos del factor oostático modulador de tripsina (TMOF) que se identificaron como posibles larvicidas, véase D. Borovsky, Journal of Experimental Biology 206, 3869-3875, como un péptido insecticida de tipo CRIP. Se define un péptido CRIP como uno con diversas cisteínas de acuerdo con las definiciones que se incluyen en la presente. Los péptidos de TMOF no se ajustan al motivo que se describe como un péptido CRIP. Véase la sección de definiciones en la primera parte del documento para encontrar una definición de CRIP y TMOF. Se trata la combinación de proteínas de tipos CRIP y/o TMOF con un tipo diferente de proteína que se describe como PFIP.

Las PFIP son proteínas insecticidas formadoras de poros que también se definen en la sección de definiciones. Un ejemplo de un tipo de PFIP son diversas proteínas del grupo ampliamente utilizado de proteínas derivadas de Bt, como cry, cyt y VIP. Estos son insecticidas eficaces utilizados para la protección de cultivos tanto en forma de protectores incorporados a la planta como de pulverizadores de hoja. Las formulaciones comerciales de las proteínas de Bt se utilizan ampliamente para controlar a los insectos en etapa de larva.

A diferencia a las PFIP, las CRIP como los péptidos del nudo inhibidor de cisteína o ICK son grupos de péptidos muy diferentes que también tienen actividad insecticida, pero estos actúan con un modo de acción muy diferente. En el presente documento no hay superposición de una proteína PFIP con una proteína CRIP, los dos grupos se encuentran separados y son distintos. Los péptidos de ICK e incluso los péptidos que no son de ICK se consideran ambos CRIP en este documento. A menudo, las CRIP son tóxicas para las especies biológicas diana de origen natural, normalmente insectos o aráenidos de algún tipo. A menudo los péptidos de CRIP pueden tener orígenes artrópodos como los venenos de escorpiones o arañas, este origen venenoso es muy común con los ICK. Las CRIP se pueden administrar a su punto de acción fisiológico de diversas formas, por ejemplo, mediante administración de la toxina de forma directa al intestino o los órganos internos del insecto mediante inyección, mediante aplicación a un locus del insecto y absorción de contacto con la superficie o induciendo al insecto a que consuma la toxina en su alimento, por ejemplo, un insecto que se alimenta de una planta transgénica.

Los péptidos descritos en la presente se pueden formular como pruebas con productos aplicados o a través de la superficie de plantas transgénicas. Puede ser difícil producir de forma exitosa los péptidos a escala comercial, con formación y plegamiento de péptidos reproducibles. Los controles de costos pueden ser un desafío. La gran variedad, propiedades únicas y naturaleza especial de los péptidos, combinadas con la gran variedad de posibles téenicas de producción, pueden presentar una cantidad abrumadora de enfoques para la producción de péptidos. Los productos comerciales tienen sus propios desafíos considerables. Los péptidos a menudo son inestables cuando se aplican en el ambiente de un cultivo. La irradiación UV y otros factores pueden provocar que los insecticidas de Bt se deterioren rápidamente en el ambiente, a menudo en tan solo unas horas.

Adicionalmente, la eficacia comercial puede cambiar. Tanto el aerosol de Bt en los productos como las proteínas de Bt transgénicas que se utilizan como planta incorporaron resistencia a insectos que emergen en la superficie protectora.

Se necesita un producto que potencie la actividad intensa, mejore el rendimiento de resistencia o prolongue la duración de la acción para aumentar el control de insectos y la protección de cultivos.

En la presente se incluyen combinaciones de proteína de Bt y péptidos de ICK y TMOF en diversas combinaciones. Se describen ejemplos de estas combinaciones novedosas. En la presente se describen y reivindican las nuevas combinaciones, productos, métodos y su formulación, así como usos de estos.

PÉPTIDOS INSECTICIDAS RICOS EN CISTEÍNA (CRIP) EN COMBINACIONES SINÉRGICAS Los péptidos insecticidas ricos en cisteína (CRIPS) son péptidos ricos en cisteína que forman enlaces de disulfuro. Los enlaces de disulfuro cisteína-cisteína tienen una incidencia considerable en la toxicidad de estos péptidos insecticidas que se ejemplifica mediante los péptidos del nudo inhibidor de cisteína o ICK y mediante los ejemplos de péptidos tóxicos con enlaces de disulfuro que no se consideran péptidos de ICK (CRIP no de ICK) como los péptidos de anémonas, como los péptidos Av2 y Av3. Estos péptidos tóxicos estabilizados con enlaces de disulfuro cisteína-cisteína (CRIPS) pueden presentar una estabilidad notable cuando se exponen al ambiente. Muchos péptidos de ICK se aíslan de animales venenosos como arañas, escorpiones y serpientes y son tóxicos a los insectos. Se sabe que los péptidos del TMOF tienen actividad larvicida. Los péptidos Av2 y Av3 se aíslan de anémonas. También se describe un grupo diferente de péptidos que actúan en el recubrimiento intestinal del insecto. Estos se denominan PFIP, por proteínas insecticidas formadoras de poros. La mayoría de los ejemplos conocidos de una PFIP son las proteínas de Bt, muy conocidas debido a sus actividades pesticidas específicas y aplicaciones comerciales. De manera sorprendente, los inventores descubrieron que al combinar la combinación de estos péptidos, PFIP y CRIP, y administrarlos de forma que actúen juntos en el intestino (no es necesaria la administración conjunta de la combinación, solamente la combinación de la actividad en el intestino), estos se vuelven altamente eficaces para controlar insectos. Por ejemplo, una de las combinaciones preferidas sería una combinación de una proteína de Bt con un péptido de ICK o péptido de anémona para crear un insecticida con una potencia mucho mayor de lo que se esperaría.

Se describe una composición de péptidos insecticidas de combinación que comprende tanto una PFIP (proteína insecticida formadora de poros) en combinación con una CRIP y/o una proteína insecticida de tipo TMOF de la proteína insecticida. Cabe destacar que las CRIP incluyen proteínas insecticidas como péptidos de ICK (nudo inhibidor de cisteína) y proteínas que no son de ICK pero los péptidos de TMOF no se consideran proteínas CRIP. Las proteínas CRIP pueden incluir proteínas que no son de ICK como las proteínas identificadas en primer término en anémonas, por ejemplo, Av2 o Av3. La composición se puede encontrar en la relación en peso seco de PFIP: a CRIP y/o TMOF de alrededor de cualquiera o todas de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. También se describe una composición en la que la relación de PFIP a CRIP o TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. Las CRIP, CRIP de ICK y no de ICK y los TMOF pueden ser 100 % del péptido combinado con Bt o se puede combinar cualquiera de los péptidos en cualquier combinación que forme un total del 100 % de ambos péptidos de ICK + TMOF con Bt.

En otra modalidad, la combinación de mezclas de PFIP en combinación con péptidos CRIP o TMOF incluye cualquiera o ambos de los péptidos de PFIP y CRIP, así como no de CRIP que derivan de más de 1 tipo u origen distinto de orígenes de cepa bacteriana para cualquiera o ambos de los péptidos de PFIP, ICK y TMOF. Orígenes de cepa bacteriana significa que los péptidos se pueden describir como expresados por una cepa bacteriana que expresa los péptidos con el entendimiento de que muchos péptidos también son artificiales en el sentido de que ya no se desarrollan a partir de cepas bacterianas o animales.

Se describen también composiciones en las que una cualquiera o ambas mezclas de PFIP en combinación con los péptidos de CRIP o TMOF y/o mezclas de PFIP en combinación péptidos de CRIP más o con TMOF derivan de entre 2 y 5, 2-15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 y otros diversos tipos u orígenes de cepas bacterianas de una o ambas de las proteínas. Se describe una composición donde una cualquiera o ambas proteínas se codifican mediante entre 2 y 15 tipos u orígenes de cepas bacterianas diferentes de una cualquiera o ambas de las PFIP en combinación con péptidos de CRIP o TMOF. Y cualquiera de estas combinaciones de 2-5, 2-15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 y muchas otras mezclas y tipos distintos de PFIP en combinación con péptidos de CRIP o TMOF pueden contribuir más de al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición.

Se describen composiciones de péptidos de Bt e ICK, Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF de las reivindicaciones 1-6, donde la concentración total de péptido de Bt e ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes. Se describen composiciones en las que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida. Se describen composiciones en las que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, donde el ERSP es BAAS.

Se describen composiciones donde la combinación de péptidos se produce usando un casete genético que comprende además un dipéptido unido operativamente al péptido del TMOF e ICK insecticida, donde el dipéptido está unido en el N- terminal del péptido de ICK insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, que incluye modalidades en las que el dipéptido es glicina-serina, que incluyen modalidades en las que el péptido de ICK insecticida es cualquier péptido insecticida que inhibe tanto los canales de calcio regulados por voltaje como los canales de potasio activados por calcio en insectos, que incluye las modalidades en las que el péptido de ICK insecticida proviene de cualquier especie de araña de Sídncy con tela en embudo, que incluye modalidades en las que la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche, incluyendo modalidades en las que la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Hadronyche, que incluye modalidades en la que la araña se selecciona de la araña de Sídney con tela en embudo, Hadronyche versuta, que incluye modalidades en las que el péptido de ICK insecticida es híbrido-ACTX-Hvla, que incluye modalidades en las que el péptido de ICK insecticida contiene 20-100 aminoácidos y 2-4 enlaces de disulfuro, incluyendo modalidades en las que el péptido de ICK insecticida es cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ICK descritas en la presente, incluyendo modalidades en las que el péptido de ICK insecticida se selecciona de publicaciones incorporadas mediante referencia, incluyendo modalidades en las que la proteína de Bt es cualquier proteína de Bt insecticida, incluyendo modalidades en las que la proteína de Bt es una proteína Cry o Cyt, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1, incluyendo modalidades en las que la proteína de Bt se selecciona de una proteína Cry, una proteína CrylA o una proteína CrylF, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es una combinación de proteína CrylF-CrylA, incluyendo modalidades en las que la proteína de Bt comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28 o 34 de la patente estadounidense N° 7,304,206, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es Dipel, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es Thuricide.

Se describe una composición que comprende los nucleótidos de: la proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) , y un péptido del ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida, peptido de BT y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF en una planta transformada o genoma vegetal, donde la relación en peso seco de Bt a ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos del BT e ICK + TMOF se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de cualesquiera dos de estos valores.

Se describe una planta transformada o genoma vegetal en la que la relación del Bt al ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF en peso seco se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. La planta transformada o genoma vegetal pueden tener cualquiera o ambos de los péptidos del Bt e ICK derivados de más de 1 tipo u origen de cepa bacteriana distinto de péptidos de Bt o ICK, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de entre 2 y 5 tipos u orígenes de cepa bacteriana distintos de uno cualquiera de los péptidos de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt ICK se derivan de entre 2 y 5 tipos u orígenes de cepa distintos, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de entre 2 y 15 tipos u orígenes de cepa bacteriana distintos de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de los péptidos de Bt e ICK o ambos de los péptidos de Bt e ICK codificados por más de una copia de los genes de Bt o ICK, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de más de un tipo u origen de cepa bacteriana distinto de los péptidos de Bt y/o ICK, donde todas las cepas de los péptidos de Bt y/o ICK contribuyen más de al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de entre 2 y 5 tipos u orígenes de cepa bacteriana distintos de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de los péptidos de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e ICK codificados por más de una copia de los genes de Bt del ICK, o la concentración total del péptido de Bt e ICK en la composición se puede seleccionar de los siguientes porcentajes de concentración: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes.

Las composiciones y plantas descritas en la presente incluyen un péptido de combinación insecticida que se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida o a un péptido de TMOF, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK o TMOF insecticida. En otra modalidad, el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, donde el ERSP es BAAS. En otra modalidad, la planta transgénica que incorpora y expresa los péptidos de combinación a partir de los nucleótidos descritos en la presente, donde el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además nucleótidos que expresan un dipéptido unido operativamente al péptido de ICK o TMOF insecticida, donde el dipéptido está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. En otra modalidad, la planta transgénica tiene un dipéptido que es glicina-serina. En otra modalidad, la planta transgénica tiene péptidos de ICK insecticidas expresados compuestos por una combinación de péptidos insecticidas de proteínas de ICK y Bt. Las plantas transgénicas pueden tener un péptido de ICK insecticida derivado de cualquier especie de araña de Sídncy con tela en embudo, o las arañas de Sídney con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche, y la araña de Sídney con tela en embudo, Hadronyche versuta .

Se describe y reivindica una planta transgénica, donde el péptido de ICK insecticida expresado es Híbrido-ACTX-Hvla y/o el péptido de ICK insecticida expresado puede contener 20-100 aminoácidos y 2-4 enlaces de disulfuro y/o el péptido de ICK insecticida es cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de los péptidos de ICK descritos en la presente. Las plantas transgénicas descritas pueden contener cualquier proteína de Bt conocida, que incluye péptidos en los que la proteína de Bt es una proteína de Cry o Cyt y/o la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1. La proteína de Bt se puede seleccionar de una proteína Cry, una proteína CrylA o una proteína CrylF, o una proteína CrylF-CrylA de combinación, o comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a las secuencias 10, 12, 14, 26, 28 o 34 de la patente estadounidense n.° 7,304,206. Se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es Dipel y se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es Thuricide.

Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos descritos en la presente, donde la concentración promedio de péptido de Bt e ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF, en una hoja promedio de una planta transformada, es de alrededor de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre cualesquiera dos de estos valores. Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada. Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos tóxicos combinados con plegamiento adecuado en la planta transformada y la provocación de acumulación de los péptidos tóxicos expresados y con plegamiento adecuado en la planta y la provocación de un aumento del rendimiento o resistencia de la planta al daño causado por los insectos y el control de las plagas de insectos en cultivos y silvicultura. Se describen plantas generadas por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Se describen casetes de expresión que comprenden cualquiera de los nucleótidos que expresan cualquier péptido descrito en la presente, que incluyen modalidades con un casete de expresión funcional incorporado en una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican cualquiera de los péptidos descritos en la presente o que podría generar un experto en la téenica de conformidad con la descripción que se proporciona en la presente. Se describen y reivindican procedimientos para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos descritos en la presente.

Se describe el uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en la presente, para generar esta planta o transformar estos péptidos o nucleótidos en una planta, y métodos y técnicas para generar estas proteínas en plantas y/o casetes de expresión que comprenden cualquiera de los péptidos y métodos para transformarlos en un genoma de planta y cualquier método para usar, elaborar y transformar cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en una planta, y métodos y técnicas para generar plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos y casetes de expresión funcionales en plantas, que comprenden cualquiera de los péptidos y sus nucleótidos correspondientes y cualquiera de las plantas generadas por los productos y procesos descritos en la presente.

En algunas modalidades, se describe un gen quimérico que comprende un promotor activo en las plantas, unido operativamente a los ácidos nucleicos o casetes de expresión, como se describe en la presente. Se describe un método para elaborar, producir o usar la combinación de genes descritos en la presente. Se describe un vector recombinante que comprende la combinación de genes descritos en la presente. Se describe un método para elaborar, producir o usar el vector recombinante. Se describe una célula hospedadora transgénica que comprende la combinación de genes descritos en la presente, y el método para elaborar, producir o usar la célula hospedadora transgénica, que puede ser una célula vegetal transgénica y se describe un método para elaborar, producir o usar la célula vegetal transgénica, así como la planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica y el modo de elaborar y usar la planta transgénica. Se describe una planta y semilla transgénica con las propiedades descritas en la presente, derivada de maíz, soja, algodón, arroz, sorgo, pasto varilla, caña de azúcar, alfalfa, patatas o tomates. La semilla transgénica puede tener un gen quimérico que se describe en la presente. Se describen métodos para elaborar, producir o usar la planta y/o semilla transgénica de la descripción.

Se describen métodos para usar la invención y proporcionar formulaciones novedosas. La invención es más útil para controlar los insectos. Se describe un método para controlar un insecto que comprende: Aplicar proteína de Bt ( Bacillus t huringiensis) a el insecto, y aplicar un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida a el insecto.

Este método se puede usar cuando se aplican juntos la proteína de Bt y el péptido de ICK insecticida, los péptidos de Bt y TMOF o los péptidos de BT e ICK + TMOF en el mismo momento en las mismas composiciones o por separado en distintas composiciones y en distintos momentos. Se pueden aplicar la proteína de Bt y el péptido de ICK insecticida y/o el péptido de TMOF de forma secuencial, y se pueden aplicar a insectos resistentes a la proteína de Bt. Se puede seleccionar la relación en peso seco de Bt a ICK o TMOF de al menos alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de cualesquiera dos de estos valores. Se puede seleccionar la relación de Bt a ICK, en peso seco, de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de más de 1 tipo u orígenes de cepa bacteriana distintos de péptidos de Bt e ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF se derivan de entre 2 y 5 tipos u orígenes de cepa bacteriana distintos de cualquiera de los péptidos del Bt e ICK o ambos péptidos del Bt e ICK. Cualquiera o ambos péptidos de Bt e ICK se derivan de entre 2 y 15 tipos u orígenes de cepa bacteriana distintos de cualquiera o ambos péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de los péptidos de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e ICK se codifican mediante más de una copia de los genes de Bt o ICK. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de los péptidos de Bt y/o ICK, donde todas las cepas de péptidos de Bt y/o ICK contribuyen más de al menos 1 % de los péptidos a partir de cada tipo de cepa en la composición. Cualquiera o ambos péptidos de Bt e ICK derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e ICK se codifican mediante más de una copia de los genes de Bt o ICK. La concentración total de péptidos de Bt e ICK, péptidos de Bt y TMOF o péptidos de BT e ICK + TMOF en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes .

Los métodos se pueden usar cuando se produzca el péptido de combinación insecticida usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido del TMOF o péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida. En algunas modalidades, los péptidos de combinación insecticidas se producen usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, donde el ERSP es BAAS.

Se puede usar cualquiera de los péptidos y plantas descritos en la presente para controlar insectos, su crecimiento y daño, especialmente su daño a las plantas. Se puede aplicar la combinación de proteína de Bt y péptido de ICK insecticida rociándolo en una planta, el locus del insecto o el locus de una planta que necesita protección.

También se describen formulaciones que comprenden: Proteína de Bt y un péptido de ICK insecticida y/o un péptido de TMOF insecticida que puede incluir cualquiera de las composiciones descritas en la presente o que puede elaborar un experto en la téenica en función de la presente descripción. Algunas de las formulaciones descritas incluyen el uso de un solvente aprótico polar y/o agua, y/o cuando el solvente aprótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso, el solvente prótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso y el agua está presente en una cantidad de 0-98 % en peso. Las formulaciones incluyen formulaciones donde la proteína de Bt es Dipel y donde el péptido de ICK insecticida es un péptido de híbrido-ACTX-Hvla. Las formulaciones de solvente aprótico polar son especialmente eficaces cuando contienen MSO. MSO es una mezcla de aceite de semilla metilado y tensioactivo que utiliza ásteres de metilo de aceite de soja en cantidades de entre alrededor de 80 y 85 por ciento de aceite de petróleo con 15 a 20 por ciento de tensioactivo.

La presente descripción proporciona diversos ejemplos de péptidos tipo CRIP, péptidos de ICK, péptidos de CRIP que no son de ICK y péptidos de TMOF adecuados además de muchos tipos de péptidos del tipo de PFIP como péptidos y proteínas de Bt y VIP, cuando se combinan, proporcionan productos insecticidas novedosos y estos se pueden denominar en la presente como "péptidos de combinación". Los péptidos adecuados para uso con la presente invención se describen en el presente documento y los ejemplos específicos se describen en el listado de secuencias. Los péptidos en el listado de secuencias se proporcionan solamente como ejemplos para ilustrar la invención y para proporcionar sentido y significado al experto en la téenica. Se debe comprender que el listado de secuencias no proporciona una lista plena y completa de todas las CRIP, los ICK, las CRIP que no son de ICK y los TMOF, ni proporciona una lista completa de todas las PFIP. Los insectos se pueden tratar con péptidos de combinación aplicados directamente, como rociados en un insecto o su locus, o los péptidos de combinación se pueden aplicar de forma indirecta, como administrándolos en una planta transgénica. En primer lugar se proporcionaron descripciones escritas y ejemplos detallados de péptidos de CRIP como el ICK (Sección I) y estos también se proporcionan precedentemente. Luego se proporcionaron descripciones escritas y ejemplos detallados del péptido de TMOF (Sección II). Luego se proporcionan descripciones escritas y ejemplos detallados de proteínas de Bt (Sección III). Se debe comprender que la solicitud proporciona estos ejemplos como forma de ilustrar y no limitar los límites de la patente y la invención reivindicada. Se puede combinar cualquier proteína de Bt y péptido de ICK o péptido de TMOF adecuados de la forma descrita y producir un insecticida eficaz. Luego de describir las proteínas de ICK y Bt, el solicitante describe diversas composiciones de pesticidas (Sección IV). Se describen transformaciones vegetales usando proteínas de ICK y Bt (Sección V). Descripciones y ejemplos de combinaciones de CRIP y Bt (Sección VI). Se describen combinaciones de proteínas de TMOF y Bt (Sección VII). Se proporcionan ejemplos no taxativos y descripciones de cómo se combinaron las proteínas de ICK y Bt para producir un insecticida altamente eficaz. Los resultados y datos se proporcionan en la presente.

Sección I. Los peptidos del motivo de ICK o péptidos de ICK "Motivo de ICK", "motivo proteico de ICK" "motivo del nudo inhibidor de cistina", "péptidos de ICK de insectos tóxicos" o "péptidos de ICK" significa un péptido de 16 a 60 aminoácidos con al menos 6 aminoácidos nucleares de cistina media con tres puentes disulfuro, donde los 3 puentes disulfuro son enlaces covalentes y de los seis residuos de cistina media, los enlaces de disulfuro covalentes están entre la primera y la cuarta, la segunda y la quinta y la tercera y la sexta cistina media, de los seis aminoácidos de cistina media del núcleo empezando desde el aminoácido del N-terminal. El motivo proteico de ICK también comprende una estructura secundaria de horquilla-beta, normalmente compuesta por residuos ubicados entre la cuarta y la sexta cistina media del núcleo del motivo, donde la horquilla se estabiliza mediante la reticulación estructural proporcionada por los tres enlaces de disulfuro del motivo. Cabe destacar que puede haber aminoácidos de cisteína/cistina o cistina media adicionales presentes dentro del motivo del nudo inhibidor de cistina.

Este motivo es común en los péptidos aislados del veneno de varias especies. Las especies de invertebrados incluyen arañas y escorpiones, hay varios ejemplos adicionales, incluso se sabe que el veneno de serpiente tiene péptidos con el motivo de ICK. Los ejemplos específicos de péptidos de ICK insecticidas son los "péptidos U" descritos en la presente y en patentes publicadas y solicitudes de patente y sus homologías, que tienen un origen de los venenos de las arañas de Sídncy con tela de embudo. Estas proteínas también se denominan péptidos de ACTX de la araña de Sídney con tela en embudo, pero los procedimientos que se describen en la presente son útiles y se pueden aplicar a cualquier proteína con el motivo de ICK. Los siguientes documentos se incorporan mediante esta referencia en los Estados Unidos en su totalidad, son conocidos por los expertos en la téenica, y se han publicado.

Los ejemplos de toxinas peptídicas con el motivo de ICK se puede encontrar en las siguientes referencias. La co-Conotoxina de bloqueador del canal de calcio tipo N fue estudiada por Lew, M.J. et ál. "Structure-Function Relationships of w-Conotoxin GVIA" Journal of Biological Chemistry, tomo 272, N.° 18, publicación del 2 de mayo, pp. 12014-12023, 1997. Se estudió un resumen de varios péptidos de ICK tóxicos de artrópodos de distintas especies de diferentes arañas y escorpiones en Quintero-Hernandez, V. et ál. "Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene Cloning and Peptide Expression" Toxicon, 58, pp. 644-663, 2011. Se identificó la estructura tridimensional de Hanatoxinal usando espectroscopia de NMR como motivo proteico del nudo inhibidor de cisterna en Takahashi, H. et ál. "Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins" Journal of Molecular Biology, tomo 297, publicación 3, 31 marzo 2000, pp . 771-780. Se publicó el aislamiento e identificación de ADNc que codifica un péptido de toxina de ICK de veneno de escorpión, Opicalcinel, por parte de Zhu, S. et ál . "Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides" FASEB J., 17 de septiembre de 2003, (12):1765-7, pub. ele. 3 de julio de 2003. La cesión específica de la secuencia y la identificación de estructura secundaria de BgK, una toxina que bloquea el canal de K+ de la anémona Bunodosoma granulifera, fue descrita por Dauplais, M. et ál. "On the convergent evolution of animal toxins" Journal of Biological Chemistry. 14 de febrero de 1997; 272(7): 4302-9. Se publicó una revisión de la composición y farmacología de venenos de araña con énfasis en la estructura, modo de acción y evolución molecular de la toxina de polipéptido, que muestra puentes de cisteína, formaciones del nudo de cisteína y el plegamiento "tipo nudo" por parte de Escoubas, P. et ál. "Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins" Biochimie, tomo 82, publicaciones 9-10, 10 de septiembre de 2000, pp . 893-907. Se describió el péptido purificado, iberiotoxina, un inhibidor del canal de K+ activado por Ca2+, de veneno de escorpión ( Buthus tamulus) en Galvez, A. et ál. "Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus" Journal of Biological Chemistry, 5 de julio de 1990; 265(19): 11083-90. Se describió el péptido purificado, caribdotoxina, un inhibidor del canal de K+ activado por Ca2+, del veneno de escorpión Leiurus quinquestriatus en Giménez-Gallego, G. et ál. "Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels" Proc Nati Acad Sci, mayo de 1988; 85(10): 3329-3333. De estas y otras publicaciones, un experto en la téenica debería poder identificar fácilmente proteínas y péptidos con lo que se describe como motivo de ICK, motivo proteico de ICK o "motivo del nudo inhibidor de cisteína".

El motivo proteico de ICK puede ser cualquier proteína con el motivo de ICK y tiene entre 16 y 60 aminoácidos de longitud, con al menos 6 residuos de cisteína que generan enlaces de disulfuro covalentes de reticulación en el orden adecuado. Algunos péptidos del motivo de ICK tienen entre 26-60 aminoácidos de longitud. Algunos motivos proteicos de ICK tienen entre 16-48 aminoácidos de longitud. Algunos motivos proteicos de ICK tienen entre 26-48 aminoácidos de longitud.

Algunos motivos proteicos de ICK tienen entre 30-44 aminoácidos de longitud. Los motivos proteicos de ICK con actividad insecticida natural son preferidos pero los expertos en la téenica conocen motivos proteicos de ICK con otros tipos de actividad, tal como resistencia a la sal y escarcha y se reivindican en la presente. Los ejemplos de motivos proteicos de ICK insecticidas incluyen los péptidos y genes de ACTX e incluyen todos los péptidos y sus genes de codificación conocidos como Magi6.

Los ejemplos de motivos proteicos de ICK insecticidas incluyen los péptidos y genes de ACTX e incluyen todos los péptidos y sus genes de codificación según se describen en las referencias proporcionadas anteriormente y en la presente. Los ejemplos de péptidos y motivos proteicos de ICK descritos a los efectos de proporcionar ejemplos y sin intención de limitar la presente, son los péptidos y sus homologías que se describen en la presente y, en particular, péptidos y nucleótidos que se originan de los venenos de arañas de Sídncy con tela en embudo. Los siguientes documentos se incorporan mediante esta referencia en los Estados Unidos en su totalidad, son conocidos por los expertos en la técnica, y se han publicado. Describen varios motivos proteicos de ICK cuya secuencia de péptidos completa y secuencia de nucleótidos completa se describen específicamente y se incorporan mediante esta referencia y además, las descripciones totales se incorporan mediante referencia que incluye todos sus listados de secuencias. Se conocen y se encuentran publicados sus listados de secuencias. Véanse las siguientes: US 7,354,993 B2, emitida el 8 de abril de 2008, específicamente las secuencias de nucleótidos y péptidos incluidos en el listado de secuencias con los números de SEQ ID NO: 33-71, de 7,354,993 B2, y los denominados polipéptidos U-ACTX, y estas y otras toxinas que pueden formar de 2 a 4 puentes de disulfuro intercatenarios, y variantes de estos, y los péptidos que figuran en las columnas 4 a 9 y en la Figura 2 de 7,354,993 B2. Se pueden encontrar otras secuencias específicas en la patente EP 1812 464 Bl, publicada y otorgada el 08.10.2008, véase el boletín 2008/41, específicamente las secuencias de nucleótidos y péptidos que se indican en el listado de secuencias y otras toxinas que pueden formar de 2 a 4 puentes de disulfuro intercatenarios y las secuencias numeradas con las SEQ ID NO: 33-71 y las secuencias denominadas polipéptidos U-ACTX y variantes de estos, así como los péptidos que figuran en los párrafos 0023 a 0055 y se incluyen en la patente EP 1812 464 Bl, ver la Figura 1 de EP 1, 1812 464 Bl.

Se describen e incorporan mediante referencia para describir los péptidos identificados en la presente variantes homologas de las secuencias mencionadas, con homología con respecto a las secuencias o mencionadas en la presente, que también se identifican y reivindican como adecuadas para volverse especiales de acuerdo con los procesos que se describen en la presente, incluyendo todas las secuencias homologas con al menos cualquiera de los siguientes porcentajes de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en la presente o con cualquier secuencia incorporada mediante referencia: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor identidad o 100 % de identidad con todas y cualesquiera de las secuencias identificadas en las patentes mencionadas anteriormente, y con cualquier otra secuencia identificada en la presente, que incluye cada una de las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud. Cuando el término homólogo u homología se utiliza en la presente con un número tal como 50 % o mayor, se refiere al porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre los dos péptidos. Cuando se usa un homólogo u homología sin un porcentaje numérico, se refiere a dos secuencias de péptidos que están muy relacionadas en el aspecto evolutivo o del desarrollo en que comparten aspectos físicos y funcionales en común, como toxicidad tópica y tamaño similar (es decir, el homólogo tiene una longitud de 100 % más o 50 % menos que el péptido que se menciona específicamente en la presente o se identifica mediante referencia en la presente como antecede).

Se describen e incorporan mediante referencia para describir los péptidos identificados en la presente péptidos del ICK tóxicos que incluyen los siguientes: péptidos U y sus variantes que se encuentran, aíslan o derivan de arañas del género Atrax o Hadronyche, incluyendo las especies del género Hadronyche versuta, o la araña de Sídncy con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis , Atrax infensus, incluyendo toxinas conocidas como polipéptidos U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb, o mutantes o variantes, especialmente los péptidos de cualquiera de estos tipos y especialmente los de menos de 200 aminoácidos pero más de 10 aminoácidos, y especialmente los péptidos de menos de 150 aminoácidos pero más de alrededor de 20 aminoácidos, especialmente los péptidos de menos de alrededor de 100 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 65 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 55 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de alrededor de 37 o 39 o alrededor de 36 a 42 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 55 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 45 aminoácidos pero más de alrededor de 35 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 115 aminoácidos pero más de alrededor de 75 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 105 aminoácidos pero más de alrededor de 85 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 100 aminoácidos pero más de alrededor de 90 aminoácidos, incluyendo toxinas de péptidos de cualquiera de las longitudes mencionadas en la presente que pueden formar 2, 3 y/o 4 o más puentes de disulfuro intercatenarios, incluyendo las toxinas que alteran las corrientes del canal de calcio, incluyendo las toxinas que alteran los canales de potasio, especialmente toxinas que alteran los canales de calcio de insectos o los U de estos, especialmente toxinas o variantes de estas de cualquiera de los tipos de toxinas descritas en la presente que tienen actividad insecticida oral o tópica, se pueden volver especiales mediante los procesos descritos en la presente.

Los péptidos U de la araña de Sídncy con tela en embudo, género Atrax y Hadronyche son particularmente adecuados y funcionan bien cuando se colocan en combinación de acuerdo con los métodos, procedimientos o procesos descritos en la presente invención. Los ejemplos de los péptidos adecuados analizados y con datos se proporcionan en la presente. También se sabe específicamente que las siguientes especies transportan péptidos de ICK tóxicos adecuados para volverse especiales mediante el proceso de la presente invención. Se mencionan específicamente las siguientes especies: Atrax formidabillis, Atrax infensus, Atrax robustus, Hadronyche infensa, Hadronyche versuta . Cualquier péptido de ICK tóxico derivado de cualquiera de los géneros enumerados anteriormente y/o especies de géneros y homólogos del péptido U es adecuado para volverse especial de acuerdo con el proceso en la presente invención.

Tal como se indicó anteriormente, muchos péptidos son candidatos adecuados para combinaciones con proteína de Bt. Las secuencias que se indican previamente, a continuación y en el listado de secuencias son péptidos especialmente adecuados que se pueden volver especiales y algunos de estos se volvieron especiales de acuerdo con la presente invención, con los resultados que se expresan en los ejemplos a continuación .

Se conocen y pueden encontrar ejemplos de péptidos tóxicos de ICK de insectos en diversas referencias. Se pueden identificar mediante su naturaleza peptídica y su actividad, normalmente actividad insecticida de inyección u oral. Se proporcionan en la presente algunos ejemplos para describir e ilustrar mejor la invención, pero la misma no se limita a estos ejemplos. Todos estos ejemplos y otros que no se muestran en la presente describen materiales nuevos, descritos y reivindicados por primera vez en la presente.

Los péptidos tóxicos de ICK de insectos son péptidos de más de 5 residuos de aminoácidos y menos de 3.000 residuos de aminoácidos. Se encuentran en el intervalo de peso molecular de entre 550 Da y alrededor de 350.000 Da. Los péptidos tóxicos de ICK de insecto tienen algún tipo de actividad insecticida. Típicamente, presentan actividad cuando se inyectan a insectos, pero la mayoría no presenta una actividad considerable cuando se aplica a un insecto por vía tópica. La actividad insecticida de los péptidos tóxicos de ICK de insectos se mide de diversas formas. Los expertos en la téenica conocen ampliamente los métodos comunes de medición. Estos métodos incluyen, de modo no taxativo, determinación de dosis de respuesta mediana (p. ej., LDso, PD50, LC50, ED50) mediante ajuste de gráficas de respuesta a la dosis según el registro de diversos parámetros como: parálisis, mortalidad, imposibilidad de aumentar de peso, etc. Las mediciones se pueden realizar para cohortes de insectos expuestos a diversas dosis de la formulación insecticida en cuestión. El análisis de los datos se puede realizar creando curvas definidas mediante análisis de función probit y/o la ecuación Hill, etc. En estos casos, las dosis se administrarían mediante inyección hipodérmica, mediante infusión hiperbárica, mediante presentación de la formulación insecticida como parte de una muestra de alimento o cebo, etc.

Los péptidos tóxicos de ICK de insecto o péptidos de ICK se definen en la presente como todos los péptidos que demuestran ser insecticidas luego de la administración a los insectos ya sea mediante inyección hipodérmica, infusión hiperbárica o tras administración oral a un insecto (es decir, mediante ingestión como parte de una muestra de alimentos que se presentan al insecto). Por lo tanto, esta clase de péptidos comprende, de modo no taxativo, muchos péptidos producidos de forma natural como componentes de los venenos de arañas, ácaros, escorpiones, serpientes, caracoles, etc. Esta clase también comprende, de modo no taxativo, diversos péptidos producidos por plantas (p. ej., diversas lectinas, proteíns que inactivan ribosomas y proteasas de cisteína) y diversos péptidos producidos por microbios entomopatogénicos (p. ej., la familia de proteínas de Cry/Bt de proteínas producidas por diversas especies de Bacillus) .

Los péptidos insecticidas se pueden seleccionar de veneno insecticida, por ejemplo, el veneno de una araña. La araña puede ser una araña de Sídncy con tela en embudo. Los péptidos pueden ser del género de Atrax o Hadronyche, incluyendo U-ACTX-Hvla y sus análogos. Los ejemplos de péptidos específicos de arañas se describen en el listado de secuencias que se proporciona en la presente. Estos péptidos se pueden combinar con proteínas de Bt usando los procedimientos descritos en la presente.

Ejemplos de secuencia de peptidos de ICK Los siguientes documentos se incorporan mediante referencia en Estados Unidos en su totalidad, en otras jurisdicciones si se permite y son de conocimiento común dada su publicación. Asimismo, se incorporan mediante referencia y se conocen de forma específica por sus listados de secuencias en la medida en que describen secuencias peptídicas. Véanse las siguientes: Patentes estadounidenses: US 5,763,568, emitida el 9 de junio de 1998, que se incorpora en su totalidad a la presente, específicamente las secuencias en el listado de secuencia y las que reciben los números 33-58 y las que se conocen como toxinas "kappa" u "omega", incluyendo las que pueden formar 2-4 puentes de disulfuro intercatenarios, y los péptidos que figuran en las columnas 2 y 4 y la Tabla 5 y en la Figura 5, Figura 15, Figura 16, Figura 17, Figura 18.

US 5,959,182, emitida el 28 de septiembre de 1999, que se incorpora en su totalidad a la presente, específicamente las secuencias en el listado de secuencia y las que reciben los números 33-58 y las que se conocen como toxinas "kappa" u "omega", incluyendo toxinas que pueden formar 2-4 puentes de disulfuro intercatenarios, y los péptidos que figuran en las columnas 2 y 4 y la Tabla 5 y en la Figura 5, Figura 15, Figura 16, Figura 17, Figura 18.

US 6,583,264 B2, emitida el 24 de junio de 2003 y US 7,173,106 B2, emitida el 6 de febrero de 2007, que se incorporan a la presente en su totalidad, de forma específica la secuencia número 1, denominada "omega-atracotoxina-Hv2a o co-atracotoxina-Hv2a", incluyendo las toxinas que pueden formar 2-4 puentes de disulfuro intercatenarios.

US 7,279,547 B2, emitida el 9 de octubre de 2007, que se incorpora en su totalidad a la presente, específicamente las secuencias en el listado de secuencia y las que reciben los números 33-67 y variantes de <a-atracotoxin-Hv2a, toxinas que pueden formar 2-4 puentes de disulfuro intercatenarios, y los péptidos que figuran en las columnas 4-8 de la descripción y en la Figura 3 y la Figura 4.

US 7,354,993 B2, emitida el 8 de abril de 2008, que se incorpora en su totalidad a la presente, específicamente las secuencias peptídicas incluidas en el listado de secuencia y las que reciben los números 33-71 y las que tienen los números 33-71 y las que se denominan polipéptidos U-ACTX, toxinas que pueden formar 2-4 puentes de disulfuro intercatenarios y variantes de estos y los péptidos que figuran en las columnas 4-9 de la descripción y en la Figura 1.

Pat nt EP 1 812 646 Bl, publicada y otorgada el 08.10.2008, boletín 2008/41, que se incorpora en su totalidad a la presente, específicamente las secuencias peptídicas incluidas en el listado de secuencias, toxinas que pueden formar 2-4 puentes de disulfuro intercatenario y las que tienen los números 33-71 y los denominados polipéptidos U-ACTX y variantes de estos, y los péptidos que figuran en los párrafos 0023 a 0055 y figuran en la Fig.1.

Se describen e incorporan mediante referencia a los péptidos identificados en la presente variantes homologas de las secuencias mencionadas, con homología a las secuencias o mencionadas en la presente, que también se identifican y reivindican como adecuadas para volverse especial a los procesos que se describen en la presente, incluyendo de modo no taxativo todas las secuencias homologas, incluyendo las secuencias de homólogos con al menos cualquiera de los siguientes porcentajes de identidad con respecto a cualquiera de las secuencias descritas en la presente o con respecto a cualquier secuencia incorporada mediante referencia: 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % o mayor identidad con respecto a todas y cualesquiera de las secuencias identificadas en las patentes mencionadas anteriormente, y con respecto a cualquier otra secuencia identificada en la presente, incluyendo todas y cada una de las secuencias en el listado de secuencias de la presente solicitud. Cuando el término homólogo u homología se utiliza en la presente con un número tal como 30 % o mayor, se refiere al porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre los dos péptidos. Cuando se usa un homólogo u homología sin un porcentaje numérico, se refiere a dos secuencias de péptidos que están muy relacionadas en el aspecto evolutivo o del desarrollo en que comparten aspectos físicos y funcionales en común, como toxicidad tópica y tamaño similar dentro de 100 % más o 50 % menos de longitud del péptido.

Se describen e incorporan mediante referencia a los péptidos identificados en la presente derivados de cualquier fuente mencionada en los documentos de patente estadounidense y EP mencionados anteriormente, incluyendo de modo no taxativo las siguientes: toxinas aisladas de plantas e insectos, especialmente toxinas de arañas, escorpiones y plantas que se alimentan o defienden de insectos, como arañas con tela de embudo, arañas y especialmente arañas de Sídncy con tela de embudo, incluyendo toxinas que se encuentran, aíslan o derivan del género Atrax o Hadronyche, incluyendo las especies del género Hadronyche versuta, o la araña de Sídney con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis, Atrax infensus , incluyendo toxinas conocidas como polipéptidos "atracotoxinas", "co-atracotoxinas", atracotoxinas "kappa", atracotoxinas "omega" también conocidas como w-atracotoxina, polipéptidos U-ACTX, U-ACTX- Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb, o mutantes o variantes, especialmente los péptidos de cualquiera de estos tipos y especialmente los de menos de 200 aminoácidos pero más de 10 aminoácidos, y especialmente los péptidos de menos de 150 aminoácidos pero más de alrededor de 20 aminoácidos, especialmente los péptidos de menos de alrededor de 100 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 65 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 55 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de alrededor de 37 o 39 o alrededor de 36 a 42 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 55 aminoácidos pero más de alrededor de 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 45 aminoácidos pero más de alrededor de 35 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 115 aminoácidos pero más de alrededor de 75 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 105 aminoácidos pero más de alrededor de 85 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de alrededor de 100 aminoácidos pero más de alrededor de 90 aminoácidos, incluyendo toxinas de péptidos de cualquiera de las longitudes mencionadas en la presente que pueden formar 2, 3 y/o 4 o más puentes de disulfuro intercatenarios, incluyendo las toxinas que alteran las corrientes del canal de calcio, incluyendo las toxinas que alteran los canales de potasio, especialmente canales de calcio de insectos o híbridos de estos, especialmente toxinas o variantes de estas de cualquiera de estos tipos y cualquier combinación de cualquiera de los tipos de toxinas descritas en la presente que tienen actividad insecticida tópica, se pueden volver especiales mediante los procesos descritos en la presente.

Los péptidos venenosos de la araña de Sídncy con tela en embudo, género Atrax y Hadronyche son particularmente adecuados y funcionan bien cuando se tratan mediante los métodos, procedimientos o procesos descritos en la presente invención. Estos péptidos de aráenidos, como muchos otros péptidos tóxicos de ICK, incluyendo especialmente péptidos de plantas tóxicas y de escorpión tóxicos, se vuelven tópicamente activos o tóxicos cuando se tratan mediante los procesos descritos en la presente invención. Los ejemplos de péptidos adecuados analizados y datos resultantes se proporcionan en la presente. Además de los organismos mencionados anteriormente, también se sabe específicamente que las siguientes especies transportan toxinas adecuadas para volverse especiales mediante el proceso de la presente invención. Se mencionan específicamente las siguientes especies: Agelenopsis aperta, Androctonus australis H ctor, Antrax formidabillis , Antrax infensus, Atrax robustus, Bacillus thuringiensis Bothus martensii Karsch Bothus occitanus tunetanus, Buthacus arenicola, Buthotus judaicus, Buthus occitanus mardochei , Centruroides noxius , Centruroides suffusus suffusus, Hadronyche infensa, Hadronyche versuta, Hadronyche versutus, Hololena curta, Hottentotta judaica, Leiurus quinquestriatus , Leiurus quinquestriatus hebraeus, Leiurus quinquestriatus quinquestriatus , Oldenlandia affinis, Scorpio maurus palmatus , Tityus serrulatus , Tityus zulianu. Cualquier toxina peptídica de cualquiera de los géneros enumerados anteriormente y/o especies de géneros es adecuado para volverse especial de acuerdo con el proceso en la presente invención.

Como se indicó anteriormente, muchos péptidos son candidatos adecuados como objeto del proceso para volverse especiales. Las secuencias que se indican previamente, a continuación y en el listado de secuencias son péptidos especialmente adecuados que se pueden volver especiales y muchos de estos se volvieron especiales de acuerdo con la presente invención, con los resultados que se expresan en los ejemplos a continuación.

Tal como se indicó anteriormente, muchos péptidos son candidatos adecuados como objeto del proceso para la expresión vegetal como PIP. Las secuencias que se indicaron previamente, a continuación y en el listado de secuencias son péptidos especialmente adecuados que se pueden expresar en plantas como PEP y algunos de estos se expresaron en plantas como PEP de acuerdo con la presente invención, con los resultados que se muestran en los ejemplos a continuación.

SEQ ID NO: 1042 (código de una letra).

GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A Denominada "U+2-ACTX-Hvla", cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 5-20, 12-25, 19-39. El peso molecular es de 4564,85 Daltons.

Otro ejemplo de una proteína insecticida del motivo de ICK es la SEQ ID NO: 1010.

SEQ ID NO: 661 (código de una letra).

QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVY YCRA SEQ ID NO: 661, denominada "Híbrido-ACTX-Hvla", tiene puentes de disulfuro en las posiciones: 3-18, 10-23, 17-37.

El peso molecular es de 4426.84 Daltons.

SEQ ID NO: 593 (código de una letra).

SPTCI PSGQP CPYNE NCCSQ SCTFK ENENG NTVKR CD SEQ ID NO: 593 (código de tres letras).

Ser Pro Thr Cys lie Pro Ser Gly Gln Pro Cys Pro Tyr Asn Glu Asn Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly Asn Thr Val Lys Arg Cys Asp Denominada "w-ACTX-Hvla", cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 4-18, 11-22 y 17-36. El peso molecular es de 4096.

SEQ ID NO: 650 (código de una letra).

GSSPT CIPSG QPCPY NENCC SQSCT FKENE NGNTV KRCD SEQ ID NO: 650 (código de tres letras).

Gly Ser Ser Pro Thr Cys lie Pro Ser Gly Gln Pro Cys Pro Tyr Asn Glu Asn Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly Asn Thr Val Lys Arg Cys Asp Denominada "G)-ACTX-Hvla+2", cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 6-20, 13-24 y 19-38. El peso molecular es de 4199.

SEQ ID NO: 651 (código de una letra).

GSAIC TGADR PCAAC CPCCP GTSCK AESNG VSYCR KDEP SEQ ID NO: 651 (código de tres letras).

Gly Ser Ala lie Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys Cys Pro Cys Cys Pro Gly Thr Ser Cys Lys Ala Glu Ser Asn Gly Val Ser Tyr Cys Arg Lys Asp Glu Pro Denominada "GK-ACTX-HVIC", cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 5-19, 12-24, 15-16, 18-34. El peso molecular es de 3912,15.

SEQ ID NO: 652 (código de tres letras).

Gly Ser Gln Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr Gln Pro Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gln Glu Arg Asn Glu Asn Gly His Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala Denominada "rU-ACTX-Hvla ( "híbrido")+2", cuenta con puentes de disulfuro en las posiciones: 5-20, 12-25, 19-39.

El peso molecular es de 4570,51.

Se proporcionan otros ejemplos de péptidos de ICK en el listado de secuencias. Las SEQ ID NO: 534-707 son secuencias de péptidos de ICK e incluyen las toxinas "kappa" / "omega" y las toxinas "híbridas". La SEQ ID NO: 593 es omega-ACTX-Hvla. La SEQ ID NO: 661 es híbrido-ACTX-Hvla o U-ACTX-Hvla.

Sección . Los péptidos del motivo de TMOF o péptidos de TMOF "Motivo de TMOF" o "proteínas de TMOF" significa el péptido del factor oostático modulador de tripsina. En la presente se proporcionan diversos ejemplos y variantes. La SEQ ID NO: 708 es la secuencia de TMOF de tipo salvaje. Otras variantes no taxativas se proporcionan en las SEQ. ID. NO: 709-721. Un experto en la téenica puede conocer o generar otros ejemplos.

Sección III. Proteínas de Bt Bt son las iniciales de una bacteria denominada Bacillus thuringiensis . La bacteria Bt produce una familia de péptidos que son tóxicos para muchos insectos. Se sabe bien que los péptidos tóxicos de Bt tienen capacidad de producir inclusiones de proteína cristalina parasporal (normalmente denominados cristales) que se encuentran dentro de las dos clases principales de toxinas, citolisinas (Cyt) y proteínas de Bt de cristal (Cry). Desde la clonación y el secuenciamiento de los primeros genes de proteínas de cristal a principios de los años '80, se han caracterizado muchos otros y ahora se clasifican de acuerdo con la nomenclatura de Crickmore et ál. (1998). Generalmente, las proteínas Cyt son tóxicas hacia los órdenes de insectos Coleópteros (escarabajos) y Dípteros (moscas), y las proteínas Cry se dirigen a Lepidópteros (polillas y mariposas). Las proteínas Cry se unen a receptores específicos en las células de la membrana del intestino medio (epitelial), lo cual produce una ruptura de las células. Si una proteína Cry no puede encontrar un receptor específico en la célula epitelial a la que se puede unir, entonces no es tóxica. Las cepas de Bt pueden tener complementos diferentes de proteínas Cyt y Cry y, por lo tanto, definen sus espectros de hospedadores. Se identificaron los genes que codifican muchas proteínas Cry.

Actualmente hay cuatro fatotipos principales de péptidos parasporales de Bt insecticidas según la especificidad del orden: Específicos de lepidópteros (Cryl, ahora Cryl), específicos de Coleópteros (CrylII, ahora Cry3), específicos de Dípteros (CrylV, ahora Cry4, Cry 10, Cryll; y CytA, ahora CytlA), y Cryll (ahora Cry2), la única familia que en ese momento se sabía que tenía especificidad dual (Lepidópteros y Dípteros). La actividad en órdenes cruzados ahora es evidente en muchos casos.

La nomenclatura le asigna a las secuencias de holotipos un nombre exclusivo que incorpora intervalos según el grado de divergencia, con límites entre el intervalo primario (números arábigos), secundario (letra mayúscula) y terciario (letra minúscula) que representan identidades de aproximadamente 95 %, 78 % y 45 %. Se utiliza un cuarto intervalo (otro número arábigo) para indicar aislamientos independientes de genes de toxinas de holotipo con secuencias idénticas o solo ligeramente diferentes. En la actualidad, la nomenclatura distingue 174 secuencias de holotipos que se agrupan en 55 familias cry y 2 cyt (Crickmore, N., Zeigler, D.R., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Daum, J, Bravo, A., Dean, D.H., B. thuringiensis toxin nomenclature) . Cualquiera de estas proteínas de cristal y los genes que las producen se pueden utilizar para producir una toxina relacionada con Bt adecuada para la presente invención.

También se incluyen en las descripciones de la presente invención familias de proteínas de cristal altamente relacionadas producidas por otras bacterias: Cryl6 y Cryl7 de Clostridium bifermentans (Barloy et ál., 1996, 1998), Cryl8 de Bacillus popilliae (Zhang et ál., 1997), Cry43 de Paenibacillus lentimorbis (Yokoyama et ál., 2004) y las Cry48/Cry49 binarias producidas por Bacillus sphaericus (Jones et ál., 2008). Otras proteínas pesticidas secretadas o cristalinas, como las proteínas de capa S (Peña et ál., 2006) incluidas en la presente son proteínas de cristal con alteración genética, salvo aquellas que se modificaron a través de sustituciones únicas de aminoácidos (p. ej., Lambert et ál., 1996). Se puede utilizar cualquiera de estos genes para producir una toxina relacionada con Bt adecuada para la presente invención.

Ejemplos de Bt En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que corresponden a secuencias de ácido nucleico de la proteína de Bt. Adicionalmente, se comprenden secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos. En particular, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, que se incorpora en su totalidad a la presente mediante referencia, y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia. La SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 o 18 o una secuencia de nucleótidos que se indica en la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o 17, así co o variantes y fragmentos de esta. También se comprenden secuencias de nucleótidos complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención o que se hibridan en una secuencia de la invención.

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen el conjunto de secuencias que se indica en US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o 17 y variantes, fragmentos y complementos de estas. "Complemento" pretende indicar una secuencia de nucleótidos suficientemente complementaria con respecto a una secuencia de nucleótidos dada de forma que se pueda hibridar a la secuencia de nucleótidos dada y así formar una estructura doble estable. La secuencia de aminoácidos correspondiente para la proteína de Bt codificada por esta secuencia de nucleótidos se indica en las SEQ ID NO: 33-533.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas proteínas de Bt que codifican secuencias de nucleótidos también se encuentran comprendidas por la presente invención (por ejemplo, US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante referencia, y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia. La SEQ ID NO: 8 es un fragmento de la SEQ ID NO: 4 y 12, SEQ ID NO: 4 es un fragmento de la SEQ ID NO: 2). "Fragmento" pretende indicar una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de Bt. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una parte biológicamente activa de una proteína de Bt o puede ser un fragmento que se puede utilizar como sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando métodos descritos en la presente a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de proteína de Bt comprenden al menos alrededor de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1860, 1870, 1880, 1885 nucleótidos contiguos o hasta la cantidad de nucleótidos presente en una proteína de Bt de longitud completa que codifica la secuencia de nucleótidos descrita en la presente (por ejemplo, 1890 nucleótidos para US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009. En la presente estos se proporcionan como SEQ ID NO: 1 y 2, 1806 nucleótidos para la SEQ ID NO: 4, 1743 nucleótidos para la SEQ ID NO: 6, 7, 8 y 16, 1809 nucleótidos para la SEQ ID NO: 10, y 1752 nucleótidos para la SEQ ID NO: 12 y 14, en el listado de secuencias) dependiendo del uso deseado. Nucleótidos "contiguos" pretende indicar residuos de nucleótidos inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína de proteína de Bt y, por lo tanto, retienen la actividad pesticida. "Retiene la actividad" pretende indicar que el fragmento tendrá al menos alrededor de 30 %, al menos alrededor de 50 %, al menos alrededor de 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más actividad pesticida de la proteína de Bt. En la téenica se conocen métodos para medir la actividad pesticida. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol.83:2480-2485; Andrews et ál. (1988) Biochem. J.252:199-206; Marrone et ál. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense n° 5,743,477, todos los cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia, y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia.

Un fragmento de una proteína de Bt que codifica una secuencia de nucleótidos que codifica una parte biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos alrededor de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 560, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600 aminoácidos contiguos o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en una proteína de proteína de Bt de longitud completa de la invención (por ejemplo, 580 aminoácidos para la SEQ ID NO: 41, 602 aminoácidos para la SEQ ID NO: 43, y 583 aminoácidos para la SEQ ID NO: 45 y 47).

Las proteínas de proteína de Bt preferidas de la presente invención se codifican mediante una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante referencia y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia, las secuencias 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o 17. "Suficientemente idéntica" pretende indicar una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene al menos alrededor de 60 % o 65 % de identidad de secuencia, alrededor de 70 % o 75 % de identidad de secuencia, alrededor de 80 % u 85 % de identidad de secuencia, alrededor de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia que utiliza uno de los programas de alineación descritos en la presente usando parámetros estándar. Un experto en la téenica reconocerá que estos valores se pueden ajustar de manera apropiada para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas mediante dos secuencias de nucleótidos considerando la degradación de los codones, la similitud de aminoácidos, la posición del marco de lectura y similares.

La invención también comprende moléculas de ácido nucleico variante (por ejemplo, US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante referencia, y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia, la secuencia 2 es una variante de la secuencia 1, las secuencias 7 y 8 son variantes de la secuencia 6, la secuencia 10 es una variante de las secuencias 4 y 12, y la secuencia 14 es una variante de la secuencia 12). "Variantes" de la proteína de Bt que codifica secuencias de nucleótidos incluyen las secuencias que codifican la proteína de Bt descrita en la presente pero difieren de forma conservativa debido a la degradación del código genético, así como las que son suficientemente idénticas tal como se indicó anteriormente.

Las variantes alélicas de origen natural se pueden identificar usando téenicas de biología molecular muy conocidas, como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación tal como se indica a continuación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que se generaron, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio, pero que aun codifican las proteínas de Bt descritas en la presente invención tal como se indica a continuación. Las proteínas variantes comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada de la proteína natural, es decir, retienen la actividad pesticida. "Retiene la actividad" pretende indicar que la variante tendrá al menos alrededor de 30 %, al menos alrededor de 50 %, al menos alrededor de 70 % o al menos alrededor de 80 % de la actividad pesticida de la proteína natural. En la téenica se conocen métodos para medir la actividad pesticida. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et ál. (1988) Biochem. J.252:199-206; Marrone et ál. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente estadounidense n° 5,743,477, todos los cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia, y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia.

Ejemplos de la generación de genes de Bt variantes y sintéticos En un aspecto de la invención, se generaron secuencias de axmi-004 sintéticas, por ejemplo, synaxmi-004 de US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante referencia y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia (secuencia 1) y synax i-004B (secuencia 2). Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de ADN alterada con relación a la secuencia de axmi-004 (secuencia 3) que se indica en U.S. 7,355,099, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante referencia y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia) y codifican la proteína de AXMI-004 original. De la misma forma, se designó synaxmi-004B-2M (secuencia 4) y codifica el sitio de inicio alternativo de axmi-004 (referido en la presente como axmi-004B-2M e indicado en la secuencia 5) identificado originalmente en la solicitud de patente estadounidense con el número de serie 10/782,020.

En otro aspecto de la invención, se identificó un tercer sitio de inicio en la secuencia que codifica axmi-004. Esta región de codificación se designa axmi-004B-3M (US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante referencia y todas las secuencias identificadas según el número que se incorporan específicamente mediante referencia, secuencia 16) y codifica la secuencia de aminoácidos de AXMI-004B-3M que se indica en la secuencia 9. También se designaron las secuencias sintéticas que codifican la proteína de AXMI-004B-3M. Estas secuencias de nucleótidos sintéticas se designaron synaxmi-004B-3M, synaxmi-004C-3M y synaxmi-004D-3M y se indican en las secuencias 6, 7 y 8, respectivamente. En otro aspecto de la invención, se designaron versiones modificadas de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de AXMI-004B-3M de forma que se agreguen residuos del N-terminal a la proteína codificada. Estas secuencias se designan synaxmi-004B-3M-altl (US 2009/0099081, publicada el 18 de abril de 2009, secuencia 10), synaxmi-004B-3M-alt2 (secuencia 12), synax i-004B-3M-alt3 (secuencia 14) y synaxmi-004B-3M-alt4 (secuencia 17). Las proteínas codificadas se designan AXMI-004B-3M-ALT1 (secuencia 11), AXMI-004B-3M-ALT2 (secuencia 13), AXMI-004B-3M-ALT3 (secuencia 15) y AXMI-004B-3M-ALT4 (secuencia 18).

A continuación se pueden encontrar otras proteínas de Bt y descripciones de genes. Todas y cada una de las publicaciones de patente indicadas a continuación con una indicación con respecto a la toxina de Bt a la que se refiere la publicación se incorporan en su totalidad a la presente mediante referencia. Estos documentos también se publicaron y estos y sus secuencias son de dominio público.

Se pueden encontrar más ejemplos de genes de Bt, proteínas y los documentos de patente que los describen en las Tablas 4, 5 y 6 a continuación. Los documentos de patente en las Tablas 4, 5, 6, en particular en las patentes estadounidenses y solicitudes estadounidenses se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia.

Tabla 4. Toxinas de Bt Toxin Número de patente o publicación de Toxin Número depatente o publicación de Cry US2003046726 , US 6833449 , Cry CN195215 CN1260397 , US201026939 , Cry US2006174372 , Cry _ US642241, US6229004,_ Cry US200301796_ US2004194165, Cry W02006053473, US5424409,US5407825, Cry W0200605347 US5135867, Cry US2007061919, Cry W02007107302 , US6855873 , Cry W0200506620 W02004020636 , Cry US2007061919, US6448226, US6048839. US2007061919. US2005097635, AU784649B,US2007061919, US6143550, US6028246, US5679343,US5616319, Cry US2005097635, W02005066202, Cry W02007107302, US2006174372, Cry US6570005, US2005091714, Cry AU784649B, US2007074308, US2008020968, US6043415, US7361 Cry W02007107302,US2007061919, Cryl MXPA0200870 US6172281, Cryl US2004018982, US6166195, Cry WO03082910, MX9606262, US6077937, US5824792, US5407825, Cryl US2004018982, US6166195, Cry US2006174372, US6077937, US5824792, Cry US2007061919, Cryl JP2007006895, Cry US2007061919, Cry2 US5831011, Cr US2007061919, CN1401772, Cry2 US2006218666, Cry US2007061919,AU784649B, MXPA01004361, US5616319,US5356623, Cry2 US2003229919, Cry US5723 Cry2 US2006051822, US2003144192, Cry CN1942582,W09840490, UA75317, US6399330, US2007061919,UA75570, US6949626, MXPA03006130, Cry2 US200315001 US6107278,US6096708, Cry2 US200315001 US7208474, Cry3 CA2410153, Cry US2002152496, RU2278161, Cry3 US200316 US2003054391, Cry3 US2003167522, Cry US5837237,US5723756, Cry3 US2006051822, US2003144192, US5104974, UA75317, US6399330, Cry US5837237, US6949626, Cry WO9840491,US2004018982, Cry4 US200527164 US2001010932, US5985831, Cyt W02007027776, US528153 Cyt US6150165, Cry W02007062064, Cyt US2007163000, EP1681351, US5824792, US6686452, Cry W02007062064, US5973231,US5874288, US683106 Cry US2004018982, Cry US6048839,US5683691, US518709 Tabla 5. Proteínas de cristal insecticidas híbridas y patentes.

Tabla 6. Patentes relacionadas con otras proteínas de cristal insecticidas híbridas El listado de secuencias incluye las secuencias de Bt de la SEQ. ID. NO: 33-533. Estas secuencias incluyen ejemplos de secuencias de proteína Cry y Cyt de la proteína de Bt. Los ejemplos son numerosos y el experto en la téenica conocería muchos otros ejemplos de diversas secuencias de Bt que son sustitutos adecuados para las descritos en la presente descripción.

Sección IV. Composiciones pesticidas y mayor rendimiento de la planta Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo o planta que se va a tratar, simultánea o consecutivamente, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones pesticidas, aceites inactivos, polímeros y/o formulaciones portadoras biodegradables o de liberación prolongada que permiten la dosificación a largo plazo de un área diana luego de una única aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con portadores, tensioactivos o adyuvantes que fomentan la aplicación, aceptables en la agricultura, que se emplean comúnmente en la téenica de la formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias empleadas comúnmente en la tecnología de formulación, p. ej., sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, fijadores, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones se pueden preparar en "cebos" comestibles o se pueden elaborar en "trampas" de plagas para permitir la alimentación o ingestión mediante una plaga diana de la formulación pesticida.

Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen aplicación a la hoja, recubrimiento de semillas y aplicación a la tierra. La cantidad de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de infestación mediante la plaga correspondiente.

La composición se puede formular como un polvo, arena, pelotilla, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, solución o similares, y se puede preparar mediante medios convencionales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En las composiciones que contienen al menos uno de los polipéptidos pesticidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de alrededor de 1 % a alrededor de 99 % en peso.

Se pueden matar o reducir las plagas de lepidópteros o coleópteros en cantidades en un área determinada mediante los métodos de la invención, o se puede aplicar profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación por parte de una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere o entra en contacto con una cantidad eficaz del polipéptido como pesticida. "Cantidad eficaz como pesticida" pretende referirse a una cantidad del pesticida que puede provocar la muerte de al menos una plaga, o reducir perceptiblemente el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores como, por ejemplo, las plagas diana específicas que se van a controlar, el ambiente específico, sitio, planta, cultivo o sitio agrícola que se va a tratar, las condiciones ambientales, y el método, tasa, concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición de polipéptido eficaz como pesticida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales, frecuencia de aplicación y/o gravedad de infestación de la plaga.

Las composiciones pesticidas descritas se pueden elaborar formulando la suspensión de esporas, cristales y/o células bacterianas, o componente de proteína aislada, con el portador deseado aceptable en la agricultura. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado, tal como liofilización, deshidratado por congelación, desecado o en un diluyente adecuado, medio o portador acuoso, tal como solución salina u otro amortiguador. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral) , o agua o emulsiones de aceite/agua, o como un polvo humedecible, o junto con cualquier otro material portador adecuado para la aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son conocidos en la téenica. El término "portador aceptable en la agricultura" abarca todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, fijadores, aglutinantes, etc. que se utilizan comúnmente en la tecnología de formulaciones pesticidas, conocidos por los expertos en la formulación de pesticidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y se pueden preparar mediante varios medios, p. ej., mediante mezcla, fusión y/o molienda homogénea de la composición pesticida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y métodos de aplicación adecuados se describen en la patente estadounidense n. 6,468,523, que se incorpora a la presente mediante referencia.

Métodos para aumentar el rendimiento de las plantas Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia pesticida descrita en la presente. Tal como se define en la presente, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. "Biomasa" pretende referirse a cualquier producto vegetal medido. Un aumento de la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de las hojas de la planta puede aumentar el rendimiento de los vegetales de hoja para el consumo humano o animal. De manera adicional, el aumento de la biomasa de hoja se puede usar para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluye, de modo no taxativo, un aumento de al menos 1 %, un aumento de al menos 3 %, un aumento de al menos 5 %, un aumento de al menos 10 %, un aumento de al menos 20 %, un aumento de al menos 30 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 % o un aumento mayor del rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia pesticida.

En métodos específicos, aumenta el rendimiento de la planta como resultado de una mejora de la resistencia a la plaga de una planta que expresa una proteína pesticida descrita en la presente. La expresión de la proteína pesticida da como resultado una menor capacidad de una plaga de infestar o alimentarse de la planta, mejorando así el rendimiento de la planta.

Sección V. Transformaciones de la planta Se puede usar cualquier combinación de los componentes principales del motivo proteico de ICK y/o motivo proteico de TMOF y proteína de Bt, en un PIP. También se describe la adición de ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) y una proteína de estabilización traduccional y enlazador intermedio para crear un PIP (protector incorporado a la planta) superior y expresado como un PEP (péptido expresado en la planta), con la condición de que se use un mínimo de ambos motivos proteicos de Bt e ICK, se prefiere el uso de estos dos péptidos junto con ERSP. También se puede usar el motivo de TMOF con o en lugar del motivo de ICK. Estas composiciones se pueden generar, utilizar como PEP y expresar como PIP.

Se describen métodos para aumentar la eficacia de la expresión de la planta, para aumentar la acumulación de proteínas expresadas en la planta y para aumentar drásticamente la actividad insecticida de las proteínas expresadas en la planta. Se describe el direccionamiento de los motivos proteicos de ICK al retículo endoplasmático (ER) mediante una proteína de señalización del retículo endoplasmático (ERSP) en plantas, para proporcionar la reticulación covalente correcta de puentes de disulfuro de péptido que generan la estructura del motivo de ICK terciaria esencial necesaria para la actividad insecticida. Se describe adicionalmente el direccionamiento del motivo proteico de ICK al ER mediante una ERSP en plantas, con adición de un dominio de la proteína de estabilización traduccional para aumentar el tamaño de la proteína de fusión de ICK resultante que potencia la acumulación de péptido en la planta. Se describe adicionalmente el direccionamiento del motivo proteico de ICK al ER mediante una ERSP en plantas, con adición de una proteína de estabilización traduccional como se menciona anteriormente, y con adición de una secuencia de péptido intermedio, donde esta última permite la posible escisión y la recuperación de la forma activa del motivo proteico de ICK con actividad insecticida.

La presente invención describe los motivos proteicos de ICK con actividad insecticida que se expresan en la planta y que pueden proteger satisfactoriamente una planta o cultivo del daño de los insectos. Los métodos ilustrados en la presente permitirán que los péptidos no solamente se expresen en una planta sino que se expresen y plieguen adecuadamente, de modo que conserven su actividad insecticida, incluso luego de la expresión en la planta.

Se describe el modo en que se debe modificar el marco de lectura abierto (ORF) de un péptido diana, tal como un motivo proteico de ICK, para que permanezca la actividad biológica deseada luego de la expresión en la planta del motivo proteico de ICK. En una modalidad, se describe un protector incorporado a la planta, o PIP, que expresa una proteína insecticida activa. La proteína insecticida PIP está compuesta por un péptido señal del retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) o motivo proteico del nudo inhibidor de cistina (ICK), donde el ERSP es el N-terminal del motivo proteico de ERSP+ICK unido. Luego, la proteína insecticida PIP se incorpora a una planta elegida para proporcionar resistencia del insecto a la planta. Las células vegetales expresarán y acumularán la proteína insecticida del motivo de ICK con plegamiento adecuado. Cuando un insecto consume las células vegetales, se administrará la proteína insecticida del motivo de ICK con plegamiento adecuado dentro del insecto, donde tendrá actividad insecticida y provocará que el insecto enlentezca o detenga su alimentación, enlentezca sus movimientos, y enlentezca o detenga la reproducción, los cuales proporcionan la protección a la planta del daño causado por los insectos.

Se describen sistemas de expresión transitoria para expresar varios casetes de expresión en plantas. Un transgén expresado que se usa es la proteína fluorescente verde o GFP, que se detecta visualmente cuando se provoca por luz UV. El sistema de expresión transitoria de GFP que se usa para la evaluación de las proteínas transgénicas vegetales es, a todos los efectos prácticos, equivalente al uso de un sistema de planta transgénica estable para estos tipos de evaluaciones.

El motivo de anémona, CRIP, ICK, TMOF se puede unir al ERSP Para que la proteína insecticida del motivo de ICK se pliegue adecuadamente cuando se expresa a partir de una planta transgénica, debe tener un ERSP fusionado en el marco con la proteína insecticida del motivo de ICK. Esto se puede realizar con un motivo de TMOF. Esto se puede lograr de varias maneras. Véase las Figuras 1, 2 y 3. La proteína se debería transportar a través del ER, donde se forman las conexiones correctas del enlace covalente para la formación adecuada de enlaces de disulfuro. Sin la intención de limitarse a la teoría, se considera que el transporte en el ER da como resultado la estructura terciaria correcta del motivo proteico de ICK. Se postula comúnmente que el transporte se logra mediante un componente celular denominado partícula de reconocimiento de señales: la partícula de reconocimiento de señales se une al ribosoma que traduce la proteína, pausa la traducción y transporta el complejo de ribosoma/ARNm a un poro translocador en el ER, donde el ribosoma continúa la traducción y pasa la proteína resultante al ER. Dentro del ER, se escinde el ERSP y los procesos de modificación postraduccional en el ER afectan la proteína. Uno de los procesos implica las isomerasas de disulfuro de proteína, una clase de proteínas que catalizan la formación de enlaces de disulfuro. Sin ninguna señal de la proteína de retención adicional, se transporta la proteína a través del ER hacia el aparato de Golgi, donde se secreta finalmente fuera de la membrana plasmática y dentro del espacio apoplástico. Sin la intención de limitarse a la teoría, se considera que las proteínas, como las proteínas insecticidas, que tienen un motivo de ICK, se deben transportar a través del ER, para que las proteínas tengan la correcta formación de los enlaces de disulfuro, si se expresan en plantas.

ERSP (proteína de señalización del retículo endo 1asmático) Además del texto que figura a continuación, véase la Parte I - 1 (La ERSP o el componente de ersp de los PEP).

La ERSP es la región del N-terminal del complejo del motivo proteico de ERSP+ICK y la parte de ERSP está compuesta por alrededor de 3 a 60 aminoácidos. En algunas modalidades, es de 5 a 50 aminoácidos. En algunas modalidades, es de 10 a 40 aminoácidos, pero más a menudo está compuesta por 15 a 20, 20 a 25 o 25 a 30 aminoácidos. El ERSP es un péptido señal denominado así porque dirige el transporte de una proteína. Los péptidos de señal también se pueden denominar señales dirigidas, secuencias de señal, péptidos de tránsito o señales de localización. Los péptidos de señal para el direccionamiento al ER a menudo son residuos de 15 a 30 aminoácidos de longitud y tienen una organización tripartita, compuesta por un núcleo de residuos hidrofóbicos flanqueado por una región aminoterminal con carga positiva y una región carboxiterminal polar pero sin carga. Ver: Zimmermann, Richard; Eyrisch, Susanne; Ahmad, Mazen y Helms, Volkhard: "Protein translocation across the ER membrane" Biochimica et Biohysica Acta 1808 (2011) 912-924, Elsevier.

Alrededor de la mitad y a menudo más del ERSP está comúnmente compuesto por aminoácidos hidrofóbicos, pero puede variar el porcentaje de aminoácidos en un ERSP que son hidrofóbicos. Sin la intención de limitarse a ninguna teoría sobre el modo en que funciona la invención, se considera que los aminoácidos hidrofóbicos se adhieren a la membrana del ER luego de la traducción y esto permite que la peptidasa del péptido señal escinda el ERSP de la proteína traducida, liberando el motivo proteico de ICK en el ER. Se conocen muchos ERSP. Se conocen muchos ERSP de planta. NO es necesario que el ERSP se obtenga de un ERSP vegetal, los ERSP no vegetales funcionarán con los procedimientos descritos en la presente. Sin embargo, muchos ERSP vegetales son conocidos y se describen en la presente algunos ERSP derivados de plantas. BAAS , por ejemplo, se deriva de la planta Hordeum vulgare.

Un ejemplo de un ERSP usado en la presente es BAAS, la secuencia de BAAS es MANKH LSLSL FLVLL GLSAS LASG (SEQ ID NO: 1035 - código de una letra).

Este péptido, denominado "BAAS" se escinde del motivo de ICK luego de la traducción de la proteína en el ER. El peso molecular es de 2442,94 Daltons. Las Figuras 1-3 muestran una representación de un motivo proteico de ICK unido a un ERSP. Estas figuras podrían representar de la misma forma un motivo proteico de TMOF unido a un ERSP.

ERSP vegetales, que se seleccionan de la secuencia genómica de proteínas que se sabe que se expresan y liberan en el espacio apoplástico de plantas, y unos pocos ejemplos son BAAS, extensina de zanahoria, tabaco PR1. Las siguientes referencias proporcionan descripciones adicionales y se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad. De Loose, M. et ál. "The extensión signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts" Gene, 99 (1991) 95-100. De Loose, M. et ál. describen el análisis estructural de un gen que codifica extensina, de Nicotiana plumbagini folia, cuya secuencia contiene un péptido señal típico para la translocación de la proteína al retículo endoplasmático. Chen, M.H. et ál. "Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells" Plant Physiology, jul 2004; 135(3): 1367-77. Pub ele.2 jul 2004. Chen, M.H. et ál. estudiaron la localización subcelular de oc-amilasas en células vegetales mediante el análisis de la expresión de a-amilasa, con o sin su péptido señal, en tabaco transgénico. Estas y otras referencias ilustran y describen proteínas de estabilización traduccional que se pueden utilizar en los métodos, procedimientos y complejos y construcciones de péptido, proteína y nucleótido descritos en la presente.

La proteína de estabilización traduccional Además del texto a continuación, véase la Parte I - III (El componente de la proteína de estabilización traduccional, STA o sta).

Los procedimientos descritos anteriormente se refieren a proporcionar un ERSP + CRIP, donde ERSP + CRIP podría ser ERSP + ICK, ERSP + que no es de ICK, ERSP + Av (anémona) o los procedimientos podrían referirse a ERSP + TMOF, o podrían referirse a ERSP + CRIP y un TMOF suficiente para que una planta produzca péptidos con plegamiento adecuado. También se sugiere que a veces se necesita más que simplemente el plegamiento adecuado para proteger una planta de algunos insectos de forma más completa. Con un casete de expresión construido adecuadamente, se puede inducir una planta para elaborar y acumular cantidades incluso mayores de péptido tóxico. Cuando una planta acumula mayores cantidades de péptidos tóxicos de CRIP o TMOF con plegamiento adecuado, puede resistir o matar más fácilmente los insectos que atacan y comen las plantas. Una forma de aumentar la actividad insecticida del PIP es con proteínas de estabilización traduccional. Se puede usar la proteína de estabilización traduccional para aumentar considerablemente la acumulación del péptido tóxico en la planta y, por lo tanto, la potencia del PIP, especialmente cuando el PIP tiene una proteína de estabilización traduccional propia. Los procedimientos descritos en la presente pueden proporcionar la acumulación en la planta de grandes cantidades de proteínas de planta transgénica que ahora tienen un plegamiento adecuado. Las plantas transgénicas que expresan tanto una proteína insecticida del motivo de ICK como una proteína de estabilización traduccional, demuestran una acumulación drásticamente mejorada de péptidos de ICK tóxicos en comparación con sistemas sin una proteína de estabilización traduccional. En la presente se describen PIP representativos con una proteína de estabilización traduccional.

Los experimentos que comparan péptidos expresados en la planta, con y sin una proteína de estabilización traduccional, demuestran diferencias drásticas. La expresión de proteína de un motivo proteico de ICK sin una proteína de estabilización traduccional puede ser muy escasa. Cuando se fusiona una proteína de estabilización traduccional con el motivo proteico de ICK, hay niveles más altos de acumulación detectable. La proteína de estabilización traduccional puede ser un dominio de otra proteína o puede comprender una secuencia de proteína completa. La proteína de estabilización traduccional es una proteína con estructura terciaria suficiente que se puede acumular en una célula sin ser la diana del proceso celular de degradación de proteína. La proteína puede ser de entre 5 y 50aa (p. ej., otro motivo proteico de ICK), 50 a 250aa (GNA), 250 a 750aa (p. ej., quitinasa) y 750 a 1500aa (p. ej., enhancin).

La proteína de estabilización traduccional (o dominio de proteína) puede contener proteínas que no tienen características útiles sin ser a la estabilización traduccional, o pueden presentar otros rasgos útiles distintos, además de la estabilización traduccional. Una modalidad de la proteína de estabilización traduccional pueden ser múltiples motivos proteicos de ICK en tándem. Los rasgos útiles pueden incluir: actividad insecticida adicional, tal como actividad que es destructiva para la membrana peritrófica, actividad que es destructiva para la pared intestinal y/o actividad que transporta de forma activa el motivo proteico de ICK a través de la pared intestinal. Una modalidad de la proteína de estabilización traduccional puede ser un polímero de proteínas de fusión que implica motivos proteicos de ICK. Una modalidad de la proteína de estabilización traduccional puede ser un polímero de proteínas de fusión que implica motivos proteicos de TMOF. Se proporciona en la presente un ejemplo específico de una proteína de estabilización traduccional para ilustrar el uso de una proteína de estabilización traduccional. El ejemplo no pretende limitar la descripción o las reivindicaciones de modo alguno. Las proteínas de estabilización traduccional útiles son conocidas en la téenica y se podría utilizar cualquier proteína de este tipo, como se describe en la presente. Los procedimientos para evaluar y analizar la producción de péptidos son conocidos en la técnica y se describen en la presente. Un ejemplo de una proteína de estabilización traduccional es SEQ ID NO:1036, código de una letra, como figura a continuación: SEQ ID NO: 1036 (código de una letra).

ASKGE ELFTG W PIL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT GKLPV PWPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF KDDGN YKTRA EVKFE GDTLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPIGD GPVLL PDNHY LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK La Seq. ID No. 1036 se denomina "GFP" . El peso molecular es de 26736,02 Daltons.

Se pueden encontrar ejemplos adicionales de proteínas de estabilización traduccional en las siguientes referencias, que se incorporan en su totalidad mediante esta referencia: Kramer, K.J. et ál. "Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta" Insect Biochemistry and Molecular Biology, tomo 23, publicación del 6 septiembre 1993, pp.691-701. Kramer, K.J. et ál. aislaron y secuenciaron un ADNc que codifica quitinasa del gusano del tabaco, Manduca sexta. Hashimoto, Y. et ál. "Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus" Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651.

Hashimoto, Y. et ál. clonaron el gen que codifica el factor potenciador viral de una Trichoplusia en el virus de granulosis y determinaron la secuencia de nucleótidos completa. Van Damme, E.J.M. et ál. "Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop ( Galanthus nivalis L.) lectin" European Journal of Biochemistry, 202, 23-30 (1991). Van Damme, E.J.M. et ál. aislaron ARN rico en Poli(A) de ovarios maduros de lectina de campanilla de invierno, y así proporcionaron un único polipéptido de lectina de 17-kDa luego de la traducción en un sistema sin células de germen de trigo. Estas y otras referencias ilustran y describen proteínas de estabilización traduccional que se pueden utilizar en los métodos, procedimientos y complejos y construcciones de péptido, proteína y nucleótido descritos en la presente.

El enlazador intermedio Además del texto a continuación, ver la Parte I - IV (el componente de péptido enlazador intermedio, ENLAZADOR, enlazador, L o si es polinucleótido, enlazador o 1 de los PEP).

La presente invención también incorpora un enlazador intermedio entre el motivo proteico de ICK y la proteína de estabilización traduccional. El enlazador intermedio tiene de 1 a 30 aminoácidos. Puede no tener sitios de escisión ni un sitio de escisión de proteasa específico de proteasas o metaloproteasas serina, treonina, cisterna y aspartato. El enlazador escindible puede ser el punto de digestión mediante las proteasas que se encuentran en el ambiente del intestino del lepidóptero y/o el ambiente de hemolinfa del lepidóptero. Un ejemplo del componente adicional para ilustrar la presente invención se enumera a continuación, pero no se limita a este ejemplo.

El ejemplo de un enlazador intermedio es IGER (SEQ ID NO: 1037).

Denominado "IGER". El peso molecular de este enlazador intermedio es de 473,53 Daltons.

Se pueden encontrar otros ejemplos de enlazadores intermedios en las siguientes referencias, que se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia: Se analiza una comparación del comportamiento de plegamiento de proteínas fluorescentes verdes mediante seis enlazadores distintos en Chang, H.C. et ál. "De novo folding of GFP fusión proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria" Journal of Molecular Biology, 21 oct 2005; 353(2): 397-409. Se demostró que una isoforma de la familia GalNAc-Ts humana, GalNAc-T2, conserva su localización y funcionalidad luego de la expresión en plantas de N. benthamiana, en Daskalova, S.M. et ál. "Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins" BMC Biotechnology, 24 ago 2010; 10: 62. Se demostró la capacidad de las proteínas de plástidos endógenos de trasladarse a través de los estrómulos en Kwok, E.Y. et ál. "GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids" Journal of Experimental Botany, mar 2004; 55(397): 595-604.

Pub ele. 30 ene 2004. Se realizó un informe sobre la modificación genética de la superficie del virión del virus del mosaico del tabaco (TMV), con una hormona decapéptido del mosquito, factor oostático modulador de tripsina (TMOF) por Borovsky, D. et ál. "Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide" Proc Nati Acad Sci, 12 diciembre 2006; 103(50): 18963-18968. Estas y otras referencias ilustran y describen proteínas de estabilización traduccional que se pueden utilizar en los métodos, procedimientos y complejos y construcciones de péptido, proteína y nucleótido descritos en la presente.

Son más conocidas otras transformaciones de plantas Los métodos de la invención implican introducir una construcción de nucleótido en una planta. "Introducir11 pretende presentar la construcción de nucleótido a la planta, de modo tal que la construcción acceda al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren el uso de un método particular para introducir una construcción de nucleótido en una planta, sino que simplemente la construcción de nucleótido acceda al interior de al menos una célula de la planta. En la téenica se conocen métodos para introducir construcciones de nucleótidos que incluyen, de modo no taxativo, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

"Planta" pretende referirse a plantas enteras, órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de estos. Las células vegetales pueden estar diferenciadas o indiferenciadas (p. ej., callos, células de cultivo de suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen).

"Plantas transgénicas", "plantas transformadas" o plantas, células o tejidos "transformados establemente" se refiere a las plantas que se han incorporado o integrado a las secuencias de ácidos nucleicos exógenos o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen las que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como las que pueden ser endógenas, o están presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólogo" se refiere en general a las secuencias de ácidos nucleicos que no son endógenas a la célula o parte del genoma natural en el que están presentes, y se han agregado a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares.

La transformación de células vegetales puede llevarse a cabo mediante una de varias téenicas conocidas en la técnica. El gen de la proteína de Bt de la invención se puede modificar para obtener o potenciar la expresión en células vegetales. Comúnmente, una construcción que expresa la proteína contendría un p^romotor para impulsar la transcripción del gen, así como una región no traducida 3' para permitir la terminación de transcripción y la poliadenilación. La organización de las construcciones es conocida en la téenica. En algunos casos, puede ser útil modificar genéticamente el gen, de modo que se secrete el péptido resultante, o se dirija de otro modo dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, se puede modificar genéticamente el gen para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. También puede ser preferible modificar genéticamente el casete de expresión de la planta para que contenga un intrón, de modo que se requiera el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.

Comúnmente, este "casete de expresión de la planta" se insertará a un "vector de transformación de la planta". Este vector de transformación de la planta puede estar compuesto por uno o más vectores.de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar los vectores de transformación de la planta compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se denominan "vectores binarios" en la técnica. Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, son utilizados con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficaz es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios contienen comúnmente un vector de plásmido que contiene las secuencias que actúan en cis, necesarias para la transferencia de ADN-T (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que se modifica genéticamente para que se pueda expresar en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen modificado genéticamente para que se pueda expresar en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector de plásmido las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis se disponen de manera que permitan la transferencia eficaz en células vegetales y se expresen allí. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y la proteína de Bt se ubican entre los bordes izquierdos y derechos. A menudo, un segundo vector de plásmido contiene los factores que actúan en trans que actúan como intermediarios en la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a células vegetales. A menudo, este plásmido contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales mediante Agrobacterium, y la transferencia de ADN mediante escisión en las secuencias de borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la téenica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Se pueden usar varias cepas de Agrobacterium (p. ej., LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de la planta. No es necesario el segundo vector de plásmido para transformar las plantas mediante otros métodos como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a células vegetales diana (p. ej., embriones inmaduros o maduros, cultivos de suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida de aplicación de un nivel de umbral máximo de la selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa de células no transformadas. Los explantos se transfieren comúnmente a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes luego de colocar el agente de selección en el medio de regeneración complementado con un nivel umbral máximo. Luego, los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar el brote o plántula enraizado. Luego, la plántula transgénica crece en una planta madura y produce semillas fértiles (p. ej., Hiei et ál. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et ál. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantos se transfieren comúnmente a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Se encuentra una descripción general de las téenicas y métodos para generar plantas transgénicas en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células, tanto las células transformadas como no transformadas están presentes en cualquier parte del callo, tejido o grupo de células diana en cuestión. La capacidad de matar las células no transformadas y permitir la proliferación de células transformadas da como resultado cultivos vegetales transformados. A menudo, la capacidad de retirar las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células vegetales transformadas y la generación satisfactoria de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, diana de la transformación. La generación de plantas transgénicas se puede realizar mediante uno de varios métodos que incluyen, de modo no taxativo, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo mediante Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN foráneo heterólogo adherido a las partículas, aceleración de partículas balística, transformación de haz de aerosol (solicitud publicada estadounidense n.° 20010026941, patente estadounidense n.° 4,945,050; publicación internacional n.° WO 91/00915; solicitud estadounidense publicada n.° 2002015066), transformación de Lecl y varios métodos directos no mediados por partículas para transferir ADN.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la téenica. Véase, por ejemplo, Svab et ál. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A.90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J.12:601-606. El método depende de la administración biolística de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y dirige el ADN al genoma del plástido a través de la recombinación homologa. De manera adicional, la transformación de plástido se puede lograr mediante la transactivación de un transgén con plástidos silencioso mediante expresión preferida del tejido de una polimerasa de ARN codificado nuclear y dirigida al plástido. El sistema se ha registrado en McBride et ál. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:7301-7305.

Luego de la integración de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, se aplica un nivel de umbral máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no transformadas y separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección mediante la transferencia regular a un medio nuevo. Mediante el pasaje y exposición continuos con selección apropiada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector de plásmido. Se pueden usar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que se transformaron se pueden cultivar en plantas de acuerdo con los modos convencionales. Véase, por ejemplo, McCormic et ál. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Luego estas plantas se pueden cultivar y se pueden polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes y se puede identificar el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y hereda de forma estable y luego las semillas se cosechan para garantizar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona la semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") con una construcción de nucleótido de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporada de forma estable a su genoma.

Expresión de ICK y TMOF en las plantas Tal como se mencionó anteriormente, hay muchas alternativas que se podrían usar para los componentes de ERSP, motivo proteico de ICK, motivo de TMOF, proteína de estabilización traduccional y enlazador intermedio.

Evaluación de transformaciones de plantas Luego de la introducción de ADN foráneo heterólogo en las células vegetales, se confirma la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta mediante varios métodos como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados al gen integrado.

El análisis de PCR es un método rápido para analizar las células, el tejido o los brotes transformados, para determinar la presencia del gen incorporado en la etapa temprana antes de trasplantarse a la tierra (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y.). Se llevó a cabo la PCR usando cebadores de oligonucleótidos específicos del gen de interés o ambiente de vector de Agrobacterium, etc.

Se puede confirmar la transformación de la planta mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformado, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nylon. La membrana o "transferencia" se coloca en una sonda con, por ejemplo, fragmento de ADN diana .sup.32P radioetiquetado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con las téenicas estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, se aísla ARN de tejidos específicos del transformado, se fracciona en un gel de agarosa de formaldehído y se transfiere a un filtro de nylon de acuerdo con los procedimientos estándar que se utilizan de forma rutinaria en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por la proteína de Bt se analiza mediante hibridación del filtro a una sonda radioactiva derivada de una proteína de Bt, mediante los métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra).

Se puede llevar a cabo Western blot, ensayos bioquímicos y similares en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen de la proteína de Bt mediante procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína de Bt.

Actividad pesticida en plantas En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresan una proteína de Bt que tiene actividad pesticida. Los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo se pueden utilizar para generar plantas transgénicas, pero la manera en que se generan células de plantas transgénicas no es fundamental para la presente invención. Se pueden usar los métodos conocidos o descritos en la téenica, tal como la transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística y métodos no mediados por partículas. Las plantas que expresan una proteína de Bt se pueden aislar mediante métodos comunes descritos en la técnica, por ejemplo, mediante transformación del callo, selección del callo transformado y regeneración de plantas fértiles de el callo transgénico. En los procesos, se puede usar cualquier gen como marcador seleccionable, en la medida en que su expresión en células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar las células transformadas.

Se ha desarrollado una cantidad de marcadores para su uso con células vegetales, tales como la resistencia a cloranf enicol, el aminoglucósido G418, higromicina o similares. También se pueden usar otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo de cloroplastos como marcadores seleccionables. Por ejemplo. los genes que proporcionan resistencia a los herbicidas de plantas, tales como glifosato, bromoxinilo o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Se han indicado los genes (Stalker et ál. (1985) J. Biol. Che .263:6310-6314 (gen de nitrilasa de resistencia a bromoxinilo) y Sathasivan et ál. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a imidazolinona AHAS) . De manera adicional, los genes descritos en la presente son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano de planta (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de estos, son conocidos en la téenica. En una modalidad, se detecta la presencia del transgén mediante el análisis para determinar la actividad insecticida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína de Bt se pueden analizar para determinar la actividad insecticida, y se seleccionan las plantas que muestran actividad óptima para la reproducción adicional. Hay métodos disponibles en la técnica para analizar la actividad de las plagas. En general, la proteína se mezcla y usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et ál . (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

Sección VI. Descripciones y ejemplos de combinaciones Los péptidos de Bt e ICK pueden inhibir el crecimiento, afectar el movimiento o incluso matar a un insecto cuando se administra apropiadamente la combinación de toxina al locus habitado por el insecto. SDP 1234604, 1234605 y 609 son preparaciones en polvo secadas por aspersión del péptido de híbrido+2-ACTX-Hvla, denominado en la presente "péptido de Hvla" . Los polvos de péptido de Hvla secados por aspersión se elaboran a partir del péptido, varios excipientes y derivados de fermentación. Las formulaciones '604 y '605 usan el mismo péptido, solamente los excipientes son distintos. La concentración del péptido híbrido activo se cuantificó a alrededor de 26 % peso/peso tanto en polvos '604 como '605. La concentración del péptido híbrido activo se cuantificó a alrededor de 35 % peso/peso tanto en polvos 609. Se cuantificó el péptido de Hvla en cada polvo usando métodos de rpHPLC C18 conocidos por los expertos en la téenica.

Los péptidos del nudo inhibidor de cisteína o ICK pueden tener estabilidad notoria cuando se exponen al ambiente. Se aíslan muchos péptidos de ICK de animales venenosos, tales como arañas, escorpiones y serpientes. Las proteínas de Bt son conocidas por sus actividades pesticidas específicas. Sorprendentemente, se ha descubierto que cuando se mezclan selectivamente las proteínas de Bt con los péptidos de ICK, la combinación de péptidos de Bt e ICK produce un insecticida muy eficaz con una potencia mucho mayor que la esperada.

Se describe una composición de péptido de la combinación insecticida que comprende tanto una proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) como un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida. La composición se puede encontrar en la relación de Bt a ICK, en peso seco, de alrededor de cualquiera o todas de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores . También se describe una composición en la que la relación de Bt a ICK, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 0:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores.

Los procedimientos descritos en la presente se pueden aplicar a cualquier péptido de PFIP o CRIP. La combinación de péptidos de PFIP y CRIP incluye que uno o ambos de los péptidos de PFIP y CRIP se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepas bacterianas para uno o ambos de los péptidos de PFIP y CRIP. Orígenes de cepa bacteriana significa que los péptidos se pueden describir como que se han expresado mediante una cepa bacteriana que expresa los péptidos con la comprensión de que muchos péptidos de PFIP que incluyen muchas proteínas de Bt también son artificiales en el sentido de que ya no se desarrollan todos a partir de cepas bacterianas.

En otra modalidad, la combinación de péptidos de PFIP y CRIP incluye que uno o ambos de los PFIP, tal como Bt junto con péptidos de ICK, no de ICK y TMOF, derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepas bacterianas para uno o ambos de los péptidos de Bt e ICK. Orígenes de cepa bacteriana significa que los péptidos se pueden describir como que se han expresado mediante una cepa bacteriana que expresa los péptidos con la comprensión de que muchas proteínas de Bt también son artificiales en el sentido de que ya no se desarrollan todas a partir de cepas bacterianas.

Se describen también composiciones en las que uno o ambos de PFIP, tal como Bt, junto con los péptidos de ICK, no de ICK y TMOF, se derivan de entre 2 y 5, 2 - 15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 y otros distintos tipos u orígenes de cepas bacterianas de uno o ambos de los péptidos de Bt o ICK. Se describe una composición en la que uno o ambos de los péptidos de Bt e ICK se codifican mediante 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno o ambos de los péptidos de Bt e ICK. Y cualquiera de estas combinaciones de 2 - 5,2 - 15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 y otras mezclas y tipos distintos de péptidos de Bt e ICK pueden contribuir más de al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición.

Se describe una composición de péptidos de Bt e ICK de las reivindicaciones 33-38, donde la concentración total de PFIP, tal como Bt junto con péptidos de ICK, no de ICK y TMOF en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre cualesquiera dos de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes. Se describen las composiciones en las que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente a los péptidos de ICK, no de ICK y/o TMOF, péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida. Se describen composiciones en las que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, donde el ERSP es BAA.S.

Se describen composiciones donde el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además un dipéptido unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el dipéptido está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, que incluye modalidades en las que el dipéptido es glicina-serina, que incluyen modalidades en las que el péptido de ICK insecticida es cualquier péptido insecticida que inhibe tanto los canales de calcio regulados por voltaje como los canales de potasio activados por calcio en insectos, que incluye las modalidades en las que los péptidos de ICK insecticida provienen de cualquier especie de araña de Sídncy con tela en embudo, que incluye modalidades en las que la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche, que incluye modalidades en las que la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Hadronyche, que incluye modalidades en la que la araña se selecciona de la araña de Sídney con tela en embudo, Hadronyche versuta, que incluye modalidades en las que el péptido de ICK insecticida es híbrido-ACTX-Hvla, que incluye modalidades en las que el péptido de ICK insecticida contiene 20-100 aminoácidos y 2-4 enlaces de disulfuro, que incluye modalidades en las que el péptido de ICK insecticida es cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ICK descritas en la presente, que incluye modalidades en las que el péptido de ICK insecticida se selecciona de publicaciones incorporadas mediante referencia, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es cualquier proteína de Bt insecticida, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es una proteína Cry o Cyt, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt se selecciona de una proteína Cry, una proteína CrylA o una proteína CrylF, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es una combinación de proteína CrylF-CrylA, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28 o 34 de la patente estadounidense n.° 7,304,206, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es Dipel, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es Thuricide.

Se describe una composición que comprende los nucleótidos de: Proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) , y una proteína de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida, en una planta o genoma de planta transformada, donde la relación de Bt a ICK, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores.

Se describe la planta o genoma de planta transformada, donde la relación de PFIP, como Bt a ICK, péptidos de TMOF y que no son de ICK, y preferentemente Bt a ICK o Bt a una toxina de anémona, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de cualesquiera dos de estos valores. La planta o genoma de planta transformada puede tener una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK o Bt y anémona se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de proteínas de Bt o ICK, o una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK se derivan de 2 y 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de una cualquiera de las proteínas de Bt e ICK o ambas proteínas de Bt e ICK se derivan de 2 y 5 distintos tipos u orígenes de cepa, o una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK y al menos una cepa de una cualquiera de Bt o ICK o ambas de las proteínas de Bt e ICK codificadas por más de una copia de los genes de Bt e ICK, o una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK se derivan de más de un distinto tipo u origen de cepa bacteriana de proteínas de Bt y/o ICK, donde todas las cepas de las proteínas de Bt y/o ICK contribuyen más que al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición, o una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK se derivan de 2 a 5 tipos distintos de orígenes de cepa bacteriana de una cualquiera o ambas de las proteínas de Bt e ICK y al menos una cepa de una cualquiera de Bt e ICK o ambas proteínas de Bt e ICK codificadas por más de una copia de los genes de Bt e ICK, o la concentración total de la proteína de Bt e ICK en la composición se puede seleccionar del siguiente porcentaje de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes.

Las composiciones y plantas descritas en la presente incluyen una proteína de combinación insecticida que se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida. En otra modalidad, el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, donde el ERSP es BAAS. En otra modalidad, la planta transgénica que incorpora y expresa los péptidos de combinación a partir de los nucleótidos descritos en la presente, donde el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además nucleótidos que expresan un dipéptido unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el dipéptido está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, y donde el dipéptido está compuesto de un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. En otra modalidad, la planta transgénica tiene un dipéptido que es glicina-serina. En otra modalidad, la planta transgénica tiene péptidos de ICK insecticidas expresados, compuestos por una combinación de péptido insecticida de proteínas de ICK y Bt. Las plantas transgénicas pueden tener un péptido de ICK insecticida derivado de cualquier especie de araña de Sídncy con tela en embudo, o las arañas de Sídney con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche, y la araña de Sídncy con tela en embudo, Hadronyche versuta .

Se describe y reivindica una planta transgénica, donde el péptido de ICK insecticida expresado es Híbrido-ACTX-Hvla y/o el péptido de ICK insecticida expresado puede contener 20-100 aminoácidos y 2-4 enlaces de disulfuro y/o el péptido de ICK insecticida es cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de los péptidos de ICK descritos en la presente. Las plantas transgénicas descritas pueden contener cualquier proteína de Bt conocida, que incluye péptidos en los que la proteína de Bt es una proteína de Cry o Cyt y/o la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1. La proteína de Bt se puede seleccionar de una proteína de Cry, una proteína de CrylA o una proteína de CrylF, o una combinación de proteína de CrylF-CrylA, o comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28 o 34 de la patente estadounidense n.° 7,304,206. Se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es Dipel y se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es Thuricide.

Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos descritos en la presente, donde el promedio de concentración del péptido de Bt e ICK, en una hoja promedio de una planta transformada, es de alrededor de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores. Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada. Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos tóxicos combinados con plegamiento adecuado en la planta transformada y la provocación de la acumulación de los péptidos tóxicos expresados y con plegamiento adecuado en la planta y provocación de un aumento del rendimiento o resistencia de la planta al daño causado por los insectos y el control de las plagas de insectos en cultivos y silvicultura. Se describen plantas generadas por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Se describe el uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en la presente, para generar una planta o transformar estos péptidos o nucleótidos en una planta, y métodos y técnicas para generar estas proteínas en plantas y/o casetes de expresión que comprenden cualquiera de los péptidos y métodos para transformarlos en un genoma de planta y cualquier método para usar, elaborar y transformar cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en una planta, y métodos y técnicas para generar plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos y casetes de expresión funcionales en plantas, que comprenden cualquiera de los péptidos y sus nucleótidos correspondientes y cualquiera de las plantas generadas por los productos y procesos descritos en la presente.

Se describen métodos para usar la invención y proporcionar formulaciones novedosas. La invención es más útil para controlar los insectos. Se describe un método para controlar un insecto que comprende: Aplicar proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) a el insecto, y aplicar un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida a el insecto. Este método se puede usar cuando se aplican juntos la proteína de Bt y el péptido de ICK insecticida en el mismo momento en las mismas composiciones o individualmente en distintas composiciones y en distintos momentos. Se pueden aplicar la proteína de Bt y el péptido de ICK insecticida de forma secuencial, y se puede aplicar a insectos resistentes (a la proteína de Bt). Se puede seleccionar la relación de Bt a ICK, en peso seco, de al menos alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. Se puede seleccionar la relación de Bt a ICK, en peso seco, de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,9 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de péptidos de Bt e ICK. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan entre 2 y 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de péptidos de Bt e ICK o ambos péptidos de Bt e ICK. Cualquiera o ambos péptidos de Bt e ICK se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e ICK se codifican mediante más de una copia de los genes de Bt o ICK. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de los péptidos de Bt y/o ICK, donde todas las cepas de péptidos de Bt y/o ICK contribuyen más de al menos 1 % de los péptidos a partir de cada tipo de cepa en la composición. Cualquiera o ambos péptidos de Bt e ICK se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e .ICK se codifican mediante más de una copia de los genes de Bt o ICK. La concentración total del péptido de Bt e ICK en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes .

Los métodos se puede usar cuando se produzca el péptido de combinación insecticida usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida. En algunas modalidades, los péptidos de combinación insecticidas utilizados se producen usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, donde el ERSP es BAAS.

Se puede usar cualquiera de los péptidos y plantas descritos en la presente para controlar insectos, su crecimiento y daño, especialmente su daño a las plantas. Se puede aplicar la combinación de proteína de Bt y péptido de ICK insecticida pulverizándolo sobre una planta, o el locus del insecto, o el locus de una planta que necesita protección.

También se describen formulaciones que comprenden: Proteína de Bt y un péptido de ICK insecticida que puede incluir cualquiera de las composiciones descritas en la presente o que puede elaborar un experto en la téenica de acuerdo con la presente descripción. Algunas de las formulaciones descritas incluyen el uso de un solvente aprótico polar y/o agua, y/o cuando el solvente aprótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso, el solvente prótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso y el agua está presente en una cantidad de 0-98 % en peso. Las formulaciones incluyen formulaciones donde la proteína de Bt es Dipel y donde el péptido de ICK insecticida es un péptido de híbrido-ACTX-Hvla. Las formulaciones de solvente aprótico polar son especialmente eficaces cuando contienen MSO. Los ejemplos que figuran a continuación pretenden ilustrar y no limitar la invención de forma alguna.

Sección VII. Descripciones y ejemplos de combinaciones de TMOF y Bt Los péptidos de Bt y TMOF pueden inhibir el crecimiento, afectar el movimiento o incluso matar a un insecto cuando se administra apropiadamente la combinación de toxina al locus habitado por el insecto. Los polvos secados por aspersión se elaboran a partir del péptido, varios excipientes y derivados de fermentación.

Se describe una composición de péptido de combinación insecticida que comprende tanto una proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) como un péptido de TMOF insecticida. La composición se puede encontrar en la relación de Bt a TMOF, en peso seco, de alrededor de cualquiera o todas de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. También se describe una composición en la que la relación de Bt a TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 0:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores.

En otra modalidad, la combinación de péptidos de Bt y TMOF incluye cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF que se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana para cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF. Orígenes de cepa bacteriana significa que los péptidos se pueden describir como que se han expresado mediante una cepa bacteriana que expresa los péptidos con la comprensión de que muchas proteínas de Bt también son artificiales en el sentido de que ya no se desarrollan todas a partir de cepas bacterianas.

Se describen también composiciones en las que cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de entre 2 y 5, 2 - 15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 y otros distintos tipos u orígenes de cepas bacterianas de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt o TMOF. Se describe una composición en la que cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se codifican mediante 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF. Y cualquiera de estas combinaciones de 2 - 5, 2 - 15, 2-30, 5-10, 5-15, 5-30, 5-50 y otras mezclas y tipos distintos de péptidos de Bt y TMOF pueden contribuir más de al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición.

Se describe la composición de Bt y TMOF, donde la concentración total del péptido de Bt y TMOF en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes. Se describen composiciones en las que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida. Se describen composiciones en las que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP es BAAS.

Se describen composiciones donde el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además un dipéptido unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el dipéptido está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, que incluye modalidades en las que el dipéptido es glicina-serina, que incluyen modalidades en las que el péptido de TMOF insecticida es cualquiera que incluye las modalidades en las que el péptido de TMOF insecticida tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de TMOF descritas en la presente, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es cualquier proteína de Bt insecticida, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es una proteína de Cry o Cyt, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt se selecciona de una proteína de Cry, una proteína de CrylA o una proteína de CrylF, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es una combinación de proteína CrylF-CrylA, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28 o 34 de la patente estadounidense n.° 7,304,206, que incluye modalidades en las que la endotoxina de Bt es Dipel, que incluye modalidades en las que la proteína de Bt es Thuricide.

Se describe una composición que comprende los nucleótidos de: Proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) , y un péptido de TMOF insecticida, en una planta o genoma de planta transformada, donde la relación de Bt a TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores.

Se describe una planta o genoma de planta en la que la relación de Bt a TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. La planta o genoma de planta transformada puede tener cualquiera o ambos de los péptidos de TMOF se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de péptidos de Bt o TMOF, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno cualquiera de los péptidos de Bt o TMOF o ambos péptidos de Bt y TMOF se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o TMOF o ambos de los péptidos de Bt y TMOF codificados por más de una copia de los genes de Bt o TMOF, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de más de un distinto tipo u origen de cepa bacteriana de péptidos de Bt y/o TMOF, donde todas las cepas de los péptidos de Bt y/o TMOF contribuyen más que al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición, o cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o TMOF o ambos péptidos de Bt y TMOF codificadas por más de una copia de los genes de Bt o TMOF, o la concentración total del péptido de Bt y TMOF en la composición se puede seleccionar del siguiente porcentaje de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes .

Las composiciones y plantas descritas en la presente incluyen un péptido de combinación insecticida que se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida. En otra modalidad, el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP es BAAS. En otra modalidad, la planta transgénica que incorpora y expresa los péptidos de combinación a partir de los nucleótidos descritos en la presente, donde el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además nucleótidos que expresan un dipéptido unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el dipéptido está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. En otra modalidad, la planta transgénica tiene un dipéptido que es glicina-serina. En otra modalidad, la planta transgénica tiene péptidos de TMOF insecticidas expresados, compuestos por una combinación de péptido insecticida de proteínas de TMOF y Bt. Las plantas transgénicas pueden tener un péptido de TMOF insecticida derivado de cualquier especie de TMOF.

Se describe y reivindica una planta transgénica, donde el péptido de TMOF insecticida expresado puede contener 20- 100 aminoácidos y/o el péptido de TMOF insecticida es cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de los péptidos de TMOF descritos en la presente. Las plantas transgénicas descritas pueden contener cualquier proteína de Bt conocida, que incluye péptidos en los que la proteína de Bt es una proteína de Cry o Cyt y/o la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryETSO y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1. La proteína de Bt se puede seleccionar de una proteína de Cry, una proteína de CrylA o una proteína de CrylF, o una proteína de CrylF-CrylA de combinación, o comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 26, 28 o 34 de la patente estadounidense n.° 7,304,206. Se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es Dipel y se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es Thuricide.

Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos descritos en la presente, donde el promedio de concentración del péptido de Bt y TMOF, en una hoja promedio de una planta transformada es de alrededor de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores. Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos tóxicos con plegamiento adecuado en la planta transformada. Se describe y reivindica específicamente una planta transformada que expresa los péptidos tóxicos combinados con plegamiento adecuado en la planta transformada y la provocación de la acumulación de los péptidos tóxicos expresados y con plegamiento adecuado en la planta y la provocación de un aumento del rendimiento o resistencia de la planta al daño causado por los insectos y el control de las plagas de insectos en cultivos y silvicultura. Se describen plantas generadas por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Se describe el uso de cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en la presente, para generar esta planta o transformar estos péptidos o nucleótidos en una planta, y métodos y téenicas para generar estas proteínas en plantas y/o casetes de expresión que comprenden cualquiera de los péptidos y métodos para transformarlos en un genoma de planta y cualquier método para usar, elaborar y transformar cualquiera de los péptidos o nucleótidos descritos en una planta, y métodos y técnicas para generar plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos y casetes de expresión funcionales en plantas, que comprenden cualquiera de los péptidos y sus nucleótidos correspondientes y cualquiera de las plantas generadas por los productos y procesos descritos en la presente.

En algunas modalidades, se describe un gen quimérico que comprende un promotor activo en las plantas, unido operativamente a los ácidos nucleicos o casetes de expresión, como se describe en la presente. Se describe un método para elaborar, producir o usar la combinación de genes descritos en la presente. Se describe un vector recombinante que comprende la combinación de genes descritos en la presente. Se describe un método para elaborar, producir o usar el vector recombinante. Se describe una célula hospedadora transgénica que comprende la combinación de genes descritos en la presente, y el método para elaborar, producir o usar la célula hospedadora transgénica, que puede ser una célula vegetal transgénica y se describe un método para elaborar, producir o usar la célula vegetal transgénica, así como la planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica y el modo de elaborar y usar la planta transgénica. Se describe una planta y semilla transgénica con las propiedades descritas en la presente, derivada de maíz, soja, algodón, arroz, sorgo, pasto varilla, caña de azúcar, alfalfa, patatas o tomates. La semilla transgénica puede tener un gen quimérico que se describe en la presente. Se describen métodos para elaborar, producir o usar la planta y/o semilla transgénica de la presente descripción.

Se describen métodos para usar la invención y proporcionar formulaciones novedosas. La invención es más útil para controlar los insectos. Se describe un método para controlar un insecto que comprende: aplicar proteína de Bt ( Bacillus t huringiensis) a el insecto, y aplicar un péptido de TMOF insecticida a el insecto. Este método se puede usar cuando se aplican juntos la proteína de Bt y el péptido de ICK insecticida en el mismo momento en las mismas composiciones o individualmente en distintas composiciones y en distintos momentos. Se pueden aplicar la proteína de Bt y el péptido de TMOF insecticida de forma secuencial, y se puede aplicar a insectos resistentes a la proteina de Bt. Se puede seleccionar la relación de Bt a TMOF, en peso seco, de al menos alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. Se puede seleccionar la relación de Bt a TMOF, en peso seco, de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de péptidos de Bt y TMOF. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan entre 2 y 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno cualquiera de péptidos de Bt o TMOF o ambos péptidos de Bt y TMOF. Cualquiera o ambos péptidos de Bt y TMOF se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de péptidos de Bt y TMOF y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o TMOF o ambos péptidos de Bt y TMOF se codifican mediante más de una copia de los genes de Bt o TMOF. Cualquiera o ambos de los péptidos de Bt y TMOF se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de los péptidos de Bt y/o TMOF, donde todas las cepas de peptidos de Bt y/o TMOF contribuyen más de al menos 1 % de los péptidos a partir de cada tipo de cepa en la composición. Cualquiera o ambos péptidos de Bt y TMOF se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de péptidos de Bt y TMOF y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o TMOF o ambos péptidos de Bt y TMOF se codifican mediante más de una copia de los genes de Bt o TMOF. La concentración total del péptido de Bt y TMOF en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes.

Los métodos se pueden usar cuando se produce el péptido de combinación insecticida usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida. En algunas modalidades, los péptidos de combinación insecticidas utilizados se producen usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de TMOF insecticida, donde el ERSP es BAAS.

Se puede usar cualquiera de los péptidos y plantas descritos en la presente para controlar insectos, su crecimiento y daño, especialmente su daño a las plantas. Se puede aplicar la combinación de proteína de Bt y péptido de TMOF insecticida pulverizándolo sobre una planta, o el locus del insecto, o el locus de una planta que necesita protección.

También se describen formulaciones que comprenden: proteínas de Bt y un péptido de TMOF insecticida que puede incluir cualquiera de las composiciones descritas en la presente o que puede elaborar un experto en la téenica de acuerdo con la presente descripción. Algunas de las formulaciones descritas incluyen el uso de un solvente aprótico polar y/o agua, y/o cuando el solvente aprótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso, el solvente prótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso y el agua está presente en una cantidad de 0-98 % en peso. Las formulaciones incluyen formulaciones en las que la proteína de Bt es Dipel y en las que el péptido de TMOF insecticida es un péptido similar a cualquiera de los péptidos de TMOF proporcionados en el listado de secuencias. Las formulaciones de solvente aprótico polar son especialmente eficaces cuando contienen MSO. Los ejemplos que figuran a continuación pretenden ilustrar y no limitar la invención de forma alguna.

En resumen, se describe lo siguiente en la Parte 3: Una composición que comprende al menos dos tipos de proteínas o péptidos insecticidas, donde un tipo es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP). Donde la composición puede comprender al menos dos tipos de péptidos insecticidas, donde un tipo es proteína insecticida que forma poros (PFIP), donde la PFIP es una proteína de Bt y el otro tipo es péptido insecticida rico en cisteína (CRIP), donde el CRIP es una proteína de ICK, donde la proteína de ICK deriva de la araña con tela en embudo. Se describe un proceso de: a) evaluación y análisis opcional de un insecto o una muestra de insectos para determinar si los insectos muestran resistencia o no a una PFIP y b) cuando el resultado de la evaluación lleva a la conclusión de que la muestra de insectos es resistente a una PFIP, entonces c) la aplicación de una o más CRIPS y opcionalmente la CRIPS puede ser un ICK de Hadronyche versuta o araña de Sídncy con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis , Atrax infensus, que incluye las toxinas conocidas como polipéptidos de U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb, o mutantes o variantes, o la CRIP puede no ser de ICK de anémonas, de la anémona denominada Anemonia viridi, los péptidos denominados Av2 y Av3, especialmente los péptidos similares a estos en el listado de secuencias. Se describe un método para controlar insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt que comprende crear una composición de al menos dos tipos de péptidos, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas de PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la presente y de cualquiera de las proteínas proporcionadas en el listado de secuencias y luego aplicar la composición al locus del insecto. Se describe un método para controlar insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt que comprende proteger una planta de insectos resistentes a Bt que comprende crear una planta que expresa una combinación de al menos dos péptidos con plegamiento adecuado, donde un tipo de péptido es un péptido insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas de PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones descritas en la presente y de cualquiera de las proteínas proporcionadas en el listado de secuencias. Se describe un proceso de: a) evaluación y análisis opcional de un insecto o una muestra de insectos para determinar si los insectos muestran resistencia o no a una PFIP y b) cuando el resultado de la evaluación lleva a la conclusión de que la muestra de insectos es resistente a una PFIP, entonces c) la aplicación de uno o más CRIPS y opcionalmente d) la aplicación de una combinación de PFIP y CRIP, en aplicaciones simultáneas o secuenciales.

Se describe una composición que comprende al menos dos tipos de proteínas o péptidos insecticidas, donde un tipo es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo es un péptido insecticida rico en cisterna (CRIP). Una composición en la que el CRIP es un ICK y, opcionalmente, el ICK se deriva o se origina de, Hadronyche versuta, o araña de Sídncy con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis , Atrax infensus, que incluye toxinas conocidas como polipéptidos de U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb o mutantes o variantes. Una composición en la que el CRIP no es de ICK y, opcionalmente, el CRIP que no es de ICK se origina o deriva de animales que tienen CRIP que no son de ICK, como anemonas, erizos de mar y babosas marinas, que incluyen opcionalmente la anémona denominada A nemonia viridi, que incluye opcionalmente los péptidos denominados Av2 y Av3, particularmente los péptidos similares a Av2 y Av3, que incluyen los péptidos enumerados en el listado de secuencias o mutantes o variantes. Un método para utilizar la composición para controlar insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt que comprende crear una composición de al menos dos tipos de péptidos, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas de PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la reivindicación 1 y en la presente y de cualquiera de las proteínas que se proporcionan en el listado de secuencias y luego aplicar la composición al locus del insecto. Un método para controlar insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt que comprende proteger a una planta de insectos resistentes a Bt que comprende crear una planta que exprese una combinación de al menos dos péptidos con plegamiento adecuado, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas de PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la presente y de cualquiera de las proteínas que se proporcionan en el listado de secuencias. Un método para controlar insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt, en el que se administra la CRIP en cualquier momento durante el cual la PFIP afecta el revestimiento del intestino del insecto. Un método para controlar insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt, en el que se administra la CRIP luego de analizar al insecto para determinar la resistencia a Bt y, donde el análisis del insecto dio positivo para resistencia a Bt. La aplicación o administración de cualquiera de los compuestos descritos en la presente en forma sólida o líquida al insecto, el locus del insecto o como un protector incorporado a la planta.

Se describe una composición que comprende al menos dos tipos de péptidos insecticidas, donde un tipo es una proteína insecticida que forma poros (PFIP), donde el PFIP es una proteína de cry y el otro tipo es péptido insecticida rico en cisteína (CRIP), donde el CRIP es una proteína de ICK, donde la proteína de ICK se deriva de la araña con tela en embudo. Se describe una composición que comprende al menos dos tipos de péptidos insecticidas, donde un tipo es un péptido insecticida que forma poros (PFIP), donde el PFIP tiene como su origen en el organismo de Bt y el otro tipo es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP), donde el CRIP es una proteína que no es de ICK. Se describe una composición que comprende al menos dos tipos de péptidos insecticidas, donde un tipo es un péptido insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo es un TMOF. Se describe un método para proteger una planta de insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt, que comprende crear una planta que incorpora una combinación de al menos dos distintos tipos de péptidos, donde un tipo de péptido es un péptido insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP). Se describe un método para proteger a una planta de insectos que incluyen los insectos resistentes a Bt, que comprende crear una planta que exprese una combinación de al menos dos péptidos con plegamiento adecuado, donde un tipo de péptido es un péptido insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisterna (CRIP) y las proteínas PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la presente y de cualquiera de las proteínas que se proporcionan en el listado de secuencias.

Se describe una composición de péptido de combinación insecticida que comprende proteína insecticida rica en cisteína (CRIP), tal como un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida como un péptido de araña o que no es de ICK, como una toxina de anémona, combinado con una proteína insecticida que forma poros (PFIP), como un péptido de Bt, tal como cry, cyp o VIP; o una proteína insecticida rica en cisteína (CRIP), tal como un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida combinado con un péptido de TMOF (factor oostático modulador de tripsina). Cabe destacar que CRIP puede ser una proteína que no es de ICK, como un péptido de anémona, tal como Av2 y Av3, y otras secuencias similares en el listado de secuencias. Se describen las composiciones en las que la relación de Bt a CRIP, Bt a ICK, Bt a CRIP que no es de ICK, Bt a TMOF o Bt a ICK y TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. De manera alternativa, cuando la relación de Bt a CRIP, Bt a ICK, Bt a CRIP que no es de ICK, Bt a TMOF y TMOF, y anémona, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores. De manera alternativa, cuando la relación de Bt a CRIP, Bt a ICK, Bt CRIP que no es de ICK, Bt a TMOF o Bt a ICK y TMOF, y los péptidos de anémona se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK. De manera alternativa, cuando los péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémona y péptidos de TMOF se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémona y péptidos de TMOF se derivan de 2 a 5 cepas distintas. De manera alternativa, cuando cualquiera o ambos de los péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno cualquiera o todos los péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémona y péptidos de TMOF. De manera alternativa, cuando cualquiera o ambos de los péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF están codificados a partir de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno cualquiera o todos los péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémona y péptidos de TMOF. De manera alternativa, cuando uno o todos los péptidos de Bt, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno cualquiera o todos los péptidos de Bt, ICK y TMOF y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF o ambos péptidos de Bt, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF, y Bt y ICK, péptidos de Bt y TMOF o Bt e ICK + TMOF están codificados por más de una copia de los genes de Bt o ICK. De manera alternativa, cuando cualquiera o ambos de los péptidos de Bt, CRIP, ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF se derivan de 2 a 15 cepas o tipos bacterianos de péptidos de Bt y/o ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF, donde todas las cepas de péptidos de Bt y/o ICK contribuyen más de al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición.

Se describe una composición de péptidos de Bt e ICK, CRIP que no es de ICK, péptidos de anémonas y péptidos de TMOF de los números 1-9, donde la concentración total de péptido de Bt y CRIP en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentraciones: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes. Se describe una composición en la que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de CRIP insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de CRIP insecticida. Se describe una composición en la que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de CRIP insecticida, donde el ERSP es BAAS. Se describe una composición en la que el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además un dipéptido unido operativamente al péptido de CRIP insecticida, donde el dipéptido está unido en el N-terminal del péptido de CRIP insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. Se describe una composición en la que el dipéptido es glicina-serina.

Se describe una composición en la que el péptido de CRIP insecticida es cualquier péptido insecticida que inhibe tanto los canales de calcio regulados por voltaje como los canales de potasio activados por voltaje en insectos, y donde el péptido de CRIP insecticida se origina de cualquier especie de araña de Sídncy con tela en embudo, y donde la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche, y donde la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Hadronyche, y donde la araña se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo, Hadronyche versuta, y donde el péptido de CRIP insecticida es Híbrido-ACTX-Hvla, y donde el péptido de CRIP insecticida contiene 20-100 aminoácidos y 2-4 enlaces de disulfuro, donde el péptido de CRIP insecticida es cualquier péptido insecticida con al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de los péptidos en el listado de secuencias.

Se describe un péptido de CRIP insecticida de la proteína de Bt y donde la proteína de Bt es una proteína de Cry o Cyt o se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1. Se describe una proteína de Bt que se selecciona de una proteína de Cry, una proteína de CrylA o una proteína de CrylF. Se describe donde la proteína de Bt es una combinación de una proteína de CrylF-CrylA, Dipel o Thuricide y donde la proteína de Bt se deriva de Bacillus thuringiensis kurstaki .

Se describen composiciones que comprenden los nucleótidos de un PFIP, tal como la proteína de Bt ( Bacillus thuringiensis) y un CRIP, tal como un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida o un péptido que no es de ICK, en una planta o genoma de planta transformada, y donde la relación de Bt a ICK, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores, o donde la composición de número 33, en una planta o genoma de planta transformada, y donde la relación de Bt a ICK, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 0:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de dos cualesquiera de estos valores.

Se describe una composición donde cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de péptidos de Bt o ICK, donde cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de uno cualquiera de los péptidos de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e ICK se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa, donde cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt e ICK o ambos de los péptidos de Bt e ICK codificados por más de una copia de los genes de Bt o ICK, donde cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de más de un distinto tipo u origen de cepa bacteriana de péptidos de Bt y/o ICK, donde todas las cepas de los péptidos de Bt y/o ICK contribuyen más que al menos 1 % de cada tipo de cepa a la composición, donde cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK se derivan de 2 a 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno cualquiera de Bt o ICK o ambos péptidos de Bt e ICK codificados por más de una copia de los genes de Bt o ICK.

Se describe una composición donde la concentración total del péptido de Bt e ICK expresado transgénicamente que resulta de la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre cualesquiera dos de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes. Se describe una composición en la que el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de ICK insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de ICK insecticida, y donde el péptido de combinación insecticida se produce usando un casete genético que comprende además un ERSP (péptido señal del retículo endoplasmático) unido operativamente al péptido de CRIP insecticida, donde el ERSP está unido en el N-terminal del péptido de CRIP insecticida, donde el ERSP es BAA.S.

Se describe una planta transgénica que incorpora y expresa los péptidos de combinación descritos en la presente, donde el péptido de combinación se produce usando un casete genético que comprende además nucleótidos que expresan un dipéptido unido operativamente al (péptido) de CRIP insecticida, donde el dipéptido está codificado de modo de unirse covalentemente en el N-terminal del CRIP insecticida, y donde el dipéptido está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido. Se describe una planta transgénica, donde el péptido transformado incluye un dipéptido con una glicina-serina en el N-terminal. Se describe una planta transgénica, donde los péptidos insecticidas expresados son cualquier combinación de péptido insecticida de CRIP y PFIP (o péptidos de Bt) que permite que el péptido ingrese al intestino y luego inhiba tanto los canales de calcio regulados por voltaje como los canales de potasio activados por calcio en insectos.

Se describe una planta transgénica, donde el péptido de CRIP insecticida producido recombinantemente se deriva de una araña de Sídncy con tela en embudo o anémona y se describen y proporcionan ejemplos reales o teóricos de plantas transformadas, transformadas con un CRIP de una araña que se selecciona de las arañas de Sídney con tela en embudo del género Atrax o Hadronyche o una anémona que se selecciona de Anemonia viridis . La planta transgénica puede tener péptido de ICK insecticida expresado que es Híbrido-ACTX-Hvla. El CRIP puede ser de ICK o no de ICK que cuando se expresa contiene 20-100 aminoácidos y 2-4 enlaces de disulfuro. Los péptidos de PIP pueden tener al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 33, y/o el péptido que se selecciona de la SEQ ID NO: 33-1032.

Se describe una planta transgénica, donde la proteína de Bt es cualquier proteína de Bt insecticida y donde la proteína de Bt es una proteína de Cry o Cyt, y donde la proteína de Bt se selecciona del grupo que consiste en Cryl, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22f TIC901, TIC201, TIC407, TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80, y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812 y una proteína insecticida binaria PS149B1, y donde la proteína de Bt se selecciona de una proteína de Cry, una proteína de CrylA o una proteína de CrylF, y donde la proteína de Bt es una combinación de proteína de CrylF-CrylA, Dipel y/o Thuricide.

Se describe una planta transgénica, donde el promedio de concentración de péptido de Bt e ICK/que no es de ICK, en una hoja promedio de una planta transformada es de alrededor de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % de la proteína soluble recuperable total, o cualquier intervalo entre cualesquiera dos de estos valores, y donde la planta transformada que expresa los péptidos tóxicos con plega iento adecuado en la planta transformada, y donde provoca la acumulación de los péptidos tóxicos expresados y con plegamiento adecuado en la planta y provoca un aumento en el rendimiento o resistencia de la planta al daño provocado por insectos. Se describen estas composiciones y procedimientos para controlar los insectos.

Se describen casetes de expresión que comprenden cualquiera de los nucleótidos que expresan cualquier péptido mencionado en la presente. Se describe un casete de expresión funcional incorporado en una planta transformada, que comprende nucleótidos que codifican cualquiera de los péptidos descritos en la presente o que podría generar un experto en la téenica de acuerdo con la descripción de la presente. Se describen procedimientos para la generación de plantas transformadas que tienen o expresan cualquiera de los péptidos de combinación descritos en la presente. Se describe una planta generada por cualquiera de los productos y procesos descritos en la presente.

Se describe un gen quimérico que comprende un promotor activo en plantas unido operativamente a los ácidos nucleicos o casetes de expresión que se describen en la presente y el método para elaborar, producir o usar la combinación de genes descritos en la presente. Se describe un vector recombinante que comprende la combinación de genes descritos en la presente. Se describe un método para elaborar, producir o usar los vectores recombinantes, una célula hospedadora transgénica que comprende la combinación de genes, la célula hospedadora transgénica que es una célula vegetal transgénica, la planta transgénica y las plantas transgénicas que son maíz, soja, algodón, arroz, sorgo, pasto varilla, caña de azúcar, alfalfa, patatas o tomates, y las semillas para estas y otras plantas, y donde la semilla comprende un gen quimérico.

Se describe un método para controlar un insecto o el sitio de un sitio, que comprende: aplicar un PFIP, proteína tipo Bt ( Bacillus thuringiensis) a el insecto, seguido de una aplicación de cualquier combinación de los siguientes: un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) a el insecto y junto con o como alternativa a aplicar un péptido de ICK (nudo inhibidor de cistina) insecticida a el insecto y junto con o como alternativa a aplicar un péptido de CRIP que no es de ICK a el insecto y junto con o como alternativa a aplicar un péptido de TMOF a el insecto, aplicar un péptido de anémona a el insecto.

Se explica que se aplican la proteína de Bt y el péptido de CRIP, ICK y/o TMOF insecticida de modo que funcionen juntos, pero no tienen que aplicarse necesariamente en el mismo momento. El PFIP como una proteína de Bt y el péptido de CRIP, ICK y/o TMOF insecticida se aplica simultánea o secuencialmente.

Explicamos las cantidades de la siguiente manera: la relación de Bt a CRIP, Bt a ICK, Bt a CRIP que no es de ICK, Bt a TMOF o Bt a ICK y TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 y 1:99, o cualquier combinación de cualesquiera dos de estos valores; de manera alternativa, la relación de Bt a CRIP, Bt a ICK, Bt a CRIP que no es de ICK, Bt a TMOF o Bt a ICK y TMOF, en peso seco, se selecciona de alrededor de las siguientes relaciones: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 1:99, 0,5:99,5, 0,1:99,9 y 0,01:99,99 o cualquier combinación de cualesquiera dos de estos valores.

Se explica que ambos o todos los péptidos de Bt + CRIP; Bt + ICK, Bt+ CRIP que no es de ICK, Bt + TMOF o Bt + ICK + TMOF; se derivan de más de 1 distinto tipo u origen de cepa bacteriana de Bt, o ICK y TMOF y/o ambos de los péptidos de Bt y CRIP, ICK, CRIP que no es de ICK, Bt y TMOF o Bt e ICK + TMOF; Bt + anémona se derivan de entre 2 y 5 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera uno de uno, dos o más de péptidos de Bt, CRIP, ICK, CRIP que no es de ICK, anémonas o péptidos de TMOF, y/o uno cualquiera de uno, dos o todos los péptidos de Bt, ICK y TMOF se derivan de 2 a 15 distintos tipos u orígenes de cepa bacteriana de cualquiera o ambos de los péptidos de Bt e ICK y al menos una cepa de uno, dos o todos los péptidos de Bt, CRIP, ICK, CRIP que no es de ICK, anémona o péptidos de TMOF codificados por más de una copia de uno, dos o todos los péptidos de Bt, CRIP, ICK, CRIP que no es de ICK, anémona o genes de TMOF.

Se explica que uno, dos o todos los péptidos de Bt, ICK y TMOF se derivan de más de 1 tipo u origen de cepa bacteriana distinto de uno, dos o todos los péptidos de Bt, ICK y TMOF, donde todas las cepas de uno, dos o todos los péptidos de Bt, ICK y TMOF contribuyen con más de al menos 1 % de los péptidos de cada tipo de cepa en la composición. La concentración total del péptido de Bt y CRIP en la composición se selecciona de los siguientes porcentajes de concentración: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o cualquier intervalo entre cualesquiera dos de estos valores, y el porcentaje restante de la composición está compuesto por excipientes.

Se proporciona suficiente información de que un experto en la téenica podría elaborar una formulación que comprende: un PFIP, tal como una proteína de Bt, y un CRIP, tal como un péptido de ICK o que no es de ICK insecticida y/o un péptido de TMOF. Se explica que las formulaciones podrían realizarse utilizando un solvente aprótico polar y un solvente prótico polar y que comprenden además agua. En algunas formulaciones, el solvente aprótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso, el solvente prótico polar está presente en una cantidad de 1-99 % en peso y el agua está presente en una cantidad de 0-98 % en peso y puede comprender adicionalmente MSO.

Ejemplo 1 Bioensayo foliar usando SDP 1234604 y 1234605 contra Spodoptera exigua en lechuga romana de Mud Lakes Far s Objetivo: El propósito de este experimento se diseña para determinar el porcentaje de mortalidad que ocurre contra S. exigua cuando se pulverizan SDP 1234604 (formulación % en peso) y 605 (formulación pre-gran) contra larvas en estadio 1, 2, 3 y 4 en un bioensayo de disco de hojas foliares.

Preparación de ensayos y formulación de tratamiento: Se recibieron huevos de S. exigua de Benzon Research. Los huevos se colocaron a 10 °C en el enfriador de vino durante dos días y luego se trasladaron al conjunto de incubadoras a baja temperatura VWR a 28 °C y 2-30 % de humedad relativa en un soporte bajo luz LED, hasta que los neonatos recientemente incubados llegaron a ~24 horas de edad para el primer experimento. Se recibió lechuga de Mud Lake Farms el 09/07/12 y se almacenó a 4 °C en un refrigerador hasta su uso. Para cada estadio, las larvas se colocaron en lechuga de mud lakes farms luego de 24 horas en la incubadora. Se cortaron las hojas de lechuga y se colocaron en un recipiente de polietileno cuadrado mediano y las larvas se colocaron en el recipiente. Luego de 24 horas, se retiraron las larvas de la lechuga vieja y se remplazó por lechuga nueva para que las larvas se desarrollaran por lo menos en tejido superior. Esto ocurrió una vez al día, durante tres días, hasta que las larvas llegaron a las 96 horas de edad. Se cortaron las hojas de lechuga en discos usando un arco de 2 ¼ pulgadas esterilizado con 70 % de etanol y lavado para retirar cualquier tejido de hoja de los ensayos anteriores. Los discos de hojas se perforaron sobre una tabla de cortar de bambú auténtico. Se usó una solución blanqueadora muy diluida de 12 ppm (dilución de 1/500 de solución de hipoclorito de 6 ppt [blanqueador Clorox]) para esterilizar el tejido de hoja sin dañar los discos de hoja antes del enjuague cuádruple. Los discos de hoja se sometieron al tratamiento blanqueador de 12 ppm colocando los discos de hoja cortados en una solución de 12 ppm de blanqueador en un recipiente de polietileno rectangular grande (cubierto con una tapa) y agitándolo a 3500 rpm en un agitador orbital durante 1,5 minutos. Luego, se drenó la solución blanqueadora del depósito y las hojas se enjuagaron en depósitos con dH20 cuatro veces para retirar el blanqueador residual con agitación leve en diH20 en el agitador orbital. Los discos de hoja se colocaron en toallas de papel y se cubrieron con toallas de papel adicionales de modo que no se deshidrataran. Luego, solamente los discos más planos, circulares y uniformes se secaron a mano con Kimwipes para retirar el agua remanente y se colocaron en recipientes Tupperware etiquetados con la cara abaxial hacia arriba para la pulverización. Durante este momento, las formulaciones se elaboraron (como se describe en la tabla que figura a continuación) para que las soluciones de aspersión de los polvos secados por aspersión en los discos de hoja en un tubo Falcon de 50 mL llenen los tubos con H20 desionizado antes de agregar la cantidad precisa con la masa de polvos secados por aspersión. La pulverización se realizó en la campana de gases de Labconco en E207 iniciando con el lado ventral del disco de hoja. Para la pulverización, una acción doble, aerógrafo para mezcla interna (Paasch Airbrush Company, Chicago IL) con el conjunto de líneas neumáticas a una velocidad de 200 pL/segundo (20 psi). Los discos de hoja se pulverizaron de forma circular con el aerógrafo perpendicular a la superficie de la hoja de modo que un vapor fino cubra la superficie total de la hoja de forma uniforme (~3-4 segundos). Entre cada pulverización de tratamiento, se enjuagó con dH20 el recipiente que contiene la solución de pulverización para retirar los residuos de los tratamientos anteriores. Luego de la pulverización, los discos se dejaron secar durante una hora y luego se dieron vuelta para que la cara adaxial quede orientada hacia arriba en el recipiente Tupperware y se pulverice de la misma manera. Luego de pulverizar la cara adaxial, se dejó transcurrir una hora para el secado y los discos de hoja se colocaron en discos de petri etiquetados con filtros de papel Whatman 3 Qualitative de 2 90 mm (GE Healthcare UK Limited, Amersham Place Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, Reino Unido) en el fondo, que se habían humedecido con 4 mL de diH20 usando un Eppendorf Repeater Plus y una punta de 25 mL. Se cubrieron discos de petri y se asignaron aleatoriamente antes de aplicar ~7-9 neonatos de S . exigua recién incubados a cada disco de hoja usando un pincel de cerdas finas #0 mediante la obtención de una tabla blanca y vaciando un recipiente de nenonatos de 24, 48, 72 o 96 horas sobre esta. Las placas se sellaron con Parafilm y se colocaron de forma aleatoria en el soporte con efectos estadísticos a 27 °C. Se proporcionó un valor al ensayo en el transcurso del día siguiente a las 18, 24, 40 y 48 horas mediante la observación de la mortalidad y registrando las diferencias entre las hojas tratadas y no tratadas .

La Figura 19 muestra el porcentaje de los resultados de mortalidad de cuatro experimentos registrados para cada experimento a las 18, 24, 40 y 48 horas. El tratamiento de control sin secado por aspersión mostró el promedio de mortalidad más bajo de todos los tratamientos. La mayor parte de la mortalidad de los insectos se observa en el valor a las 18 horas y la mortalidad adicional se observa a las 40 y 48 horas que se muestra mediante el registro a las 40 y 48 horas. Los insectos sanos tienen un color verde clorofila notorio, una respuesta de evasión rápida cuando se toca con un pincel y un crecimiento promedio durante 48 horas. El porcentaje de los resultados de mortalidad de las larvas de 72 y 96 horas se redujo significativamente en comparación con las larvas de 24 y 48 horas de edad. Claramente, tanto los tratamientos con la proteína de Bt como con péptido híbrido solo no son eficaces para controlar los insectos más maduros.

Ejemplo 2 Bioensayo foliar usando SDP 1234605 contra Spodopt ra exigua en lechuga romana de Mud Lakes Farros Objetivo: El propósito de este experimento se diseñó para determinar el porcentaje de mortalidad que ocurre contra S. exigua cuando se pulveriza SDP 1234605 contra larvas de 72 horas de edad en un ensayo biológico de discos de hoja foliar y cuando se pulveriza conjuntamente Dipel DF con SDP 1234605.

Preparación de ensayos y formulación de tratamiento: Ver preparación en el Ejemplo 1. Se recibieron huevos de S. exigua de Benzon Research. Se cubrieron discos de petri y se asignaron aleatoriamente antes de aplicar -7-9 neonatos de S. exigua recién incubados a cada disco de hoja usando un pincel de cerdas finas #0 mediante la obtención de una tabla blanca y vaciando un recipiente de larvas de 72 horas de edad sobre esta. Las placas se sellaron con Parafilm y se colocaron de forma aleatoria en el soporte con efectos estadísticos a 27 °C. Se proporcionó un valor al ensayo en el transcurso del día siguiente a las 18, 24 y 48 horas mediante la observación de la mortalidad y registrando las diferencias entre las hojas tratadas y no tratadas.

La Figura 20 muestra una gráfica en columnas de los datos del Ejemplo 2 a las 18, 24 y 48 horas. Individualmente, 10 partes por mil (ppt) de péptido híbrido en la formulación '605 y Dipel a 300 partes por millón (pp ) muestran una escasa mejora con respecto al control no tratado o las mortalidades de tensioactivo. Sin embargo, en combinación, la mortalidad resultante a las 48 horas de 84,4 % supera sorprendentemente lo que sería esperable de los efectos aditivos de los tratamientos individuales (29,1 %). La sinergia de los componentes individuales es de al menos 2,9 veces más (84,4/29,1). Sería inesperado que una proteína insecticida que mata mediante sepsis fuera sinérgica con un péptido insecticida que modula los canales iónicos en el SNC.

Ejemplo 3 Se analizaron los posibles efectos aditivos y/o sinérgicos de las combinaciones de proteínas de Bacillus t huringiensis (Bt) y el peptido Av2 de anémonas. Se utilizó el producto de Bt: Dipel DF, comercialmente disponible, y un péptido de anémona tóxica Av2, comercialmente disponible.

Métodos: Se cortaron discos de hoja pequeños (~2cm) en las hojas internas de repollo comprado en un almacén local. Los discos se sumergieron en 400 mL de tratamiento y se colocaron en discos de filtro de 4,25 cm #4 (Whatman) en el fondo de recipientes de condimento de ~4,5 cm. Se prepararon cuatro discos por tratamiento. Se aplicaron 75 pL de agua a un segundo disco de filtro de 3,2 cm #1 (Whatman) más pequeño sobre el disco de filtro más grande. Se dejó que los discos de hoja se secaran aproximadamente diez minutos antes de agregar cuatro Plutella xylostella resistentes a Cryla de 120 horas de edad por disco de hoja. Se sellaron los recipientes de condimentos con tapas no perforadas. Los tratamientos se colocaron en la incubadora y se almacenaron para determinar el daño de mortalidad y alimentación a las 24 y 48 horas. Debido al gran consumo de discos de hoja en muchos tratamientos, se agregó un disco de hoja no tratado adicional de 3,2 cm a las 24 horas para garantizar que no ocurra la inanición de las larvas.

A las 24 y 48 horas, se tomaron fotografías de los discos de hoja usando un Iphone 4S (Apple Inc.) y se conservaron. Se recortaron fotos de discos de hojas individuales de la fotografía de tratamiento grupal y se les asignaron números aleatorios. Usando el programa ImageJ, se calculó el área de hoja comida. Se abrió la imagen en imageJ y se configuró la escala en la fotografía. Para configurar la escala, se dibujó una distancia conocida en centímetros (cm) en la fotografía usando la herramienta de línea de segmento y se midió en unidades de píxeles. Para este experimento, el diámetro conocido del disco de filtro de papel es de 1,5 cm para el disco de filtro #1 y 4,5 cm para el disco de filtro Whatman #4. Usando esta longitud conocida en cm, las unidades de píxeles se convierten a centímetros en la imagen. Una vez que se configura la escala, se usa una herramienta de selección hecha a pulso para dibujar alrededor del área en la que hay tejido de hojas. Este proceso se repitió para todas las fotos para asegurarse que registre el área calculada por image J en la libreta de laboratorio. Para este experimento, el área de control del disco de hoja no comido es de 2,54 cm2 y se realizaron cálculos para determinar el % de área comida.

Tratamientos: Dipel DF 150 PPM: 200 mL de Dipel DF 300 PPM + 200 m L de agua Av2 1 PPT: 0,1 mg de Av2 en 100 m L de agua (se combinaron cuatro recipientes de Av21 PPT para tratamientos de 400 m L necesarios) Dipel DF 150 PPM + Av2 1PPT: Se agregaron 100 m L de Dipel DF 150 PPM a 0,1 mg de Av2 (se combinaron cuatro recipientes para tratamientos de 400 mL necesarios) La Figura 21 muestra el porcentaje de daño de alimentación que resulta de las larvas de palomilla dorso de diamante (120 horas de edad) resistentes a la proteína de Bt en discos de hojas de repollo. La valoración a las 24 horas y las 48 horas muestra una mejora significativa con respecto al tratamiento solo con Dipel. Si bien estos insectos son resistentes a Bt, continúan alimentándose hasta cierto grado, sin mortalidad. El tratamiento combinado da como resultado una mejora significativa de la protección del material foliar. Además, el tratamiento solo con Av2 no tiene efecto en el daño por alimentación y su efecto solamente se vuelve evidente en combinación con la proteína de Bt. Esto concuerda con un aumento de la biodisponibilidad de Av2 generada por la proteína de Bt.

Ejemplo 4 Ensayo biológico foliar usando SDP 1234609 y DiPel DF contra en lechuga romana de Earthbound Farms Objetivo: El propósito de este experimento es determinar el porcentaje de mortalidad que ocurre contra P. xylostella resistente a Bt (HD-1) cuando se pulveriza SDP 1234609 contra larvas de 120 horas de edad en un ensayo biológico de discos de hoja foliar y cuando se pulveriza conjuntamente Dipel DF con SDP 1234609.

Preparación de ensayos y formulación de tratamiento: Ver preparación en el Ejemplo 1.

La Figura 22 muestra una gráfica en columnas de los datos del Ejemplo 4 a las 24 y 48 horas. Individualmente, 1 parte por mil (ppt) de péptido híbrido en la formulación '609 y Dipel a 150 partes por millón (ppm) muestran una escasa mejora con respecto al control no tratado o las mortalidades de tensioactio . Sin embargo, en combinación, la mortalidad resultante a las 48 horas de 62,5 % supera sorprendentemente lo que sería esperable de los efectos aditivos de los tratamientos individuales (21,8 %). La sinergia de los componentes individuales es de al menos 2,86 veces más (62,5/21,8). Nuevamente, sería inesperado que una proteína insecticida que mata mediante sepsis fuera sinérgica con un péptido insecticida que modula los canales iónicos en el SNC.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína caracterizada porque está compuesta por un péptido señal de retículo endoplasmático (ERSP) unido operativamente a una proteína insecticida rica en cisteína (CRIP), tal como un motivo proteico del nudo inhibidor de cisteína (ICK), en donde el ERSP está en el N-terminal de la proteína (ERSP-ICK).

2. Un péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es cualquier péptido señal que dirige la CRIP expresada al retículo endoplasmático de las células vegetales.

3. Un péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la CRIP es una proteína del nudo inhibidor de cisteína (ICK).

4. Un péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la CRIP es una proteína que no es de ICK.

5. Un péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es un péptido de entre 5 y 50 aminoácidos de longitud, que se origina de una planta.

6. Un péptido de conformidad con la reivindicación 1, unido operativamente a una proteína de estabilización traduccional (STA), caracterizado porque es el N-terminal de la proteína y una proteína de estabilización traduccional (STA) puede estar en el lado del N-terminal de la CRIP, que es opcionalmente un motivo proteico de ICK (ERSP-STA-ICK) o motivo proteico que no es de ICK (ERSP-STA que no es de ICK) o en el lado del C-terminal del motivo proteico de ICK o que no es de ICK (ERSP-ICK-STA) o (ERSP que no es de ICK -STA).

7. Un péptido con un dipéptido en el N-terminal, caracterizado porque se agrega y une operativamente a un péptido conocido, donde el dipéptido en el N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido, donde el péptido se selecciona de un CRIP (péptido insecticida rico en cisteína), tal como un péptido de ICK, o un péptido que no es de ICK.

8. Un péptido de conformidad con la reivindicación 7, con un dipéptido del N-terminal que se agrega y une operativamente a un péptido conocido, caracterizado porque el dipéptido del N-terminal está compuesto por un aminoácido no polar en el N-terminal del dipéptido y un aminoácido polar en el C-terminal del dipéptido.

9. Un péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido no polar del aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina.

10. Un péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se selecciona de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina.

11. Un péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido no polar del aminoácido del N-terminal del dipéptido del N-terminal se selecciona de glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y metionina y el aminoácido polar del aminoácido del C-terminal del péptido del N-terminal se selecciona de serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina, histidina, triptófano, tirosina.

12. Un péptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dipéptido está compuesto por glicina-serina.

13. Una composición caracterizada porque comprende al menos dos tipos de proteínas o péptidos insecticidas, donde un tipo es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP).

14. Una composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el CRIP es un ICK y, opcionalmente, el ICK se deriva o se origina de, Hadronyche versuta, o araña de Sídncy con tela en embudo, Atrax robustus, Atrax formidabilis , Atrax infensus, que incluye toxinas conocidas como polipéptidos de U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb o mutantes o variantes.

15. Una composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el CRIP no es de ICK y, opcionalmente, el CRIP que no es de ICK se origina o deriva de animales que tienen CRIP que no son de ICK, como anemonas, erizos de mar y babosas marinas, que incluyen opcionalmente la anémona denominada Anemonia viridi , que incluye opcionalmente los péptidos denominados Av2 y Av3, particularmente los péptidos similares a Av2 y Av3, que incluyen los péptidos enumerados en el listado de secuencias o mutantes o variantes.

16. Un método para utilizar la composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es para controlar los insectos resistentes a Bt que comprende crear una composición de al menos dos tipos de péptidos, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas de PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la reivindicación 1 y en la presente y de cualquiera de las proteínas proporcionadas en el listado de secuencias y luego aplicar la composición al locus del insecto.

17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, para controlar los insectos resistentes a Bt, caracterizado porque comprende proteger a una planta de insectos resistentes a Bt que comprende crear una planta que exprese una combinación de al menos dos péptidos con plegamiento adecuado, donde un tipo de péptido es una proteína insecticida que forma poros (PFIP) y el otro tipo de péptido es un péptido insecticida rico en cisteína (CRIP) y las proteínas de PFIP y CRIP se seleccionan de cualquiera de las composiciones que se describen en la presente y de cualquiera de las proteínas proporcionadas en el listado de secuencias.

18. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se administra la CRIP en cualquier momento durante el cual la PFIP afecta el revestimiento del intestino del insecto.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se administra la CRIP luego de analizar al insecto para determinar la resistencia a Bt y, donde el análisis del insecto dio positivo para resistencia a Bt.

20. Uso de conformidad con cualquiera de los compuestos descritos anteriorment, en forma sólida o líquida al insecto al locus del insecto, o como un protector incorporado a la planta .