CN108912218B - 拟环纹豹蛛a家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟环纹豹蛛A家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用，该拟环纹豹蛛A家族杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑5所示；拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽的氨基酸如SEQ ID NO.11‑15所示。本发明利用生物信息学分析方法，对拟环纹豹蛛转录组数据库中的基因进行筛选，获得一类相似的拟环纹豹蛛毒素的候选基因，将该基因构建到原核表达载体pET‑32a(+)中，即可获得该基因编码的杀虫肽，该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源，具有不同于Bt毒素的杀虫机制，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。

Description

拟环纹豹蛛A家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物防治领域，涉及一类杀虫基因及其编码蛋白，具体涉及一种拟环纹豹蛛A家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用。

背景技术

目前广泛用于害虫防治的杀虫基因主要是苏云金芽孢杆菌产生Bt毒素的基因，Bt毒素对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等农业害虫表现出极高的杀虫特异性。因此Bt毒素基因被转基因到棉花、玉米、烟草等广泛种植的重要作物中。携带抗虫基因的转基因作物在农业害虫防治方面起着重要的作用。然而，单一抗虫基因的长期使用使害虫对Bt毒素的抗性不断增加。多种昆虫群体在自然环境下对Bt蛋白制剂和Bt转基因作物产生了抗性，如棉铃虫、小菜蛾及二化螟等(易晓莉等，昆虫对Bt毒素抗性研究进展[J]，江苏农业科学，2014年第7期)。因此，开发另外一种高效环保的新型抗虫基因或蛋白质能够增加对抗虫基因的选择和降低抗性的发展。

蜘蛛毒素因其化学多样性和广谱性而被作为潜在的杀虫剂受到广泛关注(G.F.King,et al.,Spider-Venom peptides:structure,pharmacology,and potentialfor control of insect pests,Annu.Rev.Entomol.2013,58:475-496.)。蜘蛛毒素能够作用于昆虫细胞膜的多种通道和受体，如离子通道、神经配体门控通道和G蛋白关联受体等。因此对多种昆虫都具有抗虫作用。但目前对蜘蛛毒素的研究多集中在黑寡妇蜘蛛中集中重要毒素的作用机制，对其杀虫作用的直接测试比较少。综上，现有对蜘蛛毒素的研究还不能满足抗虫基因的选择需求。因此需要一种具有杀虫效果的蜘蛛毒素，该毒素能够通过分子基因工程的方法大量表达或通过转基因技术在作物中表达，从而达到抗虫的效果。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种拟环纹豹蛛A家族杀虫基因，通过生物学手段可获得该基因编码的成熟肽，该成熟肽作为全新的杀虫基因资源，具有神经毒性，作用于昆虫离子通道，具有不同于Bt毒素的杀虫机制Bt毒素作用于昆虫围食膜，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。

本发明还公开拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽与应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种拟环纹豹蛛A家族杀虫基因，所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示。

本发明所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的杀虫蛋白，所述杀虫蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.6-10所示。

本发明所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽，所述成熟肽氨基酸序列如SEQ ID NO.11-15所示。

编码本发明所述的成熟肽的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16-20所示。

含有本发明所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因的重组质粒。

本发明所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽在农作物害虫防治中的应用。

进一步地，所述成熟肽在农作物害虫褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱防治中的应用。

含有本发明所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂。

本发明所述的含拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂在农作物害虫防治中的应用。

本发明参考黑寡妇等蜘蛛的毒素基因，利用生物信息学分析方法，对拟环纹豹蛛转录组数据库中的基因进行筛选，获得一类相似的拟环纹豹蛛毒素的候选基因，然后利用多聚酶链式反应(PCR)及Sanger法测序，获得其中一个基因的完整序列。将该基因构建到原核表达载体pET-32a(+)中，经原核系统表达，即可获得该基因编码的成熟肽即为杀虫肽。制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产，同时，该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源，具有不同于Bt毒素的杀虫机制，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明采用的拟环纹豹蛛作为农业害虫天敌，长期以昆虫为食，其毒素主要作用于昆虫，对脊椎动物相对安全。本发明通过拟环纹豹蛛筛选到全新的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因，根据该基因通过生物学手段可获得该基因编码的成熟肽即为杀虫肽，该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源，具有神经毒性，作用于昆虫离子通道，具有不同于Bt毒素的杀虫机制Bt毒素作用于昆虫围食膜，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。

本发明预测拟环纹豹蛛毒素的成熟肽，并成功构建表达载体，优化诱导条件，使蛋白产量最大化，同时优化纯化条件，减少蛋白损失。此外，本发明采用的体外表达体系高效且产量高，得到的杀虫肽纯度高，且具有较高活性。本发明制备的重组毒素具有较高的杀虫活性。

附图说明

图1为注射CK和重组毒素PPTX-02后，褐飞虱在不同时间点的死亡率示意图；

图2为注射CK和重组毒素PPTX-02后，灰飞虱在不同时间点的死亡率示意图；

图3为注射CK和重组毒素PPTX-02后，白背飞虱在不同时间点的死亡率示图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所设计的试剂和培养基配方：

(1)LB液体培养基：

在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物和5g NaCl，搅拌混匀，用双蒸水定容至1L，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后置于4℃保存。

(2)LB固体培养基：

在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl和15g琼脂，搅拌混匀，用双蒸水定容至1L，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后至50℃加入终浓度为100mg/L的羧苄青霉素，倒板，冷却后置于4℃保存。

(3)转膜缓冲液：

甘氨酸2.9g，Tris base 0.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加入双蒸水定容至1L。

(4)PBST：

PBS中加入0.05％体积的吐温-20。

(5)封闭液：

PBST中加入1％的脱脂奶粉。

(6)Tris-HCl：

将1M的Tris-HCl稀释至20mM。

(7)结合缓冲液：

20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，10mM咪唑，双蒸水定容至1L，pH7.4。

(8)洗脱缓冲液：

20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，500mM咪唑，双蒸水定容至1L，pH7.4。

实施例1

毒素的制备

蜘蛛毒素基因的设计和构建

拟环纹豹蛛采自江苏省南京市浦口区水稻田，并在室内用褐飞虱饲养90天后，取毒腺并进行转录组测序，根据注释结果，筛选出拟环纹豹蛛毒素基因，根据其半胱氨酸的数量、排列方式、结构域预测和序列分析，获得一类拟环纹豹蛛毒素的候选基因，并选取其中的一种，即PPTX-02，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示，通过SpiderP(http://www.arachnoserver.org/spiderP.html)预测其信号肽、前肽和成熟肽，将其成熟肽序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，设计出用于在大肠杆菌中表达的PPTX-02毒素基因序列如SEQ ID NO.16所示，设计完成的基因由Invitrogen公司合成，并在南京金斯瑞公司完成测序，将合成的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中，构建出含有目的基因的pET-32a(+)-PPTX-02重组质粒，该毒素基因引入BanH I和EcoR I酶切位点。

重组质粒pET-32a(+)-PPTX-02的诱导表达

将pET-32a(+)-PPTX-02重组质粒转化到Escherichia coli BL21菌株中，在含有羧苄青霉素的LB平板中生长16h后，挑取不同的阳性菌斑，分别加入到含有100mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，恒温摇床中250r/min，37℃，12h。将培养后的菌液按照1∶100的体积比，接种到含有100mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min，37℃，培养4h，此时菌液的OD值为0.5-0.7；在pET-32a(+)-PPTX-02重组子中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，200r/min，37℃，诱导表达培养5h；取表达后的菌液4ml，4℃，12000rpm离心5min，弃上清，在菌体沉淀中加入1.5ml 20mM的Tris-HCl，pH＝7.4，重悬后进行超声破菌，强度12％，10min，运行5s，暂停5s；破菌后4℃，18000rpm，离心10min，取上清，弃沉淀，破碎液用于重组毒素检测。

Western Blot检测

取50μl的破碎液，加17μl的Loading Buffer和2μl的β-巯基乙醇，100℃煮沸5min，加20μl的混合液到SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并加入10μl的蛋白标样，50V，50min，然后100V直至上样缓冲液至凝胶底部；电泳结束后，将凝胶取出后进入转膜缓冲液中，并将PVDF膜浸泡于甲醇1min后转入转膜缓冲液，之后进行转膜，100mA，50min；转膜结束后，将膜取出，PBST洗3次，每次5min，封闭液封闭2h，37℃，80r/min；封闭后将膜取出，PBST洗3次，每次10min，转入加入一抗的封闭液(1∶1000)，孵育2h，37℃，80r/min；一抗孵育结束后，将膜取出，PBST洗3次，每次10min，转入加入二抗的封闭液(1∶2000)，孵育1.5h，37℃，80r/min；二抗孵育结束后，PBST洗3次，每次10min，加入发光液，避光3min，滤纸吸干表面液体后，化学发光检测。

重组质粒pET-32a(+)-PPTX-02的大量诱导表达

将培养后的菌液按照1∶100的体积比，接种到100ml含有100mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，培养基的体积不能超过容器体积的20％，200r/min，37℃，培养4h，此时菌液的OD值为0.5-0.7；在pET-32a(+)-PPTX-02重组子中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，200r/min，37℃，诱导表达培养5h；取表达后的菌液，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，在菌体沉淀中加入20％培养基体积的20mM的Tris-HCl，pH＝7.4，重悬后进行超声破菌，强度12％，30min，运行5s，暂停5s；破菌后4℃，18000rpm，离心30min，取上清，弃沉淀，破碎后粗蛋白液用于分离纯化重组毒素。

重组毒素PPTX-02的纯化

将大量诱导表达破菌后的粗蛋白液用0.22μm的滤膜过滤，采用AKTA avant全自动蛋白质分离纯化系统和HisTrapTM HP镍柱(5ml)进行纯化。先用5个柱体积的结合缓冲液平衡镍柱，流速5ml/min，上样流速1ml/min，上样后用6个柱体积的结合缓冲液清洗柱子，流速1ml/min，最后用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速5ml/min。纯化后的蛋白产量约为6.85mg/L，纯化后的蛋白为成熟肽即重组毒素PPTX-02，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

实施例2

采用实施例1中蜘蛛毒素基因的设计和构建方法，制备出拟环纹豹蛛的杀虫基因SEQ ID NO.2-5：PPTX-03b、PPTX-05、PPTX-06、PPTX-18；并通过相同的方法构建出对应的重组质粒的并分别大量诱导表达，经过纯化后得到不同基因编码的重组毒素。

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，如下：

atgaagtttgtagttctctttggtattctgttagtaactcttttcagttactcttcagctgatatgcttgatgatttcgaagaagcggatgaagctgatgtgctgttgtctttaatagatgaggcacccagagccaaggaatgtaccccaaggtttaacgactgttctcgagatcgccacagctgctgccgaagcgaactgttcaaagatgtctgcacatgcttttacccagaaagtggagacagtgaagtctgcacatgccaacagcccaagcatctgaagtacatggaaaaagccaccgacaaggttaaacaattcggcaaaaagttcggcggcaagcttaaaaaattgttcggt

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-03b的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，如下：

atgaaggttttcgttctagttgctattctggttacgctagtcagctattcttcaagtgaaggaattgacgatcttgaagcggacgaactgttgtctttaatggccaaggaacaaagcaggaacgaatgcattcccaaacaccacgaatgtacaagcaataagcacggctgctgtagaggcaaacttttcaaatacaaatgccagtgcaccacagtggttgaccaaaatggagaacagggagaaagatgcttctgcggaacagccactcaccacaaggctgccgaattagtgcttggcttcggaaagaagatcttcgga

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-05的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，如下：

atgaagcttttagtttttactggattagttgttttggcgattgtaagcttgattgaagctgaagcagagaatgaaagagcttgcatcccacaatatcgtgtatgtacaaatgctcctggaaactgttgtgctaaatacacttgcgattgttacggaagatataaggccggaaagaagataggtcgcaactgcttttgcttagaaaagggcgtcacatacaagctagaaaaa

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-06的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，如下：

atgaaatatcaaattctttttggtgtagttttcttaactcttctgagttactgttcctgtgatttcgaagaagctgttgaaaacttaattcaggaagaaatcgaatccgacaacccatttggccttgccagaaaagagaaagaaaactgcatccccaagcatcacgaatgtaccagcgacaggcacggctgctgtaggggtgatctgttcaagtacaaatgccagtgtgtgaaaatcgtcaacgcccagaaggaagagaccgagaggtgcgcctgcgtcaaacccggtctccacaatgccgtcgaagttgtcattcgactctttaagaaggtagctacg

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-18的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，如下：

atgaggggtttggttttctttagtgtgctttttctagctcttttcagctactcttcaactgaagcaattgacgaatttgatagcaatgcagatgaagatattctgtctctattagccaatgaagaagtgagagaaaaggcctgtacaccaaggctgcatgactgttcacatgatcgccacagttgttgcagaggtgaattgttcaaagacgaatgctattgcttttacccagaggacggaagcaaaacagaagtctgctcatgccagcaaaagaaatcagcaaagattgtcgagaaaatcgtcgacaaggcaaaggttgccattggc

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，如下：

MKFVVLFGILLVTLFSYSSADMLDDFEEADEADVLLSLIDEAPRAKECTPRFNDCSRDRHSCCRSELFKDVCTCFYPESGDSEVCTCQQPKHLKYMEKATDKVKQFGKKFGGKLKKLFG

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-03b的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，如下：

MKVFVLVAILVTLVSYSSSEGIDDLEADELLSLMAKEQSRNECIPKHHECTSNKHGCCRGKLFKYKCQCTTVVDQNGEQGERCFCGTATHHKAAELVLGFGKKIFG

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-05的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，如下：

MKLLVFTGLVVLAIVSLIEAEAENERACIPQYRVCTNAPGNCCAKYTCDCYGRYKAGKKIGRNCFCLEKGVTYKLEK

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-06的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，如下：

MKYQILFGVVFLTLLSYCSCDFEEAVENLIQEEIESDNPFGLARKEKENCIPKHHECTSDRHGCCRGDLFKYKCQCVKIVNAQKEETERCACVKPGLHNAVEVVIRLFKKVAT

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-18的氨基酸序列为SEQ ID NO.10，如下：

MRGLVFFSVLFLALFSYSSTEAIDEFDSNADEDILSLLANEEVREKACTPRLHDCSHDRHSCCRGELFKDECYCFYPEDGSKTEVCSCQQKKSAKIVEKIVDKAKVAIG

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02的成熟肽序列为SEQ ID NO.11，如下：

KECTPRFNDCSRDRHSCCRSELFKDVCTCFYPESGDSEVCTCQQPKHLKYMEKATDKVKQFGKKFGGKLKKLFG

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-03B的成熟肽序列为SEQ ID NO.12，如下：

NECIPKHHECTSNKHGCCRGKLFKYKCQCTTVVDQNGEQGERCFCGTATHHKAAELVLGFGKKIFG

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-05的成熟肽序列为SEQ ID NO.13，如下：

RACIPQYRVCTNAPGNCCAKYTCDCYGRYKAGKKIGRNCFCLEKGVTYKLEK

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-06的成熟肽序列为SEQ ID NO.14，如下：

ENCIPKHHECTSDRHGCCRGDLFKYKCQCVKIVNAQKEETERCACVKPGLHNAVEVVIRLFKKVAT

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-18的成熟肽序列为SEQ ID NO.15，如下：

KACTPRLHDCSHDRHSCCRGELFKDECYCFYPEDGSKTEVCSCQQKKSAKIVEKIVDKAKVAIG

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.16，如下：

aaggaatgtaccccaaggtttaacgactgttctcgagatcgccacagctgctgccgaagcgaactgttcaaagatgtctgcacatgcttttacccagaaagtggagacagtgaagtctgcacatgccaacagcccaagcatctgaagtacatggaaaaagccaccgacaaggttaaacaattcggcaaaaagttcggcggcaagcttaaaaaattgttcggt

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-03b的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.17，如下：

aacgaatgcattcccaaacaccacgaatgtacaagcaataagcacggctgctgtagaggcaaacttttcaaatacaaatgccagtgcaccacagtggttgaccaaaatggagaacagggagaaagatgcttctgcggaacagccactcaccacaaggctgccgaattagtgcttggcttcggaaagaagatcttcgga

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-05的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.18，如下：

agagcttgcatcccacaatatcgtgtatgtacaaatgctcctggaaactgttgtgctaaatacacttgcgattgttacggaagatataaggccggaaagaagataggtcgcaactgcttttgcttagaaaagggcgtcacatacaagctagaaaaa

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-06的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.19，如下：

gaaaactgcatccccaagcatcacgaatgtaccagcgacaggcacggctgctgtaggggtgatctgttcaagtacaaatgccagtgtgtgaaaatcgtcaacgcccagaaggaagagaccgagaggtgcgcctgcgtcaaacccggtctccacaatgccgtcgaagttgtcattcgactctttaagaaggtagctacg

拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-18的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.20，如下：

aaggcctgtacaccaaggctgcatgactgttcacatgatcgccacagttgttgcagaggtgaattgttcaaagacgaatgctattgcttttacccagaggacggaagcaaaacagaagtctgctcatgccagcaaaagaaatcagcaaagattgtcgagaaaatcgtcgacaaggcaaaggttgccattggc

试验例1

生测的过程和方法

采用显微注射法测定了重组毒素PPTX-02对3种稻飞虱的杀虫活性，试虫选取5龄若虫，每个处理3个重复，每个重复选取30头试虫，注射前，先把试虫用CO₂麻醉，每头试虫注射重组毒素20nl，注射部位为第一和第二胸板节间膜，注射结束后，将试虫放置在装有水稻苗的一次性口杯中，水稻苗用2％的琼脂固定，整个实验过程要轻柔，减少对试虫的伤害。实验共分为对照组和实验组，对照组注射等量的PBS，pH＝7.4，实验组注射重组毒素PPTX-02。图1、2和3分别为注射重组毒素PPTX-02后，3种稻飞虱在不同时间点的死亡情况，可以看出重组的毒素PPTX-02对3种稻飞虱都有优良的杀虫活性，证明本发明得到的拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02的成熟肽为有效的杀虫肽，可以用于制备杀虫剂在应用在农作物害虫如褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱的等防治，本发明其他重组毒素PPTX-03b、PPTX-05、PPTX-06、PPTX-18与重组毒素PPTX-02功能类似。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 拟环纹豹蛛A家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02(PPTX-02)

<400> 1

atgaagtttg tagttctctt tggtattctg ttagtaactc ttttcagtta ctcttcagct 60

gatatgcttg atgatttcga agaagcggat gaagctgatg tgctgttgtc tttaatagat 120

gaggcaccca gagccaagga atgtacccca aggtttaacg actgttctcg agatcgccac 180

agctgctgcc gaagcgaact gttcaaagat gtctgcacat gcttttaccc agaaagtgga 240

gacagtgaag tctgcacatg ccaacagccc aagcatctga agtacatgga aaaagccacc 300

gacaaggtta aacaattcgg caaaaagttc ggcggcaagc ttaaaaaatt gttcggt 357

<210> 2

<211> 318

<212> DNA

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-03b(PPTX-03b)

<400> 2

atgaaggttt tcgttctagt tgctattctg gttacgctag tcagctattc ttcaagtgaa 60

ggaattgacg atcttgaagc ggacgaactg ttgtctttaa tggccaagga acaaagcagg 120

aacgaatgca ttcccaaaca ccacgaatgt acaagcaata agcacggctg ctgtagaggc 180

aaacttttca aatacaaatg ccagtgcacc acagtggttg accaaaatgg agaacaggga 240

gaaagatgct tctgcggaac agccactcac cacaaggctg ccgaattagt gcttggcttc 300

ggaaagaaga tcttcgga 318

<210> 3

<211> 231

<212> DNA

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-05(PPTX-05)

<400> 3

atgaagcttt tagtttttac tggattagtt gttttggcga ttgtaagctt gattgaagct 60

gaagcagaga atgaaagagc ttgcatccca caatatcgtg tatgtacaaa tgctcctgga 120

aactgttgtg ctaaatacac ttgcgattgt tacggaagat ataaggccgg aaagaagata 180

ggtcgcaact gcttttgctt agaaaagggc gtcacataca agctagaaaa a 231

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-06(PPTX-06)

<400> 4

atgaaatatc aaattctttt tggtgtagtt ttcttaactc ttctgagtta ctgttcctgt 60

gatttcgaag aagctgttga aaacttaatt caggaagaaa tcgaatccga caacccattt 120

ggccttgcca gaaaagagaa agaaaactgc atccccaagc atcacgaatg taccagcgac 180

aggcacggct gctgtagggg tgatctgttc aagtacaaat gccagtgtgt gaaaatcgtc 240

aacgcccaga aggaagagac cgagaggtgc gcctgcgtca aacccggtct ccacaatgcc 300

gtcgaagttg tcattcgact ctttaagaag gtagctacg 339

<210> 5

<211> 327

<212> DNA

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-18(PPTX-18)

<400> 5

atgaggggtt tggttttctt tagtgtgctt tttctagctc ttttcagcta ctcttcaact 60

gaagcaattg acgaatttga tagcaatgca gatgaagata ttctgtctct attagccaat 120

gaagaagtga gagaaaaggc ctgtacacca aggctgcatg actgttcaca tgatcgccac 180

agttgttgca gaggtgaatt gttcaaagac gaatgctatt gcttttaccc agaggacgga 240

agcaaaacag aagtctgctc atgccagcaa aagaaatcag caaagattgt cgagaaaatc 300

gtcgacaagg caaaggttgc cattggc 327

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-02(PPTX-02)

<400> 6

Met Lys Phe Val Val Leu Phe Gly Ile Leu Leu Val Thr Leu Phe Ser

1 5 10 15

Tyr Ser Ser Ala Asp Met Leu Asp Asp Phe Glu Glu Ala Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Val Leu Leu Ser Leu Ile Asp Glu Ala Pro Arg Ala Lys Glu Cys

35 40 45

Thr Pro Arg Phe Asn Asp Cys Ser Arg Asp Arg His Ser Cys Cys Arg

50 55 60

Ser Glu Leu Phe Lys Asp Val Cys Thr Cys Phe Tyr Pro Glu Ser Gly

65 70 75 80

Asp Ser Glu Val Cys Thr Cys Gln Gln Pro Lys His Leu Lys Tyr Met

85 90 95

Glu Lys Ala Thr Asp Lys Val Lys Gln Phe Gly Lys Lys Phe Gly Gly

100 105 110

Lys Leu Lys Lys Leu Phe Gly

115

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-03b(PPTX-03b)

<400> 7

Met Lys Val Phe Val Leu Val Ala Ile Leu Val Thr Leu Val Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Ser Ser Glu Gly Ile Asp Asp Leu Glu Ala Asp Glu Leu Leu Ser

20 25 30

Leu Met Ala Lys Glu Gln Ser Arg Asn Glu Cys Ile Pro Lys His His

35 40 45

Glu Cys Thr Ser Asn Lys His Gly Cys Cys Arg Gly Lys Leu Phe Lys

50 55 60

Tyr Lys Cys Gln Cys Thr Thr Val Val Asp Gln Asn Gly Glu Gln Gly

65 70 75 80

Glu Arg Cys Phe Cys Gly Thr Ala Thr His His Lys Ala Ala Glu Leu

85 90 95

Val Leu Gly Phe Gly Lys Lys Ile Phe Gly

100 105

<210> 8

<211> 77

<212> PRT

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-05(PPTX-05)

<400> 8

Met Lys Leu Leu Val Phe Thr Gly Leu Val Val Leu Ala Ile Val Ser

1 5 10 15

Leu Ile Glu Ala Glu Ala Glu Asn Glu Arg Ala Cys Ile Pro Gln Tyr

20 25 30

Arg Val Cys Thr Asn Ala Pro Gly Asn Cys Cys Ala Lys Tyr Thr Cys

35 40 45

Asp Cys Tyr Gly Arg Tyr Lys Ala Gly Lys Lys Ile Gly Arg Asn Cys

50 55 60

Phe Cys Leu Glu Lys Gly Val Thr Tyr Lys Leu Glu Lys

65 70 75

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-06(PPTX-06)

<400> 9

Met Lys Tyr Gln Ile Leu Phe Gly Val Val Phe Leu Thr Leu Leu Ser

1 5 10 15

Tyr Cys Ser Cys Asp Phe Glu Glu Ala Val Glu Asn Leu Ile Gln Glu

20 25 30

Glu Ile Glu Ser Asp Asn Pro Phe Gly Leu Ala Arg Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Asn Cys Ile Pro Lys His His Glu Cys Thr Ser Asp Arg His Gly Cys

50 55 60

Cys Arg Gly Asp Leu Phe Lys Tyr Lys Cys Gln Cys Val Lys Ile Val

65 70 75 80

Asn Ala Gln Lys Glu Glu Thr Glu Arg Cys Ala Cys Val Lys Pro Gly

85 90 95

Leu His Asn Ala Val Glu Val Val Ile Arg Leu Phe Lys Lys Val Ala

100 105 110

Thr

<210> 10

<211> 109

<212> PRT

<213> 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-18(PPTX-18)

<400> 10

Met Arg Gly Leu Val Phe Phe Ser Val Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ser

1 5 10 15

Tyr Ser Ser Thr Glu Ala Ile Asp Glu Phe Asp Ser Asn Ala Asp Glu

20 25 30

Asp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Asn Glu Glu Val Arg Glu Lys Ala Cys

35 40 45

Thr Pro Arg Leu His Asp Cys Ser His Asp Arg His Ser Cys Cys Arg

50 55 60

Gly Glu Leu Phe Lys Asp Glu Cys Tyr Cys Phe Tyr Pro Glu Asp Gly

65 70 75 80

Ser Lys Thr Glu Val Cys Ser Cys Gln Gln Lys Lys Ser Ala Lys Ile

85 90 95

Val Glu Lys Ile Val Asp Lys Ala Lys Val Ala Ile Gly

100 105

<210> 11

<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Lys Glu Cys Thr Pro Arg Phe Asn Asp Cys Ser Arg Asp Arg His Ser

1 5 10 15

Cys Cys Arg Ser Glu Leu Phe Lys Asp Val Cys Thr Cys Phe Tyr Pro

20 25 30

Glu Ser Gly Asp Ser Glu Val Cys Thr Cys Gln Gln Pro Lys His Leu

35 40 45

Lys Tyr Met Glu Lys Ala Thr Asp Lys Val Lys Gln Phe Gly Lys Lys

50 55 60

Phe Gly Gly Lys Leu Lys Lys Leu Phe Gly

65 70

<210> 12

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asn Glu Cys Ile Pro Lys His His Glu Cys Thr Ser Asn Lys His Gly

1 5 10 15

Cys Cys Arg Gly Lys Leu Phe Lys Tyr Lys Cys Gln Cys Thr Thr Val

20 25 30

Val Asp Gln Asn Gly Glu Gln Gly Glu Arg Cys Phe Cys Gly Thr Ala

35 40 45

Thr His His Lys Ala Ala Glu Leu Val Leu Gly Phe Gly Lys Lys Ile

50 55 60

Phe Gly

65

<210> 13

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Ala Cys Ile Pro Gln Tyr Arg Val Cys Thr Asn Ala Pro Gly Asn

1 5 10 15

Cys Cys Ala Lys Tyr Thr Cys Asp Cys Tyr Gly Arg Tyr Lys Ala Gly

20 25 30

Lys Lys Ile Gly Arg Asn Cys Phe Cys Leu Glu Lys Gly Val Thr Tyr

35 40 45

Lys Leu Glu Lys

50

<210> 14

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Glu Asn Cys Ile Pro Lys His His Glu Cys Thr Ser Asp Arg His Gly

1 5 10 15

Cys Cys Arg Gly Asp Leu Phe Lys Tyr Lys Cys Gln Cys Val Lys Ile

20 25 30

Val Asn Ala Gln Lys Glu Glu Thr Glu Arg Cys Ala Cys Val Lys Pro

35 40 45

Gly Leu His Asn Ala Val Glu Val Val Ile Arg Leu Phe Lys Lys Val

50 55 60

Ala Thr

65

<210> 15

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Lys Ala Cys Thr Pro Arg Leu His Asp Cys Ser His Asp Arg His Ser

1 5 10 15

Cys Cys Arg Gly Glu Leu Phe Lys Asp Glu Cys Tyr Cys Phe Tyr Pro

20 25 30

Glu Asp Gly Ser Lys Thr Glu Val Cys Ser Cys Gln Gln Lys Lys Ser

35 40 45

Ala Lys Ile Val Glu Lys Ile Val Asp Lys Ala Lys Val Ala Ile Gly

50 55 60

<210> 16

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaggaatgta ccccaaggtt taacgactgt tctcgagatc gccacagctg ctgccgaagc 60

gaactgttca aagatgtctg cacatgcttt tacccagaaa gtggagacag tgaagtctgc 120

acatgccaac agcccaagca tctgaagtac atggaaaaag ccaccgacaa ggttaaacaa 180

ttcggcaaaa agttcggcgg caagcttaaa aaattgttcg gt 222

<210> 17

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aacgaatgca ttcccaaaca ccacgaatgt acaagcaata agcacggctg ctgtagaggc 60

aaacttttca aatacaaatg ccagtgcacc acagtggttg accaaaatgg agaacaggga 120

gaaagatgct tctgcggaac agccactcac cacaaggctg ccgaattagt gcttggcttc 180

ggaaagaaga tcttcgga 198

<210> 18

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agagcttgca tcccacaata tcgtgtatgt acaaatgctc ctggaaactg ttgtgctaaa 60

tacacttgcg attgttacgg aagatataag gccggaaaga agataggtcg caactgcttt 120

tgcttagaaa agggcgtcac atacaagcta gaaaaa 156

<210> 19

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaaactgca tccccaagca tcacgaatgt accagcgaca ggcacggctg ctgtaggggt 60

gatctgttca agtacaaatg ccagtgtgtg aaaatcgtca acgcccagaa ggaagagacc 120

gagaggtgcg cctgcgtcaa acccggtctc cacaatgccg tcgaagttgt cattcgactc 180

tttaagaagg tagctacg 198

<210> 20

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaggcctgta caccaaggct gcatgactgt tcacatgatc gccacagttg ttgcagaggt 60

gaattgttca aagacgaatg ctattgcttt tacccagagg acggaagcaa aacagaagtc 120

tgctcatgcc agcaaaagaa atcagcaaag attgtcgaga aaatcgtcga caaggcaaag 180

gttgccattg gc 192

Claims (8)

1.一种拟环纹豹蛛A家族杀虫基因，其特征在于，所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQ IDNO .1所示。

2.一种权利要求1所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的杀虫蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO .6所示。

3.一种权利要求1所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽，其特征在于，所述成熟肽氨基酸序列如SEQ ID NO .11所示。

4.一种编码权利要求3所述的成熟肽的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .16所示。

5.一种含有权利要求4所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因的重组质粒。

6.一种权利要求3所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽在农作物害虫褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱防治中的应用。

7.一种含权利要求3所述的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂。

8.一种权利要求7所述的杀虫剂在农作物害虫褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱防治中的应用。

Images