CN116018350A - 用于有害生物防治的蛋白水解稳定的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽 - Google Patents

用于有害生物防治的蛋白水解稳定的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽 Download PDF

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Abstract

新杀昆虫蛋白、核苷酸、肽及其在植物中的表达。产生新核苷酸和新肽的方法、新工艺、新生产技术、新制剂和新生物体。本公开还涉及并描述了称为TVP的新型肽，所述TVP是基于来源于流浪蜘蛛的U1‑漏斗网蛛毒素‑Ta1b毒素的非天然肽变型。在此，我们描述：编码TVP的基因；包含TVP基因和/或肽的制剂和组合；以及使用其用于防治有害生物的方法。

Description

用于有害生物防治的蛋白水解稳定的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月20日提交的美国临时申请序列号63/012,755的权益和优先权，该临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
序列
本申请以引用方式全文并入标题为“225312-490536_ST25.txt”(68KB)的序列表，该序列表在2021年4月20日下午6:39创建并以电子方式随此提交。
技术领域
本发明描述并要求保护新的杀昆虫蛋白、核苷酸、肽、它们在植物中的表达、生产所述肽的方法、新的方法、生产技术、新的肽、新的制剂以及新的和已知的生物体的组合，该生物体产生比用于防治昆虫的相关肽所预期的产率更高的产率。
背景技术
许多昆虫是疾病的载体。按蚊(Anopheles)属中的蚊子是寨卡病毒、基孔肯雅病毒和疟疾的主要载体，疟疾是由锥虫属(Trypanosoma)中的原生动物引起的疾病。埃及伊蚊(Aedes aegypti)是引起黄热病和登革热的病毒的主要载体。其他病毒，即各种类型脑炎的致病因子，也由伊蚊属种蚊子携带。引起丝虫病的寄生蛔虫-班氏吴策线虫(Wuchereriabancrofti)和马来布鲁线虫(Brugia malayi)通常由库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和按蚊属中的蚊子传播。
马蝇和鹿蝇可传播土拉菌病(土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis))和炭疽(炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis))的细菌病原体，以及在热带非洲引起罗阿丝虫病的寄生蛔虫(罗阿丝虫(Loa loa))。
潜蝇(Hippelates)属中的眼蚋可携带引起雅司病的螺旋体病原体(细弱螺旋体(Treponema pertenue))，并且还可传播结膜炎(红眼病)。舌蝇(Glossina)属中的采采蝇传播引起非洲昏睡病的原生动物病原体(冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗德西亚锥虫(T.rhodesiense))。白蛉(Phlebotomus)属中的白蛉是在南美洲引起卡里翁病(奥罗亚热(oroyo fever))的细菌(杆菌状巴尔通氏体(Bartonella bacilliformis))的载体。在亚洲和北非的部分地区，它们传播引起沙蝇热(白蛉热(pappataci fever))的病毒因子以及引起利什曼病的原生动物病原体(利什曼原虫属种(Leishmania spp.))。
发明内容
本公开提供了U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)、包含TVP的组合物，包含一种或多种TVP任选地与其他蛋白质的杀昆虫蛋白，以及它们用于根除、杀死、防治、抑制、伤害、扰乱一种或多种昆虫物种、致使其不育或它们的组合的方法。本文所述的TVP对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性。本公开的TVP具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6，其中该多肽相对于如SEQID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；并且其中X6为G或不存在。本文所述的TVP已显示在24小时时对家蝇具有低于200pmol/g的50％群体灭杀浓度(KD50)，并且在第4天引起蓟马的100％死亡率。
本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了由TVP和一种或多种赋形剂组成的组合物；其中所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
此外，本公开描述了由TVP和多种赋形剂组成的组合物；其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
此外，本公开描述了编码TVP的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
此外，本公开描述了一种产生TVP的方法，该方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达并分泌到生长培养基中的条件下在生长培养基中生长。
此外，本公开描述了一种使用上述组合物防治昆虫的方法，其包括向昆虫的所在部位提供组合物。
此外，本公开描述了一种保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物。
此外，本公开描述了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的上述组合物施用于该有害生物的所在部位，或施用于易受该有害生物攻击的植物或动物。
此外，本公开描述了一种包含可操作以编码TVP的多核苷酸的载体，该TVP具有与如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的序列具有90％相似性的氨基酸序列。
此外，本公开描述了一种酵母菌株，其包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了由TVP和一种或多种赋形剂组成的组合物；其中所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
此外，本公开描述了由TVP和多种赋形剂组成的组合物；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP由SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐，所述TVP包含与SEQ ID NO 51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP由SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
附图说明
图1描绘了包含9210个碱基对环状载体的Ta1b整合载体图谱，该环状载体含有以下序列：细菌Ori/AmpR；3′Lac4启动子；a-MF信号序列(在图中标记为“a-MF”)；编码U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽的多核苷酸(在图中标记为“Ta1b”)；Lac4终止子；amdS标记物(表示为“Amd标记物”)；和5′Lac4启动子。
图2描绘了家蝇注射测定的结果，其中将活性的野生型Ta1b和具有在位置R9Q和R9N的氨基酸取代的TVP胸腔内注射到家蝇中，然后在注射后24小时测定50％灭杀所需的TVP剂量(KD50)。
图3描绘了评价未处理对照(UTC)、野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b(Ta1bWT)和具有在位置R9Q的氨基酸取代的TVP的百分比死亡率(死亡率％)的蓟马存活测定的结果。
图4描绘了具有在位置R9Q的氨基酸取代的TVP(TVP-R9Q)的HPLC色谱图，其显示了作为主TVP峰左侧的“肩峰”的推定的糖基化种类(如黑色箭头所指示)。
图5描绘了显示TVP-R9Q质谱的ESI-MS结果。插图描绘了多电荷物质的解卷积，并计算了5732和5894Da的质量。完全氧化的TVP-R9Q的预期分子量为5731.3。
图6描绘了TVP-R9Q的HPLC色谱图结果。糖基化由主峰左侧的较小“肩峰”显示。
图7描绘了TVP-R9QΔG的HPLC色谱图结果。糖基化由主峰左侧的较小“肩峰”显示。部分蛋白水解由右肩显示。
图8描绘了TVP-R9Q/T43A/ΔG的HPLC色谱图结果。蛋白水解事件通过两个肩峰的存在来证明：主峰左侧的较小“肩峰”指示部分蛋白水解事件。
图9描绘了TVP-R9Q/T43A的HPLC色谱图结果。在此，存在单一种类的TVP。
图10描绘了TVP-R9Q/T43A/ΔK-G的HPLC色谱图结果。在此，存在单一种类的TVP。
图11描绘了显示TVP-R9Q/T43A/ΔG质谱的ESI-MS结果。
图12描绘了显示TVP-R9Q/T43A质谱的ESI-MS结果。
图13描绘了显示TVP-R9Q/T43A/ΔK-G质谱的ESI-MS结果。
图14描绘了显示TVP-R9Q/T43A/ΔK-G质谱的ESI-MS结果。
图15描绘了使用去除糖基化位点和/或C端氨基酸后的TVP的家蝇注射测定结果。
图16显示了在不同温度下随时间评价的液体浓缩物(LC)制剂的稳定性测定的结果。LC制剂包含2％TVP-R9Q/T43A、0.03％苯并异噻唑啉酮(BIT)、2％山梨醇；并且LC制剂的剩余量是发酵醪，即细胞分离的发酵醪的浓缩物，使用HPLC评价以确定TVP-R9Q/T43A在不同温度下和随时间推移的稳定性。评价的温度为4℃、21℃、37℃、45℃和54℃。评价时间为0、16、31、42、98和114天。
图17显示了喷雾干燥粉末(SDP)形式的TVP-R9Q/T43A的稳定性测定的结果。在此，SDP制剂由干燥的发酵醪产生。在21℃、37℃和45℃下，在有和没有氧/水分清除剂包的情况下使用HPLC定量TVP-R9Q/T43A的量(以mg/mL为单位)，以评价SDP中TVP-R9Q/T43A的稳定性。由黑色方块包围的结果显示了当使用氧/水分清除剂包时获得的结果。
图18显示了为评价初步稳定性制剂而进行的降解测定的结果。在54℃、37℃和21℃下测试制剂2周。每组制剂编号(即7、18、21、2-1、2-2和2-3)由制剂编号，随后用破折号“/”，然后是测试温度即54℃、37℃和21℃指示。
图19显示了含有苯并异噻唑啉酮(BIT)的制剂的稳定性测定的结果，以确定它们与TVP的相容性。在此，制剂是从表达TVP-R9Q/T43A的细胞获得的细胞分离和浓缩的发酵醪，在T0(在室温下进行配制和用喷雾干燥器干燥后立即进行的时间)处和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。在4℃、21℃、37℃和45℃下测试每种制剂。
图20显示了含有苯并异噻唑啉酮(BIT)的制剂的稳定性测定的结果，以确定它们与TVP的相容性。在此，制剂为包含TVP-R9Q/T43A的喷雾干燥粉末(SDP)，在T0(在室温下进行配制和用喷雾干燥器干燥后立即进行的时间)处和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。在4℃、21℃、37℃和45℃下测试每种制剂。
图21描绘了pH稳定性测定的结果。在此，进行pH稳定性筛选以确定pH对TVP-R9Q/T43A稳定性的影响；将1份/千份(ppt)的TVP-R9Q/T43A在不同的pH值下温育。将TVP-R9Q/T43A在45℃下温育7天并通过HPLC分析以确定剩余肽的百分比。如本文所示，确定最佳pH在6.5和7.5之间。
图22显示了包括制剂编号1-17的稳定性小组部分I的结果。测试的成分包括以下：液体浓缩物(LC)形式的TVP-R9Q/T43A，即细胞分离的发酵醪的浓缩物；H2O(反渗透)；麦芽糊精；海藻糖；麦芽糖；K2HPO4；KH2PO4；和BIT(1，2-苯并异噻唑啉-3-酮的9.25％水溶液)。在T0(在室温下进行配制和用喷雾干燥器干燥后立即进行的时间)和在54℃下温育两周后评价样品。经由HPLC分析定量肽浓度。
图23显示了包括制剂编号18-28的稳定性小组部分II的结果。所测试的成分包括以下：液体浓缩物(LC)形式的TVP-R9Q/T43A，即细胞分离的发酵醪的浓缩物；H2O(反渗透)；麦芽糊精；海藻糖；麦芽糖；K2HPO4；KH2PO4；BIT(1，2-苯并异噻唑啉-3-酮的9.25％水溶液)；和木质素磺酸盐。在T0和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。
图24显示了证明在54℃下储存2周后形成的脆性固体附聚物的照片。
图25显示了证明在添加木质素磺酸盐之后得到的物理形式的照片。如本文所示，尽管添加木质素磺酸盐确实防止了脆性固体的形成，但它仍然不能防止在54℃下温育2周后的结块。
图26显示了包括制剂编号18-28的稳定性小组部分III的结果。所测试的成分包括以下：液体浓缩物(LC)形式的TVP-R9Q/T43A，即细胞分离的发酵醪的浓缩物；H2O(反渗透)；海藻糖；木质素硫酸盐；麦芽糊精；K2HPO4；KH2PO4；和BIT(1，2-苯并异噻唑啉-3-酮的9.25％水溶液)。在此，条形图显示了基于上表中描述的组合物设计的理论肽浓度(黑色条)。在T0的肽的实际百分比以灰色条显示。在54℃下温育2周后肽的实际百分比以阴影条显示。
图27显示了证明制剂编号35的物理形式的照片(在放在标记为“形式7”的袋子上的托盘中)。如本文所示，制剂编号35能够在54℃下温育2周后保持干燥的可流动粉末形式。
图28显示了证明制剂编号36的物理形式的照片(在放在标记为“形式8”的袋子上的托盘中)。如本文所示，制剂编号36能够在54℃下温育2周后保持干燥的可流动粉末形式。
图29描绘了四种干燥颗粒原型制剂的理论配方的总结(平均值)。
图30描绘了测试四种原型试验即试验编号1-4的稳定性测定的结果。通过在氧/水分清除剂包的存在下在54℃下温育两周评价四种原型的高温稳定性。在T0(配制和干燥后)和T2W(2周后的时间)时使用HPLC-UV进行TVP-R9Q/T43A肽的测量。
图31显示了证明在54℃下温育2周后由试验编号1产生的物理形式的照片。在此，物理形式是干燥的可流动颗粒形式。
图32显示了证明在54℃下温育2周后由试验编号2产生的物理形式的照片。在此，物理形式是干燥的可流动颗粒形式。
图33显示了证明在54℃下温育2周后由试验编号3产生的物理形式的照片。在此，物理形式是干燥的可流动颗粒形式。
图34显示了证明在54℃下温育2周后由试验编号1产生的物理形式的照片。在此，物理形式是干燥的可流动颗粒形式。
图35显示了圆二色性(CD)测定的结果。添加10％海藻糖稳定了TVP-R9Q/T43A的三级结构，如通过在214nm和220nm处加深的CD光谱所指示，其显示肽变得更α螺旋，与其3D结构一致。
图36显示了评价熔融特征的圆二色性(CD)测定的结果。在此，添加10％海藻糖将TVP-R9Q/T43A的熔点从71.6℃提高至73.6℃，这支持其在海藻糖存在下的增加的稳定性。
具体实施方式
定义
“5′-端”和“3′-端”是指方向性，即核苷酸聚合物(例如DNA)的端对端取向。多核苷酸的5′-端是多核苷酸的具有第五碳的端部。
“5′-和3′-同源臂”或“5′和3′臂”或“左臂和右臂”是指载体和/或靶向载体中的多核苷酸序列，其与宿主生物体中的目标靶基因组序列和/或内源基因同源重组以便实现对宿主生物体染色体基因座的成功遗传修饰。
“ADNl启动子”指由来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)粘附缺陷蛋白1基因的启动子序列组成的DNA区段。
“影响”是指某物如何影响另一事物，例如肽、多肽、蛋白质、药物或化学品如何影响昆虫，例如有害生物。
“剂”是指一种或多种化学物质、分子、核苷酸、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、毒素、毒物、毒药、杀昆虫剂、杀有害生物剂、有机化合物、无机化合物、原核生物有机体或真核生物有机体(以及由所述原核生物有机体或真核生物有机体产生的剂)。
“农业上可接受的载剂”涵盖杀有害生物制剂技术中常用的所有辅助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘结剂等；这些是杀有害生物制剂领域技术人员公知的。
“农业上可接受的盐”在本文中与术语“药学上可接受的盐”同义使用。
“农杆菌感染”意指通过使用根癌农杆菌(Agrobacteria tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteria rhizogenes)将DNA引入植物细胞内的植物转化方法。
“比对”是指比较两个或更多个序列(例如，核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白质序列)以确定它们彼此之间的关系的方法。比对通常由应用各种算法的计算机程序来执行，然而，也可手动执行比对。比对程序通常通过潜在的序列比对进行迭代，并使用置换表对比对进行评分，采用多种策略以达到潜在的最佳比对评分。常用的比对算法包括但不限于CLUSTALW(参见Thompson J.D.，Higgins D.G.，Gibson T.J.，CLUSTAL W：improvingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，NucleicAcids Research 22：4673-4680，1994)、CLUSTALV(参见Larkin M.A.等人，CLUSTALW2，ClustalW and ClustalX version 2，Bioinformatics 23(21)：2947-2948，2007)、Mafft、Kalign、ProbCons和T-Coffee(参见Notredame等人，T-Coffee：A novel methodformultiple sequence alignments，Joumal of Molecular Biology 302：205-217，2000)。实现一个或多个前述算法的示例性程序包括但不限于来自DNAStar(DNAStar，Inc.3801Regent St.Madison，Wis.53705)的MegAlign、MUSCLE、T-Coffee、CLUSTALX、CLUSTALV、JalView、Phylip和来自Accelrys(Accelrys，Inc.，10188Telesis Ct，Suite 100，SanDiego，Calif.92121)的Discovery Studio。在一些实施方案中，比对将在被比较的一个或两个序列中引入“相移”和/或“缺口”以便使两个序列之间的相似性最大化，并且评分是指定量表达所比对序列的相关性的过程。
“α-MF信号”或“αMF分泌信号”是指将新生重组多肽导向分泌途径的蛋白质。
“蛛形纲动物(Arachnid)”是指节肢动物的一个类别。例如，在一些实施方案中，蛛形纲动物可意指蜘蛛、蝎子、蜱、螨、盲蛛(harvestmen)或避日蛛(solifuge)。
“BAAS”意指大麦α-淀粉酶信号肽，并且是ERSP的一个示例。BAAS的一个示例是具有SEQ ID NO：37(NCBI登录号AAA32925.1)的氨基酸序列的BAAS。
“生物质”是指任何测量的植物产物。
“二元载体”或“二元表达载体”意指本身可以在大肠杆菌菌株和农杆菌菌株中复制的表达载体。此外，载体含有由左边界和右边界序列界定的DNA区域(常常称为t-DNA)，该DNA区域被毒力基因识别以复制并通过农杆菌递送到植物细胞中。
“bp”或“碱基对”是指包含两个彼此键合的化学碱基的分子。例如，DNA分子由两条缠绕链组成，其中每条链具有由交替的脱氧核糖和磷酸基团组成的主链。连接至每个脱氧核糖的是四种碱基即腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)之一，其中腺嘌呤与胸腺嘧啶形成碱基对，并且胞嘧啶与鸟嘌呤形成碱基对。
“C端”是指位于多肽末端的游离羧基(即-COOH)。
“cDNA”或“拷贝DNA”或“互补DNA”是指与RNA分子互补的分子。在一些实施方案中，cDNA可以是单链或双链的。在一些实施方案中，cDNA可以是在逆转录酶催化的反应中由单链RNA模板合成的双链DNA。在其他实施方案中，“cDNA”指共享天然成熟mRNA种类中发现的序列元件排列的所有核酸，其中序列元件是外显子和3′和5′非编码区。通常mRNA种类具有连续的外显子，通过核RNA剪接去除插入的内含子，以产生编码蛋白质的连续开放阅读框。在一些实施方案中，“cDNA”是指与mRNA模板互补并来源于mRNA模板的DNA。
“CEW”是指玉米穗虫(Corn earworm)。
“可切割接头”，参见接头。
“克隆”是指涉及插入来自一种来源的DNA区段(例如，通常是目的基因，例如tvp)并将其与来自另一种来源的DNA区段(例如，通常是载体，例如质粒)重组并指导重组DNA或“重组DNA”复制的过程和/或方法，通常通过将重组DNA转化到细菌或酵母宿主中来实现。
“编码序列”或“CDS”是指当置于适当的调控序列的控制下并且在必需的转录和/或翻译分子因子的存在下可被转录(例如，在DNA的情况下)或翻译(例如，在mRNA的情况下)成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸或核酸序列。编码序列的边界由5′(氨基)末端的翻译起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定。转录终止序列通常位于编码序列的3′端。在一些实施方案中，编码序列可在5′和/或3′端侧接有非翻译区。在一些实施方案中，编码序列可用于产生肽、多肽或蛋白质产物。在一些实施方案中，编码序列可以或可以不与另一编码序列或定位信号诸如核定位信号融合。在一些实施方案中，编码序列可克隆到载体或表达构建体中，可整合到基因组中，或可作为DNA片段存在。
“密码子优化”是指其中一个或多个内源、天然和/或野生型密码子被最终仍编码相同氨基酸但在对应宿主中优选的密码子替换的基因的产生。
如本领域技术人员所理解的，“互补”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，如果两个序列能够彼此杂交形成稳定的反平行双链核酸结构，则它们是彼此“互补的”。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列基本上相同，或者如果第一多核苷酸在严格杂交条件下能够与第二多核苷酸杂交，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列5′-TATAC-3′的多核苷酸与序列5′-GTATA-3′的多核苷酸互补。
“条件培养基”意指已被细胞使用并富含细胞来源的材料但不含细胞的细胞培养基。
“拷贝数”是指在任何时间存在于宿主细胞中的载体、表达盒、扩增单位、基因或实际上任何确定的核苷酸序列的相同拷贝数。例如，在一些实施方案中，基因或另一确定的染色体核苷酸序列可以一个、两个或更多个拷贝存在于染色体上。自主复制载体可以每个宿主细胞一个或几百个拷贝存在。
“培养物”或“细胞培养物”是指细胞在人工的体外环境中的维持。
“培养”是指生物体在各种培养基上或培养基中的繁殖。例如，术语“培养”可意指使细胞群在合适的条件下在液体或固体培养基中生长。在一些实施方案中，培养是指目的异源多肽和/或其他期望的终产物的发酵重组生产(通常在容器或反应器中)。
“胱氨酸”是指氧化的半胱氨酸-二聚体。胱氨酸是通过两个半胱氨酸分子的氧化获得的含硫氨基酸，并且用二硫键连接。
“确定成分培养基”意指由已知化学组分组成但不含粗蛋白提取物或副产物如酵母提取物或蛋白胨的培养基。
“二硫键”意指在两个半胱氨酸之间通过其侧链上的两个硫醇基团偶联衍生的共价键。
“简并性”或“密码子简并性”是指一种氨基酸可由不同核苷酸密码子编码的现象。因此，编码蛋白质或多肽的核酸分子的核酸序列可由于简并性而变化。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列可编码具有特定活性的给定多肽；本文考虑了此类功能上等同的变体。
“DNA”是指脱氧核糖核酸，其包含一个或多个脱氧核糖核苷酸或核苷酸(即腺嘌呤[A]、鸟嘌呤[G]、胸腺嘧啶[T]或胞嘧啶[C])的聚合物，其可以单链或双链形式排列。例如，一个或多个核苷酸产生多核苷酸。
“dNTP”是指构成DNA和RNA的三磷酸核苷。
“双重表达盒”是指包含在同一载体上的两个TVP表达盒。
“双转基因肽表达载体”或“双转基因表达载体”意指含有两个拷贝的TVP表达盒的酵母表达载体。
“内源”是指天然发生和/或存在于生物体中的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质或过程，例如在特定遗传操作之前已经存在于宿主细胞中的分子或活性。
“增强子元件”是指可操作地连接到启动子的DNA序列，相对于不存在增强子元件时由启动子产生的转录活性，其可对启动子施加增加的转录活性。
“ER”或“内质网”是所有真核生物共有的亚细胞细胞器，其中发生一些翻译后修饰过程。
“ERSP”或“内质网信号肽”是氨基酸的N末端序列，其在编码TVP的mRNA分子的蛋白翻译期间被宿主细胞信号识别颗粒识别并结合，这样将蛋白翻译核糖体/mRNA复合物移动到细胞质中的ER。结果是蛋白翻译暂停，直到它与ER对接，在ER中它继续并且将所得蛋白注射到ER中。
“ersp”是指编码肽ERSP的多核苷酸。
“ER运输”意指将细胞表达的蛋白转运到ER中进行翻译后修饰、分选和转运。
“赋形剂”是指与本发明的活性成分(即TVP或TVP-杀昆虫蛋白)一起(例如伴随地)或在其之后配制的任何药理学上无活性的、天然的或合成的组分或物质。在一些实施方案中，赋形剂可以是任何添加剂、佐剂、粘结剂、膨胀剂、载剂、包衣、稀释剂、崩解剂、填充剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、媒介物或它们的组合，其可与本发明的TVP或TVP-杀昆虫蛋白一起施用，和/或其可用于制备本发明的组合物。赋形剂包括本领域已知的无毒且不与组合物的其他组分相互作用的任何此类物质。在一些实施方案中，当制备用于增量组合物目的组合物(因此通常称为膨胀剂、填充剂或稀释剂)时，赋形剂可与TVP或TVP-杀昆虫蛋白一起配制。在其他实施方案中，赋形剂可用于赋予最终剂型中的活性成分增强，诸如促进吸收和/或溶解。在其他实施方案中，赋形剂可用于提供稳定性或防止污染(例如，微生物污染)。在其他实施方案中，赋形剂可用于赋予组合物物理特性(例如，呈干燥颗粒或干燥可流动粉末物理形式的组合物)。提及赋形剂包括一种和多于一种此类赋形剂。合适的药物赋形剂描述于E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences中，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
“表达盒”是指(1)目的DNA序列，例如可操作以编码TVP的多核苷酸；以及以下中的一项或多项：(2)启动子、终止子和/或增强子元件；(3)适当的mRNA稳定聚腺苷酸化信号；(4)内部核糖体进入位点(IRES)；(5)内含子；和/或(6)转录后调控元件。(1)与(2)-(6)中至少一者的组合称为“表达盒”。在一些实施方案中，可存在许多克隆到载体中的表达盒。例如，在一些实施方案中，可存在包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒。在另选的实施方案中，存在两个表达盒，每个表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸(即双重表达盒)。在其他实施方案中，存在三个可操作以编码TVP的表达盒(即三重表达盒)。在一些实施方案中，双重表达盒可通过将第二表达盒亚克隆到含有第一表达盒的载体中来生成。在一些实施方案中，三重表达盒可通过将第三表达盒亚克隆到含有第一表达盒和第二表达盒的载体中来生成。涉及表达盒和克隆技术的方法是本领域公知的并在本文中描述。还参见TVP表达盒。
“表达ORF”意指编码蛋白复合物的核苷酸，并且定义为ORF中的核苷酸。
“FECT”意指使用狗尾草花叶病毒，消除包被蛋白基因和三基因段的瞬时植物表达系统。
“发酵醪”是指用过的发酵培养基，即去除生物体后的发酵培养基上清液，其已用转化的宿主细胞(例如，可操作以表达本发明的TVP的酵母细胞)接种并消耗。在一些实施方案中，发酵醪是指在转化的宿主细胞发酵后回收的溶液。术语“发酵”广泛地指在受控条件(例如，温度、氧、pH、营养物等)下通过微生物对有机物质(例如，碳底物)营养物质的酶促和厌氧或需氧分解以产生发酵产物(例如本发明的一种或多种肽)。尽管发酵典型地描述了在厌氧条件下发生的过程，但如本文所用，该术语不旨在仅限于严格的厌氧条件，因为本文所用的术语“发酵”也可发生在氧存在下发生的过程。
“发酵固体”是指在基于酵母的发酵过程中从发酵醪中保留的固体(包括溶解的)，并且基本上由盐、复合蛋白质源、维生素和具有约200kDa至约1kDA的截留分子量的附加的酵母副产物组成。
“GFP”是指来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者中的位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置的数目除以比较位置的数目×100的函数。因此，在一些实施方案中，术语“同源”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者中的位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是两个序列共有的匹配或同源位置的数目的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，则这两个序列是60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50％的同源性。
术语“同源性”当关于核酸使用时，是指互补性的程度。可存在部分同源性，或完全同源性并因此相同。“序列同一性”是指两种或更多种核酸之间相关性的量度，并且参考总比较长度以百分比给出。同一性计算考虑了在它们各自较大序列中相同且位于相同相对位置的那些核苷酸残基。
“同源重组”是指DNA区段被具有相同区域(同源)或几乎相同区域的另一DNA区段取代的事件。例如，在一些实施方案中，“同源重组”是指一种遗传重组，其中核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间交换。简而言之，同源重组被细胞最广泛地用于精确修复在DNA的两条链上发生的有害断裂，称为双链断裂。虽然同源重组在不同生物体和细胞类型中变化很大，但大多数形式涉及相同的基本步骤：在双链断裂发生后，在称为切除的过程中切除断裂5′端周围的DNA区段。在随后的链侵入步骤中，断裂的DNA分子的悬垂3′端然后“侵入”未断裂的相似或相同的DNA分子。链侵入后，进一步的事件序列可遵循两种主要途径中的任一种，即双链断裂修复途径或合成依赖性链退火途径。同源重组在生命的所有三个领域以及病毒中都是保守的，这表明它是一种几乎普遍的生物学机制。例如，在一些实施方案中，可使用位点特异性整合(SSI)序列发生同源重组，由此在核苷酸组成基本上相似的核酸序列之间存在链交换交叉事件。这些交叉事件可在本发明的靶向构建体中所包含的序列(即，SSI序列)和内源基因组核酸序列(例如，编码肽亚基的多核苷酸)之间发生。此外，在一些实施方案中，可能发生多于一个位点特异性同源重组事件，这将导致置换事件，其中包含在靶向构建体中的核酸序列已经置换了存在于内源基因组序列中的特异性序列。
“同一性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较所述序列所确定的。术语“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列串之间的匹配所确定的。“同一性”和“相似性”可以容易地通过本领域普通技术人员已知的无数方法中的任何一种方法来计算，包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编辑，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press，NewYork，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。此外，确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。例如，在一些实施方案中，确定两个序列之间的同一性和相似性的方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)和在天然环境中发生的过程或反应。
“无活性”是指某物不处于使用状态的情况，例如处于休眠和/或不工作状态。例如，当在基因的上下文中使用时或当提及基因时，术语无活性意指所述基因不再主动地合成基因产物、不再将所述基因产物翻译成蛋白质、或以其他方式基因不再执行其正常功能。例如，在一些实施方案中，术语无活性可指基因转录RNA失败、RNA加工(例如，前mRNA加工、RNA剪接、或其他转录后修饰)失败；干扰非编码RNA成熟；干扰RNA输出(例如，从细胞核到细胞质)；干扰转译、蛋白折叠、易位、蛋白质转运；和/或抑制和/或干扰分子多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、转录因子、调节剂、抑制剂或参与任何前述过程的其他因子中的任一种。
“不可操作”是指某物不起作用、功能失常或不再能够起作用的情况。例如，当在基因的上下文中使用时或当提及基因时，术语“不可操作”意指所述基因永久地或瞬时地不再能够如其正常情况那样操作。例如，在一些实施方案中，“不可操作”意指基因不再能够合成基因产物、所述基因产物不再翻译成蛋白质、或以其他方式不能使基因执行其正常功能。例如，在一些实施方案中，术语不可操作可指基因转录RNA失败、RNA加工(例如，前mRNA加工、RNA剪接、或其他转录后修饰)失败；干扰非编码RNA成熟；干扰RNA输出(例如，从细胞核到细胞质)；干扰转译、蛋白折叠、易位、蛋白质转运；和/或抑制和/或干扰分子多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、转录因子、调节剂、抑制剂或参与任何前述过程的其他因子中的任一种。
“昆虫”包括“昆虫纲(Insecta)”类中的所有生物体。术语“成年前”昆虫是指在成年阶段之前的任何形式的生物，包括例如卵、幼虫和若虫。如本文所用，术语“昆虫”是指任何节肢动物和线虫，包括螨虫和已知侵染所有作物、蔬菜和树木的昆虫，并且包括在林业、园艺和农业领域中被视为有害生物的昆虫。可用本文公开的方法保护的具体作物的示例是大豆、玉米、棉花、苜蓿和蔬菜作物。本文包括具体作物和昆虫的列表。
“杀昆虫活性”意指当昆虫暴露于化合物、剂或肽时或之后，昆虫死亡或停止或减慢其运动；停止或减慢其进食；停止或减慢其生长；变得混乱(例如，关于导航、定位食物、睡眠行为和/或交配)；不能化蛹；干扰繁殖；和/或阻止该昆虫产生后代和/或阻止该昆虫产生可育后代。
“昆虫肠道环境”或“肠道环境”意指在昆虫或昆虫幼虫的前肠、中肠或后肠内发现的特定pH和蛋白酶条件。
“昆虫血淋巴环境”意指在昆虫或昆虫幼虫中发现的特定pH和蛋白酶条件。
“整合表达载体”或“整合载体”意指本身可以插入酵母细胞基因组的特定基因座中并稳定地成为酵母基因组的一部分的酵母表达载体。
“插入接头”是指蛋白质中分离蛋白质不同部分的短肽序列，或置于ORF的阅读框中以分离上游和下游DNA序列的短DNA序列。例如，在一些实施方案中，可使用插入接头，从而允许蛋白质在翻译期间实现其独立的二级和三级结构形成。在一些实施方案中，插入接头可在植物细胞环境中、在昆虫和/或鳞翅目肠道环境中、以及在昆虫血淋巴和鳞翅目血淋巴环境中具有抗性或易受切割。
“分离的”是指将物质和/或组分从其天然环境中分离，例如，从给定属或种中分离的毒素是指毒素从其天然环境中分离。
“kb”是指千碱基，即1000个碱基。如本文所用，术语“kb”意指核酸分子的长度。例如，1kb是指1000个核苷酸长的核酸分子。1kb长的双链DNA的长度含有两千个核苷酸(即，每条链上有一千个核苷酸)。另选地，1kb长的单链RNA的长度含有一千个核苷酸。
“kDa”是指千道尔顿，一个单位等于1,000道尔顿；“道尔顿”是分子量(MW)的单位。
“敲入(Knock in或knock-in或knocks-in或knocking-in)”是指用外源或异源基因或其部分替换内源基因。例如，在一些实施方案中，术语“敲入”是指通过同源重组将编码期望蛋白质的核酸序列引入靶基因座，从而引起期望蛋白质的表达。在一些实施方案中，“敲入”突变可修饰基因序列以产生功能丧失或功能获得突变。术语“敲入”可指将外源或异源多核苷酸序列或其片段引入基因组(例如，“它们进行敲入”或“它们敲入异源基因”)的程序，或所得细胞和/或生物体(例如，细胞是“敲入”的或动物是“敲入”的)。
“敲除(Knock out或knockout或knock-out或knocks-out或knocking-out)”是指对细胞中由内源DNA序列编码的蛋白质的表达基因产物(例如，mRNA)的部分或完全抑制。在一些实施方案中，“敲除”可通过靶向缺失编码肽、多肽或蛋白质的整个基因或基因的一部分来实现。结果，缺失可使基因失活、部分失活、不可操作、部分不可操作，或以其他方式降低基因或其产物在整个生物体中的任何细胞中和/或其正常表达的细胞中的表达。术语“敲除”可指使内源基因完全或部分失活或不可操作(例如，“它们进行敲除”或“它们敲除内源基因”)的程序，或所得细胞和/或生物体(例如，细胞是“敲除”的或动物是“敲除”的)。
“灭杀剂量50”或“KD50”是指在群体的50％中，例如家蝇(普通家蝇)和/或埃及伊蚊(蚊子)群体中引起麻痹或运动停止所需的中值剂量。
“l”或“接头”是指编码插入接头肽的核苷酸。
“L”在适当的上下文中是指插入接头肽，其将翻译稳定蛋白(STA)与附加的多肽(例如TVP和/或多个TVP)连接。当提及氨基酸时，“L”也可以指亮氨酸。
“LAC4启动子”或“Lac4启动子”是指由来源于乳酸克鲁维酵母(K.lactis)β-半乳糖苷酶基因的启动子序列组成的DNA区段。LAC4启动子是用于驱动转化到酵母中的外源基因表达的强的和可诱导的报告基因。
“LAC4终止子”或“Lac4终止子”指由来源于乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶基因的转录终止子序列组成的DNA区段。
“LD20”是指杀死群体的20％所需的剂量。
“LD50”是指致死剂量50，其意指杀死群体的50％所需的剂量。
“鳞翅目肠道环境”意指在鳞翅目昆虫或幼虫的前肠、中肠或后肠内发现的特定pH和蛋白酶条件。
“鳞翅目血淋巴环境”意指在鳞翅目昆虫或幼虫中发现的特定pH和蛋白酶条件。
“接头”或“接头”或“肽接头”或“L”或“插入接头”是指可操作以将两个肽连接在一起的短肽序列。接头还可指置于ORF的阅读框中以分离上游和下游DNA序列的短DNA序列。在一些实施方案中，接头可被昆虫蛋白酶切割。在一些实施方案中，接头可允许蛋白质在翻译期间实现其独立的二级和三级结构形成。在一些实施方案中，接头可在植物细胞环境中、在昆虫和/或鳞翅目肠道环境中、以及在昆虫血淋巴和鳞翅目血淋巴环境中具有抗性或易受切割。在一些实施方案中，接头可被蛋白酶切割，例如，在一些实施方案中，接头可被植物蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶和/或凝乳酶(cardosins))、昆虫蛋白酶、真菌蛋白酶、脊椎动物蛋白酶、无脊椎动物蛋白酶、细菌蛋白酶、哺乳动物蛋白酶、爬行动物蛋白酶或禽类蛋白酶切割。在一些实施方案中，接头可以是可切割的或不可切割的。在一些实施方案中，接头包含二元或三元区域，其中每个区域可被至少两种类型的蛋白酶切割：其中一种是昆虫和/或线虫蛋白酶，另一种是人蛋白酶。在一些实施方案中，接头可具有(至少)三个作用之一：在昆虫肠道环境中切割，在植物细胞中切割，或设计为不有意切割。
“培养基”(复数形式“培养基”)是指用于在细胞培养物中培养细胞的营养液。
“MOA”是指作用机制。
“分子量(MW)”是指分子的质量或重量，并且通常以“道尔顿(Da)”或千道尔顿(kDa)测量。在一些实施方案中，MW可使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、分析超速离心或光散射来计算。在一些实施方案中，SDS-PAGE方法如下：在凝胶上用一组分子量标准物分离目的样品。将样品电泳，然后用期望的染色剂处理凝胶，接着脱色约2至14小时。下一步是确定标准物和目的蛋白质的相对迁移距离(Rf)。可使用以下等式确定迁移距离：
Figure BDA0003998753650000261
接下来，可基于针对标准物中的条带获得的值来确定MW的对数；例如，在一些实施方案中，将SDS变性多肽的分子量的对数及其相对迁移距离(Rf)绘制成图。绘制图后，对得到的值进行插值将提供未知蛋白质条带的分子量。
“基序”是指涉及具有某些生物学意义和/或发挥某些作用或参与某些生物学过程的多核苷酸或多肽序列。
“多克隆位点”或“MCS”是指在载体上发现的DNA区段，其含有其中可插入目的DNA序列的许多限制位点。
“突变体”是指(例如，在核苷酸序列或氨基酸序列中)具有改变或变异的生物体、DNA序列、氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质，这些改变或变异导致所述生物体和/或序列不同于与突变体进行比较的天然存在或野生型生物体、野生型序列和/或参考序列。在一些实施方案中，这种改变或变异可以是一个或多个核苷酸和/或氨基酸取代或修饰(例如，缺失或添加)。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代或修饰可以是保守的；在此，“突变体”中的这种保守性氨基酸取代和/或修饰基本上不降低突变体相对于其非突变体形式的活性。例如，在一些实施方案中，当与具有如SEQ ID NO所示的公开和/或要求保护的序列的肽相比时，“突变体”具有一个或多个保守氨基酸取代。
“N端”是指位于多肽的起始或起点的游离氨基(即，-NH2)。
“NCBI”是指国家生物技术信息中心。
“nm”是指纳米。
“归一化肽产率”是指条件培养基中的肽产率除以测量肽产率时的相应细胞密度。肽产率可以用单位体积产生的肽的质量表示，例如，毫克每升或mg/L，或者用HPLC色谱仪中产生的肽的UV吸收峰面积表示，例如mAu.s。细胞密度可以用培养物在600nm波长下的可见光吸收(OD600)来表示。
“OD”是指光密度。通常，使用分光光度计测量OD。当测量细胞群随时间推移的生长时，OD600优于UV光谱法；这是因为在600nm波长下，细胞不会受到损害，因为它们在过多的UV光下会受到损害。
“OD660nm”或“OD660nm”是指660纳米(nm)处的光密度。
“单字母代码”意指以其单字母代码列出以区分蛋白质一级结构中的各种氨基酸的肽序列：丙氨酸＝A，精氨酸＝R，天冬酰胺＝N，天冬氨酸＝D，天冬酰胺或天冬氨酸＝B，半胱氨酸＝C，谷氨酸＝E，谷氨酰胺＝Q，谷氨酰胺或谷氨酸＝Z，甘氨酸＝G，组氨酸＝H，异亮氨酸＝I，亮氨酸＝L，赖氨酸＝K，甲硫氨酸＝M，苯丙氨酸＝F，脯氨酸＝P，丝氨酸＝S，苏氨酸＝T，色氨酸＝W，酪氨酸＝Y，缬氨酸＝V。
“可操作”是指被使用的能力、做某事的能力和/或实现某种功能或结果的能力。例如，在一些实施方案中，“可操作”是指多核苷酸、DNA序列、RNA序列或其他核苷酸序列或基因编码肽、多肽和/或蛋白质的能力。例如，在一些实施方案中，多核苷酸可以可操作以编码蛋白质，这意味着多核苷酸含有赋予其产生蛋白质的能力的信息(例如，通过转录mRNA，其又被翻译成蛋白质)。
“可操作地连接”是指并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。例如，在一些实施方案中，可操作地连接可指两个或更多个DNA、肽或多肽序列。例如，在一些实施方案中，可操作地连接可意指将两个相邻DNA序列放在一起，使得一个序列的转录激活可作用于另一个序列。在其他实施方案中，术语“可操作地连接”可指肽和/或多肽分子，例如，其中可操作地连接意指两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单一多肽链的方式连接，或以一种肽对另一种肽发挥一些作用的方式连接。在其他实施方案中，可操作地连接可指将两个相邻DNA序列放置在一起，使得一个序列的转录激活可作用于另一个序列。在其他实施方案中，可操作地连接可指肽和/或多肽分子，其中两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单一多肽链的方式连接，或以一种肽对另一种肽发挥一些作用的方式连接。
“ORF”或“开放阅读框”是指在翻译起始信号(例如分别为AUG或ATG)和编码一个或多个多肽序列的任何一个或多个已知终止密码子之间的RNA或DNA序列的长度。换句话讲，ORF描述了从核糖体翻译RNA密码的观点来看的参考框架，因为核糖体由于没有遇到终止密码子而能够保持阅读(即，向新生蛋白添加氨基酸)。因此，“开放阅读框”或“ORF”是指在编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间编码的氨基酸序列。在此，术语“起始密码子”和“终止密码子”是指编码序列中分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止的三个相邻核苷酸(即密码子)的单元。
在一些实施方案中，ORF是以起始密码子(通常对于DNA为ATG，对于RNA为AUG)开始并以终止密码子(通常为UAA、UAG或UGA)结束的密码子的连续延伸。在其他实施方案中，ORF可以是翻译起始信号(例如AUG或ATG)和任何一个或多个已知终止密码子之间的RNA或DNA序列的长度，其中所述长度的RNA或DNA序列编码一个或多个多肽序列。在一些其他实施方案中，ORF可以是编码蛋白质的DNA序列，其以ATG起始密码子开始并以TGA、TAA或TAG终止密码子结束。ORF也可以指DNA编码的已翻译的蛋白。通常，本领域普通技术人员基于“开放阅读框”的最广义的定义仅考虑了不包含终止密码子的一系列密码子的事实，将术语“开放阅读框”和“ORF”与术语“编码序列”区分开来。因此，尽管ORF可能含有内含子，但编码序列通过涉及可被分成密码子的那些核苷酸(例如，连接的外显子)来区分，这些密码子实际上通过核糖体翻译机制翻译成氨基酸(即，编码序列不含有内含子)；然而，如本文所用，术语“编码序列”、“CDS”、“开放阅读框”和“ORF”可互换使用。
“外重组的”或“外重组”是指在体内同源重组期间去除侧接两个位点特异性重组位点(例如，与目标载体的同源臂同源的目标基因的5′-和3′-核苷酸序列)的基因和/或多核苷酸序列(例如，内源基因)。参见“敲除”。
“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、蜱等。
“杀有害生物有效量”是指能够使至少一种有害生物死亡或显著减少有害生物生长、进食或正常生理发育的杀有害生物量。该量将根据以下因素而变化，例如待防治的特定目标有害生物、待处理的特定环境、位置、植物、作物或农业所在地、环境条件以及杀有害生物有效的多肽组合物的施用方法、比率、浓度、稳定性和用量。制剂还可根据气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或有害生物侵染的严重程度而变化。
“药学上可接受的盐”与农业上可接受的盐同义，并且如本文所用是指通过制备其酸或碱盐而改性的化合物。
“植物”应意指整株植物、植物组织、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和它们的后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮细胞和花粉)。
“植物转基因蛋白”意指来自异源物种的蛋白，其在将编码它的DNA或RNA递送到一种或多种植物细胞内后在植物中表达。
“质粒”是指用作目的基因(例如，tvp)的载剂的DNA区段，并且当转化或转染到生物体中时，可独立于宿主生物体复制和表达包含在质粒内的DNA序列。质粒是一种类型的载体，并且可以是“克隆载体”(即，用于克隆DNA片段和/或经由一些选择指示剂选择携带质粒的宿主群体的简单质粒)或“表达质粒”(即，用于产生大量多核苷酸和/或多肽的质粒)。
“多核苷酸”指任何长度的核苷酸(例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式；例如两个或更多个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的序列。如本文所用，术语“多核苷酸”包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA；它还包括多核苷酸的经修饰和未修饰形式(对多核苷酸的修饰和多核苷酸的修饰例如可包括甲基化、磷酸化和/或加帽)。在一些实施方案中，多核苷酸可以是以下之一：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)；基因组DNA；基因组DNA片段；外显子；内含子；信使RNA(mRNA)；转运RNA；核糖体RNA；核酶；cDNA；重组多核苷酸；支化多核苷酸；质粒；载体；任何序列的分离的DNA；任何序列的分离的RNA；核酸探针；任何前述的引物或扩增拷贝。
在其他实施方案中，多核苷酸可指可操作以编码基因的开放阅读框的核苷酸的聚合形式。
在一些实施方案中，多核苷酸可指cDNA。
在一些实施方案中，多核苷酸可具有任何三维结构并且可执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的结构还可通过其5′-或3′-端或末端来表示，其指示多核苷酸的方向性。多核苷酸单链中的相邻核苷酸通常通过其3′和5′碳之间的磷酸二酯键连接。然而，也可使用不同的核苷酸间键，诸如包括亚甲基、氨基磷酸酯键等的键。这意味着相应的5′和3′碳可暴露在多核苷酸的任一端，其可被称为5′和3′端或末端。5′和3′端也可分别称为磷酰基(PO4)和羟基(OH)端，因为化学基团连接到那些端。术语多核苷酸还指双链和单链分子两者。除非另有说明或要求，制备或使用多核苷酸的任何实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
在一些实施方案中，多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物(包括具有非天然碱基的核苷酸、具有经修饰的天然碱基的核苷酸，诸如氮杂-或脱氮-嘌呤等)。如果存在，可在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸还可在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。另外，多核苷酸中的核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸的一个或多个端部可被保护或以其他方式修饰以防止该端部以特定方式与其他多核苷酸相互作用(例如形成共价键)。
在一些实施方案中，多核苷酸可由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)。当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)也可例如作为胸腺嘧啶的天然替代物存在。尿嘧啶也可用于DNA。因此，术语“序列”是指多核苷酸或任何核酸分子的字母表示，包括天然和非天然碱基。
术语“RNA分子”或核糖核酸分子是指具有核糖而不是脱氧核糖并且通常具有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶作为嘧啶碱基之一的多核苷酸。本发明的RNA分子通常是单链的，但也可以是双链的。在来自RNA样品的RNA分子的上下文中，RNA分子可包括从细胞核、线粒体或叶绿体中的DNA转录的单链分子，其具有与转录它的DNA链互补的核苷酸碱基的线性序列。
在一些实施方案中，多核苷酸可进一步包含一个或多个异源调控元件。例如，在一些实施方案中，调控元件是一个或多个启动子；增强子；沉默子；操纵子；剪接信号；聚腺苷酸化信号；终止信号；RNA输出元件、内部核糖体进入位点(IRES)；聚U序列；或它们的组合。
“转录后调控元件”是在mRNA转录后影响其的DNA区段和/或机制。转录后机制的机制包括剪接事件；聚(A)尾的加帽、剪接和添加，以及本领域普通技术人员已知的其他机制。
“启动子”是指RNA聚合酶结合并启动基因转录的DNA区域。
在文件中“蛋白质”与“肽”和/或“多肽”具有相同的含义。
“比率”是指两个量之间的定量关系，显示一个值包含另一个值或被包含在另一个值内的倍数。
“阅读框”是指双链DNA分子的六个可能的阅读框之一，每个方向三个。所用的阅读框决定了在DNA分子的编码序列中哪些密码子用于编码氨基酸。在一些实施方案中，阅读框是将多核苷酸和/或核酸(例如DNA或RNA)中的核苷酸序列分成一组连续的、非重叠的三联体的方式。
“重组DNA”或“rDNA”是指由两个或更多个不同DNA区段组成的DNA。
“重组载体”意指向其中插入了外源DNA的DNA质粒载体。
“调控元件”是指控制核酸序列的表达和/或加工的某些方面的遗传元件。例如，在一些实施方案中，可在转录和转录后水平发现调控元件。调控元件可以是顺式调控元件(CRE)或反式调控元件(TRE)。在一些实施方案中，调控元件可以是一个或多个启动子；增强子；沉默子；操纵子；剪接信号；聚腺苷酸化信号；终止信号；RNA输出元件、内部核糖体进入位点(IRES)；聚U序列；和/或例如以组织特异性方式、时间依赖性方式影响基因表达的其他元件；增加或减少表达；和/或以引起组成型表达。
“限制酶”或“限制内切核酸酶”是指在指定的限制位点切割DNA的酶。例如，限制酶可在EcoRI、SacII或BstXI限制位点切割质粒，使质粒线性化，并连接目的DNA。
“限制位点”是指DNA上包含4至8个核苷酸的序列的位置，并且其序列被特定的限制酶识别。
“选择基因”意指赋予经遗传修饰的生物体在选择压力下生长的优点的基因。
“血清变型(Serovar)”或“血清型(serotype)”是指由一组特征性抗原区分的一组密切相关的微生物。在一些实施方案中，血清变型是抗原性和血清学上不同的微生物种类
“sp.”是指种。
“ssp.”或“subsp.”是指亚种。
“亚克隆”或“亚克隆的”是指将DNA从一种载体转移到另一种载体(通常是有利的载体)的过程。例如，在选择用pKLAC1质粒转化的酵母菌落后，可将编码突变TVP的多核苷酸亚克隆到pKlac1质粒中。
“SSI”是上下文相关的首字母缩略词。在一些上下文中，它可指“位点特异性整合”，其用于指将允许发生体内同源重组的序列。然而，在其他上下文中，SSI可指“室内表面喷洒”，其是将可变体积的可喷洒体积的杀昆虫剂施用到载体所停留的室内表面诸如墙壁、窗户、地板和天花板上的技术。术语“位点特异性整合”是指将转基因导向宿主生物体基因组中的目标位点的过程；因此，SSI允许将目的基因整合到宿主生物体的预选基因组位置。
“STA”或“翻译稳定蛋白”或“稳定结构域”或“稳定蛋白”(在本文中可互换使用)意指具有足够的三级结构，使其能够在细胞中积累而不被细胞的蛋白降解过程所靶向的肽或蛋白。蛋白质的长度可在5至50个氨基酸之间。翻译稳定蛋白由与ORF中编码杀昆虫蛋白或TVP的序列可操作地连接的蛋白的DNA序列编码。可操作地连接的STA可在TVP的上游或下游，并且可在两个序列(STA和TVP)之间具有任何插入序列，只要插入序列不导致任一DNA序列的框移位即可。翻译稳定蛋白还可具有增加TVP穿过肠壁并进入昆虫的血淋巴的递送的活性。
“sta”意指编码翻译稳定蛋白的核苷酸。
“结构基序”是指肽和/或多肽的三维排列，和/或可操作地连接的多肽区段的排列。例如，具有ERSP基序、STA基序、接头基序和TVP多肽基序的多肽具有ERSP-STA-L-TVP的总体“结构基序”。还参见“TVP构建体”
“Ta1b”或“U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b”或“Ta1bWT”或“野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b”指从流浪蜘蛛(流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis))中分离的多肽。U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的一个示例是具有SEQ ID NO：1(NCBI登录号O46167.1)的氨基酸序列的多肽。
“Ta1b变体多核苷酸”或“U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸”是指可操作以表达和/或编码包含一种或多种TVP的杀昆虫蛋白的多核苷酸或多核苷酸组。术语“U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸”当用于描述包含在TVP表达ORF中的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸序列(其包含在载体中)时和/或当描述编码杀昆虫蛋白的多核苷酸时，被描述为“tvp”和/或“Tvp”。
“毒素”是指毒液和/或毒药，尤其是由某些动物、高等植物和病原菌产生的蛋白质或缀合蛋白。通常，术语“毒素”是保留的天然产物，例如在蝎子、蜘蛛、蛇、有毒蘑菇等中发现的分子和肽，而术语“毒物”是保留用于人造产物和/或人工产物，例如人造化学杀有害生物剂。然而，如本文所用，术语“毒素”和“毒物”同义使用
“转染”和“转化”均指将外源和/或异源DNA或RNA(例如，含有编码TVP的多核苷酸的载体)引入宿主生物体(例如，原核生物或真核生物)中的过程。通常，本领域普通技术人员有时保留术语“转化”来描述将外源和/或异源DNA或RNA引入细菌细胞的过程；并保留术语“转染”用于描述将外源和/或异源DNA或RNA引入真核细胞的过程。然而，如本文所用，术语“转化”和“转染”同义使用，无论方法是否描述将外源和/或异源DNA或RNA引入原核生物(例如细菌)或真核生物(例如酵母、植物或动物)中。
“转基因”意指编码转化到植物中的蛋白的异源DNA序列。
“转基因宿主细胞”意指用基因转化并已通过附加选择基因对其转基因状态进行选择的细胞。
“转基因植物”意指源自用外源DNA转化的单个细胞的植物，使得植物中的每个细胞都含有该转基因。
“瞬时表达系统”意指将编码解除武装的植物病毒的DNA递送到表达它的植物细胞中的基于根癌农杆菌的系统。已经将植物病毒工程改造为以高浓度表达目的蛋白，高达40％的TSP。
“三表达盒”是指包含在同一载体上的三个TVP表达盒。
“TRBO”意指使用烟草花叶病毒，去除了病毒包被蛋白基因的瞬时植物表达系统。
“TSP”或“总可溶性蛋白”意指可从植物组织样品中提取并溶解到提取缓冲液中的蛋白的总量。
“TVP”或“U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)”或“Ta1b变体多肽(TVP)”是指野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多肽序列和/或编码野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多肽的多核苷酸序列的突变体或变体，其已被改变以产生非天然存在的多肽和/或多核苷酸序列。本文提供了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的示例性野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多肽序列。本文提供了具有SEQ ID NO：48(NCBI登录号O46167.1)的氨基酸序列的示例性野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b前体多肽序列，其包括信号序列“MKLQLMICLVLLPCFFC”(SEQ ID NO：59)。在一些实施方案中，TVP可具有根据表1中列出的氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。因此，术语“TVP”是指相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有一个或多个突变的肽。在一些实施方案中，TVP可具有根据以下式(I)的氨基酸序列：
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
式(I)
其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在。
在一些实施方案中，TVP可具有根据以下式(II)的氨基酸序列：
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
式(II)
其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐。
“TVP ORF图”是指如以图或等式形式写写的一个或多个TVP ORF的组成。例如，“TVP ORF图”可使用表达ORF内所含的DNA区段的首字母或缩写参考字写出。因此，在一个示例中，“TVP ORF图”可分别通过以等式形式将DNA区段图示为“ersp”(即，编码ERSP多肽的多核苷酸序列)；“接头”或“L”(即，编码接头多肽的多核苷酸序列)；“sta”(即，编码STA多肽的多核苷酸序列)和“tvp”(即，编码TVP的多核苷酸序列)，来描述编码ERSP、接头、STA和TVP的多核苷酸区段。TVP ORF图的示例是“ersp-sta-(接头i-tvpj)N”或“ersp-(tvpj-接头i)N-sta”和/或其DNA区段的任何组合。
“TVP多核苷酸”是指可操作以表达和/或编码TVP或TVP-杀昆虫蛋白的多核苷酸或多核苷酸组。
“TVP-杀昆虫蛋白”是指由以下组成的任何蛋白质、肽、多肽、氨基酸序列、构型或排列：(1)至少一种TVP、或两种或更多种TVP；和(2)另外的非毒素肽、多肽或蛋白质，其中所述另外的非毒素肽、多肽或蛋白质例如在一些实施方案中具有进行以下中的一种或多种的能力：当昆虫暴露于TVP-杀昆虫蛋白时，相对于单独的TVP，增加昆虫的死亡率和/或抑制昆虫的生长；例如在宿主细胞或表达系统中增加所述TVP-杀昆虫蛋白的表达；和/或影响该TVP-杀昆虫蛋白的翻译后加工。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种TVP的聚合物。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种TVP的聚合物，其中TVP经由接头肽(例如可切割的和/或不可切割的接头)可操作地连接。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可指与一种或多种蛋白质诸如稳定结构域(STA)、内质网信号传导蛋白(ERSP)、昆虫可切割或昆虫不可切割的接头(L)和/或它们的任何其他组合可操作地连接的一种或多种TVP。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可以是非天然存在的蛋白，其包含(1)野生型Ta1b蛋白；和(2)另外的非毒素肽、多肽或蛋白质(例如，ERSP)、接头、STA、UBI或组氨酸标签或类似标记物。
“TVP构建体”是指可操作地连接的多肽区段(例如，TVP-杀昆虫蛋白)的肽、多肽和/或基序的三维排列/取向。例如，TVP表达ORF可包含一个或多个以下组分或基序：TVP；内质网信号肽(ERSP)；接头肽(L)；翻译稳定蛋白(STA)；或它们的任何组合。并且，如本文所用，术语“TVP构建体”用于描述结构基序的名称和/或取向。换句话讲，TVP构建体描述了包含在给定TVP表达ORF内的组分或基序的排列和取向。例如，在一些实施方案中，TVP构建体描述但不限于以下TVP-杀昆虫蛋白之一的取向：ERSP-TVP、ERSP-(TVP)N、ERSP-TVP-L、ERSP-(TVP)N-L、ERSP-(TVP-L)N、ERSP-L-TVP、ERSP-L-(TVP)N、ERSP-(L-TVP)N、ERSP-STA-TVP、ERSP-STA-(TVP)N、ERSP-TVP-STA、ERSP-(TVP)N-STA、ERSP-(STA-TVP)N、ERSP-(TVP-STA)N、ERSP-L-TVP-STA、ERSP-L-STA-TVP、ERSP-L-(TVP-STA)N、ERSP-L-(STA-TVP)N、ERSP-L-(TVP)N-STA、ERSP-(L-TVP)N-STA、ERSP-(L-STA-TVP)N、ERSP-(L-TVP-STA)N、ERSP-(L-STA)N-TVP、ERSP-(L-TVP)N-STA、ERSP-STA-L-TVP、ERSP-STA-TVP-L、ERSP-STA-L-(TVP)N、ERSP-(STA-L)N-TVP、ERSP-STA-(L-TVP)N、ERSP-(STA-L-TVP)N、ERSP-STA-(TVP)N-L、ERSP-STA-(TVP-L)N、ERSP-(STA-TVP)N-L、ERSP-(STA-TVP-L)N、ERSP-TVP-L-STA、ERSP-TVP-STA-L、ERSP-(TVP)N-STA-L ERSP-(TVP-L)N-STA、ERSP-(TVP-STA)N-L、ERSP-(TVP-L-STA)N或ERSP-(TVP-STA-L)N；其中N为1至200的整数。还参见“结构基序”。
“var.”是指变种(varietas或variety)。术语“var.”用于指示在种水平和/或亚种(当存在时)以下分级的分类学类别。在一些实施方案中，术语“var.”表示在微小但持久或可遗传特征方面不同于相同亚种或种的其他成员的成员。
“变体”或“变体序列”或“变体肽”是指具有一个或多个保守氨基酸取代或保守修饰的氨基酸序列。“变体”中的保守氨基酸取代相对于其非变异形式基本上不降低变体的活性。例如，在一些实施方案中，当与具有如SEQ ID NO所示的公开和/或要求保护的序列的肽相比时，“变体”具有一个或多个保守氨基酸取代。
“载体”是指接受目的外来基因(例如，tvp)的DNA区段。目的基因被称为“插入物”或“转基因”。
“玻璃化”是指将材料转化为玻璃状无定形材料的过程。玻璃状无定形固体可不含任何晶体结构。玻璃质固体的固化发生在玻璃化转变温度(Tg)下。
“野生型”或“WT”是指如在其天然存在的状态或条件下发现和/或观察到的生物体的表型和/或基因型(即外观或序列)、多核苷酸序列和/或多肽序列。
“酵母表达载体”或“表达载体”或“载体”意指可以将异源基因和/或表达盒引入酵母细胞中进行转录和翻译的质粒。
“产率”是指肽的产量，并且增加的产率可以意指增加的生产量，增加的生产速率，以及增加的平均或中值产率和增加的更高产率的频率。术语“产率”当用于指植物作物生长和/或生产时，如在“植物产率”中，是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。
在整个说明书中，除非另外具体说明或上下文另外要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组应当被认为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一者和多者(即一者或多者)。
除非另有说明，否则本公开使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、固相和液体核酸合成、溶液中的肽合成、固相肽合成、免疫学、细胞培养和配制的常规技术进行无需过度实验。此类程序在例如以下文献中有所描述：Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NewYork，第二版(1989)，第I、II和III卷全部；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)，IRL Press，Oxford，全文；Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach(M.J.Gait编辑，1984)IRL Press，Oxford，全文，并且特别是其中Gait的论文，第1-22页；Atkinson等人，第35-81页；Sproat等人，第83-115页；和Wu等人，第135-151页；4.Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1985)IRL Press，Oxford，全文；Immobilized Cells and Enzymes：A PracticalApproach(1986)IRL Press，Oxford，全文；Perbal，B.，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)，整个系列；J.F.Ramalho Ortigao，“The Chemistry of Peptide Synthesis”，Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva，Germany)；Sakakibara，D.，Teichman，J.，Lien，E.Land Fenichel，R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield，R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154；Barany，G.和Merrifield，R.B.(1979)，The Peptides(Gross，E.和Meienhofer，第3版)，第2卷，第1-284页，Academic Press，New York.12.Wiinsch，E.编辑(1974)Synthese vonPeptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Muler，E.编辑)，第15卷，第4版，第1和2部分，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.和Bodanszky，A.(1984)ThePractice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474；Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture：Practical Approach，第三版(John R.W.Masters编辑，2000)；这些参考文献中的每一篇全文以引入方式并入本文。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises或comprising)”的变型将被理解为暗示包括所述步骤或元件或整体、或步骤或元件或整体的组，但不排除任何其他步骤或元件或整体、或元件或整体的组。
本文所提及的所有专利申请、专利和印刷出版物均全文以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明全文以引用方式并入。并且，本文所引用的所有专利申请、专利和印刷出版物均全文以引用方式并入本文，除非有任何定义、主题放弃或否认，并且除非所并入的材料与本文的明确公开内容不一致，在这种情况下，以本公开内容中的语言为准。
野生型U1-漏斗网蛛毒素和TVP
“流浪蜘蛛”(流浪汉蜘蛛，以前称为Tegenaria agrestis)是漏斗网蛛科蜘蛛成员的有毒蜘蛛，或漏斗网蜘蛛。参见Ingale A，Antigenic epitopes prediction and MHCbinder of a paralytic insecticidal toxin(ITX-1)of Tegenaria agrestis(hobospider).2010年8月4日第2010：2卷第97-103页。流浪蜘蛛的毒液被认为具有杀昆虫活性。参见Johnson等人.Novel insecticidal peptides from Tegenaria agrestis spidervenom may have a direct effect on the insect central nervous system.ArchInsect Biochem Physiol.1998；38(1)：19-31；Klint等人，Production of RecombinantDisulfide-Rich Venom Peptides for Structural and Functional Analysis viaExpression in the Periplasm of E.coli.PLoS One.2013；8(5)：e63865。
流浪蜘蛛以及漏斗网蛛科中的几种其他蜘蛛产生含有漏斗网蛛毒素的毒液，其表现出杀昆虫活性。漏斗网蛛毒素是一组化学上不同的毒素，其可根据目标物种诱导各种杀昆虫作用；例如，漏斗网蛛毒素在鞘翅目、鳞翅目和双翅目中引起慢发性痉挛性麻痹；增加家蝇(Musca domestica)的中枢神经系统(CNS)中神经元放电的速率；并且对其他昆虫(例如，丽蝇、铜绿螟)是致死性的。因此，漏斗网蛛毒素涉及靶向CNS。参见Undheim等人，Weaponization of a hormone：convergent recruitment of hyperglycemic hormoneinto the venom of arthropod predators.Structure 23：1283-1292，以及Johnson等人，Novel insecticidal peptides from Tegenaria agrestis spider venom may have adirect effect on the insect central nervous system.Arch.InsectBiochem.Physiol.38：19-31(1998)。
两种类型的漏斗网蛛毒素包括U1-漏斗网蛛毒素-Ta1a和U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b，它们都是螺旋形节肢动物神经肽源性(HAND)毒素家族的成员。除了蜘蛛之外，这些毒素也可在蜈蚣的毒液中发现。漏斗网蛛毒素是古老的蜕皮动物激素家族即离子转运肽/甲壳动物高血糖激素(ITP/cHH)家族的进化分支。参见Undheim等人，Weaponization of ahormone：convergent recruitment of hyperglycemic hormone into the venom ofarthropod predators.Structure 23：1283-1292，以及Johnson等人，Novel insecticidalpeptides from Tegenaria agrestis spider venom may have a direct effect on theinsect central nervous system.Arch.Insect Biochem.Physiol.38：19-31(1998)。
流浪蜘蛛源性U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b毒素具有完整氨基酸序列“MKLQLMICLVLLPCFFCEPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG”(SEQ ID NO：48)，其包括来自氨基酸位置1-17的信号肽和来自位置18-68的成熟毒素。同上。该蛋白质包含四个紧密包装的α-螺旋且不存在β-链，并且成熟毒素的分子量为5700.39道尔顿(Da)。同上。
提供了来自流浪汉蜘蛛的示例性成熟野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多肽，其具有氨基酸序列：“EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG”(SEQ ID NO：1)。
在蛋白质加工期间，成熟的野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b毒素经历C端甘氨酸的切除事件，得到以下氨基酸序列：EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQK(SEQ ID NO：60)。随后的翻译后事件产生具有C端酰胺化的成熟野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b毒素。
U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)是在一些方面不同于野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b(SEQ ID NO：1)的突变体或变体，例如，在一些实施方案中，这种变异可以是氨基酸取代、缺失或添加；或导致氨基酸取代、缺失或添加的编码野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的多核苷酸的改变。该变异的结果是非天然存在的多肽和/或编码该多肽的多核苷酸序列，其相对于野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b具有增强的针对一种或多种昆虫种的杀昆虫活性。
在一些实施方案中，TVP可具有根据SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110的氨基酸序列，如表1所示。
表1.本发明的TVP。
Figure BDA0003998753650000431
Figure BDA0003998753650000441
Figure BDA0003998753650000451
Figure BDA0003998753650000461
Figure BDA0003998753650000471
Figure BDA0003998753650000481
Figure BDA0003998753650000491
Figure BDA0003998753650000501
Figure BDA0003998753650000511
Figure BDA0003998753650000521
Figure BDA0003998753650000531
Figure BDA0003998753650000541
Figure BDA0003998753650000551
Figure BDA0003998753650000561
Figure BDA0003998753650000571
在一些实施方案中，多核苷酸序列可操作以编码具有根据SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110的氨基酸序列的TVP，其可操作以编码TVP。例如，在一些实施方案中，如表2所示的多核苷酸可操作以编码TVP。
表2.本发明的多核苷酸。
Figure BDA0003998753650000572
Figure BDA0003998753650000581
Figure BDA0003998753650000591
Figure BDA0003998753650000601
Figure BDA0003998753650000611
Figure BDA0003998753650000621
Figure BDA0003998753650000631
Figure BDA0003998753650000641
Figure BDA0003998753650000651
Figure BDA0003998753650000661
Figure BDA0003998753650000671
Figure BDA0003998753650000681
在一些实施方案中，TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含一个或多个突变。例如，在一些实施方案中，TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列可具有第一突变、第二突变或第三突变。
在一些实施方案中，TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列可具有第一突变，其中该第一突变为R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P或T43A的氨基酸取代。
在一些实施方案中，TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列可具有第一突变和第二突变，例如R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG或T43AΔG；其中该第一突变为R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N或T11P的氨基酸取代；并且其中该第二突变为C端甘氨酸的缺失。
在一些实施方案中，TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列可具有第一突变和第二突变，例如R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A或T11PT43A；其中该第一突变是R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N或T11P的氨基酸取代；并且其中该第二突变为导致未糖基化的TVP的T43A氨基酸取代。
在一些实施方案中，TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列可具有第一突变、第二突变和第三突变，例如R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG或T11PT43AΔG；其中该第一突变为R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N或T11P的氨基酸取代；并且其中该第二突变为导致未糖基化的TVP的T43A氨基酸取代；并且其中该第三突变为C端甘氨酸的缺失。
在一些优选的实施方案中，TVP可以是TVP-R9Q/T43A(SEQ ID NO：51)。
在各种实施方案中，编码TVP的多核苷酸可用于转化植物细胞、酵母细胞或者细菌细胞。在一些实施方案中，杀昆虫TVP转基因蛋白可以配制成可以以本领域技术人员已知的任何方式喷洒或以其他方式施用于植物表面或其部分的组合物。因此，本文提供了可操作以在适当条件下在宿主细胞(例如，植物细胞)中编码一种或多种TVP的DNA构建体。用于控制植物细胞由寄生昆虫引起的有害生物感染的方法包括通过重组技术向植物、植物组织或植物细胞施用或引入编码如本文所述的TVP的多核苷酸，以及在暴露于有害生物的田间使所述重组改变的植物、植物组织或植物细胞生长。另选地，可将TVP配制成由TVP和赋形剂组成的可喷洒组合物，并通过直接施用来直接施用于易感植物，使得TVP在被感染性昆虫摄取后产生有害作用。
在一些实施方案中，TVP可具有SEQ ID NO：2-15、49-53和77-110中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，TVP可包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TVP可包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TVP可包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG”(SEQID NO：51)。
在一些实施方案中，TVP可由多核苷酸编码。例如，在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该TVP相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包括这样的多核苷酸，其中TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包括这样的多核苷酸，其中TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包括这样的多核苷酸，其中TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包括这样的多核苷酸，其中TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包含这样的多核苷酸，其中TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包含这样的多核苷酸，其中该多核苷酸序列具有如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的序列，或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可包含这样的多核苷酸，其中如果Z1为T或S，则TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可编码具有与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP。
在一些实施方案中，载体可包含可操作以编码TVP的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体可包含可操作以编码TVP的多核苷酸，该TVP具有与如SEQID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的序列具有90％相似性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，载体可包含具有如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的多核苷酸。
示例性TVP
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP在X1、X2、X3、X4或X5处具有一个氨基酸取代，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP在X1、X2、X3、X4或X5处具有一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP在X1、X2、X3、X4或X5处具有一个氨基酸取代；并且其中X7不存在，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP在X1、X2、X3、X4或X5处具有一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP包含如SEQ IDNO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP还包含两个或更多个TVP的均聚物或杂聚物，其中每个TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP为包含由可切割的或不可切割的接头分开的两个或更多个TVP的融合蛋白，并且其中每个TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中该TVP为包含由可切割的或不可切割的接头分开的两个或更多个TVP的融合蛋白，并且其中每个TVP的氨基酸序列可相同或不同，并且其中该接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中如果Z1为T或S，则TVP是糖基化的，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与氨基酸序列“EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG”(SEQ ID NO：51)具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中如果Z1为T，则TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐，其中X1为Q；并且Z1为A。
在一些实施方案中，杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)可以是包含与如SEQ ID NO：2、49或51任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP，或其药学上可接受的盐。
TVP-杀昆虫蛋白
TVP-杀昆虫蛋白是由以下组成的任何蛋白质、肽、多肽、氨基酸序列、构型或排列：(1)至少一种TVP、或两种或更多种TVP；和(2)另外的非毒素肽、多肽或蛋白质，其例如在一些实施方案中具有进行以下的能力：当昆虫暴露于TVP-杀昆虫蛋白时，相对于单独的TVP，增加昆虫的死亡率和/或抑制昆虫的生长；例如在宿主细胞或表达系统中增加所述TVP-杀昆虫蛋白的表达；和/或影响该TVP-杀昆虫蛋白的翻译后加工。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种TVP的聚合物。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种TVP的聚合物，其中TVP经由接头肽(例如可切割的和/或不可切割的接头)可操作地连接。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可指与一种或多种蛋白质诸如稳定结构域(STA)、内质网信号传导蛋白(ERSP)、昆虫可切割或昆虫不可切割的接头(L)和/或它们的任何其他组合可操作地连接的一种或多种TVP。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可以是非天然存在的蛋白，其包含(1)野生型Ta1b蛋白；和(2)另外的肽、多肽或蛋白质(例如，ERSP)、接头、STA、UBI或组氨酸标签或类似标记物。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含见于表1的一种或多种TVP，例如SEQID NO：2-15、49-53和77-110。在一些实施方案中，杀昆虫蛋白可包含TVP均聚物，例如相同TVP的两种或更多种TVP单体。在一些实施方案中，杀昆虫蛋白可包含TVP杂聚物，例如两种或更多种TVP单体，其中TVP单体不同。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的均聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同。例如，在一些实施方案中，TVP可具有一种相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG的氨基酸取代的多肽，其与包含具有相同氨基酸取代的相同TVP中的一者或多者的另一种多肽连接：即相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列具有R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG的氨基酸取代
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。例如，在一些实施方案中，TVP可具有一种相对于如SEQ IDNO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG的氨基酸取代的多肽；其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。例如，在一些实施方案中，TVP可具有一种相对于如SEQ IDNO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R9Q的氨基酸取代的多肽；其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R9QΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含K18A氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含K18AΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R38A氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R38AΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含A8N氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含A8NΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含A8S氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含A8SΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R9N氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含R9NΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含T11P氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含T11PΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含T43A氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含T43AΔG氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含RQ9/T43A的氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含两种或更多种TVP的杂聚物，其中每种TVP的氨基酸是不同的，例如，一种多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含RQ9/T43A氨基酸取代，其与相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含以下氨基酸取代中的一者或多者的另一种多肽连接：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A、T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG、T11PT43AΔG和/或它们的任何组合。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含融合蛋白，该融合蛋白包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP，并且其中每个TVP的氨基酸序列可相同或不同。例如，在一些实施方案中，第一TVP聚合物可相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列具有R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A或T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG和/或T11PT43AΔG的氨基酸取代；其与可相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列具有以下氨基酸取代的第二TVP聚合物融合：R9Q、K18A、R38A、A8N、A8S、R9N、T11P、T43A、R9QΔG、K18AΔG、R38AΔG、A8NΔG、A8SΔG、R9NΔG、T11PΔG、T43AΔG、R9QT43A、K18AT43A、R38AT43A、A8NT43A、A8ST43A、R9NT43A或T11PT43A、R9QT43AΔG、K18AT43AΔG、R38AT43AΔG、A8NT43AΔG、A8ST43AΔG、R9NT43AΔG和/或T11PT43AΔG.
在一些实施方案中，杀昆虫蛋白可包含融合蛋白，该融合蛋白包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同，其中该接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。用于生成可切割和不可切割接头的示例性方法可见于美国专利申请号15/727,277和PCT申请号PCT/US2013/030042，该专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含一种或多种具有SEQ ID NO：2-15、49-53和77-110的氨基酸序列的TVP。在一些实施方案中，TVP可包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含一种或多种具有SEQ ID NO：2-15、49-53和77-110的氨基酸序列的TVP。在一些实施方案中，TVP可包含与“EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG”(SEQ ID NO：51)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
用于产生TVP的方法
产生蛋白质的方法是本领域公知的，并且有多种技术可用。例如，在一些实施方案中，可使用重组方法或化学合成来产生蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的TVP可使用任何已知的用于产生蛋白质的方法来产生。例如，在一些实施方案中，并且非限制性地，TVP可以使用重组表达系统诸如酵母表达系统或细菌表达系统来产生。然而，本领域普通技术人员将认识到其他蛋白质生产方法也是可用的。
在一些实施方案中，本发明提供了使用重组表达系统产生TVP的方法。
在一些实施方案中，本发明包括产生TVP的方法、基本上由其组成或由其组成，所述方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成，(b)将该载体引入宿主细胞例如细菌或酵母、或昆虫、或植物细胞、或动物细胞中；和(c)使酵母菌株在可操作以使TVP能够表达并分泌到生长培养基中的条件下在生长培养基中生长。在一些相关的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。
本发明在多种宿主细胞(参见下面的宿主细胞部分)中都是可行的。实际上，本发明的最终使用者可在他或她选择的任何宿主细胞中实践其教导。因此，在一些实施方案中，宿主细胞可以是满足最终使用者要求的任何宿主细胞；即，在一些实施方案中，TVP的表达可使用多种宿主细胞并且依照本文的教导来实现。例如，在一些实施方案中，使用者可能希望使用一种特定类型的宿主细胞(例如，酵母细胞或细菌细胞)而不是另一种；给定宿主细胞的优选范围可从可用性到成本。
例如，在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明包括产生TVP的方法、基本上由其组成或由其组成，所述方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成，(b)将该载体引入宿主细胞例如细菌或酵母、或昆虫、或植物细胞、或动物细胞中；和(c)使酵母菌株在可操作以使TVP能够表达并分泌到生长培养基中的条件下在生长培养基中生长。在一些相关的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。
分离并突变野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b
TVP可通过在野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多核苷酸序列中产生突变而获得；将该U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸(tvp)序列插入合适的载体中；以表达编码TVP的多核苷酸的方式转化宿主生物体；培养该宿主生物以生成期望量的TVP；然后从宿主生物体中和/或周围纯化TVP。
在野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多核苷酸序列中产生突变可通过本领域普通技术人员公知的各种方法实现。诱变方法包括Kunkel方法；盒式诱变；PCR定点诱变；“完美谋杀(perfect murder)”技术(delitto perfetto)；利用PCR和一个可再循环标记物的直接基因缺失和位点特异性诱变；利用PCR和一个可再循环标记物使用长同源区的直接基因缺失和位点特异性诱变；移位“pop-in pop-out”方法；和CRISPR-Cas 9。定点诱变的示例性方法可见于Ruvkun&Ausubel，A general method for site-directed mutagenesis inprokaryotes.Nature.1981年1月1日；289(5793)：85-8；Wallace等人，Oligonucleotidedirected mutagenesis of the human beta-globin gene：a general method forproducing specific point mutations in cloned DNA.Nucleic Acids Res.1981年8月11日；9(15)：3647-56；Dalbadie-McFarland等人，Oligonucleotide-directedmutagenesis as a general and powerful method for studies of proteinfunction.Proc Natl Acad Sci U S A.1982年11月；79(21)：6409-13；Bachman.Site-directed mutagenesis.Methods Enzymol.2013；529：241-8；Carey等人，PCR-mediatedsite-directed mutagenesis.Cold Spring Harb Protoc.2013年8月1日；2013(8)：738-42；以及Cong等人，Multiplex genome engineering using CRISPR/Cassystems.Science.2013 Feb 15；339(6121)：819-23，前述所有参考文献的公开内容全文以引入方式并入本文。
野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b毒素可分离自蜘蛛毒液。蜘蛛毒液可以使用本领域普通技术人员已知的任何技术从蜘蛛(例如，蜘蛛诸如流浪汉蜘蛛)的毒液腺分离。例如，在一些实施方案中，毒液可根据美国专利号5,688,764中描述的方法从蜘蛛中分离，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多核苷酸序列可通过使用针对U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多核苷酸序列的引物探针筛选基因组文库而获得。另选地，野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多核苷酸序列和/或TVP多核苷酸序列可化学合成。例如，可使用寡核苷酸合成方法诸如亚磷酰胺、三酯、亚磷酸酯或H-膦酸酯方法生成野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b多核苷酸序列和/或TVP多核苷酸序列(参见Engels，J.W.和Uhlmann，E.(1989)，Gene Synthesis[NewSynthetic Methods(77)].Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-734，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。
化学合成TVP多核苷酸
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸序列可使用可商购获得的多核苷酸合成服务诸如由
Figure BDA0003998753650000951
(例如，TurboGENETM、PriorityGENE和FragmentGENE)或SIGMA-
Figure BDA0003998753650000952
(例如，定制DNA和RNA寡聚物设计和订购定制DNA寡聚物)提供的那些进行化学合成。用于生成DNA和/或定制的化学合成多核苷酸的示例性方法是本领域公知的，并且在1995年2月13日提交的美国专利号5,736,135、序列号08/389,615中示例性地提供，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。还参见Agarwal等人，Chemical synthesis ofpolynucleotides.Angew Chem Int Ed Engl.1972Jun；11(6)：451-9；Ohtsuka等人，Recentdevelopments in the chemical synthesis of polynucleotides.Nucleic Acids Res.，1982年11月11日；10(21)：6553-6570：Sondek&Shortle.A general strategy for randominsertion and substitution mutagenesis：substoichiometric coupling oftrinucleotide phosphoramidites.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Apr 15；89(8)：3581-3585；Beaucage S.L.等人，Advances in the Synthesis of Oligonucleotides bythe Phosphoramidite Approach.Tetrahedron，Elsevier science Publishers，Amsterdam，NL，第48卷，第12期，1992年，第2223-2311页；Agrawal(1993)Protocols forOligonucleotides and Analogs：Synthesis and Properties；Methods in MolecularBiology，第20卷，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
化学合成多核苷酸允许生成这样的DNA序列，其基于所述序列内核苷酸的排列(即，胞嘧啶[C]、鸟嘌呤[G]、腺嘌呤[A]或胸腺嘧啶[T]分子的排列)被定制以产生期望的多肽；从化学合成的DNA多核苷酸转录的mRNA序列可被翻译成氨基酸序列，每个氨基酸对应于mRNA序列中的密码子。因此，从mRNA序列翻译的多肽链的氨基酸组成可通过改变决定20种氨基酸中的哪一种将被添加到生长中的多肽中的潜在密码子来改变；因此，DNA中的突变诸如插入、取代、缺失和移码可引起氨基酸插入、取代或缺失，这取决于潜在的密码子。
从化学合成的DNA多核苷酸序列和/或通过诱变而改变的野生型DNA多核苷酸序列获得TVP可通过将DNA序列克隆到合适的载体中来实现。存在本领域普通技术人员已知的多种可用的表达载体、宿主生物体和克隆策略。例如，载体可以是质粒，其可将异源基因和/或表达盒引入酵母细胞中以进行转录和翻译。术语“载体”用于指载剂核酸分子，核酸序列可插入其中以引入细胞，在细胞中其可被复制。载体可含有“载体元件”，诸如复制起点(ORI)；赋予抗生素抗性以允许进行选择的基因；多克隆位点；启动子区；用于非细菌转染的选择标记物；和引物结合位点。核酸序列可以是“外源的”，这意味着它对于载体所引入的细胞是外源的，或者该序列与细胞中的序列同源，但在宿主细胞核酸中通常没有发现该序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员可通过标准重组技术很好地构建载体，这些标准重组技术描述于Sambrook等人，1989和Ausubel等人，1996，二者均以引用方式并入。除了编码Ta1b变体多核苷酸之外，载体可编码靶向分子。靶向分子是将期望核酸导向特定组织、细胞或其他部位的分子。
载体和转化
在一些实施方案中，可使用多种克隆策略以及本领域普通技术人员容易获得的商业克隆试剂盒和材料将TVP多核苷酸克隆到载体中。例如，可使用诸如SnapFast、Gateway、TOPO、Gibson、LIC、InFusionHD或Electra策略的策略将TVP多核苷酸克隆到载体中。有许多可商购获得的载体可用于产生TVP。例如，TVP多核苷酸可使用聚合酶链式反应(PCR)生成，并在室温下与pCRTMII-TOPO载体或PCRTM2.1-
Figure BDA0003998753650000971
载体(作为
Figure BDA0003998753650000972
TA
Figure BDA0003998753650000973
试剂盒可从Invitrogen商购获得)组合5分钟；然后可将
Figure BDA0003998753650000974
反应物转化到感受态细胞中，随后可基于颜色变化选择感受态细胞(参见Janke等人，A versatile toolbox forPCR-based tagging of yeast genes：new fluorescent proteins，more markers andpromoter substitution cassettes.Yeast.2004年8月；21(11)：947-62；还参见Adams等人Methods in Yeast Genetics.Cold Spring Harbor，NY，1997，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可被克隆到载体诸如质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和/或人工染色体(例如YAC)中。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可以通过进行以下操作插入到载体中，例如，使用大肠杆菌作为宿主的质粒载体中：使用允许插入目的DNA区段所必需的限制酶消化约2至5μg载体DNA，随后温育过夜以实现完全消化(碱性磷酸酶可用于使5′-末端去磷酸化以避免自连接/再环化)；凝胶纯化消化的载体。接着，通过PCR扩增目的DNA区段，例如编码TVP的多核苷酸，并使用本领域普通技术人员已知的技术(例如，通过使用PCR纯化试剂盒)从PCR反应中去除任何过量的酶、引物、未并入的dNTP、短效PCR产物和/或盐。通过产生包含以下的混合物将目的DNA区段与载体连接：约20ng载体；约100至1,000ng目的DNA区段；2μL10x缓冲液(即，30mM Tris-HCl 4mM MgCl2，26μM NAD，1mM DTT，50μg/ml BSA，pH 8，储存在25℃下)；1μL T4 DNA连接酶；通过添加H2O使全部达到20μL的总体积。然后，可将连接反应混合物在室温下温育2小时，或在16℃温育过夜。然后，可例如通过使用电穿孔或化学方法将连接反应物(即，约1μL)转化到感受态细胞，然后可进行菌落PCR以鉴定含有目的DNA区段的载体。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸，连同一起组成TVP表达ORF的其他DNA区段可被设计用于从宿主酵母细胞分泌。设计TVP表达ORF的示例性方法如下：ORF可从信号肽序列开始，接着是编码Kex2切割位点(赖氨酸-精氨酸)的DNA序列，随后是TVP多核苷酸转基因，在5′-末端添加甘氨酸-丝氨酸密码子，最后在3′-末端添加终止密码子。然后，所有这些元件将在酵母细胞中作为单个开放阅读框(ORF)表达为融合肽。α-交配因子(αMF)信号序列最常用于促进重组杀昆虫肽通过重组酵母的内源分泌途径的代谢加工，即所表达的融合肽通常将进入内质网，其中α-交配因子信号序列通过信号肽酶活性被去除，然后将得到的前-杀昆虫肽运输至高尔基体，在其中上述赖氨酸-精氨酸二肽被Kex2内切蛋白酶完全去除，之后成熟多肽(即TVP)从细胞中分泌出来。
在一些实施方案中，重组酵母细胞中的多肽表达水平可通过基于特定宿主酵母种优化密码子来增强。在给定宿主生物体的内源开放阅读框中观察到的密码子的天然存在频率不必为了高效表达而优化。此外，不同的酵母种(例如，乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母等)具有不同的用于高效表达的最佳密码子。因此，应该考虑对TVP表达ORF进行密码子优化，包括编码信号序列、Kex2切割位点和TVP的序列元件，因为它们最初在重组酵母细胞中被翻译为一种融合肽。
在一些实施方案中，可将密码子优化的TVP表达ORF连接到酵母特异性表达载体中用于酵母表达。有许多表达载体可用于酵母表达，包括附加型载体和整合型载体，并且它们通常是为特定酵母菌株设计的。应根据用于肽生产的特定酵母表达系统仔细选择合适的表达载体。在一些实施方案中，可使用整合型载体，其整合到转化的酵母细胞的染色体中并在细胞分裂和增殖的循环中保持稳定。整合型DNA序列与转化的酵母种中的靶向基因组DNA基因座同源，并且此类整合型序列包括pLAC4、25S rDNA、pAOX1和TRP2等。杀昆虫肽转基因的位置可与整合型DNA序列(插入载体)相邻或在整合型DNA序列(置换载体)内。
在一些实施方案中，表达载体可含有用于在大肠杆菌中制备DNA的大肠杆菌元件，例如大肠杆菌复制起点、抗生素选择标记物等。在一些实施方案中，载体可含有表达目的转基因所需的序列元件的阵列，例如转录启动子、终止子、酵母选择标记物、与宿主酵母DNA同源的整合型DNA序列等。有许多合适的可用酵母启动子，包括天然和工程化启动子，例如酵母启动子诸如pLAC4、pAOX1、pUPP、pADH1、pTEF、pGal1等和其他，可用于一些实施方案中。
在一些实施方案中，可使用选择方法诸如乙酰胺原养型选择、Zeocin抗性选择、遗传霉素抗性选择、诺尔丝菌素抗性选择、尿嘧啶缺陷型选择和/或其他选择方法。例如，在一些实施方案中，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS基因可用作选择性标记物。使用选择性标记物的示例性方法可见于美国专利号6,548,285(1997年4月3日提交)、6,165,715(1998年6月22日提交)和6,110,707(1997年1月17日提交)，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸可插入pKLAC1质粒中。pKLAC1可从NewEngland
Figure BDA0003998753650001002
Inc.(项目编号(NEB#E1000)商购获得。pKLAC1被设计为实现重组蛋白(例如，TVP)在酵母乳酸克鲁维酵母中的高水平表达。pKLAC1质粒可单独订购，或作为乳酸克鲁维酵母蛋白表达试剂盒的一部分订购。pKLAC1质粒可使用SacII或BstXI限制酶线性化，并且具有αMF分泌信号的MCS下游。αMF分泌信号将重组蛋白导向分泌途径，然后其随后经由Kex2切割，产生目的肽，例如TVP。Kex2是钙依赖性丝氨酸蛋白酶，其参与激活分泌途径的前蛋白，并且是可商购获得的(
Figure BDA0003998753650001003
项目编号450-45)。
在一些实施方案中，可将编码TVP的多核苷酸插入到pKlacl质粒中，或亚克隆到pKlac1质粒中，随后选择用与编码TVP的多核苷酸连接的pKLAC1质粒转化的酵母菌落。用与编码TVP的多核苷酸连接的pKLAC1质粒转化的酵母，例如乳酸克鲁维酵母，可基于乙酰胺酶(amdS)进行选择，乙酰胺酶允许转化的酵母细胞在含有乙酰胺作为唯一氮源的YCB培养基中生长。一旦鉴定了用与编码TVP的多核苷酸连接的pKLAC1质粒转化的阳性酵母菌落。
在一些实施方案中，可将编码TVP的多核苷酸插入到本领域技术人员容易获得的其他可商购获得的质粒和/或载体中，例如，质粒可获自Addgene(非营利质粒储库)、
Figure BDA0003998753650001001
和PromegaTM。
在一些实施方案中，用一种或多种TVP表达盒转化的酵母细胞可在酵母培养物中产生TVP，其产率为每升培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L 200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的TVP。
在一些实施方案中，可将包含可操作以表达TVP的多核苷酸的一个或多个表达盒插入载体中，得到的产率范围为每升培养基(酵母发酵液的上清液)约100mg/L的TVP至约100,000mg/L、约110mg/L至约100,000mg/L、约120mg/L至约100,000mg/L、约130mg/L至约100,000mg/L、约140mg/L至约100,000mg/L、约150mg/L至约100,000mg/L、约160mg/L至约100,000mg/L、约170mg/L至约100,000mg/L、约180mg/L至约100,000mg/L、约190mg/L至约100,000mg/L、约200mg/L至约100,000mg/L、约250mg/L至约100,000mg/L、约500mg/L至约100,000mg/L、约750mg/L至约100,000mg/L、约1000mg/L至约100,000mg/L、约1000mg/L至约100,000mg/L、约1500mg/L至约100,000mg/L、约2000mg/L至约100,000mg/L、约2500mg/L至约100,000mg/L、约3000mg/L至约100,000mg/L、约3500mg/L至约100,000mg/L、约4000mg/L至约100,000mg/L、约4500mg/L至约100,000mg/L、约5000mg/L至约100,000mg/L、约5500mg/L至约100,000mg/L、约6000mg/L至约100,000mg/L、约6500mg/L至约100,000mg/L、约7000mg/L至约100,000mg/L、约7500mg/L至约100,000mg/L、约8000mg/L至约100,000mg/L、约8500mg/L至约100,000mg/L、约9000mg/L至约100,000mg/L、约9500mg/L至约100,000mg/L、约10000mg/L至约100,000mg/L、约10500mg/L至约100,000mg/L、约11000mg/L至约100,000mg/L、约11500mg/L至约100,000mg/L、约12000mg/L至约100,000mg/L、约12500mg/L至约100,000mg/L、约13000mg/L至约100,000mg/L、约13500mg/L至约100,000mg/L、约14000mg/L至约100,000mg/L、约14500mg/L至约100,000mg/L、约15000mg/L至约100,000mg/L、约15500mg/L至约100,000mg/L、约16000mg/L至约100,000mg/L、约16500mg/L至约100,000mg/L、约17000mg/L至约100,000mg/L、约17500mg/L至约100,000mg/L、约18000mg/L至约100,000mg/L、约18500mg/L至约100,000mg/L、约19000mg/L至约100,000mg/L、约19500mg/L至约100,000mg/L、约20000mg/L至约100,000mg/L、约20500mg/L至约100,000mg/L、约21000mg/L至约100,000mg/L、约21500mg/L至约100,000mg/L、约22000mg/L至约100,000mg/L、约22500mg/L至约100,000mg/L、约23000mg/L至约100,000mg/L、约23500mg/L至约100,000mg/L、约24000mg/L至约100,000mg/L、约24500mg/L至约100,000mg/L、约25000mg/L至约100,000mg/L、约25500mg/L至约100,000mg/L、约26000mg/L至约100,000mg/L、约26500mg/L至约100,000mg/L、约27000mg/L至约100,000mg/L、约27500mg/L至约100,000mg/L、约28000mg/L至约100,000mg/L、约28500mg/L至约100,000mg/L、约29000mg/L至约100,000mg/L、约29500mg/L至约100,000mg/L、约30000mg/L至约100,000mg/L、约30500mg/L至约100,000mg/L、约31000mg/L至约100,000mg/L、约31500mg/L至约100,000mg/L、约32000mg/L至约100,000mg/L、约32500mg/L至约100,000mg/L、约33000mg/L至约100,000mg/L、约33500mg/L至约100,000mg/L、约34000mg/L至约100,000mg/L、约34500mg/L至约100,000mg/L、约35000mg/L至约100,000mg/L、约35500mg/L至约100,000mg/L、约36000mg/L至约100,000mg/L、约36500mg/L至约100,000mg/L、约37000mg/L至约100,000mg/L、约37500mg/L至约100,000mg/L、约38000mg/L至约100,000mg/L、约38500mg/L至约100,000mg/L、约39000mg/L至约100,000mg/L、约39500mg/L至约100,000mg/L、约40000mg/L至约100,000mg/L、约40500mg/L至约100,000mg/L、约41000mg/L至约100,000mg/L、约41500mg/L至约100,000mg/L、约42000mg/L至约100,000mg/L、约42500mg/L至约100,000mg/L、约43000mg/L至约100,000mg/L、约43500mg/L至约100,000mg/L、约44000mg/L至约100,000mg/L、约44500mg/L至约100,000mg/L、约45000mg/L至约100,000mg/L、约45500mg/L至约100,000mg/L、约46000mg/L至约100,000mg/L、约46500mg/L至约100,000mg/L、约47000mg/L至约100,000mg/L、约47500mg/L至约100,000mg/L、约48000mg/L至约100,000mg/L、约48500mg/L至约100,000mg/L、约49000mg/L至约100,000mg/L、约49500mg/L至约100,000mg/L、约50000mg/L至约100,000mg/L、约50500mg/L至约100,000mg/L、约51000mg/L至约100,000mg/L、约51500mg/L至约100,000mg/L、约52000mg/L至约100,000mg/L、约52500mg/L至约100,000mg/L、约53000mg/L至约100,000mg/L、约53500mg/L至约100,000mg/L、约54000mg/L至约100,000mg/L、约54500mg/L至约100,000mg/L、约55000mg/L至约100,000mg/L、约55500mg/L至约100,000mg/L、约56000mg/L至约100,000mg/L、约56500mg/L至约100,000mg/L、约57000mg/L至约100,000mg/L、约57500mg/L至约100,000mg/L、约58000mg/L至约100,000mg/L、约58500mg/L至约100,000mg/L、约59000mg/L至约100,000mg/L、约59500mg/L至约100,000mg/L、约60000mg/L至约100,000mg/L、约60500mg/L至约100,000mg/L、约61000mg/L至约100,000mg/L、约61500mg/L至约100,000mg/L、约62000mg/L至约100,000mg/L、约62500mg/L至约100,000mg/L、约63000mg/L至约100,000mg/L、约63500mg/L至约100,000mg/L、约64000mg/L至约100,000mg/L、约64500mg/L至约100,000mg/L、约65000mg/L至约100,000mg/L、约65500mg/L至约100,000mg/L、约66000mg/L至约100,000mg/L、约66500mg/L至约100,000mg/L、约67000mg/L至约100,000mg/L、约67500mg/L至约100,000mg/L、约68000mg/L至约100,000mg/L、约68500mg/L至约100,000mg/L、约69000mg/L至约100,000mg/L、约69500mg/L至约100,000mg/L、约70000mg/L至约100,000mg/L、约70500mg/L至约100,000mg/L、约71000mg/L至约100,000mg/L、约71500mg/L至约100,000mg/L、约72000mg/L至约100,000mg/L、约72500mg/L至约100,000mg/L、约73000mg/L至约100,000mg/L、约73500mg/L至约100,000mg/L、约74000mg/L至约100,000mg/L、约74500mg/L至约100,000mg/L、约75000mg/L至约100,000mg/L、约75500mg/L至约100,000mg/L、约76000mg/L至约100,000mg/L、约76500mg/L至约100,000mg/L、约77000mg/L至约100,000mg/L、约77500mg/L至约100,000mg/L、约78000mg/L至约100,000mg/L、约78500mg/L至约100,000mg/L、约79000mg/L至约100,000mg/L、约79500mg/L至约100,000mg/L、约80000mg/L至约100,000mg/L、约80500mg/L至约100,000mg/L、约81000mg/L至约100,000mg/L、约81500mg/L至约100,000mg/L、约82000mg/L至约100,000mg/L、约82500mg/L至约100,000mg/L、约83000mg/L至约100,000mg/L、约83500mg/L至约100,000mg/L、约84000mg/L至约100,000mg/L、约84500mg/L至约100,000mg/L、约85000mg/L至约100,000mg/L、约85500mg/L至约100,000mg/L、约86000mg/L至约100,000mg/L、约86500mg/L至约100,000mg/L、约87000mg/L至约100,000mg/L、约87500mg/L至约100,000mg/L、约88000mg/L至约100,000mg/L、约88500mg/L至约100,000mg/L、约89000mg/L至约100,000mg/L、约89500mg/L至约100,000mg/L、约90000mg/L至约100,000mg/L、约90500mg/L至约100,000mg/L、约91000mg/L至约100,000mg/L、约91500mg/L至约100,000mg/L、约92000mg/L至约100,000mg/L、约92500mg/L至约100,000mg/L、约93000mg/L至约100,000mg/L、约93500mg/L至约100,000mg/L、约94000mg/L至约100,000mg/L、约94500mg/L至约100,000mg/L、约95000mg/L至约100,000mg/L、约95500mg/L至约100,000mg/L、约96000mg/L至约100,000mg/L、约96500mg/L至约100,000mg/L、约97000mg/L至约100,000mg/L、约97500mg/L至约100,000mg/L、约98000mg/L至约100,000mg/L、约98500mg/L至约100,000mg/L、约99000mg/L至约100,000mg/L或约99500mg/L至约100,000mg/L的TVP。
在一些实施方案中，可将包含可操作以表达TVP的多核苷酸的一个或多个表达盒插入载体中，得到的产率范围为每升培养基(酵母发酵液的上清液)约100mg/L的TVP至约100,000mg/L、约100mg/L至约99500mg/L、约100mg/L至约99000mg/L、约100mg/L至约98500mg/L、约100mg/L至约98000mg/L、约100mg/L至约97500mg/L、约100mg/L至约97000mg/L、约100mg/L至约96500mg/L、约100mg/L至约96000mg/L、约100mg/L至约95500mg/L、约100mg/L至约95000mg/L、约100mg/L至约94500mg/L、约100mg/L至约94000mg/L、约100mg/L至约93500mg/L、约100mg/L至约93000mg/L、约100mg/L至约92500mg/L、约100mg/L至约92000mg/L、约100mg/L至约91500mg/L、约100mg/L至约91000mg/L、约100mg/L至约90500mg/L、约100mg/L至约90000mg/L、约100mg/L至约89500mg/L、约100mg/L至约89000mg/L、约100mg/L至约88500mg/L、约100mg/L至约88000mg/L、约100mg/L至约87500mg/L、约100mg/L至约87000mg/L、约100mg/L至约86500mg/L、约100mg/L至约86000mg/L、约100mg/L至约85500mg/L、约100mg/L至约85000mg/L、约100mg/L至约84500mg/L、约100mg/L至约84000mg/L、约100mg/L至约83500mg/L、约100mg/L至约83000mg/L、约100mg/L至约82500mg/L、约100mg/L至约82000mg/L、约100mg/L至约81500mg/L、约100mg/L至约81000mg/L、约100mg/L至约80500mg/L、约100mg/L至约80000mg/L、约100mg/L至约79500mg/L、约100mg/L至约79000mg/L、约100mg/L至约78500mg/L、约100mg/L至约78000mg/L、约100mg/L至约77500mg/L、约100mg/L至约77000mg/L、约100mg/L至约76500mg/L、约100mg/L至约76000mg/L、约100mg/L至约75500mg/L、约100mg/L至约75000mg/L、约100mg/L至约74500mg/L、约100mg/L至约74000mg/L、约100mg/L至约73500mg/L、约100mg/L至约73000mg/L、约100mg/L至约72500mg/L、约100mg/L至约72000mg/L、约100mg/L至约71500mg/L、约100mg/L至约71000mg/L、约100mg/L至约70500mg/L、约100mg/L至约70000mg/L、约100mg/L至约69500mg/L、约100mg/L至约69000mg/L、约100mg/L至约68500mg/L、约100mg/L至约68000mg/L、约100mg/L至约67500mg/L、约100mg/L至约67000mg/L、约100mg/L至约66500mg/L、约100mg/L至约66000mg/L、约100mg/L至约65500mg/L、约100mg/L至约65000mg/L、约100mg/L至约64500mg/L、约100mg/L至约64000mg/L、约100mg/L至约63500mg/L、约100mg/L至约63000mg/L、约100mg/L至约62500mg/L、约100mg/L至约62000mg/L、约100mg/L至约61500mg/L、约100mg/L至约61000mg/L、约100mg/L至约60500mg/L、约100mg/L至约60000mg/L、约100mg/L至约59500mg/L、约100mg/L至约59000mg/L、约100mg/L至约58500mg/L、约100mg/L至约58000mg/L、约100mg/L至约57500mg/L、约100mg/L至约57000mg/L、约100mg/L至约56500mg/L、约100mg/L至约56000mg/L、约100mg/L至约55500mg/L、约100mg/L至约55000mg/L、约100mg/L至约54500mg/L、约100mg/L至约54000mg/L、约100mg/L至约53500mg/L、约100mg/L至约53000mg/L、约100mg/L至约52500mg/L、约100mg/L至约52000mg/L、约100mg/L至约51500mg/L、约100mg/L至约51000mg/L、约100mg/L至约50500mg/L、约100mg/L至约50000mg/L、约100mg/L至约49500mg/L、约100mg/L至约49000mg/L、约100mg/L至约48500mg/L、约100mg/L至约48000mg/L、约100mg/L至约47500mg/L、约100mg/L至约47000mg/L、约100mg/L至约46500mg/L、约100mg/L至约46000mg/L、约100mg/L至约45500mg/L、约100mg/L至约45000mg/L、约100mg/L至约44500mg/L、约100mg/L至约44000mg/L、约100mg/L至约43500mg/L、约100mg/L至约43000mg/L、约100mg/L至约42500mg/L、约100mg/L至约42000mg/L、约100mg/L至约41500mg/L、约100mg/L至约41000mg/L、约100mg/L至约40500mg/L、约100mg/L至约40000mg/L、约100mg/L至约39500mg/L、约100mg/L至约39000mg/L、约100mg/L至约38500mg/L、约100mg/L至约38000mg/L、约100mg/L至约37500mg/L、约100mg/L至约37000mg/L、约100mg/L至约36500mg/L、约100mg/L至约36000mg/L、约100mg/L至约35500mg/L、约100mg/L至约35000mg/L、约100mg/L至约34500mg/L、约100mg/L至约34000mg/L、约100mg/L至约33500mg/L、约100mg/L至约33000mg/L、约100mg/L至约32500mg/L、约100mg/L至约32000mg/L、约100mg/L至约31500mg/L、约100mg/L至约31000mg/L、约100mg/L至约30500mg/L、约100mg/L至约30000mg/L、约100mg/L至约29500mg/L、约100mg/L至约29000mg/L、约100mg/L至约28500mg/L、约100mg/L至约28000mg/L、约100mg/L至约27500mg/L、约100mg/L至约27000mg/L、约100mg/L至约26500mg/L、约100mg/L至约26000mg/L、约100mg/L至约25500mg/L、约100mg/L至约25000mg/L、约100mg/L至约24500mg/L、约100mg/L至约24000mg/L、约100mg/L至约23500mg/L、约100mg/L至约23000mg/L、约100mg/L至约22500mg/L、约100mg/L至约22000mg/L、约100mg/L至约21500mg/L、约100mg/L至约21000mg/L、约100mg/L至约20500mg/L、约100mg/L至约20000mg/L、约100mg/L至约19500mg/L、约100mg/L至约19000mg/L、约100mg/L至约18500mg/L、约100mg/L至约18000mg/L、约100mg/L至约17500mg/L、约100mg/L至约17000mg/L、约100mg/L至约16500mg/L、约100mg/L至约16000mg/L、约100mg/L至约15500mg/L、约100mg/L至约15000mg/L、约100mg/L至约14500mg/L、约100mg/L至约14000mg/L、约100mg/L至约13500mg/L、约100mg/L至约13000mg/L、约100mg/L至约12500mg/L、约100mg/L至约12000mg/L、约100mg/L至约11500mg/L、约100mg/L至约11000mg/L、约100mg/L至约10500mg/L、约100mg/L至约10000mg/L、约100mg/L至约9500mg/L、约100mg/L至约9000mg/L、约100mg/L至约8500mg/L、约100mg/L至约8000mg/L、约100mg/L至约7500mg/L、约100mg/L至约7000mg/L、约100mg/L至约6500mg/L、约100mg/L至约6000mg/L、约100mg/L至约5500mg/L、约100mg/L至约5000mg/L、约100mg/L至约4500mg/L、约100mg/L至约4000mg/L、约100mg/L至约3500mg/L、约100mg/L至约3000mg/L、约100mg/L至约2500mg/L、约100mg/L至约2000mg/L、约100mg/L至约1500mg/L、约100mg/L至约1000mg/L、约100mg/L至约1000mg/L、约100mg/L至约750mg/L、约100mg/L至约500mg/L、约100mg/L至约250mg/L、约100mg/L至约100mg/L或约100mg/L至约110mg/L的TVP。
除了编码TVP的DNA多核苷酸序列之外，可将被称为调控元件的附加DNA区段克隆到允许外源DNA或转基因的增强表达的载体中；此类附加DNA区段的示例包括(1)启动子、终止子和/或增强子元件；(2)适当的mRNA稳定聚腺苷酸化信号；(3)内部核糖体进入位点(IRES)；(4)内含子；和(5)转录后调控元件。目的DNA区段(例如，tvp)与前述顺式作用元件中的任一种的组合被称为“表达盒”。
单个表达盒可含有前述调控元件中的一者或多者和可操作以表达TVP的多核苷酸。例如，在一些实施方案中，TVP表达盒可包含可操作以表达TVP和α-MF信号的多核苷酸；Kex2位点；LAC4终止子；ADN1启动子；和乙酰胺酶(amdS)选择标记物-在5′末端和3′末端侧接LAC4启动子。
在一些实施方案中，可存在许多克隆到载体中的表达盒。例如，在一些实施方案中，可存在包含可操作以表达TVP的多核苷酸的第一表达盒。在另选的实施方案中，存在两个可操作以编码TVP的表达盒(即双重表达盒)。在其他实施方案中，存在三个可操作以编码TVP的表达盒(即三重表达盒)。
在一些实施方案中，双重表达盒可通过将第二TVP表达盒亚克隆到含有第一TVP表达盒的载体中来生成。
在一些实施方案中，三重表达盒可通过将第三TVP表达盒亚克隆到含有第一TVP表达盒和第二TVP表达盒的载体中来生成。
在一些实施方案中，用一种或多种TVP表达盒转化的酵母细胞可在酵母培养物中产生TVP，其产率为每升酵母培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L 200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的TVP。
在一些实施方案中，可将包含可操作以表达TVP的多核苷酸的一个或多个表达盒插入载体例如pKlac1质粒中，得到约100mg/LTVP(酵母发酵液的上清液)的产率。例如，在一些实施方案中，可将包含可操作以表达TVP的多核苷酸的两个表达盒插入载体例如pKS482质粒中，得到约2g/L TVP(酵母发酵液的上清液)的产率。另选地，在一些实施方案中，可将包含可操作以表达TVP的多核苷酸的三个表达盒插入载体例如pKlac1T质粒中。
在一些实施方案中，可将多个TVP表达盒转染到酵母中，以便能够将优化TVP转基因的一个或多个拷贝整合到乳酸克鲁维酵母基因组中。将多个TVP表达盒引入乳酸克鲁维酵母基因组的示例性方法如下：合成TVP表达盒DNA序列，其包含完整的LAC4启动子元件、密码子优化的TVP表达ORF元件和pLAC4终止子元件；将完整表达盒在pKS477的pLAC4终止子下游的Sal I和Kpn I限制位点之间连接到pKlac1载体中，得到双转基因TVP表达载体pKS482；然后使用Sac II限制性内切核酸酶将双转基因载体pKS482线性化并通过电穿孔转化到乳酸克鲁维酵母的YCT306菌株中。然后使得到的酵母菌落在补充有5mM乙酰胺的YCB琼脂板上生长，其中只有表达乙酰胺酶的细胞可有效地用作氮的代谢源。为了评价酵母菌落，可从pKS482酵母板中挑取约100至400个菌落。将来自菌落的接种物各自在2.2mL的添加了2％糖醇作为碳源的确定成分的乳酸克鲁维酵母培养基中培养。将培养物在23.5℃下温育，以280rpm振荡六天，此时培养物中的细胞密度将达到其最大水平，如600nm处的吸光度(OD600)所示。然后通过以4,000rpm离心10分钟从培养物中去除细胞，并将所得上清液(条件培养基)通过0.2μM膜过滤用于HPLC产率分析。
在一些实施方案中，载体包含可操作以编码TVP的多核苷酸，该TVP具有与如SEQID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的序列具有90％相似性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，载体包含具有如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的氨基序列的多核苷酸或其互补核苷酸序列。
化学合成TVP
可使用肽合成或肽和/或多肽的化学合成来生成TVP：这些方法可由本领域普通技术人员和/或通过使用商业供应商(例如，
Figure BDA0003998753650001101
Piscataway、New Jersey)来进行。例如，在一些实施方案中，化学肽合成可使用液相肽合成(LPPS)或固相肽合成(SPPS)来实现。
在一些实施方案中，肽合成通常可通过使用这样的策略来实现，其中将后续氨基酸的羧基偶联到在先氨基酸的N端生成新生多肽链-这是与自然界中发生的多肽合成类型相反的过程。
肽脱保护是多肽化学合成中重要的第一步。肽脱保护是其中通过使用化学品封闭氨基酸的反应性基团以防止所述氨基酸的官能团参与不希望的或非特异性反应或副反应的过程；换句话讲，氨基酸被“保护”以免参与这些不期望的反应。
在合成肽链之前，氨基酸必须“脱保护”以允许形成链(即，氨基酸结合)。用于保护N端的化学品包括9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)，它们中的每一种可分别经由使用弱碱(例如哌啶)和中强酸(例如三氟乙酸(TFA))去除。
所需的C端保护剂取决于所用化学肽合成策略的类型：例如，LPPS需要保护C端氨基酸，而SPPS不归因于充当保护基团的固体载体。侧链氨基酸需要使用若干不同的保护基团，这些保护基团基于单个肽序列和N端保护策略而变化；然而，典型地，用于侧链氨基酸的保护基团基于叔丁基(tBu)或苄基(Bzl)保护基团。
氨基酸偶联是肽合成程序中的下一步。为了完成氨基酸偶联，必须活化引入的氨基酸的C端羧酸：这可使用碳二亚胺诸如二异丙基碳二亚胺(DIC)或二环己基碳二亚胺(DCC)来实现，其与引入的氨基酸的羧基反应以形成O-酰基异脲中间体。O-酰基异脲中间体随后通过亲核攻击被生长的肽链的N端上的伯氨基置换。由碳二亚胺生成的反应性中间体可导致氨基酸的外消旋化。为了避免氨基酸的外消旋化，添加试剂诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)以与O-酰基异脲中间体反应。可使用的其他偶联剂包括2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)和苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，以及附加的活化碱。最后，在氨基酸脱保护和偶联后，
在合成过程结束时，必须从多肽上去除保护基团-通常通过酸解进行的过程。确定肽切割所需的试剂是所用保护方案和总体合成方法的函数。例如，在一些实施方案中，溴化氢(HBr)、氟化氢(HF)或三氟甲磺酸(TFMSA)可用于切割Bzl和Boc基团。另选地，在其他实施方案中，较弱的酸诸如TFA可实现tBut和Fmoc基团的酸解。最后，可基于肽的生理化学特征(例如电荷、大小、疏水性等)纯化肽。可用于纯化肽的技术包括纯化技术，包括反相色谱法(RPC)、尺寸排阻色谱法、分配色谱法、高效液相色谱法(HPLC)和离子交换色谱法(IEC)。
肽合成的示例性方法可见于Anderson G.W.和McGregor A.C.(1957)T-butyloxycarbonylamino acids and their use in peptide synthesis.Journal of theAmerican Chemical Society.79，6180-3；Carpino L.A.(1957)OxidatiVe reactions ofhydrazines.Iv.Elimination of nitrogen from 1，1-disubstituted-2-arenesulfonhydrazides1-4.Joumal of the American Chemical Society.79，4427-31；McKay F.C.和Albertson N.F.(1957)New amine-masking groups for peptidesynthesis.Joumal of the American Chemical Society.79，4686-90；Merrifield R.B.(1963)Solid phase peptide synthesis.I.The synthesis of a tetrapeptide.Journalof the American Chemical Society.85，2149-54；Carpino L.A.和Han G.Y.(1972)9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group.The Journal of OrganicChemistry.37，3404-9；以及A Lloyd-Williams P.等人(1997)Chemical approaches tothe synthesis ofpeptides and proteins.Boca Raton：CRC Press.278；美国专利号3,714,140(1971年3月16日提交)、4,411,994(1978年6月8日提交)、7,785,832(2006年1月20日提交)、8,314,208(2006年2月10日提交)和10,442,834(2015年10月2日提交)；以及美国专利申请2005/0165215(2004年12月23日提交)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
示例性方法
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体是包含α-MF信号的质粒。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该α-MF信号可操作以表达α-MF信号肽。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体被转化到宿主细胞中。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是酵母细胞。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是选自酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何种的酵母细胞。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP被分泌到生长培养基中。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP被分泌到该生长培养基中，其中该TVP与该α-MF信号肽可操作地连接。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP的表达提供以下产率：每升酵母培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L 200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少12,500mg/L、至少15,000mg/L、至少17,500mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L或至少100,000mg/L的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP的表达提供每升培养基至少100mg/L的TVP的产率。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP在培养基中的表达导致单个TVP在培养基中的表达。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP在培养基中的表达导致包含两种或更多种TVP多肽的TVP融合聚合物在培养基中的表达
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒可操作以编码第一表达盒的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒可操作以编码第一表达盒的TVP或不同表达盒的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该表达盒可操作以编码如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的TVP
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中如果Z1为T，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中X1为Q；并且Z1为A。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体是包含α-MF信号的质粒。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该α-MF信号可操作以表达α-MF信号肽。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体被转化到宿主细胞中。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-ZZ-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是酵母细胞。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是选自酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何种的酵母细胞。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP被分泌到生长培养基中。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP可操作地连接到α-MF信号肽。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP的表达提供以下产率：每升酵母培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L 200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少12,500mg/L、至少15,000mg/L、至少17,500mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L或至少100,000mg/L的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP的表达提供每升培养基至少100mg/L的TVP的产率。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP在培养基中的表达导致单个TVP在培养基中的表达。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP在所述培养基中的表达导致包含两种或更多种TVP多肽的TVP融合聚合物在培养基中的表达
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒可操作以编码第一表达盒的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒可操作以编码第一表达盒的TVP或不同表达盒的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该表达盒可操作以编码如SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的TVP。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中如果Z1为T，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，一种产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；(b)将该载体引入宿主细胞中；以及(c)使宿主细胞在可操作以使TVP能够表达的条件下在生长培养基中生长；其中X1为Q；并且Z1为A。
细胞培养和转化技术
术语“转化”和“转染”均描述了将外源和/或异源DNA或RNA引入宿主生物体的过程。通常，本领域普通技术人员有时保留术语“转化”来描述将外源和/或异源DNA或RNA引入细菌细胞的过程；并保留术语“转染”用于描述将外源和/或异源DNA或RNA引入真核细胞的过程。然而，如本文所用，术语“转化”和“转染”同义使用，无论方法是否描述将外源和/或异源DNA或RNA引入原核生物(例如细菌)或真核生物(例如酵母、植物或动物)中。
在一些实施方案中，可使用以下方法转化宿主细胞：电穿孔；细胞挤压；显微注射；穿刺转染(impalefection)；使用流体静压；声致穿孔；光学转染；连续输注；脂质转染；通过使用病毒诸如腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒；化学磷酸盐方法；经由DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI)的内吞作用；原生质体融合；流体动力学递送；磁转染；核感染；和/或其他。关于转染和/或转化技术的示例性方法可见于Makrides(2003)，Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells，Elvesier；Wong，TK&Neumann，E.Electric field mediated gene transfer.Biochem.Biophys.Res.Commun.107，584-587(1982)；Potter&Heller，Transfection by Electroporation.Curr Protoc MolBiol.2003年5月；章节：单元-9.3；Kim&Eberwine，Mammalian cell transfection：thepresent and thefuture.Anal Bioanal Chem.2010年8月；397(8)：3173-3178，这些参考文献中的每一篇全文以引入方式并入本文。
电穿孔是一种将电流施加到细胞上使细胞膜变得可渗透的技术；这又允许外源DNA被引入细胞。电穿孔是本领域普通技术人员容易知道的，并且实现电穿孔所需的工具和装置是可商购获得的(例如，Gene Pulser XcellTM电穿孔系统、Bio-
Figure BDA0003998753650001351
用于电穿孔的
Figure BDA0003998753650001352
转染系统、Thermo-Fisher Scientific以及其他工具和/或装置)。电穿孔的示例性方法在以下文献中进行了说明：Potter&Heller，Transfection by Electroporation.CurrProtoc Mol Biol.2003年5月；章节：单元-9.3；Saito(2015)Electroporation Methods inNeuroscience.Springer press；Pakhomov等人，(2017)Advanced ElectroporationTechniques in Biology and Medicine.Taylor&Francis；这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可使用电穿孔将含有编码TVP的多核苷酸的载体引入酵母中，例如，将TVP克隆到pKlac1质粒中并通过电穿孔转化到乳酸克鲁维酵母细胞中可通过如下方式实现：用合适的酵母种例如乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等接种约10-200mL的酵母提取物蛋白胨右旋糖(YEPD)，并且在30℃下在摇床上温育直到酵母培养物的早期指数期(例如，约0.6至2x108个细胞/mL)；在无菌离心管中收获酵母并在4℃下以3000rpm离心5分钟(注意：在该程序期间保持细胞冷冻)，用40mL冰冷的无菌去离子水洗涤细胞，并以23,000rpm沉淀细胞5分钟；重复洗涤步骤，并将细胞重悬于20mL 1M可发酵糖(例如半乳糖、麦芽糖、乳糖三糖(latotriose)、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如赤藓糖醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇和木糖醇)中，随后以3,000rpm旋转5分钟；将细胞用适当体积的冰冷的1M可发酵糖(例如半乳糖、麦芽糖、乳糖三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇和木糖醇)重悬至3x109个细胞/mL的最终细胞密度；将40μl酵母悬浮液与约1-4μl含有编码TVP的线性多核苷酸的载体(约1μg)在预冷冻的0.2cm电穿孔比色杯中混合(注意：确保样品与铝制比色杯的两侧接触)；在2000V下提供单脉冲，保持RC电路的5ms的最佳时间常数，然后将细胞在0.5ml YED和0.5mL 1M可发酵糖(例如半乳糖、麦芽糖、乳糖三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇和木糖醇)混合物中恢复，然后铺展到选择板上。
在一些实施方案中，可使用电穿孔通过如下方式将含有编码TVP的多核苷酸的载体引入植物原生质体中：将无菌植物材料在原生质体溶液(例如，约8mL的10mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)，pH 5.5；0.01％(w/v)果胶酶；1％(w/v)离析酶；40mM CaCl2；和0.4M甘露糖醇)中温育，并在30℃下将混合物添加到旋转振荡器中持续约3至6小时以产生原生质体；通过80μm目尼龙筛网过滤去除碎片；将该筛网用约4ml植物电穿孔缓冲液(例如，5mMCaCl2；0.4M甘露糖醇；和PBS)冲洗；将原生质体在无菌的15mL锥形离心管中合并，然后以约300×g离心约5分钟；离心后，弃去上清液并用5mL植物电穿孔缓冲液洗涤；将原生质体以约1.5x106至2x106个原生质体/mL液体重悬于植物电穿孔缓冲液中；将约0.5mL原生质体悬浮液转移到一个或多个置于冰上的电穿孔比色杯中，并添加载体(注意：为了稳定转化，应使用上述限制性方法中的任一种将载体线性化，并可使用约1至10μg载体；为了瞬时表达，可将载体保持在其超螺旋状态，并可使用约10至40μg载体)；将载体与原生质体悬浮液混合；将比色杯放入电穿孔设备中，并以约1至2kV电击一次或多次(最初可使用3至25μF电容，同时使反应最佳化)；将比色杯放回冰中；将转化的细胞在完全培养基中稀释20倍；并在约48小时后收获原生质体。
宿主细胞
本发明的方法、组合物和TVP可在任何细胞类型例如真核或原核细胞中实施。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞是原核生物。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是古细菌(Archaebacteria)或真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。可用的细菌的示例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)种(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是单细胞。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌细胞诸如革兰氏阳性细菌。
在一些实施方案中，宿主细胞可以是选自由以下项组成的以下属的细菌：暂定种氯酸杆菌属(Candidatus Chloracidobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产液拟杆菌属(Aquifex Bacteroides)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉单胞菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)、衣原体属(Chlamydia)、突柄杆菌属(Prosthecobacter)、疣微菌属(Verrucomicrobium)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、色球藻属(Chroococcus)、平裂藻属(Merismopedia)、聚球藻属(Synechococcus)、鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)、螺旋藻属(Spirulina)、束毛藻属(Trichodesmium)、厚皮藻属(Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、脱卤素杆菌属(Dehalobacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、支原体属(Mycoplasma)、钩端螺菌属(Leptospirillum)、硝化螺菌属(Nitrospira)、热脱硫杆菌属(Thermodesulfobacterium)、出芽菌属(Gemmata)、小梨形菌属(Pirellula)、浮霉状菌属(Planctomyces)、柄杆菌属(Caulobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、突柄微菌属(Prosthecomicrobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、红细菌属(Rhodobacter)、玫瑰杆菌属(Roseobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、红螺菌属(Rhodospirillum)、立克次体属(Rickettsia)、康诺尔立克次体属(Rickettsia conorii)、线粒体属(Mitochondria)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、赤杆菌属(Erythrobacter)、赤微菌属(Erythromicrobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、纤毛菌属(Leptothrix)、浮游球衣菌属(Sphaerotilus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、披毛菌属(Gallionella)、螺菌属(Spirillum)、固氮弧菌属(Azoarcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、琥珀酸单胞菌属(Succinomonas)、琥拍酸弧菌属(Succinivibrio)、瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、荚硫菌属(Thiocapsa)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙、门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、威格尔斯沃思氏菌属(Wigglesworthia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、考克斯氏体属(Coxiella)、军团菌属(Legionella)、盐单胞菌属(Halomonas)、巴斯德菌属(Pasteurella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、贝日阿托氏菌属(Beggiatoa)、硫珠菌属(Thiomargarita)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、脱硫八叠球菌属(Desulfosarcina)、地杆菌属(Geobacter)、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、疏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、密螺旋体属(Treponema)、石袍菌属(Petrotoga)、栖热袍菌属(Thermotoga)、异常球菌属(Deinococcus)或栖热菌属(Thermus)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可选自以下细菌种之一：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、白色链霉菌(Streptomyces albicans)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、褶皱链霉菌(Streptomyces plicatosporus)、艾伯特埃希氏菌(Escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、大肠杆菌、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、塞内加尔埃希氏菌(Escherichia senegalensis)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)、安比坦尼假单胞菌(Pseudomonas abietaniphila)、伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)、琼胶假单胞菌(Pseudomonas agarolyticus)、嗜碱性假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)、褐藻假单胞菌(Pseudomonas alginovora)、安德森假单胞菌(Pseudomonas andersonii)、南极洲假单胞菌(Pseudomonas antarctica)、铁角蕨假单胞菌(Pseudomonas asplenii)、壬二酸假单胞菌(Pseudomonas azelaica)、巴统假单胞菌(Pseudomonas batumici)、北方假单胞菌(Pseudomonas borealis)、油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)、潘氏假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)、乳脂色假单胞菌(Pseudomonascremoricolorata)、二萜假单胞菌(Pseudomonas diterpeniphila)、丝状假单胞菌(Pseudomonas filiscindens)、弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensis)、姜黄色假单胞菌(Pseudomonas gingeri)、革兰氏假单胞菌(Pseudomonas graminis)、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、盐脱氮假单胞菌(Pseudomonas halodenitrificans)、嗜盐假单胞菌(Pseudomonas halophila)、栖木槿假单胞菌(Pseudomonas bibiscicola)、噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)、印度假单胞菌(Pseudomonas indica)、日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)、杰氏假单胞菌(Pseudomonas jessenii)、基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)、韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、亚麻假单胞菌(Pseudomonas lini)、浅黄色假单胞菌(Pseudomonas lurida)、黄假单胞菌(Pseudomonas lutea)、边缘假单胞菌(Pseudomonasmarginata)、地中海假单胞菌(Pseudomonas meridiana)、嗜中酸假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)、帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)、副黄假单胞菌(Pseudomonas parafulva)、孔雀尾假单胞菌(Pseudomonas pavonanceae)、解朊假单胞菌(Pseudomonas proteolyica)、嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)、耐冷假单胞菌(Pseudomonas psychrotolerans)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudica)、拉梭假单胞菌(Pseudomonas rathonis)、反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)、根际假单胞菌(Pseudomonas rhizosphaerae)、沙门氏假单胞菌(Pseudomonas salmononii)、高温假单胞菌(Pseudomonas thermaerum)、热食碳酸假单胞菌(Pseudomonas thermocarboxydovorans)、耐热假单胞菌(Pseudomonasthermotolerans)、赛维瓦尔假单胞菌(Pseudomonas thivervalensis)、阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)、温哥华假单胞菌(Pseuclomonas vancouverensis)、威斯康星假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、黄色海假单胞菌(Pseudomonasxanthomarina)、厦门假单胞菌(Pseudomonas xiamenensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、鳗败血假单胞菌(Pseuclomonasanguilliseptica)、香茅醇假单胞菌(Pseuclomonas citronellolis)、变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)、晋州假单胞菌(Pseudomonas jinjuensis)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、食树脂假单孢菌(Pseudomonas resinovorans)、稻草假单胞菌(Pseuclomonas straminae)、桔黄假单胞菌(Pseuclomonas aurantiaca)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、海雀假单胞菌(Pseudomonas lundensis)、腐臭假单胞菌(Pseuclomonas taetrolens)、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、布氏假单胞菌(Pseudomonas brenneri)、松柏假单胞菌(Pseudomonas cedrina)、结冰假单胞菌(Pseudomonas congelans)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、康氏假单胞菌(Pseuclomonas costantinii)、远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、闪光假单胞菌(Pseudomonas fulgida)、盖氏假单孢菌(Pseudomonas gessardii)、黎巴嫩假单胞菌(Pseudomonas libanensis)、孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)、米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、东方假单胞菌(Pseudomonas orientalis)、草假单胞菌(Pseudomonas poae)、罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)、类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、托拉氏假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、穿孔假单胞菌(Pseudomonas pertucinogena)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)或施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、榛色假单胞菌(Pseudomonas avellanae)、大麻假单胞菌(Pseudomonas cannabina)、番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapyae)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、燕麦晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)、山黄麻假单胞菌(Pseudomonas tremae)或绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞是真核生物。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是属于以下分化枝的细胞：后鞭毛生物(Opisthokonta)；绿色植物亚界(Viridiplantae)(例如藻类和植物)；变形虫门(Amebozoa)；丝足虫门(cercozoa)；囊泡虫总门(Alveolata)；海洋鞭毛虫(Marine flagellates)；不等鞭毛门(Heterokonta)；盘嵴总门(Discicristata)；或古虫界(Excavata)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞来实现，该宿主细胞是例如后生动物(Metazoan)、领鞭毛虫(Choanoflagellata)或真菌。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用为真菌的宿主细胞来实现。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是属于真核生物门的细胞：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、微孢子门(Microsporidia)或接合菌门(Zygomycota)
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用属于以下属之一的真菌的宿主细胞来实现：曲霉属(Aspergillus)、枝孢霉属(Cladosporium)、梨孢菌属(Magnaporthe)、羊肚菌属(Morchella)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、酵母属、隐球菌属(Cryptococcus)或黑粉菌属(Ustilago)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用属于以下种之一的真菌的宿主细胞来实现：酿酒酵母、布拉酵母(Saccharomyces boulardi)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)；黄曲霉、土曲霉(A.terreus)、泡盛曲霉(A.awamori)；隆起枝孢霉(Cladosporiumelatum)、草本枝孢霉(Cl.Herbarum)、球抱枝孢霉(Cl.Sphaerospermum)和芽枝状枝孢霉(Cl.Cladosporioides)；稻梨孢菌(Magnaporthe grise)、灰梨孢菌(Magnaportheoryzae)、嗜根梨孢菌(Magnaporthe rhizophila)，小羊肚菌(Morchella deliciosa)、圆顶羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)、四孢脉孢菌(Neurosporatetrasperma)，点青霉(Penicillium notatum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、娄地青霉(Penicillium roquefortii)或简青霉(Penicillium simplicissimum)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞来实现，该宿主细胞是乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是属于以下属之一的真菌：曲霉属、枝孢霉属、梨孢菌属、羊肚菌属、脉孢菌属、青霉属、酵母属、隐球菌属或黑粉菌属。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是酵母科的成员。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是酵母科中的以下属之一：酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、复膜孢酵母属(Cyniclomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、哈萨克酵母属(Kazachstania)、克鲁维酵母属、法夫驹形氏酵母(Komagataella)、Kuraishia、拉茜斯酵母属(Lachancea)、路德酵母属(Lodderomyces)、纳卡氏菌属(Nakaseomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属、酵母属、刀孢酵母属(Spathaspora)、Tetrapisispora、范氏酵母属(Vanderwaltozyma)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、拟威尔酵母属(Williopsis)、接合酵母属或接合囊孢菌属(Zygotorulaspora)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是以下之一：黄曲霉、土曲霉、泡盛曲霉、隆起枝孢霉、草本枝孢霉、球抱枝孢霉、芽枝状枝孢霉、稻梨孢菌、灰梨孢菌、嗜根梨孢菌、小羊肚菌、圆顶羊肚菌、尖顶羊肚菌、粗糙脉孢菌、间型脉孢菌、四孢脉孢菌、点青霉、产黄青霉、娄地青霉或简青霉。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是假丝酵母属内的种。例如，宿主细胞可以是以下之一：白色假丝酵母(Candida albicansl、艾斯卡乐菲假丝酵母(Candida ascalaphidarum)、暗牧菲克假丝酵母(Candida amphixiae)、南极洲假丝酵母(Candida antarctica)、耐银假丝酵母(Candida argentea)、大西洋假丝酵母(Candida atlantica)、大气假丝酵母(Candida atmosphaerica)、耳道假丝酵母(Candidaauris)、布兰克假丝酵母(Candida blankii)、蟑螂假丝酵母(Candida blattae)、巴卡西假丝酵母(Candida bracarensis)、凤梨假丝酵母(Candida bromeliacearum)、嗜果实假丝酵母(Candida carpophila)、卡瓦哈尔假丝酵母(Candida carvajalis)、天牛假丝酵母(Candida cerambycidarum)、果生假丝酵母(Candida chauliodes)、延胡索假丝酵母(Candida corydalis)、多西假丝酵母(Candida dosseyi)、杜氏假丝酵母(Candidadubliniensis)、埃氏假丝酵母(Candida ergatensis)、果实假丝酵母(Candida fructus)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、发酵假丝酵母(Candida fermentati)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、黑马朗假丝酵母(Candida haemulonii)、小假丝酵母(Candida humilis)、昆虫门假丝酵母(Candida insectamens)、昆虫假丝酵母(Candidainsectorum)、中型假丝酵母(Candida intermedia)、杰弗里西假丝酵母(Candidajeffresii)或乳酒假丝酵母(Candida kefyr)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是克鲁维酵母属内的种。例如，宿主细胞可以是以下之一：海泥克鲁维酵母(Kluyveromycesaestuarii)、多布克鲁维酵母(Kluyveromyces dobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、非发酵克鲁维酵母(Kluyveromyces nonfermentans)或威克海姆克鲁维酵母(Kluyveromyces wickerhamii)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是毕赤酵母属内的种。例如，宿主细胞可以是以下之一：粉状毕赤酵母(Pichia farinose)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、黑迪氏毕赤酵母(Pichia heedii)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、膜璞毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)、奥默毕赤酵母(Pichiaohmeri)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)或亚膜毕赤酵母(Pichia subpelliculosa)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是酵母属内的种。例如，宿主细胞可以是以下之一：树生酵母(Saccharomyces arboricolus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、里约酵母(Saccharomyces cariocanus)、卡里奥库斯酵母(Saccharomyces cariocus)、酿酒酵母、酿酒酵母布拉迪变种(Saccharomyces cerevisiae var boulardii)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、大连酵母(Saccharomyces dairenensis)、椭圆酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguous)、弗罗棱酵母(Saccharomyces florentinus)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、马提尼酒糖酵母(Saccharomyces martiniae)、米卡塔酵母(Saccharomyces mikatae)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、斯潘思龙酵母(Saccharomyces spencerorum)、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母或左娜图酵母(Saccharomyces zonatus)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是以下之一：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)。
使用酵母细胞作为宿主生物体生成重组TVP是本领域普通技术人员公知的一种特殊方法。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用任何酵母种进行，包括但不限于酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何种，并且酵母属的种包括酵母属的任何种，例如选自以下菌株的酿酒酵母种：INVSc1、YNN27、S150-2B、W303-1B、CG25、W3124、JRY188、BJ5464、AH22、GRF18、W303-1A和BJ3505。在一些实施方案中，毕赤酵母属种的成员包括毕赤酵母属的任何种，例如毕赤酵母属种，巴斯德毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母选自以下菌株：Bg08、Y-11430、X-33、GS115、GS190、JC220、JC254、GS200、JC227、JC300、JC301、JC302、JC303、JC304、JC305、JC306、JC307、JC308、YJN165、KM71、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168、GS241、MS105、任何pep4敲除菌株和任何prb1敲除菌株，以及选自以下菌株的巴斯德毕赤酵母：Bg08、X-33、SMD1168和KM71。在一些实施方案中，可使用任何克鲁维酵母属种来实现在此描述的方法，包括克鲁维酵母属的任何种，例如乳酸克鲁维酵母，并且我们教导乳酸克鲁维酵母的菌株可以但不要求选自以下菌株：GG799、YCT306、YCT284、YCT389、YCT390、YCT569、YCT598、NRRL Y-1140、MW98-8C、MS1、CBS293.91、Y721、MD2/1、PM6-7A、WM37、K6、K7、22AR1、22A295-1、SD11、MG1/2、MSK110、JA6、CMK5、HP101、HP108 and PM6-3C，除了乳酸克鲁维酵母种之外，还选自GG799、YCT306和NRRLY-1140。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是日本曲霉(Aspergillus japonicas)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是黑曲霉(Aspergillus niger)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是枯草芽孢杆菌。
在一些实施方案中，用于产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞来实现，该宿主细胞是酵母，包括但不限于汉逊酵母属种的任何种，包括汉逊酵母属的任何种并且优选地多形汉逊酵母。在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可用任何酵母物种来实现，包括但不限于任何耶氏酵母属的种，例如解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可用酵母的任何种来实现，包括但不限于裂殖酵母属种的任何种，包括裂殖酵母属的任何种并且优选地粟酒裂殖酵母。
在一些实施方案中，酵母种诸如乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等可用作宿主生物体。酵母细胞培养技术是本领域普通技术人员公知的。酵母细胞培养的示例性方法可见于Evans，Yeast Protocols.Springer(1996)；Bill，Recombinant ProteinProduction in Yeast.Springer(2012)；Hagan等人，Fission Yeast：A LaboratoryManual，CSH Press(2016)；Konishi等人，Improvement of the transformationefficiency of Saccharomyces cerevisiae by altering carbon sources in pre-culture.Biosci Biotechnol Biochem.2014；78(6)：1090-3；Dymond，Saccharomycescerevisiae growth media.Methods Enzymol.2013；533：191-204；Looke等人，Extractionof genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.Biotechniques.，2011年5月，50(5)：325-8；和Romanos等人，Culture of yeast for the production ofheterologous proteins.CurrProtoc Cell Biol.2014年9月2日，64：20.9.1-16，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
酵母细胞发酵培养基和储备液的配方描述如下：(1)MSM培养基配方：2g/L柠檬酸钠二水合物；1g/L硫酸钙二水合物(0.79g/L无水硫酸钙)；42.9g/L磷酸二氢钾；5.17g/L硫酸铵；14.33g/L硫酸钾；11.7g/L硫酸镁七水合物；2mL/L PTM1痕量盐溶液；0.4ppm生物素(来自500X，200ppm储备液)；1％-2％纯甘油或其他碳源。(2)PTM1痕量盐溶液：硫酸铜-5H2O6.0g；碘化钠0.08g；硫酸锰-H2O 3.0g；钼酸钠-2H2O 0.2g；硼酸0.02g；氯化钴0.5g；氯化锌20.0g；硫酸亚铁-7H2O 65.0g；生物素0.2g；硫酸5.0ml；添加水至终体积为1升。乳酸克鲁维酵母确定成分培养基(DMSor)的示例性组成如下：11.83g/L KH2PO4、2.299g/L K2HPO4、20g/L可发酵糖(例如半乳糖、麦芽糖、乳糖三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如赤藓糖醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇和木糖醇)、1g/LMgSO4.7H2O、10g/L(NH4)SO4、0.33g/L CaCl2.2H2O、1g/L NaCl、1g/L KCl、5mg/L CuSO4.5H2O、30mg/L MnSO4.H2O、10mg/L ZnCl2、1mg/L KI、2mg/L CoCl2.6H2O、8mg/L Na2MoO4.2H2O、0.4mg/L H3BO3、15mg/L FeCl3.6H2O、0.8mg/L生物素、20mg/L泛酸钙、15mg/L硫胺素、16mg/L肌醇、10mg/L烟酸和4mg/L吡哆醇。
可将酵母细胞在48孔深孔板中培养，在接种后用无菌透气盖密封。可挑取培养在板上的酵母菌落，例如乳酸克鲁维酵母，并以每孔2.2mL培养基接种由DMSor组成的深孔板。可使接种的深孔板在23.5℃下在冷冻培养箱-摇床中以280rpm振荡生长6天。在接种后第6天，应通过以4000rpm离心10分钟，随后使用具有0.22μM膜的滤板过滤来收获条件培养基，对过滤的培养基进行HPLC分析。
示例性酵母菌株
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该酵母菌株选自酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何种
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该酵母菌株酵母细胞选自由乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母组成的组。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列；其中该酵母菌株是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
形式(II)
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中如果Z1为T，则TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中X1为Q；并且Z1为A。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中该酵母菌株选自酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何种
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中该酵母菌株酵母细胞选自由乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母组成的组。
在一些实施方案中，本发明的酵母菌株可包含：包含可操作以编码TVP的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其互补核苷酸序列；其中该酵母菌株是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
酵母转化、TVP纯化和分析
酵母转化的示例性方法如下：将携带TVP表达ORF的表达载体转化到酵母细胞中。首先，表达载体通常通过特异性限制酶切割而线性化，以促进通过同源重组的染色体整合。然后通过化学或电穿孔转化方法将线性表达载体转化到酵母细胞中，并通过同源重组整合到酵母基因组的靶向基因座中。整合可在同一染色体基因座发生多次；因此，转化的酵母细胞的基因组可以含有TVP表达盒的多个拷贝。成功转化的酵母细胞可以使用有利于选择性标记物的生长条件来鉴定，该选择性标记物被工程化到表达载体中并与TVP表达ORF共整合到酵母染色体中；此类标记物的示例包括但不限于乙酰胺原养型、zeocin抗性、遗传霉素抗性、诺尔丝菌素抗性和尿嘧啶原养型。
由于不可预知的和可变的因素的影响，诸如基因和基因网络的表观遗传修饰，以及在经历转化过程的群体中的单个细胞中发生的整合事件的数目的变化，给定转化过程的单个酵母菌落在产生TVP表达ORF的能力方面将不同。因此，应筛选携带TVP转基因的转基因酵母菌落以获得高产菌株。用于此类筛选的两种有效方法-各自依赖于转基因酵母的小规模培养物的生长以提供用于随后分析的条件培养基样品-使用反相HPLC或家蝇注射程序来分析来自阳性转基因酵母菌落的条件培养基样品。
转基因酵母培养可使用14mL圆底聚丙烯培养管进行，其中向每个管中添加5至10mL确定成分培养基，或者在48孔深孔培养板中进行，其中向每个孔中添加2.2mL确定成分培养基。将不含粗蛋白质提取物或副产物诸如酵母提取物或蛋白胨的确定成分培养基用于培养以降低收获用于后续筛选步骤的条件培养基中的蛋白质背景。培养在最佳温度下进行，例如对于乳酸克鲁维酵母为23.5℃，持续约5-6天，直到达到最大细胞密度。TVP现在将由转化的酵母细胞产生并从细胞分泌到生长培养基中。为了制备用于筛选的样品，通过离心从培养物中去除细胞，并收集上清液作为条件培养基，然后通过0.22μm滤膜过滤进行清洗，然后准备用于菌株筛选。
在一些实施方案中，可通过反相HPLC(rpHPLC)筛选推定的酵母菌落来筛选用TVP转化的阳性酵母菌落。在该筛选方法中，可使用具有C18键合相的HPLC分析柱。乙腈和水用作流动相溶剂，并且使用设置在220nm的UV吸光度检测器进行肽检测。将适量的条件培养基样品加载到rpHPLC系统中并用线性梯度的流动相溶剂洗脱。使用HPLC色谱中杀昆虫肽的对应峰面积来定量条件培养基中的TVP浓度。将已知量的纯TVP通过相同的rpHPLC柱，采用相同的HPLC方案，以确认肽的保留时间，并产生用于定量的标准肽HPLC曲线。
阳性乳酸克鲁维酵母细胞的示例性反相HPLC筛选方法如下：可将TVP表达ORF插入到表达载体pKLAC1中，并转化到来自New England Biolabs，Ipswich，MA，USA的乳酸克鲁维酵母菌株YCT306中。pKLAC1载体是整合型表达载体。一旦将TVP转基因克隆到pKLAC1中并转化到YCT306中，它们的表达就由LAC4启动子控制。所得的转化菌落产生包含α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和成熟TVP的前肽。α-交配因子信号肽引导前原肽进入内源分泌途径，并且成熟TVP被释放到生长培养基中。
在一些实施方案中，用于TVP表达的密码子优化可在两轮中进行，例如，在第一轮中，基于高表达DNA序列的一些共同特征，设计表达α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和TVP的TVP表达ORF的多种变体，并在乳酸克鲁维酵母的YCT306菌株中评价它们的表达水平，产生初始乳酸克鲁维酵母表达算法；在第二轮优化中，可基于初始乳酸克鲁维酵母表达算法设计另外的变体TVP表达ORF，以进一步微调乳酸克鲁维酵母表达算法，并鉴定用于在乳酸克鲁维酵母中的TVP表达的最佳ORF。在一些实施方案中，由上述优化得到的DNA序列可具有编码α-MF信号肽、Kex2切割位点和TVP的开放阅读框，可使用Hind III和Not I限制位点将其克隆到pKLAC1载体中，得到TVP表达载体。
在一些实施方案中，酵母巴斯德毕赤酵母可用TVP表达盒转化。用于转化巴斯德毕赤酵母的示例性方法如下：载体pJUGαKR和pJUZαKR可用于将TVP转化到巴斯德毕赤酵母中。pJUGαKR和pJUZαKR载体可获自Biogrammatics，Carlsbad，California，USA。两种载体都是整合型载体，并且使用尿嘧啶磷酸核糖转移酶启动子(pUPP)来增强异源转基因表达。载体之间的唯一差异是pJUGαKR为宿主酵母提供G418抗性，而pJUZαKR提供Zeocin抗性。设计并合成编码TVP的互补寡核苷酸对，用于亚克隆到两个酵母表达载体中。杂交反应通过如下进行：将对应的互补寡核苷酸在30mMNaCl、10mM Tris-Cl(所有终浓度)pH 8中混合至终浓度为20μM，然后在95℃下温育20分钟，接着进行在92℃下开始并在17℃下结束的9小时温育，每20分钟温度下降3℃。杂交反应将产生编码TVP的DNA片段。用BsaI-HF限制酶消化这两个巴斯德毕赤酵母载体，然后使用标准程序将反应的双链DNA产物亚克隆到线性化的巴斯德毕赤酵母载体中。在验证亚克隆的序列后，通过电穿孔将质粒等分转染到巴斯德毕赤酵母菌株Bg08中。可如本文所述培养和筛选基于分别由工程化到载体pJUZαKR和pJUGαKR中的元件赋予的对Zeocin或G418的抗性而选择的所得转化酵母。
酵母肽产率筛选和评价
可通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，毛细管凝胶电泳(CGE)、Western印迹分析等)来确定肽产率。如本文所述和本领域已知的活性测定也可提供关于肽产率的信息。在一些实施方案中，可使用本领域已知的这些或任何其他方法来评价肽产率。
定量测定
在一些实施方案中，并且非限制性地，TVP肽产率可使用以下测量：HPLC；质谱(MS)和相关技术；LC/MS/MS；反相蛋白阵列(RPPA)；免疫组织化学；ELISA；悬浮珠阵列质谱分析法；斑点印迹；SDS-PAGE；毛细管凝胶电泳(CGE)；Western印迹分析；Bradford测定；测量260nm处的UV吸收；Lowry测定；史密斯铜/二辛可宁测定；分泌测定；Pierce蛋白测定；缩二脲反应；等等。蛋白质定量的示例性方法在以下文献中提供：Stoscheck，C.1990“Quantification of Protein”Methods in Enzymology，182：50-68；Lowry，O.Rosebrough，A.、Farr，A.和Randall，R.1951 J.Biol.Chem.193：265；Smith，P.等人，(1985)Anal.Biochem.150：76-85；Bradford，M.1976“A Rapid and SensitiVe Method forthe Quantitation of Microgram Quantities of Pratein Utilizing the Principleof Protein-Dye Binding”Anal.Biochem.72：248-254；Cabib，E.和Polacheck，I.1984“Pratein assay for dilute solutians.”Methods in Enzymology，104：318-328；Turcanu，Victor；Williams，Neil A.(2001).”Cell identification and isolation onthe basis of cytokine secretion：A novel tool for investigating immuneresponses.”Nature Medicine.7(3)：373-376；美国专利号6,391,649；这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在其他实施方案中，可使用包括但不限于以下的方法定量和/或评估TVP肽产率：每体积培养物的重组蛋白质量(例如，克或毫克蛋白质/升培养物)；测定细胞裂解后获得的重组蛋白不溶性沉淀物的百分比或分数(例如，重组蛋白提取的上清液的量/不溶性组分中蛋白质的量)；活性蛋白质的百分比或分数(例如，用于蛋白质量的活性蛋白质的量/分析)；总细胞蛋白(tcp)百分比或分数；和/或蛋白质/细胞与干生物质的量的百分比或比率。
在一些实施方案中，其中产率以培养物体积表示，可考虑培养细胞密度，特别是当比较不同培养物之间的产率时。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生为总细胞蛋白(tcp)的至少约5％、至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％或更多的异源多肽的方法。“总细胞蛋白百分比”是宿主细胞中异源多肽的量占聚集细胞蛋白的百分比。总细胞蛋白百分比的确定是本领域公知的。
“总细胞蛋白(tcp)”或“总细胞蛋白百分比(％tcp)”是宿主细胞中蛋白质或多肽的量占聚集细胞蛋白的百分比。用于确定总细胞蛋白百分比的方法是本领域公知的。
在一些实施方案中，HPLC可用于定量肽产率。例如，在一些实施方案中，肽产率可使用配备有Onyx monolithic 4.5x100mm、C18反相分析HPLC柱和自动进样器的Agilent1100HPLC系统来定量。配备有Onyx monolithic 4.5x100mm、C18反相分析HPLC柱和自动进样器的Agilent 1100HPLC系统的示例性用途如下：使用配备有Onyx monolithic4.5x100mm、C18反相分析HPLC柱和自动进样器的Agilent 1100HPLC系统，通过分析构成用于HPLC分析的两种流动相溶剂的HPLC级水和含有0.1％三氟乙酸的乙腈，分析来自转化的乳酸克鲁维酵母细胞的过滤的条件培养基样品；使用HPLC色谱分析TVP或TVP-杀昆虫蛋白的峰面积，然后用于计算条件培养基中的肽浓度，其可进一步以对应的最终细胞密度(如通过OD600测量所确定的)作归一化作为归一化肽产率。
活性测定
在一些实施方案中，可使用家蝇注射测定来筛选用TVP或TVP-杀昆虫蛋白转化的阳性酵母菌落。当通过背部胸腔的体壁以测量剂量注射时，TVP或TVP-杀昆虫蛋白可麻痹/杀死家蝇。TVP或TVP-杀昆虫蛋白的功效可通过肽的中值麻痹/致死剂量(PD5o/LD50)来定义，其分别引起注射的家蝇50％的灭杀比或死亡率。纯TVP或TVP-杀昆虫蛋白通常用于家蝇注射测定中以生成标准剂量-响应曲线，从该曲线可确定PD50/LD50值。使用来自纯TVP或TVP-杀昆虫蛋白的标准剂量-响应曲线的分析的PD50/LD50值，由转化的酵母产生的TVP或TVP-杀昆虫蛋白的定量可使用用对应条件培养基的系列稀释液进行的家蝇注射测定来实现。
示例性家蝇注射生物测定如下：连续稀释条件培养基以生成来自家蝇注射生物测定的全剂量-响应曲线。注射前，用CO2固定成年家蝇(Musca domestica)，并选择12-18mg家蝇进行注射。用装有1cc注射器和30号针头的微型涂布器将连续稀释的条件培养基样品剂量0.5μL/蝇通过背部胸腔的体壁注射到家蝇中。将注射的家蝇置于盖子上具有潮湿滤纸和通气孔的密闭容器中，并通过灭杀比或通过注射后24小时的死亡率评分来检查它们。计算归一化产率。肽产率意指以mg/L为单位的条件培养基中的肽浓度。然而，肽产率并不总是足以准确地比较菌株的生产率。单个菌株可具有不同的生长速率，因此当收获培养物时，不同的培养物的细胞密度可能不同。具有高细胞密度的培养物可在培养基中产生更高浓度的肽，即使该菌株的肽产生率低于具有更高产生速率的另一菌株。因此，术语“归一化产率”是通过将肽产率除以对应培养物中的细胞密度而产生的，并且这允许菌株之间的肽生产率的更好比较。细胞密度由600nm处的吸光度表示，单位为“A”(吸光度单位)。
筛选已经历TVP转化的酵母菌落可从数百个潜在菌落中鉴定高产率酵母菌株。当使用本文所述的优化的发酵培养基和发酵条件时，这些菌株可在生物反应器中发酵以实现至少高达4g/L或至少高达3g/L或至少高达2g/L TVP的产率。较高的生产率(以mg/L表示)可为约100mg/L至约100,000mg/L、或约100mg/L至约90,000mg/L、或约100mg/L至约80,000mg/L、或约100mg/L至约70,000mg/L、或约100mg/L至约60,000mg/L、或约100mg/L至约50,000mg/L、或约100mg/L至约40,000mg/L、或约100mg/L至约30,000mg/L、或约100mg/L至约20,000mg/L、或约100mg/L至约17,500mg/L、或约100mg/L至约15,000mg/L、或约100mg/L至约12,500mg/L、或约100mg/L至约10,000mg/L、或约100mg/L至约9,000mg/L、或约100mg/L至约8,000mg/L、或约100mg/L至约7,000mg/L、或约100mg/L至约6,000mg/L、或约100mg/L至约5,000mg/L、或约100mg/L至约3,000mg/L、或约100mg/L至2,000mg/L、或约100mg/L至1,500mg/L、或约100mg/L至1,000mg/L、或约100mg/L至750mg/L、或约100mg/L至500mg/L、或约150mg/L至100,000mg/L、或约200mg/L至100,000mg/L、或约300mg/L至100,000mg/L、或约400mg/L至100,000mg/L、或约500mg/L至100,000mg/L、或约750mg/L至100,000mg/L、或约1,000mg/L至100,000mg/L、或约1,250mg/L至100,000mg/L、或约1,500mg/L至100,000mg/L、或约2,000mg/L至100,000mg/L、或约2,500mg/L至100,000mg/L、或约3,000mg/L至100,000mg/L、或约3,500mg/L至100,000mg/L、或约4,000mg/L至100,000mg/L、或约4,500mg/L至100,000mg/L、或约5,000mg/L至100,000mg/L、或约6,000mg/L至100,000mg/L、或约7,000mg/L至100,000mg/L、或约8,000mg/L至100,000mg/L、或约9,000mg/L至100,000mg/L、或约10,000mg/L至100,000mg/L、或约12,500mg/L至100,000mg/L、或约15,000mg/L至100,000mg/L、或约17,500mg/L至100,000mg/L、或约20,000mg/L至100,000mg/L、或约30,000mg/L至100,000mg/L、或约40,000mg/L至100,000mg/L、或约50,000mg/L至100,000mg/L、或约60,000mg/L至100,000mg/L、或约70,000mg/L至100,000mg/L、或约80,000mg/L至100,000mg/L、或约90,000mg/L至100,000mg/L的任何值；或所提供的任何值的任何范围，或甚至比使用与用于生产转化前的肽相同或相似的生产方法用转化前的肽所能达到的更高的产率。
培养和发酵条件
细胞培养技术是本领域公知的。在一些实施方案中，培养方法和/或材料将必然需要基于所选择的宿主细胞的适应；并且，此类适应(例如，改变pH、温度、培养基含量等)是本领域普通技术人员公知的。在一些实施方案中，可使用任何已知的培养技术来产生本发明的TVP或TVP-杀昆虫蛋白。
示例性培养方法在美国专利号3,933,590、3,946,780、4,988,623、5,153,131、5,153,133、5,155,034、5,316,905、5,330,908、6,159,724、7,419,801、9,320,816、9,714,408和10,563,169中提供；这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
酵母培养
酵母细胞培养技术是本领域普通技术人员公知的。酵母细胞培养的示例性方法可见于Evans，Yeast Protocols.Springer(1996)；Bill，Recombinant Protein Productionin Yeast.Springer(2012)；Hagan等人，Fission Yeast：A Laboratory Manual，CSH Press(2016)；Konishi等人，Improvement of the transformation efhciency ofSaccharomyces cerevisiae by altering carbon sources in pre-culture.BiosciBiotechnol Biochem.2014；78(6)：1090-3；Dymond，Saccharomyces cerevisiae growthmedia.Methods Enzymol.2013；533：191-204；Looke等人，Extraction of genomic DNAfrom yeasts for PCR-based applications.Biotechniques.，2011年5月，50(5)：325-8；和Romanos等人，Culture of yeast for the production of heterologousproteins.Curr Protoc Cell Biol.2014年9月2日，64：20.9.1-16，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
酵母可在多种培养基中培养，例如，在一些实施方案中，酵母可在基本培养基、YPD培养基、酵母氨基酸缺陷型合成培养基(yeast synthetic drop-out medium)、酵母氮碱(含或不含氨基酸的YNB)、YEPD培养基、ADED培养基、ADEDS″培养基、LEUD培养基、HIS D培养基或矿物盐培养基中培养。
在一些实施方案中，酵母可在基本培养基中培养。在一些实施方案中，基本培养基成分可包括：2％糖；磷酸盐缓冲液，pH 6.0；硫酸镁；氯化钙；硫酸铵；氯化钠；氯化钾；硫酸铜；硫酸锰；氯化锌；碘化钾；氯化钴；钼酸钠；硼酸；氯化铁；生物素；泛酸钙；硫胺；肌醇；烟酸；和吡哆醇。
在一些实施方案中，酵母可在YPD培养基中培养。YPD培养基包含细菌蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖。
在一些实施方案中，酵母可在酵母氨基酸缺陷型合成培养基中培养，该培养基可用于区分在没有特定培养基成分的情况下不能生长的营养缺陷型突变菌株，该菌株用允许所述转化体在缺少所需成分的培养基上生长的质粒转化。
在一些实施方案中，可使用酵母氮碱(含或不含氨基酸的YNB)培养酵母，该酵母氮碱包含氮、维生素、微量元素和盐。
在一些实施方案中，培养基可以是YEPD培养基，例如包含2％D-葡萄糖、2％BACTO蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)、1％BACTO酵母提取物(Difco)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸的培养基；或其变型，其中碳源是糖醇，例如甘油或山梨糖醇
在一些实施方案中，培养基可以是ADE D培养基，例如，包含0.056％-Ade-Trp-Thr粉末、0.67％不含氨基酸的酵母氮碱、2％D-葡萄糖和0.5％200×色氨酸、苏氨酸溶液的培养基；或其变型，其中碳源是糖醇，例如甘油或山梨糖醇
在一些实施方案中，培养基可以是ADE DS″培养基，例如包含0.056％-Ade-Trp-Thr粉末、0.67％不含氨基酸的酵母氮碱、2％D-葡萄糖、0.5％200×色氨酸、苏氨酸溶液和18.22％D-山梨糖醇的培养基；或其变型，其中碳源完全是糖醇，例如甘油或山梨糖醇
在一些实施方案中，培养基可以是LEU D培养基，例如包含0.052％-Leu-Trp-Thr粉末、0.67％不含氨基酸的酵母氮碱、2％D-葡萄糖和0.5％200×色氨酸、苏氨酸溶液的培养基；或其变型，其中碳源是糖醇，例如甘油或山梨糖醇。
在一些实施方案中，培养基可以是HIS D培养基，例如包含0.052％-His-Trp-Thr粉末、0.67％不含氨基酸的酵母氮碱、2％D-葡萄糖和0.5％200×色氨酸、苏氨酸溶液的培养基；或其变型，其中碳源是糖醇，例如甘油或山梨糖醇。
在一些实施方案中，可使用矿物盐培养基。矿物盐培养基由矿物盐和碳源诸如例如葡萄糖、蔗糖或甘油组成。矿物盐培养基的示例包括例如M9培养基、假单胞菌培养基(ATCC 179)以及Davis和Mingioli培养基。参见Davis&Mingioli(1950)J.Bact.60：17-28。用于制备矿物盐培养基的矿物盐包括选自例如磷酸钾、硫酸铵或氯化铵、硫酸镁或氯化镁和痕量矿物质诸如氯化钙、硼酸盐以及铁、铜、锰和锌的硫酸盐的那些。通常，矿物盐培养基中不包含有机氮源，例如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。相反，使用无机氮源，并且其可选自例如铵盐、氨水和气态氨。矿物盐培养基通常含有葡萄糖或甘油作为碳源。
与矿物盐培养基相比，基本培养基也可含有矿物盐和碳源，但可补充例如低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨或其他成分，尽管这些以非常低的水平添加。可使用本领域例如美国专利申请公开号2006/0040352中描述的方法来制备培养基，该专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。Riesenberg，D等人，199l，“High cell density cultivation ofEscherichia coli at controlled specific growth rate，”J.Biotechnol.20(1)：17-27详细描述了在本发明方法中可用的培养程序和矿物盐培养基。
在一些实施方案中，使乳酸克鲁维酵母在补充有2％葡萄糖、半乳糖、山梨糖醇或甘油作为唯一碳源的基本培养基中生长。将培养物在30℃下温育直至对数中期(24-48小时)以进行β-半乳糖苷酶测量，或在23.5℃下温育6天以进行异源蛋白质表达。
在一些实施方案中，可将酵母细胞在48孔深孔板中培养，在接种后用无菌透气盖密封。可挑取培养在板上的酵母菌落，例如乳酸克鲁维酵母，并以每孔2.2mL培养基接种由DMSor组成的深孔板。可使接种的深孔板在23.5℃下在冷冻培养箱-摇床中以280rpm振荡生长6天。在接种后第6天，应通过以4000rpm离心10分钟，随后使用具有0.22μM膜的滤板过滤来收获条件培养基，对过滤的培养基进行HPLC分析。
在一些实施方案中，酵母种诸如乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等可用作宿主生物体，和/或待使用本文所述的方法修饰的酵母。
温度和pH条件将根据培养阶段和所选择的宿主细胞种类而变化。细胞培养中的变量诸如温度和pH是本领域普通技术人员容易知道的。
pH水平在酵母培养中是重要的。本领域技术人员将理解，培养过程不仅包括酵母培养的开始，而且还包括培养的维持。酵母培养可在任何pH水平开始，然而，由于酵母培养的培养基倾向于随时间变得更酸性(即，降低pH)，因此必须小心监测培养过程中的pH水平。
在本发明的一些实施方案中，使酵母在培养基中生长，该培养基的pH水平根据所用酵母的种类、培养阶段和/或温度而定。因此，在一些实施方案中，pH水平可落在约2至约10的范围内。本领域普通技术人员将认识到大多数微生物的最佳pH接近中性点(pH 7.0)。然而，在一些实施方案中，一些真菌种优选酸性环境：因此，在一些实施方案中，pH可在2至6.5的范围内。在一些实施方案中，pH可在约4至约4.5的范围内。一些真菌种(例如霉菌)可在约2至约8.5的pH下生长，但优选酸性pH。参见Mountney&Gould，Practical foodmicrobiology and technology.1988.第3版；和Pena等人，Effects of high medium pHon growth.metabolism and transport in Saccharomyces cerevisiae.FEMS YeastRes.2015年3月；15(2)：fou005。
在其他实施方案中，pH为约5.7至5.9、5.8至6.0、5.9至6.1、6.0至6.2、6.1至6.3、6.2至6.5、6.4至6.7、6.5至6.8、6.6至6.9、6.7至7.0、6.8至7.1、6.9至7.2、7.0至7.3、7.1至7.4、7.2至7.5、7.3至7.6、7.4至7.7、7.5至7.8、7.6至7.9、7.7至8.0、7.8至8.1、7.9至8.2、8.0至8.3、8.1至8.4、8.2至8.5、8.3至8.6、8.4至8.7或8.5至8.8。
在一些实施方案中，培养基的pH可为至少5.5。在其他方面，培养基可具有约5.5的pH水平。在其他方面，培养基可具有在4至8之间的pH水平。在一些情况下，培养物维持在5.5至8之间的pH水平。在其他方面，培养基具有在6至8之间的pH水平。在一些情况下，培养基具有维持在6和8之间的pH水平的pH水平。在一些实施方案中，酵母在6.1至8.1之间的pH水平下生长和/或维持。在一些实施方案中，酵母在6.2至8.2之间的pH水平下生长和/或维持。在一些实施方案中，酵母在6.3至8.3之间的pH水平下生长和/或维持。在一些实施方案中，酵母在6.4至8.4之间的pH水平下生长和/或维持。在一些实施方案中，酵母在5.5至8.5之间的pH水平下生长和/或维持。在一些实施方案中，酵母在6.5至8.5之间的pH水平下生长和/或维持。在一些实施方案中，酵母在约5.6、5.7、5.8或5.9的pH水平下生长。在一些实施方案中，酵母在约6的pH水平下生长。在一些实施方案中，酵母在约6.5的pH水平下生长。在一些实施方案中，酵母在约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH水平下生长。在一些实施方案中，酵母在约7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH水平下生长。在一些实施方案中，酵母在高于8的水平下生长。
在一些实施方案中，培养基的pH可在2至8.5的pH范围内。在某些实施方案中，pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7或8.8。
酵母培养的示例性方法可见见以下专利中：标题为“Repressible yeastpromoters”的美国专利号5，436，136(1991年12月20日提交；受让人Ciba-GeigyCorporation)；标题为“Yeast expression systems，methods of producingpolypeptides in yeast，and compositions relating to same”的美国专利号6,645,739(2001年7月26日提交；受嚷人Phoenix Pharmacologies，Inc.，Lexington，KY)；和标题为“Medium for yeasts”的美国专利号10,023,836(2013年8月23日提交；受让人YamaguchiUniversity)；这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
发酵
本发明考虑了任何发酵形式的宿主生物体的培养。例如，本文可采用分批、补料分批、半连续和连续发酵模式。
发酵可以任何规模进行。根据本发明所考虑的方法和技术可用于任何规模的重组蛋白表达。因此，在一些实施方案中，例如，可使用微升规模、毫升规模、厘升规模和分升规模的发酵体积，并且可使用1升规模和更大的发酵体积。
在一些实施方案中，发酵体积等于或高于约1升。例如，在一些实施方案中，发酵体积为约1升至约100升。在一些实施方案中，发酵体积为约1升、约2升、约3升、约4升、约5升、约6升、约7升、约8升、约9升或约10升。在一些实施方案中，发酵体积为约1升至约5升、约1升至约10升、约1升至约25升、约1升至约50升、约1升至约75升、约10升至约25升、约25升至约50升、或约50升至约100升。在其他实施方案中，发酵体积等于或高于5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升。100升、200升、500升、1,000升、2,000升、5,000升、10,000升或50,000升。
在一些实施方案中，发酵培养基可以是用于生长和/或维持细胞的营养液。非限制性地，该溶液通常提供来自以下类别中的一种或多种的至少一种组分：(1)能量源，通常为碳源的形式，例如葡萄糖；(2)所有必需氨基酸，通常是二十种氨基酸的基本组；(3)低浓度时所需的维生素和/或其他有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸；和(5)痕量元素，其中痕量元素被定义为通常需要非常低浓度(通常在微摩尔范围内)的无机化合物或天然存在的元素。
在一些实施方案中，发酵培养基可与细胞培养基或本文所述的任何其他培养基相同。在一些实施方案中，发酵培养基可不同于细胞培养基。在一些实施方案中，可修改发酵培养基以适应蛋白质的大规模生产。
在一些实施方案中，发酵培养基可选择性地补充一种或多种来自以下类别中的任一种的组分：(1)激素和其他生长因子，诸如血清、胰岛素、转铁蛋白等；(2)盐，例如镁盐、钙盐和磷酸盐；(3)缓冲剂，诸如HEPES；(4)核苷和碱基，诸如腺苷、胸苷等；(5)蛋白质和组织水解产物，例如可以从纯化的明胶、植物材料或动物副产品获得的蛋白胨或蛋白胨混合物；(6)抗生素，诸如庆大霉素；和(7)细胞保护剂，例如普朗尼克多元醇。
在一些实施方案中，发酵培养基的pH可使用pH缓冲液和本领域技术人员已知的方法来维持。发酵过程中pH的控制也可使用氨水来实现。在一些实施方案中，发酵培养基的pH将基于所用生物体的优选pH来选择。因此，在一些实施方案中，并且取决于宿主细胞和温度，pH可在约1至约10的范围内。
在一些实施方案中，发酵培养基的pH可在2至8.5的pH范围内。在某些实施方案中，pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7或8.8。
在其他实施方案中，pH为约5.7至5.9、5.8至6.0、5.9至6.1、6.0至6.2、6.1至6.3、6.2至6.5、6.4至6.7、6.5至6.8、6.6至6.9、6.7至7.0、6.8至7.1、6.9至7.2、7.0至7.3、7.1至7.4、7.2至7.5、7.3至7.6、7.4至7.7、7.5至7.8、7.6至7.9、7.7至8.0、7.8至8.1、7.9至8.2、8.0至8.3、8.1至8.4、8.2至8.5、8.3至8.6、8.4至8.7或8.5至8.8
在一些实施方案中，例如，当使用大肠杆菌(E.coli)时，最佳pH范围在6.5和7.5之间，这取决于温度。
在其他实施方案中，例如，当使用酵母菌株时，pH可在约4.0至8.0的范围内。
在一些实施方案中，可使用中性pH，即约7.0的pH。
本领域普通技术人员将认识到，在发酵期间，pH水平可能由于底物和代谢化合物的转化和产生而漂移。
在一些实施方案中，发酵培养基可补充缓冲液或其他化学品以避免pH的变化。例如，在一些实施方案中，可向发酵培养基中添加Ca(OH)2、CaCO3、NaOH或NH4OH以中和例如在一些酵母物种中在工业工艺期间发生的酸性化合物的产生。
温度是发酵过程中的另一个重要考虑因素；并且，与pH考虑一样，温度将取决于所选择的宿主细胞的类型。
在一些实施方案中，发酵温度保持在约4℃至约42℃。在某些实施方案中，发酵温度为约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃或约42℃。
在其他实施方案中，发酵温度保持在约25℃至约27℃、约25℃至约28℃、约25℃至约29℃、约25℃至约30℃、约25℃至约31℃、约25℃至约32℃、约25℃至约33℃、约26℃至约28℃、约26℃至约29℃、约26℃至约30℃、约26℃至约31℃、约26℃至约32℃、约27℃至约29℃、约27℃至约30℃、约27℃至约31℃、约27℃至约32℃、约26℃至约33℃、约28℃至约30℃、约28℃至约31℃、约28℃至约32℃、约29℃至约31℃、约29℃至约32℃、约29℃至约33℃、约30℃至约32℃、约30℃至约33℃、约31℃至约33℃、约31℃至约32℃、约30℃至约33℃或约32℃至约33℃
在其他实施方案中，温度在发酵期间改变，例如，取决于发酵阶段。
发酵可用本领域普通技术人员已知的多种微生物实现。用于大规模产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的合适的微生物包括本文列出的任何微生物。在一些实施方案中，微生物的非限制性示例包括以下属的菌株：酵母属种(包括但不限于酿酒酵母(面包酵母)、糖化酵母(S.distaticus)、葡萄汁酵母)、克鲁维酵母属(包括但不限于马克斯克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis))、假丝酵母属(包括但不限于假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)和芸苔假丝酵母(C.brassicae))、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)属(休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的亲缘菌)、棒孢毕赤酵母(Clavispora)属(包括但不限于葡萄牙棒孢酵母(C.lusitaniae)和仙人掌棒孢酵母(C.opuntiae))、管囊酵母(Pachysolen)属(包括但不限于嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus))、酒香酵母(Bretannomyces)属(包括但不限于例如铁红梅氏酒香酵母(B.clausenii))。其他合适的微生物包括例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、梭菌属种(Clostridium spp.)(包括但不限于热纤维梭菌(C.thermocellum)、糖丁基丙酮梭菌(C.saccharobutylacetonicum)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、略紫色梭菌(C.Puniceum)、拜氏梭菌(C.beijernckii)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum))、丛梗孢酵母(Moniliella pollinis)、浸透压耐性酵母(Moniliella megachiliensis)、乳杆菌属种、解脂耶氏酵母、短梗霉属种(Aureobasidium sp.)、三型孢菌属种(Trichosporonoidessp.)、变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)、毛孢子菌属种(Trichosporon sp.)、丛梗孢酵母属种(Moniliellaacetoabutans sp.)、变异核瑚菌(Typhula variabilis)、木兰假丝酵母(Candida magnolias)、黑粉菌纲属种(Ustilaginomycetes sp.)、筑波拟酵母(Pseudozyma tsukubaensis)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)和毕赤酵母属的酵母种、以及暗丛梗孢形圆酵母属(Torula)的真菌。参见例如，Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversiontechnology，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编辑，Taylor&Francis，Washington，D.C.，179-212。
发酵培养基可根据宿主细胞和/或最终使用者的需要来选择。除了例如碳之外的任何必需的补充物也可以单独引入的适当的浓度被包含或作为与另一种补充物或培养基诸如复合氮源的混合物被包含。
酵母发酵
使用酵母的发酵方法是本领域普通技术人员公知的。在一些实施方案中，可根据本文提供的方法使用分批发酵；在其他实施方案中，可使用连续发酵程序。
在一些实施方案中，可使用分批发酵方法生产本发明的TVP。简而言之，分批发酵方法是指用封闭系统进行的发酵类型，其中培养基的组成在发酵开始时确定并且在发酵期间不经受人为改变(即，将培养基在发酵开始时用一种或多种酵母细胞接种，并且允许发酵继续进行，不被使用者中断)。典型地，在分批发酵系统中，系统的代谢物和生物质组成持续变化，直到发酵停止。在分批培养中，酵母细胞经过静态停滞期到高生长对数期，最后到稳定期，在稳定期生长速率降低或停止。如果不处理，处于稳定期的酵母细胞将最终死亡。在分批方法中，对数期的酵母细胞通常负责终产物的大量合成。
在一些实施方案中，可使用补料分批发酵生产本发明的TVP。简而言之，补料分批发酵类似于典型的分批方法(如上所述)，然而，补料分批方法中的底物随着发酵进行而以增量添加。当分解代谢物阻遏可能抑制酵母细胞代谢时，以及当希望培养基中具有有限量的底物时，补料分批发酵是有用的。通常，补料分批系统中底物浓度的测量是基于反映代谢的可测量因素的变化来估计的，这些因素例如pH、溶解氧、废气(例如CO2)分压等。
在一些实施方式中，补料分批发酵程序可用于如下产生TVP：在用N2/CO2混合物喷射的10L生物反应器中，使用含有5g/L磷酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁和30g/L玉米浆以及20g/L的初始第一碳源和第二碳源浓度的5L肉汤培养生产生物体(例如，改良的酵母细胞)。随着改良的酵母细胞生长并利用碳源，然后以近似平衡碳源消耗的速率将附加的70％碳源混合物进料到生物反应器中。生物反应器的温度通常维持在30℃。生长持续约24小时或更长时间，异源肽达到所需浓度，例如细胞密度在约5和10g/L之间。在培养期完成后，可使发酵罐内容物通过细胞分离单元诸如离心机以去除细胞和细胞碎片，并且可将发酵液转移至产物分离单元。异源肽的分离可通过本领域公知的标准分离方法进行。
在一些实施方案中，可使用连续发酵产生本发明的TVP。简而言之，连续发酵是指用开放系统进行的发酵，其中将发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时移出大致等量的条件培养基用于处理。连续发酵通常使培养物维持在高密度，其中酵母细胞主要处于对数生长期。典型地，进行连续发酵方法以维持稳态生长条件，并且由于培养基撤除导致的酵母细胞损失应与发酵中的细胞生长速率平衡。
在一些实施方案中，连续发酵方法可用于如下产生TVP：可使用生物反应器设备和培养基组合物培养改良的酵母菌株，尽管其中初始第一碳源和第二碳源为约例如30-50g/L。当碳源耗尽时，以约0.5L/hr至1L/hr之间的速率连续供应相同组成的补料培养基，并以相同速率抽取液体。生物反应器中的异源肽浓度通常与细胞密度一起保持恒定。温度通常维持在30℃，并且根据需要使用浓NaOH和HCl将pH通常维持在约4.5。
在一些实施方案中，当生产TVP时，生物反应器可连续操作，例如持续约一个月，每天或根据需要取样以确保目标化合物浓度的一致性。在连续模式中，随着新的补料培养基的供应，发酵罐内容物被不断地被移出。然后在去除或不去除细胞和细胞碎片的情况下，可对含有细胞、培养基和异源肽的出口流进行连续产物分离程序，并且可通过本领域公知的连续分离方法进行以从目的肽中分离有机产物。
在一些实施方案中，可使可操作以表达TVP或TVP-杀昆虫蛋白的酵母细胞例如使用分批补料工艺在需氧生物反应器中生长。简而言之，用包含碳源和其他试剂的培养基将反应器填充至约20％至约70％容量。使用如本文所述的一种或多种化学品维持温度和pH。通过与搅拌一致地间歇喷射空气来维持氧水平。
例如，在一些实施方案中，本发明提供了在需氧生物反应器中使用补料分批工艺的方法，其中将反应器填充至约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％容量。
在一些实施方案中，本发明提供了使用需氧生物反应器产生TVP的补料分批发酵方法，其中培养基是丰富培养基。例如，在一些实施方案中，碳源可以是葡萄糖、山梨糖醇或乳糖。
在一些实施方案中，葡萄糖的量可为约2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L或30g/L培养基。
在一些实施方案中，山梨糖醇的量可为约2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L或30g/L培养基。
在一些实施方案中，乳糖的量可为约2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L或30g/L培养基。
在一些实施方案中，本发明提供了使用需氧生物反应器的补料分批发酵方法，其中该培养基补充有磷酸、硫酸钙、硫酸钾、硫酸镁七水合物、氢氧化钾和/或玉米浆中的一种或多种。
在一些实施方案中，培养基可补充约2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L或30g/L的量的磷酸到培养基中。
在一些实施方案中，培养基可补充约0.05g/L、0.15g/L、0.25g/L、0.35g/L、0.45g/L、0.55g/L、0.65g/L、0.75g/L、0.85g/L、0.95g/L、1.05g/L、1.15g/L、1.25g/L、1.35g/L、1.45g/L、1.55g/L、1.65g/L、1.75g/L、1.85g/L、1.95g/L、2.05g/L、2.15g/L、2.25g/L、2.35g/L、2.45g/L、2.55g/L、2.65g/L、2.75g/L、2.85g/L或2.95g/L的量的硫酸钙到培养基中。
在一些实施方案中，培养基可补充约2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L、10g/L、10.5g/L、11g/L、11.5g/L、12g/L、12.5g/L、13g/L、13.5g/L、14g/L、14.5g/L、15g/L、15.5g/L、16g/L、16.5g/L、17g/L、17.5g/L、18g/L、18.5g/L、19g/L、19.5g/L或20g/L的量的硫酸钾到培养基中。
在一些实施方案中，培养基可补充约0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1g/L、1.25g/L、1.5g/L、1.75g/L、2g/L、2.25g/L、2.5g/L、2.75g/L、3g/L、3.25g/L、3.5g/L、3.75g/L、4g/L、4.25g/L、4.5g/L、4.75g/L、5g/L、5.25g/L、5.5g/L、5.75g/L、6g/L、6.25g/L、6.5g/L、6.75g/L、7g/L、7.25g/L、7.5g/L、7.75g/L、8g/L、8.25g/L、8.5g/L、8.75g/L、9g/L、9.25g/L、9.5g/L、9.75g/L、10g/L、10.25g/L、10.5g/L、10.75g/L、11g/L、11.25g/L、11.5g/L、11.75g/L、12g/L、12.25g/L、12.5g/L、12.75g/L、13g/L、13.25g/L、13.5g/L、13.75g/L、14g/L、14.25g/L、14.5g/L、14.75g/L或15g/L的量的硫酸镁七水合物到培养基中。
在一些实施方案中，培养基可补充约0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1g/L、1.25g/L、1.5g/L、1.75g/L、2g/L、2.25g/L、2.5g/L、2.75g/L、3g/L、3.25g/L、3.5g/L、3.75g/L、4g/L、4.25g/L、4.5g/L、4.75g/L、5g/L、5.25g/L、5.5g/L、5.75g/L、6g/L、6.25g/L、6.5g/L、6.75g/L或7g/L的量的氢氧化钾到培养基中。
在一些实施方案中，培养基可补充约5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L或70g/L的量的玉米浆到培养基中。
在一些实施方案中，反应器的温度可保持在约15℃至约45℃之间。在一些实施方案中，反应器可具有约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃的温度。
在一些实施方案中，pH可具有约3至约6的水平。在一些实施方案中，pH可为3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
在一些实施方案中，可通过添加一种或多种化学品将pH维持在恒定水平。例如，在一些实施方案中，可添加氢氧化铵以维持pH。在一些实施方案中，可将氢氧化铵添加到培养基中至氢氧化铵的水平为约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的氢氧化铵
在一些实施方案中，可通过喷射维持氧水平。例如，在一些实施方案中，通过在0.5-1.5体积/体积/分钟之间喷射空气和通过增加搅拌以维持10％-30％的设定点，可将溶解氧维持在恒定水平。
在一些实施方案中，反应器的接种可基于包含约2.5g/L至约50g/L碳源(例如葡萄糖、山梨糖醇或乳糖)的过夜种子培养物来实现。在一些实施方案中，过夜种子培养物可包含玉米浆，例如约2.5g/L至约50g/L的玉米浆。
在一些实施方案中，接种百分比可在初始填充体积的约5％-20％的范围内。接种后，可向反应器中添加约50％至约80％的所选碳源溶液，直至反应器充满和/或达到期望的上清液肽浓度。在一些实施方案中，填充反应器所需的时间可在约86小时至约160小时范围内。在一些实施方案中，达到期望的肽浓度所需的量可在约0.8g/L至约1.2g/L的范围内。发酵完成后，可使内容物通过细胞分离单元并任选地浓缩，这取决于材料的预期用途。
本文提供了用于酵母发酵培养基的附加配方。
酵母细胞发酵培养基和储备液的配方描述如下：(1)MSM培养基配方：2g/L柠檬酸钠二水合物；1g/L硫酸钙二水合物(0.79g/L无水硫酸钙)；42.9g/L磷酸二氢钾；5.17g/L硫酸铵；14.33g/L硫酸钾；11.7g/L硫酸镁七水合物；2mL/L PTM1痕量盐溶液；0.4ppm生物素(来自500X，200ppm储备液)；1％-2％纯甘油或其他碳源。(2)PTM1痕量盐溶液：硫酸铜-5H2O6.0g；碘化钠0.08g；硫酸锰-H2O 3.0g；钼酸钠-2H2O 0.2g；硼酸0.02g；氯化钴0.5g；氯化锌20.0g；硫酸亚铁-7H2O 65.0g；生物素0.2g；硫酸5.0ml；添加水至终体积为1升。乳酸克鲁维酵母确定成分培养基(DMSor)的示例性组成如下：11.83g/L KH2PO4、2.299g/L K2HPO4、20g/L可发酵糖(例如半乳糖、麦芽糖、乳糖三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如赤藓糖醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇和木糖醇)、1g/LMgSO4.7H2O、10g/L(NH4)SO4、0.33g/L CaCl2.2H2O、1g/L NaCl、1g/L KCl、5mg/L CuSO4.5H2O、30mg/L MnSO4.H2O、10mg/L ZnCl2、1mg/L KI、2mg/L CoCl2.6H2O、8mg/L Na2MoO4.2H2O、0.4mg/L H3BO3、15mg/L FeCl3.6H2O、0.8mg/L生物素、20mg/L泛酸钙、15mg/L硫胺素、16mg/L肌醇、10mg/L烟酸和4mg/L吡哆醇。
肽降解
蛋白质、多肽和肽在生物样品和溶液中(例如，细胞培养物和/或发酵期间)均有降解。检测TVP肽降解的方法是本领域公知的。在此可使用任何公知的检测肽降解(例如，在发酵期间)的方法。
在一些实施方案中，肽降解可使用以下技术检测：同位素标记技术；液相色谱/质谱(LC/MS)；HPLC；放射性氨基酸的并入和随后的检测，例如经由闪烁计数；使用报告蛋白，例如可(例如通过荧光、光谱、发光测定等)检测的蛋白；一种或多种生物发光蛋白和/或荧光蛋白和/或其融合物的荧光强度；脉冲追踪分析(例如，用放射性氨基酸脉冲标记细胞，并在用未标记前体追踪的同时跟踪标记蛋白质的衰减，以及阻止蛋白质合成并测量总蛋白质水平随时间的衰减)；放线菌酮追踪测定；
在一些实施方案中，测定可用于检测肽降解，其中使样品与非荧光化合物接触，该非荧光化合物可操作以与所述样品中经由肽降解所产生的游离伯胺反应，然后产生可量化并与标准物进行比较的荧光信号。可用作根据本公开的游离胺的荧光标记的非荧光化合物的示例是3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-甲醛(CBQCA)、荧光胺和邻苯二甲醛。
在一些实施方案中，测定来自报告蛋白的读出信号的方法取决于报告蛋白的性质。例如，对于荧光报告蛋白，读出信号对应于荧光信号的强度。例如，可使用基于光谱学、荧光测定法、光度测定法和/或基于发光测定法的方法和检测系统来测量读出信号。此类方法和检测系统是本领域公知的。
在一些实施方案中，本领域普通技术人员已知的标准免疫学方法可用于检测肽降解。例如，在一些实施方案中，可使用采用可检测抗体的免疫测定来检测样品中的肽降解。此类免疫测定包括例如凝集测定、ELISA、Pandex微量荧光测定、流式细胞术、血清诊断测定和免疫组织化学染色程序，所有这些方法都是本领域公知的。在一些实施方案中，可将一个样品中的水平(例如荧光水平)与标准物进行比较。抗体可通过本领域公知的各种方法检测。例如，可将可检测标记物可直接或间接地连接至抗体。可用的标记物包括例如放射性核苷酸、酶、荧光团、色原体和化学发光标记。
检测肽降解的示例性方法在以下文献中提供：美国专利号5,766,927、7,504,253、9,201,073、9,429,566；美国专利申请20120028286；Eldeeb等人，A molecular toolboxfor studying protein degradation in mammalian cells.J Neurochem.2019年11月；151(4)：520-533；和Buchanan等人，Cycloheximide Chase Analysis of ProteinDegradation inSaccharomyces cerevisiae.J Vis Exp.2016；(110)：53975，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
药学上可接受的盐
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”和“农业上可接受的盐”是同义的。在一些实施方案中，可使用本文所述的TVP的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、晶体形式和单独的异构体、对映异构体、互变异构体、非对映异构体和前药。
在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的盐具有母体化合物的期望的药理学活性。此类盐包括：与无机酸形成的酸加成盐；与有机酸形成的酸加成盐；或当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、铝离子替换时形成的盐；或与有机碱诸如乙醇胺等配位。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐包括常规的毒性或无毒性盐。例如，在一些实施方案中，常规无毒盐包括诸如富马酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氯酸盐(chlorydrate)等的那些。在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由母体化合物合成。在一些实施方案中，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。在一些实施方案中，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表见Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可以是以下中的一种：盐酸盐；钠；硫酸盐；乙酸盐；磷酸盐或二磷酸盐；氯化物；钾；马来酸盐；钙；柠檬酸盐；甲磺酸盐；硝酸盐；酒石酸盐；铝；或葡糖酸盐。
在一些实施方案中，可用于形成盐的药学上可接受的酸的列表可以是：乙醇酸；马尿酸；氢溴酸；盐酸；异丁酸；乳酸(DL)；乳糖酸；月桂酸；马来酸；苹果酸(-L)；丙二酸；扁桃酸(DL)；甲磺酸；萘-1，5-二磺酸；萘-2-磺酸；烟酸；硝酸；油酸；草酸；棕榈酸；双羟萘酸；磷酸；丙酸；焦谷氨酸(-L)；水杨酸；癸二酸；硬脂酸；琥珀酸；硫酸；酒石酸(+L)；硫氰酸；甲苯磺酸(p)；十一碳烯酸；1-羟基-2-萘甲酸；2，2-二氯乙酸；2-羟基乙磺酸；2-氧代戊二酸；4-乙酰氨基苯甲酸；4-氨基水杨酸；乙酸；己二酸；抗坏血酸(L)；天冬氨酸；苯磺酸；苯甲酸；樟脑酸(+)；樟脑-10-磺酸(+)；癸酸(capric acid，decanoic acid)；己酸(caproic acid，hexanoic acid)；辛酸(caprylic acid，octanoic acid)；碳酸；肉桂酸；柠檬酸；环拉酸；十二烷基硫酸；乙烷-1，2-二磺酸；乙磺酸；甲酸；富马酸；半乳糖二酸；龙胆酸；葡庚糖酸(D)；葡糖酸(D)；葡糖醛酸(D)；谷氨酸；戊二酸；或甘油磷酸。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可以是任何有机或无机加成盐。
在一些实施方案中，盐可使用无机酸和有机酸作为游离酸。无机酸可以是盐酸、溴酸、硝酸、硫酸、高氯酸、磷酸等。有机酸可以是柠檬酸、乙酸、乳酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、甲磺酸、葡糖酸、琥珀酸、酒石酸、半乳糖醛酸、帕莫酸、谷氨酸、天冬氨酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、4-甲苯磺酸、水杨酸、柠檬酸、苯甲酸、丙二酸等。
在一些实施方案中，盐包括碱金属盐(钠盐、钾盐等)和碱土金属盐(钙盐、镁盐等)。例如，酸加成盐可包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘二甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐、铝盐、精氨酸盐、苄星盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐、锌盐等，并且其中可使用盐酸盐或三氟乙酸盐。
在其他实施方案中，药学上可接受的盐可以是与酸形成的盐，该酸诸如乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、三氟乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、硬脂酸、琥珀酸、乙基琥珀酸、乳糖酸、葡糖酸、葡庚糖酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、月桂基硫酸、苹果酸、天冬氨酸、谷氨酸、己二酸、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、氢碘酸、烟酸、草酸、苦味酸、硫氰酸、十一烷酸、聚丙烯酸酯或聚羧乙烯聚合物。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可由无机碱或有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、亚铁盐、锌盐、铜盐、二价锰盐、铝盐、铁盐、锰盐等。优选的无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)和环胺(包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶等)的盐。优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、氨丁三醇和胆碱。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐是指在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等人describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本发明的盐可在本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。药学上可接受的无毒酸加成盐的示例是氨基与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(诸如离子交换)形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。适当时，其他药学上可接受的盐包括使用抗衡离子诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
药学上可接受的盐的示例性描述提供于P.H.Stahl和C.G.Wermuth，(编辑)，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use，John Wiley&Sons，8月23日，(2002)，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
TVP并入植物或其部分中
本文所述的TVP和/或由本文所述的一种或多种TVP组成的杀昆虫蛋白可并入植物、植物组织、植物细胞、植物种子和/或其植物部分中，用于TVP或TVP-杀昆虫蛋白和/或编码其的多核苷酸序列的稳定或瞬时表达。
在一些实施方案中，可使用本领域已知的重组技术将TVP(或由一种或多种TVP组成的杀昆虫蛋白)并入植物中。在一些实施方案中，TVP或由一种或多种TVP组成的杀昆虫蛋白可以是由一种或多种TVP单体组成的杀昆虫蛋白的形式。
如本文所用，就转基因植物、植物组织、植物细胞和植物种子而言，术语“TVP”还涵盖TVP-杀昆虫蛋白，并且“TVP多核苷酸”类似地还用于涵盖可操作以表达和/或编码由一种或多种TVP组成的杀昆虫蛋白的多核苷酸或多核苷酸组。
将TVP并入植物中(即，以制备表达U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸和/或TVP-杀昆虫蛋白的转基因植物)的目的是经由昆虫对在由该昆虫消耗的植物组织中表达的转基因TVP的消耗而将含有TVP的杀昆虫蛋白递送至有害生物。当昆虫从其食物中消耗TVP时(例如，经由昆虫以用TVP转化的转基因植物为食)，消耗的TVP可能具有抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫的能力。因此，表达TVP多核苷酸和/或TVP多肽的转基因植物可在多种植物组织中表达所述TVP多核苷酸/多肽，这些植物组织包括但不限于：表皮(例如叶肉)；周皮；韧皮部；木质部；薄壁组织；厚角组织；厚壁组织；和初生和次生分生组织。例如，在一些实施方案中，编码TVP的多核苷酸序列可与含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶启动子的调控区可操作地连接，导致TVP在植物叶肉组织中表达。
表达TVP和/或可操作以表达TVP的多核苷酸的转基因植物可通过本领域普通技术人员公知的各种方法和方案中的任一种来生成；本发明的这些方法不需要使用将核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要核苷酸构建体能够进入植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已将外源核酸序列或DNA片段并入或整合到植物细胞中的植物。这些核酸序列包括是外源的或不存在于未转化的植物细胞中的核酸序列，以及可以是内源的或存在于未转化的植物细胞中的核酸序列。“异源”通常是指这样的核酸序列，它们不是细胞内源性的也不是它们所存在的天然基因组的一部分内源性的，并且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微投影等添加到细胞中。
植物细胞的转化可通过本领域已知的几种技术之一来实现。通常，表达外源或异源目的肽或多肽(例如TVP)的构建体将含有驱动基因转录的启动子，以及允许转录终止和聚腺苷酸化的3′非翻译区。此类构建体的设计和组织在本领域中是公知的。在一些实施方案中，基因可被工程化，使得所得肽被分泌，或在植物细胞内以其他方式靶向特定区域和/或细胞器。例如，可以将基因工程改造为含有信号肽以促进肽向内质网的转移。也可以优选地将植物表达盒工程改造成含有内含子，使得内含子的mRNA加工是表达所必需的。
通常，植物表达盒可以插入植物转化载体中。该植物转化载体可包含实现植物转化所需的一种或多种DNA载体。例如，本领域的常规实践是利用包含一个以上连续DNA区段的植物转化载体。这些载体在本领域中通常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性非常大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，该质粒载体包含T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、经工程改造为能够在植物细胞中表达的选择性标记物以及“目的基因”(生成转基因植物所需的经工程改造为能够在植物细胞中表达的基因)。该质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列以某种方式排列，以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达。例如，选择性标记物基因和TVP位于左边界与右边界之间。第二质粒载体通常含有介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。该质粒通常含有毒力功能(Vir基因)，其使得农杆菌能感染植物细胞，并通过边界序列处的切割和vir介导的DNA转移而转移DNA，如本领域所理解的那样(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。第二质粒载体不是通过其他方法例如显微投影、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等转化植物所必需的。
一般而言，植物转化方法涉及将异源DNA转移到目标植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，然后应用最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记物基因)以从一组未转化的细胞团中回收转化的植物细胞。通常将外植体转移到新供应的相同培养基中并按常规方式培养。随后，在置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后，使转化的细胞分化成芽。然后将芽转移到选择性生根培养基中以回收生根的芽或小植株。然后，转基因小植株生长成成熟植物并产生可育种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology 14：745-750)。通常将外植体转移到新供应的相同培养基中并按常规方式培养。用于生成转基因植物的技术和方法的一般描述见于Ayres和Park(1994)CriticalReviews in Plant Science 13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120。因为转化的材料含有许多细胞，因此转化的和未转化的细胞都存在于任何一块受试目标愈伤组织或组织或细胞群中。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。通常，除去未转化细胞的能力限制了转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功生成。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物的方案可以根据目标在于进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变化。转基因植物的生成可以通过几种方法之一进行，这些方法包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用粘附于粒子的异源外来DNA轰击植物细胞、弹道粒子加速、气溶胶束转化、Lec1转化和各种其他非粒子直接介导的转移DNA的方法。示例性转化方案公开于美国公开申请20010026941、美国专利号4,945,050、国际公开号WO 91/00915和美国公开申请号2002015066中，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
叶绿体也可容易地转化，并且涉及叶绿体转化的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。叶绿体转化的方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记物的DNA并通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，质体转化可以通过核编码的且质体定向的RNA聚合酶的组织优先表达来反式激活沉默的质体携带的转基因而实现。这样的系统在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中进行了报道。
在将异源外来DNA整合到植物细胞中之后，本领域普通技术人员然后可在培养基中应用最大阈值水平的适当选择化学品/试剂(例如，抗生素)以杀死未转化的细胞，并通过将所述存活的细胞定期转移到新鲜培养基中来分离和生长从该选择处理中存活的推定转化的细胞。通过连续传代并经过合适的筛选而挑战，技术人员鉴定并增殖用质粒载体转化了的细胞。然后可以使用分子和生物化学方法来确认整合的异源目的基因存在于转基因植物的基因组中。
可使已转化的细胞根据本领域普通技术人员已知的常规方法生长成植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。然后可以使这些植物生长，并用相同的转化品系或不同的品系授粉，并鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以生长两代或更多代以确保稳定维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保实现所需表型特征的表达。以这种方式，本公开提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，本发明的核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)稳定地并入其基因组中。
在各种实施方案中，本公开提供了一种充当如上所述的昆虫蛋白酶、蛋白酶和肽酶(本文统称为“蛋白酶”)的底物的TVP-杀昆虫蛋白。
在一些实施方案中，可接受TVP表达的转基因植物或其部分可包括：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、西葫芦、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、西红柿、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
在一些实施方案中，可使转基因植物从最初用本文所述的DNA构建体转化的细胞生长。在其他实施方案中，转基因植物可以在特定组织或植物部分(例如叶、茎、花、萼片、果实、根、种子或它们的组合)中表达所编码的TVP。
在一些实施方案中，可用TVP或编码TVP的多核苷酸转化植物、植物组织、植物细胞或植物种子，其中该TVP包含具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的TVP多肽：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；并且其中X6为G或不存在。
在一些实施方案中，可用TVP或编码TVP的多核苷酸转化植物、植物组织、植物细胞或植物种子，其中该TVP包含具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的TVP多肽：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为G或不存在；并且其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，可用TVP或编码TVP的多核苷酸转化植物、植物组织、植物细胞或植物种子，其中该TVP包含具有选自由SEQ NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30组成的组的氨基酸序列的TVP多肽。
在一些实施方案中，可用编码TVP的多核苷酸转化植物、植物组织、植物细胞或植物种子，其中编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列选自由SEQ NO 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15组成的组。
在一些实施方案中，可用TVP或编码TVP的多核苷酸转化植物、植物组织、植物细胞或植物种子，其中该TVP还包含两种或更多种TVP多肽的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
具有可切割接头和不可切割接头的蛋白质
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白包含至少一种与可切割肽可操作地连接的TVP。在其他实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白包含至少一种与不可切割肽可操作地连接的TVP。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可具有两种或更多种可切割肽，其中该杀昆虫蛋白包含昆虫可切割接头(L)，该昆虫可切割接头与包含(TVP-L)n的构建体框内融合，其中“n”为在1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在另一个实施方案中，本文所述的TVP-杀昆虫蛋白包含与TVP可操作地连接的内质网信号肽(ERSP)，该TVP与昆虫可切割接头(L)和/或重复构建体(L-TVP)n或(TVP-L)n可操作地连接，其中n为1至200、或1至100、或1至10的整数。
在各种实施方案中，示例性杀昆虫蛋白可包括蛋白构建体，该蛋白构建体包含：(ERSP)-(TVP-L)n、(ERSP)-(L)-(TVP-L)n、(ERSP)-(L-TVP)n、(ERSP)-(L-TVP)n-(L)；其中n为1至200或1至100或1至10范围内的整数。在上述各种相关实施方案中，TVP是前述U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽，L是不可切割或可切割的肽，并且n为1至200范围内的整数，优选地1至100范围内的整数，并且更优选地1至10范围内的整数。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可含有相同或不同的TVP肽，以及相同或不同的昆虫可切割肽。在一些实施方案中，C端TVP在其C端与可切割肽可操作地连接，该可切割肽可操作以在昆虫肠道环境中被切割。在一些实施方案中，N端TVP在其N端与可切割肽可操作地连接，该可切割肽可操作以在昆虫肠道环境中被切割。
在昆虫肠道环境中发现的一些可用的蛋白酶和肽酶依赖于昆虫的生命阶段，因为这些酶通常在空间和时间上表达。昆虫的消化系统由消化道和相关的腺体组成。食物进入口腔并且与可以包含或可以不包含消化性蛋白酶和肽酶的分泌物混合。前肠和后肠是外胚层起源的。前肠通常作为原始食物的储存库。离散的食物团从前肠进入中肠(肠系膜(mesenteron)或昆虫的胃(ventriculus))。中肠是食物营养物的消化和吸收部位。通常，某些蛋白酶和肽酶根据肠道pH而存在于中肠中。人胃肠系统中的某些蛋白酶和肽酶可以包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶。
昆虫肠道环境包括食草动物物种中的消化系统的区域，其中肽和蛋白在消化期间被降解。在昆虫肠道环境中发现的一些可用的蛋白酶和肽酶可包括：(1)丝氨酸蛋白酶；(2)半胱氨酸蛋白酶；(3)天冬氨酸蛋白酶，和(4)金属蛋白酶。
植食性昆虫的消化系统中的两种主要蛋白酶类别是丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。Murdock等人(1987)对属于鞘翅目(Coleoptera)的各种有害生物的中肠酶进行了详细研究，而Srinivasan等人(2008)则报道了属于鳞翅目的各种有害生物的中肠酶。已知丝氨酸蛋白酶在幼虫肠道环境中占优势地位并且在鳞翅目中占总消化活性的约95％，而鞘翅目的种具有更广泛的优势肠道蛋白酶(包括半胱氨酸蛋白酶)。
木瓜蛋白酶家族含有具有各种活性的肽酶，包括具有广泛特异性的内肽酶(诸如木瓜蛋白酶)、具有非常窄的特异性的内肽酶(诸如甘氨酰内肽酶)、氨肽酶、二肽基肽酶以及具有内肽酶活性和外肽酶活性二者的肽酶(诸如组织蛋白酶B和H)。各种昆虫的中肠中存在的其他示例性蛋白酶包括胰蛋白酶样酶，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶B和氨基三肽酶。
丝氨酸蛋白酶广泛分布于几乎所有动物和微生物中(Joanitti等人，2006)。在高等生物中，几乎2％的基因编码这些酶(Barrette-Ng等人，2003)。对于宿主生物的维持和存活基本上必不可少的丝氨酸蛋白酶在许多生物过程中发挥着关键作用。丝氨酸蛋白酶的经典分类通过它们的底物特异性进行，特别是P1处的残基：胰蛋白酶样(P1处优选的Lys/Arg)、胰凝乳蛋白酶样(P1处的大型疏水性残基，诸如Phe/Tyr/Leu)或弹性蛋白酶样(P1处的小型疏水性残基，诸如Ala/Val)(Tyndall等人修订，2005)。丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，它们的中心催化机构由三个不变的残基：即天冬氨酸、组氨酸和独特反应性丝氨酸组成，它们的名称“催化三联体”来自后者。Asp-His-Ser三联体可以存在于至少四种不同的结构背景中(Hedtrom，2002)。这四个家族的丝氨酸蛋白酶的代表是胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y和Clp蛋白酶。已经进行最详细研究的胰凝乳蛋白酶样家族的三种丝氨酸蛋白酶是胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。最近，已经发现了具有新型催化三联体和二联体的丝氨酸蛋白酶(包括Ser-His-Glu、Ser-Lys/His、His-Ser-His和N端Ser)在消化中的作用。
在昆虫肠道环境中发现的一类已充分研究的消化酶是半胱氨酸蛋白酶的类别。术语“半胱氨酸蛋白酶”旨在描述在酶的催化位点具有半胱氨酸残基的高反应性硫醇基团的蛋白酶。有证据表明，许多植食性昆虫和植物寄生线虫至少部分依赖于中肠半胱氨酸蛋白酶来进行蛋白消化。这些包括但不仅限于半翅目，特别是南瓜缘蝽(Anasa tristis)；喜绿蝽(Acrosternum hilare)；点蜂缘椿象(Riptortus clavatus)；以及目前为止研究的几乎所有鞘翅目，特别是科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa deaemlineata)；三线马铃薯甲虫(Lema trilineata)；芦笋甲虫(Crioceris asparagi)；墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis)；赤拟谷盗(Triolium castaneum)；扁拟谷盗(Tribolium confusum)；跳甲(凹胫跳甲属种(Chaetocnema spp.)、跳甲属种(Haltica spp.)和毛跳甲属种(Epitrixspp.))；玉米根虫(条叶甲属种(Diabrotica Spp.))；四纹豆象(Callosobruchusaculatue)；棉铃象(Antonomus grandis)；米象(Sitophilus oryza)；玉米象(Sitophiluszeamais)；谷象(Sitophilus granarius)；埃及苜蓿象甲(Hypera postica)；大豆象(Acanthoseelides obtectus)；谷蠹(Rhyzopertha dominica)；黄粉虫(Tenebriomolitor)；缨翅目(Thysanoptera)，特别是西花蓟马(Franklini ella occidentalis)；双翅目(Diptera)，特别是潜蝇属种(leafminer spp.)(非洲菊斑潜蝇(Liriomyzatrifolii))；植物寄生线虫，特别是马铃薯胞囊线虫(线虫属种(Globodera spp.))、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)和根瘤线虫(根瘤线虫属种(Meloidogyne spp.))。
另一类消化酶是天冬氨酸蛋白酶。术语“天冬氨酸蛋白酶”旨在描述在酶的催化位点具有两个高反应性天冬氨酸残基的蛋白酶，该蛋白酶的最常见特征是它被胃蛋白酶抑制剂(几乎全部已知的天冬氨酸蛋白酶的低分子量抑制剂)特异性抑制。有证据表明，许多植食性昆虫部分依赖于中肠天冬氨酸蛋白酶最常见地与半胱氨酸蛋白酶结合来进行蛋白消化。这些包括但不限于半翅目，特别是长红猎蝽(Rhodnius prolixus)和臭虫(臭虫属种(Cimex spp.))以及瘤蝽科(Phymatidae)、蝽科(Pentatomidae)、长蝽科(Lygaeidae)和负蝽科(Belostomatidae)的成员；鞘翅目，在芫菁科(Meloidae)、金花虫科(Chrysomelidae)、瓢虫科(Coccinelidae)和豆象科(Bruchidae)(全部属于扁虫下目(Cucujiformia)系)中，特别是科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、三线马铃薯甲虫(Lematrilineata)；南部方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)和西方玉米根虫(D.virgifera)、棉铃象(Anthonomus grandis)、南瓜缘蝽(Anasatristis)；跳蚤甲虫(萝卜菜跳甲(Phyllotreta crucifera))、四纹豆象(Callosobruchus maculatus)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、大豆潜叶细蛾(Odontota horni)、具缘芫菁(Epicautapestifera)和赤拟谷盗(Triolium castaneum)；双翅目，特别是家蝇(Musca domestica)。参见Terra and Ferreira(1994)Comn.Biochem.Physiol.109B：1-62；Wolfson和Murdock(1990)J.Chem.Ecol.16：1089-1102。
多核苷酸并入植物中
关于异源多肽在转基因植物中表达的挑战是在宿主生物体中表达时维持所引入多肽的期望作用(例如杀昆虫活性)；维持此类作用的一种方法是通过使用可操作地连接的内质网信号肽(ERSP)来增加正确蛋白质折叠的机会。另一种维持转基因蛋白作用的方法是并入翻译稳定蛋白(STA)。
使用上述任何转染方法，可用编码TVP或包含一种或多种TVP的TVP-杀昆虫蛋白的DNA序列瞬时或稳定转染植物。另选地，可用编码TVP的多核苷酸转染植物，其中所述TVP与可操作以编码内质网信号肽(ERSP)、接头、翻译稳定蛋白(STA)或它们的组合的多核苷酸可操作地连接。例如，在一些实施方案中，转基因植物或植物基因组可用编码内质网信号肽(ERSP)、TVP和/或插入接头肽(接头或L)的多核苷酸序列转化，从而使从异源DNA转录的mRNA在转化植物中表达，并随后将所述mRNA翻译成肽。
内质网信号肽(ERSP)
重组蛋白在亚细胞层面上靶向ER可通过使用与所述重组蛋白可操作地连接的ERSP来实现；这允许这些蛋白质的正确组装和/或折叠，以及这些重组蛋白在植物中的高水平积累。有关在细胞内储库中进行宿主蛋白质区室化的示例性方法公开于McCormick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.uSA 96(2)：703-708，1999；Staub等人，Nature Biotechnology 18：333-338，2000；Conrad et al.，Plant Mol.Biol.38：101-109，1998；和Stoger等人，PlantMol.Biol.42：583-590，2000中，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。因此，实现重组蛋白的正确组装和/或折叠的一种方式是将内质网信号肽(ERSP)与目的重组蛋白可操作地连接。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的肽可与TVP(命名为ERSP-TVP)可操作地连接，其中所述ERSP是所述肽的N端。在一些实施方案中，ERSP肽的长度在3至60个氨基酸之间，长度在5至50个氨基酸之间，长度在20至30个氨基酸之间。
在一些实施方案中，ERSP可包括但不限于以下之一：BAAS；烟草伸展蛋白信号肽；经修饰的烟草伸展蛋白信号肽；或来自德州雪松(Juniperus ashei)的Jun a 3信号肽。例如，在一些实施方案中，可用编码本文描述为内质网信号肽(ERSP)的肽和TVP中的任一种的核苷酸转化植物。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的蛋白质可与TVP和插入接头肽(L或接头)可操作地连接；此类构建体被命名为ERSP-L-TVP或ERSP-TVP-L，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，并且所述L或接头可在TVP的N端侧(上游)或TVP的C端侧(下游)。命名为ERSP-L-TVP或ERSP-TVP-L的包含本文所述的ERSP或TVP中的任一种的蛋白质可具有接头“L”，其可以是不可切割的接头肽或可切割的接头肽，并且其可在蛋白质表达过程期间在植物细胞中是可切割的，或者可在昆虫肠道环境和/或血淋巴环境中是可切割的。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含本文所述的或本文件教导的任何插入接头肽(接头或L)，包括但不限于以下序列：IGER(SEQ ID NO：31)、EEKKN(SEQ ID NO：32)和ETMFKHGL(SEQ ID NO：33)、ALKFLV(SEQ ID NO：61)或它们的组合。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的蛋白质可与TVP可操作地连接，TVP继而与翻译稳定蛋白(STA)可操作地连接。在此，这种构型被命名为ERSP-STA-TVP或ERSP-TVP-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端并且所述STA可在TVP的N端侧(上游)或TVP的C端侧(下游)。在一些实施方案中，命名为ERSP-STA-TVP或ERSP-TVP-STA的包含本文所述的任何ERSP或TVP的蛋白质可与STA可操作地连接，例如，本文件所述或教导的任何翻译稳定蛋白，包括GFP(绿色荧光蛋白；SEQ ID NO：34；NCBI登录号P42212)，或Jun a 3(德州雪松；SEQ ID NO：36；NCBI登录号P81295.1)。
使用上述任何一种转染方法，可用编码TVP或包含一种或多种TVP的杀昆虫蛋白的DNA序列瞬时或稳定转染植物。另选地，可用与ERSP、接头和/或STA蛋白编码多核苷酸可操作地连接的编码TVP的多核苷酸转染植物。例如，在一些实施方案中，可转染转基因植物或植物基因组以并入编码内质网信号肽(ERSP)、TVP和/或插入接头肽(接头或L)的多核苷酸序列，从而使从异源DNA转录的mRNA在转化植物中表达。
本公开可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。对于其转基因方法或PEP将是特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉花、西红柿、玉蜀黍、小麦、玉米、甜玉米、紫苜蓿、大豆、高粱、紫花豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、油菜、水稻、大豆、大麦、向日葵、树(包括松类和落叶类)、花(包括商业化和温室种植的那些)、田野羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和油菜、芸苔属种、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
在一些实施方案中，本文所述的TVP表达开放阅读框(ORF)是将使植物能够表达mRNA的多核苷酸序列，mRNA继而将被翻译成肽，肽被表达、正确折叠和/或积累至所述蛋白质提供足以抑制和/或杀死一种或多种有害生物的剂量的程度。在一个实施方案中，蛋白质TVP表达ORF的示例可以是U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸(tvp)、“ersp”(即，编码ERSP多肽的多核苷酸序列)、“接头”(即，编码接头多肽的多核苷酸序列)、“sta”(即，编码STA多肽的多核苷酸序列)或它们的任何组合，并且可以以下等式形式描述：
ersp-sta-(接头i-tvpj)n，或ersp-(tvpj-接头i)n-sta
多核苷酸等式的前述示例性实施方案将导致表达以下蛋白质复合物：ERSP-STA-(接头I-TVPJ)N，其含有四种可能的肽组分，其中破折号用以分离每种组分。ersp的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta的组分是编码翻译稳定蛋白(STA)的多核苷酸区段，其有助于植物中表达的TVP的积累，然而，在一些实施方案中，在TVP表达ORF中包含sta可能不是必需的。接头i的组分是编码插入接头肽(L或接头)的多核苷酸区段，以将TVP与ORF中所含的其他组分以及翻译稳定蛋白分离。下标字母“i”指示在一些实施方案中，可在TVP表达ORF中使用不同类型的接头肽。组分“tvp”指示编码TVP的多核苷酸区段(也称为U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸序列)。下标“j”指示在TVP表达ORF中可包括不同的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸。例如，在一些实施方案中，U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸序列可编码具有氨基酸取代或氨基酸缺失的TVP。如“(接头i-tvpj)n”中所示的下标“n”指示编码插入接头肽和TVP的核苷酸的结构可在相同TVP表达ORF中的相同开放阅读框中重复“n”次，其中“n”可以是1至10的任何整数；“n”可以是1至10，具体地“n”可以是1、2、3、4或5，并且在一些实施方案中“n”是6、7、8、9或10。重复序列可含有编码不同插入接头(接头)和不同TVP的多核苷酸区段。在同一TVP表达ORF内包括重复序列的不同多核苷酸片段全部在同一翻译框内。在一些实施方案中，可能不需要在TVP表达ORF中包含sta多核苷酸。例如，ersp多核苷酸序列可不用接头直接与编码TVP变体多核苷酸的多核苷酸连接。
在上述示例性等式中，编码多肽“TVP”的多核苷酸“tvp”可以是编码任何变体U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽的多核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，“tvp”多核苷酸可编码具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-Xs-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；并且其中X6为G或不存在。
在一些实施方案中，“tvp”多核苷酸可编码具有如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15中任一项所示的氨基酸序列的TVP。
在一些实施方案中，“tvp”多核苷酸或其互补核苷酸序列如SEQ NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中任一项所示。
在上述示例性等式中，编码多肽“TVP”的多核苷酸“tvp”可以是编码任何变体U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽的多核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，“tvp”多核苷酸可编码具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-Xs-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为G或不存在；并且其中如果Z1为T，则该TVP糖基化。
在一些实施方案中，TVP表达ORF以在其5′-末端的ersp开始。为了使TVP在从转基因植物中表达时正确折叠并具有功能，其必须具有与编码TVP的多核苷酸框内融合的ersp核苷酸。在细胞翻译过程期间，翻译的ERSP可通过与称为信号识别颗粒的细胞组分结合而指导被翻译的TVP插入到植物细胞的内质网(ER)中。在ER内，ERSP肽被信号肽酶切割，TVP被释放到ER内，其中TVP在翻译后修饰过程期间被正确折叠，例如形成二硫键。在没有任何附加的滞留蛋白信号的情况下，蛋白质通过ER转运到高尔基体，在那里它最终分泌到质膜外并进入质外体间隙。TVP可在质外体空间有效积累以达到植物中的杀昆虫剂量。
ERSP肽位于植物翻译的TVP复合物的N端区域，并且ERSP部分由约3至60个氨基酸组成。在一些实施方案中，其为5至50个氨基酸。在一些实施方案中，其为10至40个氨基酸，但最通常由15至20、20至25或25至30个氨基酸组成。ERSP是所谓的信号肽，因为它指导蛋白的运输。信号肽也可以称为靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER运输的信号肽的长度通常为15至30个氨基酸残基，并且具有三分式组织，包含疏水性残基核心侧接带正电的氨基末端区域和极性但不带电的羧基末端区域。(Zimmermann等人，“Proteintranslocation across the ER membrane,”Biochimica et Biohysica Acta，2011，1808：912-924)。
许多ERSP是已知的。不要求ERSP来源于植物ERSP，非植物ERSP将与本文所述的程序一起工作。然而，许多植物ERSP是公知的，我们在此描述了一些植物源性ERSP。例如，在一些实施方案中，ERSP可以是大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)，其来源于植物大麦(Hord eumvulgare)，并且具有如下氨基酸序列：MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG(SEQ ID NO：37)。
植物ERSP(其选自已知表达并释放到植物质外体空间中的蛋白质的基因组序列)包括示例诸如BAAS、胡萝卜伸展蛋白和烟草PR1。以下参考文献提供了进一步的描述并且全文以引用方式并入本文：De Loose，M.等人“The extensin signal peptide allowssecretion of a heterologous protein from protoplasts”Gene，99(1991)95-100；DeLoose，M.等人描述了来自皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)的伸展蛋白编码基因的结构分析，该伸展蛋白的序列含有用于将蛋白易位至内质网中的典型信号肽；Chen，M.H.等.&“Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargoproteins to plastids and extracellular compartments ofplant cells”PlantPhysiology，2004年7月；135(3)：1367-77。Epub2004年7月2日。Chen，M.H.等人通过分析转基因烟草中在信号肽的存在或不存在下α-淀粉酶的表达来研究α-淀粉酶在植物细胞中的亚细胞定位。这些参考文献和其他参考文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的信号肽。
烟草伸展蛋白信号肽基序是ERSP的另一种示例性类型。参见Memelink等人，thePlant Journal，1993，V4：1011-1022；Pogue GP等人，Plant Biotechnology Journal，2010，V8：638-654，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，TVP表达ORF可具有烟草伸展蛋白信号肽基序。在一个实施方案中，TVP表达ORF可具有根据SEQ ID NO：38的伸展蛋白基序。在另一个实施方案中，TVP表达ORF可具有根据SEQ ID NO：39的伸展蛋白基序。
如何生成具有伸展蛋白信号基序的实施方案的示例性示例如下：使用具有四种合成DNA引物的寡核苷酸延伸PCR设计编码伸展蛋白基序的DNA序列(例如，SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41中所示的DNA序列)；可使用以伸展蛋白DNA序列作为模板的PCR添加端部位点诸如限制位点，例如在5′-端的Pac I限制位点，和在3′-端处GFP序列的5′-端，并产生片段；将该片段用作正向PCR引物以扩增编码TVP表达ORF的DNA序列，例如包含在pFECT载体中的“gfp-l-tvp”，从而产生编码(从N′到C′末端)“ERSP-GFP-L-TVP”的TVP表达ORF，其中ERSP是伸展蛋白。然后可将所得的DNA序列克隆到FECT载体的Pac I和Avr II限制位点中，以生成用于GFP融合TVP的瞬时植物表达的pFECT-TVP载体。
在一些实施方案中，示例性表达系统可包括将含有TVP表达ORF的FECT表达载体转化到农杆菌GV3101中，并将转化的GV3101注射到烟草叶片中以瞬时表达TVP表达ORF。
翻译稳定蛋白(STA)
翻译稳定蛋白(STA)可增加植物组织中TVP的量。TVP表达ORF之一，即ERSP-TVP，足以在转染的植物中表达正确折叠的TVP，但在一些实施方案中，有效保护植物免受有害生物损害可能需要植物表达的TVP积累。通过转染适当构建的TVP表达ORF，转基因植物可表达和积累更大量的正确折叠的TVP。当植物积累了更大量的正确折叠的TVP时，它可更容易地抵抗、抑制和/或杀死攻击和进食植物的有害生物。一种增加多肽在转基因组织中的积累的方法是通过使用翻译稳定蛋白(STA)。该翻译稳定蛋白可用于显著增加植物组织中TVP的积累，从而增加用TVP转染的植物对有害生物抗性的功效。该翻译稳定蛋白是具有足够的三级结构以使其可在细胞中积累而不被细胞的蛋白降解过程所靶向的蛋白质。下列等式描述了编码与U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸序列融合的稳定蛋白的TVP表达ORF的两个示例：
ersp-sta-l-tvp或ersp-tvp-l-sta
在一些实施方案中，翻译稳定蛋白可以是另一种蛋白质的一个结构域，或者其可包含完整的蛋白质序列。在一些实施方案中，翻译稳定蛋白可在5至50个氨基酸、50至250个氨基酸(例如，GNA)、250至750个氨基酸(例如，几丁质酶)和750至1500个氨基酸(例如，增效蛋白(enhancin))之间。
翻译稳定蛋白的一个实施方案可以是包含至少一个TVP的融合蛋白的聚合物。在此提供了翻译稳定蛋白的具体示例，以说明翻译稳定蛋白的用途。该示例不旨在以任何方式限制本公开或权利要求。可用的翻译稳定蛋白是本领域公知的，并且如本文所公开的，可使用任何这种类型的蛋白。用于评价和测试肽产生的程序在本领域中是已知的并且在本文中描述。一种翻译稳定蛋白的一个示例是绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ ID NO：34；NCBI登录号P42212.1)。
翻译稳定蛋白的其他示例可见于以下参考文献中，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文：Kramer，K.J.等人“Sequence of a cDNA and expression of the geneencoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta”Insect Biochemistryand Molecular Biology，第23卷，第6期，1993年9月，第691-701页。Kramer，K.J.等人isolated and sequenced a chitinase-encoding cDNA from the tobacco homworm，Manduca sexta。Hashimoto，Y.等人“Location and nucleotide sequence of the geneencoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virrus”Journal ofGeneral Virology，(1991)，72，2645-2651。这些参考文献和其他文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定蛋白。
在一些实施方案中，可使用含有STA的TVP表达ORF将TVP表达ORF转化到植物中，例如烟草植物本氏烟(Nicotiana benthamiana)中。例如，在一些实施方案中，STA可以是Juna 3。成熟的Jun a 3是约30kDa的植物防御蛋白，其也是一些人的变应原。Jun a 3由德州雪松树产生，并且在一些实施方案中可用作翻译稳定蛋白(STA)。在一些实施方案中，Jun a 3氨基酸序列可以是SEQ ID NO：36所示的序列。在其他实施方案中，Jun a 3氨基酸序列可以是SEQ ID NO：42所示的序列。
接头
接头蛋白有助于组成TVP表达ORF的不同基序的正确折叠。本发明所述的TVP表达ORF还在编码TVP(tvp)与翻译稳定蛋白(sta)的多核苷酸序列之间、或在编码多个编码TVP(即，(l-tvp)N或(tvp-l)N)的多核苷酸序列的多核苷酸序列之间并入编码插入接头肽的多核苷酸序列，如果表达ORF涉及多个TVP结构域表达的话。插入接头肽(接头或L或LINK)分离所表达的TVP构建体的不同部分，并在表达过程期间帮助复合物的不同部分正确折叠。在表达的TVP构建体中，不同的插入接头肽可参与分离不同的功能结构域。在一些实施方案中，接头与TVP连接，并且该二价基团可重复多达10次(N＝1-10)，并且甚至可能超过10次(例如，N＝200)，以便促进正确折叠的TVP在待保护的植物中的积累。
在一些实施方案中，插入接头肽的长度可在1至30个氨基酸之间。然而，它不一定是植物中表达的TVP中的必需组分。可设计TVP表达ORF的可切割接头肽，以在转化的植物中从所表达的TVP复合物中释放适当的TVP，从而改善TVP为植物提供的对有害生物损害的保护。一种类型的插入接头肽是植物可切割接头肽。在植物翻译后修饰期间，可从所表达的TVP表达ORF复合物中完全去除这种类型的接头肽。因此，在一些实施方案中，在植物中的翻译后修饰期间，通过这种类型的插入接头肽连接的正确折叠的TVP可在植物细胞中从所表达的TVP表达ORF复合物中释放。
另一种类型的可切割插入接头肽在植物中的表达过程期间不可切割。然而，它具有对丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶特异的蛋白酶切割位点。可切割接头肽的类型可被昆虫和鳞翅目肠道环境和/或昆虫血淋巴和鳞翅目血淋巴环境中发现的蛋白酶消化，以在昆虫肠道或血淋巴中释放TVP。使用本公开所教导的信息，本领域技术人员应当常规地制备或找到将在本发明中有用的其他接头示例。
在一些实施方案中，TVP表达ORF可含有可切割类型的插入接头，例如SEQ ID NO：3l中列出的类型，具有氨基酸代码“IGER”(SEQ ID NO：31)。该插入接头或接头的分子量为473.53道尔顿。在其他实施方案中，插入接头肽(接头)也可以是没有任何类型的蛋白酶切割位点的插入接头肽，即不可切割的插入接头肽，例如接头“ETMFKHGL”(SEQ ID NO：33)。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可具有两种或更多种可切割肽，其中该杀昆虫蛋白包含昆虫可切割接头(L)，该昆虫可切割接头与包含(TVP-L)n的构建体框内融合，其中“n”为在1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在另一个实施方案中，本文所述的TVP-杀昆虫蛋白包含与TVP可操作地连接的内质网信号肽(ERSP)，该TVP与昆虫可切割接头(L)和/或重复构建体(L-TVP)n或(TVP-L)n可操作地连接，其中n为1至200、或1至100、或1至10的整数。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的蛋白质可与TVP和插入接头肽(L或接头)可操作地连接；此类构建体被命名为ERSP-L-TVP或ERSP-TVP-L，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，并且所述L或接头可在TVP的N端侧(上游)或TVP的C端侧(下游)。命名为ERSP-L-TVP或ERSP-TVP-L的包含本文所述的ERSP或TVP中的任一种的蛋白质可具有接头“L”，其可以是不可切割的接头肽或可切割的接头肽，并且其可在蛋白质表达过程期间在植物细胞中是可切割的，或者可在昆虫肠道环境和/或血淋巴环境中是可切割的。
在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可包含本文所述的或本文件教导的任何插入接头肽(接头或L)，包括但不限于以下序列：IGER(SEQ ID NO：181)、EEKKN(SEQ ID NO：182)和ETMFKHGL(SEQ ID NO：183)、或它们的组合。
在一些实施方案中，接头可以是以下中的一种或多种：ALKFLV(SEQ ID NO：61)、ALKLFV(SEQ ID NO：62)、IFVRLR(SEQ ID NO：63)、LFAAPF(SEQ ID NO：64)、ALKFLVGS(SEQID NO：65)、ALKLFVGS(SEQ ID NO：66)、IFVRLRGS(SEQ ID NO：67)、LFAAPFGS(SEQ ID NO：68)、LFVRLRGS(SEQ ID NO：69)和/或LGERGS(SEQ ID NO：70)。
前述接头及其制备和使用方法的示例性描述提供于美国专利申请公开US20180362598A1中，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在各种实施方案中，示例性杀昆虫蛋白可包括蛋白构建体，该蛋白构建体包含：(ERSP)-(TVP-L)n、(ERSP)-(L)-(TVP-L)n、(ERSP)-(L-TVP)n、(ERSP)-(L-TVP)n-(L)；其中n为1至200或1至100或1至10范围内的整数。在上述各种相关实施方案中，TVP是Ta1b变体肽，L是不可切割或可切割的肽，并且n为1至200范围内的整数，优选地1至100范围内的整数，并且更优选地1至10范围内的整数。在一些实施方案中，TVP-杀昆虫蛋白可含有相同或不同的TVP肽，以及相同或不同的昆虫可切割肽。在一些实施方案中，C端TVP在其C端与可切割肽可操作地连接，该可切割肽可操作以在昆虫肠道环境中被切割。在一些实施方案中，N端TVP在其N端与可切割肽可操作地连接，该可切割肽可操作以在昆虫肠道环境中被切割。
在昆虫肠道环境中发现的一些可用的蛋白酶和肽酶依赖于昆虫的生命阶段，因为这些酶通常在空间和时间上表达。昆虫的消化系统由消化道和相关的腺体组成。食物进入口腔并且与可以包含或可以不包含消化性蛋白酶和肽酶的分泌物混合。前肠和后肠是外胚层起源的。前肠通常作为原始食物的储存库。离散的食物团从前肠进入中肠(肠系膜或昆虫的胃)。中肠是食物营养物的消化和吸收部位。通常，某些蛋白酶和肽酶根据肠道pH而存在于中肠中。人胃肠系统中的某些蛋白酶和肽酶可以包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶。
昆虫肠道环境包括食草动物物种中的消化系统的区域，其中肽和蛋白在消化期间被降解。在昆虫肠道环境中发现的一些可用的蛋白酶和肽酶可包括：(1)丝氨酸蛋白酶；(2)半胱氨酸蛋白酶；(3)天冬氨酸蛋白酶，和(4)金属蛋白酶。
植食性昆虫的消化系统中的两种主要蛋白酶类别是丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。Murdock等人(1987)对属于鞘翅目的各种有害生物的中肠酶进行了详细研究，而Srinivasan等人(2008)则报道了属于鳞翅目的各种有害生物的中肠酶。已知丝氨酸蛋白酶在幼虫肠道环境中占优势地位并且在鳞翅目中占总消化活性的约95％，而鞘翅目的种具有更广泛的优势肠道蛋白酶(包括半胱氨酸蛋白酶)。
木瓜蛋白酶家族含有具有各种活性的肽酶，包括具有广泛特异性的内肽酶(诸如木瓜蛋白酶)、具有非常窄的特异性的内肽酶(诸如甘氨酰内肽酶)、氨肽酶、二肽基肽酶以及具有内肽酶活性和外肽酶活性二者的肽酶(诸如组织蛋白酶B和H)。各种昆虫的中肠中存在的其他示例性蛋白酶包括胰蛋白酶样酶，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶B和氨基三肽酶。
丝氨酸蛋白酶广泛分布于几乎所有动物和微生物中(Joanitti等人，2006)。在高等生物中，几乎2％的基因编码这些酶(Barrette-Ng等人，2003)。对于宿主生物的维持和存活基本上必不可少的丝氨酸蛋白酶在许多生物过程中发挥着关键作用。丝氨酸蛋白酶的经典分类通过它们的底物特异性进行，特别是P1处的残基：胰蛋白酶样(P1处优选的Lys/Arg)、胰凝乳蛋白酶样(P1处的大型疏水性残基，诸如Phe/Tyr/Leu)或弹性蛋白酶样(P1处的小型疏水性残基，诸如Ala/Val)(Tyndall等人修订，2005)。丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，它们的中心催化机构由三个不变的残基：即天冬氨酸、组氨酸和独特反应性丝氨酸组成，它们的名称“催化三联体”来自后者。Asp-His-Ser三联体可以存在于至少四种不同的结构背景中(Hedtrom，2002)。这四个家族的丝氨酸蛋白酶的代表是胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y和Clp蛋白酶。已经进行最详细研究的胰凝乳蛋白酶样家族的三种丝氨酸蛋白酶是胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。最近，已经发现了具有新型催化三联体和二联体的丝氨酸蛋白酶(包括Ser-His-Glu、Ser-Lys/His、His-Ser-His和N端Ser)在消化中的作用。
在昆虫肠道环境中发现的一类已充分研究的消化酶是半胱氨酸蛋白酶的类别。术语“半胱氨酸蛋白酶”旨在描述在酶的催化位点具有半胱氨酸残基的高反应性硫醇基团的蛋白酶。有证据表明，许多植食性昆虫和植物寄生线虫至少部分依赖于中肠半胱氨酸蛋白酶来进行蛋白消化。这些包括但不仅限于半翅目，特别是南瓜缘蝽(Anasa tristis)；喜绿蝽(Acrosternum hilare)；点蜂缘椿象(Riptortus clavatus)；以及目前为止研究的几乎所有鞘翅目，特别是科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa deaemlineata)；三线马铃薯甲虫(Lema trilineata)；芦笋甲虫(Crioceris asparagi)；墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis)；赤拟谷盗(Triolium castaneum)；扁拟谷盗(Tribolium confusum)；跳甲(凹胫跳甲属种(Chaetocnema spp.)、跳甲属种(Haltica spp.)和毛跳甲属种(Epitrixspp.))；玉米根虫(条叶甲属种(Diabrotica Spp.))；四纹豆象(Callosobruchusaculatue)；棉铃象(Antonomus grandis)；米象(Sitophilus oryza)；玉米象(Sitophiluszeamais)；谷象(Sitophilus granarius)；埃及苜蓿象甲(Hypera postica)；大豆象(Acanthoseelides obtectus)；谷蠹(Rhyzopertha dominica)；黄粉虫(Tenebriomolitor)；缨翅目(Thysanoptera)，特别是西花蓟马(Franklini ella occidentalis)；双翅目(Diptera)，特别是潜蝇属种(leafminer spp.)(非洲菊斑潜蝇(Liriomyzatrifolii))；植物寄生线虫，特别是马铃薯胞囊线虫(线虫属种(Globodera spp.))、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)和根瘤线虫(根瘤线虫属种(Meloidogyne spp.))。
另一类消化酶是天冬氨酸蛋白酶。术语“天冬氨酸蛋白酶”旨在描述在酶的催化位点具有两个高反应性天冬氨酸残基的蛋白酶，该蛋白酶的最常见特征是它被胃蛋白酶抑制剂(几乎全部已知的天冬氨酸蛋白酶的低分子量抑制剂)特异性抑制。有证据表明，许多植食性昆虫部分依赖于中肠天冬氨酸蛋白酶最常见地与半胱氨酸蛋白酶结合来进行蛋白消化。这些包括但不限于半翅目，特别是长红猎蝽(Rhodnius prolixus)和臭虫(臭虫属种(Cimex spp.))以及瘤蝽科(Phymatidae)、蝽科(Pentatomidae)、长蝽科(Lygaeidae)和负蝽科(Belostomatidae)的成员；鞘翅目，在芫菁科(Meloidae)、金花虫科(Chrysomelidae)、瓢虫科(Coccinelidae)和豆象科(Bruchidae)(全部属于扁虫下目(Cucujiformia)系)中，特别是科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、三线马铃薯甲虫(Lematrilineata)；南部方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)和西方玉米根虫(D.virgifera)、棉铃象(Anthonomus grandis)、南瓜缘蝽(Anasatristis)；跳蚤甲虫(萝卜菜跳甲(Phyllotreta crucifera))、四纹豆象(Callosobruchus maculatus)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、大豆潜叶细蛾(Odontota horni)、具缘芫菁(Epicautapestifera)和赤拟谷盗(Triolium castaneum)；双翅目，特别是家蝇(Musca domestica)。参见Terra and Ferreira(1994)Comn.Biochem.Physiol.109B：1-62；Wolfson和Murdock(1990)J.Chem.Ecol.16：1089-1102。
插入接头肽的其他示例可见于以下参考文献中，这些文献全文以引用方式并入本文：发现植物表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂前体含有由六个相同的接头肽分开的五种同质蛋白质抑制剂，如Heath等人，“Characterization of the protease processing sites ina multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata”EuropeanJournal of Biochemistry，1995；230：250-257中所公开的。Chang，H.C.等人“De novofolding of GFP fusion proteins：high efficiency in eukaryotes but not inbacteria”Journal of Molecular Biology，2005年10月21日；353(2)：397-409探究了绿色荧光蛋白通过六种不同接头的折叠行为的比较。Daskalova，S.M.等人“Engineering ofN.benthamiana L.plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylatedproteins”BMC Biotechnology，2010年8月24日；10：62显示，人GalNAc-T家族的同种型GalNAc-T2在本氏烟植物中表达时保留其定位和功能性。内源质体蛋白穿过质体微管结构(stromule)的能力示于Kwok，E.Y.等人“GFP-labelled Rubisco and aspartateaminotransferase are present in plastid stromules and traffic betweenplastids”Journal of Experimental Botany，2004年3月；55(397)：595-604中。Epub 2004年1月30日。Borovsky，D.等人“Expression of Aedes trypsin-modulating oostaticfactor on the virion of TMV：A potential larvicide”Proc Natl Acad Sci，2006年12月12日；103(50)：18963-18968报道了用蚊子十肽激素胰蛋白酶调节抑卵因子(TMOF)对烟草花叶病毒(TMV)病毒体的表面进行工程改造。这些参考文献和其他参考文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白和核苷酸复合物和构建体的插入接头。
TVP ORF和TVP构建体
“TVP ORF”是指编码TVP和/或一种或多种稳定蛋白、分泌信号或目标指导信号(例如ERSP或STA)的核苷酸，并且定义为ORF中具有被翻译能力的核苷酸。因此，“TVP ORF图”是指如以图或等式形式写出的一个或多个TVP ORF的组成。例如，“TVP ORF图”可使用表达ORF内所含的DNA区段的首字母或缩写参考字写出。因此，在一个示例中，“TVP ORF图”可分别通过以等式形式将DNA区段图示为“ersp”(即，编码ERSP多肽的多核苷酸序列)；“接头”或“L”(即，编码接头多肽的多核苷酸序列)；“sta”(即，编码STA多肽的多核苷酸序列)和“tvp”(即，编码TVP的多核苷酸序列)，来描述编码ERSP、接头、STA和TVP的多核苷酸区段。TVP ORF图的示例是“ersp-sta-(接头i-tvpj)N”或“ersp-(tvpj-接头i)N-sta”和/或其DNA区段的任何组合。
以下等式描述了编码ERSP、STA、接头和TVP的TVP ORF的两个示例：
ersp-sta-l-tvp或ersp-tvp-l-sta
在一些实施方案中，本文所述的TVP开放阅读框(ORF)是将使植物能够表达mRNA的多核苷酸序列，mRNA继而将被翻译成肽，肽将被正确折叠和/或积累至所述蛋白质提供足以抑制和/或杀死一种或多种有害生物的剂量的程度。在一个实施方案中，蛋白质TVP ORF的示例可以是编码TVP(tvp)的多核苷酸、“ersp”(即编码ERSP多肽的多核苷酸序列)、“接头”(即编码接头多肽的多核苷酸序列)、“sta”(即编码STA多肽的多核苷酸序列)或它们的任何组合，并且可以以下等式形式描述：
ersp-sta-(接头i-tvpj)n，或ersp-(tvpj-接头i)n-sta
多核苷酸等式的前述示例性实施方案将导致表达以下蛋白质复合物：ERSP-STA-(接头I-TVPJ)N，其含有四种可能的肽组分，其中破折号用以分离每种组分。ersp的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸区段。sta的组分是编码翻译稳定蛋白(STA)的多核苷酸区段，其有助于植物中表达的TVP的积累，然而，在一些实施方案中，在TVPORF中包含sta可能不是必需的。接头i的组分是编码插入接头肽(L或接头)的多核苷酸区段，以将TVP与ORF中所含的其他组分以及翻译稳定蛋白分离。下标字母“i”指示在一些实施方案中，可在TVP ORF中使用不同类型的接头肽。组分“tvp”指示编码TVP的多核苷酸区段。下标“j”指示在TVP ORF中可包括不同的多核苷酸。例如，在一些实施方案中，多核苷酸序列可编码具有不同氨基酸取代的TVP。如“(接头i-tvpj)n”中所示的下标“n”指示编码插入接头肽和TVP的核苷酸的结构可在相同TVP ORF中的相同开放阅读框中重复“n”次，其中“n”可以是1至10的任何整数；“n”可以是1至10，具体地“n”可以是1、2、3、4或5，并且在一些实施方案中“n”是6、7、8、9或10。重复序列可含有编码不同插入接头(接头)和不同TVP的多核苷酸区段。包括相同TVP ORF内的重复序列的不同多核苷酸区段全部在相同翻译框内。在一些实施方案中，可能不需要在TVP ORF中包含sta多核苷酸。例如，ersp多核苷酸序列可不用接头直接与编码TVP变体多核苷酸的多核苷酸连接。
在上述示例性等式中，编码多肽“TVP”的多核苷酸“tvp”可以是编码如本文所述的任何TVP的多核苷酸序列，例如，包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，tvp多核苷酸或可操作以编码TVP的多核苷酸可编码包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的TVP。
在一些实施方案中，多核苷酸可操作以编码具有以下TVP构建体取向和/或排列的TVP-杀昆虫蛋白：ERSP-TVP、ERSP-(TVP)N、ERSP-TVP-L、ERSP-(TVP)N-L、ERSP-(TVP-L)N、ERSP-L-TVP、ERSP-L-(TVP)N、ERSP-(L-TVP)N、ERSP-STA-TVP、ERSP-STA-(TVP)N、ERSP-TVP-STA、ERSP-(TVP)N-STA、ERSP-(STA-TVP)N、ERSP-(TVP-STA)N、ERSP-L-TVP-STA、ERSP-L-STA-TVP、ERSP-L-(TVP-STA)N、ERSP-L-(STA-TVP)N、ERSP-L-(TVP)N-STA、ERSP-(L-TVP)N-STA、ERSP-(L-STA-TVP)N、ERSP-(L-TVP-STA)N、ERSP-(L-STA)N-TVP、ERSP-(L-TVP)N-STA、ERSP-STA-L-TVP、ERSP-STA-TVP-L、ERSP-STA-L-(TVP)N、ERSP-(STA-L)N-TVP、ERSP-STA-(L-TVP)N、ERSP-(STA-L-TVP)N、ERSP-STA-(TVP)N-L、ERSP-STA-(TVP-L)N、ERSP-(STA-TVP)N-L、ERSP-(STA-TVP-L)N、ERSP-TVP-L-STA、ERSP-TVP-STA-L、ERSP-(TVP)N-STA-L ERSP-(TVP-L)N-STA、ERSP-(TVP-STA)N-L、ERSP-(TVP-L-STA)N或ERSP-(TVP-STA-L)N；其中N为1至200范围内的整数。
在一些实施方案中，本文所述的TVP ORF和/或TVP构建体中的任一种可重组产生，例如，在一些实施方案中，本文所述的TVP ORF和/或TVP构建体中的任一种可在细胞培养物中产生，例如，通过酵母细胞。
任何前述方法和/或本文所述的任何方法可用于将一种或多种多核苷酸并入植物或其植物部分中，该一种或多种多核苷酸可操作以表达任何一种或多种本文所述的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；例如，一种或多种具有SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110的氨基酸序列的TVP或TVP-杀昆虫蛋白，其同样在本文描述。
本公开可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。对于其转基因方法或PEP将是特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉花、西红柿、玉蜀黍、小麦、玉米、甜玉米、紫苜蓿、大豆、高粱、紫花豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、油菜、水稻、大豆、大麦、向日葵、树(包括松类和落叶类)、花(包括商业化和温室种植的那些)、田野羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和油菜、芸苔属种、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
用多核苷酸转化植物
在一些实施方案中，可将上述和本文所述的TVP表达ORF和TVP构建体克隆到任何植物表达载体中，用于在植物中瞬时或稳定表达TVP。
瞬时植物表达系统可用于迅速优化植物中某些特定TVP表达的TVP表达ORF的结构，包括某些组分的必要性、某些组分的密码子优化、每种组分顺序的优化等。瞬时植物表达载体通常来源于植物病毒基因组。植物病毒载体由于植物病毒的感染特性而在植物中提供快速和高水平的外源基因表达的优点。植物病毒基因组的全长可用作载体，但通常缺失病毒组分，例如外壳蛋白，并将转基因ORF亚克隆在该位置。可将TVP表达ORF亚克隆到此类位点以产生病毒载体。这些病毒载体可以机械方式引入植物，因为它们本身是感染性的，例如通过植物创伤、喷洒等。也可经由农杆菌感染，通过将病毒载体克隆到根癌菌(根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens)或毛根菌(发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes)的T-DNA中，将它们转染到植物中。TVP在该载体中的表达受RNA病毒的复制控制，并且病毒翻译成mRNA以进行复制受强病毒启动子例如来自花椰菜花叶病毒的35S启动子的控制。具有TVP表达ORF的病毒载体通常被克隆到二元载体中的T-DNA区域，该二元载体可在大肠杆菌株和农杆菌菌株两者中自我复制。植物的瞬时转染可以通过用含有用于TVP表达的病毒载体的农杆菌细胞浸润植物叶子来进行。在瞬时转化的植物中，由于转录后基因沉默(PTGS)，外源蛋白的表达通常在短时间内停止。有时需要将PTGS抑制蛋白基因与驱动TVP表达ORF表达的相同类型的病毒载体瞬时共转化到植物中。这提高并延长了植物中TVP的表达。最常用的PTGS抑制蛋白是从番茄丛矮病毒(TBSV)中发现的P19蛋白。
在一些实施方案中，植物的瞬时转染可通过将编码TVP的多核苷酸与任何一种容易获得的载体(参见上文和本文所述)重组来实现，并且使用标记物或信号(例如，GFP发射)来确认。在一些实施方案中，瞬时转染的植物可通过将编码TVP的多核苷酸与编码GFP-杂交融合蛋白的DNA在载体中重组，并使用为靶向表达设计的不同FECT载体将所述载体转染到植物(例如烟草)中来产生。在一些实施方案中，可将编码TVP的多核苷酸与用于APO(质外体定位)积累的pFECT载体、用于CYTO(细胞质定位)积累的pFECT载体、或用于ER(内质网定位)积累的具有ersp的pFECT载体重组。
示例性瞬时植物转化策略是使用植物病毒载体的农杆菌感染，因为其高效、容易和低成本。在一些实施方案中，烟草花叶病毒过表达系统可用于用TVP瞬时转化植物。参见TRBO，Lindbo JA，Plant Physiology，2007，V145：1232-1240，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
TRBO DNA载体具有用于农杆菌感染的T-DNA区，该区包含驱动烟草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子，而没有编码病毒包被蛋白的基因。此外，该系统使用了“解除武装”的病毒基因组，因此可有效地防止病毒在植物间的传播。
在另一个实施方案中，FECT病毒瞬时植物表达系统可用于用TVP瞬时转化植物。参见Liu Z&Kearney CM，BMC Biotechnology，2010，10：88，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。FECT载体含有用于农杆菌感染的T-DNA区，该区包含驱动狗尾草花叶病毒RNA的表达的CaMV 35S启动子，而没有编码病毒包被蛋白的基因和三基因块(triple geneblock)。此外，该系统使用了“解除武装”的病毒基因组，因此可有效地防止病毒在植物间的传播。为了有效地表达引入的异源基因，FECT表达系统还需要共表达来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白P19，以防止引入的T-DNA的转录后基因沉默(PTGS)(TRBO表达系统不需要共表达P19)。
在一些实施方案中，TVP表达ORF可被设计成编码一系列可如下描述的翻译融合结构基序：N’-ERSP-STA-L-TVP-C’，其中“N′”和“C′”分别指示N端和C端氨基酸，并且ERSP基序可以是大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)(SEQ ID NO：37)；稳定蛋白(STA)可以是GFP(SEQ IDNO：34)；接头肽“L”可以是IGER(SEQ ID NO：31)。在一些实施方案中，可化学合成ersp-sta-l-tvp ORF以包括限制位点，例如在其5′-末端的Pac I限制位点和在其3′-末端的Avr II限制位点。在一些实施方案中，可将TVP表达ORF克隆到FECT表达载体(pFECT)的Pac I和AvrII限制位点中，以产生用于FECT瞬时植物表达系统的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体表达载体(pFECT-TVP)。为了使FECT表达系统中的表达最大化，一些实施方案可具有生成用于共转化的表达RNA沉默抑制蛋白P19(pFECT-P19)的FECT载体。
在一些实施方案中，可重组U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体表达载体用于TRBO瞬时植物表达系统，例如，通过进行常规PCR程序，并在上述TVP表达ORF的3′-末端添加NotI限制位点，然后将TVP表达ORF克隆到TRBO表达载体(pTRBO-TVP)的Pac I和Not I限制位点。
在一些实施方案中，使用一种或多种瞬时表达系统，例如FECT和TRBO表达系统，根癌农杆菌菌株，例如可商购获得的GV3101细胞，可用于植物组织(例如烟草叶片)中TVP表达ORF的瞬时表达。此类瞬时转染方案的示例性说明包括以下：GV3101的过夜培养物可用于接种200mL Luria-Bertani(LB)培养基；可使细胞生长至OD600在0.5至0.8之间的对数期；然后通过在4℃下以5000rpm离心10分钟沉淀细胞；然后用10mL预冷冻的TE缓冲液(Tris-HCl10mM，EDTA 1mM，pH 8.0)洗涤细胞一次，然后重悬于20mL LB培养基中；然后可将GV3101细胞重悬浮液以250μL级分等分到1.5mL微管中；然后将等分试样在液氮中速冻并储存在-80℃冰箱中以备将来转化。然后可使用如下冻融法将pFECT-TVP和pTRBO-TVP载体转化到感受态GV3101细胞中：将储存的感受态GV3101细胞在冰上解冻，并与1至5μg纯DNA(pFECT-TVP或pTRBO-TVP载体)混合。将细胞-DNA混合物在冰上保持5分钟，转移至-80℃下保持5分钟，并在37℃水浴中温育5分钟。然后将冻融处理的细胞稀释到1mL LB培养基中并在摇床上在室温下振荡2至4小时。然后将细胞-DNA混合物的200μL等分试样铺展到具有适当抗生素(10μg/mL利福平、25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素可用于pFECT-TVP转化和pTRBO-TVP转化两者)的LB琼脂板上，并在28℃下温育两天。然后挑取所得的转化菌落，并在具有适当抗生素的6mL LB培养基等分试样中培养，以用于转化的DNA分析并制备转化的GV3101细胞的甘油储备液。
在一些实施方案中，植物组织例如烟草叶片的瞬时转化可使用叶注射用无针头的3mL注射器进行。在一个示例性示例中，将转化的GV3101细胞划线到具有适当抗生素(如上所述)的LB板上，并在28℃下温育两天。将转化的GV3101细胞的菌落接种到5mlLB-MESA培养基(补充有10mM MES和20μM乙酰丁香酮的LB培养基)和上述相同的抗生素中，并在28℃下生长过夜。通过以5000rpm离心10分钟收集过夜培养物的细胞，并以1.0的最终OD600重悬于诱导培养基(10mM MES、10mM MgCl2、100μM乙酰丁香酮)中。然后将细胞在诱导培养基中温育2小时至室温下过夜，然后准备好用于烟草叶片的瞬时转化。可使用不连接针头的3mL注射器通过注射将处理过的细胞渗入本氏烟植株的附着叶的下侧。
在一些实施方案中，瞬时转化可通过用pFECT-TVP或pTRBO-TVP转染GV3101细胞的一个群体和用pFECT-P19转染另一个群体，将这两个细胞群体以等量混合在一起用于通过用3mL注射器注射浸润烟草叶片来实现。
可操作以编码TVP的多核苷酸的稳定整合对于本公开也是可能的，例如，TVP表达ORF也可使用稳定的植物转化技术整合到植物基因组中，并且因此TVP可在植物中稳定表达并保护转化的植物一代又一代。对于植物的稳定转化，TVP表达载体可以是环状的或线性的。用于稳定植物转化的TVP表达ORF、TVP表达盒和/或具有编码TVP的多核苷酸的载体应基于本领域普通技术人员已知的和/或通过使用预测载体设计工具诸如Gene Designer 2.0(Atum Bio)、VectorBuilder(Cyagen)、
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观察器、GeneArtTM质粒构建服务(Thermo-Fisher Scientific)和/或其他可商购获得的质粒设计服务仔细设计以在植物中最佳表达。参见Tolmachov，Designing plasmid vectors.Methods Mol Biol.2009；542：117-29。TVP的表达通常由在转基因植物的一些或全部细胞中促进转录的启动子控制。启动子可以是强植物病毒启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成型35S启动子；它也可以是强植物启动子，例如来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的氢过氧化物裂解酶启动子(pHPL)；来自大豆的大豆多聚泛素(Gmubi)启动子；来自不同植物种(水稻、玉米、马铃薯等)的泛素启动子等。植物转录终止子通常出现在ORF的终止密码子之后，以停止RNA聚合酶和mRNA的转录。为了评价TVP的表达，报告基因可以被包含在TVP表达载体中，例如，用于GUS染色测定的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、用于在UV光下的绿色荧光检测的绿色荧光蛋白(GFP)基因等。为了选择转化的植物，通常将选择标记物基因包含在TVP表达载体中。在一些实施方案中，标记物基因表达产物可以为转化的植物提供对特定抗生素(例如卡那霉素、潮霉素等)或特定除草剂(例如草甘膦等)的抗性。如果采用农杆菌感染技术进行植物转化，则T-DNA左边界和右边界序列也被包含在TVP表达载体中以将T-DNA部分转运到植物中。
可使用许多转染技术将构建的TVP表达载体转染到植物细胞或组织中。农杆菌感染是使用根癌农杆菌菌株或发根农杆菌菌株转化植物的非常流行的方式。粒子轰击(也称为基因枪或生物射弹)技术也是非常常见的植物转染方法。其他不太常见的转染方法包括组织电穿孔、碳化硅晶须、DNA直接注射等。转染后，将转染的植物细胞或组织置于植物再生培养基上，以将成功转染的植物细胞或组织再生为转基因植物。
可在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平上实现转化植物的评价。可在所有这些水平上评价稳定转化的植物，并且通常仅在蛋白质水平上评价瞬时转化的植物。为了确保TVP表达ORF整合到稳定转化的植物的基因组中，可从稳定转化的植物组织中提取基因组DNA，并使用PCR或Southern印迹进行分析。稳定转化的植物中TVP的表达可在RNA水平上进行评价，例如，通过使用northern印迹或RT-PCR分析从转化的植物组织中提取的总mRNA。转化植物中TVP的表达也可直接在蛋白质水平上进行评价。有许多方法来评价转化植物中TVP的表达。如果报告基因包含在TVP表达ORF中，则可进行报告基因测定，例如，在一些实施方案中，可采用用于GUS报告基因表达的GUS染色测定、用于GFP报告基因表达的绿色荧光检测测定、用于荧光素酶报告基因表达的荧光素酶测定和/或其他报告基因技术。
在一些实施方案中，可从转化的植物组织中提取总蛋白，用于使用Bradford测定直接评价TVP的表达，以评价样品中的总蛋白质水平。
在一些实施方案中，可采用分析型HPLC色谱技术、Western印迹技术或iELISA测定来定性或定量地评价从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品中的TVP。还可通过在昆虫生物测定中使用从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品来评价TVP表达，例如，在一些实施方案中，转化的植物组织或整个转化的植物本身可用于昆虫生物测定中以评价TVP表达及其为植物提供保护的能力。
示例性转基因植物
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP或多核苷酸或其互补序列包含至少两种或更多种TVP。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种TVP或编码其的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中如果Z1为T或S，则TVP是糖基化的。
确认用TVP成功转化
在将异源外来DNA引入植物细胞后，对异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法进行证实，例如分析与整合基因相关联的核酸、蛋白和代谢物。
PCR分析是一种快速的方法，用于在移植到土壤中之前的早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中是否存在所并入的基因(Sambroo和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。使用对目的基因或农杆菌载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可以通过基因组DNA的Southern印迹分析来确认(Sambrook和Russell，2001，同上)。一般而言，从转化的植物中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离并转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，同上)，用例如放射性标记的32P目标DNA片段探测膜或“印迹”，以证实将引入的基因整合到植物基因组中。
在Northern印迹分析中，根据本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)，从转化的植物的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，并印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，同上)，通过使滤膜与来源于TVP的放射性探针杂交来测试由编码TVP的多核苷酸编码的RNA的表达。
可以对转基因植物进行Western印迹、生物化学测定等，以通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)使用与TVP上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实由TVP基因编码的蛋白质的存在。
已经开发了许多用于确定植物转化成功的标记物，例如对氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。编码叶绿体代谢中涉及到的产物的其他基因也可用作选择性标记物。例如，尤其可以使用对植物除草剂如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮提供抗性的基因。已经报道了此类基因(Stalker等人(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)和Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，本文公开的基因可用作评估细菌、酵母或植物细胞转化的标记物。用于检测植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其后代中转基因的存在的方法是本领域公知的。在一个实施方案中，通过测试杀有害生物活性来检测转基因的存在。
可以测试表达TVP和/或U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多核苷酸的可育植物的杀有害生物活性，并选择显示出最佳活性的植物以用于进一步育种。本领域存在用于测定有害生物活性的方法。通常，将蛋白质混合并用于进食测定。参见例如Marrone等人(1985)J.ofEconomic Entomology 78：290-293。
在一些实施方案中，评价瞬时转染程序的成功可基于报告基因(例如GFP)的表达来确定。在一些实施方案中，GFP可在紫外光下在用FECT和/或TRBO载体转化的烟草叶片中检测。
在一些实施方案中，可定量评价植物(例如烟草)中的TVP表达。说明烟草植物中TVP定量的示例性程序如下：通过用1000μL移液管尖端的大开口冲压叶子来收集100mg转化的叶组织圆片。将收集的叶组织置于具有5/32″直径不锈钢研磨球的2mL微管中，并在-80℃冷冻1小时，然后使用Troemner-Talboys高通量均化器均化。接着，将750μL冰冷的TSP-SE1提取溶液(磷酸钠溶液50mM，1∶100稀释的蛋白酶抑制剂混合物，EDTA 1mM，DIECA 10mM，PVPP 8％，pH 7.0)添加到管中并涡旋。然后将微管在室温下静置15分钟，然后在4℃下以16,000g离心15分钟；取100μL所得上清液并将其加载到0.45pm Millipore MultiScreen过滤微量滴定板中的pre-Sephadex G-50填充柱中，其在底部具有空的Costar接收微量滴定板。然后将微量滴定板在4℃下以800g离心2分钟。然后将所得滤液(本文称为烟草叶片的总可溶性蛋白质提取物(TSP提取物))准备用于定量分析。
在一些实施方案中，TSP提取物的总可溶性蛋白质浓度可使用Pierce CoomassiePlus蛋白质测定来估计。具有已知浓度的BSA蛋白质标准品可用于生成蛋白质定量标准曲线。例如，可将2μL的每种TSP提取物混合到Coomassie Plus蛋白质测定试剂盒的200μL显色试剂(CPPA试剂)中并温育10分钟。然后，可通过使用SoftMax Pro作为对照软件，使用SpectroMax-M2读板器读取OD595来评价显色反应。在来自分别经由FECT和TRBO转化的植物的TSP提取物中，总可溶性蛋白的浓度可为约0.788±0.20μg/μL或约0.533±0.03μg/μL，并且结果可用于计算所表达的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体肽在TSP中的百分比(％TSP)以用于iELISA测定
在一些实施方案中，间接ELISA(iELISA)测定可用于定量评价用FECT和/或TRBO表达系统瞬时转化的烟草叶片中的TVP含量。使用iELISA定量TVP的一个示例性示例如下：将5μL叶TSP提取物用95μL CB2溶液(Immunochemistry Technologies)在Immulon 2HD 96孔板的孔中稀释，根据需要进行连续稀释；然后使从提取样品获得的叶蛋白在室温下在黑暗中包被孔壁3小时，然后随后去除CB2溶液；将每个孔用200μL PBS(Gibco)洗涤两次；向每个孔中添加150μL封闭溶液(具有5％脱脂奶粉的PBS中的封闭BSA)，并在黑暗中在室温下温育1小时；在去除封闭溶液后，用PBS洗涤孔，100μL抗TVP的一抗(定制抗体可从ProMabBiotechnologies，Inc.、
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商购获得；或使用本领域普通技术人员容易获得的知识产生)；向每个孔中添加在封闭溶液中以1∶250稀释度稀释的抗体，并在室温下在黑暗中温育1小时；去除一抗并用PBS洗涤每个孔4次；向每个孔中添加100μL HRP缀合的二抗(即针对用于生成一抗的宿主物种的抗体，在封闭溶液中以1∶1000稀释使用)，并在室温下在黑暗中温育1小时；去除二抗，用100μL PBS洗涤孔；向每个孔中添加底物溶液(ABTS过氧化物酶底物溶液A和溶液B的1∶1混合物，KPL)，并且进行显色反应直至显色充分；向每个孔中添加100μL过氧化物酶终止液以终止反应；使用SpectroMax-M2读板器，以SoftMax Pro作为对照软件，在405nm下读取板中各反应混合物的吸光度；可以如上文所述iELISA测定中相同的方式处理连续稀释的已知浓度的纯TVP样品，以生成用于量分析的质量-吸光度标准曲线。可通过iELISA检测到的所表达的TVP在来自FECT转化的烟草的叶TSP提取物中为约3.09±1.83ng/μL；以及在来自TRBO转化的烟草的叶TSP提取物中为约3.56±0.74ng/μL。另选地，所表达的TVP对于FECT转化的植物可为约0.40％总可溶性蛋白(％TSP)，而在TRBO转化的植物中可为约0.67％TSP。
组合物和制剂
如本文所用，术语“组合物”和“制剂”可互换使用。
如本文所用，“v/v”或“％v/v”或“体积/体积”是指溶液的体积浓度(“v/v”代表体积/体积)。在此，当溶液的两种组分都是液体时，可使用v/v。例如，当用50mL水稀释50mL成分X时，在100mL的总体积中将存在50mL成分X；因此，这可表示为“成分X 50％v/v”体积/体积百分比(％v/v)如下计算：(溶质体积(mL)/溶液体积(100mL))；例如，％v/v＝溶质的mL/100mL溶液。
如本文所用，“w/w”或“％w/w”或“重量/重量”或“wt/wt”或“％wt/wt”是指制剂或溶液的重量浓度，即重量百分比(重量)(“w/w”代表重量/重量)。在此，w/w表示100g溶液或混合物中成分的克数(g)。例如，由30g成分X和70g水组成的混合物将表示为“成分X 30％w/w”重量/重量百分比(％w/w)如下计算：(溶质重量(g)/溶液重量(g))x 100；或(溶质质量(g)/溶液质量(g))x 100。
如本文所用，“w/v”或“％w/v”或“重量/体积”是指溶液的质量浓度，即重量体积百分比(“w/v”表示重量/体积)。在此，w/v表示100mL溶液中的成分的克数(g)。例如，如果使用1g成分X来组成100mL的总体积，则制得“成分X的1％w/v溶液”。重量/体积百分比(％w/v)计算如下：(溶质质量(g)/溶液体积(mL))x 100。
本文所述的任何前述U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或TVP-杀昆虫蛋白(例如，表1中发现的那些)可用于产生组合物，其中所述组合物由至少一种TVP和/或至少一种TVP-杀昆虫蛋白组成。
在一些实施方案中，组合物可由TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成。
在一些实施方案中，该组合物由对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的TVP或其药学上可接受的盐和赋形剂组成，所述TVP包含与表1中提供的氨基酸序列中的任一项具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该组合物由表1中公开的一种或多种TVP和赋形剂组成。
在一些实施方案中，该组合物由对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的TVP或其药学上可接受的盐和赋形剂组成，所述TVP包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110所示的氨基酸序列中的任一项具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该组合物由TVP和赋形剂组成，其中所述TVP具有如SEQ IDNO：2-15、49-53和77-110所示的氨基酸序列。
由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的组合物，例如农用化学品组合物，可包括但不限于气溶胶和/或气溶胶化产品，例如喷洒剂、熏蒸剂、粉末、粉剂和/或气体；拌种剂；口服配制剂(例如昆虫食物等)；表达和/或产生TVP、TVP-杀昆虫蛋白和/或TVPORF(瞬时和/或稳定)的转基因生物体，例如植物或动物。
该组合物可被配制成粉末、粉剂、丸剂、颗粒、喷洒剂、乳液、胶体、溶液等，并且可通过常规手段制备，诸如干燥、冻干、匀化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩包含多肽的细胞培养物。在含有至少一种此类杀有害生物多肽的所有此类组合物中，该多肽可以约1重量％至约99重量％的浓度存在。
在一些实施方案中，本文所述的杀有害生物组合物可通过将TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐与期望的农业上可接受的载剂一起配制来制备。组合物可以在施用之前以合适的方式配制，例如冻干、冷冻干燥、干燥，或在水性载剂、介质或合适的稀释剂(例如盐水和/或其他缓冲液)中配制。在一些实施方案中，配制的组合物可以是粉剂或颗粒材料的形式，或油(植物或矿物)中的悬浮液，或水或油/水乳液的形式，或作为可湿性粉剂，或与任何其他适于农业应用的载剂材料组合。合适的农业载剂可以是固体或液体，并且是本领域公知的。在一些实施方案中，制剂可与一种或多种固体或液体助剂混合，并通过各种方式制备，例如通过使用常规配制技术将杀有害生物组合物与合适的助剂均匀混合、共混和/或研磨。合适的制剂和施用方法描述于美国专利号6,468,523中，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，组合物由TVP和赋形剂组成。
在一些实施方案中，组合物由TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成。
在一些实施方案中，组合物可由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成和赋形剂。
可喷洒组合物
本发明的喷洒产品的示例可包括用于农业用途的田间可喷洒制剂和用于住宅或商业空间的内部空间的室内喷洒剂。在一些实施方案中，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的残留喷洒剂或空间喷洒剂可用于减少或消除内部空间中的昆虫有害生物。
室内表面喷洒(SSI)是将可变体积可喷洒体积的杀昆虫剂施用到存在载体的室内表面诸如墙壁、窗户、地板和天花板上的技术。可变体积可喷洒体积的主要目的是减少昆虫有害生物(例如苍蝇、跳蚤、蜱或蚊子载体)的寿命，从而减少或中断疾病传播。次要影响是降低处理区域内昆虫有害生物的密度。SSI可用作防治昆虫有害生物载体疾病诸如莱姆病、沙门氏菌、基孔肯雅病毒、寨卡病毒和疟疾的方法，并且还可用于控制昆虫载体携带的寄生虫诸如利什曼原虫病和查加斯氏病。许多携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和疟疾的蚊子载体包括内栖蚊子载体，其在进食血餐后在房内停留。这些蚊子特别容易通过用由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的可喷洒组合物进行室内表面喷洒(SSI)来防治。顾名思义，SSI涉及将组合物施用到具有残留杀昆虫剂的房屋的墙壁和其他表面上。
在一个实施方案中，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的组合物将杀灭与这些表面接触的昆虫有害生物。SSI不直接防止人们被蚊子叮咬。而是如果昆虫有害生物停留在喷洒的表面上，则通常在昆虫有害生物进食血液后控制它们。因此，SSI防止感染传播给其他人。为了有效，SSI必须应用于区域中非常高比例的家庭(通常大于40％-80％)。因此，根据本发明的具有良好残留效力和可接受气味的喷洒剂特别适合作为综合的昆虫有害生物载体管理或防治溶液的组分。
与要求活性TVP或TVP-杀昆虫蛋白与住宅表面诸如墙壁或天花板结合(如与油漆结合)的SSI相反，例如，本发明的空间喷洒产品依赖于大量小杀昆虫液滴的产生，这些小杀昆虫液滴旨在在给定的时间段内分布在一定体积的空气中。当这些液滴冲击目标昆虫有害生物时，它们递送灭杀有效剂量的有效防治昆虫有害生物的TVP或TVP-杀昆虫蛋白。用于生成空间喷洒的传统方法包括热雾化(由此产生由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的组合物的致密云状物，从而产生浓雾外观)和超低体积(ULV)，由此通过冷的机械气溶胶生成机器产生液滴。也可使用即用型气溶胶，诸如气溶胶罐。
因为可在任何一个时间处理大的区域，所以前述方法是快速减少特定区域中飞行昆虫有害生物群的非常有效的方法。并且，由于施用后残余活性非常有限，因此必须以5-7天的间隔重复以便完全有效。该方法在需要快速减少昆虫有害生物数量的流行情况下特别有效。因此，它可用于城市登革热防治活动中。
有效的空间喷洒通常取决于以下具体原理。目标昆虫通常飞过喷雾云(或有时在停留在暴露表面上的同时受到冲击)。因此，喷洒液滴与目标昆虫之间的接触效率是至关重要的。这是通过确保喷洒液滴在最佳时间段内保持空气传播并且它们包含正确剂量的杀昆虫剂来实现的。这两个问题通过优化液滴尺寸而得到很大程度的解决。如果液滴太大，它们就会太快地落到地面上，并且不会穿透植被或在施用期间遇到的其他障碍物(限制了施用的有效面积)。如果这些大液滴之一冲击个体昆虫，则它也是“过度杀灭的”，因为将对每个个体昆虫递送高剂量。如果液滴太小，则它们可能由于空气动力学而不沉积在目标昆虫上(没有冲击)，或者它们可通过对流被向上带入大气中。用于空间喷洒应用的液滴的最佳尺寸是体积中值直径(VMD)为10-25微米的液滴。
在一些实施方案中，可喷洒组合物可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，可喷洒组合物可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
泡沫
由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的本发明的活性组合物可被制成作为基于气溶胶的应用(包括气溶胶化的泡沫应用)的喷洒产品。加压罐是用于形成气溶胶的典型媒介物。使用与TVP或TVP-杀昆虫蛋白相容的气溶胶推进剂。优选地，使用液化气体型推进剂。
合适的推进剂包括压缩空气、二氧化碳、丁烷和氮气。推进剂在活性化合物组合物中的浓度为按吡啶组合物的重量计约5％至约40％，优选地为按由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的组合物的重量计约15％至约30％。
在一个实施方案中，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的制剂还可包含一种或多种发泡剂。可使用的发泡剂包括月桂醇聚醚硫酸酯钠、椰油酰胺DEA和椰油酰胺丙基甜菜碱。优选地，月桂醇聚醚硫酸酯钠、椰油酰胺DEA和椰油酰胺丙基甜菜碱组合使用。发泡剂在活性化合物组合物中的浓度为按组合物的重量计约10％至约25％，更优选地15％至20％。
当此类制剂用于不含发泡剂的气溶胶应用时，本发明的活性组合物可在使用前无需直接混合而使用。然而，含有发泡剂的气溶胶制剂确实需要在使用前立即混合(即，摇动)。此外，如果含有发泡剂的制剂使用延长的时间，则它们可能需要在使用期间以周期性的间隔进行附加混合。
在一些实施方案中，气溶胶化泡沫可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，气溶胶化泡沫可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
燃烧制剂
在一些实施方案中，还可通过使用含有组合物的燃烧制剂诸如蜡烛、烟卷或香片，用活性TVP或TVP-杀昆虫蛋白组合物来处理居住区。例如，可将组合物配制成家用产品，诸如“加热的”空气清新剂，其中杀昆虫组合物在加热(例如电加热)或燃烧时释放。由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的本发明的活性化合物组合物可被制成喷洒产品，如气溶胶、蚊香和/或蒸发器或喷洒器。
在一些实施方案中，燃烧制剂可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，燃烧制剂可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
织物处理
在一些实施方案中，可制备含有有效杀有害生物组合物的织物和衣服，该组合物由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成。在一些实施方案中，本文所述的聚合物材料、纤维、纱线、织物、网状物或基底中TVP或TVP-杀昆虫蛋白的浓度可在相对宽的浓度范围内变化，例如0.05重量％至15重量％，优选地0.2重量％至10重量％，更优选地0.4重量％至8重量％，特别是0.5重量％至5，诸如1重量％至3重量％。
类似地，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂(无论是用于处理表面还是用于涂布纤维、纱线、网状物、织物)组成的组合物的浓度可在相对宽的浓度范围内变化，例如0.1重量％至70重量％，诸如0.5重量％至50重量％，优选地1重量％至40重量％，更优选地5重量％至30重量％，尤其是10重量％至20重量％。
TVP或TVP-杀昆虫蛋白的浓度可根据应用领域进行选择，使得满足有关灭杀效力、持久性和毒性的要求。还可实现材料特性的调整，并且因此可以此方式获得定制的纺织品织物。
因此，TVP，TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的有效量可取决于具体的使用模式、最期望防治的昆虫有害生物和将使用TVP或TVP-杀昆虫蛋白的环境。因此，有效量的TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐足以实现对昆虫有害生物的防治。
在一些实施方案中，织物处理剂可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，织物处理剂可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
表面处理组合物
在一些实施方案中，本公开提供了由TVP和赋形剂组成、或由TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的组合物或制剂，其用于涂布建筑物内部的墙壁、地板和天花板，以及用于涂布基底或非生命材料。由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的本发明的组合物可使用已知的技术制备以用于所考虑的目的。因此由TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的组合物的配制剂可被配制为还含有粘结剂以促进化合物与表面或其他基底的粘结。可用于粘结的剂是本领域已知的，并且倾向于为聚合形式。与纤维、纱线、织物或网状物相比，适用于待施加到具有特定孔隙率和/或粘结特性的壁表面的组合物的粘结剂的类型将是不同的，因此，基于已知的教导，技术人员将基于期望的表面和/或基底选择合适的粘结剂。
典型的粘结剂是聚乙烯醇、改性淀粉、聚丙烯酸乙烯酯、聚丙烯酸类、聚乙酸乙烯酯共聚物、聚氨酯和改性植物油。合适的粘结剂可包括衍生自各种聚合物和共聚物以及它们的组合的胶乳分散体。在本发明组合物中用作粘结剂的合适的胶乳包括苯乙烯、烷基苯乙烯、异戊二烯、丁二烯、丙烯腈丙烯酸低级烷基酯、氯乙烯、偏二氯乙烯、低级羧酸和α，β-烯属不饱和羧酸的乙烯基酯的聚合物和共聚物，包括其中含有共聚的三种或更多种不同单体物质的聚合物，以及有机硅或聚氨酯的后分散悬浮液。用于将活性成分粘结到其他表面的聚四氟乙烯(PTFE)聚合物也可以是合适的。
在一些实施方案中，表面处理组合物可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，表面处理组合物可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
分散体
在一些示例性实施方案中，根据本公开的杀昆虫制剂可由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，以及赋形剂、稀释剂或载剂(例如，诸如水)、聚合物粘结剂和/或附加组分组成，该附加组分诸如分散剂、聚合剂、乳化剂、增稠剂、醇、香料或本领域已知的用于制备可喷洒杀昆虫剂的任何其他惰性赋形剂。
在一些实施方案中，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的组合物可制备成多种不同的形式或制剂类型，诸如悬浮液或胶囊悬浮液。并且本领域技术人员可基于特定的TVP或TVP-杀昆虫蛋白的特性、其用途以及其应用类型制备相关的组合物。例如，在本公开的方法、实施方案和其他方面中使用的TVP或TVP-杀昆虫蛋白可被包封在悬浮液或胶囊悬浮液制剂中。包封的TVP或TVP-杀昆虫蛋白可提供改善的耐洗性，以及更长的活性期。制剂可以是有机基或水基的，优选地水基的。
在一些实施方案中，分散体可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，分散体可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
微囊化
适用于根据本公开的组合物和方法中的微囊化TVP或TVP-杀昆虫蛋白可用本领域已知的任何合适的技术制备。例如，先前已经开发了用于使材料微囊化的各种方法。这些方法可分为三类：物理方法、相分离和界面反应。在物理方法类别中，微胶囊壁材料和核心颗粒被物理地集合在一起，并且壁材料围绕核心颗粒流动以形成微胶囊。在相分离类别中，微胶囊是通过将核心材料乳化或分散在不混溶的连续相中而形成的，其中壁材料溶解在该连续相中，并且诸如通过例如凝聚作用使其与连续相物理分离，并且沉积在核心颗粒周围。在界面反应类别中，微胶囊是通过将核心材料乳化或分散在不混溶的连续相中，然后在核心颗粒的表面处引起界面聚合反应的发生而形成的。微胶囊中存在的TVP或TVP-杀昆虫蛋白的浓度可在按微胶囊的重量计0.1％至60％之间变化。
在一些实施方案中，微胶囊可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，微胶囊可含有范围为约0.005wt％至约99wt％的量的TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
试剂盒、制剂、分散体以及它们的成分
用于根据本公开的组合物(由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成)、方法、实施方案和其他方面的制剂可通过将所有成分与水混合在一起，并任选地使用合适的混合和/或分散聚集体来形成。通常，此类制剂在10℃至70℃、优选地15℃至50℃、更优选地20℃至40℃的温度下形成。通常，包含(A)、(B)、(C)和/或(D)中的一种或多种的制剂是可能的，其中可能使用：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(作为杀有害生物剂)(A)；固体聚合物(B)；任选的附加添加剂(D)；以及将它们分散在水性组分(C)中。如果粘结剂存在于本发明的组合物(由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成)中，则优选使用聚合物粘结剂(B)在水中的分散体以及之前分开制备的TVP或TVP-杀昆虫蛋白(A)在水中的水性制剂。此类单独的制剂可含有用于稳定相应制剂中的(A)和/或(B)的附加添加剂并且是可商购获得的。在第二方法步骤中，添加此类粗制剂和任选地附加水(组分(C))。同样，基于前述方案的上述成分的组合也是可能的，例如使用(A)和/或(B)的预形成分散体并将其与固体(A)和/或(B)混合。聚合物粘结剂(B)的分散体可以是已由化学品制造商制备的预制分散体。
此外，使用“手工制备”分散体，即由最终使用者小规模制备的分散体，也在本发明的范围内。此类分散体可通过提供约20％的粘结剂(B)在水中的混合物，将该混合物加热到90℃至100℃的温度并将该混合物强烈搅拌数小时来制备。可能制造作为最终产品的制剂，使得其可容易地被最终使用者用于根据本发明的方法。并且，当然类似地有可能制造一种浓缩物，该浓缩物可由最终使用者用附加的水(C)稀释至期望的浓度以供使用。
在一个实施方案中，适于SSI应用的组合物(由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成)或包衣制剂(由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成)含有活性成分和载剂，诸如水，并且还可含有一种或多种选自分散体、润湿剂、防冻剂、增稠剂、防腐剂、乳化剂和粘结剂或粘着剂的共配制物。
在一些实施方案中，TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的示例性固体制剂通常被研磨至期望的粒度，诸如粒度分布d(0.5)通常为3μm至20μm，优选地5μm至15μm，尤其是7μm至12μm。
此外，可将制剂作为试剂盒运送至最终使用者，该试剂盒包含至少由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的第一组分(A)；和包含至少一种聚合物粘结剂的第二组分(B)。其他添加剂(D)可以是试剂盒的第三单独组分，或者可已经与组分(A)和/或(B)混合。最终使用者可仅通过将水(C)添加到试剂盒的组分中并混合来制备供使用的制剂。试剂盒的组分也可以是在水中的制剂。当然，可将一种组分的水性制剂与另一种组分的干燥制剂组合。作为示例，试剂盒可由以下组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(A)和任选的水(C)的一种制剂；和至少一种聚合物粘结剂(B)、作为组分(C)的水和任选的组分(D)的第二单独制剂。
组分(A)、(B)、(C)和任选的(D)的浓度将由本领域技术人员根据用于涂布/处理的技术来选择。通常，基于该组合物的重量，TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(A)的量可为至多50重量％，优选地1重量％至50重量％，诸如10重量％至40重量％，尤其是15重量％至30重量％。基于该组合物的重量，聚合物粘结剂(B)的量可在0.01重量％至30重量％、优选地0.5重量％至15重量％、更优选地1重量％至10重量％、尤其是1重量％至5重量％的范围内。如果存在，基于该组合物的重量，附加组分(D)的量通常为0.1重量％至20重量％，优选地0.5重量％至15重量％。如果存在，基于该组合物的重量，颜料和/或染料和/或香料的合适量通常为0.01重量％至5重量％，优选地0.1重量％至3重量％，更优选地0.2重量％至2重量％。典型的备用制剂包含0.1％至40％、优选地1％至30％的组分(A)、(B)和任选的(D)，余量为水(C)。待由最终使用者稀释的浓缩物的典型浓度可包含％5至70％、优选地10％至60％的组分(A)、(B)和任选的(D)，余量为水(C)。
本文所述的任何U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)(例如，表1中发现的那些)、和/或本文所述的任何TVP-杀昆虫蛋白、和/或关于其的任何方法可用于产生如本文所述的任何前述可喷洒组合物、制剂和/或试剂盒。
玻璃化
玻璃化描述了一种方法，其中通过将肽固定在刚性的无定形玻璃状糖基质中来减慢肽的反应动力学：这导致肽的降解急剧减慢。参见Slade等人，Beyond water activity：recent advances based on an altemative approach to the assessment of foodquality and safety，Crit.Rev.Food Sci.Nutr.30(1991)115-360。肽的解折叠和其他降解机制取决于肽的分子移动性；因此，玻璃化减慢了此类降解。参见Change等人，Mechanismof protein stabilization by sugars during freeze-drying and storage：nativestructure preservation，specific interaction，and/or immobilization in a glassymatrix？，J Pharm.Sci.94(2005)1427-1444；以及G.O.Poinar和R.Hess，Ultrastructureof 40-million-year-old insect tissue，Science 80(215)(1982)1241-1242。
玻璃化及其在肽稳定化中的考虑因素的示例性描述提供于Mensink等人，Howsugars protect proteins in the solid state and during drying(review)：Mechanisms of stabilization in relation to stress conditions.Eur J PharmBiopharm.2017年5月；114：288-295中；该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本发明的TVP可以是玻璃化的。例如，在一些实施方案中，本发明的TVP可使用玻璃化工艺来稳定。
在一些实施方案中，玻璃化可通过使用糖发生。在一些实施方案中，糖可以是海藻糖。
海藻糖
海藻糖是由两个α-葡萄糖单元之间的1，1-糖苷键形成的二糖。在一些实施方案中，海藻糖的分子式为C12H22O11；具有342.3g/mol的分子量。
海藻糖在自然界中作为二糖被发现，并且在一些聚合物中也作为单体；然而，存在一些在自然界中未发现的海藻糖异构体。参见Elbein等人，New insights on trehalose：amultifunctional molecule.Glycobiology.2003年4月；13(4)：17R-27R。
已显示海藻糖稳定蛋白质和细胞对抗应激诸如热、冷冻和干燥。参见K.Lippert和E.Galinski，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1992，37，61-65；J.K.Kaushik和R.Bhat，J.Biol.Chem.，2003，278，26458-26465；R.P.Baptista、S.Pedersen、G.J.Cabrita、D.E.Otzen、J.M.Cabral和E.P.Melo，Biopolymers，2008，89，538-547；Guo等人，Nat.Biotechnol.，2000，18，168-171；Hengherr等人，FEBS J.，2008，275，281-288；Crowe等人，Science，1984，223，701-703；Beattie等人，Diabetes，1997，46，519-523；P.Sundaramurthi和R.Suryanarayanan，J.Phys.Chem.Lett.，2009，1，510-514；Duong等人，Appl.Environ.Microbiol.，2006，72，1218-1225。
实际上，一些动物响应于环境应激而积累海藻糖至显著水平，因此强调了海藻糖稳定生物分子的能力。参见P.Westh和H.Ramlev，J.Exp.Zool.，1991，258，303-311；以及K.A.C.Madin和J.H.Crowe，J.Exp.Zool.，1975，193，335-342。此外，海藻糖通常被认为是安全的，并且在若干药物中用作稳定剂。参见N.K.Jain和I.Roy，Protein Sci.，2009，18，24-36；以及S.Ohtake和Y.J.Wang，J.Pharm.Sci.，2011，100，2020-2053。
海藻糖的使用是本领域公知的。海藻糖可容易地从商业来源获得。例如，D-(+)-海藻糖二水合物(产品号T9531)和海藻糖(产品号PHR1344和1673715)购自Sigma Aldrich(Sigma-Aldrich Corp.St.Louis，MO，USA)。
本文提供了示例性海藻糖分子，其具有化学文摘社(CAS)登记号99-20-7号(无水)和CAS登记号6138-23-4号(二水)。本公开的示例性海藻糖化合物具有PubChem CID号7427。
使用海藻糖稳定肽的示例性描述提供于美国专利号6,165,981、6,171,586、6,991,790、7,956,028、10,273,333和10,588,957中；这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
海藻糖的制备和在组合物中的使用的示例性描述提供于美国专利号7,678,764中，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
示例性组合物和制剂
如本文所用，“制剂”和“组合物”是同义的。
范围和描述组合物和制剂组分
在一些实施方案中，本发明的制剂是液体浓缩物、可湿性粉剂或颗粒制剂。在一些实施方案中，如本文所述的TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐中的任一种可用于下文所述制剂中的任一种，例如前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐中的任一种可用于以下制剂中：可湿性粉剂或颗粒制剂；或液体浓缩制剂。
在一些实施方案中，制剂由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)一种或多种赋形剂；其中这些赋形剂包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：海藻糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、麦芽糊精和BIT。
在一些实施方案中，本发明的制剂由浓度范围为按总制剂的重量计约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的海藻糖组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约99.9％、约1％至约99.9％、约2％至约99.9％、约3％至约99.9％、约4％至约99.9％、约5％至约99.9％、约6％至约99.9％、约7％至约99.9％、约8％至约99.9％、约9％至约99.9％、约10％至约99.9％、约11％至约99.9％、约12％至约99.9％、约13％至约99.9％、约14％至约99.9％、约15％至约99.9％、约16％至约99.9％、约17％至约99.9％、约18％至约99.9％、约19％至约99.9％、约20％至约99.9％、约21％至约99.9％、约22％至约99.9％、约23％至约99.9％、约24％至约99.9％、约25％至约99.9％、约26％至约99.9％、约27％至约99.9％、约28％至约99.9％、约29％至约99.9％、约30％至约99.9％、约31％至约99.9％、约32％至约99.9％、约33％至约99.9％、约34％至约99.9％、约35％至约99.9％、约36％至约99.9％、约37％至约99.9％、约38％至约99.9％、约39％至约99.9％、约40％至约99.9％、约41％至约99.9％、约42％至约99.9％、约43％至约99.9％、约44％至约99.9％、约45％至约99.9％、约46％至约99.9％、约47％至约99.9％、约48％至约99.9％、约49％至约99.9％、约50％至约99.9％、约51％至约99.9％、约52％至约99.9％、约53％至约99.9％、约54％至约99.9％、约55％至约99.9％、约56％至约99.9％、约57％至约99.9％、约58％至约99.9％、约59％至约99.9％、约60％至约99.9％、约61％至约99.9％、约62％至约99.9％、约63％至约99.9％、约64％至约99.9％、约65％至约99.9％、约66％至约99.9％、约67％至约99.9％、约68％至约99.9％、约69％至约99.9％、约70％至约99.9％、约71％至约99.9％、约72％至约99.9％、约73％至约99.9％、约74％至约99.9％、约75％至约99.9％、约76％至约99.9％、约77％至约99.9％、约78％至约99.9％、约79％至约99.9％、约80％至约99.9％、约81％至约99.9％、约82％至约99.9％、约83％至约99.9％、约84％至约99.9％、约85％至约99.9％、约86％至约99.9％、约87％至约99.9％、约88％至约99.9％、约89％至约99.9％、约90％至约99.9％、约91％至约99.9％、约92％至约99.9％、约93％至约99.9％、约94％至约99.9％、约95％至约99.9％、约96％至约99.9％、约97％至约99.9％、约98％至约99.9％或约99％至约99.9％的海藻糖组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约99％、约0.1％至约98％、约0.1％至约97％、约0.1％至约96％、约0.1％至约95％、约0.1％至约94％、约0.1％至约93％、约0.1％至约92％、约0.1％至约91％、约0.1％至约90％、约0.1％至约89％、约0.1％至约88％、约0.1％至约87％、约0.1％至约86％、约0.1％至约85％、约0.1％至约84％、约0.1％至约83％、约0.1％至约82％、约0.1％至约81％、约0.1％至约80％、约0.1％至约79％、约0.1％至约78％、约0.1％至约77％、约0.1％至约76％、约0.1％至约75％、约0.1％至约74％、约0.1％至约73％、约0.1％至约72％、约0.1％至约71％、约0.1％至约70％、约0.1％至约69％、约0.1％至约68％、约0.1％至约67％、约0.1％至约66％、约0.1％至约65％、约0.1％至约64％、约0.1％至约63％、约0.1％至约62％、约0.1％至约61％、约0.1％至约60％、约0.1％至约59％、约0.1％至约58％、约0.1％至约57％、约0.1％至约56％、约0.1％至约55％、约0.1％至约54％、约0.1％至约53％、约0.1％至约52％、约0.1％至约51％、约0.1％至约50％、约0.1％至约49％、约0.1％至约48％、约0.1％至约47％、约0.1％至约46％、约0.1％至约45％、约0.1％至约44％、约0.1％至约43％、约0.1％至约42％、约0.1％至约41％、约0.1％至约40％、约0.1％至约39％、约0.1％至约38％、约0.1％至约37％、约0.1％至约36％、约0.1％至约35％、约0.1％至约34％、约0.1％至约33％、约0.1％至约32％、约0.1％至约31％、约0.1％至约30％、约0.1％至约29％、约0.1％至约28％、约0.1％至约27％、约0.1％至约26％、约0.1％至约25％、约0.1％至约24％、约0.1％至约23％、约0.1％至约22％、约0.1％至约21％、约0.1％至约20％、约0.1％至约19％、约0.1％至约18％、约0.1％至约17％、约0.1％至约16％、约0.1％至约15％、约0.1％至约14％、约0.1％至约13％、约0.1％至约12％、约0.1％至约11％、约0.1％至约10％、约0.1％至约9％、约0.1％至约8％、约0.1％至约7％、约0.1％至约6％、约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.1％至约1％或约0.1％至约0.5％的海藻糖组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约40％、约0.5％至约40％、约1％至约40％、约2％至约40％、约3％至约40％、约4％至约40％、约5％至约40％、约6％至约40％、约7％至约40％、约8％至约40％、约9％至约40％、约10％至约40％、约11％至约40％、约12％至约40％、约13％至约40％、约14％至约40％、约15％至约40％、约16％至约40％、约17％至约40％、约18％至约40％、约19％至约40％、约20％至约40％、约21％至约40％、约22％至约40％、约23％至约40％、约24％至约40％、约25％至约40％、约26％至约40％、约27％至约40％、约28％至约40％、约29％至约40％、约30％至约40％、约31％至约40％、约32％至约40％、约33％至约40％、约34％至约40％、约35％至约40％、约36％至约40％、约37％至约40％、约38％至约40％或约39％至约40％的磷酸氢二钾(K2HPO4)组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约40％、约0.1％至约39％、约0.1％至约38％、约0.1％至约37％、约0.1％至约36％、约0.1％至约35％、约0.1％至约34％、约0.1％至约33％、约0.1％至约32％、约0.1％至约31％、约0.1％至约30％、约0.1％至约29％、约0.1％至约28％、约0.1％至约27％、约0.1％至约26％、约0.1％至约25％、约0.1％至约24％、约0.1％至约23％、约0.1％至约22％、约0.1％至约21％、约0.1％至约20％、约0.1％至约19％、约0.1％至约18％、约0.1％至约17％、约0.1％至约16％、约0.1％至约15％、约0.1％至约14％、约0.1％至约13％、约0.1％至约12％、约0.1％至约11％、约0.1％至约10％、约0.1％至约9％、约0.1％至约8％、约0.1％至约7％、约0.1％至约6％、约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.1％至约1％或约0.1％至约0.5％的磷酸氢二钾(K2HPO4)组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约20％、约2％至约20％、约3％至约20％、约4％至约20％、约5％至约20％、约6％至约20％、约7％至约20％、约8％至约20％、约9％至约20％、约10％至约20％、约11％至约20％、约12％至约20％、约13％至约20％、约14％至约20％、约15％至约20％、约16％至约20％、约17％至约20％、约18％至约20％或约19％至约20％的磷酸二氢钾(KH2PO4)组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约20％、约0.1％至约19％、约0.1％至约18％、约0.1％至约17％、约0.1％至约16％、约0.1％至约15％、约0.1％至约14％、约0.1％至约13％、约0.1％至约12％、约0.1％至约11％、约0.1％至约10％、约0.1％至约9％、约0.1％至约8％、约0.1％至约7％、约0.1％至约6％、约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.1％至约1％或约0.1％至约0.5％的磷酸二氢钾(KH2PO4)组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约99.9％、约1％至约99.9％、约2％至约99.9％、约3％至约99.9％、约4％至约99.9％、约5％至约99.9％、约6％至约99.9％、约7％至约99.9％、约8％至约99.9％、约9％至约99.9％、约10％至约99.9％、约11％至约99.9％、约12％至约99.9％、约13％至约99.9％、约14％至约99.9％、约15％至约99.9％、约16％至约99.9％、约17％至约99.9％、约18％至约99.9％、约19％至约99.9％、约20％至约99.9％、约21％至约99.9％、约22％至约99.9％、约23％至约99.9％、约24％至约99.9％、约25％至约99.9％、约26％至约99.9％、约27％至约99.9％、约28％至约99.9％、约29％至约99.9％、约30％至约99.9％、约31％至约99.9％、约32％至约99.9％、约33％至约99.9％、约34％至约99.9％、约35％至约99.9％、约36％至约99.9％、约37％至约99.9％、约38％至约99.9％、约39％至约99.9％、约40％至约99.9％、约41％至约99.9％、约42％至约99.9％、约43％至约99.9％、约44％至约99.9％、约45％至约99.9％、约46％至约99.9％、约47％至约99.9％、约48％至约99.9％、约49％至约99.9％、约50％至约99.9％、约51％至约99.9％、约52％至约99.9％、约53％至约99.9％、约54％至约99.9％、约55％至约99.9％、约56％至约99.9％、约57％至约99.9％、约58％至约99.9％、约59％至约99.9％、约60％至约99.9％、约61％至约99.9％、约62％至约99.9％、约63％至约99.9％、约64％至约99.9％、约65％至约99.9％、约66％至约99.9％、约67％至约99.9％、约68％至约99.9％、约69％至约99.9％、约70％至约99.9％、约71％至约99.9％、约72％至约99.9％、约73％至约99.9％、约74％至约99.9％、约75％至约99.9％、约76％至约99.9％、约77％至约99.9％、约78％至约99.9％、约79％至约99.9％、约80％至约99.9％、约81％至约99.9％、约82％至约99.9％、约83％至约99.9％、约84％至约99.9％、约85％至约99.9％、约86％至约99.9％、约87％至约99.9％、约88％至约99.9％、约89％至约99.9％、约90％至约99.9％、约91％至约99.9％、约92％至约99.9％、约93％至约99.9％、约94％至约99.9％、约95％至约99.9％、约96％至约99.9％、约97％至约99.9％、约98％至约99.9％或约99％至约99.9％的麦芽糊精组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约99％、约0.1％至约98％、约0.1％至约97％、约0.1％至约96％、约0.1％至约95％、约0.1％至约94％、约0.1％至约93％、约0.1％至约92％、约0.1％至约91％、约0.1％至约90％、约0.1％至约89％、约0.1％至约88％、约0.1％至约87％、约0.1％至约86％、约0.1％至约85％、约0.1％至约84％、约0.1％至约83％、约0.1％至约82％、约0.1％至约81％、约0.1％至约80％、约0.1％至约79％、约0.1％至约78％、约0.1％至约77％、约0.1％至约76％、约0.1％至约75％、约0.1％至约74％、约0.1％至约73％、约0.1％至约72％、约0.1％至约71％、约0.1％至约70％、约0.1％至约69％、约0.1％至约68％、约0.1％至约67％、约0.1％至约66％、约0.1％至约65％、约0.1％至约64％、约0.1％至约63％、约0.1％至约62％、约0.1％至约61％、约0.1％至约60％、约0.1％至约59％、约0.1％至约58％、约0.1％至约57％、约0.1％至约56％、约0.1％至约55％、约0.1％至约54％、约0.1％至约53％、约0.1％至约52％、约0.1％至约51％、约0.1％至约50％、约0.1％至约49％、约0.1％至约48％、约0.1％至约47％、约0.1％至约46％、约0.1％至约45％、约0.1％至约44％、约0.1％至约43％、约0.1％至约42％、约0.1％至约41％、约0.1％至约40％、约0.1％至约39％、约0.1％至约38％、约0.1％至约37％、约0.1％至约36％、约0.1％至约35％、约0.1％至约34％、约0.1％至约33％、约0.1％至约32％、约0.1％至约31％、约0.1％至约30％、约0.1％至约29％、约0.1％至约28％、约0.1％至约27％、约0.1％至约26％、约0.1％至约25％、约0.1％至约24％、约0.1％至约23％、约0.1％至约22％、约0.1％至约21％、约0.1％至约20％、约0.1％至约19％、约0.1％至约18％、约0.1％至约17％、约0.1％至约16％、约0.1％至约15％、约0.1％至约14％、约0.1％至约13％、约0.1％至约12％、约0.1％至约11％、约0.1％至约10％、约0.1％至约9％、约0.1％至约8％、约0.1％至约7％、约0.1％至约6％、约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.1％至约1％或约0.1％至约0.5％的麦芽糊精组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，麦芽糊精可具有范围为约2％至约20％、约3％至约20％、约4％至约20％、约5％至约20％、约6％至约20％、约7％至约20％、约8％至约20％、约9％至约20％、约10％至约20％、约11％至约20％、约12％至约20％、约13％至约20％、约14％至约20％、约15％至约20％、约16％至约20％、约17％至约20％、约18％至约20％或约19％至约20％的右旋糖当量。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，麦芽糊精可具有范围为约2％至约20％、约2％至约19％、约2％至约18％、约2％至约17％、约2％至约16％、约2％至约15％、约2％至约14％、约2％至约13％、约2％至约12％、约2％至约11％、约2％至约10％、约2％至约9％、约2％至约8％、约2％至约7％、约2％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％或约2％至约3％的右旋糖当量。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.01％至约1％、约0.025％至约1％、约0.05％至约1％、约0.075％至约1％、约0.1％至约1％、约0.125％至约1％、约0.15％至约1％、约0.175％至约1％、约0.2％至约1％、约0.225％至约1％、约0.25％至约1％、约0.275％至约1％、约0.3％至约1％、约0.325％至约1％、约0.35％至约1％、约0.375％至约1％、约0.4％至约1％、约0.425％至约1％、约0.45％至约1％、约0.475％至约1％、约0.5％至约1％、约0.525％至约1％、约0.55％至约1％、约0.575％至约1％、约0.6％至约1％、约0.625％至约1％、约0.65％至约1％、约0.675％至约1％、约0.7％至约1％、约0.725％至约1％、约0.75％至约1％、约0.775％至约1％、约0.8％至约1％、约0.825％至约1％、约0.85％至约1％、约0.875％至约1％、约0.9％至约1％、约0.925％至约1％、约0.95％至约1％或约0.975％至约1％的苯并异噻唑啉酮(BIT)组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.01％至约1％、约0.01％至约0.975％、约0.01％至约0.95％、约0.01％至约0.925％、约0.01％至约0.9％、约0.01％至约0.875％、约0.01％至约0.85％、约0.01％至约0.825％、约0.01％至约0.8％、约0.01％至约0.775％、约0.01％至约0.75％、约0.01％至约0.725％、约0.01％至约0.7％、约0.01％至约0.675％、约0.01％至约0.65％、约0.01％至约0.625％、约0.01％至约0.6％、约0.01％至约0.575％、约0.01％至约0.55％、约0.01％至约0.525％、约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.475％、约0.01％至约0.45％、约0.01％至约0.425％、约0.01％至约0.4％、约0.01％至约0.375％、约0.01％至约0.35％、约0.01％至约0.325％、约0.01％至约0.3％、约0.01％至约0.275％、约0.01％至约0.25％、约0.01％至约0.225％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.175％、约0.01％至约0.15％、约0.01％至约0.125％、约0.01％至约0.1％、约0.01％至约0.075％、约0.01％至约0.05％或约0.01％至约0.025％的苯并异噻唑啉酮(BIT)组成。
在一些实施方案中，BIT可以是1，2-苯并异噻唑啉-3-酮。本文提供了一种示例性1，2-苯并异噻唑啉-3-酮，CAS号为2634-33-5。描述如何制备1，2-苯并异噻唑啉-3-酮的示例性描述提供于WIPO公开案WO2014173716A1中，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。此外，1，2-苯并异噻唑啉-3-酮容易获自商业供应商，例如
Figure BDA0003998753650002481
AQPreservative；9.25％的l，2-苯并异噻唑啉-3-酮水溶液；购自Lonza GroupLtd.Muenchensteinerstrasse 38，CH-4002Basel，Switzerland.
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.125％至约1％、约0.15％至约1％、约0.175％至约1％、约0.2％至约1％、约0.225％至约1％、约0.25％至约1％、约0.275％至约1％、约0.3％至约1％、约0.325％至约1％、约0.35％至约1％、约0.375％至约1％、约0.4％至约1％、约0.425％至约1％、约0.45％至约1％、约0.475％至约1％、约0.5％至约1％、约0.525％至约1％、约0.55％至约1％、约0.575％至约1％、约0.6％至约1％、约0.625％至约1％、约0.65％至约1％、约0.675％至约1％、约0.7％至约1％、约0.725％至约1％、约0.75％至约1％、约0.775％至约1％、约0.8％至约1％、约0.825％至约1％、约0.85％至约1％、约0.875％至约1％、约0.9％至约1％、约0.925％至约1％、约0.95％至约1％或约0.975％至约1％的木质素磺酸盐组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度为约0.1％至约1％、约0.1％至约0.975％、约0.1％至约0.95％、约0.1％至约0.925％、约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.875％、约0.1％至约0.85％、约0.1％至约0.825％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.775％、约0.1％至约0.75％、约0.1％至约0.725％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.675％、约0.1％至约0.65％、约0.1％至约0.625％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.575％、约0.1％至约0.55％、约0.1％至约0.525％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.475％、约0.1％至约0.45％、约0.1％至约0.425％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.375％、约0.1％至约0.35％、约0.1％至约0.325％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.275％、约0.1％至约0.25％、约0.1％至约0.225％、约0.1％至约0.2％、约0.1％至约0.175％、约0.1％至约0.15％或约0.1％至约0.125％的木质素磺酸盐组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.125％至约1％、约0.15％至约1％、约0.175％至约1％、约0.2％至约1％、约0.225％至约1％、约0.25％至约1％、约0.275％至约1％、约0.3％至约1％、约0.325％至约1％、约0.35％至约1％、约0.375％至约1％、约0.4％至约1％、约0.425％至约1％、约0.45％至约1％、约0.475％至约1％、约0.5％至约1％、约0.525％至约1％、约0.55％至约1％、约0.575％至约1％、约0.6％至约1％、约0.625％至约1％、约0.65％至约1％、约0.675％至约1％、约0.7％至约1％、约0.725％至约1％、约0.75％至约1％、约0.775％至约1％、约0.8％至约1％、约0.825％至约1％、约0.85％至约1％、约0.875％至约1％、约0.9％至约1％、约0.925％至约1％、约0.95％至约1％或约0.975％至约1％的石膏组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.1％至约0.975％、约0.1％至约0.95％、约0.1％至约0.925％、约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.875％、约0.1％至约0.85％、约0.1％至约0.825％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.775％、约0.1％至约0.75％、约0.1％至约0.725％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.675％、约0.1％至约0.65％、约0.1％至约0.625％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.575％、约0.1％至约0.55％、约0.1％至约0.525％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.475％、约0.1％至约0.45％、约0.1％至约0.425％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.375％、约0.1％至约0.35％、约0.1％至约0.325％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.275％、约0.1％至约0.25％、约0.1％至约0.225％、约0.1％至约0.2％、约0.1％至约0.175％、约0.1％至约0.15％或约0.1％至约0.125％的石膏组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.5％至约8％、约0.75％至约8％、约1％至约8％、约1.25％至约8％、约1.5％至约8％、约1.75％至约8％、约2％至约8％、约2.25％至约8％、约2.5％至约8％、约2.75％至约8％、约3％至约8％、约3.25％至约8％、约3.5％至约8％、约3.75％至约8％、约4％至约8％、约4.25％至约8％、约4.5％至约8％、约4.75％至约8％、约5％至约8％、约5.25％至约8％、约5.5％至约8％、约5.75％至约8％、约6％至约8％、约6.25％至约8％、约6.5％至约8％、约6.75％至约8％、约7％至约8％、约7.25％至约8％、约7.5％至约8％或约7.75％至约8％的山梨糖醇组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.5％至约8％、约0.5％至约7.75％、约0.5％至约7.5％、约0.5％至约7.25％、约0.5％至约7％、约0.5％至约6.75％、约0.5％至约6.5％、约0.5％至约6.25％、约0.5％至约6％、约0.5％至约5.75％、约0.5％至约5.5％、约0.5％至约5.25％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4.75％、约0.5％至约4.5％、约0.5％至约4.25％、约0.5％至约4％、约0.5％至约3.75％、约0.5％至约3.5％、约0.5％至约3.25％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2.75％、约0.5％至约2.5％、约0.5％至约2.25％、约0.5％至约2％、约0.5％至约1.75％、约0.5％至约1.5％、约0.5％至约1.25％、约0.5％至约1％或约0.5％至约0.75％的山梨糖醇组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.125％至约1％、约0.15％至约1％、约0.175％至约1％、约0.2％至约1％、约0.225％至约1％、约0.25％至约1％、约0.275％至约1％、约0.3％至约1％、约0.325％至约1％、约0.35％至约1％、约0.375％至约1％、约0.4％至约1％、约0.425％至约1％、约0.45％至约1％、约0.475％至约1％、约0.5％至约1％、约0.525％至约1％、约0.55％至约1％、约0.575％至约1％、约0.6％至约1％、约0.625％至约1％、约0.65％至约1％、约0.675％至约1％、约0.7％至约1％、约0.725％至约1％、约0.75％至约1％、约0.775％至约1％、约0.8％至约1％、约0.825％至约1％、约0.85％至约1％、约0.875％至约1％、约0.9％至约1％、约0.925％至约1％、约0.95％至约1％或约0.975％至约1％的苯甲酸钠组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围约0.1％至约1％、约0.1％至约0.975％、约0.1％至约0.95％、约0.1％至约0.925％、约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.875％、约0.1％至约0.85％、约0.1％至约0.825％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.775％、约0.1％至约0.75％、约0.1％至约0.725％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.675％、约0.1％至约0.65％、约0.1％至约0.625％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.575％、约0.1％至约0.55％、约0.1％至约0.525％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.475％、约0.1％至约0.45％、约0.1％至约0.425％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.375％、约0.1％至约0.35％、约0.1％至约0.325％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.275％、约0.1％至约0.25％、约0.1％至约0.225％、约0.1％至约0.2％、约0.1％至约0.175％、约0.1％至约0.15％或约0.1％至约0.125％的苯甲酸钠组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.125％至约1％、约0.15％至约1％、约0.175％至约1％、约0.2％至约1％、约0.225％至约1％、约0.25％至约1％、约0.275％至约1％、约0.3％至约1％、约0.325％至约1％、约0.35％至约1％、约0.375％至约1％、约0.4％至约1％、约0.425％至约1％、约0.45％至约1％、约0.475％至约1％、约0.5％至约1％、约0.525％至约1％、约0.55％至约1％、约0.575％至约1％、约0.6％至约1％、约0.625％至约1％、约0.65％至约1％、约0.675％至约1％、约0.7％至约1％、约0.725％至约1％、约0.75％至约1％、约0.775％至约1％、约0.8％至约1％、约0.825％至约1％、约0.85％至约1％、约0.875％至约1％、约0.9％至约1％、约0.925％至约1％、约0.95％至约1％或约0.975％至约1％的山梨酸钾组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.1％至约0.975％、约0.1％至约0.95％、约0.1％至约0.925％、约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.875％、约0.1％至约0.85％、约0.1％至约0.825％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.775％、约0.1％至约0.75％、约0.1％至约0.725％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.675％、约0.1％至约0.65％、约0.1％至约0.625％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.575％、约0.1％至约0.55％、约0.1％至约0.525％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.475％、约0.1％至约0.45％、约0.1％至约0.425％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.375％、约0.1％至约0.35％、约0.1％至约0.325％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.275％、约0.1％至约0.25％、约0.1％至约0.225％、约0.1％至约0.2％、约0.1％至约0.175％、约0.1％至约0.15％或约0.1％至约0.125％的山梨酸钾组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.125％至约1％、约0.15％至约1％、约0.175％至约1％、约0.2％至约1％、约0.225％至约1％、约0.25％至约1％、约0.275％至约1％、约0.3％至约1％、约0.325％至约1％、约0.35％至约1％、约0.375％至约1％、约0.4％至约1％、约0.425％至约1％、约0.45％至约1％、约0.475％至约1％、约0.5％至约1％、约0.525％至约1％、约0.55％至约1％、约0.575％至约1％、约0.6％至约1％、约0.625％至约1％、约0.65％至约1％、约0.675％至约1％、约0.7％至约1％、约0.725％至约1％、约0.75％至约1％、约0.775％至约1％、约0.8％至约1％、约0.825％至约1％、约0.85％至约1％、约0.875％至约1％、约0.9％至约1％、约0.925％至约1％、约0.95％至约1％或约0.975％至约1％的EDTA组成。
在一些实施方案中，以总制剂的wt/wt计，本发明的制剂由浓度范围为约0.1％至约1％、约0.1％至约0.975％、约0.1％至约0.95％、约0.1％至约0.925％、约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.875％、约0.1％至约0.85％、约0.1％至约0.825％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.775％、约0.1％至约0.75％、约0.1％至约0.725％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.675％、约0.1％至约0.65％、约0.1％至约0.625％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.575％、约0.1％至约0.55％、约0.1％至约0.525％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.475％、约0.1％至约0.45％、约0.1％至约0.425％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.375％、约0.1％至约0.35％、约0.1％至约0.325％、约0.1％至约0.3％、约0.1％至约0.275％、约0.1％至约0.25％、约0.1％至约0.225％、约0.1％至约0.2％、约0.1％至约0.175％、约0.1％至约0.15％或约0.1％至约0.125％的EDTA组成。
在一些实施方案中，本发明的制剂可在约5至约11、约5.5至约11、约6至约11、约6.5至约11、约7至约11、约7.5至约11、约8至约11、约8.5至约11、约9至约11、约9.5至约11、约10至约11或约10.5至约11的pH范围内配制。
在一些实施方案中，本发明的制剂可在约5至约11、约5至约10.5、约5至约10、约5至约9.5、约5至约9、约5至约8.5、约5至约8、约5至约7.5、约5至约7、约5至约6.5、约5至约6或约5至约5.5的pH范围内配制。
在一些实施方案中，制剂可被配制成颗粒形式(颗粒制剂)。生成颗粒制剂的方法是本领域公知的，并且包括：结晶、沉淀、锅包衣、流化床包衣、附聚(例如流化床附聚)、旋转雾化、挤出、颗粒化、滚圆、尺寸减小法、转鼓造粒和/或高剪切造粒等。
在一些实施方案中，颗粒制剂可经由附聚例如喷雾干燥附聚、再润湿附聚、流化床附聚等生成。
在一些实施方案中，附聚的类型可以是流化床附聚。流化床附聚的示例性方法提供于美国专利号7,582,147中；该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，颗粒制剂可经由流化床附聚生成。
在一些实施方案中，颗粒制剂可通过将活性成分和惰性成分喷雾到流化床中的空白载剂上来生成。
在一些实施方案中，颗粒制剂可通过将活性成分和惰性成分(赋形剂)喷雾到空白载剂上并在盘式造粒机中造粒来生成。
在一些实施方案中，颗粒制剂可通过将活性粉末和惰性粉末(即，本文所述的一种或多种赋形剂)与水混合，随后通过使成分通过挤出机而造粒来生成。
在一些实施方案中，颗粒制剂可通过将活性粉末和惰性粉末(即，本文所述的一种或多种赋形剂)与水混合并通过辊压造粒来生成。
任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于本文和下文所述的任何制剂中，例如，任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于以下制剂中：可湿性粉剂或颗粒制剂；或液体浓缩制剂。
本发明的示例性实施方案
本公开考虑了组合物、产品和转基因生物体，其含有-或在转基因生物体的情况下，表达或以其他方式产生-一种或多种TVP或一种或多种TVP-杀昆虫蛋白。
在一些实施方案中，示例性组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)赋形剂(例如，本文所述的任何赋形剂)。
在一些实施方案中，示例性组合物由以下组成：(1)TVP或其药学上可接受的盐；TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；或它们的组合；和(2)赋形剂(例如，本文所述的任何赋形剂)。
在一些实施方案中，示例性组合物由以下组成：(1)一种或多种TVP、一种或多种TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂(例如，本文所述的任何赋形剂)。
在一些实施方案中，示例性组合物由以下组成：(1)一种或多种TVP或其药学上可接受的盐；一种或多种TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂(例如，本文所述的任何赋形剂)。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)一种或多种TVP、或一种或多种TVP-杀昆虫蛋白；和(2)一种或多种赋形剂(例如，本文所述的任何赋形剂)。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)一种或多种TVP、或一种或多种TVP-杀昆虫蛋白；和(2)一种或多种赋形剂(例如，本文所述的任何赋形剂)；其中前述(1)或(2)中的任一者可伴随地或顺序地使用。
利用TVP或TVP-杀昆虫蛋白(如本文所述)的组合物、产品、多肽和/或植物中的任一种可用于防治有害生物、其生长和/或由其作用引起的损害，尤其是其对植物的损害。
由TVP或TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的组合物可包括农用化学品组合物。例如，在一些实施方案中，农用化学品组合物可包括但不限于气溶胶和/或气溶胶化产品(例如，喷洒剂、熏蒸剂、粉末、粉剂和/或气体)；拌种剂；口服配制剂(例如昆虫食物等)；或瞬时和/或稳定表达和/或产生TVP或TVP-杀昆虫蛋白的转基因生物体(例如细胞、植物或动物)。
在一些实施方案中，本公开的活性成分可以组合物的形式施用，并且可与其他非活性化合物同时或相继施用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、肥皂、休眠油、聚合物和/或定时释放或可生物降解的载剂制剂，其允许在单次施用制剂后长期向目标区域给药。如果需要，这些非活性化合物中的一种或多种可与制剂领域中常用的其他农业上可接受的载剂、表面活性剂或施用促进助剂一起制备。合适的载剂和助剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散体、润湿剂、增粘剂、粘结剂或肥料。同样，可将制剂制备成可食用的“饵料”或制成有害生物“陷阱”以允许目标有害生物进食或摄取杀有害生物制剂。
施用由如通过本公开的本文所述的方法产生的TVP或TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的本公开的活性成分或本公开的农用化学品组合物的方法包括叶施用、种子包衣和土壤施用。在一些实施方案中，施用次数和施用率取决于对应有害生物的侵染强度。
由TVP或TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的组合物可被配制成粉末、粉剂、丸剂、颗粒、喷洒剂、乳液、胶体、溶液等，并且可通过常规手段制备，诸如干燥、冻干、匀化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩包含多肽的细胞培养物。在含有至少一种此类杀有害生物多肽的所有此类组合物中，该多肽可以约l重量％至约99重量％的浓度存在。
在一些实施方案中，可将由TVP或TVP-杀昆虫蛋白组成的组合物预防性地施用于环境区域以防止被易感有害生物(例如鳞翅目和/或鞘翅目有害生物)侵染，该易感有害生物可通过本发明的方法在给定区域被杀死或减少数量。在一些实施方案中，有害生物摄取或接触杀有害生物有效量的多肽。
在一些实施方案中，本文所述的杀有害生物组合物可通过将TVP或TVP-杀昆虫蛋白转化的细菌、酵母或其他细胞、晶体和/或孢子悬浮液或分离的蛋白质组分与期望的农业上可接受的载剂一起配制来制备。组合物可以在施用之前以合适的方式配制，例如冻干、冷冻干燥、干燥，或在水性载剂、介质或合适的稀释剂(例如盐水和/或其他缓冲液)中配制。在一些实施方案中，配制的组合物可以是粉剂或颗粒材料的形式，或油(植物或矿物)中的悬浮液，或水或油/水乳液的形式，或作为可湿性粉剂，或与任何其他适于农业应用的载剂材料组合。合适的农业载剂可以是固体或液体，并且是本领域公知的。在一些实施方案中，制剂可与一种或多种固体或液体助剂混合，并通过各种方式制备，例如通过使用常规配制技术将杀有害生物组合物与合适的助剂均匀混合、共混和/或研磨。合适的制剂和施用方法描述于美国专利号6,468,523中，该专利全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ IDNO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ IDNO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ IDNO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP在X1、X2、X3、X4或X5处具有一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ IDNO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中该TVP在X1、X2、X3、X4或X5处具有一个氨基酸取代；并且其中X7不存在；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110所示的氨基酸序列中的任一项至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的制剂可具有按制剂的重量计0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的TVP。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP和一种或多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP或其药学上可接受的盐组成，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP或其药学上可接受的盐组成，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP或其药学上可接受的盐组成，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP或其药学上可接受的盐组成，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP组成，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基酸序列中的任一者具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP组成，其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP组成，其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP组成，其中该TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的组合物由具有接头的TVP组成，其中该接头为可切割接头。
在一些实施方案中，本发明的组合物由具有可切割接头的TVP组成，其中该可切割接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明的组合物由具有接头的TVP组成，其中该接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP和一种或多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体，其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明的组合物由一种或多种赋形剂组成。
在一些实施方案中，本发明的组合物由一种或多种赋形剂组成，其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约2％至约16％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％wt/wt；BIT的范围为约0.01％至约0.1％wt/wt；麦芽糊精的范围为约10％至约50％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约1％至约5％wt/wt；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％wt/wt；以及发酵固体的范围为约15％至约40％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约7％至约9％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％wt/wt；BIT的范围为约0.025％至约0.075％wt/wt；麦芽糊精的范围为约30％至约40％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2％至约3％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白为约8.5％wt/wt；并且其中海藻糖为约25％wt/wt；BIT为约0.05％wt/wt；麦芽糊精为约36.3％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％wt/wt；以及发酵固体为约26.85％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明的组合物基本上由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP是包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该接头是可切割接头。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该可切割接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体；其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于本文和下文所述的任何制剂中，例如，任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于以下制剂中：可湿性粉剂或颗粒制剂；或液体浓缩制剂。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；其中如果Z1为T，则该TVP是糖基化的；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；其中X1为Q；并且Z1为A；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，制剂由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51所示的氨基酸序列中的任一项具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列；以及以下赋形剂中的一种或多种：麦芽糊精、海藻糖、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA和/或苯并异噻唑啉酮(BIT)。
在一些实施方案中，由TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成的制剂可具有按制剂的重量计0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的TVP。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP和一种或多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；其中X1为Q；并且Z1为A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP组成，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列中的任一者具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP组成，其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP和一种或多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体，其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明的组合物由一种或多种赋形剂组成。
在一些实施方案中，本发明的组合物由一种或多种赋形剂组成，其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约2％至约16％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％wt/wt；BIT的范围为约0.01％至约0.1％wt/wt；麦芽糊精的范围为约10％至约50％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约1％至约5％wt/wt；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％wt/wt；以及发酵固体的范围为约15％至约40％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约7％至约9％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％wt/wt；BIT的范围为约0.025％至约0.075％wt/wt；麦芽糊精的范围为约30％至约40％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2％至约3％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白为约8.5％wt/wt；并且其中海藻糖为约25％wt/wt；BIT为约0.05％wt/wt；麦芽糊精为约36.3％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％wt/wt；以及发酵固体为约26.85％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明的组合物基本上由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐，其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中Z1为T并且该TVP是糖基化的，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明的组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐，其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体；其中如果Z1为T，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体，其中X1为Q；并且Z1为A。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51中任一项的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51中任一项的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中以该组合物的总重量计，该TVP的范围为约2％至约16％w/w；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％w/w；BIT的范围为约0.01％至约0.1％w/w；麦芽糊精的范围为约10％至约50％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约1％至约5％w/w；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％w/w；以及发酵固体的范围为约15％至约40％w/w。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中以该组合物的总重量计，该TVP的范围为约7％至约9％w/w；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％w/w；BIT的范围为约0.025％至约0.075％w/w；麦芽糊精的范围为约30％至约40％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约2％至约3％w/w；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中以该组合物的总重量计，该TVP为约8.5％w/w；并且其中海藻糖为约25％w/w；BIT为约0.05％w/w；麦芽糊精为约36.3％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％w/w；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％w/w；以及发酵固体为约26.85％w/w。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该组合物基本上由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％w/w的TVP；量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由以下项组成：TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该组合物由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％w/w的TVP；量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由TVP和多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
在一些实施方案中，组合物由TVP和多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体；其中如果Z1为T并且该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，组合物由TVP和多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体；其中X1为Q；并且Z1为A。
在一些实施方案中，组合物由TVP和多种赋形剂组成；其中该TVP包含与根据SEQID NO：2、49或51的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于本文和下文所述的任何制剂中，例如，任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于以下制剂中：可湿性粉剂或颗粒制剂；或液体浓缩制剂。
使用本发明的方法
保护植物、植物部分和种子的方法
在一些实施方案中，本公开提供了在农业和/或非农业应用中防治无脊椎有害生物的方法，该方法包括使无脊椎有害生物或其环境、固体表面(包括植物表面或其部分)与生物学有效量的本发明的TVP中的一种或多种接触，或者与包含至少一种TVP的杀昆虫蛋白接触。
在一些实施方案中，本公开提供了在农业和/或非农业应用中防治无脊椎有害生物的方法，该方法包括使无脊椎有害生物或其环境、固体表面(包括植物表面或其部分)与生物学有效量的由至少一种本发明的TVP和赋形剂组成的组合物接触。
在一些实施方案中，本公开提供了在农业和/或非农业应用中防治无脊椎有害生物的方法，该方法包括使无脊椎有害生物或其环境、固体表面(包括植物表面或其部分)与生物学有效量的由至少一种本发明的TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的组合物接触。
合适的组合物的示例由以下组成：(1)至少一种本发明的TVP；本发明的TVP中的两种或更多种；TVP-杀昆虫蛋白；和/或两种或更多种TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂；包括配制成待以如下形式递送非活性成分的所述组合物：液体溶液、乳液、粉末、颗粒、纳米粒子、微粒或它们的组合。
在一些实施方案中，为了实现与本发明的化合物、混合物或组合物接触以保护田间作物免受无脊椎有害生物侵害，通常将所述化合物或组合物在种植前施用于作物的种子，施用于作物植株的叶子(例如，叶、茎、花、果实)，或在种植作物之前或之后施用于土壤或其他生长介质。
接触方法的一个实施方案是通过喷洒。另选地，可将由TVP或TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的颗粒组合物施用于植物叶子或土壤。通过使植物与包含本发明化合物的组合物接触，本发明的化合物还可通过植物吸收有效地递送，该组合物作为液体制剂的土壤浸液、土壤的颗粒制剂、育苗箱处理或移栽浸渍液施用。值得注意的是土壤浸液液体制剂形式的本公开的组合物。还值得注意的是用于防治无脊椎有害生物的方法，其包括使无脊椎有害生物或其环境与生物学有效量的TVP或TVP-杀昆虫蛋白接触。进一步值得注意的是，在一些示例性实施方案中，示例性方法考虑了土壤环境，其中组合物作为土壤浸液制剂施用于土壤。还值得注意的是，TVP或TVP-杀昆虫蛋白通过局部施用于侵染所在部位也是有效的。其他接触方法包括通过直接和残余喷洒、空中喷洒、凝胶、种子包衣、微囊化、全身摄取、诱饵、耳标、大丸剂、烟雾剂、熏蒸剂、气溶胶、粉剂和许多其他方法施用本发明的化合物或组合物。接触方法的一个实施方案是包含本发明的化合物或组合物的尺寸稳定的肥料颗粒、棒或片剂。本发明的化合物还可浸渍到用于制造无脊椎动物防治装置的材料中(例如，昆虫网，施用到衣服上，施用到蜡烛制剂等中)。
在一些实施方案中，TVP或TVP-杀昆虫蛋白还可用于种子处理以保护种子免受无脊椎有害生物侵害。在本公开和权利要求的上下文中，处理种子是指使种子与生物学有效量的通常被配制成本发明的组合物的TVP或TVP-杀昆虫蛋白接触。这种种子处理保护种子免受无脊椎土壤有害生物的侵害，并且通常还可保护由发芽的种子发育的幼苗的根和与土壤接触的其他植物部分。种子处理还可通过TVP或TVP-杀昆虫蛋白在发育中的植物内的迁移来提供对叶子的保护。种子处理可应用于所有类型的种子，包括将从其萌发经遗传转化以表达特定性状的植物的那些。此外，TVP或TVP-杀昆虫蛋白可被转化到已经转化的植物或其部分，例如植物细胞或植物种子，例如表达除草剂抗性诸如草甘膦乙酰转移酶(其提供对草甘膦的抗性)的那些。
种子处理的一种方法是在播种种子之前用TVP或TVP-杀昆虫蛋白(即作为由TVP或TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的配制组合物)喷洒或撒粉于种子。配制用于种子处理的组合物通常由TVP或TVP-杀昆虫蛋白和成膜剂或粘合剂组成。因此，通常，本公开的种子包衣组合物由生物学有效量的TVP或TVP-杀昆虫蛋白和成膜剂或粘合剂组成。种子可通过将可流动的悬浮浓缩物直接喷洒到种子的滚床中然后干燥种子来包衣。另选地，可将其他制剂类型诸如湿粉、溶液、悬乳剂、可乳化浓缩物和水乳剂喷洒在种子上。该方法特别适用于在种子上施加薄膜包衣。本领域技术人员可使用各种包衣机和方法。合适的方法包括P.Kosters等人，Seed Treatment：Progress and Prospects，1994 BCPC Monograph No.57和其中列出的参考文献中所列的那些，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
处理过的种子通常含有量在约0.01g至1kg/100kg种子(即按处理前种子的重量计约0.00001％至1％)范围内的TVP或TVP-杀昆虫蛋白。配制用于种子处理的可流动悬浮液通常包含约0.5％至约70％的活性成分、约0.5％至约30％的成膜粘合剂、约0.5％至约20％的分散剂、0％至约5％的增稠剂、0％至约5％的颜料和/或染料、0％至约2％的消泡剂、0％至约1％的防腐剂和0％至约75％的挥发性液体稀释剂。
使用制剂和组合物的方法
在一些实施方案中，本发明提供了使用由以下组成的组合物以防治昆虫的方法：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂；其中该TVP选自本文所述的TVP的一种或任何组合，例如杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-Xs-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；其中所述方法包括制备该组合物，然后将所述组合物施用于昆虫的所在部位。
在一些实施方案中，本发明提供了使用由以下组成的组合物以防治昆虫的方法：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂；其中该TVP选自本文所述的TVP的一种或任何组合，例如杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；其中所述方法包括制备该组合物，然后将所述组合物施用于昆虫的所在部位。
在一些实施方案中，本发明提供了使用组合物以防治昆虫的方法，所述组合物由以下组成：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白，和(2)赋形剂；其中该昆虫选自由以下项组成的组：葡萄蔓天蛾(Achema Sphinx Moth)(天蛾幼虫(Hornworm))(欧罗巴天蛾(Eumorphaachemon))；苜蓿粉蝶(Alfalfa Caterpillar)(纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme))；粉斑螟(Almond Moth/Caudra cautella)；白条卷叶蛾(Amorbia Moth/Amorbia humerosana)；夜盜蛾(Armyworm)(夜蛾属种(Spodoptera spp.)，例如甜菜夜蛾(exigua)、草地贪夜蛾(frugiperda)、海灰翅夜蛾(littoralis)、一星粘虫(Pseuda，etia unipuncta))；洋蓟羽蛾(Artichoke Plume Moth/Platyptilia carduidactyla)；杜鹃毛虫(Azalea Caterpillar/Datana major)；蓑蛾(Bagworm)(常绿树蓑蛾(Thyridopteryx ephemeraeformis))；香蕉灯蛾(Banana Moth/Hypercompe scribonia)；黄斑蕉弄蝶(Banana Skipper)(尖翅蕉弄蝶(Erionotathrax))；黑头芽虫(Blackheaded Budworm)(西部黑头长翅卷蛾(Aclerisgloverana))；加州橡木虫(加州槲蛾(Phryganidia californica))；春尺蠖(SpringCankerworm/Paleacrita merriccata)；樱桃果虫(樱桃小食心虫(Grapholitapackardi))；塘水螟(China Mark Moth/Nymphula stagnata)；柑橘夜蛾(Citrus Cutworm/Xylomyges curialis)；苹果蠹蛾(Codling Moth/Cydia pomonella)；越橘果虫(越橘蜂斑螟(Acrobasis vaccinii))；卷心菜薄翅野螟(Cross-striped Cabbageworm/Evergestisrimosalis)；切根虫(Cutworm)(夜蛾属种，小地老虎(Agrotis ipsilon))；黄杉毒蛾(Douglas Fir Tussock Moth/Orgyia pseudotsugata)；天蛾(Ello Moth)(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖(Elm Spanworm/Ennomos subsignaria)；欧洲葡萄蛾(EuropeanGrapevine Moth)(葡萄花翅小蛾(Lobesia botrana))；欧洲弄蝶(European Skipper)(无斑豹弄蝶(Thymelicus lineola)(埃塞克斯弄蝶(Essex Skipper)))；美国白蛾(FallWebworm/Melissopus latiferreanus)；榛卷蛾(Filbert Leafroller)(蔷薇黄卷蛾(Archips rosanus))；果树黄卷蛾(Fruittree Leafroller/Archips argyrospilia)；葡萄浆果小卷叶蛾(Grape Berry Moth/Paralobesia viteana)；葡萄卷叶蛾(GrapeLeairoller/Platynota stultana)；黑拟蛉蛾(Grapeleaf Skeletonizer/Harrisinaamericana(仅地面))；苜蓿绿夜蛾(Green Cloverworm/Plathypena scabra)；绿条纹枫树蛾(Greenstriped Mapleworm/Dryocampa rubicunda)；流胶病-蛙蛾(Gummosos-Batrachedra)；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(Gypsy Moth/Lymantria dispar)；铁杉尺蠖(Hemlock Looper/Lambdina fiscellaria)；天蛾幼虫(天蛾属种(Manduca spp.))；菜粉蝶(Imported Cabbageworm/Pieris rapae)；玉米天蚕蛾(Io MothMutomeris io)；短叶松芽卷叶蛾(Jack Pine Budworm/Choristoneura pinus)；苹浅褐卷蛾(Light Brown AppleMoth/Epiphyas postvittana)；瓜虫(甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata))；合欢巢蛾(Mimosa Webworm/Homadaula anisocentra)；斜纹卷叶虫(Obliquebanded Leafroller)(玫瑰色卷蛾(Choristoneura rosaceana))；夹竹桃蛾(Oleander Moth)(黄蜂飞蛾(Syntomeida epilais))；杂食卷叶蛾(Omnivorous Leafroller)(荷兰石竹小卷蛾(Playnota stultana))；杂食尺蠖(Omnivorous Looper/Sabulodes aegrotata)；桔凤蝶(Orangedog)(美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes))；桔带卷蛾(Orange Tortrix/Argyrotaenia citrana)；梨小食心虫(Oriental Fruit Moth/Grapholita molesta)；桃条麦蛾(Peach Twig Borer/Anarsia lineatella)；松蝴蝶(Pine Butterfly)(美洲松粉蝶(Neophasia menapia))；美洲棉铃虫(Podworm/Heliocoverpa zea)；红带卷叶蛾(Redbanded Leafroller/Argyrotaenia velutinana)；红疣天社蛾(RedhumpedCaterpillar/Schizura concinna)；瓜皮虫(Rindworm)群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(Saddleback Caterpillar)(鞍背刺蛾(Sibine stimulea))；鞍斑美洲舟蛾(saddleProminent Caterpillar/Heterocampa guttivitta)；盐泽灯蛾(Saltmarsh Caterpillar/Estigmene acrea)；草皮网螟(Sod Webworm)(草螟属种(Crambus spp.))；尺蠖(Spanworm)(白尺蠖(Ennomos subsignaria))；秋星尺蠖(Fall Cankerworm/Alsophila pometaria)；云杉卷叶蛾(Spruce Budworm/Choristoneura fumiferana)；天幕毛虫(TentCaterpillar)(各种枯叶蛾科(Lasiocampidae))；菠萝褐灰蝶(Geyr)(Thecla-TheclaBasilides/Thecla basilicles)；烟草天蛾(Tobacco Hornworm/Manduca sexta)；烟草粉斑蛾(Tobacco Moth/Ephestia elutella)；苹果丛生芽卷蛾(Tufted Apple Budmoth)(苹果芽小卷蛾(Platynota iclaeusalis))；桃蚜蛾(Twig Borer)(桃条麦蛾(Anarsialineatella))；豆杂色夜蛾(Variegated Cutworm)(疆夜蛾(Peridroma saucia))；杂色卷叶蛾(Variegated Leafroller/Platynota flavedana)；黎豆夜蛾(VelvetbeanCaterpillar/Anticarsia gemmatalis)；胡桃毛虫(Walnut Caterpillar/Datanaintegerrima)；结网虫(Webworm)(美国白蛾幼虫(Hyphantria cunea))；西部栎柳毒蛾(Western Tussock Moth/Orgyia vetusta)；南方玉米螟(Southern Cornstalk Borer/Diatraea crambidoides)；玉米穗虫(Corn Earworm)；甘薯小象甲(Sweet potatoweevil)；胡椒茎象甲(Pepper weevil)；柑橘根象甲(Citrus root weevil)；草莓根象甲(Strawberry root weevil)；山核桃象甲(Pecan weevil)；榛象甲(Filbert weevil)；稻水象甲(Ricewater weevil)；苜蓿叶象甲(Alfalfa weevil)；三叶草象甲(Clover weevil)；茶枝小蠹虫(Tea shot-hole borer)；根象甲(Root weevil)；甘庶犀金龟(Sugarcanebeetle)；咖啡果小蠧(Coffee berry borer)；一年生早熟禾象甲(Annual blue grassweevil/Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(Asiatic garden beetle)(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧洲金龟子(European chafer/Rhizotroqus majalis)；绿六月花金龟(Green June beetle/Cotinis nitida)；日本丽金龟(Japanese beetle/Popilliajaponica)；五月或六月甲虫(鳃金龟属(Phyllophaga)昆虫)；北方独角仙(Northernmasked chafer)(北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis))；东方丽金龟(Orientalbeetle/Anomala orientalis)；南方独角仙(Southern masked chafer/Cyclocephalalurida)；谷象(Billbug)(象甲总科(Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culex pipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraeasaccharalis)；番茄夜蛾(Helicoverpa armigera)；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)；烟夜蛾(Heliothis virescens)；科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacali)；欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)；印度谷螟(Plodia interpunctella)；小菜蛾(Plutella xylostella)；大豆尺蠖蛾(Pseudoplusia includens)；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和榆黄萤叶甲(Xanthogaleruca luteola)。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达一种或多种TVP或编码其的多核苷酸的植物。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该TVP是包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中该接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，其包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物，其中保护该植物免受选自由以下项组成的组的昆虫侵害：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黄斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州槲蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠹蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树蛾)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫(梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖蛾)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草天蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟芽夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
在一些实施方案中，本发明提供了用于防治昆虫的方法，其包括向所述昆虫提供在其基因组中包含稳定并入的核酸构建体的转基因植物，其中所述稳定并入的核酸构建体包含可操作以编码TVP的多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂；其中该TVP选自本文所述的TVP的一种或任何组合，例如杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；并且其中将该组合物施用于该有害生物的所在部位，或施用于易受该有害生物攻击的植物或动物。
本文描述的组合物中的任一种可用于对抗、防治或抑制有害生物的方法中，其包括施用杀有害生物有效量的由以下组成的组合物：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂。
例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP和一种或多种赋形剂组成的组合物；其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP或其药学上可接受的盐组成的组合物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP或其药学上可接受的盐组成的组合物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP或其药学上可接受的盐组成的组合物，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
在一些实施方案中，本发明的组合物由TVP或其药学上可接受的盐组成，其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基酸序列中的任一者具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由具有接头的TVP组成的组合物，其中该接头是可切割接头。
在一些实施方案中，本发明的组合物由具有可切割接头的TVP组成，其中该可切割接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由具有接头的TVP组成的组合物，其中该接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP和一种或多种赋形剂组成的组合物；其中该TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体，其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂，其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约2％至约16％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％wt/wt；BIT的范围为约0.01％至约0.1％wt/wt；麦芽糊精的范围为约10％至约50％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约1％至约5％wt/wt；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％wt/wt；以及发酵固体的范围为约15％至约40％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约7％至约9％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％wt/wt；BIT的范围为约0.025％至约0.075％wt/wt；麦芽糊精的范围为约30％至约40％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约2％至约3％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白为约8.5％wt/wt；并且其中海藻糖为约25％wt/wt；BIT为约0.05％wt/wt；麦芽糊精为约36.3％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％wt/wt；以及发酵固体为约26.85％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物基本上由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP由如SEQ ID NO：17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP是包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该接头是可切割接头。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该可切割接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体；其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于本文和下文所述的任何制剂中，例如，任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于以下制剂中：可湿性粉剂或颗粒制剂；或液体浓缩制剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的一种组合物施用于有害生物的所在部位，该组合物由以下组成：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂；其中该有害生物选自由以下项组成的组：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黄斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州槲蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠧蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树蛾)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫（梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖蛾)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草天蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟芽夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂；其中该TVP选自本文所述的TVP的一种或任何组合，例如杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；并且其中将该组合物施用于该有害生物的所在部位，或施用于易受该有害生物攻击的植物或动物。
本文描述的组合物中的任一种可用于对抗、防治或抑制有害生物的方法中，其包括施用杀有害生物有效量的由以下组成的组合物：(1)TVP或TVP-杀昆虫蛋白；和(2)赋形剂。
例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP和一种或多种赋形剂组成的组合物；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP或其药学上可接受的盐组成的组合物，其中Z1为T并且该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP或其药学上可接受的盐组成的组合物，其中X1为Q；并且Z1为A。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列中的任一者具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP组成的组合物，其中该TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由具有接头的TVP组成的组合物，其中该接头是可切割接头。
在一些实施方案中，本发明的组合物由具有可切割接头的TVP组成，其中该可切割接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由具有接头的TVP组成的组合物，其中该接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的由TVP和一种或多种赋形剂组成的组合物；其中该TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体，其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂，其中该一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约2％至约16％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％wt/wt；BIT的范围为约0.01％至约0.1％wt/wt；麦芽糊精的范围为约10％至约50％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约1％至约5％wt/wt；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％wt/wt；以及发酵固体的范围为约15％至约40％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白的范围为约7％至约9％wt/wt；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％wt/wt；BIT的范围为约0.025％至约0.075％wt/wt；麦芽糊精的范围为约30％至约40％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约2％至约3％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)一种或多种赋形剂；其中以该组合物的总重量计，该TVP或TVP-杀昆虫蛋白为约8.5％wt/wt；并且其中海藻糖为约25％wt/wt；BIT为约0.05％wt/wt；麦芽糊精为约36.3％wt/wt；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％wt/wt；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％wt/wt；以及发酵固体为约26.85％wt/wt。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物基本上由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：以该组合物的总重量计，量为8.5％wt/wt的TVP或TVP-杀昆虫蛋白；量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐，其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中Z1为T并且该TVP是糖基化的，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中X1为Q；并且Z1为A，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP包含如SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP由如SEQ ID NO：17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该TVP是包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该接头是可切割接头。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该可切割接头在昆虫的肠或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白；其中该接头具有如SEQ ID NO：61-70中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括施用杀有害生物有效量的一种组合物，该组合物由以下组成：(1)TVP、TVP-杀昆虫蛋白或它们的组合；和(2)多种赋形剂；其中该TVP或TVP-杀昆虫蛋白包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中该多肽相对于如SEQ ID NO：1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中该组合物由以该组合物的总重量计量为8.5％wt/wt的TVP组成；并且其中该多种赋形剂由以下组成：以该组合物的总重量计，量为25％wt/wt的海藻糖；量为0.05％wt/wt的BIT；量为36.3％wt/wt的麦芽糊精；量为2.6％wt/wt的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％wt/wt的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％wt/wt的发酵固体；其中如果Z1为T或S，则该TVP是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐施用于该有害生物的所在部位，所述TVP包含与SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐施用于该有害生物的所在部位，所述TVP包含SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐施用于该有害生物的所在部位，所述TVP由SEQ ID NO：2、49或51中任一项所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐施用于该有害生物的所在部位，所述TVP包含与SEQ ID NO 51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐施用于该有害生物的所在部位，所述TVP包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，其包括将杀有害生物有效量的杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)或其药学上可接受的盐施用于该有害生物的所在部位，所述TVP由SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列组成。
任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于本文所述的任何组合物中，例如任何前述TVP、TVP-杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于对抗、防治或抑制有害生物和/或施用于有害生物的所在部位，其中该有害生物选自由以下项组成的组：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黄斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州檞蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠹蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树螟)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫(梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖蛾)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草天蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟芽夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
作物和有害生物
可通过这些方法防治的具体作物有害生物和昆虫包括以下：网翅目(蟑螂)；等翅目(白蚁类)；直翅目(蝗虫、蚱蜢和蟋蟀)；双翅目(家蝇、蚊子、采采蝇、鹤蝇和果蝇)；膜翅目(蚂蚁、黄蜂、蜜蜂、锯蝇、姬蜂和瘿蚊)；虱目(咬虱和吸虱)；蚤目(蚤)；和半翅目(臭虫和蚜虫)，以及蜘蛛诸如蜱螨亚纲(Acari)(蜱和螨)，以及这些生物体各自所携带的寄生虫。
“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、蜱等。
昆虫有害生物包括但不限于选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等的昆虫。更具体地，昆虫有害生物包括鞘翅目、鳞翅目和双翅目。
对于用杀昆虫多肽处理而言，具有合适的农业、家庭和/或医学/兽医学重要性的昆虫包括但不限于下列纲和目的成员：
鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)。多食亚目包括牙甲总科(Hydrophiloidea)、隐翅甲总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公虫总科(Cleroidea)、叩头虫总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芜菁总科(Meloidea)、花蚤总科Mordelloidea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠹总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)以及象甲总科(Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)以及龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。牙甲总科包括牙甲科(Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(Silphidae)和隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芜菁科(Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜕科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。
鞘翅目的示例包括但不限于：美国豆象(菜豆象(ACanthoscelides obtectus))、叶甲(杨毛臀萤叶甲(Agelastica alni))、叩甲(直条叩甲(Agriotes lineatus)、暗色叩甲(Agriotes obscurus)、二色叩甲(Agriotes bicolor))、谷盗(米扁虫(Ahasverusadvena))、马铃薯鳃金龟(summer schafer Amphimallon solstitialis)、家具窃蠹(furniture beetle，Anobium punctatum)、花象属种(Anthonomus spp.)(象鼻虫)、甜菜隐食甲(Pygmy mangold beetle，Atomaria linearis)、地毯甲虫类(圆皮蠹属种(Anthrenusspp.)、毛皮蠹属种(Attagenus spp.))、豇豆象(四纹豆象(Callosobruchus maculates))、干果甲虫(黄斑露尾甲(Carpophilus hemipterus))、卷心菜荚象甲(白菜房原象甲(Ceutorhynchus assimilis))、冬油菜茎象甲(Ceutorhynchus picitarsis)、线虫(烟草金针虫(Conoderus vespertinus)和南方马铃薯金针虫(Conoderus falli))、香蕉象甲(香蕉根颈象(Cosmopolites sordidus))、新西兰草地蛴螬(新西兰草金龟(Costelytrazealandica))、六月金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))、向日葵茎象(密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus))、火腿皮蠹(Dermestes lardarius)、玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera))、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)和巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、北美家天牛(Hylotropes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata))、粉蠹属(Lyctus)甲虫(粉蠹属种)、露尾甲(油菜花露尾甲(Meligethesaeneus))、五月鳃盒龟(Melolontha melolontha)、美洲蜘蛛甲(Mezium americanum)、黄蛛甲(Niptus hololeucus)、谷盗类(锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)和大眼锯谷盗(Oryzaephilus mercator))、葡萄黑耳喙象(Otiorhynchus sulcaius)、芥甲虫(辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae))、十字花科植物跳甲(蔬菜黄条跳甲(Phyllotretacruciferae))、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)、卷心菜茎跳甲(油菜蚤跳甲(Psylliodes chrysocephala))、蛛甲属(Ptinus)种(蜘甲)、谷蠹(Rhizoperthadominica)、豌豆象(条纹根瘤象甲(Sitona lineatus))、米象和谷象(米象(Sitophilusoryzae)和谷象(Sitophilus granaries))、红色瓜子象(黄褐小爪象(Smicronyxfulvus))、窃蠹(药材甲(Stegobium paniceum))、大黄粉虫(黄粉虫(Tenebrio molitor))、粉甲(赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和杂拟谷盗(Tribolium confusum))、仓库和橱柜甲虫(斑皮蠹属种(Trogoderma spp.))和向日葵叶甲(Zygogramma exclamation′s)。
革翅目(蠼螋类)的示例包括但不限于：欧洲球螋普通蠼螋(Forficulaauricularia)和河岸蠼螋(Labidura riparia)。
网翅目(Dictyoptera)的示例包括但不限于：东方蜚蠊(Blatta orientalis)、德国小蠊(Blatella germanica)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、美洲大蠊(Periplaneta americana)和烟色大蠊(Periplaneta fuliginosa)。
倍足亚纲(Diplonoda)的示例包括但不限于：带斑蛇千足虫(Blaniulusguttulatus)、平脊千足虫(Brachydesmus superus)和温室千足虫(Oxidus gracilis)。
双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)以及环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)以及瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)以及长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(DivisionAschiza)和有缝组(Division Schizophora)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)以及果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)以及麻蝇科(Sarcophagidae)。
双翅目的示例包括但不限于：家蝇(Musca domestica)、非洲盾波蝇(Cordylobiaanthropophaga)、拟蚊蠓(库蠓属种(Culicoides spp.))、蜂虱(蜂虱蝇属种(Braulaspp.))、甜菜浅叶花蝇(Pegomyia betae)、黑蝇(斯蚋属种(Cnephia spp.)、真蚋属种(Eusimulium spp.)、蚋属种(Simulium spp.))、胃蝇(黄蝇属种(Cuterebra spp.)、胃蝇属种(Gastrophilus spp.)、狂蝇属种(Oestrus spp.))、大蚊(大蚊属种(Tipula spp.))、眼潜蝇(潜蝇属种(Hippelaies spp.))、污物繁殖蝇(丽蝇属种(Calliphora spp.)、厕蝇属种(Fannia spp.)、水虻属种(Hermetia spp.)、绿蝇属种(Lucilia spp.)、家蝇属种(Muscaspp.)、腐蝇属种(Muscina spp.)、金属色绿蝇属种(Phaenicia spp.)、伏蝇属种(Phormiaspp.))、麻蝇(食肉麻蝇种(Sarcophaga spp.)、污蝇属种(Wohlfahrtia spp.))；欧小蝇(黑麦秆蝇(Oscinella frit))、果蝇(寡鬃实蝇属种(Dacus spp.)、果蝇属种(Drosophilaspp.))、齿股蝇属(齿股蝇属种(Hydrotea spp.))、小麦瘿蝇(Mayetiola destructor)、黑角蝇(黑角蝇属种(Haematobia spp.))、马蝇和斑虻(斑虻属种(Chrysops spp.)、麻虻属种(Haematopota spp.)、虻属种(Tabanus spp.))、虱蝇(羊虱蝇属种(Lipoptena spp.)、拟虱蝇属种(Lynchia spp.)和鸽虱蝇属种(Pseudolynchia spp.))、蜡实蝇属种(Ceratitusspp.)、蚊(伊蚊属种(Aedes spp.)、按蚊属种(Anopheles spp.)、库蚊属种(Culex spp.)、鳞蚊属种(Psorophora spp.))、白蛉(白蛉属种(Phlebotomus spp.)、罗蛉属种(Lutzomyiaspp.))、旋丽蝇(蛆症金蝇(Chtysomya bezziana)和螺旋蛆蝇(Cochliomyiahominivorax))、绵羊蜱(蜱蝇属种(Melophagus spp.))；厩螫蝇(螫蝇属种(Stomoxysspp.))、采采蝇(舌蝇属种(Glossina spp.))和皮蝇(皮蝇属种(Hypoderma spp.))。
等翅目(白蚁类)的示例包括但不限于：来自草白蚁科(Hodotermitidae)、木白蚁科(Kalotermitidae)、澳白蚁科(Mastotermitidae)、鼻白蚁科(Rhinotermitidae)、齿白蚁科(Serritermitidae)、白蚁科(Termitidae)、原白蚁科(Termopsidae)的种。
异翅亚目(Heteroptera)的示例包括但不限于：臭虫(温带臭虫(Cimexlectularius))、污棉虫(中棉红蝽(Dysdercus intermedius))、阳光虫(麦扁盾蝽(Eurygaster integriceps))、牧草盲蝽(Lygus lineolaris)、喜绿蝽(青臭龟虫(Nezaraantennata))、稻绿蝽(Nezara viridula)和锥猎蝽(大锥蝽(Panstrogylus megistus))、红猎蝽(Rhodnius ecuadoriensis)、浅红色猎蝽(Rhodnius pallescans)、长红猎蝽(Rhodnius prolixus)、Rhodnius robustus、二分维蝽(Triatoma dimidiala)、骚扰维蝽(Triatoma infestans)和泥色锥蝽(Triatoma sordida)。
同翅目的示例包括但不限于：加利福尼亚红圆蚧(Aonidiella aurantii)、蚕豆蚜(Aphis fabae)、棉蚜(Aphis gossypii)、苹果蚜(Aphis pomi)、黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus)、夹竹桃圆蚧(Aspidiotus hederae)、棉粉虱(Bemesia tabaci)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、梨黄木虱(Cacopsylla pyricola)、醋栗蚜(Cryptomyzusribis)、葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae)、桔木虱(Diaphorina citri)、马铃薯微叶蝉(Empoasca fabae)、蚕豆微叶蝉(Empoasca solana)、葡萄微叶蝉(Empoascavitis)、绵蚜(Eriosoma lanigerum)、欧洲果圆蚧(Eulecanium corni)、桃大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、稻灰飞虱(Laodelphax striatellus)、马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)、桃蚜(Myzus persicae)、稻叶蝉(Nephotettix cinticeps)、稻褐飞虱(Nilaparvata lugens)、成瘿瘤蚜(瘿绵蚜属种(Pemphigus spp.))、忽布疣额蚜(Phoroclon humuli)、粟缢蚜(Rhopalosiphum padi)、乌盔蚧(Saissetia oleae)、麦二岔蚜(Schizaphis graminum)、燕麦长管蚜(Sitobion avenae)和温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)。
等足目(Isopoda)的示例包括但不限于：鼠妇(common pillbug，Armadillidiumvulgare)和鼠妇(common woodlouse，Oniscus asellus)。
鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺娥科(Geometridae)、灯娥科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)以及谷蛾科(Tineidae)。
鳞翅目的示例包括但不限于：茶小卷叶蛾(Adoxophyes orana)(茶小卷叶蛾)、小地老虎(Agrotis ipsolon)(小地老虎)、苹褐长翅卷蛾(Archips podana)(苹褐长翅卷蛾)、梨潜蛾(Bucculatrix pyrivorella)(梨潜蛾)、棉叶穿孔潜蛾(Bucculatrixthurberiella)(棉叶穿孔潜蛾)、松尺蠖(Bupalus piniarius)(松尺蠖)、苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella)(苹果蠹蛾)、二化螟(二化螟)、云杉卷叶蛾(东部云杉色卷蛾)、向日葵细圈叶蛾(Cochylis hospes)(向日葵细圈叶蛾)、西南玉米秆草螟(Diatraeagrandiosella)(西南玉米秆草螟)、埃及金刚钻(Earls insulana)(埃及金刚钻)、地中海粉螟(Euphestia kuehniella)(地中海粉螟)、欧洲葡萄卷叶蛾(Eupoecilia ambiguella)(欧洲葡萄卷叶蛾)、黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)(黄毒蛾)、东方毒蛾(Euproctissubflava)(东方毒蛾)、大蜡螟(Galleria mellonella)(大蜡螟)、番茄夜蛾(Helicoverpaarmigera)(棉铃虫)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(棉铃虫)、烟夜蛾(Heliothisvirescens)(烟夜蛾)、褐织叶蛾(Hofmannophila pseudopretella)(褐织叶蛾)、向日葵斑螟(Homeosoma electellum)(向日葵斑螟)、东方茶树卷蛾(Homona magnanima)(东方茶树卷蛾)、斑幕潜叶蛾(Lithocolletis blancardella)(斑幕潜叶蛾)、舞毒蛾(Lymantriadispar)(舞毒蛾)、黄褐天幕毛虫(Malacosoma neustria)(黄褐天幕毛虫)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)(甘蓝夜蛾)、披肩粘虫(Mamestra configurata)(披肩粘虫)、烟草天蛾(Manduca sexta)和Manuduca quinquemaculata、冬尺蠖(Operophtera brumata)(冬尺蠖)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲玉米螟)、小眼夜蛾(Panolisflaminea)(小眼夜蛾)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)(棉红铃虫)、桔细潜蛾(Phyllocnistiscitrella)(桔细潜蛾)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)(大菜粉蝶)、小菜蛾(Plutellaxylostella)(小菜蛾)、大豆尺夜蛾(Rachiplusia ni)(大豆尺夜蛾)、黄色熊蛾(Spilosomavirginica)(黄色熊蛾)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)(甜菜夜蛾)、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)(秋夜蛾)、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)(海灰翅夜蛾)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)(斜纹夜蛾)、黄纹夜蛾(Spodoptera praefica)(黄纹夜蛾)、棉卷叶螟(Sylepta derogata)(棉卷叶螟)、负袋夜蛾(Tineola bisselliella)(负袋夜蛾)、网衣蛾(Tineola pellionella)(网衣蛾)、欧洲橡树卷叶蛾(Tortrix viridana)(欧洲橡树卷叶蛾)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(甘蓝银纹夜蛾)和巢蛾(Yponomeutapadella)(巢蛾)。
直翅目的示例包括但不限于：家蟋(Acheta domesticus)、树蝗(Anacridiumspp.)、飞蝗(Locusta migratoria)、双带蚱蜢(Melanoplus bivittatus)、长额负蝗(Melanoplus dfferentialis)、赤腿蚱蜢(Melanoplus femurrubrum)、迁徙蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)、北美蝼蛄(Neocurtilla hexadectyla)、松红翅蝗(Nomadacris septemfasciata)、短翅蝼蛄(Scapteriscus abbreviatus)、南美蝼蛄(Scapteriscus borellii)、蝼蛄(Scapteriscus vicinus)和沙漠蝗(Schistocercagregaria)。
虱目的示例包括但不限于：牛羽虱(Bovicola bovis)、咬虱(Damalinia spp.)、猫羽虱(Felicola subrostrata)、短鼻牛虱(Haematopinus eloysternus)、尾车专换虱(Haematopinus quadriperiussus)、猪虱(Haematopinus suis)、面虱(Linognathusovillus)、足虱(Linognathus pedalis)、狗长颚虱(Linognathus setosus)、长鼻牛虱(Linognathus vituli)、鸡体虱(Menacanthus stramineus)、家禽箭轴虱(Menopongallinae)、人体虱(Pediculus humanus)、阴虱(Phthirus pubis)、牛管虱(Solenopotescapillatus)和狗羽虱(Trichodectes canis)。
啮虫目(Psocoptera)的示例包括但不限于：书虱(嗜卷书虱(Liposcelisbostrychophila)、无色书虱(Liposcelis decolor)、嗜虫书虱(Liposcelis entomophila)和尘虱(Trogium pulsatorium))。蚤目的示例包括但不限于：禽蚤(Ceratophyllusgallinae)、狗蚤(Ctenocephalides canis)、猫蚤(Ctenocephalides fells)、人蚤(Pulexirritans)和东方鼠蚤(Xenopsylla cheopis)。
综合纲的示例包括但不限于：庭院么蚰(Scutigerella immaculate)。
缨尾目的示例包括但不限于：灰衣鱼(Ctenolepisma longicaudata)、四线衣鱼(Ctenolepisma quadriseriata)、普通衣鱼(Lepisma saccharina)和家衣鱼(Thennobiadomestica)；
缨翅目的示例包括但不限于：烟草蓟马(Frankliniella fusca)、花蓟马(Frankliniella intonsa)、苜蓿蓟马(Frankliniella occidentalis)、棉芽蓟马(Frankliniella schultzei)、温室条蓟马(Hercinothrips femoralis)、大豆蓟马(Neohydatothrips variabilis)、Kelly柑桔蓟马(Pezothrips kellyanus)、鳄梨蓟马(Scirtothrips perseae)、南黄蓟马(Thrips palmi)和棉蓟马(Thrips tabaci)。
线虫的示例包括但不限于：寄生线虫例如根结线虫、孢囊线虫和根斑线虫，包括异皮线虫属种(Heterodera spp.)、根结线虫属种(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫属种(Globodera spp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于：Heterodera glycines(大豆孢囊线虫)；Heterodera schachtii(甜菜孢囊线虫)；Heterodera avenae(禾谷孢囊线虫)；以及Globodera rostochiensis和Globodera pailida(马铃薯孢囊线虫)。根斑线虫包括但不限于：短体线虫属种(Pratylenchus spp.)。
对本公开的TVP敏感的其他昆虫物种包括：引起公众和动物健康问题的节肢动物有害生物，例如蚊子，例如来自伊蚊属、按蚊属和库蚊属的蚊子，来自蜱、蚤和蝇等。
在一个实施方案中，由TVP或TVP-杀昆虫蛋白和赋形剂组成的杀昆虫组合物可用于治疗体外寄生虫。体外寄生物包括但不限于：蚤、蜱、疥癣、螨、蚊、令人讨厌和叮咬人的蝇、虱和包含前述体外寄生物的一种或多种的组合。术语“蚤”包括蚤目(Siphonaptera)寄生蚤的普通种或偶然种，特别是栉头蚤属(Ctenocephalides)的种，特别是猫栉头蚤(C.fells)和犬栉头蚤(C.cams)、鼠蚤(印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis))和人蚤(Pulexirritans)。
针对主要作物的本发明的昆虫有害生物包括但不限于：玉米：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)，小地老虎；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，棉铃虫；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾；西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)，西南玉米秆草螟；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpuslignosellus)，小玉米茎蛀虫；蔗螟(Diatraea saccharalis)，蔗螟；玉米根萤叶甲虫(Diabrotica virgifera)，玉米根叶甲；长角叶甲(Diabrotica longicornis barberi)，长角叶甲；南方玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根叶甲；梳爪叩甲属种(Melanotus spp.)，捻转血矛线虫；圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)，圆头犀金龟(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方圆头犀金龟(蛴螬)；日本丽金龟(Popillia japonica)，日本丽金龟；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲；玉米谷象(Sphenophorus maidis)，玉米谷象；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米缢管蚜；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)，玉米根蚜；白翅长蝽(Blissusleucopterus leucopterus)，白翅长蝽；赤腿蚱蜢(Melanoplus femurrubrum)，赤腿蚱蜢；迁徙蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蚱蜢；玉米种蝇(Hylemya platura)，玉米种蝇；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis)，玉米斑潜蝇；草蓟马(Anaphothrips obscrurus)，草蓟马；窃蚁(Solenopsis milesta)，窃蚁；荨麻叶螨(Tetranychus urticae)，荨麻叶螨；高 梁：高粱螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，棉铃虫；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫；粒肤地老虎(Feltia subterranea)，粒肤地老虎；蛴螬(Phyllophaga crinita)，蛴螬；Eleodes、宽胸叩头虫属和Aeolus属种(Conoderusand Aeolus spp.)，捻转血矛线虫；橙足负尼虫(Oulema melanopus)，橙足负尼虫；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲；玉米谷象(Sphenophorus maidis)，玉米谷象；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米缢管蚜；蔗黄伪毛蚜(Sipha flava)，蔗黄伪毛蚜；白翅长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)，白翅长蝽；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，高粱瘿蚊；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨；荨麻叶螨(Tetranychus urticae)，荨麻叶螨；小 麦：粘虫(Pseudaletia unipunctata)，粘虫；秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫；西方地老虎(Agrotisorthogonia)，西方地老虎；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫；橙足负尼虫(Oulema melanopus)，橙足负尼虫；车轴草叶象甲(Hypera punctata)，车轴草叶象甲；南方玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根叶甲；俄罗斯小麦蚜虫；麦二岔蚜(Schizaphis graminum)，麦二岔蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；赤腿蚱蜢(Melanoplus femurrubrum)，赤腿蚱蜢；长额负蝗(Melanoplusdifferentialis)，长额负蝗；迁徙蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蚱蜢；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，麦红吸浆虫；美洲麦秆蝇(Meromyza americana)，美洲麦秆蝇；冬作种蝇(Hylemya coarctata)，冬作种蝇；烟草蓟马(Frankliniella fusca)，烟草蓟马；麦茎蜂(Cephus cinctus)，麦茎蜂；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae)，郁金香瘤瘿螨；向日葵：向日葵芽蛾(Suleimahelianthana)，向日葵芽蛾；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵斑螟；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis)，向日葵叶甲；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜金龟；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽瘿蚊；棉：烟夜蛾(Heliothis virescens)，棉芽虫；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，棉铃虫；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甜菜夜蛾；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，棉红铃虫；棉铃象甲(Anthonomus grandis)，棉铃象甲；棉蚜(Aphis gossypii)，棉蚜；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉跳盲蝽；结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)，结翅粉虱；牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，牧草盲蝽；赤腿蚱蜢(Melanoplus femurrubrum)，赤腿蚱蜢；长额负蝗(Melanoplus differentialis)，长额负蝗；棉蓟马(Thrips tabaci)，棉蓟马；烟草蓟马(Franklinkiella fusca)，烟草蓟马；朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)，朱砂叶螨；荨麻叶螨(Tetranychus urticae)，荨麻叶螨；稻：蔗螟(Diatraea saccharalis)，蔗螟；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，棉铃虫；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄肖叶甲；稻象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻象甲；米象(Sitophilus oryzae)，米象；黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，黑尾叶蝉；白翅长蝽(Blissus leucopterus)，白翅长蝽；喜绿蝽(Acrosternum hilare)，喜绿蝽；大豆：大豆尺蠖蛾(Pseudoplusia includens)，大豆尺夜蛾；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，黎豆夜蛾；苜蓿绿夜蛾(Plathypenascabra)，苜蓿绿夜蛾；欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotisipsilon)，小地老虎；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甜菜夜蛾；烟夜蛾(Heliothisvirescens)，棉蚜虫；谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis)，墨西哥豆瓢虫；桃蚜(Myzus persicae)，桃蚜；马铃薯微叶蝉(Empoascafabae)，马铃薯微叶蝉；喜绿蝽(Acrosternum hilare)，喜绿蝽；赤腿蚱蜢(Melanoplusfemurrubrum)，赤腿蚱蜢；长额负蝗(Melanoplus differentialis)，长额负蝗；玉米种蝇(Hylemya platura)，玉米种蝇；大豆蓟马(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；棉蓟马(Thrips tabaci)，棉蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)，土耳其斯坦叶螨；荨麻叶螨(Tetranychus urticae)，荨麻叶螨；大麦：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)，小地老虎；麦二岔蚜(Schizaphis graminum)，麦二岔蚜；白翅长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，白翅长蝽；喜绿蝽(Acrosternumhilare)，喜绿蝽；褐臭蝽(Euschistus servus)，褐臭蝽；玉米种蝇(Delia platura)，玉米种蝇；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊；麦岩螨(Petrobia latens)，麦岩螨；油种子油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，甘蓝蚜；蔬菜黄条跳甲(Phyllotretacruciferae)，蔬菜黄条跳甲(Flea beetle)；披肩粘虫(Mamestra configurata)，披肩粘虫；小菜蛾(plutella xylostella)，小菜蛾；地种蝇属种(Delia ssp.)，根蛆。
在一些实施方案中，杀昆虫组合物可用于处理包含一种或多种前述昆虫的组合。
对本发明的肽敏感的昆虫包括但不限于以下科，诸如：蜚蠊目(Blattaria)、鞘翅目、弹尾目(Collembola)、双翅目、棘口目(Echinostomida)、半翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、脉翅目(Neuroptera)、直翅目、小杆目(Rhabditida)、蚤目、缨翅目。
属-种如下示出：Actebia属-黑行军虫(Actebia fennica)、地老虎属(Agrotis)-小地老虎(Agrotis ipsilon)、地老虎属(Agrotis)-黄地老虎(A.segetum)、干煞夜蛾属(Anticarsia)-黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、带卷蛾属(Argyrotaenia)-桔带卷蛾(Argyrotaenia citrana)、粉蝶属(Artogeia)-白粉蝶(Artogeia rapae)、蚕属(Bombyx)-家蚤(Bombyx-mori)、蛀褐夜蛾属(Busseola)-玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)、丁字灰蝶属(Cacyreus)-马丁字灰蝶(Cacyreus marshall)、禾草螟属(Chilo)-二化螟(Chilosuppressalis)、色卷蛾属(Christoneura)-云杉色卷蛾(Christoneura fumiferana)、色卷蛾属(C.)-西方云杉色卷蛾(C.occidentalis)、色卷蛾属(C.)-短叶松芽色卷蛾(C.-pinuspinus)、色卷蛾属(C.)-玫瑰色卷蛾(C.rosacena)、纵卷叶野螟属(Cnaphalocrocis)-稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、细蛾属(Conopomorpha)-蒸枝可可细蛾(Conopomorpha cramerella)、斜栉柄卷蛾属(Ctenopsuestis)-斜纹卷蛾(Ctenopsuestisobliquana)、蠹蛾属(Cydia)-苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、斑蝶属(Danaus)-君主斑蝶(Danaus plexippus)、蔗螟属(Diatraea)-小蔗螟(Diatraea saccharallis)、蔗螟属(D.)-西南玉米螟(D.grandiosella)、钻夜蛾属(Earias)-翠纹钻夜蛾(Earias vittella)、斑螟属(Elasmolpalpus)-南美玉米苗斑螟(Elasmolpalpus lignoselius)、杆螟属(Eldana)-薯杆螟(Elclana saccharina)、粉斑螟属(Ephestia)-地中海粉斑螟(Ephestiakuehniella)、叶小卷蛾属(Epinotia)-阿泊玛叶小卷蛾(Epinotia aporema)、褐卷蛾属(Epiphyas)-苹淡褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、蜡螟属(Galleria)-大蜡螟(Galleriamellonella)、属-种铃夜蛾属(Helicoverpa)-谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、铃夜蛾属(H.)-澳洲棉铃虫(H.punctigera)、铃夜蛾属(H.)-棉铃虫(H.armigera)、实夜蛾属(Heliothis)-烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、白蛾属(Hyphantria)-美国白蛾(Hyphantria cunea)、尺蠖属(Lambdina)-铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria)、豆食心虫属(Leguminivora)-大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)、花翅小蛾属(Lobesia)-葡萄花翅小蛾(Lobesia botrana)、毒蛾属(Lymantria)-舞毒蛾(Lymantria dispar)、天慕毛虫属(Malacosoma)-森林天幕毛虫(Malacosoma disstria)、甘蓝夜蛾属(Mamestra)-甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、甘蓝夜蛾属(M.)-蓓带夜蛾(M.configurata)、烟草天蛾属(Manduca)-烟草天蛾(Manduca sexta)、刷须野螟属(Marasmia)-角目刷须野螟(Marasmiapatnalis)、(Maruca vitrata)、古毒蛾属(Orgyia)-灰斑古毒蛾(Orgyia leucostigma)、秆野螟属(Ostrinia)-欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秆野螟属(O.)-亚洲玉米螟(O.furnacalis)、褐卷蛾属(Pandemis)-苹果褐卷蛾(Pandemis pyrusana)、红铃虫属(Pectinophora)-棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、潜叶蛾属(Perileucoptera)-咖啡潜叶蛾(Perileucoptera coffeella)、茄麦蛾属(Phthorimaea)-马铃薯麦蛾(Phthorimaea opercullela)、Pianotortrix属Pianotortrix octo种、石竹小卷蛾属(Piatynota)-荷兰石竹小卷蛾(Piatynota stultana)、粉蝶属(Pieris)-大菜粉蝶(Pierisbrassicae)、谷斑螟属(Plodia)-印度谷斑螟(Plodia interpunctala)、菜蛾属(Plutella)-小菜蛾(Plutella xylostella)、尺夜蛾属(Pseudoplusia)-大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、Rachiplusia属-向日葵尺蠖(Rachiplusia nu)、白禾螟属(Sciropophaga)-三化螟(Sciropophaga incertulas)、蛀茎夜蛾属(Sesamia)-蛀茎夜蛾(Sesamia calamistis)、雪灯蛾属(Spilosoma)-黄色熊蛾(Spilosoma virginica)、夜蛾属(Spodoptera)-甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、夜蛾属(S.)-草地夜蛾(S.frugiperda)、夜蛾属(S.)-棉贪夜蛾(S.littoralis)、夜蛾属(S.)-莎草黏虫(S.exempta)、夜蛾属(S.)-斜纹贪夜蛾(S.litura)、Tecia属-安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、异舟蛾属(Thaumetopoea)-松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)、粉夜蛾属(Trichoplusia)-粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、Wiseana属-蝙蝠蛾(Wiseana cervinata)、Wiseana属-copularis种(Wiseana copularis)、Wiseana属-jocosa种(Wiseana jocosa)、蜚蠊目(Blattaria)-小蜚蠊(Blattaria Blattella)、弹尾目(Collembola)-弹尾目奇跳属(CollembolaXenylla)、弹尾目(C.)-C.Folsomia、Echinostomida属-Fasciola种(EchinostomidaFasciola)、半翅目(Hemiptera)-突角长蝽属(Hemiptera Oncopeltrus)、半翅目(He.)-小粉虱属(He.Bemisia)、半翅目(He.)-长管蚜属(He.Macrosiphum)、半翅目(He.)-缢管蚜属(He.Rhopalosiphum)、半翅目(He.)-苑瘤属(He.Myzus)、膜翅目(Hymenoptera)-松叶蜂属(Hymenoptera Diprion)、膜翅目(Hy.)-蜜蜂属(Hy.Apis)、膜翅目(Hy.)-长距茧蜂属(Hy.Macrocentrus)、膜翅目(Hy.)-方室茧蜂属(Hy.Meteorus)、膜翅目(Hy.)-横索肿腿小蜂属(Hy.Nasonta)、膜翅目(Hy.)-火蚁属(Hy.Solenopsis)、等足目(Isopoda)-鼠妇属(Isopoda Porcellio)、等翅目(Isoptera)-散白蚁属(Isoptera Reticulitermes)、直翅目(Orthoptera)-Achta属(Orthoptera Achta)、前气门亚目(Prostigmata)-叶螨属(Prostigmata Tetranychus)、小杆目(Rhabitida)-拟丽突属(RhabiticlaAcrobeloides)、小杆目(R.)-隐杆线虫属(R.Caenorhabditis)、小杆目(R.)-Distolabrellus属(R.Distolabrellus)、小杆目(R.)-Panagrellus属(R.Panagrellus)、小杆目(R.)-Pristionchus属(R.Pristionchus)、小杆目(R.)-草地垫刃线虫属(R.Pratylenchus)、小杆目(R.)-钩口线虫属(R.Ancylostoma)、小杆目(R.)-日圆线虫属(R.Nippostrongylus)、小杆目(R.)-Panagrellus属(R.Panagrellus)、小杆目(R.)-血矛线虫属(R.Haemonchus)、小杆目(R.)-根结线虫属(R.Meloidogyne)以及蚤目(Siphonaptera)-栉首蚤属(Siphonaptera Ctenocephalides)。
本公开提供了用于植物转化的方法，其可用于转化任何植物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。基因方法或植物并入式保护剂(PIP)将是特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉花、西红柿、玉蜀黍、小麦、玉米、甜玉米、紫苜蓿、大豆、高粱、紫花豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、油菜、水稻、大豆、大麦、向日葵、树(包括松类和落叶类)、花(包括商业化和温室种植的那些)、田野羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和油菜、芸苔属种、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
在一些实施方案中，本发明的组合物和/或方法可施用于选自由以下项组成的组的昆虫和/或有害生物的所在部位：尺蠖；杂食卷叶蛾；天蛾幼虫；菜粉蝶；小菜蛾；苜蓿绿夜蛾；结网虫；盐泽灯蛾；夜盜蛾；切根虫；卷心菜薄翅野螟；美洲棉铃虫；黎豆夜蛾；大豆尺夜蛾；番茄螟蛉；豆杂色夜蛾；瓜虫；瓜皮虫群；果树黄卷蛾；柑橘夜蛾；实夜蛾；桔凤蝶；柑橘夜蛾；红疣天社蛾；天幕毛虫；美国白蛾；胡桃毛虫；尺蠖；舞毒蛾；杂色卷叶蛾；红带卷叶蛾；苹果丛生芽卷蛾；梨小食心虫；榛卷蛾；斜纹卷叶虫；苹果蠹蛾；桃条麦蛾；黑拟蛉蛾；葡萄卷叶蛾；葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)；桔带卷蛾；烟夜蛾；葡萄浆果小卷叶蛾；尺蠖；苜蓿粉蝶；棉铃虫；鬼面天蛾；白条卷叶蛾；杂食尺蠖；天蛾(天蛾幼虫)；玉米天蚕蛾；夹竹桃蛾；杜鹃毛虫；天蛾幼虫；卷叶蛾；黄斑蕉弄蝶；Batrachedra comosae(Hodges)；Thecla Moth；洋蓟羽蛾；蓟花蝶；蓑蛾；春尺蠖和秋尺蛾；白尺蠖；加州橡木虫；松蝴蝶；云杉卷叶蛾；鞍斑美洲舟蛾；黄杉毒蛾；西部栎柳毒蛾；黑头芽虫；合欢巢蛾；短叶松芽卷叶蛾；鞍背毛虫；绿条纹枫树蛾；或铁杉尺蠖。
在一些实施方案中，本发明的组合物和/或方法可施用于选自由以下项组成的组的昆虫和/或有害生物的所在部位：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黄斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州槲蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠹蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树蛾)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫（梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃条麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草无蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃条麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；或榆黄萤叶甲。
在一些实施方案中，本发明的组合物和/或方法可施用于选自由以下项组成的组的成年甲虫的所在部位：亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)、金点橡树吉丁虫(Gold spotted oakborer)(马林果窄吉丁(Agrilus coxalis auroguttatus))、绿六月花金龟(Cotinisnitida)、日本丽金龟(Popillia japonica)、五月或六月甲虫(鳃金龟属种)、东方丽金龟(Anomala orientalis)和无患子属植物吉丁虫(Soap berry-borer/Agrilus prionurus)。
在一些实施方案中，本发明的组合物和/或方法可施用于昆虫和/或有害生物的所在部位，该昆虫和/或有害生物为选自由以下项组成的组的幼虫(一年生白蛴螬)：一年生早熟禾象甲(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladeracastanea))；欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis)；绿六月花金龟(Cotinis nitida)；日本丽金龟(Popillia japonica)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方独角仙(Cyclocephala lurida)；和谷象(象甲总科)。
实施例
本说明书中的实施例不旨在且不应用于限制本发明；提供它们仅仅是为了说明本发明。
实施例1：TVP表达载体的生成
对各种TVP的DNA构建体进行密码子优化，并合成为与乳酸克鲁维酵母α交配因子前/原序列(αMF)的融合体，并将其连接到pKlac1(New England Biolabs)的NotI和HindIII限制位点。用SacII消化载体以线性化并去除细菌Ori和选择性标记物，然后将其电穿孔到电感受态乳酸克鲁维酵母细胞中。在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择板上选择多基因拷贝转化体。通过在Chromolith C18柱(4.6x100mm)上进行HPLC并在8min内以2mL min-1的流速和15％-33％乙腈的梯度洗脱来评估表达TVP的克隆。图1。
实施例2：TVP的消化和碱性氨基酸的丙氨酸扫描
确定TVP在暴露于鳞翅目肠道蛋白酶时的稳定性。简而言之，通过对肠内衬作小切口以便将肠内容物收集在管中来解剖5龄烟草天蛾。将多个切片汇集并保持在冰上以立即使用，或储存在-80℃以供将来使用。然后将分离的中肠(下文称为天蛾肠道提取物，或MGE)用于消化测定。接着，将1mg/mL的TVP与0.1mg/mL的牛胰蛋白酶一起温育，或者与用50mMTris-HCl(pH 8.8)维持碱性pH的1/10稀释的MGE一起温育。取时间点并添加200mM HCl淬灭消化物。通过HPLC分析对降解进行定量，并通过拟合单指数衰减确定速率。
鳞翅目肠道含有在Arg或Lys氨基酸之后切割的胰蛋白酶样蛋白酶；不希望受任何特定理论的束缚，我们假设将这些氨基酸单突变为丙氨酸可鉴定在鳞翅目肠道中引起降解的位点。为了检验上述假设，通过将野生型Ta1b氨基酸序列中存在的每个碱性氨基酸分别突变为丙氨酸来产生TVP。接下来，通过使TVP与如上所述的消化条件相对抗来评估这些TVP中每一种的稳定性。作为该实验的结果，揭示了用丙氨酸(R9A)取代氨基酸位置9处的精氨酸完全消除了胰蛋白酶消化，而K18A和R38A的取代产生适度的消化率，尽管显著降低。因此，在MGE测定中进一步评估R9A和R38A对鳞翅目肠道蛋白酶的稳定性，发现突变分别使Ta1b稳定247倍和8.6倍。参见表3。
表3.碱性氨基酸丙氨酸扫描消化分析。
Figure BDA0003998753650003341
实施例3：抗昆虫肠道蛋白酶序列的组合肽筛选
基于FRET的肽文库筛选以鉴定在鳞翅目肠道蛋白酶存在下可减少消化的位置。使用可商购获得的FRET试剂盒(目录号PSREPLI005，Mimotopes，Victoria，Australia)进行FRET分析。FRET分析如下：与FRET分子(染料和淬灭剂)偶联的肽文库用作报告分子测定，用于鉴定在昆虫肠道环境或模拟人胃肠环境中切割的肽。简而言之，FRET试剂盒包含FRET分子集合，这些分子具有一段3个可变氨基酸序列，该可变氨基酸序列由一系列甘氨酸氨基酸围起来，这些甘氨酸氨基酸连接到染料或淬灭剂。如果可变区不被切割则每个FRET分子都不产生信号，但是如果该分子被切割则可以被激发。切割发生的速度(即序列对蛋白酶的特异性)可以按荧光信号随时间发生的速率(即斜率)来排序。
所用的FRET试剂盒包含512个集合，每个集合最多8个不同的FRET分子。FRET反应具有非常高的通量，使用多通道装载移液器将酶添加到汇集材料的板中，然后每分钟读取一次板以获得可检测的荧光。记录每个反应的荧光检测输出。
如制造商所推荐的那样，在测定之前立即制备FRET样品(向每个孔中添加5μL50％的乙腈水溶液并在振荡器上搅拌板5分钟；然后添加45μL测定缓冲液并再次搅拌5分钟)。此时，FRET集合准备好添加50μL工作酶储备液以开始反应。使用多通道重复移液器，向每个孔中添加50μL工作酶原储备液(对于每种测试的酶类型)，然后将板立即置于酶标仪(SpectraMax酶标仪，具有SoftMax Pro 6.0软件，Molecular Devices，Sunnyvale CA)中并使用激发320nm、发射420nm与截止值420nm的设置读取发射。每1分钟读取读数一次，持续15分钟。完成读板后，将它们用铝密封机密封并储存在-80℃。
为了测试鳞翅目有害生物的肠道酶对FRET集合的切割，从玉米穗虫(谷实夜蛾)中分离肠道酶。玉米穗虫昆虫是从Benzon Research(Carlisle，PA)商购获得的卵。将孵化的幼虫在人工饲料上饲养直至第4/5龄(20mm长)，然后分离出肠道。在肠道提取之前，使用CO2麻醉幼虫。然后将幼虫在头部和尾部用针固定在解剖板上。使用解剖剪刀，切开角质层。然后将解剖剪刀插入切口中，角质层纵向沿着昆虫。接着小心地将角质层往后拉，松开固定的针以露出消化道。使用去离子水，彻底冲洗昆虫以除去血淋巴。然后用镊子切离肠道，并置于500μL 200mM Tris-HCl(pH 8.1)、150mM NaCl溶液(测定缓冲液)中。将管预先称重，然后在添加后称重，以计算添加的肠道的总量。将玉米穗虫肠道在200mM Tris-HCl(pH 8.1)、150mM NaCl中稀释至7mg/mL(10x)的储备浓度。对于每个板，用测定缓冲液将此溶液新鲜稀释20倍。使用多通道重复移液器，向每个孔中添加50μL 1X肠道提取物并如上所述立即读取。
接着，针对鳞翅目肠道模拟的蛋白酶环境测试FRET试剂盒，并回收数据。表11显示了组合肽筛选的结果，突出显示了在位置P2、P1、P1′和P2′的氨基酸取代，其中Pl对应于R9位置。该文库不含甲硫氨酸，因此假定类似的氨基酸亮氨酸和异亮氨酸接近M10(位置P1′)的可切割性。几种突变(在表4中以粗体显示)在鳞翅目蛋白酶的存在下显示出增强的稳定性，并且对这些突变中的几种进一步表征了在Ta1b中的稳定性和活性。
表4.肽消化速率的倍数降低。
Figure BDA0003998753650003361
突变体稳定性和活性谱
将基于FRET的突变并入TVP中并评估蛋白酶稳定性和活性。因为位置R9似乎是对于活性重要的药效团残基，所以我们优先考虑具有大极性侧链的保守突变，其更可能在该位置保持类似的活性谱。FRET筛选的示例性方法公开于标题为“Cleavable Peptides andInsecticidal and Nematicidal Proteins Comprising Same”的美国专利申请15/727,277，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
组合文库含有三个被甘氨酸包围的随机化氨基酸，在N和C端具有FRET染料/猝灭剂对。肽的切割导致与切割量成比例的信号增加，并允许对各种肽序列对肠道蛋白酶的敏感性进行等级排序。在以与前述MGE技术相同的方式分离的谷实夜蛾肠道提取物的存在下对组合文库进行消化。
评估TVP在MGE(如上所述)存在下的稳定性。通过注射到家蝇(Musca domestica)中来评估活性：将0.5通过胸腔内注射到平均质量为18mg的家蝇体内。在注射后24小时确定50％灭杀和死亡率所需的剂量。
在所测试的TVP中，几种突变体不利地影响活性。然而，几种TVP能够保持与天然Ta1b相似的活性，例如具有以下取代的TVP：A8S、R9N、R9Q和T11P，显示通过天蛾肠道提取物(MGE)的消化率显著降低，与组合肽文库结果一致。
为了评估丙氨酸突变的活性，将具有突变R38A和R9A的TVP注射到成年家蝇的背侧胸内区。相对于野生型Ta1b，R38A没有显示出活性的任何降低，但R9A的活性降低了9倍。参见表5。
表5.突变体稳定性和活性谱。
Figure BDA0003998753650003381
实施例4：家蝇注射测定
通过注射到家蝇(Musca domestica)中来评价在突变体稳定性测定中鉴定的TVP的活性。以0.5μL毒素或对照的注射剂量，将野生型Ta1b和在位置R9Q和R9N处具有氨基酸取代的TVP以18mg的平均质量胸腔内注射到家蝇中。然后在注射后24小时确定50％灭杀(KD50)所需的TVP剂量。该实验的结果说明，与野生型Ta1b相比，R9Q TVP更具活性，如通过达到KD50所需的剂量较低和在家蝇中(使用水和CO2的对照显示无杀灭效应)所指示的。图2。
实施例5：蓟马存活测定
从温室生长的天蓝绣球(Phlox paniculata)收集西方花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)的野生群。将未处理对照(UTC)的水或400μg毒素施加到8x33mm滤纸(85.6μg/cm2)上，并置于含有蓟马和10％蔗糖作为食物的密封容器内。然后在四天内测量蓟马死亡率。
蓟马存活测定揭示，未处理对照(UTC)和野生型U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的死亡率为12.5％；然而，使用在位置R9Q处具有氨基酸取代的TVP导致100％的死亡率。图3。
实施例6：乳酸克鲁维酵母中TVP的翻译后修饰
由乳酸克鲁维酵母表达和分泌的TVP经历翻译后修饰。为了更好地理解这种翻译后修饰，将TVP-R9Q注射到Chromolith C18柱(4.6x100mm)上并在8min内以2mL min-1的流速和15％-33％乙腈的梯度洗脱。然后在ESI LC-TOF Micromass LCT仪器(Waters)上收集质谱。
在TVP中发生的翻译后修饰由+162Da的质量位移证明。图4。这种翻译后事件很有可能是糖基化，特别是丝氨酸或苏氨酸残基的O-连接甘露糖基化。图4描绘了TVP-R9Q的HPLC色谱图的读数，显示TVP峰上的肩峰(由黑色箭头指示)。图5描绘了TVP-R9Q的质谱。多带电荷物质的解卷积(插图)计算了5732和5894Da的质量。完全氧化的TVP-R9Q的预期分子量为5731.3Da。图5。
实施例7：糖基化位点的去除和C端的保护
为了进一步表征TVP变体，分析了去除推定的糖基化位点的作用以及C端氨基酸提供的保护作用。将TVP变体注射到Chromolith C18柱(4.6x100mm)上并在8min内以2mL min-1的流速和15％-33％乙腈的梯度洗脱。在ESI LC-TOF Micromass LCT仪器(Waters)上收集质谱。
分析了以下TVP：(1)TVP-R9Q；(2)TVP-R9QΔG；(3)TVP-R9Q/T43A/ΔG；(4)TVP-R9Q/T43A；和(5)TVP-R9Q/T43A/ΔK-G。前述TVP的分子量的预期/实测的质谱结果报告于表6中。
表6.TVP的预期/实测分子量。
序列 预期分子量 实测分子量
(1)TVP-R9Q 5731.3 5732
(2)TVP-R9QΔG
(3)TVP-R9Q/T43A/ΔG 5644.2 5645
(4)TVP-R9Q/T43A 5701.3 5702
(5)TVP-R9Q/T43A/ΔK-G 5516.0 5516
如TVP-R9Q的HPLC所示并如左肩峰所指示，证实了推定的糖基化事件。图6。从Ta1b去除C端甘氨酸(例如，TVP-R9QΔG和TVP-R9Q/T43A/ΔG)导致末端赖氨酸(K50)在乳酸克鲁维酵母中表达期间部分被蛋白水解。图7-图8。
当末端甘氨酸被添加回(例如，TVP-R9Q/T43A)或末端赖氨酸也被去除(TVP-R9Q/T43A/ΔK-G)时，可表达单一种类的TVP。图9和图10。
图11-图14显示了ESI-MS分析的结果，其显示了以下的质谱；(1)TVP-R9Q；(2)TVP-R9QΔG；(3)TVP-R9Q/T43A/ΔG；(4)TVP-R9Q/T43A；和(5)TVP-R9Q/T43A/ΔK-G。
实施例8：使用去除糖基化位点后的TVP的家蝇注射测定
TVP：(1)TVP-R9Q；(2)TVP-R9QΔG；(3)TVP-R9Q/T43A/ΔG；(4)TVP-R9Q/T43A；和(5)TVP-R9Q/T43A/ΔK-G，在家蝇注射测定中进行了分析。家蝇注射如本文先前所述进行。表7显示了家蝇注射测定的结果。在此，与WT Ta1b相比，所有TVP显示出更高的活性。
表7.家蝇注射测定结果。
Figure BDA0003998753650003401
Figure BDA0003998753650003411
在此，糖基化位点和C端氨基酸(即ΔG和/或ΔK-G)的去除导致与WT Ta1b相比具有更高活性的肽。图15。
实施例9：玉米穗虫生物测定
为了比较WT Ta1b和TVP-R9Q，进行注射和口服叶面生物测定。在此，评价了WTTa1b和TVP-R9Q对玉米穗虫死亡率的影响。注射和口服生物测定的结果示于下表中。
首先，在鳞翅目注射测定中评价WT Ta1b(WT)和Ta1b的R9Q突变体(TVP-R9Q)。实验单位由每个肽剂量8只注射的单个玉米穗虫(谷实夜蛾)组成。每个肽有四个实验重复。在注射前，用标准鳞翅目食物饲养玉米穗虫幼虫至其第四龄。对幼虫称重以确定精确的剂量计算。由于玉米穗虫幼虫质量的变化，精确剂量在各重复之间略有变化，但注射的近似剂量为：1000、2000、4000和8000pmol/g。使用手动微型涂布器和装有30号针头的注射器进行注射。在它们的最靠后的腹足之一的底部注射幼虫。向幼虫注射1μL处理溶液。
注射后，将幼虫置于装有5mL标准鳞翅目食物的32孔托盘的孔中。然后将托盘置于28℃培养箱中。注射后24小时评价幼虫的状况。将幼虫评价为“活的”或“灭杀”，其中活的个体正常运动、正常进食并对正常探测起反应；灭杀个体不具有协调运动、不能进食并且对探测没有反应。
在口服叶面生物测定中，实验单元由12个叶盘(每个肽浓度)组成，叶盘(前面和后面)用5.5mL的总喷洒体积(每侧2.75mL)喷洒，在叶盘上允许喂养新生玉米穗虫(谷实夜蛾)。每个肽有四个实验重复。
将罗马生菜切成30mm直径的圆片，然后使用140ppm漂白剂溶液灭菌；然后将圆片在水中漂洗三次。然后将罗马生菜圆片用针固定到聚苯乙烯泡沫板上并用给定的处理剂喷洒；将圆片翻转，再次喷洒，使其干燥，并置于场地中。
场地是含有5mL 1％琼脂的32孔饲养盘。在每个孔中放置一个罗马生菜圆片，每个叶圆片具有单个一龄玉米穗虫(谷实夜蛾)。然后将托盘置于28℃培养箱中。
在喷洒和将幼虫施用于叶圆片后的第四天评价玉米穗虫的死亡率。将幼虫评定为活的(正常运动和进食)或死的(不动的、变色)。
注射和口服生物测定的结果在下表中给出。
表8.注射和口服死亡率测定。WT＝野生型。误差显示为平均值的标准误差(n＝3)。“ppt”＝千分之一。
Figure BDA0003998753650003421
实施例10：稳定性制剂
液体浓缩物稳定性
在不同温度下随时间评价液体浓缩物(LC)制剂。LC制剂包含2％TVP-R9Q/T43A、0.03％苯并异噻唑啉酮(BIT)、2％山梨醇；并且LC制剂的剩余量是发酵醪，即细胞分离的发酵醪的浓缩物，使用HPLC评价以确定TVP-R9Q/T43A在不同温度下和随时间推移的稳定性。评价的温度为4℃、21℃、37℃、45℃和54℃。评价时间为0、16、31、42、98和114天。
如图16所示，液体制剂在田间相关温度下迅速降解。
喷雾干燥粉末(SDP)稳定性测定
接下来以喷雾干燥粉末(SDP)形式评价TVP-R9Q/T43A的稳定性。在此，SDP制剂由干燥的发酵醪产生：简而言之，从反应器中取出发酵醪，浓缩并喷雾干燥，去除所有的水。在21℃、37℃和45℃下，在有和没有氧/水分清除剂包(Mitsubishi Gas Chemical America，Inc.，产品号AS-100；6553rd Ave#24，New York，NY 10017USA)的情况下，在0、7、14、28、42和62天，使用HPLC定量TVP-R9Q/T43A的量(以mg/mL为单位)，以评价SDP中TVP-R9Q/T43A的稳定性。
如图17所示，固态的TVP-R9Q/T43A相对于液态明显更稳定(与上述图16相比)。此外，与氧/水分清除剂包一起温育进一步增加了TVP-R9Q/T43A的稳定性。图17。
在进一步增加稳定性期间使用氧/水分清除剂包。在此，在测试之前将该包与样品一起密封在Mylar袋中。在21℃下温育62天后，与在没有氧/水分清除剂包的TVP-R9Q/T43A中观察到的15.4％降低相比，具有氧/水分清除剂包的TVP-R9Q/T43A的量(mg/mL)降低了3.5％。图17。类似地，在37℃下62天后，与没有氧/水分清除剂包时观察到的19.5％的降低相比，具有氧/水分清除剂包的TVP-R9Q/T43A的降低为13.0％。最后，在45℃下62天后，与没有氧/水分清除剂包时观察到的29.5％的降低相比，具有氧/水分清除剂包的TVP-R9Q/T43A的降低为24.7％。在此，肽的降解随温度增加而增加。图17。
实施例11：使用附加赋形剂的初步稳定性测定
稳定性制剂
本领域普通技术人员将认识到，具有高玻璃化转变温度(Tg)的长链糖和短链糖的组合促进低迁移率(例如，α弛豫和β弛豫)。参见Mensink等人，How sugars protectproteins in the solid state and during drying(review)：Mechanisms ofstabilization in relation to stress conditions.Eur J Pharm Biopharm.2017年5月；114：288-295。
进行降解测定以评价初步稳定性制剂。初步稳定性制剂的组分提供于下表中。在54℃、37℃和21℃下测试制剂2周。初步稳定性测定的结果如图18所示。
表9.初步稳定性制剂。量以克(％w/w)计；“-”指示成分不存在。
Figure BDA0003998753650003441
实施例12：苯并异噻唑啉酮(BIT)与TVP的相容性
评价两种干燥制剂-具有TVP-R9Q/T43A的细胞分离和浓缩发酵醪的制剂和SDP制剂的BIT相容性。如上所述获得TVP-R9Q/T43A的细胞分离和浓缩的发酵醪制剂。如下从发酵醪获得SDP制剂：在以下条件下使用Buchi喷雾干燥器(型号B-290)：入口温度：160℃；出口温度：65℃-70℃；泵速：35-40rpm；压降：45-50psi；抽吸器设定为100％；并且雾化压力为50psi。
在T0(在室温下进行配制和用喷雾干燥器干燥后立即进行的时间)和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。在4℃、21℃、37℃和45℃下测试每种制剂。
如图19所示，BIT的使用降低了TVP-R9Q/T43A在以固态配制时和在不使用其他添加剂时的稳定性。
然而，如图20所示，当将制剂喷雾干燥并与BIT组合时，TVP的稳定性随时间降低，这由于较高的温度而加剧。图20。
BIT通常用作抗微生物剂。然而，如在此所示，BIT的使用导致TVP在喷雾干燥时降解。图19-图20。
实施例13：pH稳定性筛选
进行pH稳定性筛选以确定pH对TVP-R9Q/T43A稳定性的影响。在此，使用Slice pH试剂盒(Hampton Research，目录号HR2-070；34Journey Aliso Viejo，CA 92656-3317USA)在不同的pH值下温育千分之1(ppt)的TVP-R9Q/T43A。将TVP-R9Q/T43A在45℃下温育7天并通过HPLC分析以确定剩余肽的百分比。如图21所示，，确定最佳pH在6.5和7.5之间。
用于防止微生物污染的常用防腐剂尤其包括苯甲酸盐、丙酸盐和山梨酸盐。防腐剂的选择高度依赖于pH。典型地，有效pH上限对于苯甲酸盐为约4.5；对于丙酸盐为约5.5；并且对于山梨酸盐为约6.5。在一些实施方案中，当在例如弱酸性产物(pH 5.5-6.0)的pH水平下使用时，山梨酸盐(与苯甲酸盐或丙酸盐相反)对广谱有害微生物更有效。
实施例14：防腐剂和微生物形成
评价防腐剂的几种不同组合以确定其对微生物污染的影响。将从发酵醪获得的2％TVP-R9Q/T43A的制剂与2％山梨糖醇和其他添加剂组合。将制剂在开放状态下混合，并在21℃下储存2天。2天后，将制剂铺板并评价菌落形成单位(CFU)。
基于从先前实施例中收集的信息，在下表中使用山梨酸盐来理解是否可替换BIT。下表中描述的制剂中使用的成分如下：山梨糖醇(Neosorb 70/20B；Roquette；目录号421112980；1347Beaver Channel Parkway Clinton，IA 52732-5933 USA)；苯甲酸钠(AlfaAesar；目录号A15946；2 Radcliff Rd，Tewksbury，MA 01876 USA)；山梨酸钾(Alfa Aesar；目录号A12844)；柠檬酸钠(Fisher Scientific；目录号BP327-500)。
下表提供了不同制剂及其对菌落形成单位(CFU)的影响的总结。
表10.防腐剂和微生物污染。所评价的TVP为TVP-R9Q/T43A。“Na”意指钠。“K”意指钾，并且为0.2％w/w的量。
Figure BDA0003998753650003461
Figure BDA0003998753650003471
如上所示，在21℃下，仅由2％TVP+2％山梨糖醇+0.2％苯甲酸钠+山梨酸钾+0.2％EDTA组成的制剂产生任何CFU；因此，除了这个例外，上述制剂防止微生物生长。
实施例15：稳定性小组部分I
根据实施例10中所示的关于TVP在液体浓缩物和SDP形式中的稳定性的结果，进行工作以鉴定将稳定TVP的制剂。所评价的制剂见下表。所测试的成分包括以下：液体浓缩物(LC)形式的TVP-R9Q/T43A，即细胞分离的发酵醪的浓缩物；H2O(反渗透)；麦芽糖糊精(
Figure BDA0003998753650003472
Grain Processing Corporation，目录号M100；1600Oregon StreetMuscatine，Iowa 52761-1494，USA)；海藻糖；麦芽糖；K2HPO4(磷酸氢二钾，无水；ICL FoodSpecialties；CAS号7758-11-4；622 Emerson Road，Suite 500，St.Louis，MO 63141 USA)；KH2PO4(磷酸一钾；ICL Specialty Fertilizers；CAS号7778-77-0；2755W 5th N St N，Summerville，SC 29483)；和BIT(Lonza；
Figure BDA0003998753650003473
AQ Preservative；9.25％的1，2-苯并异噻唑啉-3-酮水溶液；Lonza Group Ltd.Muenchensteinerstrasse 38，CH-4002Basel，Switzerland)。
喷雾干燥参数如下：入口温度：160℃；出口温度：65-70℃；泵速：35-40rpm；压降：45-50psi；抽吸器设定为100％；并且雾化压力为50psi。
在T0(在室温下进行配制和用喷雾干燥器干燥后立即进行的时间)和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。
Figure BDA0003998753650003491
Figure BDA0003998753650003501
在T0(在配制、通过喷雾干燥器干燥并在室温下进行后立即进行的时间)处和在54℃下温育两周后评价上表中呈现的制剂。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。分析结果如图22所示。
如图22所示，在包含麦芽糖或麦芽糊精的制剂中观察到显著的降解。然而，海藻糖和磷酸盐的组合显示出稳定TVP-R9Q/T43A。在此，单独的麦芽糊精和麦芽糖(制剂编号1、3、15-17)都不提供稳定性；然而，使用海藻糖和磷酸盐显示出改善的稳定性(配方编号11-13)。图22。
实施例16：稳定性小组部分II
进行了另外一组测试以确定以下：(1)来自不同制造商的海藻糖是否影响稳定性；(2)可用设定量的海藻糖稳定的肽的量；(3)KH2PO4是否是稳定化所必需的；和(4)木质素磺酸盐是否会防止物理稳定性问题；和(5)BIT的作用。
在该实施例中，根据下表中提供的描述产生每种制剂；在此，将组分合并，充分混合和/或溶解，然后喷雾干燥。所测试的成分包括以下：液体浓缩物(LC)形式的TVP-R9Q/T43A，即细胞分离的发酵醪的浓缩物；H2O(反渗透)；麦芽糖糊精(
Figure BDA0003998753650003511
GrainProcessing Corporation，目录号M100；1600 Oregon Street Muscatine，Iowa 52761-1494，USA)；海藻糖；麦芽糖；K2HPO4(磷酸氢二钾，无水；ICL Food Specialties；CAS号7758-11-4；622 Emerson Road，Suite 500，St.Louis，MO 63141 USA)；KH2PO4(磷酸一钾；ICLSpecialty Fertilizers；CAS号7778-77-0；2755W 5th N St N，Summerville，SC 29483)；和BIT(Lonza；
Figure BDA0003998753650003512
AQ Preservative；9.25％的1，2-苯并异噻唑啉-3-酮水溶液；Lonza Group Ltd.Muenchensteinerstrasse 38，CH-4002 Basel，Switzerland)；和木质素磺酸盐(Borregaard LignoTech；Vanisperse CB；CAS号8061-51-6；Borregaard AS，P.OBOX 162，NO-1701 Sarpsborg，Norway)。
所测试的海藻糖制造商是Bulk Supplements(B)(目录号TREH100；7511EastgateRd，Henderson，NV 89011USA)和
Figure BDA0003998753650003521
(S)(目录号478；P.O.Box 2803.Fargo，ND58108-2803USA)。
喷雾干燥参数如下：入口温度：160℃；出口温度：65-70℃；泵速：35-40rpm；压降：45-50psi；抽吸器设定为100％；并且雾化压力为50psi。
在T0和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。
Figure BDA0003998753650003531
从不同制造商获得的海藻糖不影响TVP-R9Q/T43A的稳定性(参见例如制剂编号20、21、26、27)。图23。
可被稳定化的肽的量从2％(参见先前实施例中的制剂)增加到约5％(参见制剂编号25-28)。图23。
在此，KH2PO4是否是稳定化所必需的是非定论的。上表中的最后一行显示了具有木质素磺酸盐的唯一制剂(制剂编号28)。由于发生了意想不到的物理稳定性问题，添加了木质素磺酸盐：在54℃下储存期间，制剂编号18-27具有从轻质粉末变为脆性固体附聚物的物理形式。图24。
向制剂编号28中添加木质素磺酸盐以防止这种附聚，从而使制剂保持为干燥可流动的粉末形式。尽管添加木质素磺酸盐确实防止了脆性固体的形成，但它仍然不能防止结块。图25。
最后，如制剂编号8-11所证明的，添加BIT对TVP-R9Q/T43A的稳定性没有影响。
一些样品显示肽明显增加；该结果可能是由发生的意想不到的物理稳定性问题导致的假象。图23。如上所述，在54℃下储存导致物理形式从轻质粉末变为脆性固体附聚物。因此，粉末的附聚使得精确测量变得困难，并且肽(例如，配方编号22)的明显增加可归因于获取代表性样品的问题。
实施例17：稳定性小组部分III
基于从实施例15和16收集的信息，进行附加的喷雾干燥实验：在此，目的是稳定肽，同时还保持物理稳定性(即，干燥可流动的粉末形式)。
使用根据下表的成分制备制剂，并使用如本文所述的HPLC进行评价。将组分合并，充分混合和/或溶解，然后喷雾干燥。所测试的成分包括以下：液体浓缩物(LC)形式的TVP-R9Q/T43A，即细胞分离的发酵醪的浓缩物；H2O(反渗透)；海藻糖；木质素硫酸盐(Borregaard LignoTech；Vanisperse CB；CAS号8061-51-6；Borregaard AS，P.O BOX 162，NO-1701 Sarpsborg，Norway)；麦芽糊精(
Figure BDA0003998753650003551
Grain Processing Corporation，目录号M100；1600 Oregon Street Muscatine，Iowa 52761-1494，USA)；K2HPO4(磷酸氢二钾，无水；ICL Food Specialties；CAS号7758-11-4；622Emerson Road，Suite 500，St.Louis，MO 63141 USA)；KH2PO4(磷酸一钾；ICL Specialty Fertilizers；CAS号7778-77-0；2755W 5th N St N，Summerville，SC 29483)；和BIT(Lonza；
Figure BDA0003998753650003552
AQPreservative；9.25％的1，2-苯并异噻唑啉-3-酮水溶液；Lonza GroupLtd.Muenchensteinerstrasse 38，CH-4002 Basel，Switzerland)。所测试的海藻糖制造商是
Figure BDA0003998753650003553
(S)(目录号478；P.O.Box 2803.Fargo，ND 58108-2803USA)；和NagaseAmerica LLC.(N)(
Figure BDA0003998753650003554
由以α，α-1，1键联键合的两个葡萄糖分子组成的非还原性二糖；546 5th Avenue，Floor 19，New York，NY 10036-5000 USA)。
喷雾干燥参数如下：入口温度：160℃；出口温度：65-70℃；泵速：35-40rpm；压降：45-50psi；抽吸器设定为100％；并且雾化压力为50psi。
在T0和在54℃下温育两周后评价样品。如本文所述经由HPLC分析定量肽浓度。
计算理论肽浓度的等式如下：
Figure BDA0003998753650003555
Figure BDA0003998753650003561
如图26所示，条形图显示了基于上表中描述的组合物设计的理论肽浓度(黑色条)。在T0的肽的实际百分比以灰色条显示。在54℃下温育两周后肽的实际百分比以阴影条显示。图26。
在此，木质素磺酸盐的添加没有防止物理不稳定性。然而，本实施例中的制剂能够稳定肽并且还保持干燥可流动粉末形式的物理稳定性。制剂编号35和36显示出良好的肽稳定性，并产生干燥可流动的粉末形式。图27-图28。
制剂编号31-34显示出良好的肽稳定性，然而，它们仍然导致结块和/或附聚。
实施例18：干燥和颗粒制剂
设计干燥制剂
使用流化床干燥器以中试规模生成四种原型制剂，目的是产生赋予不稳定的TVP活性成分稳定性的颗粒产品。
原型制剂通过在干燥前将不同量的海藻糖添加到含有TVP-R9Q/T43A的液体浓缩物(LC)中来制备。
试验设置在下表中示出。在流化床工艺之前添加除麦芽糊精之外的所有成分。在流化床干燥过程中，将配制的液体喷雾到麦芽糊精的流化床上以产生颗粒。所用的成分与上述实施例中所述的那些相同。
表14.原型制剂。“LC”意指液体浓缩物。“LC DS”意指液体浓缩物溶解的固体。
Figure BDA0003998753650003571
在流化床干燥过程之后的原型的理论最终％w/w呈现于下表中。TVP-R9Q/T43A活性成分的百分比(％AI)被认为是在液体浓缩物中溶解的固体(％LC DS)。
表15.原型制剂的理论最终％w/w。“％AI”是指活性成分(TVP-R9Q/T43A)的百分比。“LC DS”意指液体浓缩物溶解的固体。量以％w/w表示。
Figure BDA0003998753650003581
基于下表中给出的数据，四种原型的理论制剂(平均值)呈现于图29中。
表16.理论制剂数据。“R”意指重复，并且是指用于肽测量的测定的重复(即，非技术重复)。“Avg.”意指平均值。T0意指时间零。T2w意指两周的时间。Std.Dev.意指标准偏差。
Figure BDA0003998753650003582
Figure BDA0003998753650003591
通过在氧/水分清除剂包(Mitsubishi Gas Chemical America，Inc.，产品号AS-100；6553rd Ave#24，New York，NY 10017USA)的存在下，在54℃下温育两周，评价这四种原型的高温稳定性。在t＝0(配制和干燥后)和t＝14天时使用HPLC-UV进行TVP-R9Q/T43A肽的测量。
如图30所示，所有四种原型在54℃下温育两周后是稳定的。
基于上述实验组开发了随后的配制方法。配制方法测量发酵(即，下游方法)中的液体浓缩物、溶解固体(LC DS)，并且添加海藻糖至适当比率以赋予不稳定的TVP-R9Q/T43A肽在干燥后的稳定性。
所评价的测试比率范围为每海藻糖约0.81至约2.44LC DS(0.81-2.44 LC DS：海藻糖)并呈现于下表中。
表17.TVP与海藻糖的比例范围。“LC DS”意指液体浓缩物溶解的固体。基质DS是指从制剂上游的发酵/下游加工步骤中剩余的溶解固体。
Figure BDA0003998753650003601
前述试验也是物理稳定的，因为它们是干燥可流动的颗粒形式。试验编号1、2、3和4的物理形式的结果示于图31-图34中。
实施例19：海藻糖稳定化的圆二色性(CD)测定
圆二色性(CD)是一种吸收光谱法。CD采用了左右圆偏振光的差异吸收。由于这种现象而获得的光谱被称为CD光谱，其中CD信号以毫度(mdeg)表示。
光学活性手性分子将以优先方式吸收一个方向的圆偏振光；并且，可以测量和量化该吸收的差异，即左或右圆偏振光的吸收的差异。紫外(UV)CD可用于确定蛋白质二级结构的方面，例如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等。例如，最广泛使用的CD应用之一是评价蛋白质是否正确折叠，和/或给定突变是否影响该蛋白质的稳定性或构象。参见N.Greenfield.Using circular dichroism spectra to estimate protein secondarystructure，Nat Protoc.2006；1(6)：2876-2890。
为了进一步评价海藻糖对TVP的稳定性及其生物物理特性的影响，使用CD研究了含有最低限度和高纯度组分的组合物。在此，组合物包含10％海藻糖和0.5ppt(0.05％w/v)TVP-R9Q/T43A。除了海藻糖和Ta1b，唯一的其他组分是10mM磷酸钠缓冲液。在Jasco J-1500光谱仪(JASCO Inc.，28600 Mary′s Court，Easton，MD 21601 USA)上记录CD光谱。在0.1cm石英比色杯中，将TVP-R9Q/T43A以0.5mg/mL稀释到10mM磷酸钠(pH 7.0)中。在20℃下以100nm min-1的扫描速率以0.1nm间隔记录光谱。以10℃min-1的变温速率每1℃生成固定波长熔融曲线。将熔融曲线拟合至Boltzmann S形曲线以确定熔点(Tm)。
添加10％海藻糖稳定了TVP-R9Q/T43A的二级结构，如通过在214nm和220nm处加深的CD光谱所指示，其显示肽变得更α螺旋，与其3D结构一致。图35.此外，添加10％海藻糖将TVP-R9Q/T43A的熔点从71.6℃提高至73.6℃，这支持其在海藻糖存在下的增加的稳定性。图36.
实施例20：稳定制剂的总结
下表提供了用于产生TVP的稳定制剂的组分的总结。
表18.示例性制剂。以下描述的％w/w量是基于从实施例部分获得的结果的示例性制剂的总结。
组分 ％w/w
TVP 8.50％
1，2-苯并异噻唑啉-3-酮 0.05％
麦芽糊精(M100) 36.30％
海藻糖 25.30％
<![CDATA[无水磷酸氢二钾(K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)]]> 2.60％
<![CDATA[磷酸二氢钾(KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)]]> 0.40％
发酵固体 26.85％
实施例21：位置扫描和肠道环境测定
将TVP暴露于鳞翅目肠道蛋白酶以确定它们在模拟的鳞翅目肠道环境中的稳定性。
TVP表达载体的生成
对各种TVP的DNA构建体进行密码子优化，并合成为与乳酸克鲁维酵母α交配因子前/原序列(αMF)的融合体，并将其连接到pKlac1(New England 
Figure BDA0003998753650003611
)的NotI和HindIII限制位点。用SacII消化载体以线性化并去除细菌Ori和选择性标记物，然后将其电穿孔到电感受态乳酸克鲁维酵母细胞中。在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择板上选择多基因拷贝转化体。通过在Chromolith C18柱(4.6x25mm)上进行HPLC并在2min内以2mL min-1的流速和10％-30％乙腈的梯度洗脱来评估表达TVP的克隆。
TVP的消化
为了确定TVP在暴露于鳞翅目肠道蛋白酶时的稳定性，将五龄早期谷实夜蛾幼虫解剖以从其他组织和血淋巴中去除完整的消化道。为了获得夜蛾肠道提取物(HGE)，对肠内衬作小切口以便将肠内容物收集在管中。将多个切片汇集并保持在冰上以立即使用，或储存在-80℃以供将来使用。
野生型Ta1b(SEQ ID NO：1)用作模板，并且在位置9的氨基酸取代处突变(即R9；SEQ ID NO：1)以产生在此评价的TVP；这些TVP用氨基酸F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、D、V、M、I、Q、C、E、T和S中的一者取代野生型氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的位置9(即R9)处的精氨酸；此外，同样评价了具有R9Q+T43A突变(相对于野生型Ta1b)的TVP(SEQ ID NO：85)。在此测试的每种TVP及其氨基酸取代示于表19中。
将上述和表19中所示的TVP与夜蛾肠道提取物(HGE)相接触以模拟在鳞翅目肠道环境中的消化。在此，将TVP与6x稀释量的获自夜蛾深孔细胞生长物的HGE一起温育。6x稀释的HGE补充有30mM Tris-HCl，pH 8.8，以维持夜蛾肠道环境的碱性pH。
在0、3和22.5小时的时间点收集消化的TVP样品。为了淬灭消化过程，向样品中添加30mM甘氨酸，pH 2.0，并立即使用反相HPLC分析消化的TVP样品以定量TVP峰面积。如表19所示，当WT Ta1b与6x稀释的HGE一起温育时，它在3至22.5小时之间完全消化，半衰期为1.9小时。
如下表19所示，用氨基酸A、G、N、L、D、V、M、I、Q+T43A、Q、C、E、T或S取代R9(如SEQ IDNO：77-90所示)完全消除了HGE消化。相反，相对于在野生型Ta1b中观察到的稳定性，用氨基酸F、P、Y、K、W或H取代R9(如SEQ ID NO：71-76所示)没有提供稳定性的显著增加。
表19.完全氨基酸扫描消化分析。
Figure BDA0003998753650003631
Figure BDA0003998753650003641
实施例22：糖基化位点的去除
TVP表达载体的生成
对各种TVP的DNA构建体进行密码子优化，并合成为与乳酸克鲁维酵母α交配因子前/原序列(αMF)的融合体，并将其连接到pKlacl(New England Biolabs)的NotI和HindIII限制位点。用SacII消化载体以线性化并去除细菌Ori和选择性标记物，然后将其电穿孔到电感受态乳酸克鲁维酵母细胞中。在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择板上选择多基因拷贝转化体。通过在Chromolith C18柱(4.6x25mm)上进行HPLC并在2min内以2mL min-1的流速和10％-30％乙腈的梯度洗脱来评估表达TVP的克隆。通过在Chromolith C18柱(4.6x100mm)上进行LC-MS并以1mL min-1的流速洗脱来评估TVP的糖基化(+162至MW)，并如上述实施例中所述经由质谱进行分析。
如表20所示，在位置43处被取代的氨基酸中，仅苏氨酸(T)和丝氨酸(S)(SEQ IDNO 108和109)产生糖基化种类，而其他18种不同的氨基酸(SEQ ID NO：91-107和110)不产生任何糖基化种类。
表20.糖基化位点去除的结果。
Figure BDA0003998753650003651
Figure BDA0003998753650003661
Figure BDA0003998753650003671
序列表
<110> 韦斯塔隆公司(Vestaron Corporation)
<120> 用于有害生物防治的蛋白水解稳定的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽
<130> 225312-490536
<150> 63/012,755
<151> 2020-04-20
<160> 150
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 1
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 2
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q
<400> 2
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 3
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9QdG
<400> 3
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 4
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-K18A
<400> 4
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Ala Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 5
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-K18AdG
<400> 5
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Ala Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 6
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R38A
<400> 6
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Ala Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 7
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R38AdG
<400> 7
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Ala Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 8
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8N
<400> 8
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Asn Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 9
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8NdG
<400> 9
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Asn Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 10
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8S
<400> 10
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ser Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 11
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8SdG
<400> 11
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ser Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 12
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9N
<400> 12
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Asn Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 13
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9NdG
<400> 13
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Asn Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 14
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T11P
<400> 14
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Pro Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 15
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T11PdG
<400> 15
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Pro Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 16
<211> 153
<212> DNA
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 16
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 17
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q
<400> 17
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 18
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9QdG
<400> 18
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 19
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-K18A
<400> 19
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta tgcttccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 20
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-K18AdG
<400> 20
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta tgcttccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 21
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R38A
<400> 21
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tgctaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 22
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R38AdG
<400> 22
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tgctaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 23
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8N
<400> 23
gaaccagacg agatatgcag aaacaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 24
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8NdG
<400> 24
gaaccagacg agatatgcag aaacaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 25
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8S
<400> 25
gaaccagacg agatatgcag atcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 26
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-A8SdG
<400> 26
gaaccagacg agatatgcag atcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 27
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9N
<400> 27
gaaccagacg agatatgcag agcaaacatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 28
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9NdG
<400> 28
gaaccagacg agatatgcag agcaaacatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 29
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T11P
<400> 29
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg cctaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 30
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T11PdG
<400> 30
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg cctaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> IGER
<400> 31
Ile Gly Glu Arg
1
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> EEKKN
<400> 32
Glu Glu Lys Lys Asn
1               5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> ETMFKHGL
<400> 33
Glu Thr Met Phe Lys His Gly Leu
1               5
<210> 34
<211> 238
<212> PRT
<213> 维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)
<400> 34
Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1               5                   10                  15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
            20                  25                  30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
        35                  40                  45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
    50                  55                  60
Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg
65                  70                  75                  80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
            100                 105                 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
        115                 120                 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
    130                 135                 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
                165                 170                 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
            180                 185                 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
        195                 200                 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
    210                 215                 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225                 230                 235
<210> 35
<211> 157
<212> PRT
<213> 雪花莲(Galanthus nivalis)
<400> 35
Met Ala Lys Ala Ser Leu Leu Ile Leu Ala Thr Ile Phe Leu Gly Val
1               5                   10                  15
Ile Thr Pro Ser Cys Leu Ser Glu Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr
            20                  25                  30
Leu Pro Thr Gly Gly Phe Leu Ser Ser Gly Ser Phe Val Phe Ile Met
        35                  40                  45
Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asn Val Asp Lys Pro Ile Trp
    50                  55                  60
Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu Ser Ser Asp Cys Ser Leu Ser Met Gln
65                  70                  75                  80
Asn Asp Gly Asn Leu Val Val Phe Thr Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp
                85                  90                  95
Ala Ser Asn Thr Asp Gly Gln Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln
            100                 105                 110
Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Thr Asn Arg Trp Ala Thr Gly
        115                 120                 125
Thr Tyr Thr Gly Ala Val Gly Ile Pro Glu Ser Pro Pro Ser Glu Lys
    130                 135                 140
Tyr Pro Ser Ala Gly Lys Ile Lys Leu Val Thr Ala Lys
145                 150                 155
<210> 36
<211> 224
<212> PRT
<213> 德州雪松(Juniperus ashei)
<400> 36
Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Phe Leu Leu Ala Ala Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Val Val Lys Phe Asp Ile Lys
            20                  25                  30
Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly Leu Pro Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val Asn Leu Ala Ala Gly
    50                  55                  60
Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly Cys Thr Phe Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Lys Gly Ser Cys Gln Thr Gly Asp Cys Gly Gly Gln Leu Ser
                85                  90                  95
Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu Ala Glu Tyr Thr Gln
            100                 105                 110
Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Ala Gln Cys Thr Ala Pro Ala Cys
    130                 135                 140
Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu Leu Lys Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Lys Thr Asp Gln Tyr Cys Cys
                165                 170                 175
Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Lys Ile
            180                 185                 190
Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Lys Asp Asp Thr
        195                 200                 205
Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Ile Val Phe Cys
    210                 215                 220
<210> 37
<211> 24
<212> PRT
<213> 大麦(Hordeum vulgare)
<400> 37
Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly
            20
<210> 38
<211> 27
<212> PRT
<213> 皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)
<400> 38
Glu Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Ser Leu Leu Val Val Leu
1               5                   10                  15
Val Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala
            20                  25
<210> 39
<211> 26
<212> PRT
<213> 皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)
<400> 39
Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Val Val Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala
            20                  25
<210> 40
<211> 78
<212> DNA
<213> 皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)
<400> 40
atgggtaaga tggcttctct gtttgcttct ctgctggttg ttctggtttc tctgtctctg 60
gcttctgaat cttctgct 78
<210> 41
<211> 78
<212> DNA
<213> 皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)
<400> 41
atgggtaaga tggcttctct gtttgctact tttctggttg ttctggtttc tctgtctctg 60
gcttctgaat cttctgct 78
<210> 42
<211> 224
<212> PRT
<213> 德州雪松(Juniperus ashei)
<400> 42
Lys Phe Asp Ile Lys Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val
            20                  25                  30
Asn Leu Ala Ala Gly Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly
        35                  40                  45
Cys Thr Phe Asp Ala Ser Gly Lys Gly Ser Cys Gln Thr Gly Asp Cys
    50                  55                  60
Gly Gly Gln Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Tyr Thr Gln Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val
                85                  90                  95
Asp Gly Phe Asn Ile Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Ala Gln Cys
            100                 105                 110
Thr Ala Pro Ala Cys Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu
        115                 120                 125
Leu Lys Val Asp Gly Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Lys Thr
    130                 135                 140
Asp Gln Tyr Cys Cys Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr
145                 150                 155                 160
Asn Tyr Ser Lys Ile Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Ser Tyr
                165                 170                 175
Ala Lys Asp Asp Thr Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr
            180                 185                 190
Ser Ile Val Phe Cys Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Phe Leu Leu
        195                 200                 205
Ala Ala Thr Leu Ala Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Val Val
    210                 215                 220
<210> 43
<211> 105
<212> PRT
<213> 雪花莲(Galanthus nivalis)
<400> 43
Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly Glu Phe Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val
            20                  25                  30
Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu
        35                  40                  45
Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val
    50                  55                  60
Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile
                85                  90                  95
Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr Gly
            100                 105
<210> 44
<211> 68
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 44
Met Lys Leu Gln Leu Met Ile Cys Leu Val Leu Leu Pro Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
Cys Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe
            20                  25                  30
Thr Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala
        35                  40                  45
Cys Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Lys Gly
65
<210> 45
<211> 68
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 45
Met Lys Leu Gln Leu Met Ile Cys Leu Val Leu Leu Pro Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
Cys Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe
            20                  25                  30
Thr Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala
        35                  40                  45
Cys Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Lys Gly
65
<210> 46
<211> 68
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 46
Met Lys Leu Gln Leu Met Ile Cys Leu Val Leu Leu Pro Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
Cys Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe
            20                  25                  30
Thr Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala
        35                  40                  45
Cys Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Lys Gly
65
<210> 47
<211> 68
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 47
Met Lys Leu Gln Leu Met Ile Cys Leu Val Leu Leu Pro Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
Cys Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe
            20                  25                  30
Thr Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala
        35                  40                  45
Cys Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Lys Gly
65
<210> 48
<211> 68
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 48
Met Lys Leu Gln Leu Met Ile Cys Leu Val Leu Leu Pro Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
Cys Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe
            20                  25                  30
Thr Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala
        35                  40                  45
Cys Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Lys Gly
65
<210> 49
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43A
<400> 49
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 50
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43AdG
<400> 50
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 51
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/T43A
<400> 51
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 52
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/T43A/dG
<400> 52
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 53
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/T43A/dK-G
<400> 53
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln
<210> 54
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43A
<400> 54
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgctg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 55
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43AdG
<400> 55
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgctg cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 56
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/T43A
<400> 56
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgcag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 57
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/T43A/dG
<400> 57
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgctg cttgtcacga ggctcagaaa 150
<210> 58
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/T43A/dK-G
<400> 58
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgctg cttgtcacga ggctcag 147
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 59
Met Lys Leu Gln Leu Met Ile Cys Leu Val Leu Leu Pro Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
Cys
<210> 60
<211> 50
<212> PRT
<213> 流浪汉蜘蛛(Eratigena agrestis)
<400> 60
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys
    50
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> ALKFLV
<400> 61
Ala Leu Lys Phe Leu Val
1               5
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> ALKLFV
<400> 62
Ala Leu Lys Leu Phe Val
1               5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> IFVRLR
<400> 63
Ile Phe Val Arg Leu Arg
1               5
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> LFAAPF
<400> 64
Leu Phe Ala Ala Pro Phe
1               5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> ALKFLVGS
<400> 65
Ala Leu Lys Phe Leu Val Gly Ser
1               5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> ALKLFVGS
<400> 66
Ala Leu Lys Leu Phe Val Gly Ser
1               5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> IFVRLRGS
<400> 67
Ile Phe Val Arg Leu Arg Gly Ser
1               5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> LFAAPFGS
<400> 68
Leu Phe Ala Ala Pro Phe Gly Ser
1               5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> LFVRLRGS
<400> 69
Leu Phe Val Arg Leu Arg Gly Ser
1               5
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> LGERGS
<400> 70
Leu Gly Glu Arg Gly Ser
1               5
<210> 71
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9F
<400> 71
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Phe Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 72
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9P
<400> 72
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Pro Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 73
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Y
<400> 73
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Tyr Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 74
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9K
<400> 74
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Lys Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 75
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9W
<400> 75
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Trp Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 76
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9H
<400> 76
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala His Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 77
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9A
<400> 77
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Ala Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 78
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9G
<400> 78
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gly Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 79
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9N
<400> 79
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Asn Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 80
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9L
<400> 80
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Leu Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 81
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9D
<400> 81
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Asp Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 82
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9V
<400> 82
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Val Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 83
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9M
<400> 83
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Met Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 84
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9I
<400> 84
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Ile Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 85
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/ T43A
<400> 85
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 86
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q
<400> 86
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 87
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9C
<400> 87
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Cys Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 88
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9E
<400> 88
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Glu Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 89
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9T
<400> 89
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Thr Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 90
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9S
<400> 90
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Ser Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 91
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43F
<400> 91
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Phe Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 92
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43P
<400> 92
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Pro Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 93
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43Y
<400> 93
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Tyr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 94
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43K
<400> 94
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Lys Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 95
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43W
<400> 95
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Trp Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 96
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43H
<400> 96
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr His Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 97
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43A
<400> 97
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ala Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 98
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43G
<400> 98
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Gly Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 99
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43N
<400> 99
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Asn Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 100
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43L
<400> 100
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Leu Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 101
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43D
<400> 101
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Asp Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 102
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43V
<400> 102
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Val Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 103
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43M
<400> 103
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Met Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 104
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43I
<400> 104
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ile Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 105
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43Q
<400> 105
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Gln Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 106
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43C
<400> 106
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Cys Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 107
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43E
<400> 107
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Glu Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 108
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43T
<400> 108
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 109
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43S
<400> 109
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Ser Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 110
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43R
<400> 110
Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Arg Ala Cys His Glu Ala
        35                  40                  45
Gln Lys Gly
    50
<210> 111
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9F
<400> 111
gaaccagacg agatatgcag agcattcatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 112
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9P
<400> 112
gaaccagacg agatatgcag agcacccatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 113
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Y
<400> 113
gaaccagacg agatatgcag agcatatatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 114
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9K
<400> 114
gaaccagacg agatatgcag agcaaaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 115
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9W
<400> 115
gaaccagacg agatatgcag agcatggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 116
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9H
<400> 116
gaaccagacg agatatgcag agcacatatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 117
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9A
<400> 117
gaaccagacg agatatgcag agcagcaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 118
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9G
<400> 118
gaaccagacg agatatgcag agcaggaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 119
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9N
<400> 119
gaaccagacg agatatgcag agcaaatatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 120
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9L
<400> 120
gaaccagacg agatatgcag agcactaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 121
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9D
<400> 121
gaaccagacg agatatgcag agcagatatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 122
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9V
<400> 122
gaaccagacg agatatgcag agcagtcatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 123
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9M
<400> 123
gaaccagacg agatatgcag agcaatgatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 124
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9I
<400> 124
gaaccagacg agatatgcag agcaattatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 125
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q/ T43A
<400> 125
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgcag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 126
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9Q
<400> 126
gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 127
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9C
<400> 127
gaaccagacg agatatgcag agcatctatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 128
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9E
<400> 128
gaaccagacg agatatgcag agcagaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 129
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9T
<400> 129
gaaccagacg agatatgcag agcaactatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 130
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-R9S
<400> 130
gaaccagacg agatatgcag agcatctatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 131
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43F
<400> 131
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttactttg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 132
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43P
<400> 132
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttaccctg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 133
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43Y
<400> 133
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttactatg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 134
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43K
<400> 134
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacaaag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 135
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43W
<400> 135
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttactggg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 136
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43H
<400> 136
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttaccatg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 137
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43A
<400> 137
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgctg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 138
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43G
<400> 138
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacggtg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 139
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43N
<400> 139
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacaatg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 140
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43L
<400> 140
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacttag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 141
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43D
<400> 141
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgatg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 142
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43V
<400> 142
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacgtcg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 143
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43M
<400> 143
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacatgg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 144
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43I
<400> 144
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacattg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 145
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43Q
<400> 145
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttaccaag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
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<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43C
<400> 146
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttactctg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 147
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43E
<400> 147
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
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<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43T
<400> 148
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
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gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 149
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43S
<400> 149
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttactcag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153
<210> 150
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> TVP-T43R
<400> 150
gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60
gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120
gtttacagag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153

Claims (148)

1.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的TVP，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代，或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求1所述的TVP，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸，或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求1所述的TVP，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在，或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求1所述的TVP，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在，或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求1-5中任一项所述的TVP，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列，或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求6所述的TVP，其中所述TVP由如SEQ ID NO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
8.如权利要求1所述的TVP，其中所述TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
9.如权利要求1所述的TVP，其中所述TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
10.如权利要求9所述的TVP，其中所述接头是可切割接头。
11.如权利要求10所述的TVP，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴中可切割。
12.如权利要求11所述的TVP，其中所述接头具有如SEQ IDNO:61-70中任一项所示的氨基酸序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的TVP，其中如果Z1为T或S，则所述TVP是糖基化的。
14.一种组合物，所述组合物由TVP和一种或多种赋形剂组成；其中所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；并且其中所述一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代，或其药学上可接受的盐。
16.如权利要求14所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸，或其药学上可接受的盐。
17.如权利要求14所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在，或其药学上可接受的盐。
18.如权利要求14所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在，或其药学上可接受的盐。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述TVP由如SEQ IDNO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
21.如权利要求14所述的组合物，其中所述TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
22.如权利要求14所述的组合物，其中所述TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
23.如权利要求22所述的TVP，其中所述接头是可切割接头。
24.如权利要求23所述的TVP，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴中可切割。
25.如权利要求24所述的TVP，其中所述接头具有如SEQ IDNO:61-70中任一项所示的氨基酸序列。
26.如权利要求14-25中任一项所述的组合物，其中如果Z1为T或S，则所述TVP是糖基化的。
27.如权利要求14-26中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
28.如权利要求27所述的组合物，其中以所述组合物的总重量计，所述TVP的范围为约2％至约16％w/w；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％w/w；BIT的范围为约0.01％至约0.1％w/w；麦芽糊精的范围为约10％至约50％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约1％至约5％w/w；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％w/w；以及发酵固体的范围为约15％至约40％w/w。
29.如权利要求28所述的组合物，其中以所述组合物的总重量计，所述TVP的范围为约7％至约9％w/w；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％w/w；BIT的范围为约0.025％至约0.075％w/w；麦芽糊精的范围为约30％至约40％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约2％至约3％w/w；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
30.如权利要求29所述的组合物，其中以所述组合物的总重量计，所述TVP为约8.5％w/w；并且其中海藻糖为约25％w/w；BIT为约0.05％w/w；麦芽糊精为约36.3％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％w/w；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％w/w；以及发酵固体为约26.85％w/w。
31.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物基本上由以下组成：以所述组合物的总重量计，量为8.5％w/w的TVP；量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
32.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物由以下组成：以所述组合物的总重量计，量为8.5％w/w的TVP；量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
33.一种组合物，所述组合物由TVP和多种赋形剂组成；其中所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其药学上可接受的盐；其中所述组合物由以所述组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中所述多种赋形剂由以下组成：以所述组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代，或其药学上可接受的盐。
35.如权利要求33所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸，或其药学上可接受的盐。
36.如权利要求33所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在，或其药学上可接受的盐。
37.如权利要求33所述的组合物，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在，或其药学上可接受的盐。
38.如权利要求33-37中任一项所述的组合物，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述TVP由如SEQ IDNO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
40.如权利要求33所述的组合物，其中所述TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
41.如权利要求33所述的组合物，其中所述TVP是包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述接头是可切割接头。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴中可切割。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述接头具有如SEQ IDNO:61-70中任一项所示的氨基酸序列。
45.如权利要求33-44中任一项所述的组合物，其中如果Z1为T或S，则所述TVP是糖基化的。
46.一种编码TVP的多核苷酸，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述TVP相对于如SEQID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
47.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
48.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
49.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
50.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
51.如权利要求46-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
52.如权利要求46-51中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列具有如SEQ IDNO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的序列或其互补核苷酸序列。
53.如权利要求46-53中任一项所述的多核苷酸，其中如果Z1为T或S，则所述TVP是糖基化的。
54.一种产生TVP的方法，所述方法包括：
(a)制备包含第一表达盒的载体，所述第一表达盒包含可操作以编码TVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；
(b)将所述载体引入宿主细胞中；以及
(c)使所述宿主细胞在可操作以使所述TVP能够表达并分泌到生长培养基中的条件下在所述生长培养基中生长。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
58.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述TVP由如SEQ ID NO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述载体是包含α-MF信号的质粒。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述α-MF信号可操作以表达α-MF信号肽。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述载体被转化到宿主细胞中。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述酵母细胞选自属于以下属的任何种：酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述酵母细胞选自由以下项组成的组：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母。
70.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP分泌到所述生长培养基中。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述TVP与所述α-MF信号肽可操作地连接。
72.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP的表达提供以下产率：每升酵母培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的TVP。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述TVP的表达提供每升培养基至少100mg/L TVP的产率。
74.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP在所述培养基中的表达导致单个TVP在所述培养基中的表达。
75.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP在所述培养基中的表达导致包含两种或更多种TVP多肽的TVP融合聚合物在所述培养基中的表达。
76.如权利要求54所述的方法，其中所述载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒可操作以编码所述第一表达盒的所述TVP。
77.如权利要求54所述的方法，其中所述载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒可操作以编码所述第一表达盒的所述TVP或不同表达盒的TVP。
78.如权利要求54所述的方法，其中所述第一表达盒可操作以编码如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的TVP。
79.如权利要求54所述的方法，其中所述TVP由如SEQ ID NO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
80.如权利要求54-79中任一项所述的方法，其中如果Z1为T或S，则所述TVP是糖基化的。
81.一种使用如权利要求14所述的组合物防治昆虫的方法，所述方法包括向昆虫的所在地提供如权利要求14所述的组合物。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述昆虫选自由以下项组成的组：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黃斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州槲蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠹蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树蛾)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫(梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖蛾)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草天蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟芽夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
83.一种保护植物免受昆虫侵害的方法，所述方法包括提供表达TVP或编码其的多核苷酸的植物。
84.如权利要求82所述的方法，其中所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
88.如权利要求84所述的方法，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
89.如权利要求84-88中任一项权利要求所述的方法，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
90.如权利要求84-89中任一项所述的方法，其中所述TVP由如SEQ ID NO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
91.如权利要求83所述的方法，其中所述TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
92.如权利要求83所述的方法，其中所述TVP是包含两种或更多种由可切割或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
93.如权利要求83所述的方法，其中所述接头是可切割接头。
94.如权利要求83所述的方法，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴中可切割。
95.如权利要求83所述的方法，其中所述接头具有如SEQ ID NO:61-70中任一项所示的氨基酸序列。
96.如权利要求83所述的方法，其中所述昆虫选自由以下项组成的组：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黃斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州槲蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠹蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树蛾)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫(梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖蛾)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草天蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟芽夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述昆虫选自由以下项组成的组：埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
98.一种对抗、防治或抑制有害生物的方法，所述方法包括将杀有害生物有效量的如权利要求14所述的组合物施用于所述有害生物的所在部位，或施用于易受所述有害生物攻击的植物或动物。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述有害生物选自由以下项组成的组：葡萄蔓天蛾(天蛾幼虫)(欧罗巴天蛾)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶)；粉斑螟(粉斑螟)；白条卷叶蛾(白条卷叶蛾)；夜盜蛾(夜蛾属种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾)；杜鹃毛虫(杜鹃毛虫)；蓑蛾(常绿树蓑蛾)；香蕉灯蛾(香蕉灯蛾)；黃斑蕉弄蝶(尖翅蕉弄蝶)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾)；加州橡木虫(加州槲蛾)；春尺蠖(春尺蠖)；樱桃果虫(樱桃小食心虫)；塘水螟(塘水螟)；柑橘夜蛾(柑橘夜蛾)；苹果蠹蛾(苹果蠹蛾)；越橘果虫(越橘蜂斑螟)；交叉条纹卷心菜蠕虫(卷心菜薄翅野螟)；切根虫(夜蛾属种，小地老虎)；黄杉毒蛾(黄杉毒蛾)；天蛾(天蛾幼虫)(木薯天蛾)；白尺蠖蛾(白尺蠖蛾)；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小蛾)；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(埃塞克斯弄蝶))；美国白蛾(美国白蛾)；榛卷蛾(蔷薇黄卷蛾)；果树黄卷蛾(果树黄卷蛾)；葡萄浆果小卷叶蛾(葡萄浆果小卷叶蛾)；葡萄卷叶蛾(葡萄卷叶蛾)；黑拟蛉蛾(黑拟蛉蛾)(仅地面)；苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)；绿条纹枫树蛾(绿条纹枫树蛾)；流胶病-蛙蛾；Comosae(Hodges)；舞毒蛾(舞毒蛾)；铁杉尺蠖(铁杉尺蠖)；天蛾幼虫(天蛾属种)；菜粉蝶(菜粉蝶)；玉米天蚕蛾(玉米天蚕蛾)；短叶松芽卷叶蛾(短叶松芽卷叶蛾)；苹浅褐卷蛾(苹浅褐卷蛾)；瓜虫(甜瓜绢野螟)；合欢巢蛾(合欢巢蛾)；斜纹卷叶虫(玫瑰色卷蛾)；夹竹桃蛾(黄蜂飞蛾)；杂食卷叶蛾(荷兰石竹小卷蛾)；杂食尺蠖(杂食尺蠖)；桔凤蝶(美洲大芷凤蝶)；桔带卷蛾(桔带卷蛾)；梨小食心虫(梨小食心虫)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；松蝴蝶(美洲松粉蝶)；美洲棉铃虫(美洲棉铃虫)；红带卷叶蛾(红带卷叶蛾)；红疣天社蛾(红疣天社蛾)；瓜皮虫群(各种鳞翅目)；鞍背毛虫(鞍背刺蛾)；鞍斑美洲舟蛾(鞍斑美洲舟蛾)；盐泽灯蛾(盐泽灯蛾)；草皮网螟(草螟属种)；尺蠖(白尺蠖蛾)；秋星尺蠖(秋星尺蠖)；云杉卷叶蛾(云杉卷叶蛾)；天幕毛虫(各种枯叶蛾科)；菠萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶)；烟草天蛾(烟草天蛾)；烟草粉斑蛾(烟草粉斑蛾)；苹果丛生芽卷蛾(苹果芽小卷蛾)；桃蚜蛾(桃枝麦蛾)；豆杂色夜蛾(疆夜蛾)；杂色卷叶蛾(杂色卷叶蛾)；黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)；胡桃毛虫(胡桃毛虫)；结网虫(美国白蛾幼虫)；西部栎柳毒蛾(西部栎柳毒蛾)；南方玉米螟(南方玉米螟)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；柑橘根象甲；草莓根象甲；山核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘庶犀金龟；咖啡果小蠹；一年生早熟禾象甲(一年生早熟禾象甲)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟)；欧洲金龟子(欧洲金龟子)；绿六月花金龟(绿六月花金龟)；日本丽金龟(日本丽金龟)；五月或六月甲虫(鳃金龟属种)；北方独角仙(北方圆头犀金龟)；东方丽金龟(东方丽金龟)；南方独角仙(南方独角仙)；谷象(象甲总科)；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟芽夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述有害生物选自由以下项组成的组：埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾；二化螟；尖音库蚊；致倦库蚊；玉米根萤叶甲；小蔗螟；番茄夜蛾；谷实夜蛾；烟夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫；亚洲玉米螟；欧洲玉米螟；棉红铃虫；印度谷螟；小菜蛾；大豆尺蠖蛾；甜菜夜蛾；草地贪夜蛾；海灰翅夜蛾；粉纹夜蛾；和榆黄萤叶甲。
101.一种载体，所述载体包含可操作以编码TVP的多核苷酸，所述TVP具有与如SEQ IDNO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的序列具有90％相似性的氨基酸序列。
102.如权利要求101所述的载体，其中所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
103.一种酵母菌株，所述酵母菌株包含：包含可操作以编码TV P的多核苷酸的第一表达盒，所述TVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7，其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为A、S或N；X2为R、Q、N、A、G、N、L、D、V、M、I、C、E、T或S；X3为T或P；X4为K或A；X5为R或A；Z1为T、S、A、F、P、Y、K、W、H、A、G、N、L、V、M、I、Q、C、E或R；X6为K或不存在；并且X7为G或不存在；或其互补核苷酸序列。
104.如权利要求103所述的酵母菌株，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代。
105.如权利要求103所述的酵母菌株，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7为甘氨酸。
106.如权利要求103所述的酵母菌株，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X7不存在。
107.如权利要求103所述的酵母菌株，其中所述TVP具有在X1、X2、X3、X4或X5处的一个氨基酸取代；并且其中X6和X7不存在。
108.如权利要求103-105中任一项权利要求所述的酵母菌株，其中所述TVP包含如SEQID NO:2-15、49-53或77-110中任一项所示的氨基序列。
109.如权利要求103所述的酵母菌株，其中所述TVP由如SEQ ID NO:17-30、54-58或117-150中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
110.如权利要求103所述的酵母菌株，其中所述酵母细胞选自属于以下属的任何种：酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属。
111.如权利要求110所述的酵母菌株，其中所述酵母细胞选自由以下项组成的组：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母。
114.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐。
115.如权利要求114所述的TVP，其中如果Z1为T，则所述TVP是糖基化的。
116.如权利要求114所述的TVP，其中X1为Q；并且Z1为A。
117.如权利要求114-116中任一项所述的TVP，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2、49或51中任一项所示的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐。
118.如权利要求116所述的TVP，其中所述TVP由如SEQ IDNO:17、54或56中任一项所示的多核苷酸序列或其互补核苷酸序列编码。
119.一种组合物，所述组合物由TVP和一种或多种赋形剂组成；其中所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；并且其中所述一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、麦芽糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、木质素磺酸盐、石膏、山梨醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA、苯并异噻唑啉酮(BIT)和发酵固体。
120.如权利要求119所述的组合物，其中如果Z1为T，则所述TVP是糖基化的。
121.如权利要求119所述的组合物，其中X1为Q；并且Z1为A。
122.如权利要求119-121中任一项所述的组合物，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2、49或51中任一项所示的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐。
123.如权利要求119所述的组合物，其中所述TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
124.如权利要求119所述的组合物，其中所述TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
125.如权利要求124所述的TVP，其中所述接头是可切割接头。
126.如权利要求125所述的TVP，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴中可切割。
127.如权利要求125所述的TVP，其中所述接头具有如SEQ IDNO:61-70中任一项所示的氨基酸序列。
128.如权利要求119-127中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂选自由以下项组成的组：海藻糖、麦芽糊精、无水磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、BIT和发酵固体。
129.如权利要求128所述的组合物，其中以所述组合物的总重量计，所述TVP的范围为约2％至约16％w/w；并且其中海藻糖的范围为约5％至约40％w/w；BIT的范围为约0.01％至约0.1％w/w；麦芽糊精的范围为约10％至约50％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约1％至约5％w/w；和磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.10％至约1％w/w；以及发酵固体的范围为约15％至约40％w/w。
130.如权利要求129所述的组合物，其中以所述组合物的总重量计，所述TVP的范围为约7％至约9％w/w；并且其中海藻糖的范围为约20％至约30％w/w；BIT的范围为约0.025％至约0.075％w/w；麦芽糊精的范围为约30％至约40％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)的范围为约2％至约3％w/w；磷酸二氢钾(KH2PO4)的范围为约0.2％至约0.6％；以及发酵固体的范围为约20％至约30％。
131.如权利要求130所述的组合物，其中以所述组合物的总重量计，所述TVP为约8.5％w/w；并且其中海藻糖为约25％w/w；BIT为约0.05％w/w；麦芽糊精为约36.3％w/w；无水磷酸氢二钾(K2HPO4)为约2.6％w/w；磷酸二氢钾(KH2PO4)为约0.4％w/w；以及发酵固体为约26.85％w/w。
132.如权利要求119所述的组合物，其中所述组合物基本上由以下组成：以所述组合物的总重量计，量为8.5％w/w的TVP；量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
133.如权利要求119所述的组合物，其中所述组合物由以下组成：以所述组合物的总重量计，量为8.5％w/w的TVP；量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
134.一种组合物，所述组合物由TVP和多种赋形剂组成；其中所述TVP包含与根据以下式(II)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G；其中所述多肽相对于如SEQ ID NO:1所示的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为R或Q；并且Z1为T或A；或其药学上可接受的盐；其中所述组合物由以所述组合物的总重量计量为8.5％w/w的TVP组成；并且其中所述多种赋形剂由以下组成：以所述组合物的总重量计，量为25％w/w的海藻糖；量为0.05％w/w的BIT；量为36.3％w/w的麦芽糊精；量为2.6％w/w的无水磷酸氢二钾(K2HPO4)；量为0.4％w/w的磷酸二氢钾(KH2PO4)；和量为26.85％w/w的发酵固体。
135.如权利要求134所述的组合物，其中如果Z1为T，则所述TVP是糖基化的。
136.如权利要求134所述的组合物，其中X1为Q；并且Z1为A。
137.如权利要求134-136中任一项所述的组合物，其中所述TVP包含如SEQ ID NO:2、49或51中任一项所示的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐。
138.如权利要求134所述的组合物，其中所述TVP还包含两种或更多种TVP的均聚物或杂聚物，其中每种TVP的氨基酸序列相同或不同。
139.如权利要求134所述的组合物，其中所述TVP是包含两种或更多种由可切割接头或不可切割接头分开的TVP的融合蛋白，并且其中每种TVP的氨基酸序列可相同或不同。
140.如权利要求139所述的TVP，其中所述接头是可切割接头。
141.如权利要求140所述的TVP，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴中可切割。
142.如权利要求141所述的TVP，其中所述接头具有如SEQ IDNO:61-70中任一项所示的氨基酸序列。
143.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与SEQ ID NO:2、49或51中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
144.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含SEQ ID NO:2、49或51中任一项所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
145.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP由SEQ ID NO:2、49或51中任一项所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
146.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含与SEQ ID NO51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐。
147.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，或其药学上可接受的盐。
148.一种杀昆虫的U1-漏斗网蛛毒素-Ta1b变体多肽(TVP)，所述TVP由SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列组成，或其药学上可接受的盐。
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