JPH09173066A - 殺虫に有効なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 テジェナリア（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ）クモ毒
液から単離し得る殺虫に有効なペプチドへの転写及び発
現を制御せしめる遺伝子、および該遺伝子を組み込んだ
発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換または
形質導入せしめられた形質転換体または形質導入体の取
得に関する。 【解決手段】 テジェナリアクモ毒液からのｍＲＮＡの
分離、分離したｍＲＮＡの同定、ｍＲＮＡからのｃＤＮ
Ａの合成、合成したｃＤＮＡのクローニングベクターへ
の挿入、組換えＤＮＡの構築、組換えＤＮＡの宿主細胞
への導入、形質転換細胞の検出及び選択、および形質転
換細胞からの殺虫に有効なペプチドの採取から構成され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は殺虫に有効なペプチ
ドに関する。更に詳しくは本発明はとりわけてテジェナ
リア（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ）クモ毒液から単離しうる殺
虫に有効なペプチド、このような殺虫に有効なペプチド
をコードするＤＮＡ、および無脊椎害虫の制御法に関す
る。

【０００２】近年、人々は合成殺虫剤の使用に伴う環境
上の危険及び哺乳動物の毒性に実際に気付き始めてき
た。その結果として、これらの殺虫剤の使用が迅速に低
下した。然しながら、有効な昆虫制御の必要性は変わっ
ていない。これが研究者を新規な昆虫制御法の開発へと
駆り立てている。

【０００３】

【従来の技術とその課題】最も広く使用されている微生
物殺虫薬はバクテリウム・バシラス・チュリンジイエン
シス（以後Ｂ．ｔ．と呼ぶ）から誘導される。この抗菌
剤は種々の食葉毛虫、ジャパニーズ・ビートルズ（甲
虫）および蚊を制御するのに使用されている。カラマタ
らの１９８９年１月１０日発行の米国特許第４，７９
７，２７９号明細書にはＢ．ｔ．クルスタキ・デルタ−
エンドトキシンをコードする遺伝子およびＢ．ｔ．テネ
ブリオニス・デルタ−エンドトキシンをコードする遺伝
子からなるハイブリッド・細菌細胞およびそれらの製法
が記載されている。Ｂ．ｔ．ハイブリッドはＢ．ｔ．ク
ルスタキ菌株に感染しやすい害虫に対して、ならびに
Ｂ．ｔ．テネブリオニス菌株に感染しやすい害虫に対し
て、活性である。一般に、これらのハイブリッドは殺虫
活性の水準という点で、または活性のスペクトルの点
で、あるいは両者の点で、親菌株の物理的混合物によっ
て観察されたものよりもすぐれた有用な殺虫性をもつ。
このような微生物を含む殺虫組成物を使用して昆虫を攻
撃することができる。それは殺虫有効量のハイブリッド
を昆虫に又はそれらの環境に適用することによって行わ
れる。

【０００４】バクテリウムＢ．ｔ．からの別の誘導体は
ジルロイ（Ｇｉｌｒｏｙ）およびウイルコックス（Ｗｉ
ｌｃｏｘ）らの欧州特許出願公開公報第０３２５４００
Ａ１号明細書に記載されている。この発明は鱗翅類昆虫
に対して毒性のあるハイブリッド毒性遺伝子に関する。
更に詳しくは、この発明はＢ．ｔ．バル・クルスタキＨ
Ｄ−７３毒性遺伝子の一分およびＢ．ｔ．バル・クルス
タキイ菌株ＨＤ−１からの毒性遺伝子の一分を含むハイ
ブリッド・デルタ−エンドトキシン遺伝子からなる。鱗
翅類昆虫に対する活性をもつタンパクをコードするハイ
ブリッド毒性遺伝子（ＤＮＡ）が記載されている。

【０００５】バクテリウムＢ．ｔ．はまたウイルコック
らの欧州特許出願公開公報第０３４０９４８号明細書に
もその殺虫性のために利用されている。この発明はハイ
ブリッド毒素に関し、この毒素はＢ．ｔ．遺伝子の昆虫
腸上皮細胞認識領域をジフテリア毒性Ｂ鎖に融合して鱗
翅類昆虫に対して活性なハイブリッドＢ．ｔ．毒物を産
生することによって製造される。ハイブリッドＢ．ｔ．
遺伝子は植物に挿入されるか又はバキュロウイルスにク
ローンして回収可能な毒素を産生し得るということが示
唆されている。あるいはまた、ハイブリッドＢ．ｔ．遺
伝子を含む宿主を殺虫剤として使用して、標的となる昆
虫の環境に直接使用することもできる。

【０００６】殺虫性化合物の研究において、サソリ毒が
殺虫性を与える化合物の可能な資源として確認された。
さそりレイラス・クインクエストリアタス（ｓｃｏｒｐ
ｉｏｎ Ｌｅｉｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕ
ｓ）の毒液から単離された２種の殺虫選択性毒物がズロ
トキン（Ｚｌｏｔｋｉｎ）らの“Ａｎ Ｅｘｃｉｔａｔ
ｏｒｙ ａｎｄ ａ Ｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ Ｉｎｓｅ
ｃｔ Ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｖｅ
ｎｏｍ ｂｏｔｈ Ａｆｆｅｃｔｅｄ Ｓｏｄｉｕｍ
Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｒｓ ａ
ＣｏｍｍｏｎＢｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ” Ａｒｃｈ
Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２
４０：８７７−８７（１９８５）によって明らかにされ
た。それらの化学的および薬理学的性質に関連する研究
において、そのうちの１つの毒物がハエの幼虫の早い刺
激収縮麻痺を誘発し、そして他の一つが遅い抑制弛緩性
麻痺を誘発することがわかった。両者はいずれもナトリ
ウム・コンダクタンスに影響を及ぼした。

【０００７】ズロトキンらの１９９０年６月１９日発行
のカナダ特許第２，００５，６５８号明細書にはスコー
ピオン（さそり）レイラス クインクエストリアタス
ヘブラエアウス・ブチナエ（ｈｅｂｒａｅｏｕｓ ｂｕ
ｔｈｉｎａｅ）、ブチダエ（Ｂｕｔｈｉｄａｅ）から誘
導された殺虫に有効なタンパクが記載されている。この
発明では、毒液は凍結乾燥され、複数の留分に分離され
る。幼虫に対して最高の毒性をもち、マウスに対して最
低の毒性をもつ留分を更なる精製に付し、そして最終生
成物が“ＬｑｈＰ３５”と呼ばれるものである。

【０００８】殺虫性をもつ種々の組成物に関する研究お
よび開発に対応して、研究者は殺虫性遺伝子を産生し、
これらを保護すべき目標物に導入する方法を研究し、開
発した。１９８９年１１月７日発行のスミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）らの米国特許第
４，８７９，２３６号明細書はバキュロウイルス・プロ
モータと組合せた選択された遺伝子をバキュロウイルス
・ゲノムに導入して、昆虫細胞中で選択された遺伝子を
発現しうる組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築
する方法に関するものである。この方法はポリヘドリン
・プロモータを含む、ポリヘドリン遺伝子またはそのタ
ンパクを含むＤＮＡ断片を作るためにバキュロウイルス
ＤＮＡの開裂を包含する。組換え伝達ベクターを作製す
るために、ＤＮＡ断片をクローニング・ビヒクルに挿入
し、次いで選択遺伝子をこの変性クローニング・ビヒク
ルに挿入してそれがポリヘドリン・プロモータの制御の
もとにあるようにする。組換え伝達ベクターを次いで昆
虫細胞中でバキュロウイルスＤＮＡと接触させてバキュ
ロウイルス・ゲノム中への選択遺伝子の組換えと取り込
みを行う。バキュロウイルス・オートグラファ・カルホ
ルニア（ＡｃＭＮＰＶ）およびその関連ポリヘドリン・
プロモータは非常に高い水準の選択遺伝子の発現を可能
にするウイルス発現ベクターを昆虫宿主細胞中に生産す
るのに有用であることがわかった。

【０００９】発明者は、特定の昆虫に対して又は昆虫の
スペクトルに対して毒性のあるタンパクを生ずる遺伝子
を選択することにより、そしてその遺伝子をＡｃＭＮＰ
Ｖ発現ベクター中でクローニングすることによって、こ
の発現ベクターが昆虫を制御するための系に使用し得る
ことを示唆している。彼等はこのベクターが保護される
べき植物または動物に適用しうることも示唆している。
組換えウイルスは昆虫によって摂取されて後腸壁の細胞
に浸入しうる。

【００１０】殺虫性遺伝子を産生し、これらを保護すべ
き標的に導入する更なる方法はカットラー（Ｃｕｔｌｅ
ｒ）の“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｅｉｎｇ
Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｃ
ｒｏｐｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓｗｉｔｈ Ｍｏｄｅｌ Ｃｏ
ｒｐ Ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ”，ＡＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｎｅｗｓ ｖｏｌ．７（５）：３＆１７（１９９０）に
記載されている。この文献はＤＮＡが発芽花粉中に直接
にエレクトロポレートされうること及びこの花粉は花に
戻って種を作り、次いでこれが形質転換植物に成長しう
ることを教示している。この方法はタバコに都合が良
く、またトウモロコシおよびアルファアルファにも都合
が良い。この方法は究極の目的が花を受粉させ、植物の
再生よりもむしろ“花を利用する”ことであるので原形
質体のエレクトロポレーションよりも容易でありうる。
この方法は花粉を集め、これを花粉管が花粉粒の放出を
始めるように３０〜６０分間発芽培地中で発芽させ、花
粉を含む液体懸濁液に所望のＤＮＡを加え、電気ショッ
クを与えて花粉管の細孔を開かせ、過剰のＤＮＡを洗浄
して除き、そして変化した花粉を植物の柱頭（ステイグ
マ）下におき、そして種が生成するまで待つ、ことから
なる。これは作物植物に遺伝子を移転させるのに容易な
方法でありうる。

【００１１】さらな伝達系はバーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）
およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｓ）の１９８９年８月２
９日発行の米国特許第４，８６１，５９５号明細書に記
載されている。この発明は動物及びヒトへのタンパク化
合物の供給系としての処理された実質的に自然のままの
微生物細胞の用途に関する。微生物細胞は始めに相同遺
伝子を介して細胞内にタンパクを産生する。タンパク産
生微生物を化学的または物理的手段によって処理する
が、細胞は実質的に自然のままである。この処理法の操
作は細胞内化合物の活性の目立った損失なしに非増殖処
理微生物細胞を生じる。細胞は複製ではなく、そして安
定な細胞壁をもつので、この細胞壁は次いで動物または
ヒトの消化系の所望の場所で破壊されることができ、従
ってこの発明によってカプセル化された生成物のタイミ
ング化された又は標的化された放出を可能にする。好適
な処理後に、タンパク生成微生物それ自体は生成化合物
の精製を必要とせずに供給系として使用される。微生物
手段によって産生されうる、殺虫剤を含む、すべてのタ
ンパク、ポリペプチド、アミノ酸、または化合物はこの
発明の出発物質でありうる。

【００１２】サソリ毒液に見出される神経毒をコードす
る合成遺伝子をＤＮＡ技術を使用して組み入れることの
可能性はカーボネル（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ）らの“Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏ
ｒ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒ
ｐｉｏｎ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｔｔｅｍ
ｐｔｓ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｕｓｉｎｇ ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ”，ｇｅｎｅ ７
３：４０９−１８（１９８８）に説明されている。この
文献はＤＮＡ技術を使用して、サソリ、バサス・ユーピ
アス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）のサソリ毒液に見
出される神経毒をコードする合成遺伝子をバキュロウイ
ルス・ゲノムに組み入れてバキュロウイルス殺虫剤を改
良することの可能性を教示している。ポリヘドロン・プ
ロモータ基材ＡｃＭＮＰＶ発現系を使用して毒性産生を
行う３種の発現法が研究された。３６コドン遺伝子単独
の発現は毒素の少量産生を与えた。いくつかの成功は毒
素へのシグナルペプチドの付着により見出された。かな
りの水準のタンパクは、毒素遺伝子がポリヘドロンのＮ
−末端に融合したときに産生された。然しながら、産生
はポリヘドロンそれ自体について観察されたものよりも
１０〜２０倍も少なかった。発現の限界は転写の水準に
あるとは信じられなかったが、翻訳およびタンパク安定
性を含めて後−転写水準にあると信ぜられた。毒素の麻
痺活性は検出されなかった。

【００１３】研究者はまたクモ（ｓｐｉｄｅｒｓ）の毒
液から抽出した毒素を単離することもできた。ジャクソ
ン（Ｊａｃｋｓｏｎ）およびパークス（Ｐａｒｋｓ）の
１９９０年５月１５日発行の米国特許第４，９２５，６
６４号明細書にはアジェレノプシス・アペルタ（Ａｇｅ
ｌｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｅｒｔａ）およびホロレナ・ク
ルタ（Ｈｏｌｏｌｅｎａ ｃｕｒｔａ）のクモ（ｓｐｉ
ｄｅｒｓ）から誘導された毒素を適用することによって
心臓および神経学的疾患を治療する方法が記載されてい
る。この毒素はまた昆虫および関連害虫に対しても使用
しうる特定のカルシウム・チャンネルまたは興奮アミノ
酸受容体遮断剤としても有効である。

【００１４】単離されたクモ毒液からの毒素の性質に関
する別の研究は、クモ（ファンネル−ウエブ スパイダ
ー）の毒液から単離した低分子量因子のカルシウム・チ
ャンネルに対する可逆的結合の能力を明らかにした。Ｗ
Ｏ８９／０７６０８（発明者チェルスキイら、１９８９
年８月２４日発行）には、これらの活性な低分子量因子
が十分な特異性および親和性をもってカルシウム・チャ
ンネルに可逆的に結合し、ニューロン中のカルシウム・
コンダクタンスをなくし、カルシウム・チャンネル構造
物の単離と精製を可能にすることが記載されている。こ
れらの毒液は哺乳動物に対して毒性があることが見出さ
れた。

【００１５】クモ毒物の他の応用はジャクソンおよびパ
ークスの“Ｓｐｉｄｅｒ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｒｅｃｅｎｔ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ”，Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １
２：４０５−１４（１９８９）に記載されている。この
文献は種々の毒物には毒性の非常に大きな不均一性が存
在していることを教示している。それは実験がカルシウ
ム・チャンネルの種特異性の性質を示唆したことおよび
クモ毒液がカルシウム・チャンネル拮抗剤を提供しうる
ことを認めている。論じられたクモ毒液は脊椎動物に影
響することが見出される。この文献はまたクモ毒液を農
業用途の昆虫特異性毒物の可能な資源として認めてい
る。

【００１６】アダムス（Ａｄａｍｓ）らの“Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｒ
ｏｍｔｈｅ Ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｎｅｌ
Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ，Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ Ａ
ｐｅｒｔａ”ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ，１９８６，Ｂｏｒｋｏｖｅｃ ａｎｄ Ｇｅｌｍａ
ｎ ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅ
ｒｓｅｙ，１９８６には、昆虫のシナスプス伝達に拮抗
する多重ペプチド毒物がクモＡｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ
ａｐｅｒｔａから単離されたことが教示されている。

【００１７】キョートらの１９８９年８月９日発行の米
国特許第４，８５５，４０５号明細書には女郎グモ毒液
腺から得た受容体阻止剤およびその製造法が記載されて
いる。この化合物は昆虫が液体または固体に担持された
化合物に接触するとき殺虫効果をもつ。

【００１８】ナカジマらの１９９０年４月１７日発行の
米国特許第４，９１８，１０７号明細書にはグルタメー
ト受容体抑止剤活性をもつ化合物、その製造法、および
それを含む殺虫剤組成物が記載されている。この化合物
は分散剤を加えた液体または固体担体に担持され、保護
すべき植物または動物に直接に適用される。低い調剤量
が殺虫剤として有効であり、哺乳動物および魚に対して
非常に低い毒性しかもたず、環境に対して悪影響が少な
い。

【００１９】従って、効力の弱い若干の合成殺虫剤に伴
う問題の組合せにより、無脊椎動物の新規な制御手段の
開発の必要性が依然として存在する。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、たとえ
ばテジェナリア（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ）属のクモから誘
導される新規な殺虫に有効ペプチドが提供される。この
ペプチドはａ）長さ約５１個のアミノ酸、ｂ）位置６、
２２、２５、３２、３６および４５の６個のシステイン
残基、ｃ）配列番号３で定義されるペプチドについて８
０％の配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇ
ｙ）を含むペプチド、ならびにそれらの農業的もしくは
園芸的に許容しうる塩である。本発明は更にここに定義
するような実質的に類似のペプチドおよびシグナルリー
ダー配列を提供する。

【００２１】更に本発明によれば、本発明の殺虫に有効
なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む新規なＤＮＡ
配列が提供される。更に本発明によれば、ベクターが形
質転換細胞に該暗号配列の発現を行いうる、本発明の殺
虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換
え発現ベクターが提供される。

【００２２】更に本発明によれば、本発明の殺虫に有効
なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む新規な形質転
換（トランスジェニック）植物が提供される。該ＤＮＡ
は植物又は植物の祖先の生殖細胞系列に導入されて、Ｄ
ＮＡ配列の発現の形質が有性伝播または無性伝播により
植物の次の世代に受け継がれる。

【００２３】更に本発明によれば、本発明の殺虫に有効
なペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現しうる新規な
組換えバキュロウイルス発現ベクターが提供される。

【００２４】更に本発明によれば、本発明の殺虫に有効
なペプチドを製造する新規な方法が提供され、その方法
は（ａ）ベクターが形質転換細胞中で暗号配列の発現を
行いうる宿主細胞中で形質転換またはトランスフェクシ
ョンされた組換え発現ベクターがペプチドをコードする
ＤＮＡ配列をもつ組換え宿主細胞を培養し、そして
（ｂ）組換え宿主細胞の培養物から殺虫に有効なペプチ
ドを回収する、ことからなる。

【００２５】更に本発明によれば、配列番号６に定義さ
れているアミノ酸配列を持つシグナル配列が提供され
る。

【００２６】更に本発明によれば、ペプチドが配列番号
６に定義されているシグナル配列をさらに特徴とするＤ
ＮＡ配列が提供される。

【００２７】更に本発明によれば、有効量の本発明のペ
プチドを害虫と接触させることからなる非脊椎害虫を制
御する新規な方法が提供される。

【００２８】更に本発明によれば、殺虫有効量の本発明
のペプチドを害虫中に発現しうる組換えバキュロウイル
スを害虫と接触させることからなる非脊椎害虫の新規な
制御法が提供される。

【００２９】更に本発明によれば、殺虫有効量の本発明
のペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しうる
塩を農業的または園芸的に許容しうる担体中に含む新規
な殺虫組成物が提供される。

【００３０】更に本発明によれば本発明のペプチドに実
質的に免疫反応性のある新規な抗体が提供される。

【００３１】更に本発明によれば、本発明の殺虫に有効
なペプチドをコードするＤＮＡ配列から誘導される新規
なＤＮＡプローブが提供される。

【００３２】図１はＮＰＳ−３２６のプライマーのデザ
インである。

【００３３】図２はテジェナリア・アグレステイス（Ｔ
ｅｇｅｎａｒｉａ ａｇｒｅｓｔｉｓ）のクモからのＮ
ＰＳ−３２６をコードするｍＲＮＡ配列に対応する完全
なＤＮＡ配列である。成熟した毒素から開裂されるシグ
ナル配列にはアンダーラインがしてある。箱で囲んだ領
域は関連毒素のファミリーのあいだの翻訳配列の可変性
の位置を示す。

【００３４】図３はテジェナリア・アグレステイスのク
モからのＮＰＳ−３３１をコードするｍＲＮＡ配列に対
応する完全ＤＮＡ配列である。成熟した毒素から開裂さ
れるシグナル配列にはアンダーラインがしてある。箱で
囲んだ領域は関連毒素のファミリーのあいだの翻訳配列
の可変性の位置を示す。

【００３５】図４はテジェナリア・アグレステイスのク
モからのＮＰＳ−３７３をコードするｍＲＮＡ配列に対
応する完全ＤＮＡ配列である。成熟した毒素から開裂さ
れるシグナル配列にはアンダーラインがしてある。箱で
囲んだ領域は関連毒素のファミリーのあいだのトランス
レート配列の可変性の位置を示す。

【００３６】図５は０．１％ ＴＦＡ（水性）対０．１
％ ＴＦＡ（ＣＨ₃ ＣＮ／Ｈ₂ Ｏ，１：１）の線状勾配
で溶離されたＶｙｄａｃ Ｃ₁₈逆相カラム上のテジェナ
リア・アグレステイス全毒液のフラクションのクロマト
グラムである。

【００３７】Ａ．定義 ここに使用する「発現ベクター」はそこに含まれたＤＮ
Ａ配列を発現しうる。そしてこのような配列がその発現
を行いうる他の配列に操作可能に結合されるベクターを
包含する。必ずしもはっきりと述べていないけれども、
これらの発現ベクターは宿主有機体中でエピソームとし
て又は染色体ＤＮＡの一体的な一分として複製可能でな
ければないことがそれとなく述べられている。明らかに
複製能力の欠如はそれらを効果的に操作不能にする。要
約して「発現ベクター」は機能的定義として与えられ、
ここで取り扱われる特定化されたＤＮＡ暗号の発現を行
いうるすべてのＤＮＡ配列はそれが特定化された配列に
利用されるという点でこの用語に含まれる。一般に、組
換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは多く
の場合「プラスミド」の形態であり、これは環状２重ら
せんＤＮＡと呼ばれ、このものはそれらのベクターの形
態において染色体に結合しない。「プラスミド」と「ベ
クター」は互換的に使用される。プラスミドは最もふつ
うに使用されるベクターの形態だからである。然しなが
ら、本発明は均等な機能を果たし、後に当該技術におい
て知られるようになったそのような他の形態の発現ベク
ターをも含めることを意図している。

【００３８】「組換え宿主細胞」とは組換えＤＮＡ技術
を使用して構築されたベクターで形質転換を受けた細胞
のことをいう。

【００３９】テジェナリア属（ｇｅｎｕｓ Ｔｅｇｅｎ
ａｒｉａ）のクモはジョウゴグモ（ファンネル・ウエブ
・スパイダー）として一般に知られているアジェレニダ
エ（Ａｇｅｌｅｎｉｄａｅ）科の一員である。テジェナ
リアは数多く且つ広範囲に分布している属であり、多く
の種はヒトと密接に関連して生息している。テイー・ア
グレテイス（Ｔ．ａｇｒｅｓｔｉｓ）を含むテジェナリ
アのほとんどのアメリカ合衆国の種は他の国から偶然も
ちこまれたと考えられる（Ｇｅｎｔｓｃｈ，Ｗｉｌｌｉ
ｓ Ｊ．１９７９． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｐｉｄｅｒ
ｓ．ＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ）。テジェナリア・アグレステイスは代表
的なジョウゴグモであり、高い草の中に又は壁の割れ
目、木材パイルなどにその巣を作っている。現在ではそ
の分布はオレゴン、ワシントン、およびアイダホの一部
に限られている（Ｒｏｔｈ，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｄ．１９
６８． Ｔｈｅ Ｓｐｉｄｅｒ Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｇｅ
ｎａｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｈｅｍｉ
ｓｐｈｅｒｅ（Ａｇｅｌｅｎｉｄａｅ）。Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｍｕｓｅｕｍ Ｎｏｖｉｔａｔｅｓ ２３２３：
１−３３）。然しユタのような近傍の州にも偶発的にも
ちこまれた徴候がある。テイー・アグレステイスはいく
つかの深刻なヒトの環境に巻き込まれている（Ｖｅｓ
ｔ，Ｄａｒｗｉｎ Ｋ．１９８７．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ
ａｒａｃｈｎｉｄｉｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｔｈｗ
ｅｓｔ Ｕｎｉｔｅｌ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ｐｒｏｂａｂｌｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ
Ｔｅｇｅｎａｒｉａ ａｇｒｅｓｔｉｓ（Ｗａｌｃｋ
ｅｎａｅｒ）ｓｐｉｄｅｒｓ−Ｔｏｘｉｃｏｎ２５
（２）：１７８−１８４）。然しながら入手しうるデー
タのすべては（大部分はＮＰＳインターナル・リサーチ
から誘導された）、この毒液の殺虫成分が哺乳動物の毒
性に応答するものとは区別されることを示している。

【００４０】本発明の殺虫に有効なペプチドの作用機構
は知られていない。これらの毒素はヘリオジス（Ｈｅｌ
ｉｏｔｈｉｓ）、スポドプテラ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ）、およびトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉ
ａ）の幼虫に対して症候の独特の傾向を生ぜしめる。毒
素もしくは毒液の投与と神経学的徴候の十分な展開との
間には著しい遅れ、ときとして２４時間以上の遅れがあ
る。テジェナリア毒液およびそれから精製した毒素は、
４８時間もしくはそれ以上の「連続的もだえ」を特徴と
する明瞭な「けいれん性マヒ」を生ぜしめる。これらの
症候は“Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔ
ｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”に更に十分に記載されてい
る。

【００４１】Ｂ．テジェナリア毒液からのペプチドの単
離 ペプチドの１つの資源はテジェナリア毒液である。クモ
毒液は頭胸部からの毒液腺抽出等の周知の任意の方法に
よってテジェナリアから除去することができる。然しな
がら、クモ毒液およびその単離した毒素の中に不純物が
残るのを避けるために、クモ毒液は、クモの電気刺激に
よって毒液を放出させ、次いで放出毒液を集めて、米国
特許第４，９２５，６６４号明細書に記載されているよ
うに吐出しもしくは血液リンパによって毒液の汚染を防
ぐようにして得るのが好ましい。

【００４２】電気ミルキング技術によってクモ毒液を得
ると同時に、それを高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）および種々の分離様式たとえばゲル濾過、イオ
ン交換、および逆相クロマトグラフィーを使用してその
ペプチド（毒素）成分に分けることができる。

【００４３】従って、クモの電気的ミルキング化技術
を、逆相およびカチオン交換カラムを使用する高性能液
体クロマトグラフィーと組合せて使用して、実質的に純
粋なクモ毒素を得ることができる。然しながら、他の均
等な技術も本発明の範囲内で使用してクモ毒素を分離し
うることも理解されるであろう。このように単離した毒
素を分析して殺虫活性を求め、アミノ酸配列を当業者に
知られる方法によって決定することができる。

【００４４】単離したペプチド、不純フラクション、ま
たは全毒液は多数の方法たとえば注射、局所適用、また
は摂食によって殺虫活性について分析することができ
る。注射が好ましい方法である。それは毒液の自然の入
口ルートを模ほうし、調剤量の正確な決定を可能にし、
そして比較的少量の材料を消費しながら有用なデータを
生成することを可能にするからである。ヘリオジス（Ｈ
ｅｌｉｏｔｈｉｓ）のような１種以上の主要な害虫で試
料を試験することは、殺虫活性の活発で商業的に関連す
る評価を提供する。

【００４５】Ｃ．殺虫に有効なペプチド 本発明は、その１つの面において、殺虫に有効なペプチ
ドのファミリー、およびその殺虫に有効な断片（フラグ
メント）、およびその農業的または園芸的に許容しうる
塩を提供する。

【００４６】殺虫に有効なペプチド含有フラクションが
原料から単離され、ここに述べるように精製されたなら
ば、アミノ酸配列の決定は当業者に周知の方法たとえば
Ｎ−末端アミノ酸配列の決定および自動アミノ酸シーク
エンサーを使用して行うことができる。

【００４７】追加の殺虫に有効なタンパクが本発明の範
囲内にあると予期されるということはこの開示から理解
されるであろう。すなわち、このファミリーの他の殺虫
に有効なペプチドが存在し、上記３種の詳細に記述した
ものに加えてテジェナリアならびに他の源から単離しう
るものと信ぜられる。次のものは殺虫に有効なタンパク
のファミリーに関する。このファミリーの殺虫に有効な
ペプチドは次の特性を共有していると信ぜられる。

【００４８】１）大きさ：すべて約５５００〜６０００
ダルトンの間の範囲にあり、そして約５０個のアミノ酸
の長さをもつ、そして

【００４９】２）保存アミノ末端：ＮＰＳ−３２６、Ｎ
ＰＳ−３３１およびＮＰＳ−３７３は最初の１１個の残
基について同一であり、９０％より大きい全配列相同性
（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を共有し、そ
して

【００５０】３）すべてが同一のシステイン・パターン
をもち、同一のジサルファイド結合配置を恐らく最も確
実に共有し、５−〔Ｃｙｓ〕−−１５〔Ｃｙｓ〕−３
〔Ｃｙｓ〕−−７〔Ｃｙｓ〕−３−〔Ｃｙｓ〕−−８
〔Ｃｙｓ〕−−５そして

【００５１】４）ペプチドのすべては酸性であり；毒素
の等電点はすべて５．５より小さく、そして

【００５２】５）それらの単離ｃＤＮＡ配列のすべては
同一シグナルペプチドならびにしばしばアミノ基まで処
理されるカルボキシ末端グリシン残基をコードする、し
かしながらこれが活性に関連するか否かは未だ知られて
いない；そして

【００５３】６）すべては感染ＴＢＷに特徴ある応答を
誘発することが知られている。オオタバコガの幼虫（ｔ
ａｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）まはシロイチモンジョトウガの
幼虫（ｂｅａｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ ｅｘｉｑｕａ）のような昆虫に注射するとき、
これらの毒素は独特の症候を生ぜしめる。１つの明瞭な
点は毒性のおそい開示である。毒素または全毒液が１０
０％の死滅を究極的に生ぜしめる調剤量で用いられたと
きでさえ、症候は２４時間以上表れない。毒性の症候
は、ひとたび展開すれば、また独特である。毒性の初期
の徴候は大顎のくりかえされるくいしばりおよび脚と体
壁のふるえによって特徴づけられる活動亢進状態の期間
である。数時間にわたってこれは徐々に明瞭なケイレン
もしくはケイレン性マヒの過程を与え、幼虫が体部をラ
セン形に曲げる連続のケイレンによって特徴づけられ
る。これらのケイレンは中断なしに４８時間以上続く。
感染した昆虫は飢餓および脱水により明らかに死ぬ。こ
れはケイレンに伴う大きなエネルギー消費から推定され
る。これらの毒素で処理したイラクサキンウ（ｃａｂｂ
ａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎ
ｉ）の幼虫は短時間で同じ症候の繰り返しを受ける。ふ
るえの挙動は２４時間以内に目立たないマヒへ変わる。

【００５４】更に詳しくは、これらの殺虫に有効なペプ
チドおよびそれらをコードするｃＤＮＡ配列を単離し
て、ここに特徴づけた。第１に、ＮＰＳ−３２６が単離
され、逆相およびカチオン交換クロマトグラフィーによ
って均一になるまで精製された。それは質量分光分析に
よって決定して５６７８．５５ダルトン（＋／− ０．
３７ダルトン）の分子量をもつ。部分アミノ酸分析は、
ＮＰＳ−３２６をコードするｃＤＮＡ配列を入手するた
めに使用されるオリゴヌクレオチドの設計を可能にし
た。配列番号２に定義するように、単離されたｃＤＮＡ
によってコードされる５１個のアミノ酸ペプチドはカル
ボキシ末端グリシン残基で終わる。ペプチドのこの位置
でのグリシン残基はアミノ基に一般に処理される（Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３）。表II
は単離されたｃＤＮＡによってコードされるペプチドの
アミノ酸組成を示す。６個のコード化システイン残基の
Ｃ−末端アミド化およびジサルファイド結合が可能なら
ば、配列番号２によってコードされるペプチドの分子量
は６４．０８ダルトンだけ減少して５６７８．８５ダル
トンになる。これは精製されたＮＰＳ−３２６について
質量分光分析で決定したものに等しい。すなわち、クモ
毒液から単離した殺虫活性ＮＰＳ−３２６の処理した形
態は配列番号３で定義したように現れる。

【００５５】第２に、ＮＰＳ−３３１は逆相およびカチ
オン交換クロマトグラフィーによって均質性まで単離さ
れ精製された。それは質量分光分析によって決定して５
７００．３９（＋／− ０．２９ダルトン）の分子量を
もつ。ｃＤＮＡをＮＰＳ−３２６へのアミノ末端配列の
相同性によって単離した。ＮＰＳ−３３１をコードする
ｃＤＮＡは配列番号８に表わされる。表III はこのペプ
チドのアミノ酸組成を与える。ＮＰＳ−３２６によりシ
ステイン残基のＣ−末端アミド化およびジサルファイド
結合を仮定すると、配列番号８によりコードされるペプ
チドの計算されたＭＷは５，６９９．８６ダルトンであ
る。これはＮＰＳ−３３１について質量分光分析によっ
て決定したものと等しい。すなわち、クモ毒液から単離
した殺虫に活性なＮＰＳ−３３１の処理した型体は配列
番号９に定義したようにみえる。

【００５６】このファミリーの第３のメンバーはそのア
ミノ末端配列相同性によってＮＰＳ−３２６に単離され
た。それは逆相およびカチオン交換クロマトグラフィー
によって単離され精製された。ＮＰＳ−３７３をコード
にするｃＤＮＡ配列は配列番号１２に与えられており、
そのアミノ酸組成は表IVに示されている。ＮＰＳ−３２
６およびＮＰＳ−３３１のようにシステイン残基につい
てＣ−末端アミド化およびジサルファイド結合を仮定す
ると、配列番号１２をコードするペプチドの計算された
ＭＷは５，６４２．８１ダルトンである。これは質量分
光分析により決定したものに等しい。前駆体分子の翻訳
およびプロセシングは従ってクモ毒液から精製したもの
である配列番号１４に定義した殺虫活性ペプチドを生ず
る。

【００５７】また、本発明によれば、３種の成熟タンパ
クＮＰＳ−３２６、ＮＰＳ−３３１およびＮＰＳ−３７
３に先行する新規なシグナルもしくはリーダー配列が提
供される。このシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ
は配列番号５で与えられる。この独特のシグナル配列は
これらの標的、これらの製造もしくは合成、および恐ら
くは他の組換えタンパクのために使用することができ
る。シグナル配列は新しく合成されたタンパクの適正な
局在化を保証する点で重要な役割を演じる。一般に、こ
れらは「トポジェニックシグナル」を提供する（Ｂｌｏ
ｂｅｌ，Ｇ．“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｔｏｐｏｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：１４９６−１５００（１
９８０）。これらは細胞に対して内部の又は外部の種々
の目的に対して結合タンパク配列を標的にしている。こ
れはその標的部位が細胞外にある分泌タンパクにとって
特に重要である。それはまた、全細胞抽出物から細胞を
分解し精製するよりもむしろ細胞外媒質から発現タンパ
クを精製する方がより容易でありうるので、組換えタン
パクの産生にまた有用である。特定のペプチドに対し
て、シグナルペプチドはプロセシングが生ずる細胞内又
は細胞外の位置で毒素がＣ−末端アミド化され且つ折り
たたまれることを保証することにおいて有用であると推
測できる。このシグナル配列は他の高度に構造化された
ペプチド分子の発現およびプロセシングにも有用性をも
つことができると信ぜられる。

【００５８】一次アミノ酸配列の僅かな変異はここに例
示されたペプチドに比べて実質的に均等な又は増大した
活性をもつタンパクをもたらしうるということが理解さ
れる。これらの変異は固相合成を通しての部位制御によ
る突然変異誘発およびアミノ酸置換によるものと考える
こともできるし、または本発明のペプチドを産生する宿
主の突然変異による如き突発的なものと考えることもで
きる。これらの全ての変異は殺虫活性が保持される限り
包含される。タンパク中の「突然変異」はそれをコード
するＤＮＡのヌクレオチド配列の変化に基づき（ふつう
に起こる又は特にここに述べるタンパクに関して）その
一次構造を変える。これらの突然変異は、特に対立遺伝
子変異型を含む。突然変異は、欠失、付加または置換か
ら生ずるタンパクの一次構造の変化である。「欠失」と
は１個以上の内部アミノ酸残基が不在であるポリペプチ
ドのこととして定義される。「付加」とは野生型にくら
べて１個以上の追加の内部アミノ酸残基をもつポリペプ
チドとして定義される。置換は１個以上のアミノ酸残基
が他の基と置き変わることから生ずる。タンパクの「断
片（フラグメント）」は、このポリペプチドが関連する
タンパクの一次アミノ酸配列の一部と同じ一次アミノ酸
配列を含むペプチドである。

【００５９】好ましい「置換」は保存性のあるもの、す
なわち残基が同じ一般の型の別のものによって置換され
るものである。よく理解されているように、天然のアミ
ノ酸は酸性の、塩基性の、中性および極性の、又は中性
および非極性の及び／又は芳香族のものとして副分類で
きる。天然の型とは異なるペプチドは置換されるアミノ
酸と同じ基からのアミノ酸を含むのが一般に好ましい。

【００６０】すなわち、一般に塩基性アミノ酸Ｌｙｓ、
Ａｒｇ、およびＨｉｓは互換性があり、酸性アミノ酸で
あるアスパラギン酸およびグルタミン酸は互換性があ
り、中性極性アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ
およびＡｓｎは互換性があり、非極性脂肪酸Ｇｌｙ、Ａ
ｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕは相互に関して保存
性があり（然し大きさのためにＧｌｙおよびＡｌａはよ
り密接に関係がありそしてＶａｌ、Ｉｌｅ及びＬｅｕは
さらに密接に関係がある）、そして芳香族アミノ酸Ｐｈ
ｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは互換性がある。プロリンは
非極性中性アミノ酸であるけれども、それはコンホメー
ションのその効果のために困難さを示し、そしてプロリ
ンによる又はプロリンのための置換は好ましくない。た
だし同じ又は類似のコンホメーションの結果がえられる
場合はその限りではない。保存的変化を示す極性アミノ
酸としてＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎがあげられ、
より小さい程度にＭｅｔがあげられる。また、異なった
カテゴリーに分類されているけれども、Ａｌａ、Ｇｌ
ｙ、およびＳｅｒは互換性があるものと思われ、そして
Ｃｙｓはこのグループに付加的に適合するか、または極
性中性アミノ酸と共に分類されうる。

【００６１】Ｄ．ペプチドの製法 組換え発現 本発明によれば、本発明の殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターがさらに提
供される。このベクターは形質転換細胞中で暗号配列の
発現を行うことができる。また本発明によれば、宿主細
胞にペプチドを発現させる方法で本発明の殺虫に有効な
ペプチドをコードするＤＮＡ配列によって形質転換させ
た組換え宿主細胞が提供される。

【００６２】所望のタンパクをコードする好適なＤＮＡ
配列の提供は、今や当該技術に知られている組換え技術
を使用してタンパクの製造を行うことを可能にする。こ
の暗号配列は天然資源タンパクからｃＤＮＡまたはゲノ
ム配列を取出すことによってえられ、あるいはタンパク
のアミノ酸源から推定される合成ヌクレオチド配列を使
用して化学的に製造される。この暗号ＤＮＡが合成的に
製造されるとき、意図される宿主の周知のコドンを採択
することができるという利点がある。

【００６３】必要な制御配列たとえばプロモーター、お
よび好ましくはエンハンサー及び終止制御を含む発現機
構は容易に入手することができ、そして多種類の宿主に
ついて当該技術において知られている。たとえばＳａｍ
ｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス（１９８９）を
参照されたい。

【００６４】従って、所望のタンパクは原核生物および
真核生物の双方の系で製造することができ、そしてタン
パクの処理型のスペクトルをもたらす。

【００６５】最も普通に使用される原核生物はイー・コ
リイであるが、他の系たとえばビー・サブチリスおよび
シュードモナスも有用であると予期される。原核生物系
の好適な制御配列は構成プロモーターおよび誘導プロモ
ーターの両方を含み、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロ
モーター、ハイブリッド・プロモーターたとえばｔａｃ
プロモーター、ラムダ・ファージ Ｐ１プロモーターが
あげられる。一般に、異種タンパクが融合タンパクまた
は成熟タンパクのいずれかとしてこれらの宿主中で産生
されうる。所望の配列が成熟タンパクとして生産される
とき、産生された配列は、必ずしも効果的に除去されな
いメチオニンにより先行されることがある。従って、こ
こに要求されるペプチドおよびタンパクはバクテリア中
で産生されるときはＮ−末端Ｍｅｔにより先行され得
る。その上、構造はペプチドの暗号配列がタンパクの分
泌をもたらす作動シグナルによって先行される構成が作
製される。このようにして原核生物の宿主に産生される
とき、シグナル配列は分泌の際に除かれる。

【００６６】広範囲の種類の真核生物の宿主が組換え異
種タンパクの生産のために今や利用できる。バクテリア
における如く、真核生物の宿主は所望のタンパクを直接
に生産する発現機構で形質転換させることができるが、
よりふつうにはタンパクの分泌を行うためにシグナル配
列が提供される。真核生物系はそれらが高級有機体のタ
ンパクをコードするゲノム配列中に起こりうるイントロ
ンを処理しうるという追加の利点をもつ。真核生物系は
また、たとえば若干のアミノ酸残基のグリコシル化、カ
ルボキシ−末端アミド化、酸化または誘導体化、配座の
制御などをもたらす種々の処理機構を提供する。

【００６７】ふつうに使用される真核生物系として、イ
ースト、ファンガル細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ア
ビアン細胞、および高級植物細胞があげられる。このリ
ストはすべてではない。これらの宿主系のそれぞれにお
いて使用するのに適合し且つ操作可能な好適なプロモー
ターが利用し得ると同時に終止配列およびエンハンサー
たとえばバキュロウイルス・ポリヘドリン・プロモータ
ーが利用される。上記のように、プロモーターは構成性
または誘導性のいずれかでありうる。たとえば、哺乳動
物系において、ＭＴＩＩプロモーターは重金属イオンの
添加によって誘発されうる。

【００６８】所望の宿主に好適な発現機構の構成の特徴
は当業者に周知である。タンパクの組換え産生について
は、それをコードするＤＮＡはえらばれた発現ベクター
に好適に結合され、この系次いで適合する宿主中で形質
転換され、次いで形質転換宿主を外来遺伝子の発現が起
こる条件下で培養し保持する。このようにして生産され
た本発明の殺虫に有効なタンパクは培養物から、細胞を
分解することによって、又は当業者に周期の培地からの
分離コードによってその培養物から回収される。

【００６９】本発明のタンパクのための組換え材料が提
供されるので、これらのタンパクは組換え技術によっ
て、ならびに自動化アミノ酸合成器によって、製造する
ことができる。他の種々の宿主細胞によって与えられる
翻訳後の特性の変化の故に、天然産タンパクの種々の修
飾が得られる。「修飾」タンパクは、グリコシル化、ア
ミド化またはリピド化パターン、あるいはタンパクの１
次、２次または３次構造を変える翻訳後の事柄の結果と
して未修飾タンパクとは異なるが、もちろん本発明の範
囲内に含まれる。

【００７０】ここに述べるタンパクが合成的に作られる
場合、遺伝子によってコードされないアミノ酸による置
換もなしうるということも更に注目すべきである。別法
の残基の例として式Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＣＯＯＨのωア
ミノ酸（ｎは２〜６）もあげられる。これらは中性、非
極性のアミノ酸であり、たとえばザルコシン（Ｓａ
ｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）、ｔ−ブ
チルグリシン（ｔ−ＢｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルメソロイ
シン（Ｎ−Ｍｅｌｌｅ）、およびノルロイシン（Ｎｌｅ
ｕ）である。たとえばフェニルグリシンは芳香族中性ア
ミノ酸Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅの代わりになることがで
き、シトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシ
ド（ＭＳＯ）は極性であるが中性であり、シクロヘキシ
ルアラニン（Ｃｈａ）は中性で非極性であり、システイ
ン酸（Ｃｙａ）は酸性であり、そしてオルニチン（Ｏｒ
ｎ）は塩基性である。プロリン残基の立体配置一致性は
これらの１つ以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）によ
って置換された場合にえられる。

【００７１】Ｅ．本発明の殺虫に有効なペプチドの暗号
配列の確認 本発明の別の面において、本発明のペプチドをコードす
る実質的に単離されたＤＮＡ配列が提供される。

【００７２】部分アミノ酸配列データを使用して、資源
からのタンパクの製造のもとになる遺伝子を単離しそし
て確認することができる。ペプチドの産生のもとになる
遺伝子を得るために多くの方法が利用できる。例として
次の文献があげられる。フクワ・エス（Ｆｕｑｕａ，
Ｓ．）らの“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ
ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．
２（Ａｕｇｕｓｔ １９９０）；フローマン，エム・エ
イ（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）の“ＲＡＣＥ Ｒａｐ
ｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｃＤＮＡ ｅ
ｎｄｓ”，ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ． Ｉｎ
ｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（１９９０）；および
米国特許第４，７０３，００８号明細書の“ＤＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏ
ｐｏｉｅｔｉｎ”。この特許を参考文献としてここに組
み入れる。

【００７３】要約すれば、決定されたアミノ酸配列をコ
ードするまたは決定されたアミノ酸配列をコードするそ
のようなＤＮＡ分子に対する相補的ＤＮＡ鎖を表す、Ｄ
ＮＡ分子が合成される。この合成ＤＮＡ分子は、有機体
たとえばクモのゲノムＤＮＡ又はクモのような有機体の
細胞または組織から単離されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピ
ーから誘導されるＤＮＡ配列を部分的に含む組換えＤＮ
Ａ分子を含む細胞クローン中のＤＮＡ配列の相同性をプ
ローブするために使用できる。一般に相同ＤＮＡの特異
性の同定のためには１５個以上のヌクレオチドのＤＮＡ
分子が必要である。この数は配列中の少なくとも５個の
アミノ酸の特異性の同定を必要とする。それぞれのアミ
ノ酸は６個までの特異なトリヌクレオチドＤＮＡ配列ま
たはコドンをコードすることができるので決定されたア
ミノ酸配列をコードすることのできる異なったＤＮＡ分
子の数は非常に大きくなりうるということが理解される
であろう。それ故、すべての可能な合成ＤＮＡプローブ
を個々に試験することは実際的ではなく、若干のこのよ
うなＤＮＡ分子のプールが付随的にプローブとして使用
される。「変性（デジェネレート）」プローブと呼ばれ
るこのようなプールの産生は当該技術に周知である。プ
ローブ混合物中の唯一個のＤＮＡ分子は問題の遺伝子に
対して正確な配列の相同性をもつであろうけれども、高
度の相同性のみが必要とされるので、プール中の若干の
合成ＤＮＡ分子は該遺伝子を特異性に同定することがで
きるということがまた理解されるであろう。それ故、問
題の遺伝子の満足すべき単離はすべての可能なＤＮＡプ
ローブ配列を含まない合成ＤＮＡプローブ・プールを用
いて達成しうる。一般に、有機体によってまれに利用さ
れるコドンはプローブ・プール中に表わされる必要はな
い。事実、単一配列ＤＮＡプローブはそれぞれのアミノ
酸について有機体によって最も多く利用されるＤＮＡコ
ドンのみを含有させることによって製造されうる。然し
この試みは必ずしも常に成功するとは限らないことが理
解されるであろう。

【００７４】遺伝子配列を同定するための１つの技術は
複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用している。たとえば米国
特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６８
３，２０２号明細書を参照されたい。これらの米国特許
を引用によってここに組み入れる。実質的にＰＣＲは配
列の２つの末端部分が知られているときに、えらばれた
ＤＮＡ配列の生産を可能にする。問題の配列のそれぞれ
の末端に相当するプライマー、すなわちオリゴヌクレオ
チド・プローブがえられる。ＰＣＲを使用して、ＤＮＡ
配列の中心部分が次いで合成により産生される。

【００７５】独特のクモ毒液遺伝子をコードする遺伝子
を得るために、このようなＰＣＲを使用する１つの方法
において、ＲＮＡはクモから単離され、精製される。次
いでデオキシチミジレート末端オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして使用してクモｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転
写する。上記の変性プローブにおけるように、合成ＤＮ
Ａ分子または合成ＤＮＡ分子の混合物は、先に決定され
た毒液タンパクのアミノ末端アミノ酸配列をコードしう
るものとして製造される。このＤＮＡ混合物をデオキシ
チミジレート末端オリゴヌクレオチドと共に使用してＰ
ＣＲ反応を開始させる。ＰＣＲ反応を開始させるのに使
用する合成ＤＮＡ混合物は所望のｍＲＮＡ配列に対して
特異的であるので所望のｃＤＮＡのみが効果的に増幅さ
れる。合成生成物は多数の周知のクローニング・ベクタ
ーのいずれかに結合しうる増幅ｃＤＮＡを表す。それに
もかかわらず、ペプチドの「系列（ファミリー）」が類
似のアミノ酸配列をもつクモ毒液中に存在しうること、
およびこのような場合、混合オリゴヌクレオチド・プラ
イマー配列の使用はこれらの関係ペプチドをコードする
１つ以上の関連ｃＤＮＡの増幅をもたらすこと、が理解
されるであろう。関連ペプチドをコードする遺伝子も本
発明の範囲内にある。関連ペプチドも有用な殺虫活性を
もつからである。

【００７６】最後に、産生されたｃＤＮＡ配列は通常の
技術を使用して適当なベクター中にクローン化され、分
析されそしてヌクレオチド塩基配列が決定されることが
できる。殺虫に有効なタンパクをコードするＤＮＡは配
列のリストおよび表VIIIに示されている。これらのＰＣ
Ｒ生成物の直接のアミノ酸翻訳は、それらが成熟タンパ
クのための完全な暗号配列に対応することを示してい
る。プレカーサーおよび／またはプロペプチド領域に相
当するアミノ酸をコードし得るＤＮＡ配列の部分はこの
方法によってはえられないかも知れない。このような配
列はこの方法で製造されるｃＤＮＡをこの範囲に含まれ
るハイブリダイゼーションプローブとして使用するゲノ
ムまたはｃＤＮＡクローンの単離によって決定されう
る。

【００７７】Ｆ．交差ハイブリダイゼーション：関連化
合物のためのプローブとしてのＤＮＡ配列。 好適な大きさ、一般には２０〜１５０ヌクレオチドのＤ
ＮＡプローブは本発明のＤＮＡ配列から誘導することが
できる。このようなプローブは本発明の殺虫に有効なペ
プチドをコードするＤＮＡの存在を他の資源からの核酸
によるハイブリダイゼーションによって検出するために
使用することができる。シグナル配列、ｃＤＮＡの断
片、または全ｃＤＮＡさえコードするオリゴヌクレオチ
ド・プローブを用いる低い制御条件下でのスクリーニン
グは、ここに記載する毒素分子のファミリーに機能的相
同性を持つ他の活性ペプチドに到達することを可能にす
る。本発明のＤＮＡ配列から生じるヌクレオチド・プロ
ーブによる交差ハイブリダイゼーションに対する良好な
候補と思われる核酸の資源としては、同じ属であるが異
なった種のクモ、関連する属のクモ、および同じ属であ
るが異なった場所のクモがあげられるが、これらに限定
されない。

【００７８】Ｇ．殺虫剤としてのペプチドの適用 本発明の殺虫に有効なペプチドは、害虫を有効量の本発
明のペプチドと接触させることによって無脊椎害虫たと
えば鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）害虫を制御する
のに有用である。好都合には、昆虫は駆除することが好
ましい害虫である。無脊椎害虫をペプチドと接触させて
該害虫を制御する方法は知られている。例として合成的
にカプセル化した害虫の経口摂取用タンパクがあげられ
る。本発明のタンパクを発現する組換え宿主、たとえば
シュードモナス・フルオレスセンス、熱で死滅させ、そ
の後の経口摂取および制御のために植物または適当な基
質に施用することができる。

【００７９】もちろん、本発明のタンパクを使用する無
脊椎害虫の制御する方法は他の害虫制御法と組合せて使
用することもできる。たとえば、先に述べた形質転換植
物およびイー・コリを、制御すべき害虫の種類および存
在する他の重要な可変因子に応じて、他の無脊椎動物に
毒素を発現させるように処理することができる。本発明
のペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しうる
塩の殺虫に有効な量をその農業的または園芸的に許容し
うる担体中に含む殺虫用組成物も提供される。

【００８０】Ｈ．形質転換植物 更に本発明によれば、本発明の殺虫に有効なペプチドを
コードするＤＮＡ配列をそのＤＮＡ配列の発現が有性増
殖または無性増殖により植物の次世代に受け継がれるよ
うに、植物の生殖細胞系列に導入してなる形質転換植物
が提供される。本発明により殺虫に有効なペプチドをコ
ードする遺伝子は遺伝子工学技術によって植物に導入す
ることができる。この技術により植物細胞中のペプチド
の産生は昆虫害虫を制御する手段として有用であること
が期待される。それ故、天然種のものよりも昆虫耐性の
強い植物を作ることが可能である。

【００８１】植物を形質転換させるために使用しうる殺
虫に有効なペプチド遺伝子のコード領域は遺伝子の全長
または部分的に活性の長さでありうる。然しながら、ペ
プチドをコードする遺伝子配列を発現させ、生成した植
物細胞中で機能的ペプチドとして産生させることが必要
である。殺虫に有効なペプチドをコードするゲノムＤＮ
ＡおよびｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡの双方を使用して形
質転換することができる。更に、遺伝子はｃＤＮＡクロ
ーンから部分的に、ゲノム・クローンから部分的に、そ
して合成遺伝子から部分的に、ならびにそれらの種々の
組合せから構成させることができる。また、ペプチド遺
伝子をコードするＤＮＡは、その単離されたペプチド源
以外の種々の種からの部分を含むことができる。

【００８２】更に、殺虫に有効なペプチドは別の化合物
（単数または複数）と組み合わせることができ、キラメ
遺伝子を含みそしてこの化合物を発現する形質転換され
た植物中に予想外の殺虫特性を生ぜしめると信じられ
る。これらの他種化合物として、たとえば昆虫に対して
経口毒性をもつプロテアーゼ阻止剤またはバシラス・ツ
リンジエンシス由来のポリペプチドがあげられる。Ｂ．
ツリンジエンシス蛋白は昆虫の腸細胞膜のカリウム透過
性の変化を生ぜしめ、そして膜に小孔を発生させると考
えられる。他の孔形成性タンパクを殺虫に活性なペプチ
ドと組み合せて使用することもできる。このような孔形
成性タンパクの例はマガイニン、セクロピン、アタシ
ン、メイイチン、グラミシジンＳ、ナトリウム・チャン
ネル・タンパクおよび合成断片、スタフイロコッカス・
アウレウスのα−トキシン、アポリポ・タンパク、およ
びそれらの断片、アラメチシン、および種々の合成アン
フイパシック・タンパクである。細胞膜に結合してエン
ドサイト−シスを増強させるレクチンは別の種類のタン
パクであり、このタンパクは本発明の殺虫に有効なペプ
チドと組み合せて使用でき、植物を遺伝的に昆虫耐性に
変性させうる。

【００８３】ペプチド遺伝子のプロモータはキラメ遺伝
子配列を発現させるのに有用であると予期されるが、他
のプロモータも有用であると思われる。有用である有効
な植物プロモータは超産生性プロモータである。このペ
プチドの遺伝子配列と操作可能に結合しているこのプロ
モータは、形質転換植物が害虫に対して耐性を増大する
ように、ペプチドの発現を促進させることができるもの
である。本発明に有用であると予想される超産生性プロ
モータは周知である。

【００８４】プロモーターに操作可能に結合する殺虫に
有効なペプチド遺伝子を含むキメラ遺伝子配列は好適な
クローン用ベクターに結合され所望の植物を形質転換さ
せることができる。一般に、宿主細胞と適合しうるある
種から誘導される複製および制御配列を含むプラスミド
またはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用
される。クローンニングベクターは代表的には複製源を
持つと同時に形質転換された宿主細胞中に表現型選択マ
ーカー、代表的には抗生物質に対する耐性を提供しうる
特異的遺伝子を持つであろう。形質転換用ベクターは宿
主細胞中での形質転換後にこれらの表現型マーカーによ
って選択され得る。

【００８５】有用であると予期される宿主細胞として、
イー・コリ、サルモネラ・リフィムリウム（ｒｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ）およびセラチア・マルセスエンス（ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような細菌宿主を包含する原核生
物宿主、ならびにイーストまたはフィラメンタス・ファ
ンジのような真核生物宿主があげられる。

【００８６】クローニングベクターおよび該ベクターで
形質転換された宿主細胞は一般にベクターのコピー数を
増幅させるために使用される。増幅したコピー数を用い
て、ペプチド遺伝子を含むベクターは単離することがで
き、そしてたとえばここに記述した遺伝子配列を植物ま
たは他の宿主細胞に導入するために使用される。

【００８７】外来遺伝子を発現する植物の製造法は知ら
れている。たとえば、植物組織を、エイ ツメファシエ
ンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により植物、植物
組織または細胞の直接感染または共培養；外因性ＤＮＡ
のプロトプラスト（原形質体）への直接の遺伝子転移；
ＰＥＧの接種；顕微注射およびマイクロプロジェクタイ
ルのボンバードメント；によって形質転換させることが
できる。

【００８８】電気穿孔法（エレクトロポレーション）に
よるタバコの形質転換は、Ａｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ｎｅｗｓ，Ｖｏｌ．７，Ｐ．３および１７（９
月／１０月，１９８０年）に記載の技術により確立され
た。この技術において、植物プロトプラストは殺虫に有
効なペプチド遺伝子構造を含むプラスミドの存在下で電
気穿孔される。高いフィールド強度の電気インパルスは
生体膜を透過性にしてプラスミドの導入を可能にする。
電気穿孔された植物のプロトプラストは細胞壁を再構築
し、分化して植物カルスを生成する。発現した殺虫に有
効なペプチドを持つ形質転換植物細胞の選択は、上記の
表現型マーカーを使用して達成される。外因性ＤＮＡは
任意の形態で、たとえば裸の線状、環形または高次コイ
ル型のＤＮＡ、リポゾームに包まれたＤＮＡ、スフェロ
プラスト中のＤＮＡ、他の植物プロトプラスト中のＤＮ
Ａ、塩で複合化されたＤＮＡ及びその他の形態で、プロ
トプラストに加えることができる。

【００８９】アグロバクテリウムによって形質転換させ
うるすべての植物細胞、および形質転換細胞から再生さ
れた全植物のすべても、本発明により形質転換させて、
形質転換した殺虫に有効なペプチド遺伝子を含む形質転
換した全植物を産生することもできる。米の形質転換は
デイ・エム・ライネリ（Ｄ．Ｍ．Ｒａｉｎｅｒｉ）らの
“Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙ
ｚａ ｓｔａｖｉａ １）”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ３３−３８（１９８０年１月）
によって確立された。

【００９０】殺虫に有効なペプチド遺伝子を植物細胞に
導入する別の方法は、植物細胞を、殺虫に有効なペプチ
ド遺伝子で形質転換させたエイ・ツメファシエンスによ
り感染させることである。当該技術で知られる適当な条
件下に、形質転換植物細胞を生育させて発芽、根を作
り、更に形質転換植物に成長させることである。殺虫に
有効なペプチド遺伝子配列は適当な植物細胞に、たとえ
ばエイ・ツメファシエンスのＴｉプラスミドによって、
導入することができる。Ｔｉプラスミドはエイ・ツメフ
ァシエンスによる感染の際に植物細胞に伝達され、植物
ゲノムに安定して一体化される。

【００９１】Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の生産に不
可欠と思われる２つの領域を含む。これらのうちの１つ
は、トランスファーＤＮＡ（Ｔ ＤＮＡ）と呼ばれ、腫
瘍形成を誘発する。他の１つはウィルレント（ｖｉｒｕ
ｌｅｎｔ）領域と呼ばれ、腫瘍を形成に不可欠であるが
その維持には必須ではない。植物ゲノムに転移するＴＤ
ＮＡ領域は、その転移能力が影響されることなしに、酵
素の遺伝子配列の挿入によって大きさを増すことができ
る。腫瘍発生遺伝子を除去することによってそれらがも
はや干渉しないようにすることによって、改良Ｔｉプラ
スミドを本発明の遺伝子構造を適当な植物細胞に転移す
るためのベクターとして使用することがきる。

【００９２】遺伝子物質はまた植物細胞に転移すること
ができる。これは細胞によってとり込まれる遺伝子物質
と沈殿複合体を形成するポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）を使用することによって行われる。

【００９３】植物細胞へのＤＮＡの転移はまた、単離プ
ロトプラスト、培養細胞、および組織への注入および若
木および植物の分裂組織への注入によって達成させるこ
とができる。形質転換植物およびそれからの後代は当該
技術に知られる常法によってえられる。

【００９４】外来ＤＮＡ配列を植物細胞に導入する別の
方法は、粒子にＤＮＡを付着させ、これをシューティン
グ装置すなわち「遺伝子銃」によって植物細胞に押し込
めることからなる。すべての植物組織または植物器官を
この方法の標的として使用することができ、例として生
体内および試験管内の胚、先端組織および他の分裂組
織、蕾、体組織および生殖組織があげられるが、これら
に限定されない。形質転換細胞およびカルスは次の確立
された方法によって選択される。目的とする組織は体細
胞胚又は再生シュートを形成するために誘発し、当該技
術で知られる確立された方法により形質転換植物を与え
る。適当な方法は使用する植物の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）
に従ってえらばれる。形質転換トウモロコシ植物は、高
速マイクロプロジェクタイルを使用して遺伝子を胚形成
細胞へ転移動することによって製造された。文献“Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆｃｈｉｍｅｔｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐ
ｒｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｍａ
ｉｇｅ ｐｌａｎｔｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ８３３−８３８（１９９０年９
月）を参照されたい。

【００９５】再生された植物は、組み込まれた外来ＤＮ
Ａに対してはキラメでありうる。もし外来ＤＮＡを含む
細胞が小胞子または大胞子のいずれかに発達すると、合
成された外来ＤＮＡが生殖器官に伝達される。もし外来
ＤＮＡを含む細胞が植物の体細胞であるならば、キラメ
でない形質転換植物は芽または茎の切断から生体内でま
たは試験管内で当該技術で知られる次の確立された方法
で、栄養（無性）増殖の通常の方法によって産生され
る。このような方法は使用する植物種に応じてえらばれ
る。

【００９６】植物細胞または植物の形質転換後に、ペプ
チドが発現されるように形質転換されたこれらの植物細
胞または植物は適当な表現型マーカーによって選択され
る。これらの表現型マーカーとして抗生物質耐性体があ
げられるが、これに限定はされない。他の表現型マーカ
ーも当該技術に知られており、本発明に使用することが
できる。

【００９７】種々の異なった形質転換系により、すべて
の植物タイプを原則としてそれらが本発明の殺虫に有効
なペプチドを発現するように形質転換させることができ
る。

【００９８】実際にすべての植物が培養細胞または組織
から再生されることを示す証拠は増大している。これら
の例としてすべての主要な穀物、作物種、さとうきび、
てんさい、綿、果実およびその他の樹木、マメ類および
野菜があげられるが、これらに限定されない。これらの
植物のすべてがアグロバクテリウムによって形質転換し
うるか否かについての知識は現在のところ限られてい
る。アグロバクテリウムのための天然植物宿主である種
は試験管内で形質転換しうる単子葉（モノコチレドナ
ス）植物、特に穀類および草はアグロバクテリウムに対
して天然宿主ではない。これらをアグロバクテリウムを
使用して形質転換させる試みは最近まで成功しなかっ
た。ある種の単子葉植物をアグロバクテリウムによって
形質転換させうるという証拠が今や増加しつつある。今
や入手可能になった新規の実験方法を使用して、穀物お
よび草類の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）も形質転換させること
ができる。

【００９９】アグロバクテリウムによって形質転換され
うるさらなる植物の属として、イポモエア（Ｉｐｏｍｏ
ｅａ）、パシフロラ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、シクラ
メン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ）、マラス（Ｍａｌｕｓ）、プ
ルナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ローザ（Ｒｏｓａ）、ルバス
（Ｒｕｂｕｓ）、ポプラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、サンタ
リオン（Ｓａｎｔａｌｉｏｎ）、アリウム（Ａｌｉｕ
ｍ）、リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、ナシサス（Ｎａｃｉ
ｓｓｕｓ）、アナナス（Ａｎａｎａｓ）、アラチス（Ａ
ｒａｃｈｉｓ）、ファゼオラス（Ｐｌａｓｅｏｌｕ
ｓ）、およびピサム（Ｐｉｓｕｍ）があげられる。

【０１００】再生は植物の種から種へと変化するが、一
般に殺虫に有効なペプチド遺伝子の多重コピーを含む形
質転換プロトプラストの懸濁液がまず最初に提供され
る。次いで胚形成がプロトプラスト懸濁液から天然の胚
のような成熱と発芽の段階にまで誘発される。培地は一
般に種々のアミノ酸とホルモンを含む。シュートとルー
ト（根）はふつう同時に発生する。効率的な再生は培地
に、遺伝子型および培養の由来に依存する。これら３つ
の可変因子が制御されるならば、再生は十分に再現性が
あり、反復可能である。

【０１０１】形質転換植物細胞から成長した成熟植物は
自己増殖して同系繁殖物を生じうる。この同系繁殖物は
殺虫に有効なペプチドの遺伝子を含む種子を産生する。
これらの種子は植物に成長して殺虫に有効なペプチドを
発現する。同系繁殖を使用して昆虫耐性ハイブリッドを
開発させることができる。この方法において、昆虫の同
系繁殖系は別の同形繁殖系と交雑させてハイブリッドを
作る。

【０１０２】二倍体植物において、典型的には、一方の
親を殺虫に有効なペプチド（毒素）遺伝子配列によって
形質転換させることができ、他方の親は野生種である。
この親を交配させた後、第１世代のハイブリッド
（Ｆ₁ ）は 1/2毒素／野生種： 1/2毒素／野生種の分布
を示す。これらの第１世代のハイブリッド（Ｆ₁ ）は自
己増殖して第２世代のハイブリッド（Ｆ₂ ）を産生す
る。Ｆ₂ ハイブリッドの遺伝子分布は 1/4毒素／毒素：
1/2毒素／野生種： 1/4野生種／野生種である。毒素／
毒素の遺伝子を作るＦ₂ ハイブリッドは昆虫耐性植物と
してえらばれる。

【０１０３】ここで使用する変異体は安定で且つ遺伝性
であり、そして植物の子孫に有性的に伝達される遺伝性
変異を包含する表現型変化を記述する。ただし変異体は
依然として本発明の殺虫に有効なペプチドを発現する。
また、ここに使用するように突然変異体（ミュータン
ト）は、放射線のような環境条件の結果としての、又は
よく確立された遺伝の法則により形質が減数分裂的に伝
達される遺伝的変異の結果としての変化を記述する。然
しながら、突然変異体植物は依然として本発明のペプチ
ドを発現するものでなければならない。

【０１０４】一般に、形質転換植物中で発現されるよう
に選択される理想的な殺虫に有効なタンパクは標的とし
ない昆虫および脊椎動物に対する安全性によって特徴づ
けられるものである。発現系は発現水準が殺虫効力を与
えるように選択される。従って、このような農業的に重
要な形質転換植物を得るこの技術的容易性が、環境に責
任のある方法で作物への昆虫による損害を減少させるた
めの安全な害虫管理法に使用する付加的武器を農民に提
供するものと思われる。

【０１０５】Ｉ．遺伝子工業による殺虫性微生物 殺虫に有効なペプチドは単独で又は別の昆虫毒素との組
合せにより、バキュロウイルスおよびハイブリッド・バ
クテリアのような微生物の毒性を活性化もしくは増大さ
せるのに有用であると思われる。ヘリオシス・ビレスセ
ンス〔Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ｔａ
ｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）〕、オルギア・シュード
ッガタ〔Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ
（Ｄｏｕｇｌａｓ ｆｉｒｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔ
ｈ）〕、リマントリア・ジスパー〔Ｌｙｍａｎｔｒｉａ
ｄｉｓｐａｒ（ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ）〕、オートグ
ラファ・カルフォルニア〔Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ａｌｆａｌｆａ ｌｏｏｐｅ
ｒ）〕、ネオディプリオン・セルティファー〔Ｎｅｏｄ
ｉｐｒｉｏｎ ｓｅｒｔｉｆｅｒ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
ｐｉｎｅ ｓａｗｆｌｙ）〕、およびラスペイレシア・
ポメネラ〔Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌ
ａ（ｃｏｄｌｉｎｇ ｍｏｔｈ）〕を感染させるものを
含む種々のバクロウイルスがいくつかの国で登録され、
殺虫剤として使用されている。少なくとも１種の昆虫選
択性毒素のゲノムの導入は、このような殺虫剤の能力を
著しく増大させるものと期待される。

【０１０６】本発明で使用するために特に好適であると
期待される組換え発現ベクターは米国特許第４，８７
９，２３６号明細書に記載されている種類のようなバキ
ュロウイルス発現ベクターである。この米国特許を参考
文献としてここに引用する。また、カーボネル（Ｃａｒ
ｂｏｎｅｌｌ）らの“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｆ ｇｅ
ｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｎｅｕｒｏｔｏｘ
ｉｎ ａｎｄ ａｔｔｅｍｐｔｓ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓ
ｓ ｉｔ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ”，Ｇｅｎｅ，７３：４０９−４１８（１９
８８）も参照されたい。このベクターは、テジェナリア
（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ）くも毒液から実質的に単離しう
る殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列がオー
トグラファ・カルフォルニア（ＡｃＭＮＰＶ）発現ベク
ターのようなバキュロウイルス中にクローン化されうる
系において有用であると期待される。米国特許第４，８
７９，２３６号明細書およびミラー（Ｍｉｌｅｒ）らの
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９，７１５−７２１（１９３１）
に記載の発現ベクター参照。この組換え発現ベクターウ
イルスは次いで植物または動物に適用することができ
る。この際、昆虫は害虫であり、ウイルスが害虫に摂取
されるとき、組換えウイルスは腸壁の細胞に浸入して複
製を始める。複製中、殺虫に有効なタンパクの遺伝子は
発現されて、昆虫が野生種のＡｃＭＮＰＶウイルスを摂
取した場合よりも短い時間で昆虫の無能化もしくは死を
もたらす。

【０１０７】ハイブリッド・ウイルスはまた欧州特許出
願０３４０９４８号明細書に有用であると予想されるこ
とが教示されている。本発明のＤＮＡを発現するハイブ
リッド・ウイルスは変化した昆虫宿主の範囲をもつウイ
ルスを生じると予想される。たとえば、融合タンパク
は、本発明のＤＮＡと発現された殺虫に有効なペプチド
を宿主昆虫標的に向けるための特異的昆虫腸管細胞認識
タンパクとからなるハイブリッド遺伝子の単一ポリペプ
チド生成物として発現させることができる。

【０１０８】種々の原核生物および真核生物の微生物を
形質転換させて欧州特許出願第０３２５，４００号明細
書に教示されている方法によって、殺虫に有効なタンパ
クをコードするハイブリッド毒素遺伝子を発現させるこ
とができる。

【０１０９】本発明のタンパクをコードする遺伝子をも
つプラスミドからなるハイブリッド・バクテリア細胞
は、本発明の方法に有用であると予期される。昆虫はこ
のハイブリッドを昆虫に適用することによって制御され
る。たとえば米国特許第４，７９７，２７９号明細書を
参照されたい。この米国特許を文献としてここに引用す
る。

【０１１０】本発明に使用するのに好適であるバキュロ
ウイルスを使用する他の例は、トマルスキイ（Ｔｏｍａ
ｌｓｋｉ）らの“Ｉｎｓｅｃｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ
ｂｙｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆａ ｍｉｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏ
ｘｉｎ ｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：８２−８
５（１９９１）、およびステワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）
らの“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｍｐ
ｒｏｖｅｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｃｔｉ
ｃｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ”，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３５２：８５−８８（１９９１）、に記載され
ている。

【０１１１】Ｊ．殺虫に有効なペプチドに対する抗体 本発明の別の面は、本発明の殺虫に有効なペプチドに対
する抗体である。次の記述において、ここに述べる抗体
と反応性のペプチドを検出および精製するための免疫技
術の当業者に知られている種々の方法論についての言及
がなされる。

【０１１２】もし抗体がある分子と特異的に反応しうる
場合にはその抗体はその分子に「結合しうる」ものとい
われる。「エピトープ」なる用語は、抗体によって認識
され結合されうる分子の部分のことを指すことを意味す
る。抗原は１個以上のエピトープをもつことができる。
「抗原」は動物を誘発してその抗原のエピトープに結合
しうる抗体を生成させることができる。特異反応とは、
抗原がその対応する抗体と高度に選択的方法で免疫反応
し、他の抗原によって誘発されうる他の多くの抗体とは
免疫反応しないことをいう。

【０１１３】ここに使用する用語「抗体」（Ａｂ）また
は「モノクローナル抗体」（Ｍｃｂ）とは、抗原に結合
しうるそのままの（インタクト）分子ならびにその断片
（たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ 断片）を含む意
味である。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ 断片は、円形か
ら更に容易に明らかなように、そのままの抗体のＦｃ断
片を欠き、昆虫抗原のより少ない非特異的組織結合をも
ちうる。

【０１１４】本発明の抗体は種々の方法のいずれかによ
って製造することができる。このような抗体の製造法及
び用途は周知であり、文献に十分に記載されている。た
とえばハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎ
ｅ）の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を
参照されたい。一般に、殺虫に有効なペプチドを天然の
夾雑物を実質的に含まないように製造し、精製するか、
または殺虫に有効なペプチド断片を当該技術に知られて
いる方法により合成する。精製されたペプチドまたは合
成された断片のいずれか一方または精製された天然断片
および／または合成された断片の組合せを動物に投与し
て大きい特異的活性のポリクローナル抗血清を作ること
ができる。

【０１１５】モノクローナル抗体は周知のハイブリドー
マ技術を使用して製造することができる。一般に、この
ような方法は、殺虫に有効なペプチド抗原で動物を免疫
することを包含する。このような動物の牌臓細胞を抽出
して好適な骨髄腫細胞系と融合させる。すべての好適な
骨髄腫細胞系を本発明により使用することができる。融
合後に、生成したハイブリドーマ細胞を好適な培地中に
選択的に保持し、次いで制限稀釈によってクローニング
する。このような選択により得られたハイブリドーマ細
胞を次いで分析して、殺虫に有効なペプチド抗原に結合
しうる抗体を分泌しうるクローンを同定する。

【０１１６】もしペプチド源が不純なときは、ハイブリ
ドーマ細胞のわずかなもののみがペプチドに結合しうる
抗体を産生するであろう（他のハイブリドーマ細胞はペ
プチド夾雑物に結合しうる抗体を産生する）。従って、
ペプチドに結合しうる抗体を分泌しうるものをハイブリ
ドーマ細胞の中から検索（スクリーニング）することが
必要である。このようなスクリーニングは好ましくは、
ペプチド（または毒液）の試料を特定のハイブリドーマ
細胞のそれぞれの群から分泌されたモノクローナル抗体
の存在下で培養し、そして昆虫を麻痺させる毒液の能力
を中和または減衰させる抗体を分泌することのできるハ
イブリドーマを同定することによって達成される。この
ようなハイブリドーマ細胞が同定されたならば、それを
当該技術に知られる方法によってクローンとして増殖さ
せてペプチド特異性モノクローナル抗体を産生させるこ
とができる。

【０１１７】抗体親和（アフィニティー）クロマトグラ
フィーを使用して昆虫選択性の毒素、（天然または組換
え体）を精製するために、殺虫に有効なペプチドに結合
しうる抗体を使用することが必要である。一般に、この
ような抗体はモノクローナル抗体である。ひとたびペプ
チド特異性モノクローナル抗体がえられたならば、それ
は固体担体に結合させることによって固定化し、そして
天然毒液または他の資源からのペプチドを、当該技術に
周知の方法により免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーを使用して精製するのに使用することができる。

【０１１８】このような方法は高度の精製を達成するこ
とができ、それによって天然夾雑物を実質的に含まない
ペプチドを産生することができる。ここに使用するよう
に、もしペプチドが自然に又は通常に結合される化合物
（たとえば他のタンパク、脂質、炭水化物など）を欠く
形態で存在するならば、このペプチドは「天然の夾雑物
を実質的に含まない」ものといわれる。

【０１１９】抗体は組換え発現機構（ＥＬＩＳＡまたは
Ｗｅｓｔｅｒｎ）において産生されたタンパクの検出の
ために；野外または実験室の持続性レベル等における発
現タンパクの定量のために；そして他のクモ毒液（関連
した又は関連のない属のクモ毒液）または他の毒液を分
泌する源からの関連する構造／官能性をもつ他の分子の
検出のために、に使用することもできる。

【０１２０】

【実施例】次の実施例は本発明の範囲内の特別な組成物
および方法を示すものであるが、それらは本発明の範囲
を限定するものと解すべきではない。

【０１２１】材料および方法 実施例：一般法 米国特許第４，９２５，６６４号明細書に記載されてい
るようにクモを電気刺激して毒液を放出させ、次いで放
出毒液を吸引して集め、逆流又は血液リンパによる毒液
の汚染を防ぎクモ毒液を集めた。毒素の精製 ：粗毒液（−８０℃で貯蔵）を解凍し、十分
に混合してからクロマトグラフィー処理前に出発溶媒中
にとかした。粗毒液を、ベックマン・システム・ゴール
ド １２６溶媒分配器および１６８光ダイオードアレイ
検出器モジュールを組み込んだ高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いて分別した。次のカラムおよ
び条件を精製に使用した。セミ−プレパレーティブ逆相
クロマトグラフィーを、０．１％ ＴＦＡからＣＨ₃ Ｃ
Ｎ／Ｈ₂ Ｏ、１：１中の０．１％ＴＦＡへの５０分線状
勾配（ライナー グラジェント）を用いて３．５ｍｌ／
分の流速で溶離するＶｙｄａｃ ３００オングストロー
ムＣ₁₈カラム（２５ｃｍ×１０ｍｍ（内径）、５μｍの
粒径）を用いて実施した。勾配は試料の注入から５分後
に始まった。分析用逆相クロマトグラフィーを、０．１
％ ＴＦＡからＣＨ ₃ ＣＮ／Ｈ₂ Ｏ、１：１、中の０．
１％ ＴＦＡへの５０分線状勾配で溶離するＶｙｄａｃ
Ｃ₁₈（２５ｃｍ×４．６ｍｍ（内径）、５μｍの粒
径）を用いて実施した。これは他に特別の記載のない限
り以下の実施例においても同じである。流速は１．０ｍ
ｌ／分であり、勾配は試料の注入から５分後に始まっ
た。逆相カラムを２２０ｎｍにおいてモニリングしてフ
ラクションをギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）・モデル２０３
フラクション・コレクターを用いて集めた。逆相クロマ
トグラフィーをフラクション後に凍結乾燥して−２０℃
で貯蔵した。カチオン交換クロマトグラフィーを、５０
ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０から５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム中の１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０への７５分線状
勾配で溶離するＨＥＭＡ−ＩＥＣ ＢＩＯ ＳＢカラム
（１５ｃｍ×４．６ｍｍ内径、１０μｍの粒径）を用い
て実施した。勾配は試料の注入から５分後に始まり、溶
離は１ｍｌ／分であった。溶離を２８０ｎｍにおいてモ
ニタリングし、フラクションをジルソン・モデル２０３
フラクション・コレクターに集めた。フラクションを分
析して、下記のとおり鱗翅類幼虫のいくつかの種に注入
して殺虫活性を求めた。

【０１２２】実施例１：テジェナリア・アグレステイス
全毒液からの殺虫性ペプチドの初期フラクションと同定 上記の方法のようにして得たテジェナリア・アグレステ
イス（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ ａｇｒｅｓｔｉｓ）全毒液
の５μｌを０．１％ ＴＦＡ（水性）の９５μｌで稀釈
し、上記の方法のようにＶｙｄａｃ ＲＰ Ｃ₁₈分析用
カラム上の逆相ＨＰＬＣによって分別した。各フラクシ
ョンを２２０ｎｍにおいて流出液をモニタリングするこ
とによって集めた。毒液の第２の５μｌ部分も同じ条件
で分別し、同様に２つのクロマトグラフィーからのフラ
クションを集めて凍結乾燥した。

【０１２３】凍結乾燥したフラクションを５０μｌのホ
スフェート緩衝食塩水、ｐＨ６．５（ＰＢＳ）にとか
し、オオタバコガの幼虫（ＴＢＷ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に注入することによって殺虫活
性を試験した。それぞれのフラクションについて３匹の
ＴＢＷ幼虫に６μｌ（１．２ｗｖｅ）の試験溶液を注入
した。対照群の昆虫には等用量の食塩水を注入した。フ
ラクション７および８のみが殺虫活性をもっていた（表
１、図５）。

【０１２４】実施例２：テジェナリア・アグレステイス
のフラクション８の更なる精製 テジェナリア・アグレステイスのフラクション８からの
主要殺虫剤成分を、カチオン交換カラムの１つの追加ク
ロマトグラフィーによって精製し、次いで逆相クロマト
グラフィーによって主要成分の脱塩を行った。

【０１２５】ＴＢＷ試験（２５μｌ容量中の約５ｗｖ
ｅ）後にフラクション８に残る物質を５０ｍＭ酢酸ナト
リウム、ｐＨ４．０で５００μｌに稀釈した。これを前
記の方法で述べたようにＨＥＭＡ−ＩＥＣ ＢＩＯ Ｓ
Ｂカラムでクロマトグラフィーに付した。流出液を２８
０ｎｍにおいてモニタリングし、殺虫成分を４１分で溶
離した。このフラクションを前記の方法で述べたように
分析用Ｖｙｄａｃ Ｃ₁₈カラムのクロマトグラフィーに
付し、脱塩した。精製された毒素ＮＰＳ−３２６を３
０．５分の保持時間をもつ単一ピークとして溶離した。

【０１２６】実施例３：テジェナリア・アグレステイス
全毒液の１００μｌの分別 テジェナリア・アグレステイス全毒液１００μｌを実施
例１および２で与えたのと同様の条件下で分別して約３
００μｇの毒素ＮＰＳ−３２６を得た。具体的にいえ
ば、５０μｌのテジェナリア・アグレステイス粗毒液を
０．１％ ＴＦＡ（水性）の９５０μｌに稀釈し、前記
の方法のように溶離するＶｙｄａｃセミ−プレパレーテ
ィブＲＰＣ₁₈カラム上で分別した。流出液を２２０ｎｍ
でモニタリングし、殺虫性フラクションを集めた。フラ
クション７は３５．４〜３７．１分の間で溶離したが、
フラクション８は３７．１〜３８．３分の間で溶離し
た。第２の５０μｌの毒液も同様に分別し、２つのクロ
マトグラフィーからのフラクションを同様に集めて凍結
乾燥した。

【０１２７】フラクション８の更なる精製を、ＨＥＭＡ
−ＩＥＣ ＢＩＯ ＳＢカラムを用いて、０．２ｍｌの
５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０にとかした凍結物
質のクロマトグラフィーによって行った。カラムは前記
の方法で述べたように溶離し、流出液を２８０ｎｍにお
いてモニタリングした。殺虫性成分は４６分で溶離し、
前記の方法で述べたようにＶｙｄａｃ Ｃ₁₈分析用カラ
ムの逆相クロマトグラフィーによって脱塩した。精製さ
れた毒素ＮＰＳ−３２６は３２分で溶離した。凍結乾燥
後に、３１０μｇの毒素を得た。

【０１２８】天然のペプチド及び還元且つアルキル化
（ピリジエチル化）したペプチドの両者のＮ−末端配列
分析は、ＮＰＳ−３２６の始めの３０個のアミノ酸を与
えた。

【０１２９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動はＮＰＳ
−３２６の６−８ＫＤの見掛け分子量を与えた。実際の
質量は質量分光分析により５６７８．５５±０．３７Ｄ
であることがわかった。

【０１３０】実施例４：テジェナリア・アグレステイス
からの小量の殺虫性成分であるフラクション７の精製。 ２つの小量の成分、ＮＰＳ−３３１およびＮＰＳ−３７
３を、全毒液の逆相クロマトグラフィーからの１５０ｗ
ｖｅ（実施例３から１００ｗｖｅおよび類似のクロマト
グラフィーから５０ｗｖｅのフラクション７）のフラク
ションのカチオン交換クロマトグラフィーによってえ
た。３種のものからの凍結粉末の５０μｌのクロマトグ
ラフィーを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０の２０
０μｌ中で混合し、前記の方法のように溶離するＨＥＭ
Ａ−ＩＥＣ ＢＩＯ ＳＢカラム上で分別した。流出液
を２８０ｎｍにてモニタリングし、殺虫性成分を３７分
で溶離した。このフラクションを次の勾配をもつ０．１
％ ＴＦＡ（水性）（溶媒Ａ）およびＣＨ₃ ＣＮ中の
０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ）で溶離するＶｙｄａｃ分析
用Ｃ₁₈カラムで脱塩した。３分間０％Ｂ、３分以上０〜
１５％Ｂ、８０分以上１５〜３５％Ｂ。ＮＰＳ−３３１
は２９分で溶離するが、活性の小さいＮＰＳ−３７３は
３２分で溶離する。より活性の大きいフラクションの凍
結乾燥は約３０μｇのＮＰＳ−３３１を与えた。凍結後
に回収したＮＰＳ−３７３の量は（クロマトグラムのピ
ーク区域の積分から）１０μｇと評価された。

【０１３１】両者の天然ペプチドのＮ−末端配列分析は
ＮＰＳ−３３１の最初の３１個のアミノ酸およびＮＰＳ
−３７３の最初の２０個のアミノ酸を与えた。

【０１３２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動は、ＮＰ
Ｓ−３３１およびＮＰＳ−３７３の両者について６〜８
ＫＤの見掛け分子量を与えた。質量分光分析によって示
された質量（電子噴射イオン化；カナダ国ケベック州の
バイオテクノロジー・リサーチ・インステイテュートに
よって提供されたデータ）は、ＮＰＳ−３３１について
５７００．３９±０．２９Ｄ、およびＮＰＳ−３７３に
ついて５６４３．０９±０．４１Ｄであった。

【０１３３】

【表１】

【０１３４】実施例５ クモ（ｓｐｉｄｅｒ）を集めそしてナチュラル プロダ
クト サイエンス社（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）でテジェナリア アグレ
スチス（Ｔｅｇｅｎａｒｉａ ａｇｒｅｓｔｉｓ）とし
て同定された。麻酔をかけたクモから毒液腺（Ｖｅｎｏ
ｍ ｇｌａｎｄｓ）を引き出し、液体窒素中で急速に凍
結させた。コムクチンスキー及びサクチ（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１６
２，ｐ１５６，１９８７）のプロトコールを使用してＲ
ＮＡを毒液腺から抽出した。

【０１３５】ＮＰＳ−３２６について得られたアミノ酸
配列の残基１〜１１に相当するオリゴヌクレオチドを図
１に示す。この図は高い縮重の位置でのクモコドン採択
物及びデオキシイノシン残基の両者を用いて示された。
ＸｈｏＩ制限部位をプライマーの５’領域に組み入れ
た。第一鎖ｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーはＮｏ
ｔＩ制限酵素部位に隣接する１５デオキシチミジレート
残基のランから構成された。全てのプライマーはユタ大
学のハワード ヒューズ メディカル インスティチュ
ート契約施設で合成された。

【０１３６】毒液腺ＲＮＡの調製から、メッセンジャー
ＲＮＡがネズミ白血病ウイルス転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＭＤ）によりｃＤＮＡに逆転写された。２０μｌ反応混
合物は、産生者により提供される酵素緩衝液、ＲＮＡの
５００ｎｇ、ＲＮＡ分解酵素（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の２
単位、ｄ（Ｔ）ＮｏｔＩプライマーの３５ｎｇ、各デオ
キシヌクレオシドトリホスフェートの１ｍＭ、及び逆転
写酵素の１００単位を含有した。反応混合物を３７℃で
１時間インキュベートし、そして４２℃で１０分間続け
てインキュベートした。反応混合物をエタノールで沈澱
させ、２０μｌの水で再懸濁した。

【０１３７】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの
プライマー直接酵素増幅はサエキ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２３９：４８７，１９８８）（ｐａｔｅｎｔ ４，６８
３，２０２）により最初に記載された。我々の方法に適
用するために、１０μｌの毒液腺ｃＤＮＡをＧｅｎｅＡ
ｍｐ^TMＤＮＡ増幅キット（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣ
ｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に含有された試薬を
含むポリメラーゼ連鎖反応で鋳型として使用した。増幅
反応は２μＭ濃度のセンス及びアンチセンスプライマ
ー、１００ｕＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート、及び４単位の耐熱性組換え体Ｔａｑポリメラーゼ
を含有した。反応をパーキン エルマーセタス（Ｎｏｒ
ｗａｌｋ，ＣＴ）により作製されたプログラム可能な熱
遮断中で実施した。温度サイクルパラメーターは９５℃
で２分間の変性、３７℃で２分間のプライマーアニーリ
ング、及び７２℃で１分間の酵素による伸長を包含し
た。このサイクルを二度繰り返し、そして次いでプログ
ラムを５４℃の高温度アニーリングを組み入れる同じ方
法に切り換えた。このサイクルを３５回繰り返した。

【０１３８】アンカーＰＣＲ（Ａｎｃｈｏｒｅｄ ＰＣ
Ｒ）生成物をＧｅｎｅｃｌｅａｎ^TMキット（Ｂｉｏ １
０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）で提供されているグラスミル
ク樹脂を用いて３％ＮｕＳｉｅｖｅ／１％ＳｅａＫｅｎ
複合アガロースゲル（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍ
Ｅ）から精製した。次いで挿入物を制限酵素ＮｏｔＩ及
びＸｈｏＩ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ）
で二重に消化させた。ベクター，ｐＫＳ（Ｓｔａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｌａｊｏｌｌａ，ＣＡ）、を同じ二つの酵素で
二重に消化し、直接クローニングに特異的な部位を発生
させた。ベクター及び挿入物を１５％ＰＥＧ（ｐｏｌｙ
ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）の存在下で結合させ、受容能力をも
つエッセリキアコリ菌株ＤＨ５ａＦ’（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）で形質転換させ、そしてアンピシリン
（５０ｕｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ
ｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）及びＸ−ｇａ
ｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏ
ｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を指示薬とし
て含む、ＬＢプレート［１０ｇ／ｌトリプトン（Ｄｉｆ
ｃｏ）］、５ｇ／ｌイースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１
０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、及び１５ｇ／ｌアガー（ＢＢ
Ｌ）］上で平板培養した。組換え体プラスミドを含有す
る細菌コロニーはこれらのコロニーがβ−ガラクトシダ
ーゼを合成し且つ指示版上でブルーを変える能力がない
ことにより同定された。これらをＬＢ媒質補足アンピシ
リン中で培養し、そしてプラスミドをＣｓＣｌ勾配によ
って精製した。精製プラスミドを商業的に入手可能なエ
クスターナルプライマー及びシークナーゼ バーション
（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖａｒｓｉｏｎ）（登録商標）
２．０試薬及び酵素（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて配列させた。

【０１３９】これらのｃＤＮＡ分子の上流配列に到達す
るために、ｃＤＮＡ配列をコードする三つの毒素の均質
領域に対応するインターナルオリゴヌクレオチドを二本
鎖ｃＤＮＡのアンチセンスストランドに対応して合成し
た。このオリゴヌクレオチドは配列番号Ｎｏ．２、ＮＰ
Ｓ−３２６のｃＤＮＡ、の核酸残基７６〜９７に対応す
る。一本鎖毒液腺ｃＤＮＡの１０マイクロリッターを酵
素、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）、を用いてデオキシグアノシン残基によって
その３’末端に尾部を付けた。１４μＭの酵素及び５０
０μＭのｄＧＴＰを含有する２０μｌの反応物を１５分
間３７℃で保温した。そのサンプルをエタノール沈澱さ
せ、２０μｌ Ｈ₂ Ｏに再懸濁させた。

【０１４０】インターナルプライマーのＤＮＡ配列上流
を下流／混合毒素ｃＤＮＡ配列に使用した技術と類似す
るアンカーＰＲＣ技術を使用して増幅させた。増幅反応
物は２μＭ濃度のセンス、（ａｄ（Ｃ）尾部プライマ
ー）、及びアンチセンスプライマー、１００μＭの各デ
オキシヌクレオチドトリホスフェート、及び４単位の耐
熱性組換え体Ｔａｑｌポリメラーゼを含有した。温度の
輪郭は９４℃で２分、３７℃で２分、３７℃で１分であ
った。このサイクルを二回繰り返し、そして次いでその
プログラムを第二工程で５４℃の高温度アニーリングを
組入れる同一の輪郭に切り換えた。

【０１４１】アンカーＰＲＣは臭化エチジュムの存在下
４％アガロースゲル上に示されるように２３０ｂｐで断
片（フラグメント）を生じた。反応生成物はイー・コリ
ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｅｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
の大きい（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いることにより末端
に満たし、そしてエタノールの添加により沈澱させた。
生成物を再懸濁し、制限酵素ＳａｌＩで消化させた。消
化させた断片を酵素Ｔ４キナーゼによって１ｍＭＡＴＰ
の存在下でキナーゼ化し、次いでＳａｌＩ及びＥｃｏＲ
Ｖ消化ｐＫＳベクターに連結させた。組換え体を二本鎖
ＤＮＡ配列にさせることによりスクリーニングした。Ｎ
ＰＳ−３２６、ＮＰＳ−３３１及びＮＰＳ−３７３をコ
ードするｃＤＮＡの上流配列をこの方法で得た。ＮＰＳ
−３２６、ＮＰＳ−３３１及びＮＰＳ−３７３に対する
完全なＤＮＡ配列を図２、３及び４の各々に示した。

【０１４２】ＮＰＳ−３２６をコードするそのＤＮＡ配
列をファーマシアＬＫＢバイオテクノロジイ（Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手した原核発現ベクターｐ
ＧＥＸ−３Ｘ（Ｓｍｉｔｈ，ＤＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８
７０３（１９８６））のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイト
中でクローン化した。このベクターを次いでＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞系Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）中で形質転
換させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプ
レート上で平板培養を行った。シード培養物を３７℃で
培養し、その後に新鮮な媒質中で１０倍に希釈し、引き
続き５９５ｎｍでの吸光度が０．５になるまで培養し
た。次いでこの培養を０．５ｍＭＩＰＴＧで誘発し、そ
して３時間培養した。溶解性融合蛋白をグルタチオン交
差結合ビーズ状アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ）も用いてアフィニティークロマトグラフィーで精
製した。発現した蛋白質の収量はほぼ５ｍｇ／ｌであっ
た。精製融合蛋をウエスタンブロッティング又はＥＬＩ
ＳＡアッセイを使用する発現テジェナリア毒素の検出に
有用なポリクロナール抗体を産生するために使用した。

【０１４３】表II 配列番号２即ちＮＰＳ−３２６によりコードされた蛋白 アミノ酸組成物とｐＡｄａｌ７によってコードされたＮ
ＰＳ−３２６の蛋白特性。もし全てのシステイン残基が
ジスルフィド結合に含まれるとそしてＣ−末端がアミド
化されると仮定するならば、計算される分子量は５，６
７８．８５ダルトンに調節されるべきである。これらの
変更は計算された分子量を６４．０８ダルドンだけ減少
させる。

【０１４４】

【表２】

【０１４５】表III 配列番号８即ちＮＰ−３３１によってコードされた蛋白 アミノ酸組成物及びｐＡｄａｌでコードされたＮＰＳ−
３３１の蛋白特性。もし全てのシステイン残基がジスル
フィド結合に含まれると及びＣ−末端がアミド化される
と仮定するならば、計算される分子量は５，６９９．８
６ドルトンに調節されるべきである。

【０１４６】

【表３】

【０１４７】表IV 配列番号８即ちＮＰ−３３１によってコードされた蛋白 アミノ酸組成物及びｐＡｄａｌ２でコードされたＮＰＳ
−３７３の蛋白特性。もし全てのシステイン残基がジス
ルフィド結合に含まれると及びＣ−末端がアミド化され
ると仮定するならば、計算された分子量は５，６４２．
８１ドルトンに調節されるべきである。

【０１４８】

【表４】

【０１４９】生物学的活性データ 試験された昆虫はオオタバコガの幼虫〔（ｔａｂａｃｃ
ｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）、（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒ
ｅｓｃｅｎｓ）（ＴＢＷ）〕；シロイチモンジョトウガ
の幼虫〔（ｂｅａｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、（Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）（ＢＡＷ）〕；イラクサキ
ンウワバ〔（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）、（Ｔｒ
ｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（ＣＬ）〕の最終令（ラ
ストインター）の研究所で培養された幼虫であった。全
て三種は鱗し（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目の夜蛾（Ｎ
ｏｃｔｕｉｄａｅ）科に含まれる。毒液そのまま（全毒
液）であろうと毒液フラクションであろうと全ての試料
をろ過滅菌した生理的食塩水、ｐＨ６．５に調製した。
試料を第４番目の腹腔体節の側方中線またはその近くの
血体腔中（ｈｅｍｏｃｏｅｌ）に注射をすることにより
投与した：針は内部器官の損傷を避けるために皮相方式
で挿入した。全毒投与量は全毒液当量（ＷＶＥ）によっ
て計算された。１ＷＶＥは抜き取られた全部の毒液の１
マイクロリッター中に通常存在する全ての物質の量であ
る。早いフラクションからの成分の投与量をまたＷＶＥ
に換算して計算した。

【０１５０】テジェナリアアグレスティスからの全毒液
をＴＢＷおよびＢＡＷに０．３ＷＶＥ／幼虫（〜１．０
ＷＶＥ／ｇｍ）の投与量で注射することにより試験し
た。ＴＢＷにおいてわずかな効果が最初に認められた
が、注射１６〜２４時間後に幼虫は独特の痙攣性のまひ
を示した（次の項参照）。５匹の幼虫のうち４匹が結局
死んだ。ＢＡＷ幼虫の数匹は最初に弛緩性のまひを示し
たが、６０分以内に回復した。しかしながら、２４時間
以内に６匹のＢＡＷ幼虫の５匹がＴＢＷ幼虫で見られた
のと同じ痙攣性のまひを示していた。０．０３ＷＶＥ／
幼虫の投与量はＴＢＷおよびＢＡＷに単に弱い可逆的作
用を引き起こした。しかしながら、ＣＬ幼虫では、０．
０３ＷＶＥ／幼虫の投与量は試験された６匹の幼虫の２
匹にたいして致命的であった。

【０１５１】テジェナリア毒液及びそれから精製される
毒素は作用した幼虫に独特のでたらめなラセン様の抑制
しがたい悶えを引き起こした。これらの痙攣は昆虫の死
前の数日の間持続した。毒素又は毒液の投与と視覚し得
る徴候の発作との間にはある時には２４時間以上のきわ
だった遅れがある。この遅れの長さは注射された毒素又
は毒液の量によって逆に変化する。投与後の最初の数分
間でＢＡＷに認められる可逆的な弛緩性のまひはアリー
ルアミン毒の影響であると考えられる。数種の他のアゲ
レニド（ａｇｅｌｅｎｉｄ）クモはそのような毒素を有
することが知られている。

【０１５２】注射によってＮＰＳ−３２６がＴＢＷ、Ｂ
ＡＷ及びＣＬ（６匹／投与量）において０．５〜１．０
ｎモル／ｇｍのＬＤ₅₀値を持った。ＮＰＳ−３３１を単
に初期フラクションをガイドする目的のためにＴＢＷで
試験したが、ＮＰＳ−３２６とほぼ同じ力価を持つこと
が認められた。ＢＡＷ及びＣＬにおける投与−応答実験
はＮＰＳ−３３１に対して０．５〜１．０ｎモル／ｇｍ
のＬＤ₅₀を示した。ＮＰＳ−３２６及びＮＰＳ−３３１
の両者は全テジェナリア毒液（即ち遅延した襲来による
痙攣性のまひ）の注射により引き起こされるものと類似
する徴候をＢＡＷおよびＴＢＷに引き起こした。しかし
ながら、ＣＬでは、痙攣性のまひは注射後４〜６時間以
内に現れ、そしてわずかに特殊な徴候にたいする方法を
速やかに与えた。注射後ほぼ２４時間後に、ＢＡＷ及び
ＴＢＷ幼虫が特徴的なライティング行為を示していた時
に、ＣＬ幼虫は単に敏しょうな表面的な脅えを示してい
た。

【０１５３】哺乳動物の急性毒性試験はＮＰＳ−３２６
及びＮＰＳ−３３１が昆虫に対する高度の選択性を有す
ることを指摘している。ＮＰＳ−３２６の３０μｇのオ
スのスイスウエブターマウス（〜３０ｇｍ）の脳室（ｎ
＝３）または腹膜（ｎ＝２）への注射は影響を何ももた
なかった。

【０１５４】

【配列表】配列番号１はＮＰＳ３２６をコードする完全
なｃＤＮＡ配列を示す。配列番号２はＮＰＳ３２６の合
成に関する暗号ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号３はＮＰ
Ｓ３２６（成熟した毒素）のアミノ酸配列を示す。配列
番号４はシグナル／リーダー配列を持つＮＰＳ３２６の
アミノ酸配列を示す。配列番号５はシグナル／リーダー
配列に関する暗号配列を示す。配列番号６はシグナル／
リーダー配列のアミノ酸配列を示す。配列番号７はＮＰ
Ｓ３３１をコードする完全なｃＤＮＡ配列を示す。配列
番号８はＮＰＳ３３１の暗号ｃＤＮＡ配列を示す。配列
番号９はＮＰＳ３３１（成熟した毒素）のアミノ酸配列
を示す。配列番号１０はシグナル／リーダー配列を持つ
ＮＰＳ３３１のアミノ酸配列を示す。配列番号１１はＮ
ＰＳ３７３をコードする完全なｃＤＮＡ配列を示す。配
列番号１２はＮＰＳ３７３の合成に関する暗号ｃＤＮＡ
配列を示す。配列番号１３はシグナル／リーダー配列を
持つＮＰＳ３７３のアミノ酸配列を示す。配列番号１４
はＮＰＳ３７３（成熟した毒素）のアミノ酸配列を示
す。

【０１５５】配列のリスト （１）一般情報 （ｉ）出願人：カレン クラプコ （ii）発明の名称：殺虫に有効なペプチド (iii）配列の数：１４ （iv）通信の宛先： （Ａ）宛先：ウッドコック ウオッシュバーン カーツ
マッキエウィツエンド ノリス （Ｂ）街：ワン リバティ プレイスー４６階 （Ｃ）市：フィラデルフィア （Ｄ）州：ペンシルバニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｖ）コンピュータ読み取り形体： （Ａ）メディアム型：DISKETTE, 3.4INCH, 1.44Mb STOR
AGE （Ｂ）コンピュータ：IBM PS/2 （Ｃ）オペレーション システム：PC-DOS （Ｄ）ソフトウエア：WORDPERFECT 5.0 （vi）コンピュータ適用データ： （Ａ）適用番号：まだ指定されていない （Ｂ）提出データ：ここに添える （Ｃ）分類： (vii）先願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： (viii)代理人情報： （Ａ）氏名：ジョン ダブリュー カルドウエル （Ｂ）登録番号：２８，９３７ （Ｃ）照会／荷札番号：ＦＭＣ−００５１ （ix）通信情報： （Ａ）電話：(215)568-3100 （Ｂ）テレファックス：(215)568-3439

【０１５６】（２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９４ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号１

【０１５７】

【数１】

【０１５８】（２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５３ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号２

【０１５９】

【数２】

【０１６０】（２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５１ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号３

【０１６１】

【数３】

【０１６２】（２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６８ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号４

【０１６３】

【数４】

【０１６４】（２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号５

【０１６５】

【数５】

【０１６６】（２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号６

【０１６７】

【数６】

【０１６８】（２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９８ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号７

【０１６９】

【数７】

【０１７０】（２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５３ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知

【０１７１】

【数８】

【０１７２】（２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５１ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知

【０１７３】

【数９】

【０１７４】（２）配列番号１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６８ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号１０

【０１７５】

【数１０】

【０１７６】（２）配列番号１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５２ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号１１

【０１７７】

【数１１】

【０１７８】（２）配列番号１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０４ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号１２

【０１７９】

【数１２】

【０１８０】（２）配列番号１３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６８ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号１３

【０１８１】

【数１３】

【０１８２】（２）配列番号１４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５１ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記載：配列番号１４

【０１８３】

【数１４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＮＰＳ−３２６のプライマーのデザイン
である。

【図２】図２はテジェナリア アグレステイスのクモか
らのＮＰＳ−３２６をコードするｍＲＮＡに対応する完
全なＤＮＡ配列である。成熟した毒素から開裂されるシ
グナル配列にはアンダーラインがしてある。箱で囲んだ
領域は関連する毒素のファミリーのあいだの翻訳配列の
可変性の位置を示す。

【図３】図３はテジェナリア・アグレステイスのクモか
らのＮＰＳ−３３１をコードするｍＲＮＡ配列に対応す
る完全ＤＮＡ配列である。成熟した毒素から開裂される
シグナル配列にはアンダーラインがしてある。箱に囲ん
だ領域は関連する毒素のファミリーのあいだの翻訳配列
の可変性の位置を示す。

【図４】図４はテジェナリア・アグレステイスのクモか
らのＮＰＳ−３７３をコードするｍＲＮＡ配列に対応す
る完全ＤＮＡ配列である。成熟した毒素から開裂される
シグナル配列にはアンダーラインがしてある。箱に囲ん
だ領域は関連する毒素のファミリーのあいだの翻訳配列
の可変性の位置を示す。

【図５】図５は０．１％ ＴＦＡ（水性）対０．１％
ＴＦＡ（ＣＨ₃ ＣＮ／Ｈ₂ Ｏ；１：１）の線状勾配（ラ
イナー グラジェント）で溶離されたＶｙｄａｃ Ｃ₁₈
逆相カラム上のテジェナリア・アグレステイス全毒液の
フラクションのクロマトグラムである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ０１Ｎ 37/46 // Ａ０１Ｎ 37/46 63/00 Ｚ 63/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 カレン ジョーン クラプチョ アメリカ合衆国ユタ州 84109 ソールト レイク シティ サン ラファエル ア ベニュー 3840 (72)発明者 ジョン ランドルフ ハンター ジャクソ ン アメリカ合衆国ユタ州 84109 ソールト レイク シティ ギルロイ ロード 3661 (72)発明者 ジャニス ヘレン ジョンソン アメリカ合衆国ユタ州 84108 ソールト レイク シティ メリーズ サークル イースト ストリート 2967 (72)発明者 エリック ジョージ デルマー アメリカ合衆国ユタ州 84108 ソールト レイク シティ メリーズ サークル イースト ストリート 2967

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号６に定義されているアミノ酸配
   列を持つシグナル配列としてのペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号６に定義されているシグナル配
   列をコードするＤＮＡ配列を特徴とするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号３、配列番号９及び配列番号１
   ４からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を持つ殺
   虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、該
   ＤＮＡを植物または該植物の祖先の生殖細胞系に導入
   し、該ＤＮＡ配列の発現の形質を有性生殖又は無性生殖
   により該植物の継続世代を通して継承させる、形質転換
   植物。
4. 【請求項４】 配列番号３、配列番号９及び配列番号１
   ４からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を持つ殺
   虫に有効なペプチドと実質的に免疫反応する抗体。