JPH07503845A - 殺虫に有効なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺虫に有効なペプチド 本発明は殺虫有効ペプチドに関する。更に詳しくは本発明はとりわけてテジェナ リアくも毒液から単離しうる殺虫有効ペプチド科のペプチドの、このような殺虫 有効ペプチドをコードに入れたＤＮＡ。

および無背椎害虫の制御法に関する。

近年、公衆は合成殺虫剤の使用に伴う環境状の危険と哺乳動物への毒性に実際に 気付き始めてきた。その結果として、これらの殺虫剤の使用が迅速に低下した。

然しなから、有効な昆虫制御の必要性は変わらなかった。これは研究者を新規な 昆虫制御法の開発へと駆り立てた。

最も広く使用されている殺菌性ペプチドはバクテリウム・バシラス・チュリンジ イエンシスフ（以後Ｂ、ｔ、と呼ぶ）から誘導される。この抗菌剤は種々の食薬 毛虫、ジャパニーズ・ビートルズ（甲虫）および蚊を制御するのに使用される。

カテマタらの１９８９年１月１０日発行の米国特許第４，７９７．２７９号には Ｂ、ｔ、クルスタキ・デルタ−エンドトキシンをコードした遺伝子およびＢ。

ｔ、テネプリオニス・デルタ−エンドトキシンをコードした遺伝子からなるハイ ブリッド・バクテリア細胞およびそれらの製造法が記載されている。Ｂ、ｔ、ハ イブリッドはＢ、ｔ、クルスタキ菌株に感染しやすい害虫に対して、ならびにＢ 、ｔ、テネブリオニス菌株に感染しやすい害虫に対して、活性である。一般に、 これらのハイブリッドは殺虫活性の水準という点で、または活性のスペクトルの 点で、あるいは両者の点で、母菌味の物理的混合物によって観察されたものより もすぐれた有用な殺虫性をもつ。このような微生物を含む殺虫組成物を使用して 昆虫を攻撃することができる。それは殺虫有効量のハイブリッドを昆虫に又はそ れらの環境に適用することによって行われる。

バクテリウムＢ、ｔ、からの別の誘導はジルロイおよびウィルコックスらに発行 の欧州特許出願公報Ｎｏ０３２５４００Ａ１に記載されている。この発明は鱗翅 類昆虫に毒性のあるハイブリッド毒性遺伝子に関する。更に詳しくは、この発明 はＢ、ｔ、パル・クルスタキＨＤ−７３毒性遺伝子の部分およびＢ、ｔ、パル・ クルスタキイ菌株ＨＤ−１からの毒性遺伝子の部分を含むハイブリッド・デルタ ・エンドトキシン遺伝子からなる。鱗翅類昆虫に対する活性をもつタンパクをコ ードに入れたハイブリッド毒性遺伝子（ＤＮＡ）が記載されている。

バクテリウムＢ、ｔ、はまたウィルコックらの欧州特許出願公報Ｎｏ０３４０９ ４８にもその殺虫性のために利用されている。この発明はＢ、ｔ、遺伝子の昆虫 ガツト・エビセリアル細胞認識領域をジフテリア毒性Ｂ鎖に融合して鱗翅類昆虫 に対して活性なハイブリッドＢ、ｔ、毒物を製造することに関する。ハイブリラ ードＢ、ｔ。

遺伝子はバクロウィルスに挿入もしくはクローンして回収しつる毒物を製造する ことができる。あるいはまた、ハイブリッドＢ、ｔ。

遺伝子を含む宿主を殺虫剤として使用して、標的となる昆虫の環境に直接使用す ることもできる。

殺虫性化合物の研究において、サソリ毒か殺虫性を与える化合物の可能な資源と して確認された。レイルウス・キンクエストレイアタスの毒液から単離した２種 のえらばれた毒物がズロトキンらの”Ａｎ　Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ａ 　Ｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｔｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　５ｃｏｒｐｉ ｏｎ　Ｖｅｎｏｍ　ｂｏｔｈ　Ａｆｆｅｃｔｅｄ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｏｎｄｕｃ ｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｏ５ｓｅｒｓ　ａ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ ｉｔｅ”　Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２４０　 ：８７７−８７　（１９８５）に現れた。それらの化学的および医薬学的性質に 関連する研究において、そのうちの１つの毒物がハエの幼虫の速い刺激的収縮マ ヒを誘起し、他方が遅い沈降フラシド・マヒを誘起した。両方ともナトリウム伝 達に影響を及ぼした。

ズロトキンらの１９９０年６月１９日発行のカナダ特許２，００５．６５８号に はレエイルウス・キンクエストレイアタス・ヘブラエアス・プチナエ、ブチダニ なるサソリから誘導された殺虫有効タンパクが記載されている。この発明におい て、毒液を凍結乾燥して複数の留分に分離した。幼虫に対して最高の毒性をもち 、マウスに対して最低の毒性をもつ留分を更に精製し、“ＬｑｈＰ３５“と呼ぶ 最終生成物をえた。

殺虫性をもつ種々の組成物に関連した研究および開発に対応して、研究者は殺虫 性遺伝子を製造し、これらを保護すべき目標物に導入する方法を研究し、開発し た。１９８９年１１月７日発行のスミスおよびサマーズらの米国特許第４．８７ ９．２３６号にはえらばれた遺伝子をバクロウィルス・プロモータと組合せてバ クロウィルス・ゲノムを作り、昆虫細胞中でえらばれた遺伝子の発現をなしうる 組換えバクロウィルス発現物質を製造する方法が記載されている。

この方法はポリヘトリン・プロモータを含めて、ポリヘトリン遺伝子またはその 一部からなるＤＮＡ断片を作るためのバクロウィルスＤＮＡの開裂を含んでいる 。組換え体トランスファー・ベクターを製造するために、ＤＮＡ断片をクローン 用ビークルに挿入し、次いでえらばれた遺伝子をこの変性クローン用ビヒクルに 挿入し、ポリヘトリン・プロモータの制御下におく。次いで組換え体トランスフ ァー・ベクターを昆虫細胞中でバクロウィルスＤＮＡと接触させてバクロウィル ス・ゲノム中へのえらばれた遺伝子の組換えと結合を行う。バクロウィルス・オ ートグラファ・カルホルニア（ＡｃＭＮＰＶ）およびその付随するポリヘトリン ・プロモータは非常に高い水準のえらばれた遺伝子の発現をなしつるウィルス発 現ベクターを昆虫宿主細胞中に生産するのに育用であることがわかった。

発明者はこの発現ベクターが、昆虫を制御する系に使用しつるかも知れないこと を示唆している。それは特定の昆虫に対して、または昆虫のスペクトルに対して 、毒性のあるタンパクを生産する遺伝子をえらび、そしてこの遺伝子をＡｃＭＮ ＰＶ表現ベクターにクローンすることによって行われる。彼等はこのベクターが 保護されるべき植物または動物に適用しうることも示唆している。組換え体ウィ ルスは昆虫によって消化後の腸壁の細胞に浸入しつる。

殺虫性遺伝子を生産し、これらを保護されるべき標的に導入する更なる方法はカ ットラ−の“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｂｅｉｎｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅ ｄ　ｔｏ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　Ｃｒｏｐｓ：５ｕｃｃｅｓｓ　ｗｉｔｈ　Ｍｏ ｄｅｌ　Ｃｏｒｐ　Ｃ。

ｎｆｉｒｍｅｄ”、ＡＧ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｅｗｓ　ｖｏｌ、７（５）：３＆ １７　（＋９９０）に記載されている。この文献はＤＮＡが発芽しつつある花粉 に直接に移植しうること及びこの花粉は花に戻して種を生成させ次いでこの種を 変態植物に成長させることができることを教示している。この方法はタバコ植物 に成功裡に使用された、そしてトウモロコシおよびアルファアルファにも同様に 成功しうるものである。この方法はプロトプラストの移植よりも容易であるかも 知れない。究極の目的は植物を再生するよりはむしろ「花を咲かせる」ことにあ るからである。この方法は花粉を集め、これを３０〜６０分間発芽媒質中で発芽 させ、その後に花粉を含む液体懸濁液に所望のＤＮＡを加え、電気ショックを与 えて花粉の孔を開かせ、過剰のＤＮＡを洗浄して除き、そして変化花粉を植物の 柱頭（スティグマ）下におき、そして種が生成するまで待つ、ことからなる。こ れは作物植物に遺伝子を動かすための容易な方法でありうる。

追加の分配系はハーネスおよびエドワーズの１９８９年８月２９日の米国特許第 ４．８６１，５９５号に記載されている。この発明は処理した、実質的に手付か ずの微生物細胞を分配系として使用してタンパク化合物を動物およびヒトにはこ ぶことに関する。微生物細胞は均一遺伝子を介して細胞内にタンパクを始めに生 産する。タンパク生産性微生物を、細胞を実質的に手つかずのままにしながら、 化学的または物理的手段によって処理する。この処理法の操作は細胞内化合物の 活性の目立った損失なしに非ブロリフエレーテイブ処理微生物細胞を生じる。細 胞はレプリカされず且つ安定な細胞壁をもち、これが次いで動物またはヒトの消 化系の所望区域において破壊されるので、この発明によってカプセルに包まれる 生成物をタイミングよく又は標的となる放出させることを可能にする。好適な処 理後に、タンパク生成性微生物それ自体は分配系として使用され、従って生成化 合物の精製は必要でない。微生物によって生成されつる、タンパク、ポリペプチ ド、アミノ酸、または化合物は殺虫剤を含めて、この発明の出発物質でありうる 。

サソリ毒液に見出される神経毒をコードに入れた合成遺伝子を組み入れるＤＮＡ 技術を使用することの可能性はカーボネルらの“５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇ ｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎｉｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｃｏ ｒｐｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　ａｔｔｅｍｐｔｓ　ｔｏ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｔ　ｕｓｉｎｇ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ”。

ｇｅｎｅ　７３：４０９−１８（１９８Ｂ）に説明されている。この文献はＤＮ Ａ技術を使用して、サソリ、バサス・ニーピアスのサソリ毒液に見出される神経 毒をコードした合成遺伝子をバクロウィルス・ゲノムに組み入れてバクロウィル ス殺虫剤を改良することの可能性を教示している。ポリへドロン・プロモータ系 のＡｃＭＮＰ■発現系を使用する３種の発現法を行って毒物の生産を研究した。

３６コードン遺伝子単独の発現は毒物の少量生産を与えた。毒物への信号ペプチ ドの取付けにより若干の成功が見出された。毒物遺伝子をポリへドロンのＮ−末 端に融合させたときかなりな水準のタンパクが生産された。然しなから、ポリへ ドロン自体について観察されたものよりも１０〜２０倍も少なかった。発現の限 定は転写の水準にあるとは信じられず、トランスレーションおよびタンパク安定 性を含む後−転写に水準にあると信ぜられる。毒物の麻痺活性は検出されなかっ た。

研究者はまたクモ毒液から抽出した毒物をも単離しえた。ダクソンおよびパーシ スの１９９０年５月２５日発行の米国特許第４，９２５．６６４号にはアジニレ ノブシス・アペルタおよびホロレナ・クルタのクモから誘導された毒物を施用す ることによる心臓および神経学的疾患を治療する方法が記載されている。この毒 物はまた特異カルシウム・チャンネルまたは刺激アミノ酸受容体ブロッカ−とし ても有効であり、昆虫および関連害虫に対しても使用しつる。

単離したクモ毒液の毒物に関する別の研究は、ファンネル−ウェブくもの毒液か ら単離した低分子量因子のカルシウム・チャンネルに対する可逆的結合の能力を 示した。ＷＯ３９１０７６０８（発明者チェルスクセイら、１９８９年８月２４ 日発行）には、これらの活性な低分子量因子が十分な特異性をもってカルシウム ・チャンネルに可逆的に結合し、ニューロンのカルシウム・コンダクタレスを消 す能力をもち、カルシウム・チャンネル構造物の単離と精製を可能にすること、 が記載されている。これらの毒液は哺乳動物に対して毒性があることが見出され た。

クモ毒物の他の応用はジャクソンおよびバーシスの“５ｐｉｄｅｒ　Ｔｏｘｉｎ ：Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ” 、Ａｎｎ、Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１２：４０５−１４　（１９８９）に記 載されている。この文献は種々の毒物に大きな不均一性があることを教示してい る。それはこれらの実験がカルシウム・チャンネルの種特異性の性質を示唆した こと、およびクモ毒液はカルシウム・チャンネルのアンタゴニストを与えるかも 知れないこと、を認識している。論じられているクモ毒液は背椎動物に影響する ことが見出された。この文献はまたクモ毒液を農業用途のための昆虫特異性毒物 の可能な資源として確認している。

アダムスらの”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉ ｖｉｔｙ　ｏｆ　５ｙｎａｐｔｉｃ　Ｔｏｘｉｎｓｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｖｅｎｏ ｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＦｕｎｎｅｌＷｅｂ　５ｐｉｄｅｒ、Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉ ｓ　Ａｐｅｒｔａ″ｉｎ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ ｄ　Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９８６．Ｂｏｒｋｏｖｅｃ　ａｎｄ　 Ｇｅｌｍａｎ　ｅｄｓ、、Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＪ’ｅｒｓｅｙ、１ ９８６は多くのペプチド毒は昆虫のシナスブス伝導に拮抗し、これらの毒はＡｇ ｅｌｅｎｏｐｓｉｓ　ａｐｅｒｔａクモから単離されたことを教示している。

キョートらの１９８９年８月９日発行の米国特許第４．　８５５゜４０５号には 文部グモ毒液腺からえた受容体阻止剤およびその製造法が記載されている。この 化合物は昆虫を液体または固体ではこばれた化合物に接触させたとき殺虫効果を もつ。

ナカジマらの１９９０年４月１７日発行の米国特許第４，９１８゜１０７号には グルタメート受容体阻止剤活性をもつ化合物、その製造法、およびそれを含む殺 虫剤組成物が記載されている。この化合物は分散剤を加えた液体または固体の担 体に担持され、保護されるへき植物または動物に直接に適用される。低い調剤量 か殺虫剤として有効であり、哺乳動物および魚に対して非常に低い毒性しかもた ず、環境に対して悪影響が少ない。

従って、貧弱な効力を含む若干の合成殺虫剤に伴う問題の組合せにより、無背椎 動物の制御の新規な手段を開発する必要性が依然として存在する。

本発明によれば、たとえばテジエナリア属のクモから誘導される新規な殺虫有効 ペプチドが提供される。このペプチドはａ）長さ約５１個のアミノ酸、ｂ）位置 ６．２２．２５．３２．３６および４５の６個のシスティン残基、ｃ）ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：３で定義されるペプチドについて８０％の配列均一性を含むペプチ ド、ならびにそれらの農業的もしくは園芸的に許容しつる塩である。本発明は更 にここに定義するような実質的に類似のペプチドおよび信号リーダー配列を提供 する。

更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含む 新規なりＮＡ配列が提供される。

更に本発明によれば、ベクターが変態細胞に該コード配列の発現を行いうる、本 発明の殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターが提 供される。

更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含む 新規な世代交替植物が提供される。該ＤＮＡは植物の胚腺に又は植物の先祖の胚 腺に導入されて、ＤＮＡ配列の発現の特色が性的伝播または非性的伝播を通して 植物の次の世代に受け継がれる。

更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡ配列を発現 しつる新規な組換えバクロウィルス発現ベクターが提供される。

更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドを製造する新規な方法が提供さ れ、その方法は （ａ）宿主細胞に変態または移した組換え発現ベクターがペプチドをコードに入 れたＤＮＡ配列をもち、このベクターが変態細胞中で該コード配列の発現を行い うる、組換え宿主細胞を培養し、そして（ｂ）組換え宿主細胞の培養物から殺虫 有効ペプチドを回収する、ことからなる。

更に本発明によれば、有効量の本発明のペプチドを害虫と接触させることからな る非背椎害虫を制御する新規な方法が提供される。

更に本発明によれば、殺虫有効量の本発明のペプチドを害虫中に発現しうる組換 えバクロウィルスを害虫と接触させることからなる非背椎害虫の新規な制御法が 提供される。

更に本発明によれば、殺虫有効量の本発明のペプチドおよびその農業的または園 芸的に許容しつる塩を農業的または園芸的に許容しうるキャリヤー中に含む新規 な殺虫組成物が提供される。

更に本発明によれば本発明のペプチドに実質的に免疫反応性のある新規な抗体が 提供される。

更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡ配列から誘 導される新規なりＮＡプローブが提供される。

図１はＮＦＳ−３２６のプライマーの設計図である。

図２はテジエナリア・アグレステイスのクモからのＮＦＳ−３２６をコードに入 れたｍＲＮＡに相当する完全なりＮＡ系列である。

成熟した毒から開裂させた信号配列にはアンダーラインがしである。

箱に囲んだ領域は関連前の科のあいだのトランスレート配列の可変性の位置を示 す。

図３はテジエナリア・アグレステイスのクモからのＮＦＳ−３３１をコードに入 れたｍＲＮＡ配列に相当する完全ＤＮＡ配列である。

成熟した毒から開裂させた信号配列にはアンダーラインがしである。

箱に囲んだ領域は関連前の科のあいだのトランスレート配列の可変性の位置を示 す。

図４はテジエナリア・アグレステイスのクモからのＮＦＳ−３７３をコードに入 れたｍＲＮＡ配列に相当する完全ＤＮＡである。成熟した毒から開裂させた信号 配列にはアンダーラインがしである。

箱に囲んだ領域は関連前の科のあいだのトランスレート配列の可変性の位置を示 す。

図５は０．１％　ＴＦＡ（水性）対０．１％　ＴＦＡ　（ＣＨ，ＣＮ／Ｈ，Ｏ） の線状勾配かｌ：ｌである溶離したＶｙｄａｃ　Ｃ＋＊反転反転相カラムチジエ ナリア・アグレスティス全毒液の分留のクロマトグラフである。

Ａ、定義 ここに使用する「発現ベクター」はこのような配列が発現を行いうる他の配列に 操作自在に結合する、含まれるＤＮＡ配列を発現しつるベクターを包含する。そ れはこれらの発現ベクターがエビツマ−として又は発色団ＤＮＡの一体的な部分 として宿主微生物にレプリカしうるものでなければならないことを意味するが、 常にはっきりと述べているとは限らない。明らかにレプリカ性の欠如はそれらを 効果的に操作不能にする。要約して「発現ベクター」は機能的定義として与えら れ、ここに開示の特異のＤＮＡコードの発現を行いつるすへてのＤＮＡ配列が、 この特定の配列に利用される際にこの用語に含まれる。一般に、組換えＤＮＡ技 術の利用の発現ベクターは多くの場合「プラスミド」の形体にあり、これは円形 二重ストランドのことをいい、ベクターの形体では染色体に結合しない。「プラ スミド」と「ベクター」は互換性をもっとして使用される。プラスミドは最もふ つうに使用されるベクトルの形体にあるからである。

然しなから、本発明は均等な機能を果たし、後に当業技術に知られるようになっ たこのような他の形体の発現ベクターをも含めることを意図している。

「組換え宿主細胞」とは組換えＤＮＡ技術を使用して構成したベクターで変態さ せた細胞のことをいう。

テジエナリア属のクモはファンネル・ウェブのクモとしてふつうに知られている アジエレニダ工科のメンバーである。テジエナリアは広く分布されている属であ り、多くの種はヒトとの密接な関係で生息している。ティー・アグレテイスを含 むほとんどのテジエナリアのほとんどのアメリカ合衆国の種は他の国から偶然も ちこまれたと考えられる（Ｇｅｎｔｓｃｈ、Ｗｉｌｌｉｓ　Ｊ、１９７９゜Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　５ｐｉｄｅｒｓ、Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄＲｅｉｎｈｏｌｄ、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）ａテジエナリア・アグレステイスは代表的なファンネル・ウ ェブのクモであり、高い草の中に又は壁の割れ目、木材パイルなどにその巣を作 っている。現在ではその分布はオレゴン、ワシントン、およびアイダホの一部に 限られている（Ｒｏｔｈ、Ｖｉｎｃｅｎｔ　Ｄ、１９６８．　Ｔｈｅ　５ｐｉｄ ｅｒ　Ｇｅｎｕｓ　Ｔｅｇｅｎａｒｉａ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｈｅ ｍ１ｓｐｈｅｒｅ　（Ａｇｅｌｅｎｉｄａｅ）。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｕｓｅｕ、ｍ　Ｎｏｖｉｔａｔｅｓ　２３２３：ｌ−３３ ）。然しユタのような近傍の州に偶発的にもちこまれた徴候がある。ティー・ア グレステイスはいくつかの深刻なヒトの環境に含まれた（Ｖｅｓｔ、Ｄａｒｗｉ ｎ　Ｋ、１９８７．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ　ａｒａｃｈｎｉｄｉｒｍ　ｉｎ　ｔｈｅ 　ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｔｅｌ　５ｔａｔｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒ。

ｂａｂｌｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　Ｔｅｇｅｎａｒｉａ　ａｇｒｅ ｓｔｉｓ（Ｗａｌｃｋｅｎａｅｒ）ｓｐｉｄｅｒｓ−Ｔｏｘｉｃｏｎ２５　（２ ）：１７８−１８４）ｏ然しなから入手しつるデータのすべては（大部分はＮＦ Ｓインターナル・リサーチから誘導された）は、この毒液の殺虫成分が哺乳動物 の毒性に応答するものとは区別されることを示している。

本発明の殺虫有効ペプチドの作用機構は知られていない。これらの毒はへリオジ ス、スボドブテラ、およびトリコブルシアの幼虫に独特の徴候の組合寸を生せし める。毒もしくは毒液の投与と神経学的徴候の十分な発展との間には顕著な遅れ 、ときとして２４時間以上の遅れがある。テジェナリア毒液およびそれから精製 した毒物は、４８時間以上の連続４８時間以上の「もだえ」を特徴とする明瞭な ［けいれん性マヒ」を生せしめる。これらの徴候は“Ｉｎ５ｅｃｔｉｃｆｄａｌ ｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ”に更に十分に記載されている。

Ｂ、テジエナリア毒液からのペプチドの単離ペプチドの１つの資源はテジエナリ ア毒液である。クモ毒液はセファロトラジスからの毒液線抽出のような周知の任 意の方法によってテジエナリアから除くことができる。然しなから、クモ毒液お よびその単離した毒物の中に不純物が残るのを避けるために、クモ毒液は、クモ の電気刺激によって毒液を放出させ、次いで放出毒液を集めて、米国特許第４． ９２５．６６４号に記載されているようにレデルジテートもしくはヘモリンブに よって毒液の汚染を防ぐようにして得るのが好ましい。

電気ミルキング技術によってクモ毒液をえたら、それは高性能液体クロマトグラ フ（ＨＰＬＣ）および種々の分離様式たとえばゲル濾過、イオン交換、および反 転相クロマトグラフを使用してそのペプチド（毒）成分に分けることができる。

従って、クモの電気的ミルキング化技術を、反転相およびカチオン交換カラムを 使用する高性能液体クロマトグラフと組合せて使用して、実質的に純粋なりモ毒 を得ることができる。然しなから、他の均等な技術も本発明の範囲内で使用して クモ毒を分離しうることも理解されるであろう。このように単離した毒を分析し て殺虫活性をめ、アミノ酸配列を当業者に知られる方法によって決定することが できる。

単離したペプチド、不純フラクション、または毒液は多数の方法たとえば注射、 局所適用、または供給によって殺虫活性を分析することができる。注射が好まし い方法である。それは毒液の自然の入口ルートを模はうし、調剤量の正確な決定 を可能にし、そして比較的少量の材料を消費しながら有用なデータを生成するか らである。

ヘリオジスのような１種以上の主要な害虫で試料を試験することは、殺虫活性の 活発で商業的に適切な評価を提供する。

Ｃ９殺虫活性ペプチド 本発明は、その１つの面において、殺虫に有効なペプチドのファミリー（科）、 およびその殺虫有効断片、およびその農業的または園芸的に許容しうる塩を提供 する。

殺虫有効ペプチド含有フラクションが原料から単離され、ここに述べるように精 製されたならば、アミノ酸配列の決定は当業者に周知の方法たとえばＮ−末端ア ミノ酸配列の決定および自動アミノ酸シークエンサーを使用して行うことができ る。

追加の殺虫有効タンパクが本発明の範囲内にあると予期されるということはこの 開示から理解されるであろう。すなわち、このファミリー（科）の他の殺虫有効 ペプチドが存在し、上記３種の詳細に記述したものに加えてテジエナリアならび に他の資源から単離しうるものと信ぜられる。次のものは殺虫有効タンパクのフ ァミリー（科）に関する。この科の殺虫有効ペプチドは次の特性を共有している と信ぜられる。

■）寸法：約５５００〜６０００ダルトンの間のすべての範囲にあり、約５０個 のアミノ酸の長さをもち、そして２）保存アミノ末端：ＮＰＳ−３２６、ＮＦＳ −３３１およびＮＦＳ−３７３が始めの１１個の残基について同じであり、全体 の配列均一性を９０％以上共有し、そして ３）すべてが同じシスティン・パターンをもち、同じジサルファイド結合配列を 恐らく最も確実に共有し、５−　（Ｃｙｓ）−−１５［Ｃｙｓ）−３（Ｃｙｓ） −−７（Ｃｙｓ）−：３−　（Ｃｙｓ）−−８（Ｃｙｓ）−−５そして ４）ペプチドのすべては酸性であり；毒物の等電点はすべて５゜５より小さく、 そして ５）それらの単離ｃＤＮＡ配列のすべては同じ信号ペプチドならびに多くの場合 にアミノ基になるように処理されるが、これが酸性に関連するか否かは未だ知ら れていないカーボニル末端グリシン残基をコードに入れており；そして ６）すべては感染ＴＢＷに特徴ある応答を誘発することが知られている。タバコ 毛虫（ヘリオロジス・ビレセンス）またはビート・アーミイ毛虫（スボドブテラ ・エキシグア）のような昆虫に注射するとき、これらの毒物は独特の徴候の組合 せを生せしめる。１つの明瞭な点は毒性のおそい開示である。毒または全毒液か １００％の死滅を究極的に生せしめる調剤量で用いられたときでさえ、徴候は２ ４時間以上表れない。毒性の徴候は、ひとたび発展すれば、同様に独特である。

毒性の初めに指示はアゴのくりかえしのくいしばりおよび脚と体壁のフルエによ って特徴づけられる反応低下の期間である。数時間にわたってこれは徐々に明瞭 なケイレンもしくはケイレン性マヒの過程を与え、幼虫が体部をラセン形に曲げ る連続のケイレンによって特徴づけられる。これらのケイレンは中断なしに４８ 時間以上続く。感染した昆虫し飢餓および脱水により明らかに死ぬ。これはケイ レンに伴う大きなエネルギー消費から推定される。

これらの毒で処理したキャベツしゃくとり虫（トリコブルシア・ニイ）幼虫は短 時間で同じシリーズの徴候を受ける。フルエの挙動は２４時間以内に明瞭さの少 ないマヒへの道を与える。

更に詳しくは、これらの殺虫有効ペプチドおよびそれらをコードしたｃＤＮＡ配 列は単離されて、ここに特徴づけられた。第１に、ＮＦＳ−３２６が単離され、 反転相およびカチオン交換クロマトグラフによって均一になるまで精製された。

それは質量スペクトルによって決定して５６７８．５５ダルトン（＋／−０，３ ７ダルトン）の分子量をもつ。部分アミノ酸分析は、ＮＦＳ−３２６をコードし たｃＤＮＡ配列に近づくために使用されるオリゴヌクレオチドの設計を可能にし た。Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ２に定義するように、単離ｃＤＮＡによってコードされ た５１個のアミノ酸ペプチドはカルボキシ末端グリシジル残基で終わる。ペプチ ドのこの位置でのグリシン残基は一般にアミノ基に処理される（Ｃｒｅｉｇｈｔ ｏｎ、Ｔ。

Ｅ、ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８３）ｏ表Ｉ＋は単離ｃＤＮＡをコードに 入れたペプチドのアミノ酸組成を与える。

６個のコード化システィン残基のＣ−末端アミド化およびジサルファイド結合が 可能ならば、配列番号２をコードに入れたペプチドの分子量は６４．０８ダルト ンだけ減少して５６７８．８５ダルトンになる。これは精製ＮＦＳ−３２６につ いて質量スペクトルで決定したものに等しい。すなわち、クモ毒液から単離した 殺虫活性ＮＦＳ−３２６の処理した形体は配列番号３で決定したように現れる。

第２に、ＮＦＳ−３３１は反転相およびカチオン交換クロマトグラフによって単 離され精製された。それは質量スペクトルによって決定して５７００．．３９　 （＋／−０，２９ダルトン）の分子量をもつ。ｃＤＮＡをＮＦＳ−３２６へのア ミノ末端配列の均一性によって単離した。ＮＦＳ−３３１をコードに入れたｃＤ ＮＡが配列番号８に示された。表ＩＩ＋はこのペプチドのアミノ酸組成を与える 。

ＮＦＳ−３２６のようにシスティン残基のＣ−末端アミド化およびジサルファイ ド結合を仮定すると、配列番号８をコードに入れたペプチドの計算されたＭＷは ５．６９’９．８６ダルトンである。これはＮＦＳ−３３１について質量スペク トルによって決定したものに等しい。すなわち、クモ毒液から単離した殺虫活性 ＮＦＳ−３３１の処理した形体は配列番号９に決定したようにみえる。

この科（ファミリー）の第３のメンバーはＮＦＳ−３２６へのアミノ末端配列の 均一性によって単離した。それは反転相およびカチオン交換クロマトグラフによ って単離され精製された。ＮＦＳ−３７３をコードに入れたｃＤＮΔ配列は配列 番号１２に与えられており、そのアミノ酸組成は表ＩＶに示されている。ＮＦＳ −３２６およびＮＦＳ−３３１のようにシスティン残基についてＣ−末端アミド 化およびジザルファイド結合を仮定すると、配列番号１２をコードに人ねたペプ チドの計算されたＭＷは５，６４２．８１ダルｉ・ンである。これは質量スペク トルにより決定したものに等しい。前駆体分子のトランスレーションおよび処理 は従ってクモ毒液から精製したものである配列番号１４に決定した殺虫活性ペプ チドを生ずる。

また、本発明によれば、３ｆ’ｌの成熟タンパクＮＦＳ−３２６、ＮＦＳ−３３ １およびＮＦＳ−３７３に先行する新規な信号もしくは先導配列が提供される。

この信号ペプチドをコードに入れたｃＤＮＡは配列番号５で与えられる。この独 特の信号配列は標的、これらの製造もしくは合成、および恐らくは他の組換えタ ンパクのために使用することができる。信号配列は新しく合成されたタンパクの 適正な局在化を保証する点て重要な役割を演じる。一般に、これらは「トポジェ ニック信号Ｊを提供する（Ｂｌｏｂｅｌ、Ｇ、“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　 ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｏｐｏｇｅｎｅｓｉｓ”、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ ｅｔ、７７：１４９６−１５００（１９８０）。これは細胞の内に又は外に種々 の決定に付随するタンパクを標的どする。これは標的の場が細胞外にある分泌タ ンパクにとって特に重要である。それはまた、全細胞抽出物から細胞を分解し精 製するよりもむしろ細胞外媒質から発現タンパクを精製する方が容易でありうる ので、組換えタンパクの生産にも有用である。ここに請求する特定のペプチドに ついて、信号ペプチドは毒物がＣ−末端アミド化され、処理の起こる細胞内また は細胞外にそれらを向けることによって折り重ねられることを確保する点で有用 性をもつということを思うことができる。この信号配列は他の高度に構造化され たペプチドの発現および処理にも有用性をもつことができると信ぜられる。

主要アミノ酸配列の僅かの変化はここに実例としてあげたペプチドに比べて実質 的に均等な又は増大した活性をもつタンパクをもたらしうる、ということが理解 される。これらの変化は固相合成中の場を通して指向されたミュータシネシスお よびアミノ酸置換のように伝達されうるか、または本発明のペプチドを生ずる宿 主の突然変異によるような偶然でありうる。タンパク中の「変化」はＤＮＡのヌ クレオチド配列の変化によりその主構造（ふつうに起こる又は特にここに述べる タンパクに関して）を変える。この変化は、削除、付加または置換から生ずるタ ンパクの主構造において変わる。「削除」とは１個以上の内部アミノ酸残基が不 在であるポリペプチドのこととして定義される。［付加Ｊとは野生種にくらべて １個以上の追加の内部アミノ酸残基をもつポリペプチドとして定義される。置換 は１個以上のアミノ酸残基が他の基と置き変わることから生ずる。

タンパクの「断片」は、ポリペプチドに関連するタンパクの主要配列の一部と同 じ主要アミノ酸配列からなるペプチドである。

好ましい「置換」は保存性のあるもの、すなわち残基が同じ一般の型の別のもの によって置換されるものである。理解されるように、天然のアミノ酸は酸性の、 塩基性の、中性および極性の、又は中性および非極性の及び／又は芳香族のもの として副分類される。天然望とは異なるペプチドは置換されるアミノ酸と同じ基 からのアミノ酸を含むのが一般に好ましい。

すなわち、一般に塩基性アミノ酸Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓは互換性かあり 、酸性アミノ酸であるアスバルチンおよびグルタミンは互換性かあり、中性極性 アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、ＧＩｎおよびＡｓｎは互換性があり、非極性 脂肪酸Ｇｌ）’、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕは相互に関して保存性が あり（然し寸法のためにＧｌｙおよびＡｌａはより密接に関係がある）、そして 芳香族アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは互換性がある。

プロリンは非極性中性アミノ酸であるけれども、それは調和性の効果のために困 難さを現し、そしてプロリンによる又はプロリンのための置換は好ましくない。

ただし同じ又は類似の調和的結果かえられる場合はその限りではない。保存的変 化を表すアミノ酸としてＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎがあげられ、より小さ い程度にＭｅｔがあげられる。また、異なったカテゴリーに分類されているけれ ども、Ａｌａ、Ｇｌｙ、およびＳｅｔは互換性があるものと思われ、モしてＣｙ ｓはこのグループに付加的に適合するか、または極性中性アミノ酸と共に分類さ れつる。

Ｄ、ペプチドの製造法 組換え発現 更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドをコードに入れたＤＮＡ配列を 含む組換え発現ベクターか提供される。このベクターは変態細胞中でコード配列 の発現を行うことかできる。また本発明によれば、宿主細胞にペプチドを発現さ せるように本発明の殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡ配列を用いて変態させ た組換え宿主細胞か提供される。

所望のタンパクをコードした好適なりＮＡ配列の提供は、今や当業技術に知られ ている組換え技術を使用してタンパクの製造を行うことを可能にする。このコー ド配列は天然資源タンパクからｃＤＮＡまたはゲノム配列を取出すことによって えられ、あるいはタンパクのアミノ酸源から推定される合成ヌクレオチド配列を 使用して化学的に製造される。コードＤＮＡを合成で製造するとき、利点は意図 する宿主の周知のコード優先から取ることができる。

必要な制御配列たとえばプロモータおよび好ましくは増強剤を含む発現系は容易 に入手することができ、そして種々の宿主について当業技術において知られてい る。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバ− ・プレス（１９８９）を参照されたい。

すなわち、所望のタンパクは原核系および真核系の双方で製造することができ、 タンパクの処理形体のスペクトルをもたらす。

最も普通に使用される原核系としてイー・コリイがあげられるが、他の系たとえ ばビー・サブチリスおよびシュードモナスも有用であると予期される。原核系の 好適な制御配列は構成プロモータおよび誘導プロモータの両方を含み、ｌａｃプ ロモータ、ｔｒｐプロモータ、ハイブリッド・プロモータたとえばｔａｃプロモ ータ、ラムダ・ファージ　ＰＩプロモータがあげられる。一般に、異種タンパク が融合タンパクまたは成熟タンパクのいずれかとしてこれらの宿主中で生産され つる。所望の配列が成熟タンパクとして生産されるとき、生産される配列は、必 ずしも有効に除去されないメチオニンが先導することがある。従って、ここに請 求するペプチドおよびタンパクはバクテリア中で生産されるときのＮ−末端Ｍｅ ｔが先導することがある。その上、構造は作ることができ、そこではペプチドの コード配列は、タンパクの分泌をもたらす操作性信号が先導する。

このようにして原核宿主に生産されるとき、信号配列は分泌の際に除かれる。

広範囲の種類の真核宿主も組換え異種タンパクの生産に今や利用できる。バクテ リア中で真核宿主は所望のタンパクを生産する発現系で変態させることができる が、よりふつうには信号配列はタンノくりの分泌を行うために提供される。真核 系はそれらが高級微生物のゲノム配列をコードに入れたタンパク中に起こりつる イントロンを処理しうるという追加の利点をもつ。真核系はまた、たとえばグリ コジル化、カルボキシ−末端アミド化、酸化または若干のアミノ酸残基の誘導化 体化、適合性の制御、などをもたらす種々の処理機構を提供する。

ふつうに使用される真核系として、イースト、ファンガル細胞、昆虫細胞、哺乳 動物細胞、アビアン細胞、および高級植物の細胞があげられる。このリストはす べてをつくしているわけではない。好適なプロモータはこれらの宿主型に使用す るのに相溶性があり操作性があるものが利用され、ならびに末端配列および増強 剤たとえばバクロウィルス・ポリヘトリン・プロモータが利用される。上記のよ うに、プロモータは保存性か誘導性かのいずれかでありうる。たとえば、哺乳動 物系において、ＭＴＩ！プロモータは重金属イオンの添加によって誘導化されつ る。

所望の宿主に好適な発現系の構成の特定のものは当業者に周知である。タンパク の組換え生産によって、それをコードに入れたＤＮＡはえらばれた発現ベクター に好適に結ばれ、次いで相溶性宿主を変態させるのに使用される。次いで変態宿 主を、異質遺伝子の発現が起こる条件下で培養し保持する。このようにして生産 された本発明の殺虫存効タンパクは培養物から、細胞を分解することによって、 又は当業者に知られて、いる適正な媒質から、回収される。

本発明のタンパクの組換え材料が提供されたので、これらのタンパクは組換え技 術によって、ならびに自動アミノ酸シンセサイザーによって、製造することがで きる。他の宿主によって与えられる種々のポスト・トランスレーションルな特徴 のために、天然産タンパクの種々の変性体もえられる。「変性」タンパクは、グ リコジル化またはリピド化のパターン、またはタンパクの１次、２次または３次 構造を変えるポスト・トランスレーションの結果として本変性タンパクとは異な るが、もちろん本発明の範囲内に含まれる。

ここに述べるタンパクは遺伝子によってコードされていないアミノ酸によって合 成および置換されうるということも更に注目すべきである。別の残基の例として 弐Ｈ，Ｎ　（ＣＨ，）、Ｃ０ＯＨのωアミノ酸（ｎは２〜６）もあげられる。こ れらは中性、非極性のアミノ酸であり、たとえばザルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブ チルアラニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）　、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧｌｙ）　 、Ｎ−メチルメソロイシン（Ｎ−Ｍｅ　１１　ｅ）　、およびノルロイシン（Ｎ 　１　ｅ　ｕ）である。たとえばフェニルグリシンＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、芳 香族中性アミノ酸に置換されうるし、シトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンス ルホキシド（ＭＳＯ）は極性であるが中性であり、シクロへキシルアラニン（Ｃ ｈａ）は中性で非極性であり、システィン酸（Ｃｙａ）は酸性であり、そしてオ ルニチン（Ｏｒｎ）は塩基性である。プロリン残基構造順応性はこれらの１つ以 上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に置換された場合にえられる。

Ｅ２本発明の殺虫有効性ペプチドのコード配列の確認本発明の別の面において、 本発明のペプチドをコードに入れた実質的に単離したＤＮＡ配列が提供される。

部分アミノ酸配列データを使用して、資源からのタンパクの製造に応答する遺伝 子が単離され、確認される。ペプチドの生産に応答する遺伝子を得るために、多 くの方法が利用できる。例として次の文献かあげられる。フクワ・ニスらの“Ａ 　ｓｉｍｐｌｅ　ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　 ｃｌｏｎｉｎｇ　ｌｏｗ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ”、Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｖｏｌ、９．Ｎｏ、２　（Ａｕｇｕｓｔ１９９０）；フロ ーマン、エム−１イの“ＲＡＣＥ　Ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ”、ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｅｄ、　Ｉｎｎ１ｓ　 ｅｔ　ａｌ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、（ １９９０）；および米国特許第４，７０３，００８号の“ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅｓ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ”。この特許を引用 によってここに組み入れる。

短くいえば、決定されたアミノ酸配列をコードに入れたＤＮＡ分子、または決定 アミノ酸配列をコードに入れたこのようなりＮＡ分子に対する補形のＤＮＡスト ランド、か合成される。この合成りＮＡ分子を使用して、有機体たとえばクモの ゲノムＤＮＡ、あるいはクモのような有機体の細胞または組織から単離されたｍ ＲＮＡのＣＤＮＡコピー、から誘導されたＤＮＡ配列を部分的に含む組換えＤＮ Ａ分子を含む細胞クローン中のＤＮＡ配列の均一性を検査する。

一般に均一なりＮＡの独特の確認のためには１５個以上のヌクレオチドのＤＮＡ 分子が必要である。この数は配列中に少なくとも５個のアミノ酸を独特に決定す るに必要な数である。決定されたアミノ酸配列をコードに入れることのできる異 なったＤＮＡ分子の数は非常に大きいことが理解されるであろう。それぞれのア ミノ酸は６個までの独特のトリヌクレオチドＤＮＡ配列またはコードンをコード に入れることができるからである。それ故、すへての可能な合成りＮＡプローブ を個々に試験し、そしてこのようなりＮＡ分子の若干をプールしてプローブとし て同時に使用することは非実用的である。

「デジェネレート」プローブと呼ぶこのようなプールの製造は当業技術に周知で ある。プローブ混合物中の唯一のＤＮＡ分子か関心のある遺伝子への正確な配列 均一性をもつけれども、プール中の合成りＮＡ分子のいくつかは該遺伝子を独特 に確認することかできる。

高度の均一性の相似のみが必要であるからである。それ故、関心のある遺伝子の 成功裡の単離は、可能なりＮＡプローブ配列のすべてを含んではいない合成りＮ Ａプローブ・プールに付随しうる。一般に、微生物によって利用されることの少 ないコードンはプローブ・プール中に表れる必要はない。事実、単一配列ＤＮＡ プローブは、それぞれのアミノ酸について微生物によって最も多く使用されるＤ ＮＡコードンを含有させることによって製造されつる。然しこの試みは必ずしも 常に成功するとは限らないことが理解されるであろう。

遺伝子配列を単離する１つの技術はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。

たとえば米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参 照されたい。これらの米国特許を引用によってここに組み入れる。実質的にＰＣ Ｒは配列の２つの末端部分が知られているときに、えらばれたＤＮＡ配列の生産 を可能にする。プライマー、またはオリゴヌクレオチド・プローブ、は関心のあ る配列のそれぞれの端部に相当するものかえられる。ＰＣＲを使用して、ＤＮＡ 配列の中心部分が次に合成により生産される。

ＰＣＲを使用して、独特のクモ毒液遺伝子をコードに入れた遺伝子を得るこのよ うな１つの方法において、ＲＮＡをクモから単離して精製する。デオキシアミノ レート末端オリゴヌクレオチドを次いでプライマーとして使用してクモｍＲＮＡ をｃＤＮＡに反転転写する。上記のデジェネレート・プローブ中におけるように 、合成りＮＡ分子または合成りＮＡ分子の混合物を次いで製造する。これは前述 のように毒液タンパクのアミノ末端アミノ酸をコードに入れることができる。こ のＤＮＡ混合物をデオキシアミノレート末端オリゴヌクレオチドと共に使用して ＰＣＲ反応を開示させる。ＰＣＲ反応を開示させるのに使用する合成りＮＡ混合 物は所望のｍＲＮＡに特して特異であるので、所望のｃＤＮＡのみが有効に増幅 される。えられる生成物は増幅ｃＤＮＡを表し、これは多くの周知のクローン用 ベクターのいずれかに結合しつる。それにもかかわらず、ペプチドの「ファミリ ー」がクモ毒液中に存在し、これが類似のアミノ酸配列をもつこと、およびこの ような場合には混合オリゴヌクレオチド・プライマー配列がこれらの関係ペプチ ドをフートに入れた関連ｃＤＮＡの１つ以上の増幅をもたらしうろこと、か理解 されるであろう。関連ペプチドをコードにいれた遺伝子も本発明の範囲内にある 。関連ペプチドも有用な殺虫活性をもつからである。

最後に、製造されたｃＤＮＡ配列も通常の技術を使用して適当なベクターにクロ ーンして、分析してヌクレオチド塩基配列を決定することができる。殺虫有効タ ンパクをコードに入れたＤＮＡ配列の例は配列のリストおよび表Ｖ［ＩＩに示さ れている。これらのＰＣＲ生成物の直接のアミノ酸トランスレーションはそれら が成熟タンパクの完全なコーディング配列に相当することを示している。前駆体 および／またはプロペプチド領域に相当するアミノ酸をコードに入れているかも 知れないＤＮＡ配列の部分はこの試みによってはえられないかも知れない。この ような配列はこの試みで製造されるｃＤＮＡを使用するゲノムまたはｃＤＮＡク ローンの単離によって決定さ第１うる。ハイブリッド化プローブもこの技術の範 囲内にあるからである。

Ｆ、交差ハイブリッドｆヒ、関連化合物のプローブとしてのＤＮＡ配列。

好適な大きさの、一般には２０〜ｌ！５０個のヌクレオチドのＤＮＡプローブは 本発明のＤＮＡ配列から誘導することができる。このようなプロ・−プは本発明 の殺虫有効ペプチドの存在を他の資源からの核酸によりハイブリッド化すること によって検出するのに使用する、二とかできる。信号配列、ｃＤＮＡの断片、ま たは厳密さの減少した条件下の全ｃＤＮＡさえもコードに入れたオリゴヌクレオ チド・プローブを用いるスクリーニングは、機能の類似した他の活性ペプチドを 本発明の毒分子のファミリーに接近させることを可能にする。本発明のＤＮ、Ａ 配列から生じるヌクレオチド・プローブによる交差ハイブリッド化の良好な候補 と思われる核酸の資源として、同じ属であるが異なった種のクモ、関連する属の クモ、および同じ属であるが異なった場所のクモがあげられるが、これらに限定 されない。

Ｇ、殺虫剤としてのペプチドの利用 本発明の殺虫有効ペプチドは非背椎害虫たとえば鱗翅類の目の害虫を制御するの に有用であると信ぜられる。この制御は害虫を有効量の本発明のペプチドと接触 させることによって行われる。好都合には、昆虫は好ましい害虫である。

非背椎害虫をペプチドと接触させて該害虫を制御する方法は知られている。例と して該タンパクを合成的にカプセルに入れて害虫に経口消化させることがあげら れる。本発明のタンパクを発現する組換え宿主、たとえばシュードモナス・スル オレスセンス、は焼いて殺すことができ、植物または適当な基質に施用して爾後 の経口消化および制御に供することができる。

もちろん、本発明のタンパクを使用する非背椎害虫の制御法は害虫を制御する他 の方法と組合せて使用することができる。たとえば、ここに記述する世代交替植 物とイー・コリイは、制御すべき害虫の種類と他の重要な可変因子に依存して他 の非背椎動物の毒を発現するように処理することができる。

殺虫有効量の本発明のペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しつる塩を その農業的または園芸的に許容しうる担体中に含む殺虫剤組成物も提供される。

８９世代交替植物 更に本発明によれば、本発明の殺虫有効ペプチドをコードに入れたＤＮＡ配列を 胚腺に導入してなる世代交替植物が提供される。このＤＮＡ配列の特色は性的伝 播または非性的伝播により植物の後の世代に受け継がれる。

本発明により殺虫有効ペプチドをコードに入れた遺伝子は遺伝子工学技術によっ て植物に導入することができる。これは植物細胞中のペプチドの生産の際に害虫 を制御する手段として有用であることが期待される。それ故、天然産のものより も昆虫耐性の強い植物を生せしめることが可能である。

植物を変態させるのに使用しうる殺虫有効ペプチド遺伝子のコート領域は、遺伝 子の全長または部分的な活性の長さでありうる。然しなから、ペプチドをコード した遺伝子を生成植物細胞中の機能ペプチドとじて発現させ、生産させることか 必要である。殺虫有効ペプチドをコードに入れたゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両者 からのＤＮＡおよび合成りＮＡはいずれも変態に使用することができる。更に、 遺伝子はｃＤＮ八クワクローン部分的に、ゲノム・クローンから部分的に、そし て合成遺伝子から部分的に、ならびにそれらの種々の組合せから構成させること ができる。また、ペプチド遺伝子をコートしたＤＮＡは、単離ペプチド源とは異 なる種々のクモからの部分を含むことができる。

更に、殺虫有効ペプチドは別の化合物と混合して予想外の殺虫性を変態植物中に 生成させることかできる。これには該化合物を発現する空想の遺伝子も含まれる 。これらの化合物は昆虫に経口毒性をもつプロテアーゼ阻止剤またはたとえばバ ソラス・チュリンシエンスイスからのポリペプチドも含まれつる。Ｂ、チュリン ジエンスイスは昆虫細胞膜のカリウム浸透性に変化を生ぜしめ、膜に小孔を発生 させると考えられる。他の孔形成性タンパクも殺虫活性ペプチドと組合せて使用 することができる。このような孔形成性タンパクの例はマゲイニン、セクロビン 、アタシン、メイチン、グラミシジンＳ、ナトリウム・チャンネル・タンパクお よび合成断片、スタフィロコッカス・アウレウスの毒、アポリボ・タンパク、お よびそれらの断片、アラメチシン、および種々の合成アンフィバスイック・タン パクである。レクチンは細胞膜に結合してエンドシトシスを増強するが、レシチ ンは本発明の殺虫有効ペプチドと結合して昆虫耐性の植物を遺伝的に変性させう る別の種類のタンパクである。

ペプチド遺伝子のプロモータは空想上の遺伝子配列を表現させるのに有用である と予期されるが、他のプロモータも有用であると思われる。有用と思われる植物 プロモータは過剰生産性プロモータである。ペプチドの遺伝子配列と操作的に結 合するこのプロモータは、変態植物が害虫に対して増大した耐性をもつようにペ プチドの発現を促進させることのできるものであるべきである。本発明に有用で あると思われる過剰生産性プロモータは知られている。

殺虫有効ペプチドを操作的にプロモータに結合させてなる空想上の遺伝子配列は 好適なりローン用ベクターに結合して所望の植物を変態させることができる。一 般に、宿主細胞と相溶性のある種から誘導されたレプリカおよび制御配列を含む プラスミドもしくはウィルス（バクテリオファージ）ベクターが使用される。ク ローン用ベクターは代表的にレプリカ源ならびに特定の遺伝子（変態宿主細胞中 のフェノ型分泌マーカーを与えうるもの）をはこぶ。変態用ベクターは宿主細胞 中の変態後にこれらのフェノ型マーカーによって分泌されつる。

有用であると予期される宿主細胞として、イー・コリイ、サルモネラ・リフィミ ムリウムおよびセラチア・マルセスエンスのようなバクテリア宿主を包含する原 核宿主、ならびにイーストまたはフィラメンタス・ファフジのような真核宿主か あげられる。

クローン用のベクターとこのベクターで変態した宿主細胞は一般にベクターのコ ピー数を増大させるのに使用される。増大したコピー数により、ペプチド遺伝子 を含むベクターは単離されて、たとえばここに記載の遺伝子配列を導入するのに 使用される。

異種遺伝子を発現する植物の製造法は知られている。たとえば、植物組織は直接 感染によって又は共培養によって変態させることができる。植物組織または細胞 をエイ・チュメファシエンスと共に培養し、外見性ＤＮＡからプロトプラストへ の直接の遺伝子移動を行わせ、ＰＥＧを用いて加温し、ミクロ注入を行い、そし てミクロブロジエクテイルのボンバードメントを行う。

エレクトロポレーションによるタバコの変態は、Ａｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　Ｎｅｗｓ、Ｖｏｗ、７．Ｐ、３およびｌ７（９月／１０月、１９８０年） に記載の技術により確認された。この技術において、植物プロトプラストは殺虫 存効ペプチド遺伝子構造を含むプラスミドの存在でエレクトロボレートされた。

高強度の電気パルスは生物膜を可逆的に浸透してプラスミドの導入を可能にした 。エレクトロボレートされた植物のプロトプラストは細胞壁を再生し、分割し、 そして植物細胞を生成した。発現した殺虫有効ペプチドにより変態させた植物細 胞の選択は、上記のフェノ型マーカーを使用して達成させることができる。外見 性ＤＮＡは任意の形体でプロトプラストに加えることができる。その形体はたと えば裸の線状、円形または超コイル型のＤＮＡ、リボゾームに包まれたＤＮＡ、 球形ブラストのＤＮＡ、他の植物プロトプラスト中のＤＮＡ、塩で錆化したＤＮ Ａ１などである。

アグロバクテリウムによって変態させることかでき、そして変態細胞から再生さ れる植物のすべても、変態させた殺虫有効ペプチド遺伝子を含む変態全植物を生 産するように本発明により変態させることかできる。米の変態はディ・エム・レ イネリイらの“Ａｇｒ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　５ｔａｖｉａ　１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ）’ 、Ｖｏ１．８．ｐｐ３３−３８　（１９８０年１月）によって確認された。

殺虫作動ペプチドを植物細胞に導入する別の方法は、植物細胞を、殺虫有効ペプ チド遺伝子で変態させたエイ・チュメファシエンスにより感染させることである 。画業技術に知られる適当な方法により、変態植物細胞を成長させてシュート、 根を作り、更に発展させて変態植物にする。殺虫有効ペプチド遺伝子配列は適当 な植物細胞に、たとえばエイ・チュメファシエンスのＴｉプラスミドによって、 導入することができる。Ｔｉプラスミドをエイ・チュメファシエンスによって感 染した植物細胞に移し、植物ゲノムに安定して組み込まれるようにする。

Ｔｉプラスミドは、変態細胞の生産に必須と思われる２つの領域を含む。これら のうちの１つは、トランスファーＤＮＡ（Ｔ　ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍形成を誘 発する。他の１つはウィルス領域と呼ばれ、腫瘍を形成するが維持は行わないた めに必須である。植物ゲノムに移動するＴ　ＤＮＡ領域は、その移動能力に影響 を及ぼすことなしに酵素の遺伝子配列の挿入によって大きさを増すことができる 。腫瘍発生遺伝子を除去することによってそれらはもはや干渉せず、変性Ｔｉプ ラスミドはベクターとして使用されて、本発明の遺伝子構造の適当な植物細胞へ の移動が行われる。

遺伝子物質も植物細胞に移すことができる。これは細胞によってとりこまれる遺 伝子物質と沈殿錯体を形成するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用するこ とによって行われる。

植物細胞へのＤＮＡの移動を、単離したプロトプラスト、培養した細胞、および 組織への注入によって、及び苗および植物のメリステマチック組織への注入によ って達成させることができる。

異種ＤＮＡ配列を植物細胞に導入する別の方法は、シューテイング装置「遺伝子 銃」によって植物細胞に押し込まれる粒子にＤＮＡを取り付けることからなる。

すべての植物または植物器官をこの方法の標的として使用することができる。生 体内の及び試験管内の胚、頂上の及び他の分裂組織、蕾、体組織および性組織が 包含されるが、これらに限定されない。世代交替細胞およびカルルスは次の確立 された方法に従ってえらばれる。標的となった組織はツマチック胚を形成するよ うに又は世代交替植物を与えるようにシュートを再生するように誘起される。そ の方法は画業技術において知られる確立された方法による。適当な方法は使用す る植物の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に従ってえらばれる。世代交替のトウモロコシ植 物は、胚細胞への遺伝子の移動のための高速ミクロプロジェクテイルを使用する ことによって製造された。次の文献“Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｔｉｃ　ｇｅｎｅｓｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇ ｅｎｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉＣｍａｉｇｅ　ｐｌａｎｔｓ”、Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、８．ｐｐ８３３−８３８　（１９９０年９月）を参照されたい。

再生された植物は、組み込まれた異種ＤＮＡに関しては想像上のものであるかも 知れない。異種ＤＮＡを含む細胞がミクロまたはマクロのいずれかの胞子に発達 するならば、組み込まれたＤＮＡは性的結果（子孫）に送られる。異種ＤＮＡを 含む細胞が植物の体細胞であるならば、空想でない世代交替植物が野菜（非性的 ）伝播の通常の方法によって生産され、生体内で蕾から柄に、または試験管内で 画業技術で知られる確立された方法で生産される。このような方法は使用する植 物の種に従ってえらばれる。

植物細胞または植物の変態後に、ペプチドが発現されるように変態させたこれら の植物細胞または植物は適当なフェノ型マーカーによってえらぶことかできる。

これらのフェノ型マーカーとして抗生物質耐性があげられるが、これに限定はさ れない。他のフェノ型マーカーも画業技術に知られており、本発明に使用するこ とができる。

異なった変態系の多様性のために、すべての植物の種類か原則として変態させる ことができ、それによってこれらが本発明の殺虫活性ペプチドを発現する。

実際にすべての植物が培養細胞または組織から再生されることを示す証拠となる 生体の数は増大しつつあり、これらはすべての主要穀物作物種、砂糖ケーン、砂 糖ビート、綿、果実およびその他の木、マメ類および植物類を包含するが、これ らに限定されない。これらの植物のすべてがアグロバクテリウムによって変態さ せうるか否かについて限られた知識が現在存在する。アグロバクテリウムについ て中性の植物宿主の種は試験管内で変態させることができる。モノコチレドン植 物、および特に穀類および草類はアグロバクテリウムに対して中性宿主ではない 。これらをアグロバクテリウムを使用して変態させる試みは最近まで成功しなか った。ある種のモノコツトはアグロバクテリウムによって変態させうるという証 拠が現在育ちつつある。現在入手しつるようになった新規の実験的試みを使用し て、穀物および草類の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）も変態させつる。

アグロバクテリウムによって変態させうる追加の植物の属として、イボモニア、 バシフロラ、シクラメン、マラス、ブルーノ、ローザ、パルス、ボビュラス、サ ンタリオン、アリウム、リリウム、ナシサス、アナナス、アラナス、ファセオラ ス、およびビシラムがあげられる。

再生は植物の種から種へと変わるが、一般に殺虫作動ペプチド遺伝子の多重コピ ーを含む変態プロトプラストの懸濁液が始めに提供される。次いで胚の形成がプ ロトプラスト懸濁液から中性胚として成熟と発芽の段階へと誘起されつる。培養 媒質は一般に種々のアミノ酸とホルモンを含む。シュートと根は同時に発達する のがふつうである。効率的な再生は媒質に、遺伝型に、および培養物の履歴に依 存する。これら３つの可変因子が制御されるならば、再生は十分に再現性があり 、反復可能である。

変態植物細胞から成長した成熟植物は自動的に交配植物を製造することかできる 。交配植物は殺虫有効ペプチドの遺伝子を含む種子を生産する。これらの種子は 植物に成長して殺虫有効ペプチドを発現する。交配はたとえば昆虫耐性ハイブリ ッドを発達させるように使用される。この方法において、昆虫耐性交配線を別の 交配線と交配させてハイブリッドを作る。

２倍体植物において、代表的に１つの親を殺虫有効ペプチド（毒）遺伝子配列で 変態させ、他方の親を野生にすることができる。

親を交配させた後、第１世代のハイブリッド（Ｆｌ）はｌ毒／野生ｆｌ：％毒／ ′野生種の分布を示す。これらの第１世代のハイブリッド（Ｆｌ）は自動的に第 ２世代のハイブリッド（Ｆ２）を生産する。

Ｆ２ハイブリッドの遺伝子分布はス毒／毒：％毒／野生種：Ｖ４野生種／野生種 である。毒／毒の遺伝子を作るＦ、ハイブリッドは昆虫耐性植物としてえらばれ る。

ここに述べるように、安全で遺伝子しつる可変因子はフェノ型変化を記述するが 、これには植物の特色に性的に移る遺伝性可変因子が含まれる。ただし可変因子 は依然とし７て本発明の殺虫有効ペプチドを発現する。また、ここに使用するよ うに突然変異体（ミコータント）は、放射線のような環境状態の結果としての、 又はよく確立された遺伝法則により減数分裂状に子孫に伝えられる遺伝子変化の 結果としての変化を記述する。然し、突然変異植物は依然として本発明のペプチ ドを発現しなければならない。

一般に、世代交替植物中に発現させるようにえらんだ理想的な殺虫作動タンパク は標的としない昆虫および背椎動物に安定であることを特徴とするものである。

発現系は発現水準が殺虫効果を与えるようにえらばれる。すなわち、このような 世代交替の農業的に重要な植物を得ることの技術的可能は、環境に応答しつるよ うに作物の昆虫による損害を減少させるように一体となった害虫支配系で使用す るための付加的武器を農民に提供するものと思われる。

１、遺伝子工業による殺虫性微生物 殺虫有効ペプチドは単独で又は別の昆虫毒との組合せにおいて、バクロウィルス およびハイブリッド・バクテリアのような微生物の毒性を発現もしくは増大させ るのに有用であると思われる。ヘリオジス・ビレセンス（タバコ毛虫）、オルギ イア・シュードラガタ（ダクラスのモミ材に住む蟻）、リマントリア・ジスパー ル（ジブシー蟻）、アウトグラファ・カルホルニア（アルファアルファー毛虫） 、ネオディブリオン・セルティファー（ヨーロッパ松のハエ）、およびラスベイ レシア・ボモネラ（リンゴの蟻）を感染させるものを含めて、いくつかのバクロ ウィルスはいくつかの国で登録され、殺虫剤として使用された。ゲノムへの少な くとも１つの昆虫選択性前の導入は、このような殺虫剤の能力をかなり増大させ るものと思われる。

本発明に使用するのに特に適していると思われる組換え発現ベクターは米国特許 第４，８７９．２３６号に記載されている型のようなバクロウィルス発現ベクタ ーである。この米国特許を引用によってここに組み入れる。また、カーボネルら の“５ｙｎｔｈｅｔｉｃｏｆ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎ　１ｎｓ ｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｔｃ　５ｃｏｒｐｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ　ａｎｄ 　ａｔｔｅｍｐｔｓ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｔ　ｕｓｉｎｇ　ｂａｃｕｌｏ ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｇｅｎｅ、７３：４０９−４１８　（１９８８ ）も参照されたい。このベクターは、テジエナリアくも毒液から実質的に単離し うる殺虫有効ペプチドをコードに入れたＤＮＡ配列がバクロウィルスにクローン される系において有用であると考えられる。たとえば米国特許第４，８７９゜２ ３６号およびミラーらの５ｃｉｅｎｃｅ　２１９，７１５−７２１（１９３１） に記載されているようなアウトグラファ・カルホルニア（ＡｃＭＮＰＶ）発現ベ クターである。この組換え発現ベクターウィルスは次いで植物または動物に加え ることができる。この際、昆虫は害虫であり、ウィルスが害虫によって消化され ると、組換えウィルスは内蔵壁の細胞に浸入してレプリカを始める。レプリカの 間、殺虫有効タンパクの遺伝子か発現されて、昆虫か野生種ＡｃＭＮＰＶウィル スを消化したときよりも昆虫の死をもたらす。

有用であると予想されるハイブリッド・ウィルスも欧州特許出願０３４０９４８ 号に教示されている。本発明のＤＮＡを発現するハイブリッド・ウィルスは変化 した昆虫宿主の範囲をもつウィルスを生しる。たとえば、融合タンパクは、本発 明のＤＮＡと特異な昆虫内蔵細胞認識タンパクとからなるハイブリッド遺伝子の 単一ポリペプチド生成物として発現されうる。発現された殺虫作動ペプチドは宿 主昆虫標的に向けられる。

種々の原核および真核の微生物を変態させて、欧州特許出願第０３２５．４００ 号に記載の方法によって、殺虫作動タンパクをコードしたハイブリッド毒遺伝子 を発現させることができる。

本発明のタンパクをコードした遺伝子をもつプラスミドを含むハイブリッド・バ クテリア細胞は、本発明の方法に有用であると予期される。昆虫はこのハイブリ ッドを昆虫に適用することによって制御される。たとえば米国特許第４，７９７ ，２７９号を参照されたい。この米国特許を引用によってここに組み入れる。

本発明に使用するのに好適であるバクロウィルスを使用する他の例は、トマルス キイらの”Ｉｎ５ｅｃｔ　ｐａｒａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ −ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍ１ｔｅ　ｎｅｕｒｏ ｔｏｘｉｎ　ｇｅｎｅ”。

Ｎａｔｕｒｅ、３５２：８２−８５　（１９９１）、およびステワードらの”Ｃ ｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒ ｕｓ　１ｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｎ　１ｎｓｅｃｔ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏｘｉｎ　ｇｅｎｅ”、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：８５−８ ８　（１９９１）、に記載されている。

Ｊ、殺虫有効ペプチドに対する抗体 本発明の別の面は、本発明の殺虫作動ペプチドに対する抗体である。次の記述に おいて、この抗体と反応性のペプチドを検知し精製するための免疫技術当業者に 知られている種々の方法についての引用がなされる。

抗体は分子が特異的に反応しつる場合の「分子に結合しつる」ものといわれる。

「エピトープ」なる用語は、抗体によって認識され結合されつる分子の部分のこ とを指すものを意味する。抗原は１個以上のエピトープをもちつる。「抗原」は その抗原のエピトープに結合しつる抗体を生じるように動物を誘発しつる。上記 の特異反応とは、抗原が高度に選択的に対応する抗体と免疫反応し、他の抗原に よって誘起される他の抗体とは免疫反応しないことをいう。

ここに使用する「抗体Ｊ　（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍｃｂ）と は、抗原と結合しつる手つかずの分子ならびにその断片（たとえばＦａｂおよび Ｆ　（ａ　ｂ’　）　ｓ断片）を包含することを意味する。ＦａｂおよびＦ　（ ａｂ’　）＊断片は、循環から迅速に明らかになる手つかずのＦｃ断片を欠き、 昆虫抗原の非特異組織結合をすることが少ない。

本発明の抗体は種々の方法のいずれかによって製造することができる。このよう な抗体の製造と使用は周知であり、文献に十分に記載されている。たとえばバー ロウおよびレーンの“Ａｎｔｉｂｏｄｙ　：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａ ｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ（１９８８）を参照されたい。一般に、殺虫有効ペプチドは天然の夾雑物を 実質的に含まないように製造され精製される。あるいは殺虫有効ペプチド断片は 画業技術に知られている方法により合成される。

精製ペプチド、または合成断片、または精製天然断片および／または合成断片は より大きい特異活性のポリクローナル抗血清を作るために動物に導入することが できる。

モノクローナル抗体は周知のハイブリドーマ技術を使用して製造することができ る。一般に、このような方法は、殺虫有効ペプチド抗原のような抗原で動物を免 疫することを包含する。このような動物のスブレノサイトは適当なミエローマ細 胞腺で抽出され融合する。

いずれかの好適なミエローマ細胞腺を本発明により製造することができる。融合 後に、えられたハイブリドーマ細胞を好適な媒質中に選択的に維持し、次いで限 定稀釈によりクローンする。このような選択によりえられるハイブリドーマ細胞 を次いで分析して、殺虫有効ペプチド抗原に結合しうる抗体を分泌しうるクロー ンを確認する。

ペプチド源が不純なときは、ハイブリドーマ細胞の若干のみがペプチドを生成す る（他のハイブリドーマ細胞はペプチド夾雑物に結合しつる抗体を生成する）。

従って、ハイブリドーマの中からペプチドに結合しつる抗体を選別しうるちのを 選別することが必要である。このような選別は好ましくは、特定の／−イブリド ーマ細胞のそれぞれから分泌されたモノクローナル抗体の存在下に、ペプチド（ または毒液）の試料を培養し、そして昆虫を麻痺させる毒液の能力を中和または 減衰させる抗体を分泌しうるノヅブリドーマを確認する、ことによって達成され る。このようなハイブリドーマ細胞が確認されたならば、それはペプチド特異性 モノクローナル抗体を生成させるために画業技術に知られる方法によってクロー ン増殖させることができる。

抗体親和クロマトグラフを使用して昆虫選択性の毒、（天然または組換え体）を 精製するために、殺虫有効ペプチドに結合しうる抗体を使用することが必要であ る。一般に、このような抗体はモノクローナル抗体である。ペプチド特異性抗体 がひとたびえられたならば、それは固体支持体に結合させることによって不動化 し、そして天然毒液または他の資源からのペプチドを、画業技術に周知の方法に より免疫親和クロマトグラフを使用して、精製することかできる。

このような方法は高度の精製を仲介することができ、それによって天然夾雑物を 実質的に含まないペプチドを生成させることができる。

ここに使用するペプチドとは、それが天然に又は通常は付随する（たとえば他の タンパク、脂質、炭水化物などの）［天然の夾雑物を実質的に含まない」ペプチ ドのことをいう。

抗体も組換え発現系（ＥＬＴＳＡまたはＷｅｓｔｅｒｎ）に生産されるタンパク の検出；畑または実験室の、永続性の水準などの発現タンパクの定量；および他 のクモ毒液（関連した又は関連のない属のクモ毒液）または他の毒液源からの関 連構造／官能性をもつ他の分子の検出、に使用することもできる。

実施例 次の実施例は本発明の範囲内の特別な組成物および方法を示すものであるが、そ れらは本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。

材料および方法 実施例ニー膜性 クモを電気刺激して毒液を放出させ、次いで放出毒液を吸引して集め、米国特許 第４，９２５，６６４号に記載されているようにヘモリンパによる毒液の汚染を 防ぐ、ことによってクモ毒液を集めた。

毒の精製：粗毒液（−８０°Ｃで貯蔵）を解凍し、十分に混合してからクロマト グラフ処理前に出発溶媒中にとかした。粗毒液を、ベックマン・システム・ゴー ルド　１２６溶媒分配器および１６８ホトジオデアレイ検出器モジユールを組み 込んだ高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて分別した。次のカラムお よび条件を精製に使用した。半調整反転相クロマトグラフをＶｙｄａｃ３００を 用いて行った。０，１％　ＴＦＡｌｏ、］％　ＴＦＡのＣＨ，ＣＮ／Ｉ（２０の １．１の５０分線状勾配を用いて３．５ｍｌ／分の流速でアンゲストロームＣ１ １カラム（２５ｃｍＸ　１０ｍｍ　（内径）、５μｍの粒径）を溶離した。勾配 は試料の注入から５分後に始まった。

分析反転クロマトグラフを０．１％　ＴＦＡｌｏ、１％　ＴＦＡの１．１の５０ 分線状勾配を用いるＶｙｄａｃ　Ｃ＋１（２５ｃｍＸ４．６ｍｍ（内径）、５μ ｍの粒径）により行った。これは他に特別の記載のない限り以下の実施例におい ても同じである。流速は１．　０ｍｌ／分てあり、勾配は試料の注入から５分後 に始まった。反転相カラムを２２０１ｍにおいてモニタして留分をジルソン・モ デル２０３フラクシヨン・コレクターを用いて集めた。反転相クロマトグラフを 分留後に凍結乾燥して一２０°Ｃで貯蔵した。カチオン交換クロマトグラフを、 ５０ｍＭ酢酸すトリウム、ｐＨ４，０からＩＭＮａｃｌ　（５０ｍＭ　酢酸ナト リウム、ｐＨ４，０）への７５分線状勾配で溶離するＨＥＭＡ−ＩＥＣバイオＳ Ｂカラム（１５ｃｍｘ４゜６ｍｍ内径、１０μｍの粒径）を用いて行った。勾配 は試料の注入から５分後に始まり、溶離は１ｍｌ／分であった。溶離を２８００ ｍにおいてモニタし、留分をジルソン・モデル２０３フラクシヨン・コレクター に集めた。フラクションを分析して、下記のとおり鱗翅類幼虫のいくつかの種に 注入して殺虫活性をめた。

実施例１　テジエナリア・アグレステイス全毒液からの殺虫性ペプチドの初期フ ラクションと確認 上記の方法のようにして得たテジェナリア・アグレステイス全毒液の５μｍを０ ．１％　ＴＦＡ　（水性）の９５μｌで稀釈し、上記の方法のようにＶｙｄａｃ 　ＲＰ　Ｃａｔ分析カラム上の反転相ＨＰＬＣによって分留した。２２０ｎｍに おいて溶液をモニタすることによって各フラクションを集めた。毒液の第２の５ μｍ部分も同じ条件で集め、２つのクロマトグラフからのフラクションを集めて 凍結乾燥した。

凍結乾燥フラクションを５０μｍのホスフェート緩衝食塩水、ｐＨ６，５（ＰＢ Ｓ）にとかし、タバコ毛虫（ＴＢＷ；ヘリオジス・ウィルセンス）への注入によ って殺虫活性を試験した。それぞれのフラクションについて３匹のＴＢＷ幼虫に ６μＩ　（１，２ｗｖｅ）の試験溶液を注入した。対照標準群には等用量の食塩 水を注入した。

フラクション７および８のみが殺虫活性をもっていた（表１１図５）。

実施例２：テジエナリア・アグレステイスのフラクション８の更なる精製 テジエナリア・アグレステイスのフラクション８からの主要殺虫剤成分を、カチ オン交換カラム上の１つの追加クロマトグラフによって精製し、次いで反転相ク ロマトグラフによって主要成分の脱塩を行った。

ＴＢＷ試験（２５μｍ容量中に約５ｗｖｅ）の後にフラクション８に残る物質を ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，０で５００μｍに稀釈した。これを前記の方 法で述べたようにＨＥＭＡ−ＩＥＣＢＩＯＳＢカラム上でクロマトグラフ処理し た。留出液を２８０ｎｍにおいてモニタし、殺虫成分を４１分で溶離した。この フラグジョンを前記の方法で述べたように分析Ｖ　ｙ　ｄ　ａ　ｃ　Ｃ１ｍカラ ム上のクロマトグラフ処理によって脱塩した。精製された毒ＮＦＳ−３２６を３ ０．５分のリテンション・タイムをもつ単一ピークとして溶離した。

実施例３．テジエナリア・アグレステイス全毒液１００μｌの分留 テジエナリア・アグレステイス全毒液１００μｌを実施例１および２で与えたの と同様の条件下で分留して約３００μｇの毒ＮＦＳ−３２６を得た。具体的にい えば、５０μｍのテジエナリア・アグレステイス粗毒液を０．１％　ＴＦＡ　（ 水性）の９５０μｌに稀釈し、前記の方法のように溶離するＶｙｄａｃ半調整カ 半調上カラム上た。流出液を２２０　ｎｍでモニタし、殺虫性フラクションを集 めた。フラクション７は３５．４〜３７．１分の間で溶離したが、フラクション ８は３７．１〜３８．３分の間で溶離した。第２の５０μｌの毒液も同様に分留 し、２つのクロマトグラフからの留分と同様に集めて凍結乾燥した。

フラクション８の更なる精製を、ＨＥＭＡｉＥＣＢＩＯＳＢカラム上での、０． ２ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４゜０にとかした凍結物質のクロマトグ ラフ処理によって行った。カラムを前記の方法で述べたように溶離し、流出液を ２８０ｎｍにおいてモニタした。殺虫性成分を４６分で溶離し、前記の方法で述 べたようにＶｙｄａｃ　Ｃ＋＋分析カラム上での反転相クロマトグラフによって 脱塩した。精製された毒ＮＦＳ−３２６は３２分で溶離した。

凍結乾燥後に、３１０ｎｇの毒を得た。

天然のペプチド及び還元しアルキル化（ビリジエチル化）したペプチドの両者の Ｎ−末端配列分析は、ＮＦＳ−３２６の始めの３０個のアミノ酸を与えた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動はＮＦＳ−３２６の６−８ＫＤの見掛は分子量 を与えた。実際の質量はマス・スペクトルにより５６７８．５５±０．３７Ｄで あることかわかった。

実施例４．テジェナリア・アグレステイスからの小さい殺虫性成分であるフラク ション７の精製。

２つの小さい成分、ＮＦＳ−３３１およびＮＦＳ−３７３を、全毒液の反転相ク ロマトグラフからの１５０ｗｖｅのフラクションのカチオン交換クロマトグラフ によってえた（実施例３から１００ｗｖｅおよび類似のクロマトグラフから５０ ｗｖｅのフラクション７）。３種のものからの凍結粉末の５０μｌのクロマトグ ラフを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，０の２００μｌ中で混合し、前記の方 法のように溶離するＩ（ＨＭＡ−ＩＥＣＢＩＯＳＢカラム上で分留した。流出液 を２８０ｎｍにおいてモニタし、殺虫性成分を３７分で溶離した。Ｖｙｄａｃ分 析Ｃ１１カラム上で脱塩した。このカラムは次の勾配をもつ０．　１％　ＴＦＡ 　（水性）（溶媒Ａ）およびＣＨ２ＣＮ中０．　１％　ＴＦＡ　（溶媒Ｂ）で溶 離した。３分でＯ％Ｂ、３分以上で０〜１５％Ｂ１８０％以上で１５〜３５％Ｂ 、ＮＦＳ−３３１は２９分で溶離するが、活性の小さいＮＦＳ−３７３は３２分 で溶離する。活性の大きいフラクションは約３０μｇのＮＦＳ−３３１を与えた 。凍結後に回収したＮＦＳ−３７３の量は（クロマトグラフのピーク区域の積分 から）１０ｎｇと推定された。

両者の天然ペプチドのＮ−末端配列分析はＮＦＳ−３３１について第１の３１個 のアミノ酸およびＮＦＳ−３７３について第１の２０個のアミノ酸を与えた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動は、ＮＦＳ−３３１およびＮＦＳ−３７３の両 者について６〜８ＫＤの見掛は分子量を与えた。マススペクトルによって示され た質量（を予噴射イオン化：カナダ国ケベック州のバイオテクノロジー・リサー チ・インステイテユー］・によって提供されたデータ）は、ＮＦＳ−３３１につ いて５７００゜３９±０．２９Ｄ、およびＮＦＳ−３７３について５６４３．０ ９±０．４１Ｄであった。

表Ｉ ＴＢＷにおけるテジエナリア　アグレスチス逆層りロマトグラフィー分画の活性 。全ての分画は１．２ｗｖｅ／幼虫で試験された。

分画番号　２４時間ＴＢＷ麻痺　４８時間ＴＢＷ麻痺７　２／４影響された　４ ／４麻痺した８　２／４　”　〃４／４　”　〃 ＋０　３／４Ｆｉ　Ｏ／４ Ｆｉ＝食物摂取阻害（ｆｅｅｄｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）実施例５ クモ（ｓｐｉｄｅｒ）を集めそしてナチュラル　プロダクト　サイエンス社（Ｎ ａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｉｎｃ、）でテジェナリア　アグレスチス（Ｔｅｇｅｎａｒｉａａｇｒｅｓｔｉ ｓ）として同定された。麻酔をかけたクモから毒液線（Ｖｅｎｏｍ　ｇｌａｎｄ ｓ）を引き出し、液体窒素中で急速に凍結させた。コムクチンスキー及びサクチ （ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１６２．ｐ１５６ ．１９８７）のプロトコールを使用してＲＮＡを毒液線から抽出した。

ＮＦＳ−３２６について得られたアミノ酸配列の残基１〜１１に相当するオリゴ ヌクレオチドを図１に示す。この図は高い同義性の位置でのクモコドン採択物及 びデオキシイノシン残基の両者を用いて示された。Ｘｈｏｌ制限部位をプライマ ーの５°領域に組み入れた。第−鎖ｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーはＮｏ ｔＩ制限酵素部位に隣接する１５デオキシチミジレート残基のランから構成され た。全てのプライマーはユタ大学のノ１ワード　ヒユーズ　メディカル　インス ティチュート契約施設で合成された。

毒液線ＲＮＡの調製から、メツセンジャーＲＮＡがネズミ白血病ウィルス転写酵 素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＤ） によりｃＤＮＡに逆転写された。２０ｎ１反応混合物は、産生者により提供され る酵素緩衝液、ＲＮＡの５００ｎｇ、ＲＮＡ分解酵素（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　ｍ ａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の２単位、ｄ　（Ｔ）　Ｎ 。

ｔＩプライマーの３５ｎ、ｇ、各デオキシヌクレオシドトリホスフェートのＩｍ Ｍ、及び逆転写酵素の１００単位を含をした。反応混合物を３７°Ｃで１時間イ ンキュベートし、モして４２°Ｃで１０分間続けてインキュベートした。反応混 合物をエタノールで沈澱させ、２０μｌの水で再懸濁した。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのプライマー直接酵素増幅はザエキ他（ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７，１９８８）（ｐａｔｅｎｔ　４，６８３，２ ０２）により最初に記載された。我々の方法に適用するために、１０μｌの毒液 腺ｃＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐＴＭＤＮＡ増幅キット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ。

Ｎｏｒｗａ　Ｉ　ｋ、ＣＴ）に含有された試薬を含むポリメラーゼ連鎖反応で鋳 型として使用した。増幅反応は２μＭ濃度のセンス及びアンチセンスプライマー 、ＩｏｏｕＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート、及び４単位の耐熱性 組換え体Ｔａｑポリメラーゼを含有した。反応をパーキン　エルマー　セタス（ Ｎｏ　ｒｗａ　］　ｋ。

ＣＴ）により作製されたプログラム可能な熱遮断中で実施した。温度サイクルパ ラメーターは９５°Ｃで２分間の変性、３７℃で２分間のブライマーアニーリン グ、及び７２°Ｃで１分間の酵素による伸長を包含した。このサイクルを二層繰 り返し、そして次いでプログラムを５４°Ｃの高温度アニーリングを組み入れる 同じ方法に切り換えた。このサイクルを３５回繰り返した。

アンカーＰＣＲ（Ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲ）生成物をＧｅｎｅｃｌｅａｎ”キ ット（Ｂｉｏ　１０１．Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）で提供されているグラスミルク樹脂 を用いて３％ＮｕＳｉｅｖｅ／１％５ｅａＫｅｎ複合アガロースゲル（ＦＭＣ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）から精製した。次いて挿入物を制限酵素Ｎｏｔｌ及び Ｘｈｏｌ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｎ）で二重に消化させた。

ベクター、ｐＫＳ　（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ、Ｌａｊｏｌｌａ、ＣＡ）、を同じ二 つの酵素で二重に消化し、直接クローニングに特異的な部位を発生させた。ベク ター及び挿入物を１５％ＰＥＣ；　（ｐｏ　］　ｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃ ｏｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ　ＬｏｕｉｓＭＯ）の存在下で結合させ、受容能力をも つエッセリキアコリ菌株ＤＨ５ａＦ’　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 、Ｉｎｃ、。

Ｇａ　ｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で形質転換させ、そしてアンピシリン（ ５０℃ｇ／ｍｆ）及びＩＰＴＧ　（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｔｈｉＯ−β−ｇａｌ ａｃｔｏｓｉｄｅ）及びＸ−ｇａｌ　（５−ｂｒ。

ｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ）を指示薬として含む、ＬＢプレート［ｌＯｇ／ｆｌ−リブトン（Ｄｉｆｃｏ） ］、５ｇ／Ｉ！イースト抽出物（Ｄ　ｉ　ｆ　ｃＯ）、ｌＯｇ／Ｉ！ＮａｃＬ及 び１５ｇ／ｉｌ’アガー（ＢＢＬ）］上で平板培養した。組換え体プラスミドを 含有する細菌コロニーはこれらのコロニーがβ−ガラクトシダーゼを合成し且つ 指示版上でブルーを変える能力がないことにより同定された。これらをＬＢ媒質 補足アンピシリン中で培養し、そしてプラスミドをＣｓＣ１勾配によって精製し た。精製プラスミドを商業的に入手可能なエクスターナルプライマー及びシーク ナーゼ　バージョン（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖａｒｓｉｏｎ）（登録商標）２． ０試薬及び酵素（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ） を用いて配列させた。

これらのｃＤＮＡ分子の上流配列に到達するために、ｃＤＮＡ配列をコードする 三つの毒素の均質領域に対応するインターナルオリゴヌクレオチドを二本１１ｃ ＤＮＡのアンチセンスストランドに対応して合成した。このオリゴヌクレオチド は配列番号ＮＯ１２、ＮＦＳ−３２６のｃＤＮＡ、の核酸残基７６〜９７に対応 する。一本鎮毒液腺ｃＤＮＡの１０マイクロリツターを酵素、末端デオキシヌク レオチドトランスフェラーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）、を用いてデオキシグアノシン残基によってその３゛末端に 尾部を付けた。１４℃Ｍの酵素及び５００μＭのｄＧＴＰを含有する２０μｌの 反応物を１５分間３７°Ｃで保温した。そのサンプルをエタノール沈澱させ、２ ０μＩ！Ｈ＊ｏに再懸濁させた。

インターナルブライマーのＤＮＡ配列上流を下流／混合毒素ｃＤＮＡ配列に使用 した技術と類似するアンカーＰＲＣ技術を使用して増幅させた。増幅反応物は２ μＭａ度のセンス、（ａｄ（Ｃ）尾部プライマー）、及びアンチセンスプライマ ー、１００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート、及び４単位の耐熱 性組換え体Ｔａｑ！ポリメラーゼを含有した。温度の輪郭は９４°Ｃで２分、３ ７°Ｃで２分、３７°Ｃて１分であった。このサイクルを二重繰り返し、そして 次いでそのプログラムを第二工程で５４°Ｃの高温度アニーリングを組入れる同 一の輪郭に切り換えた。

アンカーＰＲＣは臭化エチジュムの存在下４％アガロースゲル上に示されるよう に２３０ｂｐで断片（フラグメント）を生じた。反応生成物はイー・コリＤＮＡ ポリメラーゼＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｏｕｅｃｅｓ、Ｍ ａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）の大きい（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いることにより末端に 満たし、そしてエタノールの添加により沈澱させた。生成物を再懸濁し、制限酵 素５ａｌｌで消化させた。消化させた断片を酵素Ｔ４キナーゼによって１ｍＭＡ ＴＰの存在下でキナーゼ化し、次いで５ａｌｌ及びＥｃｏＲＶ消化ｐＫＳベクタ ーに連結させた。組換え体を二本鎖ＤＮＡ配列にさせることによりスクリーニン グした。ＮＦＳ−３２６、ＮＦＳ−３３１及びＮＦＳ−３７３をコードするｃＤ ＮＡの上流配列をこの方法で得た。ＮＦＳ−３２６、ＮＦＳ−３３１及びＮＦＳ −３７３に対する完全なりＮＡ配列を図２．３及び４の各々に示した。

ＮＦＳ−３２６をコードするそのＤＮＡ配列をファーマシアＬＫＢバイオチクノ ロシイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手した原核発現ベクターｐＧＥＸ −３Ｘ（Ｓｍｉｔｈ、ＤＢ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８３．８７０３　（１９８６））のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイ ト中でクローン化した。このベクターを次いでＥ、ｃｏｌｉ細胞系Ｗ３１１０（ ＡＴＣＣ２７３２５）中で形質転換させ、５０℃ｇ／ｍｆアンピシリンを含有す るＬＢプレート上で平板培養を行った。シード培養物を３７°Ｃで培養し、その 後に新鮮な媒質中で１０倍に希釈し、引き続き５９５μｍでの吸光度が０．　５ になるまで培養した。次いでこの培養を０．５ｍＭＩＰＴＧで誘発し、そして３ 時間培養した。

溶解性融合蛋白をグルタチオン交差結合ビーズ状アガロース（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ 、Ｌｏｕｉｓ）も用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。発現し た蛋白質の収量はほぼ５　ｍ　ｇ　／　ｆであった。精製融合上をウェスタンブ ロッティング又はＥＬＩＳＡアッセイを使用する発現テジエナリア毒素の検出に 有用なポリクロナール抗体を産生ずるために使用した。

表１１ 配列番号２即ちＮＦＳ−３２６によりコードされた蛋白アミノ酸組成物とｐＡｄ ａ１７によってコードされたＮＦＳ−３２６の蛋白特性。もし全てのシスティン 残基がジスルフィド結合に含まれるとそしてＣ−末端がアミド化されると仮定す るならば、計算される分子量は５，６７８．８５ダルトンに調節されるべきであ る。これらの変更は計算された分子量を６４．０８ダルトンだけ減少させる。

未処理　処　理 計算された分子量＝５７４２．９３　５．６７８．８５算出されたｐｌ＝　４． ９７６　５．４１アミノ酸組成物 非−極性　魚　パーセント Ａｌａ　６　１１．７６ Ｖａｌ　３　５．８８ Ｌｅｕ　０　０．００ １ｉｅ　１　１．　９６ Ｐｒｏ　１　１．　９６ Ｍｅｔ　ｌ　１．９６ Ｐｈｅ　２　３．　９２ Ｔｒｐ　０　０．　００ 極性　魚　パーセント Ｇｌｙ　３　５．８８ Ｓｅｒ　ｌ　１．　９６ Ｔｈｒ　２　３．　９２ Ｃｙｓ　６　１１．７６ Ｔｙｒ　２　３．９２ Ａｓｎ　４　７．　８４ Ｇｌｎ　２　３．９２ 酸性　階　パーセント Ａｓｐ　３　５．　８８ Ｇｌｕ　６　１１．７６ 塩基性　隘　パーセント Ｌｙｓ　３　５．　８８ Ａｒｇ　３　５．８８ Ｈｉｓ　２　３．９２ 表ＩＩ＋ 配列番号８即ちＮＰ−３３１によってコードされた蛋白アミノ酸組成物及びｐＡ ｄａｌでコードされたＮＦＳ−３３１の蛋白特性。もし全てのシスティン残基が ジスルフィド結合に含まれると及びＣ−末端がアミド化されると仮定するならば 、計算される゛分子量は５，６９９．８６ドルトンに調節されるべきである。

未処理　処　理 計算された分子量＝５７６３．９３９　５，６９９．８６算出されたｐｌ＝　４ ．６７８　４．９６アミノ酸組成物 非−極性　Ｎα　パーセント ΔＩａ　６　１１．７６ Ｖａｌ　３　５．８８ Ｌｅｕ　０　０．　００ Ｈｅ　Ｉ　１．　９６ Ｐｒｏ　１　１．　９６ Ｍｅｔ　１　１．９６ Ｐｈｅ　２　３．　９２ Ｔｒｐ　０　０．　００ 極性　ｈ　パーセント ｃｒｙ　２　３．９２ Ｓｅｒ　ｌ　１．　９６ Ｔｈｒ　３　５．　８８ Ａｓｎ　５　９．　８０ Ｇｌｎ　２　３．９２ 酸性　Ｎα　パーセント ΔＳｐ　３　５．８８ Ｇｌｕ　６　１１．７６ 塩基性　Ｎα　パーセント Ｌｙｓ　３　５．　８８ Ａｒｇ　３　５．　８８ Ｈｉｓ　ｌ　１．９６ 人式 配列番号８即ちＮＰ−３３１によってコードされた蛋白アミノ酸組成物及びｐＡ ｄａ　Ｉ　２でコードされたＮＦＳ−３７３の蛋白特性。もし全てのシスティン 残基がジスルフィド結合（こ含まれると及びＣ−末端がアミド化されると仮定す るなら（よ、計算された分子量は５，６４２．８１ドルトンに調節されるべきで ある。

未処理　処　理 計算された分子量＝５７０６．８９０　５．６７８．８５算出されたｐｌ：＝　 ４．６７８　４．９６アミノ酸組成物 非−極性　魚　パーセント Ａｌａ　６　１１．７６ Ｖａｌ　３　５．７７ Ｌｅｕ　Ｏ０，００ Ｐｈｅ　２　３．８５ Ｔｒｐ　０　０．　００ 極性　胤　パーセント 酸性　Ｎα　パーセント 塩基性　Ｎｏ　パーセンＩ・ Ｈｉｓ　Ｉ　１．９２ 生物学的活性データ 試験された昆虫はタバコバドヮーム（ｔａｂａｃｃｏ　ｂｕｄｗｏｒｍ）、へり オジスビレスンス（Ｈｅｌ　１ｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（ＴＡＷ）； ビートアーミヮーム（ｂｅｅｔ　ａｒｍｙｗｏｒｍＬスボドプレラエクシグア（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）（ＢＡＷ）；ギヤベラルーパ（ｃａｂｂａ ｇｅ　１ｏｏｐｅｒ）、トリコブシアニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｌ）（ ＣＬ）の最後の中間形態の、研究所で培養された幼虫であった。全て三種は鱗し くＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目の夜蛾（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）科に含まれる。毒 液そのまま（全毒液）であろうと毒液分画であろうと全ての試料をろ過滅菌した 生理的食塩水、ｐ　Ｈ６，５に調製した。試料を第４番目の腹腔佳節の側方中線 またはその近くの皿体腔中（ｈｅｍｏｃｏｅｌ）に注射をすることにより投与し た二針は内部器官の損傷を避けるために皮相方式で挿入し、た。

全毒投与量は全毒液当１（ＷＶＥ）によって計算された。ＩＷＶＥは抜き取られ た全部の毒液の１マイクロリツター中に通常存在する全ての物質の量である。早 い分画からの成分の投与量をまたＷＶＥに換算して計算した。

テジエナリアアダレスティスからの全毒液をＴＢＷおよびＢへＷｉ：：０．３Ｗ ＶＥ／幼虫（〜１．０ＷＶＥ／ｇｍ）の投与量で注射することにより試験した。

ＴＢＷにおいてわずかな効果が最初に認められたが、注射１６〜２４時間後に幼 虫は独特の痙彎性のまひを示した（次の項参照）。５匹の幼虫のうち４匹か結局 死んだ。ＢＡＷ幼虫の数匹は最初に弛緩性のまひを示したが、６０分以内に回復 した。しかしながら、２４時間以内に６匹のＢＡＷ幼虫の５匹がＴＢＷ幼虫で見 られたのと同じ痙彎性のまひを示していた。０．０３ＷＶＥ／幼虫の投与量はＴ ＢＷおよびＢＡＷに単に弱い可逆的作用を引き起こした。しかしながら、ＣＬ幼 虫では、０．０３ＷＶＥ／幼虫の投与量は試験された６匹の幼虫の２匹にたいし て致命的であった。

テジェナリア毒液及びそれから精製される毒素は作用した幼虫に独特のでたらめ なラセン様の抑制しがたい悶えを引き起こした。これらの痙彎は昆虫の死前の数 日の間持続した。毒素又は毒液の投与と視覚し得る徴候の発作との間にはある時 には２４時間以上のきわだった遅れがある。この遅れの長さは注射された毒素又 は毒液の量によって逆に変化する。投与後の最初の数分間でＢＡＷに認められる 可逆的な弛緩性のまひはアリールアミン毒の影響であると考えられる。数種の他 のアゲレニド（ａｇｅ　］　ｅｎ　ｉｄ）クモはそのような毒素を存することが 知られている。

注射によってＮＦＳ−３２６がＴＢＷ、ＢＡＷ及びＣＬ　（６匹／投！−ｉ量） において０．　５〜１．０ｎモル／ｇｍのＬ　Ｄ　ｓ。値を持った。

ＮＦＳ−３３１を単に初期分画をガイドする目的のためにＴＢＷで試験［７たか 、ＮＰＳ−３２６とほぼ同じ力価を持つことが認められた。ＢＡＷ及びＣＬにお ける投与一応答実験はＮＦＳ−３３１に対して０．５〜１．Ｏｎモル／ｇｍのＬ Ｄ、、を示した。ＮＦＳ−３２６及びＮＦＳ−３３１の両者は全テジェナリア毒 液（即ち遅延した襲来による痙彎性のまひ）の注射により引き起こされるものと 類似する徴候をＢＡＷおよびＴＢＷに引き起こした。しかしながら、ＣＬでは、 痙彎性のまひは注射後４〜６時間以内に現れ、そしてわずかに特殊な徴候にたい する方法を速やかに与えた。注射後はぼ２４時間後に、ＢＡＷ及びＴＢＷ幼虫が 特徴的なライティング行為を示していた時に、ＣＬ幼虫は単に敏しょうな表面的 な脅えを示していた。

哺乳動物の急性毒性試験はＮＦＳ−３２６及びＮＦＳ−３３１か昆虫に対する高 度の選択性を有することを指摘している。ＮＦＳ−３２６の３０μｇのオスのス イスウェブターマウス（〜３０　ｇｍ）の脳室（ｎ　＝　３　）または腹膜（ｎ ＝２）への注射は影響を何ももたなかった。

表Ｖ 配列番号　記載 Ｉ　ＮＰＳ３２６をコードする完全なｃＤＮＡ配列２　ＮＰＳ３２６の合成に関 する暗号ｃＤＮＡ配列３　ＮＰＳ３２６（成熟した毒素）のアミノ酸配列４　シ グナル／リーダー配列を持つＮＰＳ　３２６のアミノ酸配列 ５　シグナル／リーダー配列に関する暗号配列６　シグナル／リーダー配列のア ミノ酸配列７　ＮＰＳ３３１をコードする完全なｃＤＮＡ配列８　ＮＰＳ３３１ の暗号ｃＤＮＡ配列 ９　ＮＰＳ３３１（成熟した毒素）のアミノ酸配列１０　シグナル／リーダー配 列を持つＮＰＳ３３１のアミノ酸配列 １１　ＮＰＳ３７３をコードする完全なｃＤＮＡ配列１２　ＮＰＳ３７３の合成 に関する暗号ｃＤＮＡ配列１３　シグナル／リーダー配列を持つＮＰＳ　３７３ のアミノ酸配列 １４　ＮＰＳ３７３（成熟した毒素）のアミノ酸配列配列のリスト （１）一般情報 （ｉ）出願人：カレン　クラツク （ｉｉ）発明の名称二殺虫に有効なペプチド（ｉｉ）配列の数：１４ （ｉｖ）通信の宛先： （Ａ）宛先：ウッドコック　ウォッシュバーン　カーラ　マッキエウィツ　エン ド　フリユ （Ｂ）街：ワン　リバティ　ブレイス−４６階（Ｃ）市：フィラデルフィア （Ｄ）州：ペンシルバニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｖ）コンピュータ読み取り形体： （Ａ）メディアム型：　ＤＩＳＫＥＴＴＥ、　３．４［ＮＣＨ，１，４４Ｍｂ　 ５ＴＯＰＡＧＥ（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）オペレーション 　システム：　ＰＣ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　ＷＯＲＤＰＥＲＰＥＣＴ　 ５．０（ｖｉ）コンピュータ適用データ： （Ａ）適用番号：まだ指定されていない（Ｂ）提出データ：ここに添える （Ｃ）分類： （ｖｉ　）先願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：ジョン　ダブリュー　カルドウエル（Ｂ）登録番号：２８．９３７ （Ｃ）照会／荷札番号：ＦＭＣ−００５１（ｉｘ）通信情報・ （Ａ）電話：　（２１５）５６８−３］００（Ｂ）テレファックス：　（２１５ ）５６８−３４３９（２）配列番号ｌの情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さｌ３９４ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１ （２）配列番号２の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１５３ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、未知 （Ｘｌ）配列の記載、配列番号２ （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　５１ （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）ｊＪｌの数 （Ｄ）トポロジー　未知 （ｘｌ）配列の記載、配列番号３ Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ｌｌａ　ＣｙＳ　Ａｕｇ　Ａｌａ　Ａｕｇ　 Ｍｅｔ　Ｔｌｖ　＋ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅｌ　５　１０　１５ （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ−６８ （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・ （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｌ）配列の記載、配列番号４ ＭｅｔＬｙｓＬｓｕＧｌｎＬ＊ｕＭｅｔＩｔｓＣｙｓＬｅｕＶａｌＬａｕＬｅｕ ＰｒｏＣｙｓＰｈｓＰｈｉ−１５−Ｔｏ　・５ ＣｙｓＧｌｕＰｒｏＡｓｐＧｌｕｌｋ＋Ｃｙｓ＾「ζ≧＾ｌａＡＴＱＭｅｔＴｈ ｒＨｉｓＬｙｓＧ）ｕＰｈ＠Ｓ　ｌ０１５ Ａｓｎ　Ｔｙ＋　Ｌｙｓ　Ｓｅ「Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｃ ｙｓ　ＧｌｙＡｓｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｔ　Ａｌａ　ＡｌａＣｙｓＧｌｕ＾ｌａＧｌ ｕＣｙｓＰｈｅＡｕｇ＾５ｎＡｓｐＶａｌＴｙ＋Ｔｈ＋＾１ａＣｙｓＨｉｓＧｌ ｕ＾１ａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 父 （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ、５１ （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　未知 （ｘｉ）配列の記載：配列番号５ （２）配列番号６の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７ （Ｂ）型−アミノ酸 （Ｃ）鎖の数。

（Ｄ）トポロジー、未知 （ｘｌ）配列の記載　配列番号６ （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：３９８ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−木繊 （Ｄ）トポロジー　未知 （ｘｉ）配列の記載　配列番号７ Ｃη了ＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴｒＴＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＣＧＴＧｎＡＧＡ ＴＧＴＣＧ＾ＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧＴＣＡＣＴ　６０ＴＴＴＣＧＣＡＣＴＴＴ ＣＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＣＡ ＣＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣ３７０ＴＴＡＡＡｍＡ丁丁ＴＡＴｒＴＡｍＴｒＴｒ ｒＴｒ丁３９８（２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　１５３ （Ｂ）型、核酸 ＣＣ’）鎖の数、−木繊 （Ｄ）トポロジー　未知 （２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・５１ （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・ （Ｄ）トポロジー　未知 （２）配列番号ｌＯの情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、６８ （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数。

（Ｄ）トポロジー　未知 （ｘｉ）配列の記載、配列番号１０ （２）配列番号ＩＩの情報。

（ｉ）配列の特徴。

（△）長さ、２５２ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　未知 （×１）配列の記載、配列番号１１ 八′口′　２５２ （２）配列番号１２の情幹 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ：２０４ （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、未知 （ｘｌ）配列の記載：配列番号１２ ＡＣＧ　ＣＴＣＣＧＡ　ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＴｒＧ　ＣＴＡ　Ｃ ＡＡ　ＡＴＡ　ＴＧＴ　ＣＧＴ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　{　９２ Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＣｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｕｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｖ ａｌ　Ｔｙ＋　Ｔｈ＋＾ｌａ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ（２）配列番号１３の情 報。

（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　６８ （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数。

（Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１３ Ｍａｌ　Ｌｙｓ　ｌ−ｍｕ　Ｇｌｎ　Ｌ＠１１１４１　ＩＩ＠Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｈｓ　Ｐｈ＊ｓｓ　−ｔｏ　−５ （２）配列番号１４の情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：５１ （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）頑の数： （Ｄ）トポロジー　未知 （ｘｌ）配列の記載、配列番号！４ ＾Ｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈ＠Ａｕｇ　Ａｓｎ　Ａ ｓｐ　Ｖａｔ　Ｔｙ＋　Ｔｈ＋＾ｌａ　Ｃｙｓく ｎ ！：′Ｕ′：′　坏に只 く←Ｈ ｏｕｏ　ｕｏ■ Ｌ）Ｌ）１）　Ｈくの Ｕ■Ｆ−１４，Ｅ−１−＠ ■Ｑ４　（ＪｔＤ工 Ｈ＜仁　ＵＯ仁 ≦にに　ε更 ＦＩＧ、５ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年７月２２日

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）長さが約５Ｉのアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とする殺虫に有効なペプチドおよび農業的に又は園芸的に許容され得る その塩。
2. ２．ペプチドがテジェナリア（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ）層のクモ由来のものである 請求項１記載のペプチド。
3. ３．クモの種がテジェナリアアグレスチス（ａｇｒｅｓｔｉｓ）である請求項２ 記載のペプチド。
4. ４．配列番号３に定義されている配列を持つ請求項１記載のペプチド。
5. ５．配列番号９に定義されている配列を持つ請求項１記載のペプチド。
6. ６．配列番号１４に定義されている配列を持つ請求項１記載のペプチド。
7. ７．配列番号６に定義されているシグナル配列をさらに特徴とする請求項１記載 のペプチド。
8. ８．配列番号４に定義されている配列を持つ請求項７記載のペプチド。
9. ９．配列番号１０に定義されている配列を持つ請求項７記載のペプチド。
10. １０．配列番号１３に定義されている配列を持つ請求項７記載のペプチド。
11. １１．配列番号６に定義されているアミノ酸配列を持つシグナル配列。
12. １２．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とする殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列 。
13. １３．ペプチドの起源がクモテジェナリアである請求項１２記載のＤＮＡ配列。
14. １４．ペプチドの起源がクモテジェナリアアグレスチスである請求項１３記載の ＤＮＡ配列。
15. １５．ペプチドが配列番号２に定義されている配列を持つ請求項１２記載のＤＮ Ａ配列。
16. １６．ペプチドが配列番号８に定義されている配列を持つ請求項１２記載のＤＮ Ａ配列。
17. １７．ペプチドが配列番号１２に定義されている配列を持つ請求項１２記載のＤ ＮＡ配列。
18. １８．ペプチドが配列番号６に定義されているシグナル配列をさらに特徴とする ＤＮＡ配列。
19. １９．ペプチドが配列番号１に定義されている配列を持つ請求項１８記載のＤＮ Ａ配列。
20. ２０．ペプチドが配列番号７に定義されている配列を持つ請求項１８記載のＤＮ Ａ配列。
21. ２１．ペプチドが配列番号１１に定義されている配列を持つ請求項１８記載のＤ ＮＡ配列。
22. ２２．配列番号６に定義されているシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を特徴 とするＤＮＡ配列。
23. ２３．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと れと； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列め相同 性を特徴とする殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、形質転換 細胞中で該暗号配列の発現を実施し得る、組換え体発現ベクター。
24. ２４．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とする殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ を植物または該植物の祖先の生殖細胞系に導入し、該ＤＮＡ配列の発現の形質を 性生殖又は無性生殖により該植物の継続世代を通して継承させる、形質転換植物 。
25. ２５．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とする、宿主細胞又は宿主昆虫細胞において殺虫に有効なペプチドをコ ードするＤＮＡ配列を発現し得る、組換え体バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖ ｉｒｕｓ）発現ベクター。
26. ２６．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とする殺虫に有効なペプチドを産生する方法であり、 （ａ）宿主細胞中で形質転換またはトランスフェクションされた組換え体発現ベ クターが該ペプチドをコードするＤＮＡ配列を持ち、該ベクターは形質転換され た細胞中で該暗号配列の発現を実施し得る、組換え体宿主細胞を培養し、 （ｂ）該組換え体宿主細胞培養から殺虫に有効なペプチドを採取することからな 殺虫に有効なペプチドを産生する方法。
27. ２７．請求項２６記載の方法によって産生される組換え体により産生されるペプ チド。
28. ２８．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相向 性を特徴とするペプチドの有効量を無脊椎害虫に接触させることからなる無脊椎 害虫を駆除する方法。
29. ２９．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の椙同 性を特徴とするペプチドの有効量を無脊椎害虫中で発現し得る組換え体バキュロ ウイルスを該無脊椎害虫に接触させることからなる無脊椎害虫を駆除する方法。
30. ３０．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とするペプチドの殺虫に有効な量および農業的に又は園芸的に許容し得 るその担体からなる殺虫用組成物。
31. ３１．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とするペプチドと実質的に免疫反応する抗体。
32. ３２．ａ）長さが約５１のアミノ酸； ｂ）６，２２，２５，３２，３６及び４５の位置に６システイン残基を持つこと ； ｃ）配列番号３に定義されているペプチドに関して８０パーセントの配列の相同 性を特徴とする殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列由来のＤＮＡプロ ーブ。
33. ３３．標識又は担体と結合された請求項１記載のペプチド。
34. ３４．標識又は担体と結合された請求項１２記載のＤＮＡ。