KR20230013034A - 해충 제어를 위한 단백분해 안정형 u1-아가톡신-ta1b 변이체 폴리펩티드 - Google Patents

해충 제어를 위한 단백분해 안정형 u1-아가톡신-ta1b 변이체 폴리펩티드 Download PDF

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알렉산드라 하세
브렉 데이비스
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Abstract

새로운 살충 단백질, 뉴클레오티드, 펩티드 및 이의 식물에서의 발현. 새로운 뉴클레오티드 및 새로운 펩티드를 생산하는 방법, 새로운 공정, 새로운 생산 기술, 새로운 제형 및 새로운 유기체. 본 개시내용은 또한 호보 거미로부터 유래된 U1-아가톡신-Ta1b 독소에 기반하는 비천연 펩티드 변이체인 TVP라고 하는 신규 펩티드에 관한 것이고 이를 기재한다. 본원에서, 본 발명자들은 TVP를 암호화하는 유전자; TVP 유전자 및/또는 펩티드를 포함하는 제형 및 조합; 및 해충의 제어에 유용한 이를 사용하는 방법을 기재한다.

Description

해충 제어를 위한 단백분해 안정형 U1-아가톡신-TA1B 변이체 폴리펩티드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 20일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/012,755의 이익 및 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열
본 출원은 2021년 4월 20일 오후 6시 39분에 생성되어 본원과 함께 전자적으로 제출된 "225312-490536_ST25.txt"(68KB)라는 제목의 서열 목록 전체를 참조로 포함한다.
기술분야
새로운 살충 단백질, 뉴클레오티드, 펩티드, 이의 식물에서의 발현, 펩티드를 생산하는 방법, 새로운 공정, 생산 기술, 새로운 펩티드, 새로운 제형물 및 곤충 제어를 위한 관련 펩티드에서 기대되는 것보다 더 큰 수율을 생산하는 새로운 및 알려진 유기체의 조합이 기재되고 청구된다.
수많은 곤충이 질병의 매개체이다. 아노펠레스(Anopheles) 속의 모기는 지카(Zika) 바이러스, 치쿤구니아(Chikungunya) 바이러스 및 트리파노소마(Trypanosoma) 속의 원생동물에 의해 유발되는 질병인 말라리아의 주요 매개체이다. 이집트 숲모기(Aedes aegypti)는 황열병 및 뎅기열을 유발하는 바이러스의 주요 매개체이다. 다양한 유형의 뇌염의 원인 제제인 다른 바이러스도 애데스 ssp . 모기에 의해 운반된다. 사상충증을 일으키는 기생 회충인 부체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti) 및 브루기아 말라이(Brugia malayi)는 일반적으로 컬렉스(Culex), 만소니아(Mansonia) 및 아노펠레스 속의 모기에 의해 확산된다.
말파리 및 사슴파리는 야토병(파스퇴렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis)) 및 탄저병(바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis))의 세균성 병원체뿐만 아니라 열대 아프리카에서 로아증을 일으키는 기생 회충(로아 로아(Loa loa))을 옮길 수 있다.
히펠라테스(Hippelates) 속의 눈각다귀는 요스를 유발하는 스피로헤타 병원체(트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue))를 운반할 수 있으며, 급성 접촉결막염(급성 유행결막염)도 확산시킬 수 있다. 글로씨나(Glossina) 속의 체체파리는 아프리카 수면병을 유발하는 원생동물 병원체(트리파노소마 잠비엔세(Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔세(T. rhodesiense))를 옮긴다. 플레보토무스(Phlebotomus) 속의 모래파리는 남아메리카에서 캐리온병(오로요열)을 유발하는 박테리아(바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis))의 매개체이다. 이들은 아시아와 북아프리카의 일부에서 모래파리열(파파타시열)을 유발하는 바이러스성 제제뿐만 아니라 리슈마니아증을 유발하는 원생동물 병원체(리슈마니아(Leishmania) 종)를 확산시킨다.
본 개시내용은 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP), TVP를 포함하는 조성물, 선택적으로 다른 단백질과 함께, 하나 이상의 TVP를 포함하는 살충 단백질, 및 하나 이상의 곤충 종의 박멸, 사멸, 제어, 억제, 손상, 혼동, 멸균화, 또는 이의 조합을 위한 이의 사용 방법을 제공한다. 본원에 기재된 TVP는 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는다. 본 개시내용의 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 G이거나 부재한다). 본원에 기재된 TVP는 24시간째에 집파리에 대해 200 pmol/g 미만의 집단의 50% 녹다운 농도(KD50)를 갖고 4일째에 총채벌레의 100% 사망률을 유발하는 것으로 나타났다.
본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)을 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
또한, 본 개시내용은 TVP, 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 조성물을 기재하고; TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한, 본 개시내용은 TVP 및 복수의 부형제로 구성되는 조성물을 기재하며; TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
또한, 본 개시내용은 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열를 기재하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
또한, 본 개시내용은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 적어도 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시내용은 곤충의 서식지에 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충을 제어하기 위해 상기 기재된 조성물을 사용하는 방법을 기재한다.
또한, 본 개시내용은 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 기재한다.
또한, 본 개시내용은 살해충 유효량의 상기 기재된 조성물을 해충의 서식지, 또는 해충의 공격을 받기 쉬운 식물 또는 동물에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 기재한다.
또한, 본 개시내용은 서열 번호 2-15, 49-53 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 서열과 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 기재한다.
또한, 본 개시내용은 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 효모 균주를 기재하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 세트로서 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
또한, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다).
또한, 본 개시내용은 TVP 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 조성물을 기재하며; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한, 본 개시내용은 TVP 및 복수의 부형제로 구성되는 조성물을 기재하며; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되며; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성된다.
추가로, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.
또한, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)를 기재하고, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.
도 1은 하기 서열: 박테리아 Ori/AmpR; 3' Lac4 프로모터; α-MF 신호 서열(도면에서 "a-MF"로 표시됨); U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(도면에서 "Ta1b"로 표시됨); Lac4 종결인자; amdS 마커("Amd 마커로 표시됨) 및 5' Lac4 프로모터를 포함하는 9210 염기쌍 원형 벡터를 포함하는 Ta1b 통합 벡터 맵을 도시한다.
도 2는 야생형 Ta1b 및 위치 R9Q 및 R9N에서 아미노산이 치환된 TVP의 활성을 집파리에 흉부내 주사하고, 50% 녹다운에 필요한 TVP의 용량(KD50)을 주사 후 24시간째에 결정한 집파리 주사 검정 결과를 도시한다.
도 3은 미처리 대조군(UTC), 야생형 U1-아가톡신-Ta1b(Ta1bWT), 및 위치 R9Q에서 아미노산 치환을 갖는 TVP의 사망률 백분율(사망률%)을 평가하는 총채벌레 생존 검정 결과를 도시한다.
도 4는 위치 R9Q에서 아미노산 치환을 갖는 TVP(TVP-R9Q)의 HPLC 크로마토그램을 도시하며, 주요 TVP 피크(검정색 화살표로 표시됨)의 왼쪽에 "쇼울더"로서 추정 글리코실화 종을 나타낸다.
도 5는 TVP-R9Q의 질량 스펙트럼을 나타내는 ESI-MS 결과를 도시한다. 삽입도는 다중 하전된 종의 데콘볼루션을 도시하고, 5732 및 5894 Da의 질량을 계산한다. 완전 산화된 TVP-R9Q의 예상 분자량은 5731.3이다.
도 6은 TVP-R9Q의 HPLC 크로마토그램 결과를 도시한다. 글리코실화는 주요 피크의 왼쪽에서 더 작은 "쇼울더"로 나타난다.
도 7은 TVP-R9QΔG의 HPLC 크로마토그램 결과를 도시한다. 글리코실화는 주요 피크의 왼쪽에서 더 작은 "쇼울더"로 나타난다. 부분 단백분해는 오른쪽 쇼울더에 의해 나타난다.
도 8은 TVP-R9Q/T43A/ΔG의 HPLC 크로마토그램 결과를 도시한다. 단백분해 이벤트는 두 개의 쇼울더의 존재에 의해 실증된다: 주요 피크의 왼쪽에서 더 작은 "쇼울더"는 부분 단백분해 이벤트를 도시한다.
도 9는 TVP-R9Q/T43A의 HPLC 크로마토그램 결과를 도시한다. 여기에는 단일 종의 TVP가 존재한다.
도 10은 TVP-R9Q/T43A/ΔK-G의 HPLC 크로마토그램 결과를 도시한다. 여기에는 단일 종의 TVP가 존재한다.
도 11은 TVP-R9Q/T43A/ΔG의 질량 스펙트럼을 나타내는 ESI-MS 결과를 도시한다.
도 12는 TVP-R9Q/T43A의 질량 스펙트럼을 나타내는 ESI-MS 결과를 도시한다.
도 13은 TVP-R9Q/T43A/ΔK-G의 질량 스펙트럼을 나타내는 ESI-MS 결과를 도시한다.
도 14는 TVP-R9Q/T43A/ΔK-G의 질량 스펙트럼을 나타내는 ESI-MS 결과를 도시한다.
도 15는 글리코실화 부위 및/또는 C-말단 아미노산의 제거 후 TVP를 사용한 집파리 주사 검정 결과를 도시한다.
도 16은 경시적으로 상이한 온도에서 평가된, 액체 농축물(LC) 제형물의 안정성 검정 결과를 나타낸다. LC 제형물은 2% TVP-R9Q/T43A; 0.03% 벤즈이소티아졸리논(BIT); 2% 소르비톨을 포함하고; LC 제형물의 나머지 양은 발효 맥주, 즉 세포 분리 발효 맥주의 농축물이었고, HPLC를 사용해서 분석하여 상이한 온도에서 경시적인 TVP-R9Q/T43A의 안정성을 결정했다. 평가된 온도는 4℃, 21℃, 37℃, 45℃ 및 54℃였다. 평가된 시간은 0, 16, 31, 42, 98 및 114일이었다.
도 17은 분무 건조 분말(SDP) 형태의 TVP-R9Q/T43A의 안정성 검정 결과를 나타낸다. 여기서 SDP 제형물은 건조 발효 맥주로부터 생성했다. SDP에서 TVP-R9Q/T43A 안정성을 HPLC를 사용하여 평가하여 21℃, 37℃ 및 45℃에서 산소/수분 포획제 패킷을 포함하고 및 포함하지 않고 TVP-R9Q/T43A의 양을 mg/mL로 정량했다. 검은색 사각형으로 둘러싸인 결과는 산소/수분 포획제 패킷을 사용할 때 얻은 결과를 나타낸다.
도 18은 예비 안정성 제형물을 평가하기 위해 수행된 분해 검정 결과를 나타낸다. 제형물을 54℃, 37℃ 및 21℃에서 2주 동안 시험했다. 제형물 번호의 각 그룹(즉, 7; 18; 21; 2-1; 2-2 및 2-3)은 제형물 번호 다음에 대시 "/"에 이어 시험된 온도, 즉 54℃, 37℃ 및 21℃로 표시된다.
도 19는 이의 TVP와의 적합성을 결정하기 위한 벤즈이소티아졸리논(BIT)을 포함하는 제형물에 대한 안정성 검정 결과를 나타낸다. 여기서, 제형물은 TVP-R9Q/T43A를 발현하는 세포로부터 얻은 세포 단리 및 농축 발효 맥주였으며, 샘플은 T0(제형화 및 분무 건조기로의 건조 직후 시간, 실온에서 수행됨)에 및 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다. 각 제형물은 4℃, 21℃, 37℃ 및 45℃에서 시험했다.
도 20은 이의 TVP와의 상용성을 결정하기 위한 벤즈이소티아졸리논(BIT)을 포함하는 제형물에 대한 안정성 검정 결과를 나타낸다. 여기서, TVP-R9Q/T43A를 포함하는 분무 건조 분말(SDP) 제형물, 샘플은 T0(제형화 및 분무 건조기로의 건조 직후 시간, 실온에서 수행됨) 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다. 각 제형물은 4℃, 21℃, 37℃ 및 45℃에서 시험했다.
도 21은 pH 안정성 검정 결과를 도시한다. 여기서, pH 안정성 스크리닝을 수행하여 TVP-R9Q/T43A의 안정성에 대한 pH의 효과를 결정했다; 천분율(ppt)의 TVP-R9Q/T43A를 다양한 pH 값에서 인큐베이션했다. TVP-R9Q/T43A를 45℃에서 7일 동안 인큐베이션하고 HPLC로 분석하여 잔여 펩티드%를 결정했다. 여기에 나타낸 바와 같이, 최적 pH는 6.5 내지 7.5인 것으로 결정되었다.
도 22는 제형물 번호 1-17을 포함하는, 안정성 패널 파트 I의 결과를 나타낸다. 시험된 성분은 하기: 액체 농축물(LC) 형태의 TVP-R9Q/T43A, 즉, 세포 분리 발효 맥주의 농축물; H2O(역삼투); 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; K2HPO4; KH2PO4; 및 BIT(1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액)를 포함한다. 샘플을 T0(제형화 및 분무 건조기로의 건조 직후 시간, 실온에서 수행됨)에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 HPLC 분석을 통해 정량했다.
도 23은 제형물 번호 18-28을 포함하는 안정성 패널 파트 II의 결과를 나타낸다. 시험된 성분은 하기: 액체 농축물(LC) 형태의 TVP-R9Q/T43A, 즉, 세포 분리 발효 맥주의 농축물; H2O(역삼투); 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; K2HPO4; KH2PO4; BIT(1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액); 및 리그노설포네이트를 포함한다. 샘플을 T0에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다.
도 24는 2주 후 54℃에서 보관 동안 형성된 취성 고체 응집을 실증하는 사진을 나타낸다.
도 25는 리그노설포네이트의 첨가 후 생성된 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다. 여기에 나타난 바와 같이, 리그노설포네이트의 첨가는 취성 고체의 형성을 방지했지만, 그럼에도 불구하고 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 덩어리 형성을 방지하지 못했다.
도 26은 제형물 번호 18-28을 포함하는 안정성 패널 파트 III의 결과를 나타낸다. 시험된 성분은 하기: 액체 농축물(LC) 형태의 TVP-R9Q/T43A, 즉, 세포 분리 발효 맥주의 농축물; H2O(역삼투); 트레할로스; 리그노설페이트; 말토덱스트린; K2HPO4; KH2PO4; 및 BIT(1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액)를 포함한다. 여기서 막대 그래프는 위의 표에 기재된 조성물 설계에 기반한 이론적 펩티드 농도를 나타낸다(검정색 막대). T0에서 펩티드의 실제 %는 회색 막대에 나타낸다. 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후 펩티드의 실제 %는 빗금친 막대에 나타낸다.
도 27은 제형물 번호 35의 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다("Form 7"로 표시된 백 위에 놓인 트레이에서). 여기에 나타낸 바와 같이, 제형물 번호 35는 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후 건조 유동성 분말 형태를 유지할 수 있었다.
도 28은 제형물 번호 36의 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다("Form 8"로 표시된 백 위에 놓인 트레이에서). 여기에 나타낸 바와 같이, 제형물 번호 36은 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후 건조 유동성 분말 형태를 유지할 수 있었다.
도 29는 4개의 건조 과립 원형 제형물의 이론적 제형물(평균값)의 요약을 도시한다.
도 30은 4개의 프로토타입 시험, 시험 번호 1-4를 시험하는 안정성 검정 결과를 도시한다. 4개의 프로토타입은 산소/수분 포획제 패킷의 존재 하에 2주 동안 54℃에서 인큐베이션을 통해 고온 안정성에 대해 평가했다. TVP-R9Q/T43A 펩티드의 측정은 T0(제형화 및 건조 후) 및 T2W(2주 후 시간)에 HPLC-UV를 사용하여 수행했다.
도 31은 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후, 시험 1에서 생성된 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다. 여기서, 물리적 형태는 건조 유동성 과립 형태이다.
도 32는 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후, 시험 2에서 생성된 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다. 여기서, 물리적 형태는 건조 유동성 과립 형태이다.
도 33은 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후, 시험 3에서 생성된 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다. 여기서 물리적 형태는 건조 유동성 과립 형태이다.
도 34는 2주 동안 54℃에서 인큐베이션 후, 시험 번호 1에서 생성된 물리적 형태를 실증하는 사진을 나타낸다. 여기서, 물리적 형태는 건조 유동성 과립 형태이다.
도 35는 원형 이색성(CD) 검정 결과를 나타낸다. 10% 트레할로스의 첨가는 펩티드가 3D 구조와 일치하는 보다 알파 나선이 됨을 나타내는, 214 nm 및 220 nm에서 심화된 CD 스펙트럼에 의해 표시된 바와 같이 TVP-R9Q/T43A의 3차 구조를 안정화한다.
도 36은 용융 특성을 평가하는 원형 이색성(CD) 검정 결과를 나타낸다. 여기서 10% 트레할로스의 첨가는 TVP-R9Q/T43A의 용융점을 71.6℃에서 73.6℃로 증가시켜 트레할로스 존재 하에 증가된 안정성을 뒷받침한다.
정의
"5'-단부" 및 "3'-단부"는 방향성, 즉 뉴클레오티드 중합체(예를 들어, DNA)의 단부-대-단부 배향을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 5'-단부는 다섯 번째 탄소를 갖는 폴리뉴클레오티드의 단부이다.
"5'- 및 3'-상동성 아암" 또는 "5' 및 3' 아암" 또는 "왼쪽 및 오른쪽 아암"은 숙주 유기체의 염색체 유전자좌의 성공적인 유전적 변형을 달성하기 위해 숙주 유기체에서 표적 게놈 서열 및/또는 관심 내인성 유전자와 상동적으로 재조합되는 벡터 및/또는 표적화 벡터 내의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
"AND1 프로모터"는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe 접착 결함 단백질 1 유전자로부터 유래된 프로모터 서열로 이루어진 DNA 절편을 지칭한다.
"영향을 미친다"는 어떤 것이 또 다른 것에 어떻게 영향을 미치는지, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 약물 또는 화학물질이 곤충, 예를 들어 해충에 어떻게 영향을 미치는지를 지칭한다.
"제제"는 하나 이상의 화학 물질, 분자, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 독소, 독성 물질, 독, 살충제, 살해충제, 유기 화합물, 무기 화합물, 원핵 유기체 또는 진핵 유기체(및 상기 원핵생물 또는 진핵생물 유기체로부터 생산된 제제)를 지칭한다.
"농업적으로 허용 가능한 담체"는 살해충제 제형물 기술에서 일반적으로 사용되는 모든 보조제, 불활성 구성성분, 분산제, 계면활성제, 점착제, 결합제 등을 포함한다; 이들은 살해충제 제형물 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
"농업적으로 허용 가능한 염"은 본원에서 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"과 동의어로 사용된다.
"아그로감염"은 아그로박테리아 투메파시엔스(Agrobacteria tumefaciens) 또는 아그로박테리아 리조게네스(Agrobacteria rhizogenes)를 사용하여 DNA를 식물 세포에 도입하는 식물 형질전환 방법을 의미한다.
"정렬"은 서로에 대한 관계를 결정하기 위해 둘 이상의 서열(예를 들어 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열)을 비교하는 방법을 지칭한다. 정렬은 전형적으로 다양한 알고리즘을 적용하는 컴퓨터 프로그램에 의해 수행되지만 수동으로 정렬을 수행하는 것도 가능하다. 정렬 프로그램은 전형적으로 잠재적인 최적 정렬 점수에 도달하기 위해 다양한 전략을 사용하여, 서열의 잠재적인 정렬을 반복하고 치환 표를 사용하여 정렬에 점수를 매긴다. 일반적으로 사용되는 정렬 알고리즘은 CLUSTALW(Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J., CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994 참고); CLUSTALV(Larkin M. A., et al., CLUSTALW2, ClustalW and ClustalX version 2, Bioinformatics 23(21): 2947-2948, 2007 참고); Mafft; Kalign; ProbCons; 및 T-Coffee(Notredame et al., T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, Journal of Molecular Biology 302: 205-217, 2000 참고)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 알고리즘 중 하나 이상을 구현하는 예시적인 프로그램은 DNAStar(DNAStar, Inc. 3801 Regent St. Madison, Wis. 53705)의 MegAlign, MUSCLE, T-Coffee, CLUSTALX, CLUSTALV, JalView, Phylip, 및 Accelrys(Accelrys, Inc., 10188 Telesis Ct, Suite 100, San Diego, Calif. 92121)의 Discovery Studio를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 정렬은 2개의 서열 간의 유사성을 최대화하기 위해 비교되는 서열 중 하나 또는 둘 모두에 "상 이동" 및/또는 "갭"을 도입할 것이고, 점수화는 정렬된 서열의 관련성을 정량적으로 표현하는 과정을 지칭한다.
"알파-MF 신호" 또는 "αMF 분비 신호"는 신생 재조합 폴리펩티드를 분비 경로로 유도하는 단백질을 의미한다.
"거미류"는 절지동물의 한 강을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 거미류는 거미, 전갈, 진드기, 응애, 장님거미 또는 낙타거미를 의미할 수 있다.
"BAAS"는 보리 알파-아밀라제 신호 펩티드를 의미하며, ERSP의 한 예이다. BAAS의 한 예는 서열 번호 37(NCBI 수탁 번호 AAA32925.1)의 아미노산 서열을 갖는 BAAS이다.
"바이오매스"는 임의의 측정된 식물 산물을 지칭한다.
"이원성 벡터" 또는 "이원성 발현 벡터"는 대장균 균주 및 아그로박테리움 균주 모두에서 자체 복제할 수 있는 발현 벡터를 의미한다. 또한, 벡터는 아그로박테리움에 의해 복사되어 식물 세포로 전달될 병독성 유전자에 의해 인식되는 왼쪽 및 오른쪽 경계 서열로 묶인 DNA 영역(종종 t-DNA로도 지칭함)을 포함한다.
"bp" 또는 "염기쌍"은 서로 결합된 2개의 화학적 염기를 포함하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, DNA 분자는 두 개의 권선 가닥으로 구성되며, 각 가닥은 교대로 데옥시리보스 및 포스페이트기로 제조되는 골격을 갖는다. 각 데옥시리보스에는 4개의 염기, 즉 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 티민(T) 중 하나가 부착되며, 아데닌은 티민과 염기쌍을 형성하고 시토신은 구아닌과 염기쌍을 형성한다.
"C-말단"은 폴리펩티드의 말단 단부에 위치하는 유리 카복실기(즉, -COOH)를 지칭한다.
"cDNA" 또는 "복사 DNA" 또는 "상보적 DNA"는 RNA 분자와 상보적인 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, cDNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, cDNA는 역전사효소에 의해 촉매되는 반응에서 단일 가닥 RNA 주형으로부터 합성된 이중 가닥 DNA일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, "cDNA"는 천연 성숙 mRNA 종에서 발견되는 서열 요소의 배열을 공유하는 모든 핵산을 지칭하며, 서열 요소는 엑손 및 3' 및 5' 비-코딩 영역이다. 일반적으로 mRNA 종은 핵 RNA 스플라이싱에 의해 개재 인트론이 제거된 인접 엑손을 가져서, 단백질을 암호화하는 연속적인 개방 판독 프레임을 생성한다. 일부 실시양태에서, "cDNA"는 mRNA 주형과 상보적이고 이로부터 유래된 DNA를 지칭한다.
"CEW"는 왕담배나방을 지칭한다.
"절단가능 링커"는 링커를 참고한다.
"클로닝"은 한 원천의 DNA 절편(예를 들어 일반적으로 관심 유전자, 예를 들어, tvp)을 삽입하고 이를 다른 원천(예를 들어 일반적으로 벡터, 예를 들어 플라스미드)으로부터의 DNA 절편과 재조합하고 일반적으로 재조합된 DNA를 박테리아 또는 효모 숙주로 형질전환함으로써 재조합된 DNA 또는 "재조합 DNA"가 복제하도록 유도하는 공정 및/또는 방법을 지칭한다.
"코딩 서열" 또는 "CDS"는 적절한 조절 서열의 제어 하에 그리고 필요한 전사 및/또는 번역 분자 인자의 존재 하에 위치할 때 전사(예를 들어 DNA의 경우) 또는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역(예를 들어 mRNA의 경우)될 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 지칭한다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 번역 시작 코돈 및 3'(카복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 비번역 영역이 5' 및/또는 3' 단부에서 측면에 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 산물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 핵 편재 신호와 같은 편재 신호 또는 다른 코딩 서열에 융합될 수도 융합되지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 벡터 또는 발현 작제물로 클로닝될 수 있거나, 게놈으로 통합될 수 있거나, DNA 단편으로 존재할 수 있다.
"코돈 최적화"는 하나 이상의 내인성, 천연 및/또는 야생형 코돈이 궁극적으로 여전히 동일한 아미노산을 코딩하지만 해당 숙주에서 선호되는 코돈으로 대체되는 유전자의 생산을 지칭한다.
"상보적"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 2개의 폴리뉴클레오티드의 상호작용 표면과의 토폴로지 상용성 또는 매칭을 지칭한다. 따라서, 2개의 서열은 이들이 안정한 역평행, 이중 가닥 핵산 구조를 형성하기 위해 서로 혼성화할 수 있는 경우 서로 "상보적"이다. 제1 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 제2 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 결합 파트너의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하거나, 또는 제1 폴리뉴클레오티드가 엄격한 혼성화 조건 하에 제2 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 경우, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드와 상보적이다. 따라서, 서열 5'-TATAC-3'인 폴리뉴클레오티드는 서열이 5'-GTATA-3'인 폴리뉴클레오티드와 상보적이다.
"조건화 배지"는 세포에 의해 사용되었고 세포 유래 물질이 풍부하지만 세포를 포함하지 않는 세포 배양 배지를 의미한다.
"카피수"는 언제든지 숙주 세포에 존재하는 벡터, 발현 카세트, 증폭 단위, 유전자 또는 실제로 임의의 정의된 뉴클레오티드 서열의 동일한 카피의 수를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유전자 또는 또 다른 정의된 염색체 뉴클레오티드 서열은 염색체 상의 1개, 2개 또는 그 초과 카피로 존재할 수 있다. 자가 복제 벡터는 숙주 세포당 하나 또는 수백 개의 카피로 존재할 수 있다.
"배양물" 또는 "세포 배양물"은 인공 시험관내 환경에서의 세포 유지를 지칭한다.
"배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 내에서 유기체의 번식을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "배양"은 액체 또는 고체 배지에서 적합한 조건 하에 세포 집단을 성장시키는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양은 관심 이종성 폴리펩티드 및/또는 기타 원하는 최종 산물의(전형적으로 용기 또는 반응기에서) 발효적 재조합 생산을 지칭한다.
"시스틴"은 산화된 시스테인-이량체를 지칭한다. 시스틴은 두 개의 시스테인 분자의 산화를 통해 얻은 황 포함 아미노산이며, 디설피드 결합으로 연결되어 있다.
"정의 배지"란 알려진 화학적 구성성분으로 이루어져 있으나 조단백질 추출물 또는 효모 추출물, 펩톤과 같은 부산물은 포함하지 않는 배지를 의미한다.
"디설피드 결합"은 이의 측쇄에 있는 2개의 티올기의 커플링에 의해 유도된 2개의 시스테인 아미노산 사이의 공유 결합을 의미한다.
"축퇴" 또는 "코돈 축퇴"는 하나의 아미노산이 상이한 뉴클레오티드 코돈에 의해 암호화될 수 있는 현상을 지칭한다. 따라서, 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 핵산 서열은 축퇴로 인해 변할 수 있다. 유전 코드의 축퇴 결과, 많은 핵산 서열이 특정 활성을 갖는 주어진 폴리펩티드를 암호화할 수 있다; 이러한 기능적으로 동등한 변이체가 본원에서 고려된다.
"DNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 배열될 수 있는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드(즉, 아데닌[A], 구아닌[G], 티민[T] 또는 시토신[C])의 중합체를 포함하는 데옥시리보핵산을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
"dNTP"는 DNA 및 RNA를 이루는 뉴클레오시드 트리포스페이트를 지칭한다.
"이중 발현 카세트"는 동일한 벡터에 포함된 2개의 TVP 발현 카세트를 지칭한다.
"이중 트랜스유전자 펩티드 발현 벡터" 또는 "이중 트랜스유전자 발현 벡터"는 TVP 발현 카세트의 2개 카피를 포함하는 효모 발현 벡터를 의미한다.
"내인성"은 유기체에서 자연 발생 및/또는 존재하는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 공정, 예를 들어 특정 유전자 조작 전에 숙주 세포에 이미 존재하는 분자 또는 활성을 지칭한다.
"인핸서 요소"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 지칭하며, 이는 인핸서 요소의 부재 하에 프로모터로 생성되는 전사 활성에 비해 프로모터에 대해 증가된 전사 활성을 발휘할 수 있다.
"ER" 또는 "소포체"는 일부 번역 후 변형 공정이 발생하는 모든 진핵생물에 공통적인 세포내 소기관이다.
"ERSP" 또는 "소포체 신호 펩티드"는 TVP를 암호화하는 mRNA 분자의 단백질 번역 동안 인식되고 단백질 번역을 리보솜/mRNA 복합체를 세포질의 ER로 이동시키는, 숙주 세포 신호-인식 입자에 의해 결합되는 아미노산의 N-말단 서열이다. 결과는 단백질 번역이 계속되는 ER에 도킹하고 생성 단백질이 ER에 주입될 때까지 이것이 일시 중지된다.
"ersp"는 펩티드, ERSP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"ER 수송"은 번역 후 변형, 분류 및 수송을 위한 세포에서 발현된 단백질의 ER로의 수송을 의미한다.
"부형제"는 본 발명의 활성 성분(즉, TVP 또는 TVP-살충 단백질)과 함께(예를 들어, 동시에), 또는 이에 후속하여 제형화되는 임의의 약리학적으로 비활성인 천연 또는 합성, 구성성분 또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 임의의 첨가제, 보조제, 결합제, 증량제, 담체, 코팅, 희석제, 붕해제, 충전제, 활택제, 윤활제, 보존제, 비히클, 또는 이의 조합일 수 있으며, 이와 함께 본 발명의 TVP 또는 TVP-살충 단백질이 투여될 수 있거나 본 발명의 조성물을 제조하는 데 유용하다. 부형제는 비독성이고 조성물의 다른 구성성분과 상호작용하지 않는 당분야에 알려진 임의의 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 조성물을 증량할 목적으로 조성물을 제조할 때 TVP 또는 TVP-살충 단백질과 함께 제형화될 수 있다(따라서 종종 증량제, 충전제 또는 희석제로 지칭됨). 다른 실시양태에서, 부형제는 흡수 및/또는 용해도를 촉진하는 것과 같이 최종 투여형에서 활성 성분에 대한 향상을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 안정성을 제공하거나 오염(예를 들어, 미생물 오염)을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 부형제는 물리적 특성을 조성물(예를 들어, 건조 과립, 또는 건조 유동성 분말의 물리적 형태인 조성물)에 부여하기 위해 사용될 수 있다. 부형제에 대한 언급은 하나 및 하나 초과의 부형제를 모두 포함한다. 적합한 약학 부형제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin)에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
"발현 카세트"는 (1) 관심 DNA 서열, 예를 들어 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드; 및 하기: (2) 프로모터, 종결인자, 및/또는 인핸서 요소; (3) 폴리아데닐화 신호를 안정화하는 적절한 mRNA; (4) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (5) 인트론; 및/또는 (6) 전사 후 조절 요소 중 하나 이상을 지칭한다. (1) 및 (2)-(6) 중 적어도 하나의 조합을 "발현 카세트"라고 한다. 일부 실시양태에서, 벡터로 클로닝된 다수의 발현 카세트가 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트가 있을 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 각각 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2개의 발현 카세트(즉, 이중 발현 카세트)가 있다. 다른 실시양태에서, TVP를 암호화하도록 작동 가능한 3개의 발현 카세트(즉, 삼중 발현 카세트)가 있다. 일부 실시양태에서, 이중 발현 카세트는 제2 발현 카세트를 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터로 서브클로닝함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 삼중 발현 카세트는 제3 발현 카세트를 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 벡터로 서브클로닝함으로써 생성될 수 있다. 발현 카세트에 관한 방법 및 클로닝 기술은 당분야에 잘 알려져 있고 본원에 기재되어 있다. TVP 발현 카세트도 참고한다.
"발현 ORF"는 단백질 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드를 의미하며 ORF 내의 뉴클레오티드로 정의된다.
"FECT"는 코팅 단백질 유전자 및 삼중 유전자 블록을 제거한 폭스테일 모자이크 바이러스를 사용하는 일시적 식물 발현 시스템을 의미한다.
"발효 맥주"는 소모된 발효 배지, 즉, 형질전환된 숙주 세포(예를 들어, 본 발명의 TVP를 발현하도록 작동 가능한 효모 세포)가 접종되고 이에 의해 소비된, 유기체 제거 후의 발효 배지 상청액을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발효 맥주는 형질전환된 숙주 세포의 발효 후에 회수되는 용액을 지칭한다. 용어 "발효"는 발효 산물(예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 펩티드)을 생산하기 위해 제어된 조건(예를 들어 온도, 산소, pH, 영양소 등) 하에서 미생물에 의한 유기 물질(예를 들어 탄소 기질) 영양 물질의 효소적 및 혐기성 또는 호기성 분해를 광범위하게 지칭한다. 발효는 전형적으로 혐기성 조건 하에 발생하는 공정을 설명하지만, 본원에서 사용되는 용어 "발효"는 산소의 존재 하에 발생하는 공정도 발생할 수 있기 때문에, 이 용어는 엄격한 혐기성 조건으로만 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
"발효 고체(들)"은 효모 기반 발효 공정 동안 발효 맥주에서 잔여하는 고체(용해된 것들 포함)를 지칭하며, 본질적으로 염, 복합 단백질원, 비타민 및 약 200 kDa 내지 약 1 kDA의 분자량 컷오프를 갖는 추가적인 효모 부산물로 구성된다.
"GFP"는 해파리 애쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)의 녹색 형광 단백질을 의미한다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 간의 상동성%는 두 서열이 공유하는 매칭되는 또는 상동성 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 용어 "상동성"은 2개의 폴리펩티드 분자 사이, 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이의 상동성은 두 서열이 공유하는 매칭되는 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 위치에서 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이면 두 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다.
핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "상동성"은 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전한 상동성이 있을 수 있고 이에 따라 동일할 수 있다. "서열 동일성"은 둘 이상의 핵산 사이의 관련성 척도를 지칭하며, 전체 비교 길이에 대한 백분율로 제공된다. 동일성 계산은 각각의 더 큰 서열에서 동일하고 동일한 상대 위치에 있는 뉴클레오티드 잔기를 고려한다.
"상동 재조합"은 DNA 절편이 동일한 영역(상동성) 또는 거의 그러한 영역을 갖는 또 다른 절편으로 치환되는 이벤트를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "상동 재조합"은 뉴클레오티드 서열이 2개의 유사하거나 동일한 DNA 분자 사이에서 교환되는 유전적 재조합 유형을 지칭한다. 간략하게, 상동 재조합은 이중 가닥 절단으로 알려진 DNA의 두 가닥 모두에서 발생하는 유해한 절단을 정확하게 복구하기 위해 세포에서 가장 널리 사용된다. 상동 재조합은 상이한 유기체 및 세포 유형에 따라 크게 다르지만, 대부분의 형태에는 동일한 기본 단계가 관여된다: 이중 가닥 절단이 발생한 후, 절단의 5' 단부 주위의 DNA 섹션이 절제라고 불리는 공정에서 절단된다. 이어지는 가닥 침입 단계에서, 절단된 DNA 분자의 돌출된 3' 단부가 절단되지 않은 유사하거나 동일한 DNA 분자를 "침입"한다. 가닥 침입 후, 추가 이벤트 순서는 두 가지 주요 경로, 즉 이중 가닥 절단 복구 경로 또는 합성 의존적 가닥 어닐링 경로 중 하나를 따를 수 있다. 상동 재조합은 바이러스뿐만 아니라 생명의 세 영역 모두에서 보존되어, 거의 보편적인 생물학적 메커니즘임을 제시한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상동 재조합은 부위 특이적 통합(SSI) 서열을 사용하여 발생할 수 있으며, 이에 의해 뉴클레오티드 조성이 실질적으로 유사한 핵산 서열 사이에 가닥 교환 교차 이벤트가 존재한다. 이러한 교차 이벤트는 본 발명의 표적화 작제물에 포함된 서열(즉, SSI 서열) 및 내인성 게놈 핵산 서열(예를 들어, 펩티드 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드) 사이에서 일어날 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서, 표적화 작제물에 포함된 핵산 서열이 내인성 게놈 서열에 존재하는 특정 서열을 대체하는 대체 이벤트를 초래할 수 있을 하나 초과의 부위-특이적 상동 재조합 이벤트가 발생할 수 있다.
"동일성"은 상기 서열을 비교함으로써 결정되는, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계를 지칭한다. 용어 "동일성"은 또한 경우에 따라 그러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 문헌(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994:, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988))에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업자에게 알려진 수많은 방법 중 어느 하나에 의해 용이하게 계산될 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 또한, 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 출처로부터 공개적으로 이용 가능하며(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
"생체내"는 자연 환경(예를 들어 동물 또는 세포) 및 자연 환경에서 발생하는 공정 또는 반응을 지칭한다.
"비활성"은 무언가가 사용 상태가 아닌 상태, 예를 들어 휴면 상태 및/또는 작동하지 않는 상태를 지칭한다. 예를 들어, 유전자의 맥락에서 사용될 때 또는 유전자를 언급할 때, 용어 비활성은 상기 유전자가 더 이상 유전자 산물을 활발히 합성하고 있지 않거나, 상기 유전자 산물이 단백질로 번역되고 있지 않거나, 그렇지 않으면 유전자가 그 정상적인 기능을 수행하고 있지 않다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 비활성은 유전자의 RNA 전사 실패, RNA 가공(예를 들어, 프리-mRNA 가공, RNA 스플라이싱, 또는 다른 전사-후 변형)의 실패; 비코딩 RNA 성숙에 대한 간섭; RNA 외수송에 대한(예를 들어 핵에서 세포질로의) 간섭; 번역에 대한 간섭; 단백질 폴딩; 전좌; 단백질 수송; 및/또는 임의의 분자 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 전사 인자, 조절제, 억제제, 또는 임의의 전술한 공정에 참여하는 기타 인자에 대한 억제 및/또는 간섭을 지칭할 수 있다.
"작동 불가능"은 기능이 작동하지 않거나 오작동하거나 더 이상 작동할 수 없는 상태를 지칭한다. 예를 들어, 유전자의 맥락에서 사용될 때 또는 유전자를 언급할 때, 용어 작동 불가능은 상기 유전자가 더 이상 영구적으로 또는 일시적으로 정상적으로 작동할 수 없음을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 "작동 불가능"은 유전자가 더 이상 유전자 산물을 합성할 수 없고, 상기 유전자 산물이 단백질로 번역될 수 없거나 그렇지 않으면 유전자가 그 정상적인 기능을 수행할 수 없음을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 작동 불가능은 유전자의 RNA 전사 실패, RNA 가공(예를 들어, 프리-mRNA 가공; RNA 스플라이싱; 또는 다른 전사-후 변형)의 실패; 비-코딩 RNA 성숙에 대한 간섭; RNA 외수송에 대한(예를 들어 핵에서 세포질로의) 간섭; 번역에 대한 간섭; 단백질 폴딩; 전좌; 단백질 수송; 및/또는 임의의 분자 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 전사 인자, 조절제, 억제제, 또는 임의의 전술한 공정에 참여하는 기타 인자에 대한 억제 및/또는 간섭을 지칭할 수 있다.
"곤충"은 "곤충" 강의 모든 유기체를 포함한다. 용어 "성체 전" 곤충은 예를 들어 알, 유충 및 약충을 포함하는 성충 단계 전 유기체의 모든 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "곤충"은 진드기를 포함하는 임의의 절지동물 및 선충, 및 모든 작물, 채소 및 나무를 감염시키는 것으로 알려진 곤충을 지칭하고 임업, 원예 및 농업 분야에서 해충으로 간주되는 곤충을 포함한다. 본원에 개시된 방법으로 보호될 수 있는 특정 작물의 예는 대두, 옥수수, 목화, 알팔파 및 채소 작물이다. 특정 작물 및 곤충의 목록은 본원에 포함되어 있다.
"살충 활성"은 곤충이 화합물, 약제 또는 펩티드에 노출되었을 때 또는 그 후에 곤충이 죽어서 움직임이 멈추거나 느려지고; 섭식이 멈추거나 느려지고; 성장이 멈추거나 느려지고; 혼동되고(예를 들어 탐색, 음식 찾기, 수면 행동 및/또는 교배와 관련하여); 용화가 실패하고; 번식을 방해하고; 및/또는 곤충이 자손을 생산하는 것을 막고/막거나 곤충이 번식력이 있는 자손을 생산하는 것을 막는 것을 의미한다.
"곤충 장 환경" 또는 "장 환경"은 곤충 또는 곤충 유충의 앞, 중간 또는 뒷장에서 발견되는 특정 pH 및 프로티나제 조건을 의미한다.
"곤충 혈액림프 환경"은 곤충 또는 곤충 유충에서 발견되는 특정 pH 및 프로티나제 조건을 의미한다.
"통합 발현 벡터" 또는 "통합 벡터"는 효모 세포 게놈의 특정 유전자좌에 자체 삽입될 수 있고 안정적으로 효모 게놈의 일부가 되는 효모 발현 벡터를 의미한다.
"개재 링커"는 단백질의 상이한 부분을 분리하는 단백질의 짧은 펩티드 서열, 또는 상류 및 하류 DNA 서열을 분리하기 위해 ORF의 판독 프레임에 배치되는 짧은 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질이 번역 동안 독립적인 2차 및 3차 구조 형성을 달성하도록 하는 개재 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개재 링커는 식물 세포 환경, 곤충 및/또는 나비목 장 환경, 및 곤충 혈액림프 및 나비목 혈액림프 환경에서 절단에 내성이거나 민감할 수 있다.
"단리된"은 그 자연 환경에서 사물 및/또는 구성성분의 분리를 지칭한다. 예를 들어 주어진 속 또는 종에서 단리된 독소는 독소가 그 자연 환경에서 분리된다는 것을 의미한다.
"kb"는 킬로염기, 즉 1000개 염기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "kb"는 핵산 분자의 길이를 의미한다. 예를 들어, 1 kb는 1000개 뉴클레오티드 길이인 핵산 분자를 지칭한다. 1 kb 길이의 이중 가닥 DNA의 길이는 2,000개의 뉴클레오티드(즉, 각 가닥에 1,000개)를 포함한다. 대안적으로 1 kb 길이의 단일 가닥 RNA의 길이는 1,000개의 뉴클레오티드를 포함한다.
"kDa"은1,000달톤에 상응하는 단위인 킬로달톤을 지칭한다; "달톤"은 분자량(MW)의 단위이다.
"녹인시키다" 또는 "녹인" 또는 "녹인들" 또는 "녹인시키기"는 내인성 유전자의 외인성 또는 이종성 유전자, 또는 이의 일부로의 대체를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 "녹인"은 상동 재조합에 의해 표적 유전자좌에 원하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 도입하여 원하는 단백질의 발현을 유발하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "녹인" 돌연변이는 유전자 서열을 변형하여 기능 상실 또는 기능 획득 돌연변이를 생성할 수 있다. 용어 "녹인"은 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편이 게놈으로 도입되는 절차(예를 들어 "이들이 녹인을 수행함" 또는 "이들이 이종성 유전자를 녹인시킴"), 또는 생성 세포 및/또는 유기체(예를 들어 "세포가 "녹인"임 또는 "동물이 "녹인"임)를 지칭할 수 있다.
"녹아웃시키다" 또는 "녹아웃하다" 또는 "녹아웃" 또는 "녹아웃들" 또는 "녹아웃시키기"는 세포에서 내인성 DNA 서열에 의해 암호화되는 단백질의 발현 유전자 산물(예를 들어 mRNA)의 부분적 또는 완전한 억제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "녹아웃"은 전체 유전자, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 일부의 표적화된 결실에 의해 달성될 수 있다. 결과적으로, 결실은 유전자를 불활성화, 부분적으로 불활성화, 작동 불능화, 부분적으로 작동 불능화하거나, 그렇지 않으면 전체 유기체의 임의의 세포 및/또는 그것이 정상적으로 발현되는 세포에서 유전자 또는 그 산물의 발현을 감소시킬 수 있다. 용어 "녹아웃"은 내인성 유전자를 완전히 또는 부분적으로 비활성화 또는 작동 불능화하는 절차(예를 들어 "이들이 녹아웃을 수행함" 또는 "이들이 내인성 유전자를 녹아웃시킴") 또는 생성 세포 및/또는 유기체(예를 들어 "세포가 "녹아웃"임 또는 "동물이 "녹아웃"임)를 지칭할 수 있다.
"녹다운 용량 50" 또는 "KD50"은 집단, 예를 들어 무스카 도메스티카(Musca domestica)(일반 집파리) 및/또는 이집트 숲모기(모기) 집단의 50%에서 마비 또는 움직임 중단을 유발하는 데 필요한 중앙값 용량을 지칭한다.
"l" 또는 "링커"는 개재 링커 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 지칭한다.
적절한 맥락에서 "L"은 번역 안정화 단백질(STA)을 추가 폴리펩티드, 예를 들어 TVP 및/또는 다중 TVP와 연결하는 개재 링커 펩티드를 지칭한다. 아미노산을 언급할 때 "L"은 류신을 의미할 수도 있다.
"LAC4 프로모터" 또는 "Lac4 프로모터"는 클루이베로마이세스 락티스 β-갈락토시다제 유전자로부터 유래된 프로모터 서열로 이루어진 DNA 절편을 지칭한다. LAC4 프로모터는 효모로 형질전환된 외인성 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용되는 강력한 유도 가능 리포터이다.
"LAC4 종결인자" 또는 "Lac4 종결인자"는 클루이베로마이세스 락티스 β-갈락토시다제 유전자로부터 유래된 전사 종결인자 서열로 이루어진 DNA 절편을 지칭한다.
"LD20"은 집단의 20%를 사멸시키는 데 필요한 용량을 지칭한다.
"LD50"은 집단의 50%를 사멸시키는 데 필요한 용량을 의미하는 치사 용량 50을 지칭한다.
"나비목 장 환경"은 나비목 곤충 또는 유충의 앞, 중간 또는 뒷장에서 발견되는 특정 pH 및 프로티나제 조건을 의미한다.
"나비목 혈액림프 환경"은 나비목 곤충 또는 유충에서 발견되는 특정 pH 및 프로티나제 조건을 의미한다.
"링커" 또는 "펩티드 링커" 또는 "L" 또는 "개재 링커"는 2개의 펩티드를 함께 연결하도록 작동 가능한 짧은 펩티드 서열을 지칭한다. 링커는 또한 상류 및 하류 DNA 서열을 분리하기 위해 ORF의 판독 프레임에 배치되는 짧은 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 곤충 프로테아제에 의해 절단 가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 단백질이 번역 동안 이의 독립적인 2차 및 3차 구조 형성을 달성하도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 식물 세포 환경, 곤충 및/또는나비목 장 환경, 및/또는 곤충 혈액림프 및 나비목 혈액림프 환경에서 절단에 내성이거나 민감할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 프로테아제에 의해 절단될 수 있고, 예를 들어 일부 실시양태에서, 링커는 식물 프로테아제(예를 들어, 파파인, 브로멜라인, 피신, 액티니딘, 진기바인, 및/또는 카도신), 곤충 프로테아제, 진균 프로테아제, 척추동물 프로테아제, 무척추동물 프로테아제, 박테리아 프로테아제, 포유동물 프로테아제, 파충류 프로테아제, 또는 조류 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 이원성 또는 삼원성 영역을 포함하고, 각각의 영역은 적어도 2가지 유형의 프로테아제에 의해 절단 가능하다: 하나는 곤충 및/또는 선충 프로테아제이고 다른 하나는 인간 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (적어도) 세 가지 역할: 곤충 장 환경에서 절단하는 것, 식물 세포에서 절단하는 것, 또는 의도적으로 절단하지 않도록 설계되는 것 중 하나를 가질 수 있다.
"배지"(복수형 "배지들")는 세포 배양물에서 세포를 배양하기 위한 영양 용액을 지칭한다.
"MOA"는 작용 메커니즘을 지칭한다.
"분자량(MW)"은 분자의 질량 또는 중량을 지칭하며, 전형적으로 "달톤(Da)" 또는 킬로달톤(kDa)으로 측정된다. 일부 실시양태에서, MW는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 분석 초원심분리 또는 광 산란을 사용하여 계산할 수 있다. 일부 실시양태에서, SDS-PAGE 방법은 하기와 같다: 관심 샘플은 분자량 표준 세트를 사용하여 겔 상에서 분리한다. 샘플을 걸고, 이어서 원하는 염료로 겔을 처리한 다음 약 2-14시간 동안 탈색한다. 다음 단계는 표준 및 관심 단백질의 상대 이동 거리(Rf)를 결정하는 것이다. 이동 거리는 다음 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
Figure pct00001
공식 III
다음으로, MW의 로그가 표준 밴드에 대해 얻은 값에 기반하여 결정될 수 있다; 예를 들어, 일부 실시양태에서, SDS-변성 폴리펩티드의 분자량 및 그의 상대 이동 거리(Rf)의 로그값이 그래프로 도시된다. 그래프를 그린 후, 유도된 값을 내삽하면 알려지지 않은 단백질 밴드의 분자량이 제공된다.
"모티프"는 일부 생물학적 중요성을 갖는 것에 연루되고/거나 일부 효과를 발휘하거나 일부 생물학적 공정에 관여되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다.
"다중 클로닝 부위" 또는 "MCS"는 관심 DNA 서열이 삽입될 수 있는 다수의 제한 부위를 포함하는 벡터에서 발견되는 DNA 절편을 의미한다.
"돌연변이체"는 상기 유기체 및/또는 서열이 돌연변이체가 비교되는 자연 발생 또는 야생형 유기체, 야생형 서열 및/또는 참조 서열과 상이하도록 유발하는 변경 또는 변형을(예를 들어, 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에) 갖는, 유기체, DNA 서열, 아미노산 서열, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변경 또는 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 치환 또는 변형(예를 들어, 결실 또는 부가)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형은 보존적일 수 있고; 여기서, "돌연변이체"에서의 이러한 보존적 아미노산 치환 및/또는 변형은 돌연변이체의 활성을 그 비돌연변이체 형태와 관련하여 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "돌연변이체"는 서열 번호로 표시된 바와 같은, 개시되고/되거나 청구되는 서열을 갖는 펩티드와 비교될 때 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 보유한다.
"N-말단"은 폴리펩티드의 시작 또는 개시부에 위치하는 유리 아민기(즉, -NH2)를 지칭한다.
"NCBI"는 국립 생명공학 정보 센터를 지칭한다.
"nm"는 나노미터를 지칭한다.
"표준화된 펩티드 수율"은 펩티드 수율이 측정되는 지점에서 해당 세포 밀도로 나눈 조건화 배지에서의 펩티드 수율을 의미한다. 펩티드 수율은 생산된 펩티드의 질량을 부피 단위로, 예를 들어 리터당 mg 또는 mg/L로 또는 HPLC 크로마토그래피에서 생산된 펩티드의 UV 흡광도 피크 면적으로, 예를 들어 mAu.sec으로 나타낼 수 있다. 세포 밀도는 파장 600 nm에서 배양물의 가시광선 흡광도(OD600)로 나타낼 수 있다.
"OD"는 광학 밀도를 지칭한다. 전형적으로 OD는 분광광도계를 사용하여 측정된다. 세포 집단의 경시적인 성장을 측정할 때, OD600이 UV 분광법보다 선호된다; 이것은 600 nm 파장에서 세포가 너무 많은 자외선 하에서만큼 손상되지 않기 때문이다.
"OD660nm" 또는 "OD660nm"는 660나노미터(nm)에서의 광학 밀도를 지칭한다.
"한 글자 코드"는 단백질의 1차 구조에서 다양한 아미노산을 구별하기 위해 한 글자 코드로 나열된 펩티드 서열을 의미한다: 알라닌=A, 아르기닌=R, 아스파라긴=N, 아스파르트산=D, 아스파라긴 또는 아스파르트산=B, 시스테인=C, 글루탐산=E, 글루타민=Q, 글루타민 또는 글루탐산=Z, 글리신=G, 히스티딘=H, 이소류신=I, 류신=L, 라이신=K, 메티오닌=M, 페닐알라닌 =F, 프롤린=P, 세린=S, 트레오닌=T, 트립토판=W, 티로신=Y, 및 발린=V.
"작동 가능한"은 사용될 능력, 무언가를 하는 능력 및/또는 일부 기능 또는 결과를 달성하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "작동 가능한"은 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, DNA 서열, RNA 서열, 또는 다른 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단백질을 암호화하도록 작동 가능할 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 생성하는 능력을 부여하는 정보를 포함한다는 것을 의미한다(예를 들어, mRNA 전사에 의하며, 이는 다시 단백질로 번역됨).
"작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 구성성분이 이의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 작동 가능하게 연결된 것은 2개 이상의 DNA, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 작동 가능하게 연결된 것은 하나의 전사 활성화가 다른 하나에 작용할 수 있도록 2개의 인접한 DNA 서열이 함께 배치됨을 의미할 수 있다. 다른 실시양태에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 펩티드 및/또는 폴리펩티드 분자를 지칭할 수 있고, 예를 들어 작동 가능하게 연결된 것은 2개 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드 분자가 단일 폴리펩티드 사슬을 산출하는 방식으로 또는 한 펩티드가 다른 펩티드에 일부 영향을 미치는 방식으로 연결됨을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 가능하게 연결된 것은 하나의 전사 활성화가 다른 하나에 작용할 수 있도록 2개의 인접한 DNA 서열이 함께 배치됨을 지칭할 수 있다. 다른 실시양태에서, 작동 가능하게 연결된 것은 펩티드 및/또는 폴리펩티드 분자를 지칭할 수 있으며, 2개 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드 분자는 단일 폴리펩티드 사슬을 생성하는 방식으로 연결되거나 하나의 펩티드가 다른 하나에 일부 영향을 미치도록 연결된다.
"ORF" 또는 "개방 판독 프레임"은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 암호화하는, 번역 시작 신호(예를 들어, 각각 AUG 또는 ATG) 및 알려진 종결 코돈 중 어느 하나 이상 사이의, 일정 길이의 RNA 또는 DNA 서열을 지칭한다. 다시 말해, ORF는 리보솜이 정지 코돈을 만나지 않았으므로 번역을 계속할(즉, 신생 단백질에 아미노산을 부가할) 수 있는 한, RNA 코드의 리보솜 번역 관점에서 나타난 바와 같은 참조 프레임을 기재한다. 따라서, "개방 판독 프레임" 또는 "ORF"는 코딩 서열의 번역 시작 및 종결 코돈 사이의 암호화되는 아미노산 서열을 지칭한다. 여기서, 용어 "시작 코돈" 및 "종결 코돈"은 단백질 합성(mRNA 번역)의 시작 및 사슬 종결을 각각 특정하는 코딩 서열에서 인접한 3개의 뉴클레오티드(즉, 코돈) 단위를 지칭한다.
일부 실시양태에서, ORF는 시작 코돈(일반적으로 DNA의 경우 ATG, RNA의 경우 AUG)으로 시작하고 정지 코돈(일반적으로 UAA, UAG 또는 UGA)에서 끝나는 코돈의 연속 스트레치이다. 다른 실시양태에서, ORF는 번역 시작 신호(예를 들어, AUG 또는 ATG)와 알려진 종결 코돈 중 어느 하나 이상 사이의 일정 길이의 RNA 또는 DNA 서열일 수 있으며, 상기 길이의 RNA 또는 DNA 서열은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 일부 다른 실시양태에서, ORF는 ATG 시작 코돈으로 시작하고 TGA, TAA 또는 TAG 정지 코돈으로 끝나는 단백질을 암호화하는 DNA 서열일 수 있다. ORF는 또한 DNA가 암호화하는 번역된 단백질을 의미할 수 있다. 일반적으로, 당업자는 "개방 판독 프레임"의 가장 넓은 정의가 단순히 정지 코돈을 포함하지 않는 일련의 코돈을 고려한다는 사실에 기반하여 용어 "개방 판독 프레임" 및 "ORF"를 용어 "코딩 서열"과 구별한다. 따라서 ORF는 인트론을 포함할 수 있지만, 코딩 서열은 리보솜 번역 기구에 의해 아미노산으로 실제 번역되는 코돈으로 구분될 수 있는 뉴클레오티드(예를 들어, 연쇄 엑손)를 지칭함으로써 구별되며(즉, 코딩 서열은 인트론을 포함하지 않음); 그러나, 본원에 사용된 용어 "코딩 서열"; "CDS"; "개방 판독 프레임"; 및 "ORF"는 상호교환적으로 사용된다.
"제거 재조합된" 또는 "제거 재조합"은 생체내 상동 재조합 동안 2개의 부위-특이적 재조합 부위(예를 들어, 표적 벡터의 상동성 아암과 상동성인 표적 유전자의 5'- 및 3'-뉴클레오티드 서열)가 측면 배치되는 유전자 및/또는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 내인성 유전자)의 제거를 지칭한다. "녹아웃"을 참고한다.
"해충"은 곤충, 진균, 박테리아, 선충, 응애, 진드기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"살해충 유효량"은 적어도 하나의 해충을 사멸시킬 수 있거나 해충 성장, 섭식 또는 정상적인 생리적 발생을 주지 가능하게 감소시킬 수 있는 살해충제의 양을 지칭한다. 이 양은 예를 들어 제어될 특정 표적 해충, 처리할 특정 환경, 위치, 식물, 작물 또는 농업 현장, 환경 조건, 살해충 유효 폴리펩티드 조성물의 적용 방법, 비율, 농도, 안정성, 및 양과 같은 요인에 따라 변할 것이다. 제형물은 또한 기후 조건, 환경 고려사항, 및/또는 적용 빈도 및/또는 해충 만연 중증도와 관련하여 변할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 농업적으로 허용 가능한 염과 동의어이며, 본원에 사용된 바와 같이 이의 산 또는 염기 염을 만들어서 변형되는 화합물을 지칭한다.
"식물"은 전체 식물, 식물 조직, 식물 기관(예를 들어 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체, 배 및 이의 자손을 의미한다. 식물 세포는 분화되거나 미분화될 수 있다(예를 들어 캘러스, 현탁 배양 세포, 원형질체, 잎 세포, 뿌리 세포, 체관부 세포 및 꽃가루).
"식물 트랜스제닉 단백질"은 이를 암호화하는 DNA 또는 RNA가 하나 이상의 식물 세포로 전달된 후 식물에서 발현되는 이종성 종으로부터의 단백질을 의미한다.
"플라스미드"는 관심 유전자(예를 들어 tvp )에 대한 운반체로 작용하고 유기체로 형질전환되거나 형질감염될 때, 숙주 유기체와 독립적으로 플라스미드에 포함된 DNA 서열을 복제 및 발현할 수 있는 DNA 절편을 지칭한다. 플라스미드는 벡터의 한 유형이며 "클로닝 벡터"(즉, DNA 단편을 클로닝하고/하거나 일부 선택 표시인자를 통해 플라스미드를 운반하는 숙주 집단을 선택하기 위해 사용되는 단순 플라스미드) 또는 "발현 플라스미드"(즉, 다량의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용되는 플라스미드)일 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드(예를 들어 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체)의 중합체 형태; 예를 들어, 2개 이상의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 이중 및 단일 가닥 DNA뿐만 아니라 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다; 이는 또한 폴리뉴클레오티드의 변형 및 비변형 형태를 포함한다(예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 대한 및 폴리뉴클레오티드의 변형은 메틸화, 인산화 및/또는 캡핑을 포함할 수 있음). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 탐침, 프라이머, EST, 또는 SAGE 태그); 게놈 DNA; 게놈 DNA 단편; 엑손; 인트론; 메신저 RNA(mRNA); 전달 RNA; 리보솜 RNA; 리보자임; cDNA; 재조합 폴리뉴클레오티드; 분지형 폴리뉴클레오티드; 플라스미드; 벡터; 임의의 서열의 단리된 DNA; 임의의 서열의 단리된 RNA; 핵산 탐침; 임의의 상기 프라이머 또는 증폭된 카피일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 유전자의 개방 판독 프레임을 암호화하도록 작동 가능한 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 cDNA를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 구조는 또한 폴리뉴클레오티드의 방향성을 표시하는, 5'- 또는 3'-단부 또는 말단에 의해 참조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥에서 인접한 뉴클레오티드는 전형적으로 이의 3' 및 5' 탄소 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된다. 그러나 메틸렌, 포스포라미데이트 연결 등을 포함하는 연결과 같은 다른 뉴클레오티드간 연결도 사용될 수 있다. 이는 각각의 5' 및 3' 탄소가 5' 및 3' 단부 또는 말단으로 불릴 수 있는, 폴리뉴클레오티드의 양쪽 단부에서 노출될 수 있음을 의미한다. 5' 및 3' 단부는 또한 이들 단부에 부착된 화학기 때문에, 각각 포스포릴(PO4) 및 하이드록실(OH) 단부로 불릴 수 있다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자를 모두 지칭한다. 달리 특정되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드를 제조하거나 사용하는 임의의 실시양태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 2개의 상보적 단일 가닥 형태 각각을 모두 포괄한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(비-천연 염기를 갖는 뉴클레오티드, 아자- 또는 데아자-퓨린과 같은 변형된 천연 염기를 갖는 뉴클레오티드 등을 포함함). 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 또한 표지화 구성성분과의 접합에 의한 것과 같이, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 추가로, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 비뉴클레오티드 구성성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 단부는 그 단부가 다른 폴리뉴클레오티드와 특정 방식으로 상호작용(예를 들어, 공유 결합을 형성)하는 것을 방지하기 위해 보호되거나 달리 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 4개의 뉴클레오티드 염기: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 및 티민(T)의 특정 서열로 이루어질 수 있다. 우라실(U)은 또한 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 RNA일 때, 티민의 천연 대체물로 존재할 수 있다. 우라실은 DNA에도 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "서열"은 천연 및 비-천연 염기를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 또는 임의의 핵산 분자의 알파벳 표시를 지칭한다.
용어 "RNA 분자" 또는 리보핵산 분자는 피리미딘 염기 중 하나로서 데옥시리보스 당보다는 리보스 당 및 전형적으로 티민보다는 우라실을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 RNA 분자는 일반적으로 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수도 있다. RNA 샘플의 RNA 분자의 맥락에서, RNA 분자는 세포 핵, 미토콘드리아 또는 엽록체의 DNA에서 전사된 단일 가닥 분자를 포함할 수 있으며, 이는 전사되는 DNA 가닥과 상보적인 뉴클레오티드 염기의 선형 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종성 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조절 요소는 하나 이상의 프로모터; 증강제; 침묵화제; 오퍼레이터; 스플라이싱 신호; 폴리아데닐화 신호; 종결 신호; RNA 외수송 요소, 내부 리보솜 진입 부위(IRES); 폴리-U 서열; 또는 이의 조합이다.
"전사 후 조절 요소"는 전사된 후 mRNA에 영향을 미치는 DNA 절편 및/또는 메커니즘이다. 전사 후 메커니즘의 메커니즘은 스플라이싱 이벤트; 캡핑, 스플라이싱 및 폴리(A) 테일의 부가, 및 당업자에게 알려진 기타 메커니즘을 포함한다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하고 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역을 지칭한다.
"단백질"은 이 문서에서 "펩티드" 및/또는 "폴리펩티드"와 동일한 의미를 갖는다.
"비"는 한 값이 다른 값을 포함하거나 이에 포함된 횟수를 나타내는 두 양 사이의 정량적 관계를 지칭한다.
"판독 프레임"은 이중 가닥 DNA 분자의 각 방향으로 3개씩, 가능한 6개의 판독 프레임 중 하나를 지칭한다. 사용되는 판독 프레임은 DNA 분자의 코딩 서열에서 아미노산을 암호화하기 위해 사용되는 코돈을 결정한다. 일부 실시양태에서, 판독 프레임은 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)에서 뉴클레오티드의 서열을 연속적인 비중첩 삼중체 세트로 구분하는 방식이다.
"재조합 DNA" 또는 "rDNA"는 2개 이상의 상이한 DNA 절편으로 이루어지는 DNA를 지칭한다.
"재조합 벡터"는 외래 DNA가 삽입된 DNA 플라스미드 벡터를 의미한다.
"조절 요소"는 핵산 서열의 발현 및/또는 가공의 일부 측면을 제어하는 유전 요소를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조절 요소는 전사 및 전사 후 수준에서 발견될 수 있다. 조절 요소는 시스 조절 요소(CRE) 또는 트랜스 조절 요소(TRE)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 요소는 하나 이상의 프로모터; 인핸서; 침묵화제; 오퍼레이터; 스플라이싱 신호; 폴리아데닐화 신호; 종결 신호; RNA 외수송 요소, 내부 리보솜 진입 부위(IRES); 폴리-U 서열; 및/또는 예를 들어, 조직 특이적 방식으로; 시간 의존적 방식으로; 발현을 증가시키거나 감소시키기 위해; 및/또는 구성적 표현을 유발하기 위해 유전자 발현에 영향을 미치는 다른 요소일 수 있다.
"제한 효소" 또는 "제한 엔도뉴클레아제"는 특정된 제한 부위에서 DNA를 절단하는 효소를 지칭한다. 예를 들어, 제한 효소는 EcoRI, SacII 또는 BstXI 제한 부위에서 플라스미드를 절단하여 플라스미드가 선형화되고 관심 DNA가 결찰되도록 할 수 있다.
"제한 부위"는 4 내지 8개 뉴클레오티드의 서열을 포함하고 그 서열이 특정 제한 효소에 의해 인식는 DNA 상 위치를 지칭한다.
"선택 유전자"는 유전자 변형 유기체가 선택 압력 하에서 성장하는 이점을 부여하는 유전자를 의미한다.
"혈청형(serovar 또는 serotype)"은 특징적인 항원 세트로 구별되는 밀접하게 관련된 미생물 그룹을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 혈청형은 미생물의 항원적으로 및 혈청학적으로 구별되는 변종이다.
"sp."는 종을 지칭한다.
"ssp." 또는 "subsp."는 아종을 지칭한다.
"서브클로닝" 또는 "서브클로닝된"은 DNA를 한 벡터에서 또 다른 벡터, 일반적으로 유리한 벡터로 옮기는 공정을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이체 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 효모 콜로니의 선택에 이어 pKlac1 플라스미드로 서브클로닝될 수 있다.
"SSI"는 맥락 의존적 약어이다. 일부 맥락에서, 이는 "부위 특이적 통합"을 지칭할 수 있으며, 이는 생체내 상동 재조합이 일어나도록 허용할 서열을 지칭하기 위해 사용된다. 그러나 다른 맥락에서, SSI는 "실내 표면 분무"를 지칭할 수 있으며, 이는 벽, 창문, 바닥 및 천장과 같이 매개체가 쉬는 실내 표면에 가변 부피의 분무 가능한 양의 살충제를 적용하는 기술이다. 용어 "부위 특이적 통합"은 트랜스유전자를 숙주-유기체 게놈의 표적 부위로 유도하는 공정을 지칭하며; 따라서 SSI는 관심 유전자를 숙주 유기체의 미리 선택된 게놈 위치에 통합할 수 있도록 한다.
"STA" 또는 "번역 안정화 단백질" 또는 "안정화 도메인" 또는 "안정화 단백질"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)은 단백질 분해의 세포 공정에 의해 표적화되지 않고 세포에 축적될 수 있는 충분한 3차 구조를 갖는 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 단백질은 5-50개 아미노산 길이일 수 있다. 번역 안정화 단백질은 ORF에서 살충 단백질 또는 TVP를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 단백질에 대한 DNA 서열에 의해 코딩된다. 작동 가능하게 연결된 STA는 TVP의 상류 또는 하류일 수 있으며, 개재 서열이 어느 DNA 서열의 프레임 이동을 초래하지 않는 한, 두 서열(STA 및 TVP) 사이에 임의의 개재 서열을 가질 수 있다. 번역 안정화 단백질은 또한 장 벽을 거쳐 곤충의 혈액림프로 TVP의 전달을 증가시키는 활성을 가질 수 있다.
"sta"는 번역 안정화 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 의미한다.
"구조 모티프"는 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 3차원 배열, 및/또는 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드 절편의 배열을 지칭한다. 예를 들어, ERSP 모티프, STA 모티프, 링커 모티프 및 TVP 폴리펩티드 모티프를 갖는 폴리펩티드는 ERSP-STA-L-TVP의 전체적 "구조 모티프"를 갖는다. "TVP 작제물"도 참고한다.
"Ta1b" 또는 "U1-아가톡신-Ta1b" 또는 "Ta1bWT" 또는 "야생형 U1-아가톡신-Ta1b"는 호보거미, 에라티게나 아그레티스(Eratigena agrestis)로부터 단리된 폴리펩티드를 지칭한다. U1-아가톡신-Ta1b의 한 예는 서열 번호 1(NCBI 수탁 번호 O46167.1)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
"Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드"는 하나 이상의 TVP를 포함하는 살충 단백질을 발현 및/또는 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 그룹을 지칭한다. 용어 "U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드"는 TVP 발현 ORF에 포함된 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드 서열, 그 벡터 내 포함을 기재하기 위해 사용될 때, 및/또는 살충 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 기재할 때 "tvp" 및/또는 "Tvp"로 기재된다.
"독소"는 독액 및/또는 독, 특히 특정 동물, 고등 식물 및 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질 또는 접합 단백질을 지칭한다. 일반적으로 용어 "독소"는 전갈, 거미, 뱀, 독버섯 등에서 발견되는 분자 및 펩티드와 같은 천연 산물을 의미하는 반면, 용어 "독성제"는 인간 제조 제품 및/또는 인공 제품, 예를 들어, 인간 제조 화학적 살해충제를 의미한다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "독소" 및 "독성제"는 동의어로 사용된다.
"형질감염" 및 "형질전환"은 둘 다 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA(예를 들어, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)를 숙주 유기체(예를 들어, 원핵생물 또는 진핵생물)에 도입하는 공정을 지칭한다. 일반적으로, 당업자는 때때로 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA가 박테리아 세포로 도입되는 공정을 설명하기 위해 용어 "형질전환"을 사용하고; 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA의 진핵생물 세포로의 도입을 설명하는 공정에 대해 용어 "형질감염"을 사용한다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 공정이 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA의 원핵생물(예를 들어 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들어 효모, 식물 또는 동물)로의 도입을 설명하는지와 무관하게, 동의어로 사용된다.
"트랜스유전자"는 식물로 형질전환되는 단백질을 암호화하는 이종성 DNA 서열을 의미한다.
"트랜스제닉 숙주 세포"는 유전자로 형질전환되고 추가 선택 유전자를 통해 그 트랜스제닉 상태에 대해 선택된 세포를 의미한다.
"트랜스제닉 식물"은 식물의 모든 세포가 해당 트랜스유전자를 포함하도록 외래 DNA로 형질전환된 단일 세포에서 유래된 식물을 의미한다.
"일시적 발현 시스템"은 무장해제된(disarmed) 식물 바이러스를 암호화하는 DNA를 그것이 발현되는 식물 세포로 전달하는 아그로박테리움 투메파시엔스 기반 시스템을 의미한다. 식물 바이러스는 TSP의 최대 40%인 고농도로 관심 단백질을 발현하도록 조작되었다.
"3중 발현 카세트는 동일한 벡터에 포함된 3개의 TVP 발현 카세트를 지칭한다.
"TRBO"는 바이러스 코팅 단백질 유전자가 제거된 담배 모자이크 바이러스를 사용한 일시적인 식물 발현 시스템을 의미한다.
"TSP" 또는 "총 가용성 단백질"은 식물 조직 샘플에서 추출되어 추출 완충액에 가용화될 수 있는 단백질의 총량을 의미한다.
"TVP" 또는 "U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)" 또는 "Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)"는 비-자연 발생 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산하도록 변경된, 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리펩티드 서열 및/또는 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이체 또는 변이체를 지칭한다. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 예시적인 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리펩티드 서열이 본원에 제공된다. 신호 서열 "MKLQLMICLVLLPCFFC"(서열 번호 59)를 포함하는, 서열 번호 48(NCBI 수탁 번호 O46167.1)의 아미노산 서열을 갖는 예시적인 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 전구체 폴리펩티드 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, TVP는 표 1에 열거된 임의의 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 따라서, 용어 "TVP"는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 대비 하나 이상의 돌연변이를 갖는 펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열을 가질 수 있다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X 1 -X 2 -M-X 3 -N-K-E-F-T-Y-X 4 -S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X 5 -N-D-V-Y-Z 1 -A-C-H-E-A-Q-X 6 -X 7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열을 가질 수 있다:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X 1 -M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z 1 -A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다).
"TVP ORF 다이어그램"은 다이어그램 또는 공식 형태로 작성된 하나 이상의 TVP ORF의 조성을 지칭한다. 예를 들어, "TVP ORF 다이어그램"은 ORF 표현에 포함된 DNA 절편에 대한 약어 또는 약식 참조를 사용하여 작성될 수 있다. 따라서, 한 예에서 "TVP ORF 다이어그램"은 공식 형태로 DNA 절편을 "ersp"(즉, ERSP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열); "링커" 또는 "L"(즉, 링커 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열); "sta"(즉, STA 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열) 및 "tvp"(즉, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열) 각각으로 다이어그램화하여, ERSP, 링커, STA, 및 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 기재할 수 있다. TVP ORF 다이어그램의 한 예는 "ersp-sta-(링커 i- tvp j)N" 또는 "ersp -( tvp j - 링커 i ) N - sta" 및/또는 이의 DNA 절편의 임의의 조합이다.
"TVP 폴리뉴클레오티드"는 TVP 또는 TVP-살충 단백질을 발현 및/또는 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 그룹을 지칭한다.
"TVP-살충 단백질"은 (1) 적어도 하나의 TVP, 또는 둘 이상의 TVP; 및 (2) 추가의 비-독소 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 구성되는 임의의 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 아미노산 서열, 구조, 또는 배열을 지칭하며, 상기 추가의 비-독소 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 예를 들어 일부 실시양태에서 하기: 곤충이 TVP 단독에 비해 TVP-살충 단백질에 노출될 때 곤충의 사망률 증가 및/또는 성장 억제; 예를 들어, 숙주 세포 또는 발현 시스템에서, 상기 TVP-살충 단백질의 발현 증가; 및/또는 TVP-살충 단백질의 번역-후 가공으로의 영향 중 하나 이상을 수행하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP를 포함하는 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP를 포함하는 중합체일 수 있고, TVP는 링커 펩티드, 예를 들어 절단 가능 및/또는 절단불가능 링커를 통해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 안정화 도메인(STA); 소포체 신호전달 단백질(ERSP); 곤충 절단 가능 또는 곤충 절단불가능 링커(L); 및/또는 이의 임의의 다른 조합과 같은 하나 이상의 단백질과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 TVP를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 (1) 야생형 Ta1b 단백질; 및 (2) 추가의 비-독소 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어, ERSP; 링커; STA; UBI; 또는 히스티딘 태그 또는 유사한 마커를 포함하는 비-자연 발생 단백질일 수 있다.
"TVP 작제물"은 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드 절편(예를 들어, TVP-살충 단백질)의 모티프의 3차원 배열/배향을 지칭한다. 예를 들어, TVP 발현 ORF는 하기 구성성분 또는 모티프: TVP; 소포체 신호 펩티드(ERSP); 링커 펩티드(L); 번역 안정화 단백질(STA); 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 그리고, 본원에 사용된 용어 "TVP 작제물"은 구조 모티프의 지정 및/또는 배향을 설명하기 위해 사용된다. 즉, TVP 작제물은 주어진 TVP 발현 ORF에 포함된 구성성분 또는 모티프의 배열 및 배향을 기재한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP 작제물은 비제한적으로 하기 TVP-살충 단백질: ERSP-TVP; ERSP-(TVP)N; ERSP-TVP-L; ERSP-(TVP)N-L; ERSP-(TVP-L)N; ERSP-L-TVP; ERSP-L-(TVP)N; ERSP-(L-TVP)N; ERSP-STA-TVP; ERSP-STA-(TVP)N; ERSP-TVP-STA; ERSP-(TVP)N-STA; ERSP-(STA-TVP)N; ERSP-(TVP-STA)N; ERSP-L-TVP-STA; ERSP-L-STA-TVP; ERSP-L-(TVP-STA)N; ERSP-L-(STA-TVP)N; ERSP-L-(TVP)N-STA; ERSP-(L-TVP)N-STA; ERSP-(L-STA-TVP)N; ERSP-(L-TVP-STA)N; ERSP-(L-STA)N-TVP; ERSP-(L-TVP)N-STA; ERSP-STA-L-TVP; ERSP-STA-TVP-L; ERSP-STA-L-(TVP)N; ERSP-(STA-L)N-TVP; ERSP-STA-(L-TVP)N; ERSP-(STA-L-TVP)N; ERSP-STA-(TVP)N-L; ERSP-STA-(TVP-L)N; ERSP-(STA-TVP)N-L; ERSP-(STA-TVP-L)N; ERSP-TVP-L-STA; ERSP-TVP-STA-L; ERSP-(TVP)N-STA-L ERSP-(TVP-L)N-STA; ERSP-(TVP-STA)N-L; ERSP-(TVP-L-STA)N; 또는 ERSP-(TVP-STA-L)N 중 하나의 배향을 기재하며; N은 1 내지 200 범위의 정수이다. 또한 "구조 모티프"를 참고한다.
"var."는 변종(varietas 또는 variety) 또는 품종을 지칭한다. 용어 "var."는 종 수준 및/또는 (있는 경우) 아종보다 낮은 순위의 분류 범주를 표시하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "var."는 경미하지만 영구적이거나 유전 가능한 특성이 동일한 아종 또는 종의 다른 구성원과 상이한 구성원을 나타낸다.
"변이체" 또는 "변이체 서열" 또는 "변이체 펩티드"는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 보존적 변형을 보유하는 아미노산 서열을 지칭한다. "변이체"의 보존적 아미노산 치환은 그 비-변이 형태와 관련하여 변이체의 활성을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "변이체"는 서열 번호에 의해 표시된 바와 같이, 개시되고/되거나 청구되는 서열을 갖는 펩티드와 비교될 때 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 보유한다.
"벡터"는 관심 외래 유전자(예를 들어 tvp)를 수용하는 DNA 절편을 지칭한다. 관심 유전자는 "삽입부" 또는 "트랜스유전자"로 알려져 있다.
"유리화"는 물질을 유리와 같은 무정형 물질로 전환시키는 공정을 지칭한다. 유리와 같은 무정형 고체에는 임의의 결정성 구조가 없을 수 있다. 유리질 고체의 고화는 유리 전이 온도(Tg)에서 발생한다.
"야생형" 또는 "WT"는 그 자연 발생 상태 또는 조건에서 발견 및/또는 관찰된 바와 같은, 유기체, 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 폴리펩티드 서열의 표현형 및/또는 유전형(즉, 외관 또는 서열)을 지칭한다.
"효모 발현 벡터" 또는 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 전사 및 번역될 효모 세포로 이종성 유전자 및/또는 발현 카세트를 도입할 수 있는 플라스미드를 의미한다.
"수율"은 펩티드의 생산을 지칭하며, 증가된 수율은 증가된 생산량, 증가된 생산 속도, 및 증가된 평균 또는 중앙값 수율 및 더 높은 수율에서의 증가된 빈도를 의미할 수 있다. "식물의 수율"에서와 같이 식물 작물 성장 및/또는 생산에 대해 사용될 때 용어 "수율"은 식물에 의해 생산된 바이오매스의 질 및/또는 양을 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되거나 맥락상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹에 대한 언급은 이러한 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성의 그룹 중 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
본 개시내용은 달리 표시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 고상 및 액체 핵산 합성, 용액 중 펩티드 합성, 고상 펩티드 합성, 면역학, 세포 배양 및 제형화의 통상적인 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 수행된다. 이러한 절차는 예를 들어 문헌(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, whole of text, and particularly the papers therein by Gait, pp1-22; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; and Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, whole of text; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, whole of text; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), whole of series; J. F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R. L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R. B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R. B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, 3. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wiinsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); 및 Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000))에 기재되어 있고; 이들 참고문헌 각각은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 맥락상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 단계 또는 요소 또는 정수 또는 단계 또는 요소 또는 정수의 그룹을 포함하는 것을 시사하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
모두　본원에 언급된 특허 출원, 특허 및 인쇄된 간행물은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 전체가 참조로 포함된다. 그리고, 본원에 인용된 모든 특허 출원, 특허 및 인쇄된 간행물은 모든 정의, 요지 사항 면책 또는 부인을 제외하고, 그리고 포함된 자료가 본원의 명시적 개시와 일치하지 않는 정도를 제외하고 전체가 본원에 참조로 포함되며, 이 경우 본 개시의 언어가 우선한다.
야생형 U1- 아가톡신 및 TVPS
"호보거미"(에라티게나 아그레스티스, 예전 테게나리아 아그레스티스(Tegenaria agrestis))는 거미의 가게거미과(Agelenidae)의 구성원 또는 깔때기 거미의 구성원인 독이 있는 거미이다. 문헌(Ingale A, Antigenic epitopes prediction and MHC binder of a paralytic insecticidal toxin (ITX-1) of Tegenaria agrestis (hobo spider). 4 August 2010 Volume 2010:2 pp 97-103)을 참고한다. 호보 거미의 독은 살충 활성의 보유와 연루되어 있다. 문헌(Johnson et al., Novel insecticidal peptides from Tegenaria agrestis spider venom may have a direct effect on the insect central nervous system. Arch Insect Biochem Physiol. 1998;38(1):19-31; Klint et al., Production of Recombinant Disulfide-Rich Venom Peptides for Structural and Functional Analysis via Expression in the Periplasm of E. coli. PLoS One. 2013; 8(5): e63865)을 참고한다.
호보 거미는 가게거미과의 다른 몇몇 거미와 함께 살충 활성을 나타내는 아가톡신을 포함하는 독액을 생산한다. 아가톡신은 표적 종에 따라 다양한 살충 효과를 유도할 수 있는 화학적으로 다양한 독소 그룹이다; 예를 들어, 아가톡신은 딱정벌레목, 나비목 및 파리목에서 느린-발병 경련 마비를 유발하고; 집파리(무스카 도메스티카)의 중추 신경계(CNS)에서 뉴런 발화 속도를 증가시키고; 다른 곤충(예를 들어 검정파리, 루실리아 쿠프리나(Lucilia cuprina))에 치명적이다. 따라서, 아가톡신은 CNS의 표적화에 연루된다. 문헌(Undheim et al., Weaponization of a hormone: convergent recruitment of hyperglycemic hormone into the venom of arthropod predators. Structure 23: 1283-1292, 및 Johnson et al., Novel insecticidal peptides from Tegenaria agrestis spider venom may have a direct effect on the insect central nervous system. Arch. Insect Biochem. Physiol. 38:19-31(1998))을 참고한다.
두 가지 유형의 아가톡신은 U1-아가톡신-Ta1a 및 U1-아가톡신-Ta1b를 포함하며, 둘 다 나선형 절지동물-신경 펩티드-유래(HAND) 독소 패밀리의 구성원이다. 거미 외에도, 이러한 독소는 지네의 독액에서도 발견될 수 있다. 아가톡신은 고대 엑디소조안 호르몬 패밀리, 즉 이온 수송 펩티드/갑각류 고혈당 호르몬(ITP/CHH) 패밀리의 진화 파생물이다. 문헌(Undheim et al., Weaponization of a hormone: convergent recruitment of hyperglycemic hormone into the venom of arthropod predators. Structure 23: 1283-1292, 및 Johnson et al., Novel insecticidal peptides from Tegenaria agrestis spider venom may have a direct effect on the insect central nervous system. Arch. Insect Biochem. Physiol. 38:19-31(1998))을 참고한다.
호보 거미 유래 U1-아가톡신-Ta1b 독소는 아미노산 위치 1-17의 신호 펩티드 및 위치 18-68의 성숙 독소를 포함하는 "MKLQLMICLVLLPCFFCEPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG"(서열 번호 48)"의 전체 아미노산 서열을 가지고 있다. 상동. 단백질은 β 가닥이 없는 4개의 조밀하게 패킹된 α-나선을 포함하며, 성숙 독소의 분자량은 5700.39달톤(Da)이다. 상동.
아미노산 서열 "EPDEICARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEEAECFRNDVYTACHEAQKG"(서열 번호 1)를 갖는 에라티게나 아그레스티스로부터의 예시적인 성숙 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리펩티드가 제공된다.
단백질 가공 동안, 성숙 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 독소는 C-말단 글리신의 절제 이벤트를 거쳐, 하기 아미노산 서열: EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEEAECFRNDVYTACHEAQK(서열 번호 60)를 생성한다. 후속 번역 후 이벤트는 C-말단 아미드화를 갖는 성숙 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 독소를 생성한다.
U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 일부 방식으로 야생형 U1-아가톡신-Ta1b(서열 번호 1)와 상이한 돌연변이체 또는 변이체이며, 예를 들어, 일부 실시양태에서 이러한 변이는 아미노산 치환, 삭제 또는 부가; 또는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 초래하는 야생형 U1-아가톡신-Ta1b를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 변화일 수 있다. 이러한 변형의 결과는 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 대비 하나 이상의 곤충 종에 대해 향상된 살충 활성을 보유하는 비-자연 발생 폴리펩티드 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시양태에서, TVP는 표 1에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110에 따른 아미노산 서열을 가질 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110에 따른 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화하도록 작동 가능할 수 있고, TVP를 암호화하도록 작동 가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표 2에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 제1, 제2 또는 제3 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 제1 돌연변이를 가질 수 있고, 제1 돌연변이는 R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; 또는 T43A의 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 제1 및 제2 돌연변이, 예를 들어 R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; 또는 T43AΔG를 가질 수 있고; 제1 돌연변이는 R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; 또는 T11P의 아미노산 치환이고; 제2 돌연변이는 C-말단 글리신의 결실이다.
일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 제1 및 제2 돌연변이, 예를 들어 R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; 또는 T11PT43A를 가질 수 있고; 제1 돌연변이는 R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; 또는 T11P의 아미노산 치환이고; 제2 돌연변이는 글리코실화되지 않은 TVP를 생성하는 T43A 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 제1, 제2 및 제3 돌연변이, 예를 들어 R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 또는 T11PT43AΔG를 가질 수 있고; 제1 돌연변이는 R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; 또는 T11P의 아미노산 치환이고; 제2 돌연변이는 글리코실화되지 않은 TVP를 생성하는 T43A 아미노산 치환이고; 제3 돌연변이는 C-말단 글리신의 결실이다.
일부 바람직한 실시양태에서, TVP는 TVP-R9Q/T43A(서열 번호 51)일 수 있다.
다양한 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 식물 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 살충 TVP 트랜스제닉 단백질은 식물 또는 그의 일부의 표면에 당업자에게 알려진 임의의 방식으로 분무되거나 달리 적용될 수 있는 조성물로 제형화될 수 있다. 따라서, 숙주 세포, 예를 들어 식물 세포에서 적절한 조건 하에 하나 이상의 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 DNA 작제물이 본원에 제공된다. 식물 세포의 기생 곤충에 의한 해충 감염을 제어하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 기술에 의해 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에 투여하거나 도입하는 단계 및 상기 재조합적으로 변경된 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 해충에 노출된 현장에서 성장시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, TVP는 TVP 및 부형제로 구성되는 분무 가능 조성물로 제형화되고, 감염성 곤충이 TVP를 섭취하면 유해한 효과를 초래하도록 직접 적용에 의해 민감한 식물에 직접 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP는 서열 2-15, 49-53, 및 77-110 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP는 아미노산 서열: "EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG"(서열 번호 51)와 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 TVP가 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 TVP가 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고, X7이 글리신인, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 TVP가 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고, X7이 부재하는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 TVP가 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고, X6 및 X7이 부재하는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Z1이 T 또는 S인 경우, TVP가 글리코실화되는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 서열과 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
예시적인 TVP
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다).
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있고, 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 서열 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 I에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 아미노산 서열 "EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG"(서열 번호 51)에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP일 수 있다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 II에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G;
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다).
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 II에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G;
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 화학식 II에 따른 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G;
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); X1은 Q이고; Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
TVP 살충 단백질
TVP 살충 단백질은 (1) 적어도 하나의 TVP, 또는 2개 이상의 TVP; 및 (2) 예를 들어, 일부 실시양태에서 하기: 곤충이 TVP 단독에 비해 TVP-살충 단백질에 노출될 때 곤충의 사망률을 증가시키고/시키거나 성장을 억제하고; 예를 들어, 숙주 세포 또는 발현 시스템에서, 상기 TVP-살충 단백질의 발현을 증가시키고; 및/또는 TVP-살충 단백질의 번역-후 가공에 영향을 미치는 능력을 갖는, 추가 비-독소 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 구성되는 임의의 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 아미노산 서열, 구성, 또는 배열이다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP를 포함하는 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP를 포함하는 중합체일 수 있고, TVP는 링커 펩티드, 예를 들어 절단 가능 및/또는 절단불가능 링커를 통해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 안정화 도메인(STA); 소포체 신호전달 단백질(ERSP); 곤충 절단 가능 또는 곤충 절단불가능 링커(L); 및/또는 이의 임의의 다른 조합과 같은 하나 이상의 단백질과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 TVP를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 (1) 야생형 Ta1b 단백질; 및 (2) 추가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 ERSP; 링커; STA; UBI; 또는 히스티딘 태그 또는 유사한 마커를 포함하는 비-자연 발생 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 표 1, 예를 들어, 서열 번호 2-15, 49-53, 및 77-110에서 발견되는 하나 이상의 TVP를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 살충 단백질은 TVP 동종중합체, 예를 들어 동일한 TVP인 2개 이상의 TVP 단량체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 살충 단백질은 TVP 이종중합체, 예를 들어 2개 이상의 TVP 단량체를 포함할 수 있으며, TVP 단량체는 상이하다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 동종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP는 동일한 아미노산 치환을 갖는 동일한 TVP 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 아미노산 치환, 즉, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 아미노산 치환을 포함하는 하나의 폴리펩티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG를 포함하는 하나의 폴리펩티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R9Q의 아미노산 치환을 포함하는 하나의 폴리펩티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R9QΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 K18A 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 K18AΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R38A 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R38AΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 A8N 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 A8NΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열과 비교하여 A8S 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 A8SΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R9N 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 R9NΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있으며, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 T11P 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 T11PΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A; R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 T43A 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 T43AΔG 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 RQ9/T43A 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 TVP의 이종중합체를 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산은 상이하며, 예를 들어 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 하기 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; T11PT43A R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; T11PT43AΔG; 및/또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 또 다른 폴리펩티드에 연결된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 RQ9/T43A 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 TVP 중합체는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; 또는 T11PT43A R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG을 가질 수 있는 제2 TVP 중합체에 융합된, 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 아미노산 치환: R9Q; K18A; R38A; A8N; A8S; R9N; T11P; T43A; R9QΔG; K18AΔG; R38AΔG; A8NΔG; A8SΔG; R9NΔG; T11PΔG; T43AΔG; R9QT43A; K18AT43A; R38AT43A; A8NT43A; A8ST43A; R9NT43A; 또는 T11PT43A R9QT43AΔG; K18AT43AΔG; R38AT43AΔG; A8NT43AΔG; A8ST43AΔG; R9NT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG; 및/또는 T11PT43AΔG를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 살충 단백질은 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있고, 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있다. 절단가능 링커 및 절단불가능 링커의 예시적인 생성 방법은 미국 특허 출원 번호 15/727,277; 및 PCT 출원 번호 PCT/US2013/030042에서 찾을 수 있고, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 서열 번호 2-15, 49-53, 및 77-110의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 TVP를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 서열 번호 2-15, 49-53, 및 77-110의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 TVP를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP는 아미노산 서열 "EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG"(서열 번호 51)과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 100%를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TVP를 생산하는 방법
단백질을 생산하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 다양한 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 재조합 방법을 사용하여 생산되거나 화학적으로 합성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 TVP는 단백질을 생산하기 위한 임의의 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 그리고 비제한적으로, 효모 발현 시스템 또는 박테리아 발현 시스템과 같은 재조합 발현 시스템을 사용하여 TVP가 생성될 수 있다. 그러나, 당업자는 다른 단백질 생산 방법이 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 발현 시스템을 사용하여 TVP를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP를 생산하는 방법을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 구성되며, 상기 방법은 (a) TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 구성되는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계, (b) 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 또는 효모, 또는 곤충, 또는 식물 세포, 또는 동물 세포에 벡터를 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 효모 균주를 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 관련 실시양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다.
본 발명은 매우 다양한 숙주 세포에서 실시 가능하다(아래의 숙주 세포 섹션 참고). 실제로, 본 발명의 최종 사용자는 자신이 선택한 임의의 숙주 세포에서 본 발명의 교시를 실시할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 최종 사용자의 요건을 충족시키는 임의의 숙주 세포일 수 있고; 즉, 일부 실시양태에서, TVP의 발현은 다양한 숙주 세포를 사용하여 본원의 교시에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 사용자는 다른 것과 대비되는, 하나의 특정 유형의 숙주 세포(예를 들어, 효모 세포 또는 박테리아 세포)를 사용하기 원할 수 있고; 주어진 숙주 세포의 선호도는 이용 가능성부터 비용에 이르기까지 다양할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP를 생산하는 방법을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 구성되며, 상기 방법은 (a) TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 구성되는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 또는 효모, 또는 곤충, 또는 식물 세포, 또는 동물 세포에 벡터를 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 효모 균주를 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 관련 실시양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다.
야생형 U1- 아가톡신 - Ta1b의 단리 및 돌연변이화
TVP는 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 생성하고; 해당 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드(tvp ) 서열을 적절한 벡터에 삽입하고; TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 방식으로 숙주 유기체를 형질전환하고; 숙주 유기체를 배양하여 원하는 양의 TVP를 생성하고; 이어서 숙주 유기체 내부 및/또는 주위에서 TVP를 정제하여 얻을 수 있다.
야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이 생성은 당업자에게 잘 알려진 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이유발 방법은 쿤켈(Kunkel) 방법; 카세트 돌연변이유발; PCR 부위-지정 돌연변이 유발; "완벽한 살인자" 기술(delitto perfetto ); PCR 및 하나의 재활용 가능 마커를 사용한 직접적인 유전자 결실 및 부위 특이적 돌연변이유발; 긴 상동 영역을 사용하는 PCR 및 하나의 재활용 가능 마커를 사용한 직접적인 유전자 결실 및 부위 특이적 돌연변이유발; 변위 "팝-인 팝-아웃" 방법; 및 CRISPR-Cas 9를 포함한다. 예시적인 부위 지정 돌연변이 유발 방법은 문헌(Ruvkun & Ausubel, A general method for site-directed mutagenesis in prokaryotes. Nature. 1981 Jan 1; 289(5793):85-8; Wallace et al., Oligonucleotide directed mutagenesis of the human beta-globin gene: a general method for producing specific point mutations in cloned DNA. Nucleic Acids Res. 1981 Aug 11; 9(15):3647-56; Dalbadie-McFarland et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis as a general and powerful method for studies of protein function. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Nov; 79(21):6409-13; Bachman. Site-directed mutagenesis. Methods Enzymol. 2013; 529:241-8; Carey et al., PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 Aug 1; 2013(8):738-42; 및 Cong et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15; 339(6121):819-23)에서 찾을 수 있으며, 상기 언급된 모든 참고문헌의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
야생형 U1-아가톡신-Ta1b 독소는 거미 독액에서 단리될 수 있다. 거미 독은 당업자에게 알려진 임의의 기술을 사용하여 거미(예를 들어 에라티게나 아그레스티스와 같은 거미)의 독액샘으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서 독액은 미국 특허 번호 5,688,764에 기재된 방법에 따라 거미로부터 단리될 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리뉴클레오티드 서열은 U1-아가톡신-Ta1b 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 프라이머 탐침을 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 대안적으로, 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 TVP 폴리뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 야생형 U1-아가톡신-Ta1b 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 TVP 폴리뉴클레오티드 서열은 포스포라미다이트; 트리에스테르, 포스파이트 또는 H-포스포네이트 방법과 같은 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 사용하여 생성될 수 있다(그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는, Engels, J. W. and Uhlmann, E. (1989), Gene Synthesis [New Synthetic Methods (77)]. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 참고).
TVP 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 GENEWIZ®(예를 들어 TurboGENE™ PriorityGENE; 및 FragmentGENE), 또는 SIGMA-ALDRICH®(예를 들어 Custom DNA 및 RNA Oligo design 및 Order Custom DNA Oligos)에서 제공되는 것들과 같은 상업적으로 이용 가능한 폴리뉴클레오티드 합성 서비스를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 및/또는 맞춤 화학 합성 폴리뉴클레오티드의 예시적인 생성 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 1995년 2월 13일자로 출원된 일련 번호 08/389,615, 미국 특허 번호 5,736,135에 예시적으로 제공되어 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 포함된다. 또한 그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌(Agarwal, et al., Chemical synthesis of polynucleotides. Angew Chem Int Ed Engl. 1972 Jun; 11(6):451-9; Ohtsuka et al., Recent developments in the chemical synthesis of polynucleotides. Nucleic Acids Res. 1982 Nov 11; 10(21): 6553-6570; Sondek & Shortle. A general strategy for random insertion and substitution mutagenesis: substoichiometric coupling of trinucleotide phosphoramidites. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Apr 15; 89(8): 3581-3585; Beaucage S. L., et al., Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach. Tetrahedron, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, vol. 48, No. 12, 1992, pp. 2223-2311; Agrawal (1993) Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties; Methods in Molecular Biology Vol. 20)을 참고한다.
폴리뉴클레오티드의 화학적 합성은 생성될 DNA 서열이 상기 서열 내의 뉴클레오티드 배열(즉, 사이토신[C], 구아닌[G], 아데닌[A] 또는 티민 [T] 분자의 배열)에 기반하여 원하는 폴리펩티드를 생산하도록 맞춤화되는 것을 허용하며; 화학적으로 합성된 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 mRNA 서열은 아미노산 서열로 번역될 수 있으며, 각 아미노산은 mRNA 서열의 코돈에 상응한다. 따라서, mRNA 서열로부터 번역되는 폴리펩티드 사슬의 아미노산 조성은 20개 아미노산 중 어느 것이 성장하는 폴리펩티드에 부가될지를 결정하는 기본 코돈을 변화시킴으로써 변경될 수 있으며; 따라서 삽입, 치환, 결실 및 프레임이동과 같은 DNA의 돌연변이는 기본 코돈에 따라 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 유발할 수 있다.
화학적으로 합성된 DNA 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 돌연변이유발을 통해 변경된 야생형 DNA 폴리뉴클레오티드 서열로부터 TVP를 얻는 것은 DNA 서열을 적절한 벡터로 클로닝함으로써 달성될 수 있다. 이용 가능한 다양한 발현 벡터, 숙주 유기체, 및 당업자에게 알려진 클로닝 전략이 존재한다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드일 수 있고, 이는 이종성 유전자 및/또는 발현 카세트를 전사 및 번역될 효모 세포로 도입할 수 있다. 용어 "벡터"는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 벡터는 복제 기점(ORI)과 같은 "벡터 요소"; 선택을 허용하도록 항생제 내성을 부여하는 유전자; 다중 클로닝 부위; 프로모터 영역; 비박테리아 형질감염을 위한 선택 마커; 및 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래이거나 서열이 세포 내의 서열과 상동하지만 서열이 보통 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있음을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어 YAC)를 포함한다. 당업자는 둘 다 본원에 참조로 포함되는, 문헌(Sambrook et al., 1989 및 Ausubel et al., 1996)에 기재된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 잘 구성할 수 있을 것이다. Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 것 외에도, 벡터는 표적화 분자를 암호화할 수 있다. 표적화 분자는 원하는 핵산을 특정 조직, 세포 또는 기타 위치로 유도하는 분자이다.
벡터 및 형질전환
일부 실시양태에서, TVP 폴리뉴클레오티드는 다양한 클로닝 전략, 및 당업자가 용이하게 이용 가능한 상업적 클로닝 키트 및 물질을 사용하여 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, TVP 폴리뉴클레오티드는 SnapFast; Gateway; TOPO; Gibson; LIC; InFusionHD; 또는 Electra 전략과 같은 전략을 사용하여 벡터로 클로닝될 수 있다. TVP를 생산하기 위해 사용할 수 있는 수많은 상업적으로 이용 가능한 벡터가 있다. 예를 들어, TVP 폴리뉴클레오티드는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 생성될 수 있으며, pCR™ II-TOPO 벡터 또는 PCR™ 2.1-TOPO® 벡터(Invitrogen의 TOPO® TA Cloning® 키트로 상업적으로 이용 가능)와 실온에서 5분 동안 조합될 수 있고; 이어서 TOPO® 반응은 이후 색상 변화에 기반하여 선택될 수 있는 적격 세포로 형질전환될 수 있다(그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는, Janke et al., A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 2004 Aug; 21(11):947-62; see also, Adams et al. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY, 1997 참고).
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및/또는 인공 염색체(예를 들어 YAC)와 같은 벡터로 클로닝될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 수행함으로써 벡터, 예를 들어 대장균을 숙주로 사용하는 플라스미드 벡터로 삽입될 수 있다: 관심 DNA 절편이 삽입되도록 하는 데 필요한 제한 효소를 사용하여 약 2 내지 5 μg의 벡터 DNA를 소화시킨 다음 하룻밤 동안 인큐베이션하여 완전한 소화를 달성하고(알칼리성 포스파타제가 자가 결찰/재고리화를 피하기 위해 5'-단부를 탈인산화하는 데 사용될 수 있음); 겔로 소화된 벡터를 정제한다. 다음으로, 관심 DNA 절편, 예를 들어 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 PCR을 통해 증폭하고, 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 PCR 반응에서 과량의 효소, 프라이머, 혼입되지 않은 dNTP, 짧은 실패 PCR 산물 및/또는 염을 제거한다(예를 들어, PCR 클린업 키트를 사용하여). 약 20 ng의 벡터; 약 100 내지 1,000 ng 또는 관심 DNA 절편; 2 μL 10x 완충액(즉, 30 mM 트리스-HCl 4mM MgCl2, 26 μM NAD, 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, pH 8, 25℃에서 보관됨); 1 μL T4 DNA 리가제를 포함하는 혼합물을 생성하고; H2O를 첨가하여 모두 20 μL의 총 부피로 만들어 관심 DNA 절편을 벡터와 결찰한다. 그 다음, 결찰 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하거나 16℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션할 수 있다. 그 다음, 결찰 반응물(즉, 약 1 μL)으로, 예를 들어 전기천공 또는 화학적 방법을 사용하여 적격 세포를 형질전환할 수 있고, 이어서 콜로니 PCR을 수행하여 관심 DNA 절편을 포함하는 벡터를 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF를 함께 이루는 다른 DNA 절편과 함께 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 효모 세포로부터의 분비를 위해 설계될 수 있다. 예시적인 TVP 발현 ORF의 설계 방법은 하기와 같다: ORF는 신호 펩티드 서열로 시작하고, Kex2 절단 부위(라이신-아르기닌)를 암호화하는 DNA 서열이 뒤따를 수 있으며, 이어서 TVP 폴리뉴클레오티드 트랜스유전자가 뒤따를 수 있고, 5'-단부에 글리신-세린 코돈 그리고 마지막으로 3'-단부에 종결 코돈이 부가된다. 이러한 모든 요소는 효모 세포에서 단일 개방 판독 프레임(ORF)로 융합 펩티드로 발현될 것이다. α-교배 인자(αMF) 신호 서열은 재조합 효모의 내인성 분비 경로를 통해 재조합 살충 펩티드의 대사 가공을 용이하게 하기 위해 가장 자주 사용된다, 즉, 발현된 융합 펩티드는 전형적으로 소포체로 들어갈 것이며, α-교배 인자 신호 서열은 신호 펩티다제 활성에 의해 제거되고, 그 후 생성 프로-살충 펩티드는 골지체로 수송될 것이고, 위에서 언급된 라이신-아르기닌 디펩티드는 Kex2 엔도프로테아제에 의해 완전히 제거되고, 그 후에 성숙 폴리펩티드(즉, TVP)가, 세포 밖으로 분비된다.
일부 실시양태에서, 재조합 효모 세포에서의 폴리펩티드 발현 수준은 특정 숙주 효모 종에 기반하여 코돈을 최적화함으로써 향상될 수 있다. 주어진 숙주 유기체의 내인성 개방 판독 프레임에서 관찰되는 코돈의 자연 발생 빈도가 고효율 발현을 위해 반드시 최적화될 필요는 없다. 더욱이, 상이한 효모 종(예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 등)은 고효율 발현을 위해 상이한 최적 코돈을 갖는다. 따라서 신호 서열, Kex2 절단 부위 및 TVP를 암호화하는 서열 요소를 포함하는 TVP 발현 ORF는 초기에 재조합 효모 세포에서 하나의 융합 펩티드로 번역되므로, 이에 대한 코돈 최적화가 고려되어야 한다.
일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 TVP 발현 ORF는 효모 발현을 위한 효모 특이적 발현 벡터로 결찰될 수 있다. 에피솜 벡터 및 통합 벡터를 포함하여 효모 발현에 이용 가능한 많은 발현 벡터가 있으며, 일반적으로 특정 효모 균주용으로 설계된다. 펩티드 생산에 사용될 특정 효모 발현 시스템을 고려하여 적절한 발현 벡터를 신중하게 선택해야 한다. 일부 실시양태에서, 형질전환된 효모 세포의 염색체로 통합되고 세포 분열 및 증식 주기를 통해 안정하게 유지되는 통합 벡터가 사용될 수 있다. 통합 DNA 서열은 형질전환된 효모 종에서 표적화된 게놈 DNA 유전자좌와 상동성이며, 이러한 통합 서열은 pLAC4, 25S rDNA, pAOX1 및 TRP2 등을 포함한다. 살충 펩티드 트랜스유전자의 위치는 통합 DNA 서열이 인접하거나(삽입 벡터) 통합 DNA 서열 내일 수 있다(대체 벡터).
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 대장균에서 DNA 제조를 위한 대장균 요소, 예를 들어, 대장균 복제 기점, 항생제 선택 마커 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 관심 트랜스유전자의 발현에 필요한 서열 요소 어레이, 예를 들어, 전사 프로모터, 종결인자, 효모 선택 마커, 숙주 효모 DNA와 상동성인 통합 DNA 서열 등을 포함할 수 있다. 천연 및 조작된 프로모터를 포함하는, 이용 가능한 여러 적합한 효모 프로모터가 존재하며, 예를 들어 pLAC4, pAOX1, pUPP, pADH1, pTEF, pGal1 등과 같은 효모 프로모터가 일부 실시양태에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 아세트아미드 원영양체 선택; 제오신 내성 선택; 제네티신 내성 선택; 누르세오트리신 내성 선택; 우라실 결핍 선택과 같은 선택 방법; 및/또는 다른 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아스페르길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) amdS 유전자가 선택 마커로서 사용될 수 있다. 선택 가능 마커의 예시적인 사용 방법은 미국 특허 번호 6,548,285(1997년 4월 3일 출원); 6,165,715(1998년 6월 22일 출원); 및 6,110,707(1997년 1월 17일 출원)에서 찾을 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pKLAC1 플라스미드로 삽입될 수 있다. pKLAC1은 New England Biolabs® Inc.(품목 번호(NEB #E1000))에서 상업적으로 이용 가능하다. pKLAC1은 효모 클루이베로마이세스 락티스에서 재조합 단백질(예를 들어 TVP)의 고수준 발현을 달성하기 위해 설계되었다. pKLAC1 플라스미드는 단독으로 또는 클루이베로마이세스 락티스 단백질 발현 키트의 일부로서 주문될 수 있다. pKLAC1 플라스미드는 SacII 또는 BstXI 제한 효소를 사용하여 선형화될 수 있으며 αMF 분비 신호 하류 MCS를 보유한다. αMF 분비 신호는 재조합 단백질을 분비 경로로 유도하고, 이는 이후에 Kex2를 통해 절단되어 관심 펩티드, 예를 들어 TVP를 생성한다. Kex2는 칼슘 의존적 세린 프로테아제이며, 이는 분비 경로의 프로단백질 활성화에 관여되고, 상업적으로 이용 가능하다(PeproTech®; 품목 번호 450-45).
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pKlac1 플라스미드로 삽입되거나, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 결찰된 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 효모 콜로니의 선택에 이어 pKlac1 플라스미드로 서브클로닝될 수 있다. TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 결찰된 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 효모, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스는 형질전환된 효모 세포가 유일한 질소원으로서 아세트아미드를 포함하는 YCB 배지에서 성장할 수 있도록 하는, 아세트아미다제(amdS)에 기반하여 선택될 수 있다. TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 결찰된 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 양성 효모 콜로니가 확인된다.
일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업자가 쉽게 이용 가능한 다른 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 및/또는 벡터에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드는 Addgene(비영리 플라스미드 저장소); GenScript®; Takara®; Qiagen®; 및 Promega™에서 이용 가능하다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 TVP 발현 카세트로 형질전환된 효모 세포는 효모 배양물에서 TVP를 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L, 또는 적어도 100,000 mg/L의 배지 리터당 TVP의 수율로 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트가 벡터로 삽입되어, TVP를 약 100 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 110 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 120 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 130 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 140 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 150 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 160 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 170 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 180 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 190 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 200 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 250 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 750 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 1000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 1000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 1500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 2000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 2500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 3000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 3500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 4000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 4500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 5000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 5500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 6000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 6500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 7000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 7500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 8000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 8500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 9000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 9500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 10000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 10500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 11000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 11500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 12000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 12500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 13000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 13500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 14000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 14500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 15000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 15500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 16000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 16500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 17000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 17500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 18000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 18500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 19000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 19500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 20000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 20500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 21000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 21500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 22000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 22500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 23000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 23500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 24000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 24500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 25000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 25500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 26000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 26500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 27000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 27500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 28000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 28500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 29000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 29500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 30000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 30500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 31000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 31500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 32000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 32500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 33000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 33500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 34000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 34500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 35000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 35500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 36000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 36500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 37000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 37500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 38000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 38500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 39000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 39500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 40000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 40500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 41000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 41500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 42000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 42500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 43000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 43500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 44000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 44500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 45000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 45500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 46000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 46500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 47000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 47500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 48000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 48500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 49000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 49500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 50000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 50500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 51000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 51500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 52000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 52500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 53000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 53500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 54000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 54500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 55000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 55500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 56000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 56500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 57000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 57500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 58000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 58500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 59000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 59500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 60000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 60500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 61000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 61500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 62000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 62500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 63000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 63500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 64000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 64500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 65000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 65500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 66000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 66500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 67000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 67500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 68000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 68500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 69000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 69500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 70000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 70500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 71000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 71500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 72000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 72500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 73000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 73500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 74000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 74500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 75000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 75500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 76000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 76500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 77000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 77500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 78000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 78500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 79000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 79500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 80000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 80500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 81000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 81500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 82000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 82500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 83000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 83500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 84000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 84500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 85000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 85500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 86000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 86500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 87000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 87500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 88000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 88500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 89000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 89500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 90000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 90500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 91000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 91500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 92000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 92500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 93000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 93500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 94000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 94500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 95000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 95500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 96000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 96500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 97000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 97500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 98000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 98500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 99000 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 또는 약 99500 mg/L 내지 약 100,000 mg/L의 배지(효모 발효 브로스의 상청액) 리터당 TVP 범위의 수율을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트가 벡터로 삽입되어, TVP를 약 100 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 99500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 99000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 98500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 98000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 97500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 97000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 96500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 96000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 95500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 95000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 94500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 94000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 93500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 93000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 92500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 92000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 91500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 91000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 90500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 90000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 89500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 89000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 88500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 88000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 87500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 87000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 86500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 86000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 85500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 85000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 84500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 84000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 83500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 83000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 82500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 82000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 81500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 81000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 80500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 80000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 79500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 79000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 78500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 78000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 77500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 77000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 76500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 76000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 75500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 75000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 74500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 74000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 73500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 73000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 72500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 72000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 71500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 71000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 70500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 70000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 69500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 69000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 68500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 68000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 67500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 67000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 66500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 66000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 65500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 65000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 64500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 64000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 63500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 63000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 62500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 62000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 61500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 61000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 60500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 60000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 59500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 59000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 58500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 58000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 57500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 57000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 56500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 56000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 55500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 55000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 54500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 54000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 53500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 53000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 52500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 52000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 51500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 51000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 50500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 50000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 49500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 49000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 48500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 48000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 47500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 47000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 46500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 46000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 45500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 45000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 44500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 44000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 43500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 43000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 42500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 42000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 41500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 41000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 40500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 40000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 39500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 39000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 38500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 38000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 37500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 37000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 36500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 36000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 35500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 35000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 34500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 34000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 33500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 33000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 32500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 32000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 31500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 31000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 30500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 30000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 29500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 29000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 28500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 28000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 27500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 27000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 26500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 26000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 25500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 25000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 24500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 24000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 23500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 23000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 22500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 22000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 21500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 21000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 20500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 20000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 19500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 19000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 18500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 18000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 17500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 17000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 16500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 16000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 15500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 15000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 14500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 14000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 13500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 13000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 12500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 12000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 11500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 11000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 10500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 10000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 9500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 9000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 8500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 8000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 7500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 7000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 6500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 6000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 5500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 5000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 4500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 4000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 3500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 3000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 2500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 2000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 1500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 1000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 1000 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 750 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 500 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 250 mg/L; 약 100 mg/L 내지 약 100 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 110 mg/L의 배지(효모 발효 브로스의 상청액) 리터당 TVP 범위의 수율을 생성할 수 있다.
TVP를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열에 더하여, 조절 요소로 알려진 추가 DNA 절편이 외래 DNA 또는 트랜스유전자의 향상된 발현을 허용하는 벡터로 클로닝될 수 있다; 이러한 추가 DNA 절편의 예는 (1) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (2) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (3) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (4) 인트론; 및 (5) 전사 후 조절 요소를 포함한다. 관심 DNA 절편(예를 들어 tvp)과 상기 시스 작용 요소 중 어느 하나의 조합을 "발현 카세트"라고 한다.
단일 발현 카세트는 전술한 조절 요소 중 하나 이상, 및 TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP 발현 카세트는 TVP 및 α-MF 신호를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드; Kex2 부위; LAC4 종결인자; ADN1 프로모터; 및 5'-단부 및 3'-단부에서 LAC4 프로모터가 측면에 배치된 아세트아미다제(amdS) 선택 마커를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터로 클로닝된 다수의 발현 카세트가 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트가 있을 수 있다. 대안적인 실시양태에서, TVP를 암호화하도록 작동 가능한 2개의 발현 카세트(즉, 이중 발현 카세트)가 있다. 다른 실시양태에서, TVP를 암호화하도록 작동 가능한 3개의 발현 카세트(즉, 삼중 발현 카세트)가 있다.
일부 실시양태에서, 이중 발현 카세트는 제2 TVP 발현 카세트를 제1 TVP 발현 카세트를 포함하는 벡터로 서브클로닝함으로써 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 삼중 발현 카세트는 제3 TVP 발현 카세트를 제1 및 제2 TVP 발현 카세트를 포함하는 벡터로 서브클로닝함으로써 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 TVP 발현 카세트로 형질전환된 효모 세포는 효모 배양물에서 TVP를 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L, 또는 적어도 100,000 mg/L의 효모 배양 배지 리터당 TVP의 수율로 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트는 벡터, 예를 들어 pKlac1 플라스미드에 삽입되어 약 100 mg/L의 TVP(효모 발효 브로스의 상청액)의 수율을 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2개의 발현 카세트는 벡터, 예를 들어 pKS482 플라스미드에 삽입되어 약 2 g/L의 TVP(효모 발효 브로스의 상청액)의 수율을 생성할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 3개의 발현 카세트가 벡터, 예를 들어 pKlac1T 플라스미드로 삽입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 최적화된 TVP 트랜스유전자의 하나 이상의 카피의 클루이베로마이세스 락티스 게놈으로의 통합을 가능하게 하기 위해 다중 TVP 발현 카세트가 효모로 형질감염될 수 있다. 다중 TVP 발현 카세트를 클루이베로마이세스 락티스 게놈으로 도입하는 예시적인 방법은 하기와 같다: 온전한 LAC4 프로모터 요소, 코돈 최적화된 TVP 발현 ORF 요소 및 pLAC4 종결인자 요소를 포함하는 TVP 발현 카세트 DNA 서열을 합성하고; 온전한 발현 카세트를 pKS477의 pLAC4 종결인자 하류의 Sal I 및 Kpn I 제한 부위 사이에서 pKlac1 벡터에 결찰하여 이중 트랜스유전자 TVP 발현 벡터, pKS482를 생성하고; 이어서 이중 트랜스유전자 벡터인 pKS482를 Sac II 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화하고 전기천공에 의해 클루이베로마이세스 락티스의 YCT306 균주로 형질전환한다. 생성 효모 콜로니는 아세트아미다제-발현 세포만 대사 질소원으로 효율적으로 사용할 수 있는, 5 mM 아세트아미드가 보충된 YCB 한천 플레이트 상에서 성장시킨다. 효모 콜로니를 평가하기 위해 pKS482 효모 플레이트에서 약 100 내지 400개 콜로니를 선택할 수 있다. 콜로니의 접종물은 각각 탄소원으로 2% 당 알코올이 첨가된 정의된 클루이베로마이세스 락티스 배지 2.2 mL에서 배양한다. 배양물을 280 rpm에서 진탕하면서 23.5℃에서 6일 동안 인큐베이션하며, 이 시점에서 배양물의 세포 밀도는 600 nm에서의 흡광도(OD600)에 의해 표시되는 최대 수준에 도달할 것이다. 이어서, 세포를 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배양물로부터 제거하고, 생성 상청액(조건화 배지)을 HPLC 수율 분석을 위해 0.2 μM 막을 통해 여과한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 서열과 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 벡터는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
TVP의 화학적 합성
펩티드 합성 또는 화학적 합성 또는 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 TVP를 생성하기 위해 사용될 수 있다: 이러한 방법은 당업자에 의해 및/또는 상업적 공급업체(예를 들어 GenScript®, Piscataway, New Jersey)의 사용을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화학적 펩티드 합성은 액상 펩티드 합성(LPPS) 또는 고상 펩티드 합성(SPPS)을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 합성은 일반적으로 자연에서 일어나는 폴리펩티드 합성 유형과 반대 공정인, 후속 아미노산의 카복실기를 선행 아미노산의 N-말단에 커플링하여 신생 폴리펩티드 사슬을 생성하는 전략을 사용함으로써 달성될 수 있다.
펩티드 탈보호는 폴리펩티드의 화학적 합성에서 중요한 첫 번째 단계이다. 펩티드 탈보호는 아미노산의 작용기가 원치 않거나 비특이적인 반응 또는 부반응에 참여하는 것을 방지하기 위해 화학 물질을 사용하여 아미노산의 반응성기를 차단하는 공정이다; 즉, 아미노산은 이러한 바람직하지 않은 반응에 참여하는 것으로부터 "보호"된다.
펩티드 사슬을 합성하기 전에, 아미노산은 사슬이 형성되도록(즉, 아미노산이 결합하도록) "탈보호"되어야 한다. N-말단을 보호하기 위해 사용되는 화학물질은 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 및 tert-부톡시카보닐(Boc)을 포함하며, 각각은 약한 염기(예를 들어 피페리딘) 및 중간 정도의 강산(예를 들어 트리플루오르아세트산(TFA)) 각각의 사용을 통해 제거될 수 있다.
필요한 C-말단 보호제는 사용된 화학적 펩티드 합성 전략의 유형에 의존한다: 예를 들어, LPPS는 C-말단 아미노산의 보호를 필요로 하는 반면 SPPS는 보호기로 작용하는 고체 지지체로 인해 이를 필요로 하지 않는다. 측쇄 아미노산은 개별 펩티드 서열 및 N-말단 보호 전략에 따라 변하는 몇몇 상이한 보호기의 사용을 필요로 한다; 그러나 전형적으로 측쇄 아미노산에 사용되는 보호기는 tert-부틸(tBu) 또는 벤질(Bzl) 보호기에 기반한다.
아미노산 커플링은 펩티드 합성 절차의 다음 단계이다. 아미노산 커플링을 수행하려면, 들어오는 아미노산의 C-말단 카복실산이 활성화되어야 한다: 이는 디이소프로필카보디이미드(DIC) 또는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)와 같은 카보디이미드를 사용하여 달성될 수 있고, 이는 들어오는 아미노산의 카복실기와 반응하여 O-아실이소우레아 중간체를 형성한다. O-아실이소우레아 중간체는 성장하는 펩티드 사슬의 N-말단에 있는 1차 아미노기를 통한 친핵성 공격을 통해 후속적으로 변위된다. 카보디이미드에 의해 생성된 반응성 중간체는 아미노산의 라세미화를 초래할 수 있다. 아미노산의 라세미화를 피하기 위해, O-아실리소우레아 중간체와 반응하기 위해 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)과 같은 시약이 첨가된다. 사용될 수 있는 다른 커플링제는 추가 활성화 염기와 함께 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 및 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 포함한다. 마지막으로, 아미노산 탈보호 및 커플링에 이어,
합성 공정이 끝나면, 폴리펩티드로부터의 보호기 제거-일반적으로 산분해를 통해 일어나는 공정-가 일어나야 한다. 펩티드 절단에 필요한 시약을 결정하는 것은 사용된 보호 체계 및 전체 합성 방법의 함수이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 브롬화수소(HBr); 불화수소(HF); 또는 트리플루오로메탄 설폰산(TFMSA)은 Bzl 및 Boc 기를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 실시양태에서, TFA와 같은 덜 강력한 산이 tBut 및 Fmoc 기의 산분해를 일으킬 수 있다. 마지막으로, 펩티드는 펩티드의 물리화학적 특성(예를 들어 전하, 크기, 소수성 등)에 기반하여 정제될 수 있다. 펩티드를 정제하기 위해 사용할 수 있는 기술은 다음을 포함하며 정제 기술은 역상 크로마토그래피(RPC); 크기 배제 크로마토그래피; 분할 크로마토그래피; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 및 이온 교환 크로마토그래피(IEC)를 포함한다.
예시적인 펩티드 합성 방법은 그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌(Anderson G. W. and McGregor A. C. (1957) T-butyloxycarbonylamino acids and their use in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 79, 6180-3; Carpino L. A. (1957) Oxidative reactions of hydrazines. Iv. Elimination of nitrogen from 1, 1-disubstituted-2-arenesulfonhydrazides1-4. Journal of the American Chemical Society. 79, 4427-31; McKay F. C. and Albertson N. F. (1957) New amine-masking groups for peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 79, 4686-90; Merrifield R. B. (1963) Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85, 2149-54; Carpino L. A. and Han G. Y. (1972) 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. The Journal of Organic Chemistry. 37, 3404-9; 및 A Lloyd-Williams P. et al. (1997) Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins. Boca Raton: CRC Press. 278; 미국 특허 번호: 3,714,140(1971년 3월 16일 출원); 4,411,994(1978년 6월 8일 출원); 7,785,832(2006년 1월 20일 출원); 8,314,208(2006년 2월 10일 출원); 및 10,442,834(2015년 10월 2일 출원); 및 미국 특허 출원 2005/0165215(2004년 12월 23일 출원))에서 찾을 수 있다.
예시적 방법
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하며; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계,
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하며; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하며; TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하며; 벡터는 알파-MF 신호를 포함하는 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 알파-MF 신호는 알파-MF 신호 펩티드를 발현하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하며; 벡터는 숙주 세포로 형질전환된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 효모 세포이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아(Yarrowia) 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 임의의 종으로부터 선택된 효모 세포이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 성장 배지로 분비된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 성장 배지로 분비되고, TVP는 알파-MF 신호 펩티드에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP의 발현은 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 또는 적어도 100,000 mg/L의 효모 배양 배지 리터당 TVP의 수율을 제공한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP의 발현은 적어도 100 mg/L의 배지 리터당 TVP 수율을 제공한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 배지에서 TVP의 발현은 배지에서 단일 TVP의 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 배지에서 TVP의 발현은 배지에서 2개 이상의 TVP 폴리펩티드를 포함하는 TVP 융합 중합체의 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 TVP, 또는 상이한 발현 카세트의 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 발현 카세트는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP 살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; X1은 Q이고; Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 벡터는 알파-MF 신호를 포함하는 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 알파-MF 신호는 알파-MF 신호 펩티드를 발현하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 벡터는 숙주 세포로 형질전환된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 효모 세포이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하며; 숙주 세포는 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종으로부터 선택된 효모 세포이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 숙주 세포는 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스이다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 성장 배지로 분비된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 알파-MF 신호 펩티드에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP의 발현은 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 적어도 6,000 mg/ L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/ L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 또는 적어도 100,000 mg/L의 효모 배양 배지 리터당 TVP의 수율을 제공한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP의 발현은 적어도 100 mg/L의 배지 리터당 TVP의 수율을 제공한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 배지에서 TVP의 발현은 배지에서 단일 TVP의 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 배지에서 TVP의 발현은 배지에서 2개 이상의 TVP 폴리펩티드를 포함하는 TVP 융합 중합체의 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 TVP, 또는 상이한 발현 카세트의 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; 발현 카세트는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 TVP를 암호화하도록 작동 가능하다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하는 방법은 (a) 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) TVP의 발현을 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하고; X1은 Q이고; Z1은 A이다.
세포 배양 및 형질전환 기술
용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 모두 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA를 숙주 유기체에 도입하는 공정을 설명한다. 일반적으로, 당업자는 때때로 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA가 박테리아 세포로 도입되는 공정을 설명하기 위해 용어 "형질전환"을 사용하고; 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA를 진핵생물 세포로 도입하는 것을 설명하는 공정에 대해 "형질감염"을 사용한다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 공정이 외인성 및/또는 이종성 DNA 또는 RNA의 원핵생물(예를 들어 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들어 효모, 식물 또는 동물)로의 도입을 설명하는지와 무관하게, 동의어로 사용된다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 하기 방법: 전기천공; 세포 압착; 미세주사; 임페일펙션(impalefection); 정수압의 사용; 초음파천공; 광학 형질감염; 연속 주사; 리포펙션; 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스의 사용을 통해; 화학적 인산염 방법; DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI)을 통한 세포내이입; 원형질체 융합; 유체역학적 전달; 자기감염(magnetofection); 핵감염; 및/또는 등을 사용하여 형질전환될 수 있다. 형질감염 및/또는 형질전환 기술에 관한 예시적인 방법은 문헌(Makrides (2003), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elvesier; Wong, TK & Neumann, E. Electric field mediated gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 584-587 (1982); Potter & Heller, Transfection by Electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 2003 May; CHAPTER: Unit-9.3; Kim & Eberwine, Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 2010 Aug; 397(8): 3173-3178)에서 찾을 수 있으며, 이들 각각의 참고문헌은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
전기천공은 세포에 전기를 가하여 세포막이 투과성이 되도록 유발하는 기술이다; 이는 다시 외인성 DNA가 세포에 도입되도록 한다. 전기천공은 당업자에게 쉽게 알려져 있으며 전기천공을 달성하는 데 필요한 도구 및 장치는 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어 Gene Pulser Xcell™ Electroporation Systems, Bio-Rad®; Neon® Transfection System for Electroporation, Thermo-Fisher Scientific 및 기타 도구 및/또는 장치). 예시적인 전기천공 방법은 문헌(Potter & Heller, Transfection by Electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 2003 May; CHAPTER: Unit-9.3; Saito (2015) Electroporation Methods in Neuroscience. Springer press; Pakhomov et al., (2017) Advanced Electroporation Techniques in Biology and Medicine. Taylor & Francis)에 예시되어 있고; 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 전기천공은 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 효모로 도입하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, pKlac1 플라스미드로 클로닝되고 전기천공을 통해 클루이베로마이세스 락티스 세포로 형질전환된 TVP는 약 10-200 mL의 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YEPD)에 적합한 효모 종, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시애, 피치아 파스토리스 등을 접종하고 효모 배양물의 초기 지수 단계(예를 들어 약 0.6 내지 2 x 108 세포/mL)까지 30℃에서 진탕기 상에서 인큐베이션하고; 멸균 원심분리 튜브에 효모를 수확하고 4℃에서 5분 동안 3000 rpm으로 원심분리하고(주: 절차 동안 세포를 차갑게 유지함) 40 mL의 빙냉 멸균 탈이온수로 세포를 세척하고, 5분 동안 23,000 rpm으로 세포를 펠렛화하고; 세척 단계를 반복하고, 20 mL의 1 M 발효 가능 당, 예를 들어 갈락토스, 말토스, 라토트리오스, 수크로스, 프룩토스 또는 글루코스 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소화 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨에 세포를 재현탁한 후 5분 동안 3,000 rpm에서 회전침강시키고; 세포를 적절한 부피의 빙냉 1 M 발효 가능 당, 예를 들어 갈락토스, 말토스, 라토트리오스, 수크로스, 프룩토스 또는 글루코스 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소화 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨, 및 자일리톨로 3x109 세포/mL의 최종 세포 밀도로 재현탁하고; 미리 냉각된 0.2 cm 전기천공 큐벳에서 TVP를 암호화하는 선형 폴리뉴클레오티드(약 1 μg)를 포함하는 벡터 약 1-4 μL와 효모 현탁액 40 μL를 혼합하고(주: 샘플이 알루미늄 큐벳의 양면과 접촉하도록 함); RC 회로의 5 ms 최적 시간 상수로, 2000 V에서 단일 펄스를 제공하고, 세포를 0.5 ml YED 및 0.5 ml 1 M 발효 가능 당, 예를 들어 갈락토스, 말토스, 라토트리오스, 수크로스, 프룩토스 또는 글루코스 및/또는 당 알코올, 예를 들어, 에리트리톨, 수소화 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨 혼합물에서 회수한 후, 선택 플레이트 상에 퍼트림으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기천공은 원형질체 용액(예를 들어, 약 8 mL의 10 mM 2-[N-모르폴리노]에탄설폰산(MES), pH 5.5, 0.01%(w/v) 펙틸라제, 1%(w/v) 마세로자임, 40 mM CaCl2 및 0.4 M 만니톨)에서 멸균 식물 물질을 인큐베이션하고 혼합물을 30℃에서 약 3 내지 6시간 동안 회전 진탕기에 첨가하여 원형질체를 생산하고; 80-μm 메쉬 나일론 스크린 여과를 통해 파편을 제거하고; 약 4 ml 식물 전기천공 완충액(예를 들어, 5 mM CaCl2; 0.4 M 만니톨; 및 PBS)으로 스크린을 헹구고; 멸균 15 mL 원추형 원심분리 튜브에서 원형질체를 조합한 다음, 약 5분 동안 약 300 x g에서 원심분리하고, 원심분리 후 상청액을 버리고 식물 전기천공 완충액 5 mL로 세척하고, 액체 mL당 약 1.5 x 106 내지 2 x 106 원형질체로 식물 전기천공 완충액에 원형질체를 재현탁하고; 원형질체 현탁액 약 0.5 mL를 얼음 위에 고정한 하나 이상의 전기천공 큐벳에 옮기고 벡터를 첨가하고(주: 안정한 형질전환을 위해, 벡터는 위에서 기재된 제한 방법 중 어느 하나를 사용하여 선형화되어야 하며 약 1-10 μg의 벡터가 사용될 수 있고; 일시적 발현을 위해, 벡터는 그 초나선 상태로 유지될 수 있고, 약 10 내지 40 μg의 벡터가 사용될 수 있음); 벡터와 원형질체 현탁액을 혼합하고; 큐벳을 전기천공 기구에 넣고 약 1-2 kV에서 한 번 이상 충격을 가하고(반응을 최적화하는 동안 초기에 3-25 μF 정전용량이 사용될 수 있음); 큐벳을 얼음으로 되돌리고; 형질전환된 세포를 완전 배지에서 20배 희석하고; 약 48시간 후에 원형질체를 수확함으로써 식물 원형질체로 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 방법, 조성물 및 TVP는 임의의 세포 유형, 예를 들어 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 구현될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 원핵생물이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 고세균(Archaebacteria) 또는 유박테리아(Eubacteria)일 수 있다. 유용한 박테리아의 예는 에스체리키아(Escherichia)(예를 들어, 대장균), 바실러스(Bacilli)(예를 들어, 고초균(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종(예를 들어, 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 단세포 세포일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그람 양성 박테리아와 같은 박테리아 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 칸디다투스 클로르애시도박테리움(Candidatus Chloracidobacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프란키아(Frankia), 마이크로코커스 ( Micrococcus), 미코박테리움(Mycobacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴펙스 박테로이데스(Aquifex Bacteroides), 포르피로모나스(Porphyromonas), 박테로이데스(Bacteroides), 포르피로모나스(Porphyromonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 클라미디아(Chlamydia), 프로스테코박터(Prosthecobacter), 베루코마이크로비움(Verrucomicrobium), 클로로플렉서스(Chloroflexus), 크루코커스(Chroococcus), 메리스모페디아(Merismopedia), 시네코코커스(Synechococcus), 아나배나(Anabaena), 노스톡(Nostoc), 스피룰리나(Spirulina), 트리코데스미움(Trichodesmium), 플레우로캅사(Pleurocapsa), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 프로클로론(Prochloron), 바실러스, 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스, 클로스트리디움(Clostridium), 데할로박터(Dehalobacter), 에풀로피시움(Epulopiscium), 루미노코커스(Ruminococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 미코플라즈마(Mycoplasma), 렙토스피릴룸(Leptospirillum), 니트로스피라(Nitrospira), 써모데설포박테리움(Thermodesulfobacterium), 젬마타(Gemmata), 피렐룰라(Pirellula), 플랑크토마이세스(Planctomyces), 카울로박터(Caulobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 브래디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 프로스테코마이크로비움(Prosthecomicrobium), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 시노리조비움(Sinorhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 로세오박터(Roseobacter), 아세토박터(Acetobacter), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 리케챠(Rickettsia), 리케챠 코노리이(Rickettsia conorii), 미토콘드리아(Mitochondria), 볼바치아(Wolbachia), 에리트로박터(Erythrobacter), 에리트로마이크로비움(Erythromicrobium), 스핑고모나스(Sphingomonas), 알칼리게네스(Alcaligenes), 부르크홀데리아(Burkholderia), 렙토트릭스(Leptothrix), 스패로틸러스(Sphaerotilus), 티오바실러스(Thiobacillus), 나이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 갈리오넬라(Gallionella), 스피릴룸(Spirillum), 아조아르쿠스(Azoarcus), 애로모나스(Aeromonas), 숙시노모나스(Succinomonas), 숙시니비브리오(Succinivibrio), 루미노박터(Ruminobacter), 니트로소코커스(Nitrosococcus), 티오캅사(Thiocapsa), 엔테로박터(Enterobacter), 에스체리키아, 클렙시엘라, 살모넬라, 시겔라, 위글워티아(Wigglesworthia), 예르시니아(Yersinia), 콕시엘라(Coxiella), 레지오넬라(Legionella), 할로모나스(Halomonas), 파스퇴렐라(Pasteurella), 아시네토박터(Acinetobacter), 아조토박터(Azotobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 베기아토아(Beggiatoa), 티오마르가리타(Thiomargarita), 비브리오(Vibrio), 잔토모나스(Xanthomonas), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 캄필로박터(Campylobacter), 헬리코박터(Helicobacter), 믹소코커스(Myxococcus), 데설포사르시나(Desulfosarcina), 지오박터(Geobacter), 데설푸로모나스(Desulfuromonas), 보렐리아(Borrelia), 렙토스피라(Leptospira), 트레포네마(Treponema), 페트로토가(Petrotoga), 써모토가(Thermotoga), 데이노코커스(Deinococcus), 또는 써무스(Thermus)로 구성되는 속으로부터 선택된 박테리아일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 하기 박테리아 종: 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 써쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 고초균, 바실러스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 뮤리너스(Streptomyces murinus), 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 알비칸스(Streptomyces albicans), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 플리카토스포러스(Streptomyces plicatosporus), 에스체리키아 알베르티이(Escherichia albertii), 에스체리키아 블라태(Escherichia blattae), 대장균, 에스체리키아 퍼구소니이(Escherichia fergusonii), 에스체리키아 헤르만니이(Escherichia hermannii), 에스체리키아 세네갈렌시스(Escherichia senegalensis), 에스체리키아 불네리스(Escherichia vulneris), 슈도모나스 아비에타니필라(Pseudomonas abietaniphila), 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici), 슈도모나스 아가로라이티쿠스(Pseudomonas agarolyticus), 슈도모나스 알칼리필라(Pseudomonas alcaliphila), 슈도모나스 알기노보라(Pseudomonas alginovora), 슈도모나스 안데르소니이(Pseudomonas andersonii), 슈도모나스 안탁티카(Pseudomonas antarctica), 슈도모나스 아스플레니이(Pseudomonas asplenii), 슈도모나스 아젤라이카(Pseudomonas azelaica), 슈도모나스 바투미시(Pseudomonas batumici), 슈도모나스 보레알리스(Pseudomonas borealis), 슈도모나스 브라시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum), 슈도모나스 클로리티디스무탄스(Pseudomonas chloritidismutans), 슈도모나스 크레모리컬러라타(Pseudomonas cremoricolorata), 슈도모나스 디테르페니필라(Pseudomonas diterpeniphila), 슈도모나스 필리신덴스(Pseudomonas filiscindens), 슈도모나스 프레데릭스베르겐시스(Pseudomonas frederiksbergensis), 슈도모나스 진제리(Pseudomonas gingeri), 슈도모나스 그나미니스(Pseudomonas graminis), 슈도모나스 그리몬티이(Pseudomonas grimontii), 슈도모나스 할로데니트리피칸스(Pseudomonas halodenitrificans), 슈도모나스 할로필라(Pseudomonas halophila), 슈도모나스 히비스시콜라(Pseudomonas hibiscicola), 슈도모나스 하이드로게노보라(Pseudomonas hydrogenovora), 슈도모나스 인디카(Pseudomonas indica), 슈도모나스 자포니카(Pseudomonas japonica), 슈도모나스 제세니이(Pseudomonas jessenii), 슈도모나스 킬로넨시스(Pseudomonas kilonensis), 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis), 슈도모나스 리니(Pseudomonas lini), 슈도모나스 루리다(Pseudomonas lurida), 슈도모나스 루테아(Pseudomonas lutea), 슈도모나스 마르기나타(Pseudomonas marginata), 슈도모나스 메리디아나(Pseudomonas meridiana), 슈도모나스 메조애시도필라(Pseudomonas mesoacidophila), 슈도모나스 파카스트렐래(Pseudomonas pachastrellae), 슈도모나스 팔레로니아나(Pseudomonas palleroniana), 슈도모나스 파라풀바(Pseudomonas parafulva), 슈도모나스 파보난세애(Pseudomonas pavonanceae), 슈도모나스 프로테오라이카(Pseudomonas proteolyica), 슈도모나스 사이크로필라(Pseudomonas psychrophila), 슈도모나스 사이크로톨레란스(Pseudomonas psychrotolerans), 슈도모나스 푸디카(Pseudomonas pudica), 슈도모나스 라토니스(Pseudomonas rathonis), 슈도모나스 레악탄스(Pseudomonas reactans), 슈도모나스 리조스패래(Pseudomonas rhizosphaerae), 슈도모나스 살모노니이(Pseudomonas salmononii), 슈도모나스 써매룸(Pseudomonas thermaerum), 슈도모나스 써모카복시도보란스(Pseudomonas thermocarboxydovorans), 슈도모나스 써모톨레란스(Pseudomonas thermotolerans), 슈도모나스 티베발렌시스(Pseudomonas thivervalensis), 슈도모나스 움손겐시스(Pseudomonas umsongensis), 슈도모나스 반쿠베렌시스(Pseudomonas vancouverensis), 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis), 슈도모나스 잔토마리나(Pseudomonas xanthomarina) 슈도모나스 시아메넨시스(Pseudomonas xiamenensis), 슈도모나스 애루기노사, 슈도모나스 알칼리게네스(Pseudomonas alcaligenes), 슈도모나스 안귈리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 시트로넬로리스(Pseudomonas citronellolis), 슈도모나스 플라베센스(Pseudomonas flavescens), 슈도모나스 진주엔시스(Pseudomonas jinjuensis), 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 니트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans), 슈도모나스 스트라미내(Pseudomonas straminae), 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi), 슈도모나스 루덴시스(Pseudomonas lundensis), 슈도모나스 태트롤렌스(Pseudomonas taetrolens) 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 브렌네리(Pseudomonas brenneri), 슈도모나스 세드리나(Pseudomonas cedrina), 슈도모나스 콘겔란스(Pseudomonas congelans), 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata), 슈도모나스 코스탄티니이(Pseudomonas costantinii), 슈도모나스 엑스트렘오리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 풀기다(Pseudomonas fulgida), 슈도모나스 게사르디이(Pseudomonas gessardii), 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis), 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii), 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis), 슈도모나스 메디테라네아(Pseudomonas mediterranea), 슈도모나스 미굴래(Pseudomonas migulae), 슈도모나스 뮤시돌렌스(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis), 슈도모나스 포애(Pseudomonas poae), 슈도모나스 로데시애(Pseudomonas rhodesiae), 슈도모나스 신잔타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 톨라아시이(Pseudomonas tolaasii), 슈도모나스 트리비알리스(Pseudomonas trivialis), 슈도모나스 베로니이(Pseudomonas veronii) 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans), 슈도모나스 퍼투시노게나(Pseudomonas pertucinogena), 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva), 슈도모나스 몬테일리이(Pseudomonas monteilii), 슈도모나스 모셀리이(Pseudomonas mosselii), 슈도모나스 오리지하비탄스(Pseudomonas oryzihabitans), 슈도모나스 플레코글로씨시다(Pseudomonas plecoglossicida), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 발레아리카(Pseudomonas balearica), 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola), 또는 슈도모나스 스툿제리(Pseudomonas stutzeri). 슈도모나스 아벨라내(Pseudomonas avellanae), 슈도모나스 칸나비나(Pseudomonas cannabina), 슈도모나스 카리카파피애(Pseudomonas caricapapyae), 슈도모나스 시코리이(Pseudomonas cichorii), 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens), 슈도모나스 푸스코바지내(Pseudomonas fuscovaginae), 슈도모나스 트레매(Pseudomonas tremae), 또는 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava) 중 하나로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 진핵생물일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다음 계통군: 후편모생물(Opisthokonta); 녹색식물(Viridiplantae)(예를 들어 조류 및 식물); 아메바류(Amebozoa); 사족충류(Cercozoa); 피하낭류(Alveolata); 해양 편모충류(Marine flagellates); 부등편모조류(Heterokonta); 반상크리스타류(Discicristata); 또는 엑스카바타(Excavata)에 속하는 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은, 예를 들어, 후생동물, 동정편모충류(Choanoflagellata), 또는 진균인, 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 문: 자낭균문(Ascomycota), 담자균류(Basidiomycota), 호상균류(Chytridiomycota), 미포자충균(Microsporidia), 또는 접합균류(Zygomycota)에 속하는 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 하기 속: 아스페르길러스, 클라도스포리움(Cladosporium), 마그나포르테(Magnaporthe), 모르첼라(Morchella), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 사카로마이세스, 크립토코커스(Cryptococcus), 또는 우스틸라고(Ustilago) 중 하나에 속하는 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 하기 종: 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 불라디(Saccharomyces boulardi), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum); 아스페르길러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길러스 테레우스(A. terreus), 아스페르길러스 아와모리(A. awamori); 클라도스포리움 엘라툼(Cladosporium elatum), 클라도스포리움 허바룸(Cl. Herbarum), 클라도스포리움 스패로스페르뭄(Cl. Sphaerospermum), 및 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cl. Cladosporioides); 마그나포르테 그리세(Magnaporthe grise), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 마그나포르테 리조필라(Magnaporthe rhizophila); 모르첼라 델리시오사(Morchella deliciosa), 모르첼라 에스컬렌타(Morchella esculenta), 모르첼라 코니카(Morchella conica); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 뉴로스포라 인터메디아(Neurospora intermedia), 뉴로스포라 테트라스페르마(Neurospora tetrasperma); 페리실리움 노타툼(Penicillium notatum), 페리실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페리실리움 로퀘포르티이(Penicillium roquefortii), 페리실리움 심플리시씨뭄(Penicillium simplicissimum) 중 하나에 속하는 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비지애 또는 피치아 파스토리스인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 하기 속: 아스페르길러스, 클라도스포리움, 마그나포르테, 모르첼라, 뉴로스포라, 페니실리움, 사카로마이세스, 크립토코커스, 또는 우스틸라고 중 하나에 속하는 진균일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 사카로마이세스과의 구성원일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 사카로마이세스과과 내의 하기 속: 브레타노마이세스(Brettanomyces), 칸디다(Candida), 시테로마이세스(Citeromyces), 시니클로마이세스(Cyniclomyces), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 이싸첸키아(Issatchenkia), 카자흐스타니아(Kazachstania), 클루베로마이세스, 코마가탤라(Komagataella), 쿠라이시아(Kuraishia), 라찬세아(Lachancea), 로데로마이세스(Lodderomyces), 나카세오마이세스(Nakaseomyces), 파키솔렌(Pachysolen), 피치아, 사카로마이세스, 스파타스포라(Spathaspora), 테트라피시스포라(Tetrapisispora), 반데르발토자이마(Vanderwaltozyma), 토룰라스포라(Torulaspora), 윌리옵시스(Williopsis), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 또는 자이고토룰라스포라(Zygotorulaspora) 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 하기: 아스페르길러스 플라부스, 아스페르길러스 테레우스, 아스페르길러스 아와모리, 클라도스포리움 엘라툼, 클라도스포리움 허바룸, 클라도스포리움 스패로스페르뭄, 클라도스포리움 클라도스포리오이데스, 마그나포르테 그리세, 마그나포르테 오리재, 마그나포르테 리조필라, 모르첼라 델리시오사, 모르첼라 에스컬렌타, 모르첼라 코니카, 뉴로스포라 크라싸, 뉴로스포라 인터메디아, 뉴로스포라 테트라스페르마, 페리실리움 노타툼, 페리실리움 크리소게눔, 페리실리움 로퀘포르티이, 페리실리움 심플리시씨뭄 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 칸디다 속의 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기: 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아스칼라피다룸(Candida ascalaphidarum), 칸디다 앰픽시애(Candida amphixiae), 칸디다 안탁티카(Candida antarctica), 칸디다 아르젠테아(Candida argentea), 칸디다 아틀란티카(Candida atlantica), 칸디다 애트모스패리카(Candida atmosphaerica), 칸디다 아우리스(Candida auris), 칸디다 블랑키이(Candida blankii), 칸디다 블라태(Candida blattae), 칸디다 브라카렌시스(Candida bracarensis), 칸디다 브로멜리아세아룸(Candida bromeliacearum), 칸디다 카르포필라(Candida carpophila), 칸디다 카르바잘리스(Candida carvajalis), 칸디다 세람바이시다룸(Candida cerambycidarum), 칸디다 카울리오데스(Candida chauliodes), 칸디다 코리달리스(Candida corydalis), 칸디다 도세이이(Candida dosseyi), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 에르가텐시스(Candida ergatensis), 칸디다 프룩투스(Candida fructus), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 페르멘타티(Candida fermentati), 칸디다 귈리에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 해물로니이(Candida haemulonii), 칸디다 후밀리스(Candida humilis), 칸디다 인섹타멘스(Candida insectamens), 칸디다 인섹토룸(Candida insectorum), 칸디다 인터메디아(Candida intermedia), 칸디다 제프레시이(Candida jeffresii), 또는 칸디다 케피르(Candida kefyr) 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 클루이베로마이세스 속의 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기: 클루이베로마이세스 애스투아리이(Kluyveromyces aestuarii), 클루이베로마이세스 도브잔스키이(Kluyveromyces dobzhanskii), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 클루이베로마이세스 논페르멘탄스(Kluyveromyces nonfermentans), 또는 클루이베로마이세스 위케르하미이(Kluyveromyces wickerhamii) 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 피치아 속의 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기: 피치아 파리노세(Pichia farinose), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 히디이(Pichia heedii), 피치아 귈리에르몬디이(Pichia guilliermondii), 피치아 클로이베리(Pichia kluyveri), 피치아 멤브라니파시엔스(Pichia membranifaciens), 피치아 노르베겐시스(Pichia norvegensis), 피치아 오메리(Pichia ohmeri), 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 또는 피치아 서브펠리쿨로사(Pichia subpelliculosa) 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 사카로마이세스 속의 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기: 사카로마이세스 아르보리콜루스(Saccharomyces arboricolus), 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(Saccharomyces cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스(Saccharomyces cariocus), 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 세레비시애 var 불라디이, 사카로마이세스 체발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(Saccharomyces dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus), 사카로마이세스 엑시구오우스(Saccharomyces exiguous), 사카로마이세스 플루렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이세스 쿠드리아브제비이(Saccharomyces kudriavzevii), 사카로마이세스 마르티니애(Saccharomyces martiniae), 사카로마이세스 미카태(Saccharomyces mikatae), 사카로마이세스 모나센시스(Saccharomyces monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 스펜세로룸(Saccharomyces spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스(Saccharomyces turicensis), 사카로마이세스 우니스포러스(Saccharomyces unisporus), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스(Saccharomyces zonatus) 중 하나일 수 있다.
TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 하기: 사카로마이세스 세레비지애, 피치아 파스토리스, 피치아 메탄올리카, 스키조사카로마이세스 폼베, 또는 한세눌라 아노말라 중 하나일 수 있다.
재조합 TVP를 생성하기 위한 숙주 유기체로서 효모 세포의 사용은 당업자에게 잘 알려진 예외적인 방법이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 쉬조사카로마이세스 속의 임의의 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종의 효모를 사용하여 수행될 수 있고, 사카로마이세스 종은 사카로마이세스의 임의의 종, 예를 들어 하기 균주: INVSc1, YNN27, S150-2B, W303-1B, CG25, W3124, JRY188, BJ5464, AH22, GRF18, W303-1A 및 BJ3505로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비지애 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피치아의 임의의 종, 예를 들어 피치아 종, 피치아 파스토리스를 포함하는 피치아 종의 구성원, 예를 들어 피치아 파스토리스는 하기 균주: Bg08, Y-11430, X-33, GS115, GS190, JC220, JC254, GS200, JC227, JC300, JC301, JC302, JC303, JC304, JC305, JC306, JC307, JC308, YJN165, KM71, MC100-3, SMD1163, SMD1165, SMD1168, GS241, MS105, 임의의 pep4 녹아웃 균주 및 임의의 prb1 녹아웃 균주뿐만 아니라 하기 균주: Bg08, X-33, SMD1168 및 KM71로부터 선택되는 피치아 파스토리스로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 클루이베로마이세스의 임의의 종, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스를 포함하는 임의의 클루이베로마이세스 종이 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있으며, 본 발명자들은 클루이베로마이세스 락티스 균주가 하기 균주: GG799, YCT306, YCT284, YCT389, YCT390, YCT569, YCT598, NRRL Y-1140, MW98-8C, MS1, CBS293.91, Y721, MD2/1, PM6-7A, WM37, K6, K7, 22AR1, 22A295-1, SD11, MG1/2, MSK110, JA6, CMK5, HP101, HP108 및 PM6-3C로부터 선택될 수 있지만 이것이 요구되는 것은 아님을 교시하며, 또한 클루이베로마이세스 락티스 종은 GG799, YCT306 및 NRRL Y-1140로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 아스페르길러스 오리재(Aspergillus oryzae)일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 아스페르길러스 자포니카스(Aspergillus japonicas)일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger)일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 고초균일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 한세눌라의 임의의 종 및 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 포함하는 한세눌라 종의 임의의 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 효모인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 임의의 종의 야로위아 종의, 예를 들어, 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 임의의 종의 효모를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 임의의 종의 스키조사카로마이세스, 바람직하게는 스키조사카로마이세스 폼베를 포함하는 스키조사카로마이세스 종의 임의의 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 임의의 종의 효모를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 클루이베로마이세스 락티스, 사카로마이세스 세레비지애, 피치아 파스토리스 등과 같은 효모 종이 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 효모 세포 배양 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 효모 세포 배양 방법은 문헌(Evans, Yeast Protocols. Springer (1996); Bill, Recombinant Protein Production in Yeast. Springer (2012); Hagan et al., Fission Yeast: A Laboratory Manual, CSH Press (2016); Konishi et al., Improvement of the transformation efficiency of Saccharomyces cerevisiae by altering carbon sources in pre-culture. Biosci Biotechnol Biochem. 2014; 78(6):1090-3; Dymond, Saccharomyces cerevisiae growth media. Methods Enzymol. 2013; 533:191-204; Looke et al., Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011 May; 50(5):325-8; 및 Romanos et al., Culture of yeast for the production of heterologous proteins. Curr Protoc Cell Biol. 2014 Sep 2; 64:20.9.1-16)에서 찾을 수 있고, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
효모 세포 발효 배지 및 스톡을 위한 레시피는 하기와 같이 기재된다: (1) MSM 배지 레시피: 2 g/L 시트르산나트륨 2수화물; 1 g/L 황산칼슘 2수화물(0.79 g/L 무수 황산칼슘); 42.9 g/L 일염기성 인산칼륨; 5.17 g/L 황산암모늄; 14.33 g/L 황산칼륨; 11.7 g/L 황산마그네슘 7수화물; 2 mL/L PTM1 미량 염 용액; 0.4 ppm 비오틴(500X, 200 ppm 스톡으로부터); 1-2% 순수 글리세롤 또는 기타 탄소원. (2) PTM1 미량 염 용액: 황산구리-5H2O 6.0 g; 요오드화나트륨 0.08 g; 황산망간-H2O 3.0 g; 몰리브덴산나트륨-2H2O 0.2 g; 붕산 0.02 g; 염화코발트 0.5 g; 염화아연 20.0 g; 황산제일철-7H2O 65.0 g; 비오틴 0.2 g; 황산 5.0 ml; 물을 1리터의 최종 부피가 되도록 첨가한다. 클루이베로마이세스 락티스 정의 배지(DMSor)에 대한 예시적인 조성은 하기와 같다: 11.83 g/L KH2PO4, 2.299 g/L K2HPO4, 20 g/L의 발효 가능 당, 예를 들어 갈락토스, 말토스, 라토트리오스, 수크로스, 프룩토스 또는 글루코스 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소화 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨, 1 g/L MgSO4.7H2O, 10 g/L (NH4)SO4, 0.33 g/L CaCl2.2H2O, 1 g/L NaCl, 1 g/L KCl, 5 mg/L CuSO4.5H2O, 30 mg/L MnSO4.H2O, 10 mg/L, ZnCl2, 1 mg/L KI, 2 mg/L CoCl2.6H2O, 8 mg/L Na2MoO4.2H2O, 0.4 mg/L H3BO3, 15 mg/L FeCl3.6H2O, 0.8 mg/L 비오틴, 20 mg/L 판토텐산-Ca, 15 mg/L 티아민, 16 mg/L 미오-이노시톨, 10 mg/L 니코틴산 및 4 mg/L 피리독신.
효모 세포는 48웰 딥-웰 플레이트에서 배양할 수 있으며, 접종 후 멸균된 공기 투과성 덮개로 밀봉한다. 예를 들어, 플레이트 상에서 배양된 클루이베로마이세스 락티스와 같은 효모의 콜로니를 골라 딥-웰 플레이트에 DMSor로 이루어진 웰당 2.2 mL 배지를 접종할 수 있다. 접종된 딥-웰 플레이트는 냉장 인큐베이터 진탕기에서 280 rpm으로 진탕하며 23.5℃에서 6일 동안 성장시킬 수 있다. 접종 후 6일째에, 조건화 배지를 10분 동안 4000 rpm에서 원심분리하여 수확한 후, 0.22 μM 막이 있는 필터 플레이트를 사용하여 여과하고, 여과된 배지로 HPLC 분석을 거친다.
예시적인 효모 균주
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 하기: TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 효모 균주는 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 효모 균주 효모 세포는 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비지애, 및 피치아 파스토리스로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 효모 균주는 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스이다.
화학식 II
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다).
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); X1은 Q이고; Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 효모 균주는 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 효모 균주 효모 세포는 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비지애, 및 피치아 파스토리스로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 균주는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 효모 균주는 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스이다.
효모 형질전환, TVP 정제 및 분석
예시적인 효모 형질전환 방법은 하기와 같다: TVP 발현 ORF를 운반하는 발현 벡터를 효모 세포로 형질전환한다. 첫 번째로, 발현 벡터는 일반적으로 상동 재조합을 통한 염색체 통합을 촉진하기 위해 특정 제한 효소 절단에 의해 선형화한다. 그 다음 선형 발현 벡터를 화학적 또는 전기천공 형질전환 방법에 의해 효모 세포로 형질전환하고 상동 재조합에 의해 효모 게놈의 표적 유전자좌로 통합시킨다. 통합은 동일한 염색체 유전자좌에서 여러 번 발생할 수 있다; 따라서 형질전환된 효모 세포의 게놈은 TVP 발현 카세트의 여러 카피를 포함할 수 있다. 성공적으로 형질전환된 효모 세포는 발현 벡터로 조작되고 TVP 발현 ORF와 함께 효모 염색체에 공동 통합된 선택 마커를 선호하는 성장 조건 하에 확인할 수 있다; 이러한 마커의 예는 아세트아미드 기본영양, 제오신 내성, 제네티신 내성, 노르세오트리신 내성 및 우라실 기본영양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
유전자의 후성적 변형 및 유전자 네트워크, 그리고 형질전환 절차를 거치는 집단의 개별 세포에서 발생하는 통합 이벤트 수의 변동과 같은 예측할 수 없고 가변적인 요인의 영향으로 인해, 주어진 형질전환 공정의 개별 효모 콜로니는 TVP 발현 ORF를 생산하는 이의 능력이 상이할 것이다. 따라서, TVP 트랜스유전자를 운반하는 트랜스제닉 효모 콜로니는 고수율 균주에 대해 스크리닝해야 한다. 이러한 스크리닝을 위한 두 가지 효과적인 방법-각각 후속 분석을 위해 조건화 배지 샘플을 제공하는 트랜스제닉 효모의 소규모 배양물의 성장에 의존함-은 역상 HPLC 또는 집파리 주사 절차를 사용하여 양성 트랜스제닉 효모 콜로니에서 조건화 배지 샘플을 분석한다.
트랜스제닉 효모 배양은 각 튜브에 5-10 mL 정의 배지가 첨가된 14 mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 배양 튜브를 사용하거나 각 웰에 2.2 mL 정의 배지가 첨가된 48웰 딥 웰 배양 플레이트에서 수행할 수 있다. 조 단백질성 추출물 또는 효모 추출물 또는 펩톤과 같은 부산물을 포함하지 않는 정의 배지는 이후 스크리닝 단계를 위해 수확된 조건화 배지에서 단백질 배경을 감소시키기 위해 배양에 사용한다. 배양은 최대 세포 밀도에 도달할 때까지 약 5-6일 동안 최적 온도, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스의 경우 23.5℃에서 수행한다. TVP는 이제 형질전환된 효모 세포에 의해 생산되고 세포 밖 성장 배지로 분비될 것이다. 스크리닝을 위한 샘플을 제조하기 위해, 원심분리에 의해 배양물에서 세포를 제거하고 상청액을 조건화 배지로서 수집한 다음 0.22 μm 필터 막을 통해 여과에 의해 세정한 후 균주 스크리닝을 준비한다.
일부 실시양태에서, TVP로 형질전환된 양성 효모 콜로니는 추정 효모 콜로니의 역상 HPLC(rpHPLC) 스크리닝을 통해 스크리닝할 수 있다. 이 스크리닝 방법에서는, 결합상이 C18인 HPLC 분석 컬럼을 사용할 수 있다. 이동상 용매로는 아세토니트릴 및 물을 사용하고, 펩티드 검출에는 UV 흡광도 검출기를 220 nm로 설정하여 사용한다. 적절한 양의 조건화 배지 샘플을 rpHPLC 시스템에 로딩하고 이동상 용매의 선형 구배로 용출한다. HPLC 크로마토그래프에서 살충 펩티드의 해당 피크 면적을 사용하여 조건화 배지에서의 TVP 농도를 정량한다. 알려진 양의 순수한 TVP를 동일한 HPLC 프로토콜로 동일한 rpHPLC 컬럼을 통해 실행하여 펩티드의 체류 시간을 확인하고 정량화를 위한 표준 펩티드 HPLC 곡선을 생성한다.
양성 클루이베로마이세스 락티스 세포의 예시적인 역상 HPLC 스크리닝 공정은 하기와 같다: TVP 발현 ORF를 발현 벡터 pKLAC1에 삽입하고, 클루이베로마이세스 락티스 균주 YCT306(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)으로 형질전환할 수 있다. pKLAC1 벡터는 통합 발현 벡터이다. 일단 TVP 트랜스유전자가 pKLAC1에 클로닝되고 YCT306으로 형질전환되면, 이의 발현은 LAC4 프로모터에 의해 제어되었다. 생성 형질전환 콜로니는 α-교배 인자 신호 펩티드, Kex2 절단 부위 및 성숙 TVP를 포함하는 프리-프로펩티드를 생산했다. α-교배 인자 신호 펩티드는 프리-프로펩티드가 내인성 분비 경로로 들어가도록 안내하고, 성숙 TVP는 성장 배지로 방출된다.
일부 실시양태에서, TVP 발현을 위한 코돈 최적화는 2회로 수행하여, 예를 들어, 제1회에서는 고발현 DNA 서열의 일부 공통 특징에 기반하여 α-교배 인자 신호 펩티드, Kex2 절단 부위 및 TVP를 발현하는 TVP 발현 ORF의 다중 변이체가 설계되고 이의 발현 수준을 클루이베로마이세스 락티스의 YCT306 균주에서 평가하여 초기 클루이베로마이세스 락티스 발현 알고리즘을 생성하고; 제2회 최적화에서는 초기 클루이베로마이세스 락티스 발현 알고리즘에 기반하여 추가 변이체 TVP 발현 ORF를 설계하여 클루이베로마이세스 락티스 발현 알고리즘을 더욱 미세 조정하고 클루이베로마이세스 락티스에서 TVP 발현을 위한 최상의 ORF를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 최적화로부터 생성된 DNA 서열은 α-MF 신호 펩티드, Kex2 절단 부위 및 TVP를 암호화하는 개방 판독 프레임을 가질 수 있고, 이는 Hind III 및 Not I 제한 부위를 사용하여 pKLAC1 벡터로 클로닝되어 TVP 발현 벡터를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모 피치아 파스토리스는 TVP 발현 카세트로 형질전환될 수 있다. 예시적인 피치아 파스토리스의 형질전환 방법은 하기와 같다: 벡터 pJUGαKR 및 pJUZαKR이 TVP를 피치아 파스토리스로 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. pJUGαKR 및 pJUZαKR 벡터는 Biogrammatics(Carlsbad, California, USA)로부터 이용 가능하다. 두 벡터 모두 통합 벡터이며 이종성 트랜스유전자 발현을 향상시키기 위해 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 프로모터(pUPP)를 사용한다. 벡터 간의 유일한 차이는 pJUGαKR이 숙주 효모에 G418 내성을 제공하는 반면 pJUZαKR은 제오신 내성을 제공한다는 것이다. TVP를 암호화하는 상보적 올리고뉴클레오티드 쌍을 설계하고 합성하여 2개의 효모 발현 벡터로 서브클로닝한다. 혼성화 반응은 상응하는 상보성 올리고뉴클레오티드를 30 mM NaCl, 10 mM 트리스-Cl(모두 최종 농도), pH 8에서 20 μM의 최종 농도로 혼합한 다음 20분 동안 95℃에서 인큐베이션하고, 이어서 92℃에서 시작하여 17℃에서 끝나고 20분마다 3℃씩 온도 강하되는 9시간 인큐베이션에 의해 수행한다. 혼성화 반응은 TVP를 암호화하는 DNA 단편을 생성할 것이다. 두 개의 피치아 파스토리스 벡터를 BsaI-HF 제한 효소로 소화시킨 후, 반응의 이중 가닥 DNA 산물을 표준 절차를 사용하여 선형화된 피치아 파스토리스 벡터로 서브클로닝한다. 서브클론의 서열을 확인한 후, 플라스미드 분취액을 전기천공에 의해 피치아 파스토리스 균주 Bg08로 형질감염시킨다. 각각 벡터 pJUZαKR 및 pJUGαKR로 조작된 요소에 의해 부여된 제오신 또는 G418에 대한 내성에 기반하여 선택된 생성 형질전환 효모를 본원에 기재된 바와 같이 배양 및 스크리닝할 수 있다.
효모 펩티드 수율 스크리닝 및 평가
펩티드 수율은 당업자에게 알려진 임의의 방법(예를 들어, 모세관 겔 전기영동(CGE), 웨스턴 블롯 분석 등)에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재되고 당분야에 알려진 활성 검정은 또한 펩티드 수율에 관한 정보를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 방법을 사용하여 펩티드 수율을 평가할 수 있다.
정량 검정
일부 실시양태에서, 비제한적으로, TVP 펩티드 수율은 HPLC; 질량 분광측정법(MS) 및 관련 기술; LC/MS/MS; 역상 단백질 어레이(RPPA); 면역조직화학; ELISA; 현탁 비드 어레이, 질량 분광측정법; 도트 블롯; SDS-PAGE; 모세관 겔 전기영동(CGE); 웨스턴 블롯 분석; 브래드포드 검정; 260 nm에서의 UV 흡수 측정; 로우리 검정; 스미스 구리/비신코닌산 검정; 분비 검정; 피어스 단백질 검정; 뷰렛 반응 등을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적인 단백질 정량 방법은 문헌(Stoscheck, C. 1990 "Quantification of Protein"　Methods in Enzymology　,　182:50-68; Lowry, O. Rosebrough, A., Farr, A. and Randall, R. 1951　J. Biol . Chem　.　193:265; Smith, P. et al., (1985) Anal. Biochem.　150:76-85; Bradford, M. 1976 "A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding"　Anal. Biochem.　72:248-254; Cabib, E. and Polacheck, I. 1984 "Protein assay for dilute solutions."　Methods in Enzymology,　104:318-328; Turcanu, Victor; Williams, Neil A. (2001).　"Cell identification and isolation on the basis of cytokine secretion: A novel tool for investigating immune responses."　Nature Medicine.　7　(3): 373-376; 미국 특허 번호 6,391,649)에서 제공되며; 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시양태에서, TVP 펩티드 수율은 배양물 부피당 재조합 단백질 질량(예를 들어, 배양물 리터당 그램 또는 밀리그램 단백질); 예를 들어, 재조합 단백질 추출 상청액의 양/불용성 구성성분 중 단백질의 양으로 결정되는 세포 용해 후 수득된 재조합 단백질 불용성 침전물의 백분율 또는 분율; 활성 단백질의 백분율 또는 분율(예를 들어 단백질 양으로 사용하기 위한 활성 단백질의 양/분석); 총 세포 단백질(tcp) 백분율 또는 분율; 및/또는 단백질/세포의 양 및 건조 바이오매스의 백분율 또는 비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법을 사용하여 정량 및/또는 평가될 수 있다.
수율이 배양물 부피의 관점에서 표현되는 일부 실시양태에서, 특히 상이한 배양물 사이의 수율이 비교될 때, 배양 세포 밀도가 고려될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 총 세포 단백질(tcp)의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75% 이상인 이종성 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다. "총 세포 단백질%"는 응집체 세포 단백질의 백분율로서 숙주 세포에서 이종성 폴리펩티드의 양이다. 총 세포 단백질%의 결정은 당분야에 잘 알려져 있다.
"총 세포 단백질(tcp)" 또는 "총 세포 단백질%(% tcp)"는 응집체 세포 단백질의 백분율로서 숙주 세포에서 단백질 또는 폴리펩티드의 양이다. 총 세포 단백질%의 결정 방법은 당분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시양태에서, HPLC는 펩티드 수율을 정량하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 수율은 Onyx 모놀리식 4.5 x 100 mm, C18 역상 분석용 HPLC 컬럼 및 자동 주입기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 정량될 수 있다. Onyx 모놀리식 4.5 x 100 mm, C18 역상 분석용 HPLC 컬럼 및 자동 주입기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템의 예시적 사용은 하기와 같다: 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포의 여과된 조건화 배지 샘플을 HPLC 분석에 사용되는 2개의 이동상 용매를 구성하는 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴 및 HPLC 등급수를 분석함으로써 Onyx 모놀리식 4.5 x 100 mm, C18 역상 분석용 HPLC 컬럼 및 자동 주입기가 장착된 HPLC 시스템이 장착된 Agilent 1100을 사용하여 분석한다; TVP 또는 TVP 살충 단백질의 피크 면적을 HPLC 크로마토그래프를 사용하여 분석한 다음, 표준화된 펩티드 수율로서 해당 최종 세포 밀도(OD600 측정에 의해 결정됨)로 추가 표준화될 수 있는 조건화 배지의 펩티드 농도를 계산한다.
활성 검정
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질로 형질전환된 양성 효모 콜로니는 집파리 주사 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. TVP 또는 TVP 살충 단백질은 등쪽 흉부의 체벽을 통해 측정된 용량으로 주사될 때 집파리를 마비/사멸시킬 수 있다. TVP 또는 TVP 살충 단백질의 유효성은 각각 주사된 집파리의 50% 녹다운 비 또는 사망률을 유발하는 펩티드의 중앙값 마비/치사 용량(PD50/LD50)에 의해 정의될 수 있다. 순수한 TVP 또는 TVP 살충 단백질이 일반적으로 집파리 주사 검정에 사용되어 이로부터 PD50/LD50 값이 결정될 수 있는 표준 용량-반응 곡선을 생성한다. 순수한 TVP 또는 TVP 살충 단백질의 표준 용량-반응 곡선 분석으로부터 PD50/LD50 값을 사용하여, 형질전환된 효모에 의해 생산된 TVP 또는 TVP 살충 단백질의 정량은 해당 조건화 배지의 연속 희석으로 수행되는 집파리 주사 검정을 사용하여 달성될 수 있다.
예시적인 집파리 주사 생물검정은 하기와 같다: 조건화 배지를 연속 희석하여 집파리 주사 생물검정으로부터 전체 용량-반응 곡선을 생성한다. 주사 전에, 성체 집파리(무스카 도메스티카)를 CO2로 고정화하고 12-18 mg 집파리를 주사를 위해 선택한다. 1 cc 주사기 및 30게이지 바늘이 장착된 마이크로어플리케이터를 사용하여 파리당 0.5 μL의, 연속 희석된 조건화 배지 샘플의 용량을 등쪽 흉부의 체벽을 통해 집파리에 주사한다. 주사된 집파리를 습한 여과지 및 뚜껑에 호흡 구멍이 있는 밀폐된 용기에 넣고, 주사 후 24시간째에 녹다운 비 또는 사망률 점수화로 검사한다. 표준화된 수율을 계산한다. 펩티드 수율은 mg/L 단위의 조건화 배지의 펩티드 농도를 의미한다. 그러나 펩티드 수율이 항상 균주 생산 속도를 정확하게 비교하기에 충분하지는 않다. 개별 균주는 상이한 성장 속도를 가질 수 있으므로, 배양물을 수확할 때 배양물마다 세포 밀도가 상이할 수 있다. 높은 세포 밀도를 가진 배양물은 더 높은 생산 속도를 가진 또 다른 균주보다 균주의 펩티드 생산 속도가 더 낮더라도 배지에서 더 높은 농도의 펩티드를 생산할 수 있다. 따라서, 용어 "표준화된 수율"은 펩티드 수율을 해당 배양물의 세포 밀도로 나누어 생성되며 이는 균주 간 펩티드 생산 속도를 더 잘 비교할 수 있게 한다. 세포 밀도는 600 nm에서의 흡광도로 표시되며 단위는 "A"(흡광도 단위)이다.
TVP로 형질전환된 효모 콜로니를 스크리닝하면 수백 개의 잠재적 콜로니로부터 높은 수율의 효모 균주를 확인할 수 있다. 이들 균주는 본원에 기재된 최적화된 발효 배지 및 발효 조건을 사용할 때 적어도 최대 4 g/L 또는 적어도 최대 3 g/L 또는 적어도 최대 2 g/L TVP의 수율을 달성하도록 생물반응기에서 발효될 수 있다. 더 높은 생산 속도(mg/L로 표현됨)는 약 100 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 90,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 80,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 70,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 60,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 50,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 40,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 30,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 20,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 17,500 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 15,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 12,500 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 10,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 9,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 8,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 7,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 6,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 5,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 3,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 2,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 1,500 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 1,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 750 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 500 mg/L; 또는 약 150 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 200 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 300 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 400 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 750 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 1,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 1,250 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 1,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 2,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 2,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 3,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 3,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 4,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 4,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 5,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 6,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 7,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 8,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 9,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 10,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 12,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 15,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 17,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 20,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 30,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 40,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 50,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 60,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 70,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 80,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 90,000 mg/L 내지 100,000 mg/L 중 임의의 위치; 또는 제공된 임의의 값의 임의의 범위 또는 심지어 전환 전에 펩티드를 생산하기 위해 사용된 동일하거나 유사한 생산 방법을 사용하여, 전환 전에 펩티드로 달성할 수 있는 것보다 더 큰 수율일 수 있다.
배양 및 발효 조건
세포 배양 기술은 당분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 배양 방법 및/또는 물질은 선택된 숙주 세포에 기반한 적응을 반드시 필요로 할 것이고; 그리고; 그러한 적응(예를 들어, pH, 온도, 배지 함량 등의 변형)은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 알려진 배양 기술을 사용하여 본 발명의 TVP 또는 TVP-살충 단백질을 생산할 수 있다.
예시적인 배양 방법은 미국 특허 번호 3,933,590;　3,946,780; 4,988,623; 5,153,131; 5,153,133; 5,155,034; 5,316,905; 5,330,908; 6,159,724; 7,419,801;　9,320,816; 9,714,408;　및 10,563,169에 제공되며; 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
효모 배양
효모 세포 배양 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 효모 세포 배양 방법은 문헌(Evans, Yeast Protocols. Springer (1996); Bill, Recombinant Protein Production in Yeast. Springer (2012); Hagan et al., Fission Yeast: A Laboratory Manual, CSH Press (2016); Konishi et al., Improvement of the transformation efficiency of Saccharomyces cerevisiae by altering carbon sources in pre-culture. Biosci Biotechnol Biochem. 2014; 78(6):1090-3; Dymond, Saccharomyces cerevisiae growth media. Methods Enzymol. 2013; 533:191-204; Looke et al., Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011 May; 50(5):325-8; and Romanos et al., Culture of yeast for the production of heterologous proteins. Curr Protoc Cell Biol. 2014 Sep 2; 64:20.9.1-16)에서 찾을 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
효모는 다양한 배지에서 배양될 수 있으며, 예를 들어 일부 실시양태에서 효모는 최소 배지; YPD 배지; 효모 합성 드롭아웃 배지; 효모 질소 기재(아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 YNB); YEPD 배지; ADE D 배지; ADE DS" 배지, LEU D 배지, HIS D 배지 또는 미네랄 염 배지에서 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모는 최소 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최소 배지 성분은 2% 당; 인산염 완충액, pH 6.0; 황산마그네슘; 염화칼슘; 황산암모늄; 염화나트륨; 염화칼륨; 황산구리; 황산망간; 염화아연; 요오드화칼륨; 염화코발트; 몰리브덴산나트륨; 붕산; 염화철; 비오틴; 판토텐산칼슘; 티아민; 미오이노시톨; 니코틴산; 및 피리독신을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모는 YPD 배지에서 배양될 수 있다. YPD 배지는 세균학적 펩톤, 효모 추출물 및 글루코스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효모는 효모 합성 드롭아웃 배지에서 배양될 수 있으며, 이는 형질전환체가 필요한 구성성분이 부재하는 배지 상에서 성장할 수 있게 하는 플라스미드로 형질전환된 특정 배지 구성성분이 없이 성장할 수 없는 영양요구성 돌연변이체 균주를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효모는 질소, 비타민, 미량 원소 및 염을 포함하는 효모 질소 기재(아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 YNB)를 사용하여 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 YEPD 배지, 예를 들어 2% D-글루코스, 2% BACTO 펩톤(Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% BACTO 효모 추출물(Difco), 0.004% 아데닌, 및 0.006% L-류신을 포함하는 배지; 또는 탄소원이 당 알코올, 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨인 이의 변형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 ADE D 배지, 예를 들어 0.056%-Ade-Trp-Thr 분말, 아미노산을 포함하지 않는 0.67% 효모 질소 기재, 2% D-글루코스, 및 0.5% 200X 트립토판, 트레오닌 용액을 포함하는 배지; 또는 탄소원이 당 알코올, 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨인 이의 변형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 ADE DS" 배지, 예를 들어 0.056%-Ade-Trp-Thr 분말, 아미노산을 포함하지 않는 0.67% 효모 질소 기재, 2% D-글루코스, 0.5% 200X 트립토판, 트레오닌 용액, 및 18.22% D-소르비톨을 포함하는 배지, 또는 탄소원이 전적으로 당 알코올, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨인 이의 변형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 LEU D 배지, 예를 들어 0.052%-Leu-Trp-Thr 분말, 아미노산을 포함하지 않는 0.67% 효모 질소 기재, 2% D-글루코스, 및 0.5% 200X 트립토판, 트레오닌 용액을 포함하는 배지; 또는 탄소원이 당 알코올, 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨인 이의 변형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 HIS D 배지, 예를 들어 0.052%-His-Trp-Thr 분말, 아미노산을 포함하지 않는 0.67% 효모 질소 기재, 2% D-글루코스, 및 0.5% 200X 트립토판, 트레오닌 용액을 포함하는 배지; 또는 탄소원이 당 알코올, 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨인 이의 변형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 미네랄 염 배지가 사용될 수 있다. 미네랄 염 배지는 미네랄 염 및 글루코스, 수크로스 또는 글리세롤과 같은 탄소원으로 구성된다. 미네랄 염 배지의 예는 예를 들어 M9 배지, 슈도모나스 배지(ATCC 179), 및 Davis 및 Mingioli 배지를 포함한다. 문헌(Davis & Mingioli (1950) J. Bact. 60:17-28)을 참고한다. 미네랄 염 배지를 제조하기 위해 사용되는 미네랄 염은 예를 들어 인산칼륨, 황산암모늄 또는 염화암모늄, 황산마그네슘 또는 염화마그네슘, 염화칼슘, 붕산 및 황산 철, 구리, 망간 및 아연과 같은 미량 미네랄로부터 선택되는 것들을 포함한다. 전형적으로 펩톤, 트립톤, 아미노산 또는 효모 추출물과 같은 유기 질소원은 미네랄 염 배지에 포함되지 않는다. 대신에, 무기 질소원이 사용되며 이는, 예를 들어 암모늄 염, 수성 암모니아 및 기체 암모니아로부터 선택될 수 있다. 미네랄 염 배지는 전형적으로 탄소원으로 글루코스 또는 글리세롤을 포함할 것이다.
미네랄 염 배지와 비교하여, 최소 배지는 또한 미네랄 염 및 탄소원을 포함할 수 있지만, 예를 들어, 저수준의 아미노산, 비타민, 펩톤 또는 기타 성분이 보충될 수 있지만 이들은 바로 최소 수준으로 첨가된다. 배지는 당분야, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0040352에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 방법에 유용한 배양 절차 및 미네랄 염 배지의 상세사항은 문헌(Riesenberg, D et al., 1991, "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate," J. Biotechnol. 20 (1):17-27)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 클루이베로마이세스 락티스는 유일한 탄소원으로서 2% 글루코스, 갈락토스, 소르비톨 또는 글리세롤이 보충된 최소 배지에서 성장시킨다. 배양물은 β-갈락토시다아제 측정의 경우 중간-로그 단계(24-48시간)까지 30℃에서, 또는 이종성 단백질 발현의 경우 23.5℃에서 6일 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 효모 세포는 접종 후 멸균 공기 투과성 덮개로 밀봉되어, 48-웰 딥-웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 플레이트 상에서 배양된 클루이베로마이세스 락티스와 같은 효모의 콜로니를 골라 딥웰 플레이트에 DMSor로 이루어진 웰당 2.2 mL 배지를 접종할 수 있다. 접종된 딥웰 플레이트는 냉장 인큐베이터 진탕기에서 280 rpm으로 진탕하며 23.5℃에서 6일 동안 성장시킬 수 있다. 접종 후 6일째에, 조건화 배지는 10분 동안 4000 rpm에서 원심분리하여 수확한 후 0.22 μM 막이 있는 필터 플레이트를 사용하여 여과하고, 여과된 배지로는 HPLC 분석을 거친다.
일부 실시양태에서, 클루이베로마이세스 락티스, 사카로마이세스 세레비지애, 피치아 파스토리스 등과 같은 효모 종은 본원에 기재된 방법을 사용하여 변형될 숙주 유기체 및/또는 효모로서 사용될 수 있다.
온도 및 pH 조건은 배양 단계 및 선택된 숙주 세포 종에 따라 변할 것이다. 세포 배양에서 온도 및 pH와 같은 변수는 당업자에게 용이하게 알려져 있다.
pH 수준은 효모 배양에서 중요하다. 당업자는 배양 공정이 효모 배양의 시작뿐만 아니라 배양의 유지도 포함한다는 것을 이해할 것이다. 효모 배양은 임의의 pH 수준에서 시작될 수 있지만, 효모 배양 배지는 경시적으로 더 산성화되는(즉, pH를 낮추는) 경향이 있으므로 배양 공정 동안 pH 수준을 모니터링하는 데 주의를 기울여야 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 효모는 사용된 효모의 종, 배양 단계 및/또는 온도에 기반하여 지시되는 pH 수준에서 배지에서 성장시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, pH 수준은 약 2 내지 약 10 범위 내에 있을 수 있다. 당업자는 대부분의 미생물에 대한 최적 pH가 중성 지점(pH 7.0)에 가깝다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 일부 진균 종은 산성 환경을 선호한다: 따라서, 일부 실시양태에서, pH는 2 내지 6.5의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, pH는 약 4 내지 약 4.5의 범위일 수 있다. 일부 진균 종(예를 들어 곰팡이)은 pH 약 2 내지 약 8.5에서 성장할 수 있지만 산성 pH를 선호한다. 문헌(Mountney & Gould, Practical food microbiology and technology. 1988. Ed. 3; and Pena et al., Effects of high medium pH on growth, metabolism and transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res.　2015 Mar;15(2):fou005)을 참고한다.
다른 실시양태에서, pH는 약 5.7 내지 5.9, 5.8 내지 6.0, 5.9 내지 6.1, 6.0 내지 6.2, 6.1 내지 6.3, 6.2 내지 6.5, 6.4 내지 6.7, 6.5 내지 6.8, 6.6 내지 6.9, 6.7 내지 7.0, 6.8 내지 7.1, 6.9 내지 7.2, 7.0 내지 7.3, 7.1 내지 7.4, 7.2 내지 7.5, 7.3 내지 7.6, 7.4 내지 7.7, 7.5 내지 7.8, 7.6 내지 7.9, 7.7 내지 8.0, 7.8 내지 8.1, 7.9 내지 8.2, 8.0 내지 8.3, 8.1 내지 8.4, 8.2 내지 8.5, 8.3 내지 8.6, 8.4 내지 8.7, 또는 8.5 내지 8.8이다.
일부 실시양태에서, 배지의 pH는 적어도 5.5일 수 있다. 다른 측면에서, 배지는 약 5.5의 pH 수준을 가질 수 있다. 다른 측면에서, 배지는 4 내지 8의 pH 수준을 가질 수 있다. 일부 경우에, 배양물은 5.5 내지 8의 pH 수준에서 유지된다. 다른 측면에서, 배지는 6 내지 8의 pH 수준을 갖는다 일부 경우에, 배지는 6 내지 8의 pH 수준에서 유지되는 pH 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 효모는 6.1 내지 8.1의 pH 수준에서 성장 및/또는 유지된다. 일부 실시양태에서, 효모는 6.2 내지 8.2의 pH 수준에서 성장 및/또는 유지된다. 일부 실시양태에서, 효모는 6.3 내지 8.3의 pH 수준에서 성장 및/또는 유지된다. 일부 실시양태에서, 효모는 6.4 내지 8.4의 pH 수준에서 성장 및/또는 유지된다. 일부 실시양태에서, 효모는 5.5 내지 8.5의 pH 수준에서 성장 및/또는 유지된다. 일부 실시양태에서, 효모는 6.5 내지 8.5의 pH 수준에서 성장 및/또는 유지된다. 일부 실시양태에서, 효모는 약 5.6, 5.7, 5.8 또는 5.9의 pH 수준에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 효모는 약 6의 pH 수준에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 효모는 약 6.5의 pH 수준에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 효모는 약 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0의 pH 수준에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 효모는 약 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0의 pH 수준에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 효모는 8 초과의 수준에서 성장된다.
일부 실시양태에서, 배지의 pH는 2 내지 8.5의 pH 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, pH는 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7 또는 8.8이다.
예시적인 효모 배양 방법은 "억제 가능한 효모 프로모터"라는 제목의 미국 특허 번호 5,436,136(1991년 12월 20일 출원; 양수인 Ciba-Geigy Corporation); "효모 발현 시스템, 효모에서 폴리펩티드를 생산하는 방법, 및 이와 관련된 조성물"이라는 제목의 미국 특허 번호 6,645,739(2001년 7월 26일 출원; 양수인 Phoenix Pharmacologies, Inc., Lexington, KY); 및 "효모용 배지"라는 제목의 미국 특허 번호 10,023,836(2013년 8월 23일 출원, 양수인 Yamaguchi University)에서 찾을 수 있으며; 그 개시내용은 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
발효
본 발명은 임의의 발효 형식으로의 숙주 유기체 배양을 고려한다. 예를 들어, 회분식, 유가식, 반연속식 및 연속식 발효 모드가 본원에서 사용될 수 있다.
발효는 임의의 규모로 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 고려되는 방법 및 기술은 임의의 규모로 재조합 단백질 발현에 유용하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 예를 들어 마이크로리터 규모, 밀리리터 규모, 센티리터 규모 및 데시리터 규모 발효 부피가 사용될 수 있고, 1리터 규모 및 더 큰 발효 부피가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발효 부피는 약 1리터 이상이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 발효 부피는 약 1리터 내지 약 100리터이다. 일부 실시양태에서, 발효 부피는 약 1리터, 약 2리터, 약 3리터, 약 4리터, 약 5리터, 약 6리터, 약 7리터, 약 8리터, 약 9리터, 또는 약 10리터이다. 일부 실시양태에서, 발효 부피는 약 1리터 내지 약 5리터, 약 1리터 내지 약 10리터, 약 1리터 내지 약 25리터, 약 1리터 내지 약 50리터, 약 1리터 내지 약 75리터, 약 10리터 내지 약 25리터, 약 25리터 내지 약 50리터, 또는 약 50리터 내지 약 100리터이다. 다른 실시양태에서, 발효 부피는 5리터, 10리터, 15리터, 20리터, 25리터, 50리터, 75리터, 100리터, 200리터, 500리터, 1,000리터, 2,000리터, 5,000리터, 10,000리터 또는 50,000리터 이상이다.
일부 실시양태에서, 발효 배지는 세포의 성장 및/또는 유지에 사용되는 영양 용액일 수 있다. 비제한적으로, 이 용액은 일반적으로 다음 범주 중 하나 이상으로부터 적어도 하나의 구성성분을 제공한다: (1) 일반적으로 탄소원, 예를 들어 글루코스 형태의 에너지원; (2) 모든 필수 아미노산, 그리고 일반적으로 20개 아미노산의 기본 세트; (3) 낮은 농도로 요구되는 비타민 및/또는 기타 유기 화합물; (4) 유리 지방산 또는 지질, 예를 들어 리놀레산; 및 (5) 미량 원소로서, 미량 원소는 일반적으로 마이크로몰 범위의 매우 낮은 농도로 전형적으로 요구되는 무기 화합물 또는 자연 발생 원소로 정의된다.
일부 실시양태에서, 발효 배지는 세포 배양 배지 또는 본원에 기재된 임의의 다른 배지와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발효 배지는 세포 배양 배지와 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발효 배지는 단백질의 대규모 생산을 수용하기 위해 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발효 배지는 하기 범주: (1) 호르몬 및 혈청, 인슐린, 트랜스페린 등과 같은 기타 성장 인자; (2) 염, 예를 들어 마그네슘, 칼슘 및 인산염; (3) HEPES와 같은 완충액; (4) 뉴클레오시드 및 아데노신, 티미딘 등과 같은 염기; (5) 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어 정제된 젤라틴, 식물 재료 또는 동물 부산물로부터 얻을 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물; (6) 젠타마이신과 같은 항생제; 및 (7) 세포 보호제, 예를 들어 임의의 플루로닉 폴리올로부터의 하나 이상의 구성성분으로 선택적으로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발효 배지의 pH는 pH 완충액 및 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 유지될 수 있다. 발효 동안의 pH 제어는 수성 암모니아를 사용하여 달성될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 발효 배지의 pH는 사용되는 유기체의 선호 pH에 기반하여 선택될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 숙주 세포 및 온도에 따라, pH는 약 1 내지 약 10의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 발효 배지의 pH는 2 내지 8.5의 pH 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, pH는 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7 또는 8.8이다.
다른 실시양태에서, pH는 약 5.7 내지 5.9, 5.8 내지 6.0, 5.9 내지 6.1, 6.0 내지 6.2, 6.1 내지 6.3, 6.2 내지 6.5, 6.4 내지 6.7, 6.5 내지 6.8, 6.6 내지 6.9, 6.7 내지 7.0, 6.8 내지 7.1, 6.9 내지 7.2, 7.0 내지 7.3, 7.1 내지 7.4, 7.2 내지 7.5, 7.3 내지 7.6, 7.4 내지 7.7, 7.5 내지 7.8, 7.6 내지 7.9, 7.7 내지 8.0, 7.8 내지 8.1, 7.9 내지 8.2, 8.0 내지 8.3, 8.1 내지 8.4, 8.2 내지 8.5, 8.3 내지 8.6, 8.4 내지 8.7, 또는 8.5 내지 8.8이다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 대장균이 사용되는 경우, 최적 pH 범위는 온도에 따라 6.5 내지 7.5이다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 효모 균주가 사용되는 경우, pH는 약 4.0 내지 8.0의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 중성 pH, 즉 약 7.0의 pH가 사용될 수 있다.
당업자는 발효 동안 기질 및 대사 화합물의 전환 및 생산 결과로 pH 수준이 이동할 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 발효 배지는 pH의 변화를 피하기 위해 완충액 또는 기타 화학물질로 보충될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, Ca(OH)2, CaCO3, NaOH, 또는 NH4OH의 첨가가 발효 배지에 첨가되어, 예를 들어 산업 공정 동안 일부 효모 종에서 발생하는 산성 화합물의 생산을 중화할 수 있다.
온도는 발효 공정에서 또 다른 중요한 고려 사항이다; pH 고려 사항과 마찬가지로, 온도는 선택된 숙주 세포의 유형에 의존할 것이다.
일부 실시양태에서, 발효 온도는 약 4℃ 내지 약 42℃에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 발효 온도는 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22 ℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29 ℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32 ℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 또는 약 42℃이다.
다른 실시양태에서, 발효 온도는 약 25℃ 내지 약 27℃, 약 25℃ 내지 약 28℃, 약 25℃ 내지 약 29℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 25℃ 내지 약 31℃, 약 25℃ 내지 약 32℃, 약 25℃ 내지 약 33℃, 약 26℃ 내지 약 28℃, 약 26℃ 내지 약 29℃, 약 26℃ 내지 약 30℃, 약 26℃ 내지 약 31℃, 약 26℃ 내지 약 32℃, 약 27℃ 내지 약 29℃, 약 27℃ 내지 약 30℃, 약 27℃ 내지 약 31℃, 약 27℃ 내지 약 32℃, 약 26℃ 내지 약 33℃, 약 28℃ 내지 약 30℃, 약 28℃ 내지 약 31℃, 약 28℃ 내지 약 32℃, 약 29℃ 내지 약 31℃, 약 29℃ 내지 약 32℃, 약 29℃ 내지 약 33℃, 약 30℃ 내지 약 32℃, 약 30℃ 내지 약 33℃, 약 31℃ 내지 약 33℃, 약 31℃ 내지 약 32℃, 약 30℃ 내지 약 33℃, 또는 약 32℃ 내지 약 33℃이다.
다른 실시양태에서, 온도는 발효 동안, 예를 들어 발효 단계에 따라 변화된다.
발효는 당업자에게 알려진 다양한 미생물로 달성될 수 있다. TVP 또는 TVP-살충 단백질의 대규모 생산에 적합한 미생물은 본원에 열거된 임의의 미생물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물의 비제한적인 예는 사카로마이세스 spp. 속(사카로마이세스 세레비시애(제빵 효모),　사카로마이세스 디스타티쿠스(S. distaticus),　사카로마이세스 우바룸(S. uvarum)을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 클루이베로마이세스 속(클루이베로마이세스 마르시아누스, 클루이베로마이세스 프라길리스를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 칸디다 속(칸디다 슈도트로피칼리스 및 칸디다 브라시캐(C. brassicae)를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis)(칸디다 쉬하태(Candida shehatae)의 동류), 클라비스포라(Clavispora) 속(클라비스포라 루시타니애(C. lusitaniae) 및 클라비스포라 오푼티애(C. opuntiae)를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 파키솔렌(Pachysolen) 속(파키솔렌 탄노필러스(P. tannophilus)를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 브레탄노마이세스(Bretannomyces) 속(예를 들어, 브레탄노마이세스 클라우세니이(B. clausenii)를 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 균주를 포함한다. 다른 적합한 미생물은, 예를 들어 자이모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클로스트리디움　spp.(클로스트리디움　써모셀룸(C. thermocellum);　클로스트리디움　사카로부틸아세토니쿰(C. saccharobutylacetonicum), 클로스트리디움　사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum), 클로스트리디움　푸니세움(C. Puniceum), 클로스트리디움　베이제른키이(C. beijernckii), 및 클로스트리디움　아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)을 포함하지만 이에 제한되지 않음),　모닐리엘라 폴리니스(Moniliella pollinis), 모닐리엘라 메가칠리엔시스(Moniliella megachiliensis), 락토바실러스 spp.　야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 아우레오바시디움(Aureobasidium)　sp.,　트리코스포론(Trichosporon)　sp., 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 트리코스포론　sp., 모닐리엘라아세토아부탄스(Moniliellaacetoabutans)　sp.,　타이풀라 바리아빌리스(Typhula variabilis), 칸디다 매그놀리아스(Candida magnolias), 우스틸라기노마이세테스(Ustilaginomycetes)　sp.,　슈도자이마 추쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis), 효모과(Zygosaccharomyces), 균계(Debaryomyces), 한세눌라 및 피치아 속의 효모 종, 및 데마티오이드(dematioid) 속 토룰라(Torula)의 진균을 포함한다. 예를 들어, 문헌(Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, D.C., 179-212)을 참고한다.
발효 배지는 숙주 세포 및/또는 최종 사용자의 필요에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 탄소 이외의 임의의 필요한 보충물은 또한 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로 도입되는 적절한 농도로 포함될 수 있다.
효모 발효
효모를 사용한 발효 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 회분식 발효가 본원에 제공된 방법에 따라 사용될 수 있다; 다른 실시양태에서, 연속식 발효 절차가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 회분식 발효 방법이 본 발명의 TVP를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 간략하게, 회분식 발효 방법은 폐쇄된 시스템으로 수행되는 발효 유형을 지칭하며, 배지의 조성은 발효 시작 시 결정되고 발효 동안 인공적인 변경을 거치지 않는다(즉, 배지에 발효 시작 시 하나 이상의 효모 세포가 접종되고, 사용자의 방해 없이 발효가 진행되도록 함). 전형적으로 회분식 발효 시스템에서, 시스템의 대사물 및 바이오매스 조성은 발효가 정지될 시점까지 계속 변화한다. 회분식 배양물에서, 효모 세포는 정적 지연 단계를 거쳐 고성장 로그 단계로, 마지막으로 성장 속도가 감소하거나 정지되는 정지 단계로 이동한다. 처리되지 않으면, 정지 단계의 효모 세포는 결국 죽을 것이다. 회분식 방법에서, 로그 단계의 효모 세포는 일반적으로 최종 산물 합성의 대부분에 관여된다.
일부 실시양태에서, 유가식 발효가 본 발명의 TVP를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 간략하게, 유가식 발효는 (위에서 기재된) 전형적인 회분식 방식과 유사하지만, 유가식 방식의 기질은 발효가 진행됨에 따라 증분으로 첨가된다. 유가식 발효는 이화산물 억제가 효모 세포 대사를 억제할 수 있을 때 그리고 배지에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직할 때 유용하다. 일반적으로 유가식 시스템에서 기질 농도의 측정은 pH, 용존 산소, 폐가스(예를 들어 CO2)의 분압 등과 같이 대사를 반영하는 측정 가능한 요인의 변화에 기반하여 추정된다.
일부 실시양태에서, 유가식 발효 절차는 하기와 같이 TVP를 생산하기 위해 사용될 수 있다: 5 g/L 인산칼륨, 2.5 g/L 염화암모늄, 0.5 g/L 황산마그네슘, 30 g/L 옥수수 침지액, 및 20 g/L의 초기 제1 및 제2 탄소원 농도를 포함하는 5 L 브로스를 사용하여 N2/CO2 혼합물이 분무된 10 L 생물반응기에서 생산 유기체(예를 들어, 변형된 효모 세포)를 배양한다. 변형된 효모 세포가 성장하고 탄소원을 활용함에 따라, 추가 70% 탄소원 혼합물이 대략 탄소원 소비와 균형을 이루는 속도로 생물반응기에 공급된다. 생물반응기의 온도는 일반적으로 30℃로 유지된다. 성장은 대략 24시간 이상 동안 계속되고, 이종성 펩티드는 원하는 농도, 예를 들어 세포 밀도가 약 5 내지 10 g/L인 농도에 도달한다. 배양 기간이 완료되면, 발효기 내용물을 원심분리기와 같은 세포 분리 장치를 통해 통과시켜 세포 및 세포 파편을 제거할 수 있고, 발효 브로스를 산물 분리 장치로 옮길 수 있다. 이종성 펩티드의 단리는 당분야에 잘 알려진 표준 분리 절차에 의해 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 연속 발효가 본 발명의 TVP를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 간략하게, 연속 발효는 발효 배지가 생물반응기에 연속적으로 첨가되고 대략 동일한 양의 조건화 배지가 처리를 위해 동시에 제거되는, 개방 시스템을 사용한 발효를 지칭한다. 연속 발효는 일반적으로 고밀도로 배양물을 유지하며, 여기서 효모 세포는 주로 로그 단계 성장에 있다. 전형적으로 연속 발효 방법은 항정 상태 성장 조건을 유지하기 위해 수행되며, 배지 제거로 인한 효모 세포 손실은 발효 시 세포 성장 속도와 균형을 이루어야 한다.
일부 실시양태에서, 연속 발효 방법이 하기와 같이 TVP를 생산하기 위해 사용될 수 있다: 변형된 효모 균주는 생물반응기 기구 및 배지 조성물을 사용하여 배양될 수 있고, 그러나 여기서 초기 제1 및 제2 탄소원은 약, 예를 들어, 30-50 g/L이다. 탄소원이 고갈되면, 동일한 조성의 공급 배지가 약 0.5 L/hr 내지 1 L/hr의 속도로 연속 공급되고, 액체는 동일한 속도로 제거된다. 생물반응기의 이종성 펩티드 농도는 일반적으로 세포 밀도와 함께 일정하게 유지된다. 온도는 일반적으로 30℃로 유지되고, pH는 일반적으로 필요에 따라 진한 NaOH 및 HCl을 사용하여 약 4.5로 유지된다.
일부 실시양태에서, TVP를 생산할 때, 생물반응기는 예를 들어 약 1개월 동안 매일 또는 표적 화학적 화합물 농도의 일관성을 보장하기 위해 필요에 따라 샘플을 채취하며, 연속적으로 작동될 수 있다. 연속 모드에서, 새로운 공급 배지가 공급됨에 따라 발효기 내용물이 계속 제거된다. 세포, 배지 및 이종성 펩티드를 포함하는 배출 스트림이 이어서 세포 및 세포 파편을 제거하거나 제거하지 않고, 연속 산물 분리 절차를 거칠 수 있고, 관심 펩티드로부터 유기 산물을 분리하기 위해 당분야에 잘 알려진 연속 분리 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능한 효모 세포는, 예를 들어 호기성 생물반응기에서 유가식 공정을 사용하여 성장시킬 수 있다. 간략하게, 반응기는 탄소원 및 기타 시약을 포함하는 배지로 약 20% 내지 약 70% 용량으로 충전된다. 온도 및 pH는 본원에 기재된 하나 이상의 화학물질을 사용하여 유지된다. 진탕과 함께 간헐적으로 공기를 분무하여 산소 수준이 유지된다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 호기성 생물반응기에서 유가식 공정을 사용하는 방법을 제공하며, 반응기는 약 20%; 21%; 22%; 23%; 24%; 25%; 26%; 27%; 28%; 29%; 30%; 31%; 32%; 33%; 34%; 35%; 36%; 37%; 38%; 39%; 40%; 41%; 42%; 43%; 44%; 45%; 46%; 47%; 48%; 49%; 50%; 51%; 52%; 53%; 54%; 55%; 56%; 57%; 58%; 59%; 60%; 61%; 62%; 63%; 64%; 65%; 66%; 67%; 68%; 69%; 또는 70% 용량으로 충전된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP를 생산하기 위해 호기성 생물반응기를 사용하는 유가식 발효 방법을 제공하며, 배지는 농후 배양 배지이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스, 소르비톨 또는 락토스일 수 있다.
일부 실시양태에서, 글루코스의 양은 배지의 약 2 g/L; 3 g/L; 4 g/L; 5 g/L; 6 g/L; 7 g/L; 8 g/L; 9 g/L; 10 g/L; 11 g/L; 12 g/L; 13 g/L; 14 g/L; 15 g/L; 16 g/L; 17 g/L; 18 g/L; 19 g/L; 20 g/L; 21 g/L; 22 g/L; 23 g/L; 24 g/L; 25 g/L; 26 g/L; 27 g/L; 28 g/L; 29 g/L; 또는 30 g/L일 수 있다.
일부 실시양태에서, 소르비톨의 양은 배지의 약 2 g/L; 3 g/L; 4 g/L; 5 g/L; 6 g/L; 7 g/L; 8 g/L; 9 g/L; 10 g/L; 11 g/L; 12 g/L; 13 g/L; 14 g/L; 15 g/L; 16 g/L; 17 g/L; 18 g/L; 19 g/L; 20 g/L; 21 g/L; 22 g/L; 23 g/L; 24 g/L; 25 g/L; 26 g/L; 27 g/L; 28 g/L; 29 g/L; 또는 30 g/L일 수 있다.
일부 실시양태에서, 락토스의 양은 배지의 약 2 g/L; 3 g/L; 4 g/L; 5 g/L; 6 g/L; 7 g/L; 8 g/L; 9 g/L; 10 g/L; 11 g/L; 12 g/L; 13 g/L; 14 g/L; 15 g/L; 16 g/L; 17 g/L; 18 g/L; 19 g/L; 20 g/L; 21 g/L; 22 g/L; 23 g/L; 24 g/L; 25 g/L; 26 g/L; 27 g/L; 28 g/L; 29 g/L; 또는 30 g/L일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 호기성 생물반응기를 사용하는 유가식 발효 방법을 제공하며, 배지는 인산, 황산칼슘, 황산칼륨, 황산마그네슘 7수화물, 수산화칼륨 및/또는 옥수수 침지액 중 하나 이상이 보충된다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지에 약 2 g/L; 3 g/L; 4 g/L; 5 g/L; 6 g/L; 7 g/L; 8 g/L; 9 g/L; 10 g/L; 11 g/L; 12 g/L; 13 g/L; 14 g/L; 15 g/L; 16 g/L; 17 g/L; 18 g/L; 19 g/L; 20 g/L; 21 g/L; 22 g/L; 23 g/L; 24 g/L; 25 g/L; 26 g/L; 27 g/L; 28 g/L; 29 g/L; 또는 30 g/L 양의 인산으로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지에 약 0.05 g/L; 0.15 g/L; 0.25 g/L; 0.35 g/L; 0.45 g/L; 0.55 g/L; 0.65 g/L; 0.75 g/L; 0.85 g/L; 0.95 g/L; 1.05 g/L; 1.15 g/L; 1.25 g/L; 1.35 g/L; 1.45 g/L; 1.55 g/L; 1.65 g/L; 1.75 g/L; 1.85 g/L; 1.95 g/L; 2.05 g/L; 2.15 g/L; 2.25 g/L; 2.35 g/L; 2.45 g/L; 2.55 g/L; 2.65 g/L; 2.75 g/L; 2.85 g/L; 또는 2.95 g/L 양의 황산칼슘으로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지에 약 2 g/L; 2.5 g/L; 3 g/L; 3.5 g/L; 4 g/L; 4.5 g/L; 5 g/L; 5.5 g/L; 6 g/L; 6.5 g/L; 7 g/L; 7.5 g/L; 8 g/L; 8.5 g/L; 9 g/L; 9.5 g/L; 10 g/L; 10.5 g/L; 11 g/L; 11.5 g/L; 12 g/L; 12.5 g/L; 13 g/L; 13.5 g/L; 14 g/L; 14.5 g/L; 15 g/L; 15.5 g/L; 16 g/L; 16.5 g/L; 17 g/L; 17.5 g/L; 18 g/L; 18.5 g/L; 19 g/L; 19.5 g/L; 또는 20 g/L 양의 황산칼륨으로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지에 약 0.25 g/L; 0.5 g/L; 0.75 g/L; 1 g/L; 1.25 g/L; 1.5 g/L; 1.75 g/L; 2 g/L; 2.25 g/L; 2.5 g/L; 2.75 g/L; 3 g/L; 3.25 g/L; 3.5 g/L; 3.75 g/L; 4 g/L; 4.25 g/L; 4.5 g/L; 4.75 g/L; 5 g/L; 5.25 g/L; 5.5 g/L; 5.75 g/L; 6 g/L; 6.25 g/L; 6.5 g/L; 6.75 g/L; 7 g/L; 7.25 g/L; 7.5 g/L; 7.75 g/L; 8 g/L; 8.25 g/L; 8.5 g/L; 8.75 g/L; 9 g/L; 9.25 g/L; 9.5 g/L; 9.75 g/L; 10 g/L; 10.25 g/L; 10.5 g/L; 10.75 g/L; 11 g/L; 11.25 g/L; 11.5 g/L; 11.75 g/L; 12 g/L; 12.25 g/L; 12.5 g/L; 12.75 g/L; 13 g/L; 13.25 g/L; 13.5 g/L; 13.75 g/L; 14 g/L; 14.25 g/L; 14.5 g/L; 14.75 g/L; 또는 15 g/L 양의 황산마그네슘 7수화물로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지에 약 0.25 g/L; 0.5 g/L; 0.75 g/L; 1 g/L; 1.25 g/L; 1.5 g/L; 1.75 g/L; 2 g/L; 2.25 g/L; 2.5 g/L; 2.75 g/L; 3 g/L; 3.25 g/L; 3.5 g/L; 3.75 g/L; 4 g/L; 4.25 g/L; 4.5 g/L; 4.75 g/L; 5 g/L; 5.25 g/L; 5.5 g/L; 5.75 g/L; 6 g/L; 6.25 g/L; 6.5 g/L; 6.75 g/L; 또는 7 g/L 양의 수산화칼륨으로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지에 약 5 g/L; 6 g/L; 7 g/L; 8 g/L; 9 g/L; 10 g/L; 11 g/L; 12 g/L; 13 g/L; 14 g/L; 15 g/L; 16 g/L; 17 g/L; 18 g/L; 19 g/L; 20 g/L; 21 g/L; 22 g/L; 23 g/L; 24 g/L; 25 g/L; 26 g/L; 27 g/L; 28 g/L; 29 g/L; 30 g/L; 31 g/L; 32 g/L; 33 g/L; 34 g/L; 35 g/L; 36 g/L; 37 g/L; 38 g/L; 39 g /L; 40 g/L; 41 g/L; 42 g/L; 43 g/L; 44 g/L; 45 g/L; 46 g/L; 47 g/L; 48 g/L; 49 g/L; 50 g/L; 51 g/L; 52 g/L; 53 g/L; 54 g/L; 55 g/L; 56 g/L; 57 g/L; 58 g/L; 59 g/L; 60 g/L; 61 g/L; 62 g/L; 63 g/L; 64 g/L; 65 g/L; 66 g/L; 67 g/L; 68 g/L; 69 g/L; 또는 70 g/L 양의 옥수수 침지액으로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응기의 온도는 약 15℃ 내지 약 45℃로 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응기는 약 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃의 온도를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, pH는 약 3 내지 약 6의 수준을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, pH는 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0일 수 있다.
일부 실시양태에서, pH는 하나 이상의 화학물질의 첨가를 통해 일정한 수준으로 유지될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 수산화암모늄이 첨가되어 pH를 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수산화암모늄은 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%의 수산화암모늄인 배지 중 수산화암모늄 수준으로 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 산소 수준은 분무에 의해 유지될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용존 산소는 0.5-1.5 부피/부피/분 사이의 공기를 분무하고 10-30%의 설정점을 유지하기 위해 진탕을 증가시킴으로써 일정한 수준으로 유지될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응기의 접종은 약 2.5 g/L 내지 약 50 g/L의 탄소원, 예를 들어, 글루코스, 소르비톨 또는 락토스를 포함하는 하룻밤 동안의 종자 배양물에 기반하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하룻밤 동안의 종자 배양물은 옥수수 침지액, 예를 들어 약 2.5 g/L 내지 약 50 g/L의 옥수수 침지액을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 접종%은 초기 충전 부피의 약 5-20% 범위일 수 있다. 접종 후, 반응기가 충전되고/되거나 원하는 상청액 펩티드 농도가 달성될 때까지 선택된 탄소원의 약 50% 내지 약 80% 용액이 반응기에 공급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응기를 충전하는 데 필요한 시간은 약 86시간 내지 약 160시간의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 원하는 펩티드 농도에 도달하는 데 필요한 양은 약 0.8 g/L 내지 약 1.2 g/L의 범위일 수 있다. 발효가 완료되면, 내용물이 세포 분리 장치를 통과하고 물질의 의도된 용도에 따라 선택적으로 농축될 수 있다.
효모 발효 배지에 대한 추가 레시피가 본원에 제공된다.
효모 세포 발효 배지 및 스톡에 대한 레시피는 하기와 같이 기재된다: (1) MSM 배지 레시피: 2 g/L 시트르산나트륨 2수화물; 1 g/L 황산칼슘 2수화물(0.79 g/L 무수 황산칼슘); 42.9 g/L 일염기성 인산칼륨; 5.17 g/L 황산암모늄; 14.33 g/L 황산칼륨; 11.7 g/L 황산마그네슘 7수화물; 2 mL/L PTM1 미량 염 용액; 0.4 ppm 비오틴(500X, 200 ppm 스톡으로부터); 1-2% 순수 글리세롤 또는 기타 탄소원. (2) PTM1 미량 염 용액: 황산구리-5H2O 6.0 g; 요오드화나트륨 0.08 g; 황산망간-H2O 3.0 g; 몰리브덴산나트륨-2H2O 0.2 g; 붕산 0.02 g; 염화코발트 0.5 g; 염화아연 20.0 g; 황산제일철-7H2O 65.0 g; 비오틴 0.2 g; 황산 5.0 ml; 물을 1리터의 최종 부피가 되도록 첨가한다. 클루이베로마이세스 락티스 정의 배지(DMSor)에 대한 예시적인 조성은 하기와 같다: 11.83 g/L KH2PO4, 2.299 g/L K2HPO4, 20 g/L의 발효 가능 당, 예를 들어 갈락토스, 말토스, 라토트리오스, 수크로스, 프룩토스 또는 글루코스 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소화 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨, 1 g/L MgSO4.7H2O, 10 g/L (NH4)SO4, 0.33 g/L CaCl2.2H2O, 1 g/L NaCl, 1 g/L KCl, 5 mg/L CuSO4.5H2O, 30 mg/L MnSO4.H2O, 10 mg/L, ZnCl2, 1 mg/L KI, 2 mg/L CoCl2.6H2O, 8 mg/L Na2MoO4.2H2O, 0.4 mg/L H3BO3, 15 mg/L FeCl3.6H2O, 0.8 mg/L 비오틴, 20 mg/L 판토텐산-Ca, 15 mg/L 티아민, 16 mg/L 미오-이노시톨, 10 mg/L 니코틴산 및 4 mg/L 피리독신.
펩티드 분해
단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 생물학적 샘플 및 용액(예를 들어 세포 배양물 및/또는 발효 동안) 모두에서 분해된다. TVP 펩티드 분해를 검출하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 발효 동안) 펩티드 분해를 검출하는 임의의 잘 알려진 방법이 본원에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 분해는 동위원소 표지 기술; 액체 크로마토그래피/질량 분광측정법(LC/MS); HPLC; 방사성 아미노산 혼입 및 후속 검출, 예를 들어 섬광 계수를 통한 검출; 리포터 단백질, 예를 들어 검출될 수 있는 단백질의 사용(예를 들어, 형광, 분광법, 발광측정법 등에 의해); 하나 이상의 생물발광 단백질 및/또는 형광 단백질 및/또는 이의 융합체의 형광 강도; 펄스 추적 분석(예를 들어 방사성 아미노산으로 세포를 펄스 표지하고 표지되지 않은 전구체를 추적하면서 표지된 단백질의 붕괴를 추적하고, 단백질 합성을 정지시키고 경시적인 총 단백질 수준의 붕괴를 측정함); 사이클로헥시미드-추적 검정을 사용하여 검출될 수 있다;
일부 실시양태에서, 검정은 펩티드 분해를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 샘플은 펩티드의 분해를 통해 생산된 상기 샘플에서의 유리 1차 아민과 반응하도록 작동 가능하고 비형광 화합물과 접촉되고, 그 후 정량되고 표준과 비교될 수 있는 형광 신호를 생성한다. 본 개시내용에 따른 유리 아민에 대한 형광 태그로서 활용될 수 있는 비형광 화합물의 예는 3-(4-카복시벤조일) 퀴놀린-2-카복스알데히드(CBQCA), 플루오레스카민, 및 o-프탈디알데히드이다.
일부 실시양태에서, 리포터 단백질로부터 판독 신호를 결정하는 방법은 리포터 단백질의 성질에 의존한다. 예를 들어, 형광 리포터 단백질의 경우, 판독 신호는 형광 신호의 강도에 상응한다. 판독 신호는, 예를 들어 분광법, 형광측정법, 광측정법 및/또는 발광측정법 기반 방법 및 검출 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법 및 검출 시스템은 당분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 당업자에게 알려진 표준 면역학적 절차가 펩티드 분해를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 분해는 검출 가능한 항체를 사용하는 면역검정을 사용하여 샘플에서 검출될 수 있다. 이러한 면역검정은 예를 들어 응집 검정, ELISA, Pandex 미세형광 검정, 유세포 측정, 혈청 진단 검정 및 면역조직화학적 염색 절차를 포함하며, 이들 모두는 당분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 한 샘플의 수준(예를 들어 형광)은 표준과 비교될 수 있다. 항체는 당분야에 잘 알려진 다양한 수단에 의해 검출 가능하게 만들 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 유용한 마커는 예를 들어 방사성뉴클레오티드, 효소, 형광원, 발색원 및 화학발광 표지를 포함한다.
예시적인 펩티드 분해의 검출 방법은 문헌(미국 특허 번호 5,766,927; 7,504,253; 9,201,073; 9,429,566; 미국 특허 출원 20120028286; Eldeeb et al., A molecular toolbox for studying protein degradation in mammalian cells. J Neurochem.　2019 Nov;151(4):520-533; 및 Buchanan et al., Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in　Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp.　2016; (110): 53975)에 제공되며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
약학적으로 허용 가능한 염
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 염" 및 "농업적으로 허용 가능한 염"은 동의어이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TVP의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물, 결정 형태 및 개별 이성질체, 거울상이성질체, 호변이성질체, 부분입체이성질체 및 전구약물이 활용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 모 화합물의 원하는 약리학적 활성을 보유한다. 이러한 염은 무기산으로 형성된 산 부가염; 유기산으로 형성된 산부가염; 또는 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알루미늄 이온으로 대체될 때 형성된 염을 포함하거나; 에탄올아민 등과 같은 유기 염기와 배위한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 독성 또는 비독성 염을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 통상적인 비독성 염은 푸마레이트, 포스페이트, 시트레이트, 클로리드레이트 등과 같은 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 둘의 혼합물에서 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418)에서 찾을 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 하이드로클로라이드; 나트륨; 설페이트; 아세테이트; 포스페이트 또는 디포스페이트; 크롤라이드; 칼륨; 말레에이트; 칼슘; 시트레이트; 메실레이트; 니트레이트; 타르트레이트; 알류미늄; 또는 글루코네이트 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, 염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 산의 목록은 글리콜산; 히푸르산; 브롬화수소산; 염화수소산; 이소부티르산; 락트산(DL); 락토비온산; 라우르산; 말레산; 말산(-L); 말론산; 만델산(DL); 메탄설폰산; 나프탈렌-1,5-디설폰산; 나프탈렌-2-설폰산; 니코틴산; 질산; 올레산; 옥살산; 팔미트산; 파모산; 인산; 프로피온산; 피로글루탐산(-L); 살리실산; 세바스산; 스테아르산; 숙신산; 황산; 타르타르산(+L); 티오시안산; 톨루엔설폰산(p); 운데실렌산; 1-하이드록시-2-나프토산; 2,2-디클로로아세트산; 2-하이드록시에탄설폰산; 2-옥소글루타르산; 4-아세트아미도벤조산; 4-아미노살리실산; 아세트산; 아디프산; 아스코르브산(L); 아스파르트산(L); 벤젠설폰산; 벤조산; 캄포르산(+); 캄포르-10-설폰산(+); 카프르산(데칸산); 카프로산(헥산산); 카프릴산(옥탄산); 탄산; 신남산; 시트르산; 시클라믹산; 도데실황산; 에탄-1,2-디설폰산; 에탄설폰산; 포름산; 푸마르산; 갈락타르산; 젠티스산; 글루코헵톤산(D); 글루콘산(D); 글루쿠론산(D); 글루탐산; 글루타르산; 또는 글리세로인산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 임의의 유기 또는 무기 부가 염일 수 있다.
일부 실시양태에서, 염은 무기산 및 유기산을 유리산으로 사용할 수 있다. 무기산은 염화수소산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등일 수 있다. 유기산은 시트르산, 아세트산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 메탄 설폰산, 글루콘산, 숙신산, 타르타르산, 갈락투론산, 파모인산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메탄 설폰산, 에탄 설폰산, 4-톨루엔 설폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산, 말론산 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 염은 알칼리 금속 염(나트륨 염, 칼륨 염 등) 및 알칼리 토금속 염(칼슘 염, 마그네슘 염 등)을 포함한다. 예를 들어, 산 부가염은 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 히벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오다이드/요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸 설페이트, 나프탈레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/하이드로겐 포스페이트/디하이드로겐 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글리신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올라민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연 염 등을 포함할 수 있고, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 포름산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 스테아르산, 숙신산, 에틸숙신산, 락토비온산, 글루콘산, 글루코헵톤산, 벤조산산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 라우릴황산, 말산, 아스파르트산, 글루타민산, 아디프산, 시스테인, N-아세틸시스테인, 염화수소산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 요오드화수소산, 니코틴산, 옥살산, 피크르산, 티오시안산, 운데칸산, 폴리아크릴레이트 또는 카복시비닐 중합체와 같은 산과의 염일 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 무기 또는 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 제1철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, 제2철, 망간 염 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 무기 염은 암모늄, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 염이다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 자연 발생 치환 아민을 포함하는 치환 아민, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하는 고리형 아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 피페리딘, 트로메타민 및 콜린이다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 염을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 문헌(J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977))에 약학적으로 허용 가능한 염을 상세히 기재하고 있으며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 염은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 제자리에서, 또는 유리 염기 작용기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써 별도로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 부가염의 예는 염화수소산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로 또는 이온 교환과 같은 당분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약학적으로 허용 가능한 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 할라이드, 하이드록시드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 짝이온을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 염의 예시적인 설명은 문헌(P. H. Stahl and C. G. Wermuth, (editors), Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, John Wiley & Sons, Aug 23, (2002))에 제공되며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
식물 또는 이의 일부로의 TVP 혼입
본원에 기재된 TVP, 및/또는 본원에 기재된 하나 이상의 TVP로 구성되는 살충 단백질은 TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 안정한, 또는 일시적 발현을 위해 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자 및/또는 이의 식물 부분에 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP(또는 하나 이상의 TVP로 구성되는 살충 단백질)는 당분야에 알려진 재조합 기술을 사용하여 식물에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP 또는 하나 이상의 TVP로 구성되는 살충 단백질은 하나 이상의 TVP 단량체로 구성될 수 있는 살충 단백질의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 트랜스제닉 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자와 관련하여, 용어 "TVP"는 또한 TVP-살충 단백질을 포괄하고, "TVP 폴리뉴클레오티드"는 유사하게 하나 이상의 TVP로 구성되는 살충 단백질을 발현 및/또는 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 그룹을 포괄하기 위해 사용된다.
TVP를 식물에 혼입하는(즉, U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드 및/또는 TVP-살충 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물을 만드는) 목표는 곤충에 의해 소비되는 식물 조직에서 발현되는 트랜스제닉 TVP의 곤충 소비를 통해 해충에 TVP 포함 살충 단백질을 전달하는 것이다. 곤충이 그 먹이에서 TVP를 소비하면(예를 들어 TVP로 형질전환된 트랜스제닉 식물을 섭식하는 곤충을 통해), 소비된 TVP는 성장을 억제하거나, 움직임을 손상시키거나, 심지어 곤충을 사멸시키는 능력을 가질 수 있다. 따라서, TVP 폴리뉴클레오티드 및/또는 TVP 폴리펩티드를 발현하는 트랜스제닉 식물은 표피(예를 들어, 엽육); 주피; 체관부; 목관부; 유조직; 후각 조직; 후막 조직; 및 1차 및 2차 분열 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 식물 조직에서 상기 TVP 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드를 발현할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 포스포에놀피루베이트 카복실라제 프로모터를 포함하는 조절 영역에 작동 가능하게 연결되어 식물의 엽육 조직에서 TVP의 발현을 초래할 수 있다.
TVP 및/또는 TVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 발현하는 트랜스제닉 식물은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법 및 프로토콜 중 어느 하나에 의해 생성될 수 있고; 본 발명의 이러한 방법은 뉴클레오티드 작제물을 사용될 식물에 도입하기 위해 특정 방법을 사용할 것을 필요로 하지 않고, 뉴클레오티드 작제물이 식물의 적어도 하나의 세포 내부에 접근할 수 있을 것만을 필요로 한다. 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 뉴클레오티드 작제물을 식물로 도입하는 방법은 당분야에 알려져 있다. "트랜스제닉 식물" 또는 "형질전환된 식물" 또는 "안정적으로 형질전환된" 식물 또는 세포 또는 조직은 외인성 핵산 서열 또는 DNA 단편이 식물 세포로 혼입되거나 통합된 식물을 지칭한다. 이들 핵산 서열은 외인성이거나 형질전환되지 않은 식물 세포에 존재하지 않는 것들뿐만 아니라 내인성이거나 형질전환되지 않은 식물 세포에 존재할 수 있는 것들을 포함한다. "이종성"은 일반적으로 세포 또는 이들이 존재하는 천연 게놈의 일부에 내인성이 아닌 핵산 서열을 지칭하며, 감염, 형질감염, 미세주사, 전기천공, 미세투영 등에 의해 세포에 첨가되었다.
식물 세포의 형질전환은 당분야에 알려진 몇몇 기술 중 하나에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 외인성 또는 이종성 펩티드 또는 관심 폴리펩티드(예를 들어, TVP)를 발현하는 작제물은 유전자의 전사를 유도하는 프로모터 뿐만 아니라 전사 종결 및 폴리아데닐화를 허용하는 3' 비번역 영역을 포함할 것이다. 이러한 작제물의 설계 및 구성은 당분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 유전자는 생성 펩티드가 분비되거나, 그렇지 않으면 식물 세포에서 특정 영역 및/또는 소기관으로 표적화되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 펩티드의 소포체로의 전달을 용이하게 하기 위해 신호 펩티드를 포함하도록 조작될 수 있다. 인트론의 mRNA 가공이 발현을 위해 필요하도록, 인트론을 포함하도록 식물 발현 카세트를 조작하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
전형적으로, 식물 발현 카세트는 식물 형질전환 벡터에 삽입될 수 있다. 이 식물 형질전환 벡터는 식물 형질전환을 달성하는 데 필요한 하나 이상의 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 인접 DNA 절편을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 활용하는 것은 당분야에서 일반적인 관행이다. 이들 벡터는 종종 당분야에서 "이원성 벡터"로 지칭된다. 이원성 벡터뿐만 아니라 헬퍼 플라스미드가 있는 벡터가 가장 종종 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용되며, 여기서는 효율적인 형질전환을 달성하는 데 필요한 DNA 절편의 크기 및 복잡성이 상당히 크고, 기능을 별도의 DNA 분자 상으로 분리하는 것이 유리하다. 이원성 벡터는 전형적으로 T-DNA 전달에 필요한 시스 작용 서열(예를 들어 왼쪽 경계 및 오른쪽 경계), 식물 세포에서 발현할 수 있도록 조작된 선택 가능 마커 및 "관심 유전자"(트랜스제닉 식물의 생성이 필요한 식물 세포에서 발현할 수 있도록 조작된 유전자)를 포함하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 또한 이 플라스미드 벡터에는 박테리아 복제에 필요한 서열이 존재한다. 시스 작용 서열은 식물 세포로의 효율적인 전달 및 여기서의 발현을 허용하는 방식으로 배열된다. 예를 들어, 선택 가능 마커 유전자 및 TVP는 왼쪽 및 오른쪽 경계 사이에 위치한다. 종종 두 번째 플라스미드 벡터는 아그로박테리움에서 식물 세포로 T-DNA 전달을 매개하는 트랜스 작용 인자를 포함한다. 이 플라스미드는 종종 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염을 허용하는 병독성 기능(Vir 유전자)을 포함하고, 당분야에서 이해되는 바와 같이(Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451) 경계 서열 및 vir-매개 DNA 전달에서의 절단에 의해 DNA를 전달한다. 몇몇 유형의 아그로박테리움 균주(예를 들어 LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 등)가 식물 형질전환에 사용될 수 있다. 두 번째 플라스미드 벡터는 미세투영, 미세주사, 전기천공, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 다른 방법으로 식물을 형질 전환하는 데 필요하지 않다.
일반적으로 식물 형질전환 방법에는 이종성 DNA를 표적 식물 세포(예를 들어 미성숙 또는 성숙 배, 현탁 배양물, 미분화 캘러스, 원형질체 등)로 전달한 다음, 형질전환되지 않은 세포 덩어리 그룹으로부터 형질전환된 식물 세포를 회수하기 위해 최대 역치 수준의 적절한 선택(선택 가능 마커 유전자에 의존함)을 적용하는 것이 관여된다. 외식편은 전형적으로 동일한 배지의 신선 공급으로 옮겨지고 일상적으로 배양된다. 이어서, 형질전환된 세포는 최대 역치 수준의 선택 제제가 보충된 재생 배지에 배치된 후 새싹으로 분화된다. 그 다음 새싹은 발근된 새싹 또는 묘목을 회수하기 위해 선택적 발근 배지로 전달된다. 이어서 트랜스제닉 묘목은 성숙 식물로 자라서 번식력이 있는 종자를 생산한다(예를 들어, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). 외식편은 전형적으로 동일한 배지의 신선 공급으로 옮겨지고 일상적으로 배양된다. 트랜스제닉 식물을 생성하는 기술 및 방법에 대한 일반적인 설명은 문헌(Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 and Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120)에서 찾을 수 있다. 형질전환된 물질은 많은 세포를 포함하기 때문에, 형질전환된 및 형질전환되지 않은 세포 모두 대상 임의의 절편의 대상 표적 캘러스 또는 조직 또는 세포군에 존재한다. 형질전환되지 않은 세포를 사멸시키고 형질전환된 세포가 증식하도록 하는 능력이 형질전환된 식물 배양물을 생성한다. 종종, 형질전환되지 않은 세포를 제거하는 능력이 형질전환된 식물 세포의 신속한 회수 및 트랜스제닉 식물의 성공적인 생성에 대한 제한이다.
뉴클레오티드 서열을 식물에 도입하기 위한 프로토콜 뿐만 아니라 형질전환 프로토콜은 형질전환의 표적이 되는 단자엽 또는 쌍자엽과 같은 식물 또는 식물 세포의 유형에 따라 변할 수 있다. 트랜스제닉 식물의 생성은 미세주사, 전기천공, 직접적 유전자 전달, 아그로박테리움에 의한 이종성 DNA의 식물 세포로의 도입(아그로박테리움 매개 형질전환), 입자에 부착된 이종성 외래 DNA로의 식물 세포 충격, 탄도 입자 가속, 에어로졸 빔 형질전환, Lec1 형질전환 및 DNA를 전달하기 위한 다양한 기타 비입자 직접-매개 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇몇 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 예시적인 형질전환 프로토콜은 미국 공개 출원 번호 20010026941; 미국 특허 번호 4,945,050; 국제 공개 번호 WO 91/00915; 및 미국 공개 출원 번호 2002015066에 개시되며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
엽록체가 또한 용이하게 형질전환될 수 있고, 엽록체의 형질전환에 관한 방법은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌(Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606)을 참고한다. 엽록체 형질전환 방법은 선택 가능 마커를 포함하는 DNA의 입자 총 전달 및 상동 재조합을 통한 색소체 게놈으로의 DNA 표적화에 의존한다. 추가로, 색소체 형질전환은 핵-암호화 및 색소체-유도 RNA 중합효소의 조직-선호 발현에 의한 침묵 색소체-유래 트랜스유전자의 트랜스활성화에 의해 달성될 수 있다. 이러한 시스템은 문헌(McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305)에 보고되었다.
이종성 외래 DNA를 식물 세포에 통합한 후, 당업자는 배지에 최대 역치 수준의 적절한 선택 화학물질/시약(예를 들어 항생제)을 적용하여 형질전환되지 않은 세포를 사멸시키고, 상기 선택 처리로부터 생존한 추정 형질전환 세포를 정기적으로 신선 배지로 옮김으로써 상기 세포를 분리 및 성장시킬 수 있다. 적절한 선택과 함께 계속적인 계대 및 유발접종을 통해, 당업자는 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포를 확인하고 증식시킨다. 그런 다음 분자 및 생화학적 방법을 사용하여 트랜스제닉 식물의 게놈에 통합된 관심 이종성 유전자의 존재를 확인할 수 있다.
형질전환된 세포는 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 따라 식물로 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌(McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84)을 참고한다. 그 다음, 이들 식물을 성장시킬 수 있고, 동일한 형질전환된 균주 또는 상이한 균주로 수분될 수 있고, 확인된 원하는 표현형 특성의 구성적 발현을 갖는 잡종이 생성된다. 원하는 표현형 특성의 발현이 안정적으로 유지되고 유전되도록 2세대 이상을 성장시킨 후 원하는 표현형 특성의 발현이 달성되도록 종자가 수확될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 개시내용은 본 발명의 뉴클레오티드 작제물, 예를 들어, 본 발명의 발현 카세트가 이의 게놈에 안정적으로 혼입된 형질전환된 종자("트랜스제닉 종자"로도 지칭됨)를 제공한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 곤충 프로티나제, 프로테아제 및 펩티다제(본원에서 집합적으로 "프로테아제"로 지칭됨)에 대한 기질로서 작용하는 TVP-살충 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, TVP의 발현을 수용할 수 있는 트랜스제닉 식물 또는 그의 일부는 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 유채, 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 표주박, 오이, 미송, 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 상추, 테디 소나무, 기장, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 관상식물, 야자, 목초지 풀, 완두콩, 땅콩, 고추, 비둘기콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박(pumpkin), 라디아타 소나무, 래디쉬, 평지씨, 쌀, 근경, 호밀, 홍화, 관목, 수수, 남부 소나무, 대두, 시금치, 호박(squash), 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 단옥수수, 발삼, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀 식물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 본원에 기재된 DNA 작제물로 초기에 형질전환된 세포로부터 성장시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 특정 조직, 또는 식물 부분, 예를 들어 잎, 줄기, 꽃, 꽃받침, 과일, 뿌리, 종자, 또는 이의 조합에서 암호화된 TVP를 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 식물 종자는 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있고, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TVP 폴리펩티드를 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 식물 종자는 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있고, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TVP 폴리펩티드를 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 G이거나 부재한다); Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 식물 종자는 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있고, TVP는 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 TVP 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 식물 종자는 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있고, TVP 암호화 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 식물 종자는 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있고, TVP는 2개 이상의 TVP 폴리펩티드의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
절단가능 링커 및 절단불가능 링커를 갖는 단백질
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 절단 가능 펩티드에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 TVP를 포함한다. 다른 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 절단 불가능 펩티드에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 TVP를 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 절단 가능 펩티드를 가질 수 있고, 살충 단백질은 곤충 절단가능 링커(L)를 포함하고, 곤충 절단가능 링커는 (TVP-L)n을 포함하는 작제물과 같은 프레임으로 융합되고, "n"은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수이다. 또 다른 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 본원에 기재되고, 곤충 절단가능 링커(L) 및/또는 반복 작제물(L-TVP)n 또는 (TVP-L)n과 작동 가능하게 연결된, TVP와 작동 가능하게 연결된 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 포함하고, n은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수이다.
다양한 실시양태에서, 예시적인 살충 단백질은 (ERSP)-(TVP-L)n; (ERSP)-(L)-(TVP-L)n; (ERSP)-(L-TVP)n; (ERSP)-(L-TVP)n-(L)을 포함하는 단백질 작제물을 포함할 수 있고; n은 1 내지 200 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수이다. 상기 기재된 다양한 관련 실시양태에서, TVP는 상기 언급된 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드이고, L은 절단 불가능 또는 절단 가능 펩티드이고, n은 1 내지 200 범위의 정수, 바람직하게는 1 내지 100 범위의 정수, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 범위의 정수이다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 동일하거나 상이한 TVP 펩티드 및 동일하거나 상이한 곤충 절단 가능 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, C-말단 TVP는 곤충 장 환경에서 절단되도록 작동 가능한 절단 가능 펩티드와 그 C-말단에서 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, N-말단 TVP는 곤충 장 환경에서 절단되도록 작동 가능한 절단 가능 펩티드와 그 N-말단에서 작동 가능하게 연결된다.
곤충 장 환경에서 발견되는 이용 가능한 프로테아제 및 펩티다제 중 일부는 곤충의 수명 단계에 의존하는데, 이러한 효소는 종종 공간적으로 및 시간적으로 발현되기 때문이다. 곤충의 소화계는 소화관 및 관련 샘으로 이루어진다. 음식물이 입으로 들어가고 소화 프로테아제 및 펩티다제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 분비물과 혼합된다. 앞장 및 뒷장은 그 기원이 외배엽이다. 앞장은 일반적으로 날 음식을 저장하는 창고 역할을 한다. 앞장으로부터 음식의 개별 덩어리가 중장(중간장 또는 실)으로 통과된다. 중장은 음식 영양소의 소화 및 흡수 부위이다. 일반적으로 중장에서 특정 프로테아제 및 펩티다제의 존재는 장의 pH를 따른다. 인간 위장관계의 특정 프로테아제 및 펩티다제는 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 카복시펩티다제, 아미노펩티다제 및 디펩티다제를 포함할 수 있다.
곤충의 장 환경은 소화 동안 펩티드 및 단백질이 분해되는 초식동물 종의 소화계 영역을 포함한다. 곤충 장 환경에서 발견되는 이용 가능한 프로테아제 및 펩티다제 중 일부는 (1) 세린 프로테아제; (2) 시스테인 프로테아제; (3) 아스파르트산 프로테아제, 및 (4) 메탈로프로테아제를 포함할 수 있다.
초식 곤충의 소화계에서 두 가지 주요 프로테아제 클래스는 세린 및 시스테인 프로테아제이다. Murdock 등(1987)은 딱정벌레목(Coleoptera)에 속하는 다양한 해충의 중장 효소에 대한 정교한 연구를 수행했으며 Srinivasan 등(2008)은 나비목(Lepidoptera)에 속하는 다양한 해충의 중장 효소에 대해 보고했다. 세린 프로테아제는 유충의 장 환경에 우세하고 나비목의 총 소화 활성의 약 95%에 기여하는 것으로 알려진 반면 딱정벌레목 종은 시스테인 프로테아제를 포함하여 더 넓은 범위의 우세한 장 프로테아제를 가지고 있다.
파파인 패밀리는 광범위한 특이성을 갖는 엔도펩티다제(예컨대 파파인), 매우 좁은 특이성을 갖는 엔도펩티다제(예컨대 글리실 엔도펩티다제), 아미노펩티다제, 디펩티딜-펩티다제 그리고 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 활성을 모두 갖는 펩티다제, 예컨대 카텝신 B 및 H를 포함하여 매우 다양한 활성을 갖는 펩티다제를 포함한다. 다양한 곤충의 중장에서 발견되는 다른 예시적인 프로티나제는 트립신-유사 효소, 예를 들어 트립신 및 키모트립신, 펩신, 카복시펩티다제-B 및 아미노트리펩티다제를 포함한다.
세린 프로테아제는 거의 모든 동물 및 미생물에 널리 분포되어 있다(Joanitti et al., 2006). 고등 유기체에서, 거의 2%의 유전자가 이러한 효소를 코딩한다(Barrette-Ng et al., 2003). 숙주 유기체의 유지 및 생존에 본질적으로 필수 불가결한 세린 프로테아제는 많은 생물학적 공정에서 핵심적인 역할을 한다. 세린 프로테아제는 특히 P1의 잔기가 트립신 유사인지(P1에 Lys/Arg 선호), 키모트립신 유사인지(P1에 Phe/Tyr/Leu와 같은 큰 소수성 잔기) 또는 엘라스타제-유사인지(P1에 Ala/Val과 같은 작은 소수성 잔기)에 의해, 이의 기질 특이성에 의해 전통적으로 분류된다(문헌(Tyndall et al., 2005)에서 개정됨). 세린 프로테아제는 단백분해 효소의 한 클래스로, 그 중심 촉매 기구는 3개의 불변 잔기인 아스파르트산, 히스티딘 및 독특한 반응성의 세린으로 이루어지며, 후자가 "촉매 삼합체"라는 이의 이름을 갖게 한다. Asp-His-Ser 삼합체는 적어도 4개의 상이한 구조적 맥락에서 발견될 수 있다(Hedstrom, 2002). 세린 프로테아제의 이 4개 부류는 키모트립신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 Y 및 Clp 프로테아제로 대표된다. 가장 상세히 연구된 키모트립신 유사 부류의 세 가지 세린 프로테아제는 키모트립신, 트립신 및 엘라스타제이다. 보다 최근에, Ser-His-Glu, Ser-Lys/His, His-Ser-His 및 N-말단 Ser을 포함하는, 새로운 촉매 삼합체 및 이합체를 갖는 세린 프로테아제가 소화에서의 역할에 대해 발견되었다.
곤충의 장 환경에서 발견되는 잘 연구된 소화 효소의 한 클래스는 시스테인 프로테아제 클래스이다. 용어 "시스테인 프로테아제"는 효소의 촉매 부위에 시스테인 잔기의 고반응성 티올기를 보유하는 프로테아제를 설명하기 위한 것이다. 많은 초식 곤충과 식물 기생 선충이 단백질 소화를 위해 적어도 부분적으로 중장 시스테인 프로테아제에 의존한다는 증거가 있다. 이들은 노린재목, 특히 호박벌레(아나사 트리스티스(Anasa tristis)). 녹색노린재(아크로스테르눔 힐라레(Acrosternum hilare)); 립토르투스 클라바투스(Riptortus clavatus); 및 현재까지 조사된 거의 모든 딱정벌레목, 특히 콜로라도감자딱정벌레(렙티노타르사 데앰리네아타(Leptinotarsa deaemlineata)); 삼선감자딱정벌레(레마 트릴리네아타(Lema trilineata)); 아스파라거스딱정벌레(크리오세리스 아스파라기(Crioceris asparagi)); 멕시코콩딱정벌레(에필라크나 바리베스티스(Epilachna varivestis)); 거짓쌀도둑거저리(트리올리움 카스타네움(Triolium castaneum)); 어리쌀도둑거저리(트리볼리움 콘푸섬(Tribolium confusum)); 벼룩딱정벌레(캐톡네마(Chaetocnema) spp., 할티카(Haltica) spp. 및 에피트릭스(Epitrix) spp.); 옥수수뿌리벌레(디아브로티카(Diabrotica) 종); 녹두딱정벌레(칼로소브루커스 아쿨라투에(Callosobruchus aculatue)); 목화바구미(안토노무스 그란디스(Antonomus grandis)); 벼바구미(시토필러스 오리자(Sitophilus oryza)); 옥수수바구미(시토필러스 제아마이스(Sitophilus zeamais)); 곡물바구미(시토필러스 그라나리우스(Sitophilus granarius)); 이집트알팔파바구미(하이페라 포스티카(Hypera postica)); 콩 바구미(아칸토실리데스 옵텍투스(Acanthoseelides obtectus)); 장두(리조페르타 도미니카(Rhyzopertha dominica)); 황색밀웜(테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor)); 총채벌레목(Thysanoptera), 특히 꽃노랑총채벌레(프랭클리니 엘라 옥시덴탈리스(Franklini ella occidentalis)); 파리목, 특히 배잎굴나방(leafminer) spp.(리리오마이자 트리폴리이(Liriomyza trifolii)); 식물 기생 선충, 특히 감자낭종선충(글로보데라(Globodera) spp.), 비트낭종선충(헤테로데라 샤치이(Heterodera schachtii)) 및 뿌리매듭선충(멜로이도자인(Meloidogyne) spp.)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
소화 효소의 또 다른 클래스는 아스파르트산 프로테아제이다. 용어 "아스파르트산 프로테아제"는 효소의 촉매 부위에 2개의 고반응성 아스파르트산 잔기를 보유하고 가장 종종 거의 모든 알려진 아스파르트산 프로테아제의 저분자량 억제제인 펩스타틴과의 특이적 억제를 특징으로 하는 프로테아제를 설명하기 위한 것이다. 많은 초식 곤충이 가장 종종 시스테인 프로테아제와 함께 단백질 소화를 위해 중장 아스파르트산 프로테아제에 부분적으로 의존한다는 증거가 있다. 이들은 특히 노린재목(로드니우스 프롤릭수스(Rodnius prolixus)) 및 빈대(시멕스(Cimex) spp.) 및 피마티대(Phymatidae), 펜타토미대(Pentatomidae), 라이개이대(Lygaeidae) 및 벨로스토마티대(Belostomatidae) 과의 구성원; 딱정벌레목(Coleoptera), 모두 머리대장하목(Cucujiformia)에 속하는, 멜로이대(Meloidae), 크리소멜리대(Chrysomelidae), 코키넬리대(Coccinelidae) 및 브루치대(Bruchidae) 과, 특히 콜로라도감자딱정벌레(렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata)) 삼선감자딱정벌레(레마트리 리네아타(Lematri lineata)); 남부 및 서부옥수수뿌리벌레(디아브로티카 운데심펑크타타(Diabrotica undecimpunctata) 및 디아브로티카 비르기페라(D. virgifera)), 목화바구미(안토노무스 그란디스(Anthonomus grandis)), 호박벌레(아나사트리스티스(Anasatristis)); 벼룩잎벌레(필로트레타 크루시페라(Phyllotreta crucifera)), 브루키드딱정벌레(칼로소브루커스 마쿨라투스(Callosobruchus maculatus)), 멕시코녹두딱정벌레(에필라크나 바리베스티스(Epilachna varivestis)), 대두잎벌레(오돈토타 호르니(Odontota horni)), 가장자리물집딱정벌레(에피카우타 페스티페라(Epicauta pestifera)) 및 거짓쌀도둑 거저리(트리올리움 카스타네움(Triolium castaneum)); 파리목, 특히 집파리(무스카 도메스티카)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 문헌(Terra and Ferreira (1994) Comn. Biochem. Physiol. 109B: 1-62; Wolfson and Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16: 1089-1102)을 참고한다.
식물로의 폴리뉴클레오티드 혼입
트랜스제닉 식물에서 이종성 폴리펩티드의 발현에 관한 난제는 숙주 유기체에서 발현 시 도입된 폴리펩티드의 원하는 효과(예를 들어 살충 활성)를 유지하는 것이며; 이러한 효과를 유지하는 하나의 방식은 작동 가능하게 연결된 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 사용하여 적절한 단백질 폴딩 가능성을 증가시키는 것이다. 트랜스제닉 단백질의 효과를 유지하는 또 다른 방법은 번역 안정화 단백질(STA)을 혼입하는 것이다.
식물은 상기 기재된 임의의 형질감염 방법을 사용하여 TVP 또는 하나 이상의 TVP를 포함하는 TVP-살충 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 식물은 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염될 수 있으며, 상기 TVP는 소포체 신호 펩티드(ERSP); 링커, 번역 안정화 단백질(STA); 또는 이의 조합을 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 또는 식물 게놈은 소포체 신호 펩티드(ERSP); TVP; 및/또는 개재 링커 펩티드(링커 또는 L)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환될 수 있어서, 이종성 DNA로부터 전사된 mRNA가 형질전환된 식물에서 발현되도록 한 후, 상기 mRNA가 펩티드로 번역되도록 한다.
소포체 신호 펩티드(ERSP)
ER에 대한 재조합 단백질의 세포하 표적화는 상기 재조합 단백질에 작동 가능하게 연결된 ERSP의 사용을 통해 달성될 수 있고; 이것은 그러한 단백질의 정확한 조립 및/또는 폴딩, 그리고 식물에서 이러한 재조합 단백질의 고수준 축적을 허용한다. 숙주 단백질의 세포내 저장소로의 구획화에 관한 예시적인 방법은 문헌(McCormick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(2):703-708, 1999; Staub et al., Nature Biotechnology 18:333-338, 2000; Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109, 1998; 및 Stoger et al., Plant Mol. Biol. 42:583-590, 2000)에 개시되어 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 재조합 단백질의 정확한 조립 및/또는 폴딩을 달성하는 하나의 방식은 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 관심 재조합 단백질에 작동 가능하게 연결하는 것이다.
일부 실시양태에서, 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 포함하는 펩티드는 TVP에 작동 가능하게 연결될 수 있으며(ERSP-TVP로 지정됨), 상기 ERSP는 상기 펩티드의 N-말단이다. 일부 실시양태에서, ERSP 펩티드는 3 내지 60개 아미노산 길이, 5 내지 50개 아미노산 길이, 20 내지 30개 아미노산 길이이다.
일부 실시양태에서, ERSP는 하기: BAAS; 담배 엑스텐신 신호 펩티드; 변형된 담배 엑스텐신 신호 펩티드; 또는 주니페루스 아세이(Juniperus ashei)의 Jun a 3 신호 펩티드 중 하나를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 식물은 본원에 소포체 신호 펩티드(ERSP)로서 기재된 임의의 펩티드 및 TVP를 암호화하는 뉴클레오티드로 형질전환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 포함하는 단백질은 TVP 및 개재 링커 펩티드(L 또는 링커)에 작동 가능하게 연결될 수 있고; 이러한 작제물은 ERSP-L-TVP 또는 ERSP-TVP-L로 지정되며, 상기 ERSP는 상기 단백질의 N-말단이고, 상기 L 또는 링커는 TVP의 N-말단측(상류) 또는 TVP의 C-말단측(하류)에 있을 수 있다. 본원에 기재된 임의의 ERSP 또는 TVP를 포함하는 ERSP-L-TVP 또는 ERSP-TVP-L로 지정된 단백질은 절단불가능 링커 펩티드 또는 절단가능 링커 펩티드일 수 있는 링커 "L"을 가질 수 있고, 단백질 발현 공정 동안 식물 세포에서 절단될 수 있거나 곤충 장 환경 및/또는 혈액림프 환경에서 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 하기 서열: IGER(서열 번호 31), EEKKN(서열 번호 32), 및 EMFKHGL(서열 번호 33), ALKFLV(서열 번호 61), 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에 기재되거나 본 문헌에 의해 교시된 임의의 개재 링커 펩티드(링커 또는 L)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 포함하는 단백질은 TVP에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 이는 다시 번역 안정화 단백질(STA)에 작동 가능하게 연결된다. 여기서, 이 구조는 ERSP-STA-TVP 또는 ERSP-TVP-STA로 지정되며, 상기 ERSP는 상기 단백질의 N-말단이고 상기 STA는 TVP의 N-말단측(상류) 또는 TVP의 C-말단측(하류)에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 ERSP 또는 TVP를 포함하는, ERSP-STA-TVP 또는 ERSP-TVP-STA로 지정된 단백질은 STA, 예를 들어 GFP(녹색 형광 단백질; 서열 번호 34; NCBI 접근 번호 P42212), 또는 Jun a 3(주니페루스 아세이; 서열 번호 36; NCBI 접근 번호 P81295.1)을 포함하는 본 문헌에 의해 기재되거나 교시된 임의의 번역 안정화 단백질에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
식물은 전술한 형질감염 방법 중 어느 하나를 사용하여 TVP 또는 하나 이상의 TVP를 포함하는 살충 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 식물은 ERSP, 링커 및/또는 STA 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 또는 식물 게놈은 소포체 신호 펩티드(ERSP); TVP; 및/또는 개재 링커 펩티드(링커 또는 L)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 혼입하도록 형질감염될 수 있어서 이종성 DNA로부터 전사된 mRNA가 형질전환된 식물에서 발현되도록 한다.
본 개시내용은 단자엽 및 쌍자엽을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있다. 트랜스제닉 접근 또는 PEP가 특히 유용한 접근이 될 작물은 알팔파, 목화, 토마토, 옥수수(maize), 밀, 옥수수(corn), 단옥수수, 자주개자리, 대두, 수수, 완두, 아마씨, 홍화, 평지씨, 오일 종자 평지, 쌀, 대두, 보리, 해바라기, 나무(침엽수 및 낙엽수 포함), 꽃(상업적으로 및 온실에서 재배되는 것들 포함), 들판 루핀, 스위치그래스, 사탕수수, 감자, 토마토, 담배, 십자화과 식물, 고추, 사탕무, 보리, 및 오일 종자 평지, 브라시카 sp., 호밀, 기장, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤류 나무, 코코아, 차 식물, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 귀리, 야채, 관상식물 및 침엽수를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TVP 발현 개방 판독 프레임(ORF)은 식물이 mRNA를 발현할 수 있게 할 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이는 다시 펩티드로 번역되어 발현되고, 적절하게 폴딩되고/되거나 상기 단백질이 하나 이상의 해충을 억제 및/또는 사멸시키기 충분한 용량을 제공하는 정도로 축적될 것이다. 한 실시양태에서, 단백질 TVP 발현 ORF의 한 예는 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드(tvp), "ersp"(즉, ERSP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), "링커"(즉, 링커 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), "sta"(즉, STA 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), 또는 이의 임의의 조합일 수 있으며, 다음 공식 형태로 기재될 수 있다:
ersp-sta-(링커 i-tvp j)n, 또는 ersp -( tvp j - 링커 i ) n - sta
폴리뉴클레오티드 공식의 상기 예시적인 실시양태는 하기 단백질 복합체: 각 구성성분을 분리하기 위해 대시 기호가 있는 4개의 가능한 펩티드 구성성분을 포함하는, ERSP-STA-(링커I-TVPJ)N가 발현되도록 할 것이다. ersp의 뉴클레오티드 구성성분은 식물 소포체 수송 신호 펩티드(ERSP)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편이다. sta 구성성분은 식물에서 발현된 TVP의 축적을 돕는 번역 안정화 단백질(STA)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편이지만, 일부 실시양태에서, sta의 포함은 TVP 발현 ORF에 필요하지 않을 수 있다. 링커 i 구성성분은 TVP를 ORF에 포함된 다른 구성성분 및 번역 안정화 단백질로부터 분리하기 위해 개재 링커 펩티드(L 또는 링커)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편이다. 아래첨자 문자 "i"는 일부 실시양태에서 상이한 유형의 링커 펩티드가 TVP 발현 ORF에 사용될 수 있음을 표시한다. 구성성분 "tvp"는 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편(U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드 서열로도 알려짐)을 표시한다. 아래첨자 "j"는 상이한 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드가 TVP 발현 ORF에 포함될 수 있음을 표시한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드 서열은 아미노산 치환 또는 아미노산 결실을 갖는 TVP를 암호화할 수 있다. "(링커 i - tvp j)n"에 나타낸 아래 첨자 "n"은 개재 링커 펩티드 및 TVP를 암호화하는 뉴클레오티드의 구조가 동일한 TVP 발현 ORF의 동일한 개방 판독 프레임에서 "n"번 반복될 수 있음을 표시하며, "n"은 1 내지 10의 임의의 정수일 수 있고; "n"은 1 내지 10일 수 있고, 구체적으로 "n"은 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있고, 일부 실시양태에서 "n"은 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 반복부는 상이한 개재 링커(링커) 및 상이한 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 포함할 수 있다. 동일한 TVP 발현 ORF 내의 반복부를 포함하는 상이한 폴리뉴클레오티드 절편은 모두 동일한 번역 프레임에 있다. 일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF에 sta 폴리뉴클레오티드의 포함이 필요하지 않을 수 있다. 예를 들어, ersp 폴리뉴클레오티드 서열은 링커 없이 TVP 변이체 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 직접 연결될 수 있다.
상기 예시적인 공식에서, 폴리펩티드 "TVP"를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 "tvp"는 임의의 변이체 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "tvp" 폴리뉴클레오티드는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TVP를 코딩할 수 있다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, "tvp" 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화할 수 있다.
일부 실시양태에서, "tvp" 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같다.
상기 예시적인 공식에서, 폴리펩티드 "TVP"를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 "tvp"는 임의의 변이체 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "tvp" 폴리뉴클레오티드는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화할 수 있고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-X6
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 G이거나 부재한다); Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 그 5'-단부에서 ersp로 시작된다. TVP가 트랜스제닉 식물에서 발현될 때 적절하게 폴딩되고 기능하기 위해 ersp 뉴클레오티드가 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 같은 프레임으로 융합되어야 한다. 세포 번역 공정 동안, 번역된 ERSP는 신호 인식 입자라는 세포 구성성분과 결합하여 번역되는 TVP가 식물 세포의 소포체(ER)에 삽입되도록 유도할 수 있다. ER 내에서 ERSP 펩티드는 신호 펩티다제에 의해 절단되고 TVP는 ER 내로 방출되며, TVP는 번역 후 변형 공정, 예를 들어 디설피드 결합 형성 동안 적절히 폴딩된다. 어떠한 추가적인 체류 단백질 신호 없이, 단백질은 ER을 통해 골지체로 수송되고, 최종적으로 원형질막 외부 및 아포플라스틱 공간 내로 분비된다. TVP는 식물에서 살충 용량에 도달하기 위해 아포플라스틱 공간에서 효율적으로 축적될 수 있다.
ERSP 펩티드는 식물 번역 TVP 복합체의 N-말단 영역에 있으며 ERSP 부분은 약 3 내지 60개의 아미노산으로 이루어진다. 일부 실시양태에서 이는 5 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시양태에서 이는 10 내지 40개 아미노산이지만 가장 종종 15 내지 20개; 20 내지 25개; 또는 25 내지 30개의 아미노산으로 이루어진다. ERSP는 단백질의 수송을 유도하기 때문에 신호 펩티드로 불린다. 신호 펩티드는 또한 표적화 신호, 신호 서열, 운송 펩티드 또는 편재 신호로 불릴 수 있다. ER 수송을 위한 신호 펩티드는 종종 15-30개 아미노산 잔기 길이이고 양으로 하전된 아미노 말단 및 극성이지만 하전되지 않은 카복시 말단 영역이 측면에 배치된 소수성 잔기 코어를 포함하는 삼중 구조를 가지고 있다(Zimmermann, et al, "Protein translocation across the ER membrane," Biochimica et Biohysica Acta, 2011, 1808: 912-924).
많은 ERSP가 알려져 있다. ERSP가 식물 ERSP에서 유래될 필요는 없으며, 비 식물 ERSP는 본원에 기재된 절차와 함께 작동할 것이다. 그러나 많은 식물 ERSP가 잘 알려져 있으며 본원에서 일부 식물 유래 ERSP에 대해 설명한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ERSP는 보리 알파-아밀라제 신호 펩티드(BAAS)일 수 있으며, 이는 식물, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)로부터 유래되고 하기: MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG(서열 번호 37)와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
발현되고 식물의 아포플라스틱 공간 내로 방출되는 것으로 알려진 단백질의 게놈 서열로부터 선택되는 식물 ERSP는 BAAS, 당근 엑스텐신 및 담배 PR1과 같은 예를 포함한다. 하기 참고문헌은 추가 설명을 제공하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다: 문헌(De Loose, M. et al. "The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts" Gene, 99 (1991) 95-100)에서, De Loose, M. 등은 그 서열이 단백질의 소포체로의 전취를 위한 전형적인 신호 펩티드를 포함하는, 니코티아나 플럼바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia)로부터의 연장-암호화 유전자의 구조 분석을 설명하였으며; 문헌(Chen, M.H. et al. "Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells" Plant Physiology, 2004 Jul; 135(3): 1367-77. Epub 2004 Jul 2)에서, Chen, M.H. 등은 트랜스제닉 담배에서 그 신호 펩티드가 있거나 없는 α-아밀라제의 발현을 분석하여 식물 세포에서 α-아밀라제의 세포 하 편재를 연구했다. 이들 참고문헌 및 기타 문헌은 본원에 기재된 방법, 절차 및 펩티드, 단백질 및 뉴클레오티드 복합체 및 작제물에서 사용될 수 있는 신호 펩티드를 교시 및 개시한다.
담배 엑스텐신 신호 펩티드 모티프는 ERSP의 또 다른 예시적인 유형이다. 그 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌(Memelink et al, the Plant Journal, 1993, V4: 1011-1022; Pogue GP et al, Plant Biotechnology Journal, 2010, V8: 638-654)을 참고한다.
일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 담배 엑스텐신 신호 펩티드 모티프를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 서열 번호 38에 따른 엑스텐신 모티프를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 서열 번호 39에 따른 엑스텐신 모티프를 가질 수 있다.
엑스텐신 신호 모티프가 있는 실시예를 생성하는 방법의 예시적인 예는 하기와 같다. 엑스텐신 모티프를 암호화하는 DNA 서열을 4개의 합성 프라이머를 사용한 올리고 확장 PCR을 사용하여 설계한다(예를 들어, 서열 번호 40 또는 서열 번호 41에 나타낸 DNA 서열); 제한 부위와 같은 단부 부위, 예를 들어 5'-단부의 Pac I 제한 부위 및 3'-단부의 GFP 서열의 5'-단부는 PCR을 사용하여 엑스텐신 DNA 서열이 주형으로 작용하고 단편으로 생성되어 부가할 수 있다; 단편은 TVP 발현 ORF, 예를 들어 pFECT 벡터에 포함된 "gfp-l-tvp"를 암호화하는 DNA 서열을 증폭하기 위해 정방향 PCR 프라이머로 사용되어(N'에서 C' 말단으로) "ERSP-GFP-L-TVP"를 암호화하는 TVP 발현 ORF를 생성하고, ERSP는 엑스텐신이다. 생성 DNA 서열은 FECT 벡터의 Pac I 및 Avr II 제한 부위로 클로닝되어 TVP에 융합된 GFP의 일시적 식물 발현을 위한 pFECT-TVP 벡터를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예시적인 발현 시스템은 TVP 발현 ORF를 포함하는 FECT 발현 벡터를 포함할 수 있고 아그로박테리움, GV3101로 형질전환되고, 형질전환된 GV3101이 TVP 발현 ORF의 일시적인 발현을 위해 담배 잎에 주사된다.
번역 안정화 단백질(STA)
번역 안정화 단백질(STA)은 식물 조직에서 TVP의 양을 증가시킬 수 있다. TVP 발현 ORF 중 하나인 ERSP-TVP는 형질감염된 식물에서 적절하게 폴딩된 TVP를 발현하기 충분하지만, 일부 실시양태에서 식물을 해충 손상으로부터 효과적으로 보호하기 위해서는 식물 발현 TVP의 축적을 필요로 할 수 있다. 적절하게 구성된 TVP 발현 ORF의 형질감염으로, 트랜스제닉 식물은 정확하게 폴딩된 TVP를 더 많이 발현하고 축적할 수 있다. 식물이 적절하게 폴딩된 TVP를 더 많이 축적할 때, 식물을 공격하고 먹는 해충을 보다 쉽게 저항, 억제 및/또는 사멸시킬 수 있다. 트랜스제닉 조직에서 폴리펩티드의 축적을 증가시키는 한 가지 방법은 번역 안정화 단백질(STA)을 사용하는 것이다. 번역 안정화 단백질은 식물 조직에서 TVP의 축적을 상당히 증가시키고, 따라서 해충 내성과 관련하여 TVP로 형질감염된 식물의 유효성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 번역 안정화 단백질은 단백질 분해의 세포 공정에 의해 표적화되지 않고 세포에서 축적될 수 있는 충분한 3차 구조를 갖는 단백질이다. 하기 공식은 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드 서열과 융합된 안정화 단백질을 암호화하는 TVP 발현 ORF의 두 가지 예를 기재한다:
ersp - sta -l- tvp 또는 ersp - tvp -l- sta
일부 실시양태에서, 번역 안정화 단백질은 또 다른 단백질의 도메인일 수 있거나 전체 단백질 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 번역 안정화 단백질은 5 내지 50개 아미노산, 50 내지 250개 아미노산(예를 들어, GNA), 250 내지 750개 아미노산(예를 들어, 키티나제) 및 750 내지 1500개 아미노산(예를 들어, 인핸신)일 수 있다.
번역 안정화 단백질의 한 실시양태는 적어도 하나의 TVP를 포함하는 융합 단백질의 중합체일 수 있다. 번역 안정화 단백질의 특정 예가 번역 안정화 단백질의 사용을 예시하기 위해 본원에 제공된다. 이 예는 어떤 방식으로든 개시내용이나 청구 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 유용한 번역 안정화 단백질은 당분야에 잘 알려져 있고, 이러한 유형의 임의의 단백질은 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 펩티드의 생산을 평가하고 시험하기 위한 절차는 모두 당분야에 알려져 있고 본원에 기재되어 있다. 하나의 번역 안정화 단백질의 한 예는 녹색-형광 단백질(GFP)(서열 번호 34; NCBI 접근 번호 P42212.1)이다.
번역 안정화 단백질의 추가 예는 하기 참고 문헌(Kramer, K.J. et al. "Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta" Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 23, Issue 6, September 1993, pp. 691-701. Kramer, K.J. et al. isolated and sequenced a chitinase-encoding cDNA from the tobacco hornworm, Manduca sexta. Hashimoto, Y. et al. "Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus" Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651)에서 찾을 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 참조로 포함된다. 이들 참고문헌 및 기타 문헌은 본원에 기재된 방법, 절차 및 펩티드, 단백질 및 뉴클레오티드 복합체 및 작제물에서 사용될 수 있는 번역 안정화 단백질을 교시 및 개시한다.
일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 STA를 포함하는 TVP 발현 ORF를 사용하여 식물로, 예를 들어 담배 식물, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, STA는 Jun a 3일 수 있다. 성숙 Jun a 3는 일부 사람들에게는 알레르겐이기도 한 약 30 kDa의 식물 방어 단백질이다. Jun a 3는 주니페루스 아세이(Juniperus ashei) 나무에 의해 생산되며 일부 실시양태에서는 번역 안정화 단백질(STA)로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Jun a 3 아미노산 서열은 서열 번호 36에 나타낸 서열일 수 있다. 다른 실시양태에서, Jun a 3 아미노산 서열은 서열 번호 42에 나타낸 서열일 수 있다.
링커
링커 단백질은 TVP 발현 ORF를 이루는 상이한 모티프의 적절한 폴딩을 보조한다. 본 발명에 기재된 TVP 발현 ORF는 발현 ORF에 다중 TVP 도메인 발현이 관여되는 경우, TVP(tvp)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 번역 안정화 단백질(sta) 사이, 또는 TVP를 암호화하는 다중 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이, 즉 (l- tvp) N 또는 (tvp -l) N 사이에 개재 링커 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 또한 혼입한다. 개재 링커 펩티드(링커 또는 L 또는 LINK)는 발현된 TVP 작제물의 상이한 부분을 분리하고, 발현 공정 동안 복합체의 상이한 부분의 적절한 폴딩을 돕는다. 발현된 TVP 작제물에서, 상이한 개재 링커 펩티드가 상이한 기능적 도메인을 분리하는 데 관여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 TVP에 부착되고 이 2가 기는 보호될 식물에서 적절하게 폴딩된 TVP의 축적을 용이하게 하기 위해 최대 10회(N=1-10), 가능하게는 10회 초과(예를 들어 N=200) 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개재 링커 펩티드는 1 내지 30개 아미노산 길이일 수 있다. 그러나 이는 식물에서 발현되는 TVP에서 필수 구성성분은 아니다. 절단가능 링커 펩티드는 해충 손상과 관련하여 TVP가 식물에 제공하는 보호를 개선하기 위해 형질전환된 식물에서 발현된 TVP 복합체로부터 적절하게 TVP를 방출하도록 TVP 발현 ORF에 대해 설계될 수 있다. 개재 링커 펩티드의 한 유형은 식물 절단가능 링커 펩티드이다. 이러한 유형의 링커 펩티드는 식물 번역 후 변형 동안 발현된 TVP 발현 ORF 복합체로부터 완전히 제거될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이러한 유형의 개재 링커 펩티드에 의해 연결된 적절하게 폴딩된 TVP는 식물에서 번역-후 변형 동안 발현된 TVP 발현 ORF 복합체로부터 식물 세포에서 방출될 수 있다.
절단 가능 개재 링커 펩티드의 또 다른 유형은 식물에서 발현 공정 동안 절단될 수 없다. 그러나 이는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파르테이트 프로테아제 또는 메탈로프로테아제에 특이적인 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 절단가능 링커 펩티드의 유형은 곤충 및 나비목 장 환경 및/또는 곤충 혈액림프 및 나비목 혈액림프 환경에서 발견되는 프로테아제에 의해 소화되어 곤충 장 또는 혈액림프에서 TVP를 방출할 수 있다. 본 개시내용에 의해 교시된 정보를 사용하여 본 발명에 유용할 링커의 다른 예를 만들거나 발견하는 것은 당업자에게 일상적인 문제일 것이다.
일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 개재 링커의 절단 가능 유형, 예를 들어아미노산 코드 "IGER"(서열 번호 31)을 갖는 서열 번호 31에 열거된 유형을 포함할 수 있다. 이 개재 링커의 분자량은 473.53달톤이다. 다른 실시양태에서, 개재 링커 펩티드(링커)는 또한 임의의 유형의 프로테아제 절단 부위가 없는 것, 즉 절단 불가능 개재 링커 펩티드, 예를 들어 링커 "ETMFKHGL"(서열 번호 33)일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 2개 이상의 절단 가능 펩티드를 가질 수 있고, 살충 단백질은 곤충 절단가능 링커(L)를 포함하고, 곤충 절단가능 링커는 (TVP-L)n을 포함하는 작제물과 같은 프레임으로 융합되고, "n"은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수이다. 또 다른 실시양태에서, TVP-살충 단백질, 및 본원에 기재된 바와 같이 TVP와 작동 가능하게 연결된 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 포함하며, 이는 곤충 절단가능 링커(L) 및/또는 반복 작제물(L-TVP)n 또는 (TVP-L)n과 작동 가능하게 연결되고, n은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수이다.
일부 실시양태에서, 소포체 신호 펩티드(ERSP)를 포함하는 단백질은 TVP 및 개재 링커 펩티드(L 또는 링커)에 작동 가능하게 연결될 수 있고; 이러한 작제물은 ERSP-L-TVP 또는 ERSP-TVP-L로 지정되며, 상기 ERSP는 상기 단백질의 N-말단이고, 상기 L 또는 링커는 TVP의 N-말단측(상류) 또는 TVP의 C-말단측(하류)에 있을 수 있다. 본원에 기재된 임의의 ERSP 또는 TVP를 포함하는 ERSP-L-TVP 또는 ERSP-TVP-L로 지정된 단백질은 절단불가능 링커 펩티드 또는 절단가능 링커 펩티드일 수 있고, 단백질 발현 공정 동안 식물 세포에서 절단될 수 있거나 곤충 장 환경 및/또는 혈액림프 환경에서 절단될 수 있는 링커 "L"을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 하기 서열: IGER(서열 번호 181), EEKKN, (서열 번호 182), 및 EMFKHGL(서열 번호 183), 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에 기재되거나 본 문헌에 의해 교시된 임의의 개재 링커 펩티드(링커 또는 L)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 하기: ALKFLV(서열 번호 61), ALKLFV(서열 번호 62), IFVRLR(서열 번호 63), LFAAPF(서열 번호 64), ALKFLVGS(서열 번호 65), ALKLFVGS(서열 번호 66), IFVRLRGS(서열 번호 67), LFAAPFGS(서열 번호 68), LFVRLRGS(서열 번호 69), 및/또는 LGERGS(서열 번호 70) 중 하나 이상일 수 있다.
상기 링커의 예시적인 설명, 및 이를 제조 및 사용하는 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 US20180362598A1에 제공되며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
다양한 실시양태에서, 예시적인 살충 단백질은 (ERSP)-(TVP-L)n; (ERSP)-(L)-(TVP-L)n; (ERSP)-(L-TVP)n; (ERSP)-(L-TVP)n-(L)을 포함하는 단백질 작제물을 포함할 수 있고; n은 1 내지 200 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수이다. 상기 기재된 다양한 관련 실시양태에서, TVP는 Ta1b 변이체 펩티드이고, L은 절단 불가능 또는 절단 가능 펩티드이고, n은 1 내지 200 범위의 정수, 바람직하게는 1 내지 100 범위의 정수, 보다 바람직하게는 1 내지 10 범위의 정수이다. 일부 실시양태에서, TVP-살충 단백질은 동일하거나 상이한 TVP 펩티드 및 동일하거나 상이한 곤충 절단 가능 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, C-말단 TVP는 곤충 장 환경에서 절단되도록 작동 가능한 절단 가능 펩티드와 그 C-말단에서 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, N-말단 TVP는 곤충 장 환경에서 절단되도록 작동 가능한 절단 가능 펩티드와 그 N-말단에서 작동 가능하게 연결된다.
곤충 장 환경에서 발견되는 이용 가능한 프로테아제 및 펩티다제 중 일부는 곤충의 수명 단계에 의존하는데, 이러한 효소는 종종 공간적으로 및 시간적으로 발현되기 때문이다. 곤충의 소화계는 소화관 및 관련 샘으로 이루어진다. 음식물이 입으로 들어가고 소화 프로테아제 및 펩티다제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 분비물과 혼합된다. 앞장 및 뒷장은 그 기원이 외배엽이다. 앞장은 일반적으로 날 음식을 저장하는 창고 역할을 한다. 앞장으로부터, 음식의 개별 덩어리는 중장(중간장 또는 실)으로 통과된다. 중장은 음식 영양소의 소화 및 흡수 부위이다. 일반적으로 중장에서 특정 프로테아제 및 펩티다제의 존재는 장의 pH를 따른다. 인간 위장관계의 특정 프로테아제 및 펩티다제는 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 카복시펩티다제, 아미노펩티다제 및 디펩티다제를 포함할 수 있다.
곤충의 장 환경은 소화 동안 펩티드 및 단백질이 분해되는 초식 동물 종의 소화계의 영역을 포함한다. 곤충 장 환경에서 발견되는 이용 가능한 프로테아제 및 펩티다제 중 일부는 (1) 세린 프로테아제; (2) 시스테인 프로테아제; (3) 아스파르트산 프로테아제, 및 (4) 메탈로프로테아제를 포함할 수 있다.
초식 곤충의 소화계에서 두 가지 주요 프로테아제 클래스는 세린 및 시스테인 프로테아제이다. Murdock 등(1987)은 딱정벌레목에 속하는 다양한 해충의 중장 효소에 대한 정교한 연구를 수행한 반면, Srinivasan 등(2008)은 나비목에 속하는 다양한 해충의 중장 효소에 대해 보고했다. 세린 프로테아제는 유충의 장 환경에 우세하고 나비목의 총 소화 활성의 약 95%에 기여하는 것으로 알려진 반면 딱정벌레목 종은 시스테인 프로테아제를 포함하여 더 넓은 범위의 우세한 장 프로테아제를 가지고 있다.
파파인 패밀리는 광범위한 특이성을 갖는 엔도펩티다제(예를 들어 파파인), 매우 좁은 특이성을 갖는 엔도펩티다제(예를 들어 글리실 엔도펩티다제), 아미노펩티다제, 디펩티딜-펩티다제 그리고 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 활성을 모두 갖는 펩티다제(예컨대 카텝신 B 및 H)를 포함하는 매우 다양한 활성을 갖는 펩티다제를 포함한다. 다양한 곤충의 중장에서 발견되는 다른 예시적인 프로티나제는 트립신-유사 효소, 예를 들어 트립신 및 키모트립신, 펩신, 카복시펩티다제-B 및 아미노트리펩티다제를 포함한다.
세린 프로테아제는 거의 모든 동물 및 미생물에 널리 분포되어 있다(Joanitti et al., 2006). 고등 유기체에서, 거의 2%의 유전자가 이러한 효소를 코딩한다(Barrette-Ng et al., 2003). 숙주 유기체의 유지 및 생존에 본질적으로 필수 불가결한 세린 프로테아제는 많은 생물학적 공정에서 핵심적인 역할을 한다. 세린 프로테아제는 특히 P1의 잔기가 트립신 유사인지(P1에 Lys/Arg 선호), 키모트립신 유사인지(P1에 Phe/Tyr/Leu와 같은 큰 소수성 잔기) 또는 엘라스타제-유사인지(P1에 Ala/Val과 같은 작은 소수성 잔기)에 의해, 이의 기질 특이성에 의해 전통적으로 분류된다(문헌(Tyndall et al., 2005)에서 개정됨). 세린 프로테아제는 단백분해 효소의 한 클래스로, 그 중심 촉매 기구는 3개의 불변 잔기, 즉 아스파르트산, 히스티딘 및 독특한 반응성 세린으로 이루어지며, 후자는 "촉매 삼합체"라는 이의 이름을 갖게 한다. Asp-His-Ser 삼합체는 적어도 4개의 상이한 구조적 맥락에서 발견될 수 있다(Hedstrom, 2002). 세린 프로테아제의 이 4개 부류는 키모트립신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 Y 및 Clp 프로테아제로 대표된다. 가장 상세히 연구된 키모트립신 유사 부류의 세 가지 세린 프로테아제는 키모트립신, 트립신 및 엘라스타제이다. 보다 최근에, Ser-His-Glu, Ser-Lys/His, His-Ser-His 및 N-말단 Ser을 포함하는 새로운 촉매 삼합체 및 이합체를 갖는 세린 프로테아제가 소화에서의 이의 역할에 대해 발견되었다.
곤충의 장 환경에서 발견되는 잘 연구된 소화 효소의 한 클래스는 시스테인 프로테아제 클래스이다. 용어 "시스테인 프로테아제"는 효소의 촉매 부위에서 시스테인 잔기의 고반응성 티올기를 보유하는 프로테아제를 설명하기 위한 것이다. 많은 초식 곤충 및 식물 기생 선충이 단백질 소화를 위해 적어도 부분적으로 중장 시스테인 프로테아제에 의존한다는 증거가 있다. 이들은 노린재목, 특히 호박벌레(아나사 트리스티스), 녹색노린재(아크로스테르눔 힐라레); 립토르투스 클라바투스; 및 현재까지 조사된 거의 모든 딱정벌레목, 특히 콜로라도감자딱정벌레(렙티노타르사 데앰리네아타); 삼선감자딱정벌레(레마 트릴리네아타); 아스파라거스딱정벌레(크리오세리스 아스파라기); 멕시코콩딱정벌레(에필라크나 바리베스티스); 거짓쌀도둑거저리(트리올리움 카스타네움); 어리쌀도둑거저리(트리볼리움 콘푸섬); 벼룩딱정벌레(캐톡네마 spp., 할티카 spp. 및 에피트릭스 spp.); 옥수수뿌리벌레(디아브로티카 spp.); 녹두딱정벌레(칼로소브루커스 아쿨라투에); 목화바구미(안토노무스 그란디스); 벼바구미(시토필러스 오리자); 옥수수바구미(시토필러스 제아마이스); 곡물바구미(시토필러스 그라나리우스); 이집트알팔파바구미(하이페라 포스티카); 콩 바구미(아칸토실리데스 옵텍투스); 장두(리조페르타 도미니카); 황색밀웜(테네브리오 몰리토르); 총채벌레목, 특히 꽃노랑총채벌레(프랭클리니 엘라 옥시덴탈리스; 파리목, 특히 배잎굴나방 spp.(리리오마이자 트리폴리이); 식물 기생 선충, 특히 감자낭종선충(글로보데라 spp.), 비트낭종선충(헤테로데라 샤치이) 및 뿌리매듭선충(멜로이도자인 spp.)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
소화 효소의 또 다른 클래스는 아스파르트산 프로테아제이다. 용어 "아스파르트산 프로테아제"는 효소의 촉매 부위에 2개의 고반응성 아스파르트산 잔기를 보유하고 가장 종종 거의 모든 알려진 아스파르트산의 저분자량 억제제인 펩스타틴으로의 그 특이적 억제를 특징으로 하는 프로테아제를 설명하기 위한 것이다. 많은 초식 곤충이 가장 종종 시스테인 프로테아제와 함께 단백질 소화를 위해 중장 아스파르트산 프로테아제에 부분적으로 의존한다는 증거가 있다. 이들은 특히 노린재목(로드니우스 프롤릭수스) 및 빈대(시멕스 spp.) 및 피마티대, 펜타토미대, 라이개이대 및 벨로스토마티대 과의 구성원; 딱정벌레목, 모두 머리대장하목에 속하는, 멜로이대, 크리소멜리대, 코키넬리대 및 브루치대 과의 구성원, 특히 콜로라도감자딱정벌레(렙티노타르사 데셈리네아타) 삼선감자딱정벌레(레마트리 리네아타); 남부 및 서부옥수수뿌리벌레(디아브로티카 운데심펑크타타 및 디아브로티카 비르기페라), 목화바구미(안토노무스 그란디스), 호박벌레(아나사트리스티스); 벼룩잎벌레(필로트레타 크루시페라), 브루키드딱정벌레(칼로소브루커스 마쿨라투스), 멕시코녹두딱정벌레(에필라크나 바리베스티스), 대두잎벌레(오돈토타 호르니), 가장자리물집딱정벌레(에피카우타 페스티페라) 및 거짓쌀도둑 거저리(트리올리움 카스타네움); 파리목, 특히 집파리(무스카 도메스티카)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 문헌(Terra and Ferreira (1994) Comn. Biochem. Physiol. 109B: 1-62; Wolfson and Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16: 1089-1102)을 참고한다.
개재 링커 펩티드의 다른 예는 하기 참고문헌에서 찾을 수 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다: 문헌(Heath et al. "Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata" European Journal of Biochemistry, 1995; 230: 250-257)에서 개시된 바와 같이, 식물 발현 세린 프로티나제 억제제 전구체는 6개의 동일한 링커 펩티드에 의해 분리된 5개의 균질한 단백질 억제제를 포함하는 것으로 발견되었다. 6개의 상이한 링커를 통한 녹색 형광 단백질의 폴딩 거동의 비교는 문헌(Chang, H.C. et al. "De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria" Journal of Molecular Biology, 2005 Oct 21; 353(2): 397-409)에서 탐색된다. 문헌(Daskalova, S.M. et al. "Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins" BMC Biotechnology, 2010 Aug 24; 10: 62)에 의해 인간 GalNAc-Ts 패밀리의 이소형인 GalNAc-T2는 니코티아나 벤타미아나에서의 발현 시 그 편재 및 기능성을 보유하는 것으로 나타났다. 내인성 색소체 단백질이 기질을 통해 이동하는 능력은 문헌(Kwok, E.Y. et al. "GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids" Journal of Experimental Botany, 2004 Mar; 55(397): 595-604. Epub 2004 Jan 30)에서 나타났다. 문헌(Borovsky, D. et al. "Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide" Proc Natl Acad Sci, 2006 December 12; 103(50): 18963-18968)에 의해 모기 데카펩티드 호르몬을 사용하는, 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 표면, 비리온의 조작에 대해 보고되었다. 이들 참고문헌 및 기타 문헌은 본원에 기재된 방법, 절차 및 펩티드, 단백질 및 뉴클레오티드 복합체 및 작제물에서 사용될 수 있는 개재 링커를 교시 및 개시한다.
TVP ORF 및 TVP 작제물
"TVP ORF"는 TVP 및/또는 하나 이상의 안정화 단백질, 분비 신호, 또는 표적화 유도 신호를 암호화하는 뉴클레오티드, 예를 들어 ERSP 또는 STA를 지칭하며, 번역되는 능력을 갖는 ORF에서의 뉴클레오티드로 정의된다. 따라서 "TVP ORF 다이어그램"은 다이어그램 또는 공식 형태로 작성된 하나 이상의 TVP ORF의 조성을 지칭한다. 예를 들어, "TVP ORF 다이어그램"은 발현 ORF에 포함된 DNA 절편에 대한 약어 또는 약식 언급을 사용하여 작성될 수 있다. 따라서, 한 예에서 "TVP ORF 다이어그램"은 공식 형태로 DNA 절편을 "ersp"(즉, ERSP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열); "링커" 또는 "L"(즉, 링커 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열); "sta"(즉, STA 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열) 및 "tvp"(즉, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열)로 각각 다이어그램화하여, ESRP, 링커, STA, 및 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 기재할 수 있다. TVP ORF 다이어그램의 한 예는 "ersp-sta-(링커 i-tvp j)N," 또는 "ersp -( tvp j -링커 i ) N -sta" 및/또는 이의 DNA 절편의 임의의 조합이다.
하기 공식은 ERSP, STA, 링커 및 TVP를 암호화하는 TVP ORF의 두 가지 예를 기재한다.
ersp - sta -l- tvp 또는 ersp - tvp -l- sta
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TVP 개방 판독 프레임(ORF)은 식물이 mRNA를 발현할 수 있게 할 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이는 다시 적절하게 폴딩될 수 있는 펩티드로 번역되고/되거나 상기 단백질이 하나 이상의 해충을 억제 및/또는 사멸시키기 충분한 용량을 제공하는 정도로 축적될 것이다. 한 실시양태에서, 단백질 TVP ORF의 한 예는 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(tvp), "ersp"(즉, ERSP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), "링커"(즉, 링커 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), "sta"(즉, STA 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), 또는 이의 임의의 조합일 수 있으며, 다음 공식 형태로 기재될 수 있다.
ersp-sta-(링커 i-tvp j)n, 또는 ersp -( tvp j - 링커 i ) n - sta
폴리뉴클레오티드 공식의 상기 예시적인 실시양태는 각 구성성분을 분리하기 위해 대시 기호가 있는 4개의 가능한 펩티드 구성성분을 포함하는 하기 단백질 복합체: ERSP-STA-(링커I-TVPJ)N가 발현되도록 할 것이다. ersp 뉴클레오티드 구성성분은 식물 소포체 수송 신호 펩티드(ERSP)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편이다. sta 구성성분은 식물에서 발현된 TVP의 축적을 돕는, 번역 안정화 단백질(STA)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편이지만, 일부 실시양태에서 TVP ORF에 sta의 포함이 필요하지 않을 수 있다. 링커 i 구성성분은 TVP를 ORF에 포함된 다른 구성성분 및 번역 안정화 단백질로부터 분리하기 위한 개재 링커 펩티드(L 또는 링커)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편이다. 아래첨자 문자 "i"는 일부 실시양태에서 상이한 유형의 링커 펩티드가 TVP ORF에서 사용될 수 있음을 표시한다. 구성성분 "tvp"는 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 표시한다. 아래첨자 "j"는 상이한 폴리뉴클레오티드가 TVP ORF에 포함될 수 있음을 표시한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 상이한 아미노산 치환을 갖는 TVP를 암호화할 수 있다. "(링커i-tvp j)n"에 나타낸 아래첨자 "n"은 개재 링커 펩티드 및 TVP를 암호화하는 뉴클레오티드의 구조가 동일한 TVP ORF의 동일한 개방 판독 프레임에서 "n"번 반복될 수 있음을 표시하며, "n"은 1 내지 10의 모든 정수일 수 있고; "n"은 1 내지 10일 수 있고, 구체적으로 "n"은 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있고, 일부 실시양태에서 "n"은 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 반복부는 상이한 개재 링커(링커) 및 상이한 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 포함할 수 있다. 동일한 TVP ORF 내의 반복부를 포함하는 상이한 폴리뉴클레오티드 절편은 모두 동일한 번역 프레임에 있다. 일부 실시양태에서, TVP ORF에 sta 폴리뉴클레오티드의 포함이 필요하지 않을 수 있다. 예를 들어, ersp 폴리뉴클레오티드 서열은 링커 없이 TVP 변이체 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 직접 연결될 수 있다.
상기 예시적인 공식에서, 폴리펩티드 "TVP"를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 "tvp"는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 TVP, 예를 들어, 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열일 수 있다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, tvp 폴리뉴클레오티드, 또는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP를 암호화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 TVP 작제물 배향 및/또는 배열: ERSP-TVP; ERSP-(TVP)N; ERSP-TVP-L; ERSP-(TVP)N-L; ERSP-(TVP-L)N; ERSP-L-TVP; ERSP-L-(TVP)N; ERSP-(L-TVP)N; ERSP-STA-TVP; ERSP-STA-(TVP)N; ERSP-TVP-STA; ERSP-(TVP)N-STA; ERSP-(STA-TVP)N; ERSP-(TVP-STA)N; ERSP-L-TVP-STA; ERSP-L-STA-TVP; ERSP-L-(TVP-STA)N; ERSP-L-(STA-TVP)N; ERSP-L-(TVP)N-STA; ERSP-(L-TVP)N-STA; ERSP-(L-STA-TVP)N; ERSP-(L-TVP-STA)N; ERSP-(L-STA)N-TVP; ERSP-(L-TVP)N-STA; ERSP-STA-L-TVP; ERSP-STA-TVP-L; ERSP-STA-L-(TVP)N; ERSP-(STA-L)N-TVP; ERSP-STA-(L-TVP)N; ERSP-(STA-L-TVP)N; ERSP-STA-(TVP)N-L; ERSP-STA-(TVP-L)N; ERSP-(STA-TVP)N-L; ERSP-(STA-TVP-L)N; ERSP-TVP-L-STA; ERSP-TVP-STA-L; ERSP-(TVP)N-STA-L ERSP-(TVP-L)N-STA; ERSP-(TVP-STA)N-L; ERSP-(TVP-L-STA)N; 또는 ERSP-(TVP-STA-L)N을 갖는 TVP-살충 단백질을 암호화하도록 작동 가능하고; N은 1 내지 200 범위의 정수이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 TVP ORF 및/또는 TVP 작제물은 재조합적으로 생산될 수 있고, 예를 들어 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 TVP ORF 및/또는 TVP 작제물은, 예를 들어 효모 세포에 의해, 세포 배양물에서 생산될 수 있다.
임의의 전술한 방법 및/또는 본원에 기재된 임의의 방법이 식물 또는 이의 식물 부분으로, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 예를 들어, 마찬가지로 본원에 기재되는, 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 TVP 또는 TVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 혼입하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 단자엽 및 쌍자엽을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있다. 트랜스제닉 접근 또는 PEP가 특히 유용한 접근일 작물은 알팔파, 목화, 토마토, 옥수수(maize), 밀, 옥수수(corn), 단옥수수, 자주개자리, 대두, 수수, 완두, 아마씨, 홍화, 평지씨, 오일 종자 평지, 쌀, 대두, 보리, 해바라기, 나무(침엽수 및 낙엽수 포함), 꽃(상업적으로 및 온실에서 재배되는 것들 포함), 들판 루핀, 스위치그래스, 사탕수수, 감자, 토마토, 담배, 십자화과 식물, 고추, 사탕무, 보리, 및 오일 종자 평지, 브라시카 sp., 호밀, 기장, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤류 나무, 코코아, 차 식물, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 귀리, 야채, 관상식물 및 침엽수를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드로의 식물 형질전환
일부 실시양태에서, 상기 및 본원에 기재된 TVP 발현 ORF 및 TVP 작제물은 일시적으로 또는 안정적으로 식물에서 발현될 TVP에 대한 임의의 식물 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
일시적인 식물 발현 시스템은 일부 구성성분의 필요성, 일부 구성성분의 코돈 최적화, 각 구성성분의 순서 최적화 등을 포함하여 식물의 일부 특정 TVP 발현에 대한 TVP 발현 ORF의 구조를 즉각적으로 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 일시적 식물 발현 벡터는 종종 식물 바이러스 게놈으로부터 유래된다. 식물 바이러스 벡터는 식물 바이러스의 감염 성질으로 인해 식물에서 빠르고 높은 수준의 외래 유전자 발현에서 이점을 제공한다. 식물 바이러스 게놈의 전체 길이가 벡터로 사용될 수 있지만, 종종 바이러스 구성성분(예를 들어 외피 단백질)이 결실되고, 트랜스제닉 ORF가 그 위치에 서브클로닝된다. TVP 발현 ORF가 그러한 부위에 서브클로닝되어 바이러스 벡터를 생성할 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어 식물 상처, 상부-분무 등을 통해 자체적으로 감염되기 때문에 식물에 기계적으로 도입될 수 있다. 이들은 또한 바이러스 벡터를 크라운 볼 박테리아인 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 털이 많은 뿌리 박테리아인 아그로박테리움 리조게네스의 T-DNA에 클로닝함으로써 아그로감염을 통해 식물에 형질감염될 수 있다. 이 벡터에서 TVP의 발현은 RNA 바이러스의 복제에 의해 제어되고, 복제를 위한 mRNA로의 바이러스 번역은 강력한 바이러스 프로모터, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터의 35S 프로모터에 의해 제어된다. TVP 발현 ORF를 갖는 바이러스 벡터는 일반적으로 대장균 균주 및 아그로박테리움 균주 모두에서 자체 복제할 수 있는 이원성 벡터의 T-DNA 영역으로 클로닝된다. 식물의 일시적인 형질감염은 TVP 발현을 위해 바이러스 벡터를 포함하는 아그로박테리움 세포로의 식물 잎 침투에 의해 수행될 수 있다. 일시적 형질전환 식물에서는 PTGS(전사 후 유전자 침묵화)로 인해 외래 단백질 발현이 단기간에 중단되는 것이 일반적이다. 때때로 PTGS 억제 단백질 유전자가 TVP 발현 ORF의 발현을 유도하는 동일한 유형의 바이러스 벡터를 사용하여 일시적으로 식물로 공동-형질전환되는 것이 필요하다. 이것은 식물에서 TVP의 발현을 개선하고 연장한다. 가장 일반적으로 사용되는 PTGS 억제 단백질은 토마토 부시 스턴트 바이러스(TBSV)에서 발견된 P19 단백질이다.
일부 실시양태에서, 식물의 일시적 형질감염은 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 이용 가능한 벡터(상기 및 본원에 기재된 것들 참고) 중 어느 하나와 재조합하고, 마커 또는 신호(예를 들어, GFP 방출)를 사용하여 확인함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일시적으로 형질감염된 식물은 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에서 GFP-하이브리드 융합 단백질을 암호화하는 DNA와 재조합하고, 표적화된 발현을 위해 설계된 상이한 FECT 벡터를 사용해서 식물(예를 들어 담배)로 상기 벡터를 형질감염하여 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 APO(아포플라스트 편재) 축적을 위한 pFECT 벡터; CYTO(세포질 편재) 축적을 위한 pFECT 벡터; 또는 ER(소포체 편재) 축적을 위한 ersp 벡터를 사용한 pFECT와 재조합될 수 있다.
예시적인 일시적 식물 형질전환 전략은 고효율, 용이성 및 저렴한 비용으로 인해 식물 바이러스 벡터를 사용하는 아그로감염이다. 일부 실시양태에서, 담배 모자이크 바이러스 과발현 시스템이 식물을 TVP로 일시적으로 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌(TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007, V145: 1232-1240)을 참고한다.
TRBO DNA 벡터는 바이러스 피막 단백질을 암호화하는 유전자 없이 담배 모자이크 바이러스 RNA의 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 포함하는, 아그로감염을 위한 T-DNA 영역을 갖는다. 또한, 이 시스템은 "무장해제된(disarmed)" 바이러스 게놈을 사용하므로, 식물에서 식물로의 바이러스 전염이 효과적으로 방지될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, FECT 바이러스 일시적 식물 발현 시스템이 식물을 TVP로 일시적으로 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌(Liu Z & Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88)을 참고한다. FECT 벡터는 바이러스 피막 단백질 및 삼중 유전자 블록을 암호화하는 유전자 없이 폭스테일 모자이크 바이러스 RNA의 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 포함하는, 아그로감염을 위한 T-DNA 영역을 포함한다. 또한, 이 시스템은 "무장 해제된" 바이러스 게놈을 사용하므로, 식물에서 식물로의 바이러스 전염이 효과적으로 방지될 수 있다. 도입된 이종성 유전자를 효율적으로 발현하기 위해, FECT 발현 시스템은 추가로 도입된 T-DNA의 전사 후 유전자 침묵화(PTGS)를 방지하기 위해, 토마토 부시 스턴트 바이러스로부터의 RNA 침묵화 억제인자인 P19의 공동-발현을 필요로 한다(TRBO 발현 시스템은 P19의 공동 발현을 필요로 하지 않음).
일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 하기: N'-ERSP-STA-L-TVP-C'과 같이 기재될 수 있는 번역적으로 융합된 구조 모티프 시리즈를 암호화하도록 설계될 수 있고, "N'" 및 "C'"는 N-말단 및 C-말단 아미노산을 각각 표시하고, ERSP 모티프는 보리 알파-아밀라제 신호 펩티드(BAAS)(서열 번호 37)일 수 있고; 안정화 단백질(STA)은 GFP(서열 번호 34)일 수 있고; 링커 펩티드 "L"은 IGER(서열 번호 31)일 수 있다. 일부 실시양태에서, ersp - sta -l- tvp ORF는 제한 부위, 예를 들어 그 5'-단부에 Pac I 제한 부위, 및 그 3'-단부에 Avr II 제한 부위를 포함하도록 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP 발현 ORF는 FECT 발현 벡터(pFECT)의 Pac I 및 Avr II 제한 부위로 클로닝되어 FECT 일시적 식물 발현 시스템(pFECT-TVP)을 위한 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 발현 벡터를 생성할 수 있다. FECT 발현 시스템에서 발현을 최대화하기 위해, 일부 실시양태는 공동-형질전환을 위해 생성된 RNA 침묵화 억제인자 단백질 P19를 발현하는 FECT 벡터(pFECT-P19)를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, U1-아가톡신-Ta1b 변이체 발현 벡터는, 예를 들어 일상적인 PCR 절차를 수행하고 Not I 제한 부위를 위에서 기재된 TVP 발현 ORF의 3'-단부에 부가한 후, TVP 발현 ORF를 TRBO 발현 벡터(pTRBO-TVP)의 Pac I 및 Not I 제한 부위에 클로닝하여, TRBO 일시적 식물 발현 시스템에서 사용하기 위해 재조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주, 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 GV3101 세포는 하나 이상의 일시적 발현 시스템, 예를 들어 FECT 및 TRBO 발현 시스템을 사용하여 식물 조직(예를 들어, 담배 잎)에서 TVP 발현 ORF의 일시적 발현을 위해 사용될 수 있다. 이러한 일시적인 형질감염 프로토콜의 예시적인 예시는 하기를 포함한다: GV3101의 하룻밤 동안의 배양물을 사용하여 200 mL LB(루리아-베르타니) 배지를 접종할 수 있다; 세포는 OD600이 0.5와 0.8 사이인 로그 단계까지 성장시킬 수 있다; 그런 다음 세포를 4℃에서 10분 동안 5000 rpm에서 원심분리하여 펠렛화할 수 있다; 이어서 세포를 10 mL 사전냉각 TE 완충액(트리스-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0)으로 한 번 세척한 다음 20 mL LB 배지에 재현탁할 수 있다; 그 후 GV3101 세포 재현탁액을 250 μL 분획으로 1.5 mL 마이크로튜브로 분주할 수 있다; 그런 다음 분취량을 액체 질소에서 급속 냉동하고 향후 형질전환을 위해 -80℃ 냉동고에 보관할 수 있다. 이어서 pFECT-TVP 및 pTRBO-TVP 벡터를 하기와 같이 냉동-해동 방법을 사용하여 적격 GV3101 세포로 형질전환할 수 있다: 보관된 적격 GV3101 세포를 얼음 상에서 해동하고 1 내지 5 μg 순수 DNA(pFECT-TVP 또는 pTRBO-TVP 벡터)와 혼합한다. 세포-DNA 혼합물을 5분 동안 얼음 상에서 유지하고 5분 동안 -80℃로 옮기고 5분 동안 37℃ 수조에서 인큐베이션한다. 이어서 냉동-해동 처리된 세포를 1 mL LB 배지로 희석하고 실온에서 2 내지 4시간 동안 로킹 테이블에서 진탕한다. 그런 다음 세포-DNA 혼합물의 200 μL 분취량을 적절한 항생제(10 μg/mL 리팜피신, 25 μg/mL 젠타마이신 및 50 μg/mL 카나마이신을 pFECT-TVP 형질전환 및 pTRBO-TVP 형질전환을 위해 모두 사용할 수 있음)를 포함하는 LB 한천 플레이트 상으로 퍼트리고 2일 동안 28℃에서 인큐베이션한다. 그 후 생성 형질전환 콜로니를 선택하고 형질전환된 DNA 분석 및 형질전환된 GV3101 세포의 글리세롤 스톡을 만들기 위해 적절한 항생제를 포함하는 LB 배지 6 mL 분취량에서 배양한다.
일부 실시양태에서, 식물 조직, 예를 들어 담배 잎의 일시적 형질전환은 바늘이 없는 3-mL 주사기로의 잎 주사를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 예시적인 예에서, 형질전환된 GV3101 세포를 적절한 항생제(상기 기재된 바와 같음)를 포함하는 LB 플레이트 상으로 스트리킹하고 2일 동안 28℃에서 인큐베이션한다. 형질전환된 GV3101 세포의 콜로니를 5 mL의 LB-MESA 배지(10 mM MES 및 20 μM 아세토시린곤이 보충된 LB 배지) 및 상기 기재된 동일한 항생제에 접종하고, 28℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 하룻밤 동안의 배양물 세포를 10분 동안 5000 rpm에서 원심분리하여 수집하고 최종 OD600이 1.0인 유도 배지(10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 μM 아세토시링곤)에 재현탁한다. 그런 다음 세포를 실온에서 2시간 내지 하룻밤 동안 유도 배지에서 인큐베이션한 다음 담배 잎의 일시적인 형질전환이 준비된다. 처리된 세포는 바늘이 부착되지 않은 3 mL 주사기를 사용하는 주사에 의해 니코티아나 벤타미아나 식물의 부착된 잎의 밑면으로 침투시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 일시적 형질전환은 GV3101 세포의 한 집단을 pFECT-TVP 또는 pTRBO-TVP로 및 또 다른 집단을 pFECT-P19로 형질감염시키고, 2개의 세포 집단을 3 mL 주사기로의 주사에 의해 담배 잎의 침투를 위해 동일한 양으로 함께 혼합하여 달성될 수 있다.
TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드의 안정한 통합이 또한 본 개시내용으로 가능하며, 예를 들어 TVP 발현 ORF가 또한 안정한 식물 형질전환 기술을 사용하여 식물 게놈에 통합될 수 있으며, 따라서 TVP는 식물에서 안정적으로 발현되고 형질전환된 식물을 세대에서 세대로 보호할 수 있다. 식물의 안정적 형질전환을 위해, TVP 발현 벡터는 원형 또는 선형일 수 있다. TVP 발현 ORF, TVP 발현 카세트, 및/또는 안정한 식물 형질전환을 위해 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터는 당업자에게 알려진 것에 기반하여, 및/또는 Gene Designer 2.0(Atum Bio); VectorBuilder(Cyagen); SnapGene® 뷰어; GeneArtTM 플라스미드 작제 서비스(Thermo-Fisher Scientific); 및/또는 기타 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 설계 서비스와 같은 예측 벡터 설계 도구를 사용하여 식물에서 최적의 발현을 위해 신중하게 설계되어야 한다. 문헌(Tolmachov, Designing plasmid vectors. Methods Mol Biol. 2009; 542:117-29)을 참고한다. TVP의 발현은 일반적으로 트랜스제닉 식물의 일부 또는 모든 세포에서 전사를 촉진하는 프로모터에 의해 제어된다. 프로모터는 강력한 식물 바이러스 프로모터, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)로부터의 구성적 35S 프로모터일 수 있다; 이는 또한 강력한 식물 프로모터, 예를 들어 아라비답시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 하이드로퍼옥시드 라이아제 프로모터(pHPL); 대두로부터의 글리신 맥스 폴리유비퀴틴(Gmubi) 프로모터; 상이한 식물 종(쌀, 옥수수, 감자 등)으로부터의 유비퀴틴 프로모터 등일 수 있다. 식물 전사 종결인자는 종종 ORF의 정지 코돈 뒤에 발생하여 RNA 중합효소 및 mRNA의 전사를 중단시킨다. TVP 발현을 평가하기 위해, 리포터 유전자, 예를 들어 GUS 스트레이닝 검정을 위한 베타-글루쿠로니다제 유전자(GUS), UV 광 하의 녹색 형광 검출을 위한 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자 등이 TVP 발현 벡터에 포함될 수 있다. 형질전환된 식물의 선택을 위해, 선택 마커 유전자가 일반적으로 TVP 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자 발현 산물은 형질전환된 식물에 특정 항생제, 예를 들어 카나마이신, 하이그로마이신 등, 또는 특정 제초제, 예를 들어 글리포세이트 등에 대한 내성을 제공할 수 있다. 아그로감염 기술이 식물 형질전환을 위해 적응되는 경우, T-DNA 왼쪽 경계 및 오른쪽 경계 서열도 T-DNA 부분을 식물로 수송하기 위해 TVP 발현 벡터에 포함된다.
작제된 TVP 발현 벡터는 많은 형질감염 기술을 사용하여 식물 세포 또는 조직으로 형질감염될 수 있다. 아그로감염은 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 또는 아그로박테리움 리조게네스 균주를 사용하여 식물을 형질전환하는 매우 유명한 방식이다. 입자 충격(유전자 총 또는 바이올리스틱스라고도 함) 기술이 또한 식물 형질감염의 매우 일반적인 방법이다. 덜 일반적인 다른 형질감염 방법은 조직 전기천공, 탄화규소 휘스커, DNA의 직접 주사 등을 포함한다. 형질감염 후, 형질감염된 식물 세포 또는 조직을 식물 재생 배지에 배치하여 성공적으로 형질전환된 식물 세포 또는 조직을 트랜스제닉 식물로 재생시킨다.
형질전환된 식물의 평가는 DNA 수준, RNA 수준 및 단백질 수준에서 수행될 수 있다. 안정적으로 형질전환된 식물은 이러한 모든 수준에서 평가될 수 있으며 일시적으로 형질전환된 식물은 일반적으로 단백질 수준에서만 평가된다. TVP 발현 ORF가 안정적으로 형질전환된 식물의 게놈에 통합되도록 하기 위해, 안정적으로 형질전환된 식물 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하고 PCR 또는 서던 블롯을 사용하여 분석할 수 있다. 안정적으로 형질전환된 식물에서 TVP의 발현은 예를 들어, 형질전환된 식물 조직으로부터 추출된 총 mRNA를 노던 블롯 또는 RT-PCR을 사용하여 분석함으로써 RNA 수준에서 평가될 수 있다. 형질전환된 식물에서 TVP의 발현은 또한 단백질 수준에서 직접 평가될 수 있다. 형질전환된 식물에서 TVP의 발현을 평가하는 여러 방식이 있다. 리포터 유전자가 TVP 발현 ORF에 포함된 경우, 리포터 유전자 검정, 예를 들어 일부 실시양태에서 GUS 리포터 유전자 발현에 대한 GUS 스트레이닝 검정, GFP 리포터 유전자 발현에 대한 녹색 형광 검출 검정, 루시퍼라제 리포터 유전자 발현에 대한 루시퍼라제 검정이 수행될 수 있고 및/또는 기타 리포터 기술이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 내의 총 단백질 수준을 평가하기 위한 브래드포드 검정을 사용하여 TVP 발현의 직접 평가를 위해 형질전환된 식물 조직으로부터 총 단백질이 추출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분석용 HPLC 크로마토그래피 기술, 웨스턴 블롯 기술, 또는 iELISA 검정이 형질전환된 식물 조직으로부터 추출된 총 단백질 샘플에서 TVP를 정성적으로 또는 정량적으로 평가하기 위해 적응될 수 있다. TVP 발현은 또한 곤충 생물검정에서 형질전환된 식물 조직으로부터 추출된 총 단백질 샘플을 사용함으로써 평가될 수 있고, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 형질전환된 식물 조직 또는 전체 형질전환된 식물 자체가 TVP 발현 및 식물에 대한 보호를 제공하는 능력을 평가하기 위해 곤충 생물검정에서 사용될 수 있다.
예시적인 트랜스제닉 식물
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); X6 및 X7은 부재한다).
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP 또는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 서열은 적어도 2개 이상의 TVP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자, 또는 이의 일부는 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
TVP로의 성공적인 형질전환 확인
이종성 외래 DNA의 식물 세포로의 도입 후, 식물 게놈에서 이종성 유전자의 형질전환 또는 통합은 통합된 유전자와 연관된 핵산, 단백질 및 대사물질의 분석과 같은 다양한 방법에 의해 확인된다.
PCR 분석은 토양에 이식하기 전 초기 단계에서 혼입된 유전자의 존재에 대해 형질전환된 세포, 조직 또는 새싹을 스크리닝하는 신속한 방법이다(Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). PCR은 해당 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 아그로박테리움 벡터 배경 등을 사용하여 수행된다.
식물 형질전환은 게놈 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 확인될 수 있다(Sambrook and Russell, 2001, 상기 문헌). 일반적으로, 형질전환된 식물로부터 전체 DNA를 추출하고, 적절한 제한효소로 소화하고, 아가로스 겔에서 분획화하고 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 옮긴다. 그 다음, 막 또는 "블롯"을 표준 기술(Sambrook and Russell, 2001, 상기 문헌)에 따라 도입된 유전자의 식물 게놈로의 통합을 확인하기 위해, 예를 들어 방사성표지 32P 표적 DNA 단편으로 탐침조사한다.
노던 블롯 분석에서, RNA를 형질전환된 식물의 특정 조직으로부터 단리하고, 포름알데하이드 아가로스 겔에서 분획화하고, 당분야에서 일상적으로 사용되는 표준 절차에 따라 나일론 필터로 블롯팅한다(Sambrook and Russell, 2001, 상기 문헌). 이어서 TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 RNA의 발현을 당분야에 알려진 방법(Sambrook and Russell, 2001, 상기 문헌)에 의해 필터를 TVP로부터 유도된 방사성 탐침에 혼성화함으로써 시험한다.
TVP 상에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 사용하여 표준 절차(Sambrook and Russell, 2001, 상기 문헌)에 의해 TVP 유전자에 의해 암호화된 단백질의 존재를 확인하기 위해 트랜스제닉 식물에서 웨스턴 블롯, 생화학적 검정 등이 수행될 수 있다.
예를 들어, 클로람페니콜, 아미노글리코시드 G418, 하이그로마이신 등에 대한 내성과 같은, 많은 마커가 식물 형질전환의 성공을 결정하기 위해 개발되었다. 엽록체 대사에 관여되는 산물을 암호화하는 다른 유전자도 선택 가능 마커로 사용될 수 있다. 예를 들어, 글리포세이트, 브로목시닐 또는 이미다졸리논과 같은 식물 제초제에 대한 내성을 제공하는 유전자가 특히 사용될 수 있다. 이러한 유전자가 보고된 바 있다(Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314(브로목시닐 내성 니트릴라제 유전자); 및 Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188(AHAS 이미다졸리논 내성 유전자)). 추가로, 본원에 개시된 유전자는 박테리아, 효모 또는 식물 세포의 형질전환을 평가하기 위한 마커로서 유용하다. 식물, 식물 기관(예를 들어 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체, 배 또는 이의 자손의 존재를 검출하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 한 실시양태에서, 트랜스유전자의 존재는 살해충 활성에 대한 시험에 의해 검출된다.
TVP 및/또는 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리뉴클레오티드를 발현하는 번식력이 있는 식물은 살해충 활성에 대해 시험될 수 있으며, 최적 활성을 나타내는 식물이 추가 육종을 위해 선택된다. 해충 활성을 검정하기 위한 방법이 당분야에서 이용 가능하다. 일반적으로 단백질은 혼합되어 사료 검정에서 사용된다. 예를 들어 문헌(Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293)을 참고한다.
일부 실시양태에서, 일시적 형질감염 절차의 성공을 평가하는 것은 리포터 유전자, 예를 들어 GFP의 발현에 기반하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, GFP는 FECT 및/또는 TRBO 벡터로 형질전환된 담배 잎에서 UV 광 하에 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 발현은 식물(예를 들어, 담배)에서 정량적으로 평가될 수 있다. 담배 식물에서의 TVP 정량을 예시하는 예시적 절차는 하기와 같다: 1000 μL 피펫 팁의 큰 구멍으로 잎을 펀칭하여 형질전환된 잎 조직의 100 mg 디스크를 수집한다. 채취된 잎 조직을 5/32" 지름 스테인리스강 분쇄 볼이 있는 2 mL 마이크로튜브에 넣고 1시간 동안 -80℃에서 냉동한 다음 Troemner-Talboys 고처리량 균질화기를 사용하여 균질화한다. 다음으로, 750 μL의 빙냉 TSP-SE1 추출 용액(인산나트륨 용액 50 mM, 1:100 희석된 프로테아제 억제제 칵테일, EDTA 1 mM, DIECA 10 mM, PVPP 8%, pH 7.0)을 튜브에 첨가하고 볼텍싱한다. 그런 다음 마이크로튜브를 15분 동안 실온에서 그대로 둔 다음 4℃에서 15분 동안 16,000 g에서 원심분리한다; 생성 상청액 100 μL를 취하여 바닥에 빈 수용 Costar 마이크로타이터 플레이트가 있는 0.45 μm Millipore MultiScreen 필터 마이크로타이터 플레이트의 사전 Sephadex G-50 패킹 컬럼으로 로딩한다. 이어서 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 2분 동안 800 g에서 원심분리한다. 본원에서 담배 잎의 총 가용성 단백질 추출물(TSP 추출물)이라고 하는 생성 여과 용액이 정량 분석을 위해 준비된다.
일부 실시양태에서, TSP 추출물의 총 가용성 단백질 농도는 Pierce Coomasie Plus 단백질 검정을 사용하여 추정될 수 있다. 알려진 농도의 BSA 단백질 표준을 사용하여 단백질 정량 표준 곡선을 생성할 수 있다. 예를 들어, 각 TSP 추출물 2 μL를 Coomassie Plus 단백질 검정 키트의 발색 시약(CPPA 시약) 200 μL에 혼합하고 10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음 SoftMax Pro를 제어 소프트웨어로 사용하는 SpectroMax-M2 플레이트 판독기를 사용하여 OD595를 판독함으로써 발색 반응이 평가될 수 있다. 총 가용성 단백질의 농도는 각각 FECT 및 TRBO를 통해 형질전환된 식물로부터의 TSP 추출물에서 각각 약 0.788 ± 0.20 μg/μL 또는 약 0.533 ± 0.03 μg/μL일 수 있으며, 그 결과가 iELISA 검정을 위해 TSP에서의 발현된 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 펩티드%(% TSP)을 계산하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 간접 ELISA(iELISA) 검정이 FECT 및/또는 TRBO 발현 시스템으로 일시적으로 형질전환된 담배 잎의 TVP 함량을 정량적으로 평가하기 위해 사용될 수 있다. TVP를 정량하기 위해 iELISA를 사용하는 예시적인 예는 하기와 같다. 5 μL의 잎 TSP 추출물을 필요에 따라 수행되는 연속 희석과 함께, Immulon 2HD 96웰 플레이트의 웰에 95 μL의 CB2 용액(Immunochemistry Technologies)으로 희석한다; 그런 다음 추출물 샘플로부터 얻은 잎 단백질로 실온의 암소에서 3시간 동안 웰 벽을 코팅하도록 한 다음 CB2 용액을 제거한다; 각 웰은 200 μL PBS(Gibco)로 두 번 세척한다; 150 μL 차단 용액(5% 무지방 분유가 포함된 PBS의 차단 BSA)을 각 웰에 첨가하고 암소, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다; 차단 용액을 제거한 후, 웰을 PBS로 세척하고, TVP에 대해 유도된 1차 항체 100 μL(맞춤형 항체는 ProMab Biotechnologies, Inc.; GenScript®에서 상업적으로 이용 가능하거나, 당업자가 쉽게 이용 가능한 기술을 사용하여 생성됨); 차단 용액에서 1:250 희석도로 희석된 항체를 각 웰에 첨가하고 실온의 암소에서 1시간 동안 인큐베이션하고; 1차 항체를 제거하고 각 웰을 PBS로 4회 세척하고; 100 μL의 HRP-접합 2차 항체(즉, 1차 항체를 생성하기 위해 사용된 숙주 종에 대해 유도된 항체, 차단 용액에서 1:1000 희석도로 사용됨)를 각 웰에 첨가하고 실온의 암소에서 1시간 동안 인큐베이션하고; 2차 항체를 제거하고 웰을 PBS, 100 μL로 세척하고; 기질 용액(ABTS 퍼옥시다제 기질 용액 A 및 용액 B의 1:1 혼합물, KPL)을 각 웰에 첨가하고, 충분한 발색이 명백해질 때까지 발색 반응을 진행하고; 100 μL의 퍼옥시다제 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고; 플레이트에서 각 반응 혼합물의 흡광도를 제어 소프트웨어로 SoftMax Pro를 사용하는 SpectroMax-M2 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서 판독하고; 연속 희석된 알려진 농도의 순수 TVP 샘플을 iELISA 검정에서 위에서 기재된 것과 동일한 방식으로 처리하여 양 분석을 위한 질량 흡광도 표준 곡선을 생성할 수 있다. 발현된 TVP는 FECT 형질전환 담배의 잎 TSP 추출물에서 약 3.09 ± 1.83 ng/μL로; TRBO 형질전환 담배의 잎 TSP 추출물에서 약 3.56 ± 0.74 ng/μL로 iELISA에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 발현된 TVP는 FECT 형질전환 식물의 경우 약 0.40% 총 가용성 단백질(TSP%) 및 TRBO 형질전환 식물의 경우 약 0.67% TSP일 수 있다.
조성물 및 제형물
본원에 사용된 용어 "조성물" 및 "제형물"은 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "v/v" 또는 "% v/v" 또는 "부피당 부피"는 용액의 부피 농도를 지칭한다("v/v"는 부피당 부피를 나타냄). 여기서, v/v는 용액의 두 구성성분이 모두 액체일 때 사용될 수 있다. 예를 들어, 성분 X 50 mL를 물 50 mL로 희석할 때, 총 부피 100 mL에 성분 X 50 mL이 있다; 따라서 이것은 "성분 X 50% v/v"로 표현될 수 있다. 부피당 부피 백분율(% v/v)은 하기와 같이 계산된다: (용질의 부피(mL)/용액의 부피(100 mL)); 예를 들어,% v/v = 용질 mL/용액 100 mL.
본원에 사용된 바와 같은 "w/w" 또는 "% w/w" 또는 "중량당 중량" 또는 "중량/중량" 또는 "% wt/wt"는 제형물 또는 용액의 중량 농도, 즉, 중량 중 중량%를 지칭한다("w/w"는 중량당 중량을 나타냄). 여기서, w/w는 용액 또는 혼합물 100 g 중 성분의 그램(g) 수를 표현한다. 예를 들어, 성분 X 30 g 및 물 70 g으로 구성되는 혼합물은 "성분 X 30% w/w"로 표현될 것이다. 중량당 중량%(% w/w)는 하기와 같이 계산된다: (용질의 중량(g)/용액의 중량(g)) x 100; 또는 (용질의 질량(g)/용액의 질량(g)) x 100.
본원에 사용된 바와 같은 "w/v" 또는 "% w/v" 또는 "부피당 중량"은 용액의 질량 농도, 즉, 부피 중 중량%를 지칭한다("w/v"는 부피당 중량을 나타냄). 여기서, w/v는 용액 100 mL 중 성분의 그램(g) 수를 표현한다. 예를 들어, 1 g의 성분 X가 100 mL의 총 부피를 구성하기 위해 사용되는 경우, "성분 X의 1% w/v 용액"이 만들어졌다. 부피당 중량%(% w/v)는 하기와 같이 계산된다: (용질의 질량(g)/용액의 부피(mL)) X 100.
전술한 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP) 또는 본원에 기재된 임의의 TVP-살충 단백질(예를 들어, 표 1에서 발견되는 것들)이 조성물을 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 상기 조성물은 적어도 하나의 TVP 또는 적어도 하나의 TVP-살충 단백질로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP-살충 단백질 및 부형제로 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되며, 상기 TVP는 표 1에 제공된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 표 1에 개시된 하나 이상의 TVP 및 부형제로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되며, 상기 TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP 및 부형제로 구성되며, 상기 TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 및 77-110에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 조성물, 예를 들어 농약 조성물은 에어로졸 및/또는 에어로졸화된 제품, 예를 들어 분무제, 훈증제, 분말, 분진, 및/또는 가스; 종자 드레싱; 경구 제조물(예를 들어 곤충 식품 등); TVP, TVP-살충 단백질, 및/또는 TVP ORF(일시적으로 및/또는 안정적으로)를 발현 및/또는 생산하는 트랜스제닉 유기체, 예를 들어 식물 또는 동물을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 분말, 분진, 펠렛, 과립, 분무제, 에멀젼, 콜로이드, 용액 등으로 제형화될 수 있으며, 폴리펩티드를 포함하는 세포 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강, 또는 농축과 같은 통상적 수단에 의해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 이러한 살해충 폴리펩티드를 포함하는 이러한 모든 조성물에서, 폴리펩티드는 약 1중량% 내지 약 99중량%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 살해충제 조성물은 원하는 농업적으로 허용 가능한 담체와 함께 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제형화함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 전에 동결건조, 냉동건조, 건조와 같은 적절한 수단으로, 또는 수성 담체, 매질 또는 적절한 희석제, 예컨대 식염수 및/또는 기타 완충액에서 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형화된 조성물은 분진 또는 과립 물질, 또는 오일(식물성 또는 미네랄) 중 현탁액, 또는 물 또는 오일/물 에멀젼 형태로, 또는 수화성 분말로서, 또는 농업 적용에 적합한 임의의 다른 담체 물질과 조합될 수 있다. 적합한 농업 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며 당분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 제형물은 하나 이상의 고체 또는 액체 보조제와 혼합될 수 있고 다양한 수단에 의해, 예를 들어 통상적인 제형화 기술을 사용하여 살해충 조성물을 적합한 보조제와 균질하게 혼합, 배합 및/또는 연마함으로써 제조될 수 있다. 적합한 제형물 및 적용 방법은 미국 특허 번호 6,468,523에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP 및 부형제로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP-살충 단백질 및 부형제로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 부형제로 구성될 수 있다.
분무 가능 조성물
본 발명의 분무 제품의 예는 농업용 현장 분무 가능 제형물 및 주거 또는 상업 공간의 내부 공간에서 사용하기 위한 실내 분무제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 잔류 분무제 또는 공간 분무제는 내부 공간에서 곤충 해충을 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다.
실내 표면 분무(SSI)는 벽, 창문, 바닥 및 천장과 같이 매개체가 쉬는 실내 표면으로 가변 부피의 분무 가능 부피의 살충제를 적용하는 기술이다. 가변 부피의 분무 가능 부피의 일차 목표는 곤충 해충(예를 들어 파리, 벼룩, 진드기 또는 모기 매개체)의 수명을 감소시키고 이에 따라 질병 전파를 감소시키거나 차단하는 것이다. 이차 영향은 처리 지역 내 곤충 해충의 밀도를 감소시키는 것이다. SSI는 라임병, 살모넬라, 치쿤구니야 바이러스, 지카 바이러스, 및 말라리아와 같은 곤충 해충 매개체 질병의 제어 방법으로 사용될 수 있으며, 리슈마니아증 및 샤가스병과 같은 곤충 매개체에 의해 운반되는 기생충의 관리에도 사용될 수 있다. 지카 바이러스, 치쿤구니아 바이러스 및 말라리아를 보유하는 많은 모기 매개체는 혈액 식사를 한 후, 집 안에서 쉬는 인간과 관계있는 모기 매개체를 포함한다. 이들 모기는 특히 TVP, TVP 살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 부형제로 구성되는 분무 가능 조성물로의 실내 표면 분무(SSI)를 통한 제어에 민감하다. 그 이름이 시사하듯이, SSI에는 잔류 살충제를 가지며 집의 벽 및 기타 표면으로 조성물을 적용하는 것이 관여된다.
한 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 조성물은 이들 표면과 접촉하는 모든 해충을 녹다운시킬 것이다. SSI는 사람들이 모기에 물리는 것을 직접 방지하지 않는다. 오히려, 이는 곤충 해충이 일반적으로 피를 먹은 후 분무된 표면 상에서 쉬는 경우 이를 제어한다. 따라서 SSI는 다른 사람으로의 감염 전파를 방지한다. 효과적이려면, SSI가 지역 내의 매우 높은 비율의 가구(보통 40-80% 초과)에 적용되어야 한다. 따라서, 우수한 잔류 유효성 및 허용 가능한 냄새를 갖는 본 발명에 따른 분무제는 통합된 곤충 해충 매개체 관리 또는 제어 용액의 구성성분으로서 특히 적합하다.
활성 TVP 또는 TVP 살충 단백질이 페인트와 같이 벽 또는 천장과 같은 주택의 표면에 결합되는 것을 필요로 하는 SSI와 대조적으로, 본 발명의 공간 분무 제품은 일정 시기 동안 일정 부피의 공기를 통해 분포되도록 의도된 다수의 작은 살충 액적의 생산에 의존한다. 이들 액적은 표적 곤충 해충에 영향을 줄 때, 곤충 해충을 제어하는 데 효과적인 TVP 또는 TVP 살충 단백질의 녹다운 유효량을 전달한다. 공간-분무를 생성하는 전통적인 방법은 열 연무화(TVP, TVP 살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 조성물의 조밀한 구름이 생산되어 짙은 연무를 출현시킴) 및 차가운 기계적 에어로졸 생성 기계에 의해 액적이 생산되는 것이 초저부피(ULV)를 포함한다. 에어로졸 캔과 같이 바로 사용할 수 있는 에어로졸도 사용될 수 있다.
넓은 지역이 한 번에 처리될 수 있기 때문에, 상기 방법은 특정 지역에서 날아다니는 곤충 해충 집단을 신속하게 감소시키는 매우 효과적인 방법이다. 그리고 적용 후 잔류 활성이 매우 제한적이므로, 완전한 효과를 얻기 위해서는 5-7일 간격으로 반복되어야 한다. 이 방법은 곤충 해충 수의 신속한 감소가 필요한 유행 상황에서 특히 효과적일 수 있다. 이와 같이, 이는 도시 뎅기열 제어 캠페인에서 사용될 수 있다.
효과적인 공간 분무는 일반적으로 하기와 같은 특정 원칙에 의존한다. 표적 곤충은 일반적으로 분무 구름을 통해 날아간다(또는 노출된 표면 상에서 쉬는 동안 때때로 영향을 받음). 따라서 분무 액적 및 표적 곤충 간 접촉 효율성이 중추적이다. 이는 분무 액적이 최적 시기 동안 공기 중에 남아 있고 이들이 적절한 용량의 살충제를 포함하는 것을 확인함으로써 달성된다. 이 두 가지 문제는 주로 액적 크기의 최적화를 통해 해결된다. 액적이 너무 크면 이들이 너무 빨리 땅에 떨어지며 적용 동안 만나는 초목 또는 기타 장애물을 관통하지 않는다(적용 유효 영역을 제한함). 이러한 큰 액적 중 하나가 개별 곤충에 영향을 미치는 경우, 개별 곤충당 고용량이 전달될 것이므로, 이는 "과잉사멸(overkill)"이기도 하다. 물방울이 너무 작으면, 이들은 공기역학으로 인해 표적 곤충 상에 침착하지 않을 수 있거나(충돌 없음) 대류에 의해 대기 내 위쪽으로 운반될 수 있다. 공간-분무 적용을 위한 최적 액적 크기는 10-25 마이크론의 부피 중앙값 지름(VMD)를 갖는 액적이다.
일부 실시양태에서, 분무 가능 조성물은 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 분무 가능 조성물은 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
발포체
TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 본 발명의 활성 조성물은 에어로졸화된 발포체 적용을 포함하는, 에어로졸 기반 적용으로서 분무 제품으로 이용 가능하게 제조될 수 있다. 가압 캔은 에어로졸 형성을 위한 전형적인 비히클이다. TVP 또는 TVP 살충 단백질과 상용성인 에어로졸 추진제가 사용된다. 바람직하게는, 액화 가스형 추진제가 사용된다.
적합한 추진제는 압축 공기, 이산화탄소, 부탄 및 질소를 포함한다. 활성 화합물 조성물 중 추진제의 농도는 피리딘 조성물의 약 5중량% 내지 약 40중량%, 바람직하게는 TVP, TVP-살충 단백질. 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 조성물의 약 15중량% 내지 약 30중량%이다.
한 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 제형물은 또한 하나 이상의 발포제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 발포제는 나트륨 라우레스 설페이트, 코카미드 DEA 및 코카미도프로필 베타인을 포함한다. 바람직하게는, 나트륨 라우레스 설페이트, 코카미드 DEA 및 코카미도프로필이 조합되어 사용된다. 활성 화합물 조성물 중 발포제(들)의 농도는 조성물의 약 10중량% 내지 약 25중량%, 더욱 바람직하게는 15중량% 내지 20중량%이다.
이러한 제형물이 발포제를 포함하지 않는 에어로졸 적용에 사용될 때, 본 발명의 활성 조성물은 사용 직전에 혼합할 필요 없이 사용될 수 있다. 그러나 발포제를 포함하는 에어로졸 제형물은 사용 직전에 혼합(즉, 진탕)이 필요하다. 또한, 발포제를 포함하는 제형물이 장기간 사용되는 경우, 사용 동안 주기적 간격으로 추가 혼합이 필요할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에어로졸화된 발포체는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에어로졸화된 발포체는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
연소 제형물
일부 실시양태에서, 주거 지역은 또한 조성물을 포함하는 양초, 연기 코일 또는 인센스 조각과 같은 연소 제형물을 사용함으로써 활성 TVP 또는 TVP-살충 단백질 조성물로 처리될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 가열, 예를 들어 전기적으로, 또는 연소에 의해 살충 조성물이 방출되는 "가열된" 탈취 방향제와 같은 가정용 제품으로 제형화될 수 있다. TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 본 발명의 활성 화합물 조성물은 에어로졸, 모기향 코일, 및/또는 기화기 또는 연무기로서 분무 제품으로 이용 가능하게 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 연소 제형물은 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 연소 제형물은 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
직물 처리
일부 실시양태에서, 직물 및 의복은 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 살해충 유효 조성물을 포함하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 물질, 섬유, 실, 직조물, 그물 또는 기재 중 TVP 또는 TVP-살충 단백질의 농도는 예를 들어 0.05 내지 15중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10중량%, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 8중량%, 특히 0.5 내지 5, 예컨대 1 내지 3중량%의 비교적 넓은 농도 범위 내에서 변할 수 있다.
유사하게, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 조성물(표면 처리를 위한 것이건 섬유, 실, 그물, 직조물을 코팅하기 위한 것이건)의 농도는, 예를 들어 0.1 내지 70중량%, 예를 들어 0.5 내지 50중량%, 바람직하게는 1 내지 40중량%, 더욱 바람직하게는 5 내지 30중량%, 특히 10 내지 20중량%의, 비교적 넓은 농도 범위 내에서 변할 수 있다.
TVP 또는 TVP 살충 단백질의 농도는 녹다운 유효성, 내구성 및 독성에 관한 요구사항이 충족되도록 적용 분야에 따라 선택될 수 있다. 물질의 특성 적응도 달성될 수 있고, 따라서 이러한 방식으로 맞춤형 텍스타일 직물을 얻을 수 있다.
따라서, TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량은 특정 사용 패턴, 제어가 가장 요망되는 곤충 해충 및 TVP 또는 TVP-살충 단백질이 사용될 환경에 의존할 수 있다. 따라서, TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량은 곤충 해충의 제어가 달성되기 충분하다.
일부 실시양태에서, 직물 처리는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 직물 처리는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
표면 처리 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 건물 내부의 벽, 바닥 및 천장을 코팅하기 위한, 및 기재 또는 비생물 물질을 코팅하기 위한, TVP 및 부형제로 구성되거나 TVP-살충 단백질 및 부형제로 구성되는 조성물 또는 제형물을 제공한다. TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 본 발명의 조성물은 목적을 염두에 두고 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. TVP-살충 단백질 및 부형제로 구성되는 조성물의 제조물은 또한 화합물이 표면 또는 다른 기재에 결합하는 것을 용이하게 하기 위해 결합제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 결합에 유용한 제제는 당분야에 알려져 있고 형태가 중합체인 경향이 있다. 특정 다공성 및/또는 결합 특성을 갖는 벽 표면에 적용될 조성물에 적합한 결합제의 유형은 섬유, 실, 직조물 또는 그물과 비교될 때 상이할 것이며, 따라서 당업자는 알려진 교시에 기반하여 원하는 표면 및/또는 기재에 기반한 적합한 결합제를 선택할 것이다.
전형적인 결합제는 폴리비닐알코올, 변형된 전분, 폴리 비닐 아크릴레이트, 폴리아크릴, 폴리비닐 아세테이트 공중합체, 폴리우레탄 및 변형된 식물성 오일이다. 적합한 결합제는 매우 다양한 중합체 및 공중합체 그리고 이의 조합으로부터 유래된 라텍스 분산액을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 결합제로서 사용하기 적합한 라텍스는 내부에 공중합된 3개 이상의 상이한 단량체 종을 포함하는 중합체를 포함하는, 스티렌, 알킬 스티렌, 이소프렌, 부타디엔, 아크릴로니트릴 저급 알킬 아크릴레이트, 비닐 클로라이드, 비닐리덴 클로라이드, 저급 카복실산 및 알파, 베타-에틸렌계 불포화 카복실산의 비닐 에스테르의 중합체 및 공중합체뿐만 아니라 실리콘 또는 폴리우레탄의 후분산 현탁액을 포함한다. 활성 성분을 다른 표면에 결합시키기 위해 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 중합체가 또한 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표면 처리 조성물은 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표면 처리 조성물은 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
분산제
일부 예시적 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 살충 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제, 희석제 또는 담체(예를 들어, 물), 중합체 결합제 및/또는 분산제, 중합제, 유화제, 증점제, 알코올, 향료, 또는 당분야에 알려진 분무 가능 살충제의 제조에 사용되는 임의의 다른 불활성 부형제와 같은 추가 구성성분으로 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 조성물은 현탁액 또는 캡슐 현탁액과 같은 다수의 상이한 형태 또는 제형물 유형으로 제조될 수 있다. 그리고 당업자는 특정 TVP 또는 TVP 살충 단백질의 특성, 그 용도 및 그 적용 유형에 기반하여 관련 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법, 실시양태, 및 다른 측면에서 사용되는 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 현탁액 또는 캡슐 현탁액 제형물에 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 TVP 또는 TVP 살충 단백질은 개선된 세척 견뢰도 및 더 긴 활성 기간을 제공할 수 있다. 제형물은 유기물 기반 또는 수계 기반, 바람직하게는 수계 기반일 수 있다.
일부 실시양태에서, 분산제는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 분산제는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
마이크로캡슐화
본 개시내용에 따른 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 마이크로캡슐화 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 당분야에 알려진 임의의 적합한 기술로 제조될 수 있다. 예를 들어, 물질을 마이크로캡슐화하기 위한 다양한 공정이 이전에 개발되었다. 이러한 공정은 물리적 방법, 상 분리 및 계면 반응의 세 가지 범주로 구분될 수 있다. 물리적 방법 범주에서, 마이크로캡슐 벽 물질 및 코어 입자가 물리적으로 가까워지고 벽 물질이 코어 입자 주위를 흐르면서 마이크로캡슐을 형성한다. 상 분리 범주에서, 마이크로캡슐은 벽 물질이 용해되고 코아세르베이션과 같이 연속상으로부터 물리적으로 분리되고 코어 입자 주위에 침착되는 비혼화성 연속상에 코어 물질을 유화 또는 분산시켜 형성된다. 계면 반응 범주에서, 코어 물질을 비혼화성 연속상에 유화 또는 분산시킨 후 코어 입자의 표면에서 계면 중합 반응을 일으켜서 마이크로캡슐이 형성된다. 마이크로캡슐에 존재하는 TVP 또는 TVP-살충 단백질의 농도는 마이크로캡슐의 0.1 내지 60중량%로 변할 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로캡슐화는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로캡슐화는 약 0.005중량% 내지 약 99중량% 범위인 양의 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
키트, 제형물, 분산제 및 이의 성분
본 개시내용에 따른 조성물(TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성됨), 방법, 실시양태 및 기타 측면에서 사용되는 제형물은 모든 성분을 함께 물과 혼합함으로써 그리고 물과 선택적으로 적합한 혼합 및/또는 분산 응집체를 사용함으로써 형성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제형물은 10 내지 70℃, 바람직하게는 15 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 형성된다. 일반적으로, (A), (B), (C) 및/또는 (D) 중 하나 이상을 포함하는 제형물이 가능하며, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(살해충제로서)(A); 고체 중합체(B); 선택적 추가 첨가제(D)를 사용하고; 이들을 수성 구성성분(C)에 분산시킬 수 있다. 결합제가 본 발명의 조성물(TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성됨)에 존재하는 경우, 중합체 결합제(B)의 수중 분산액뿐만 아니라 이전에 별도로 제조된 수중 TVP 또는 TVP 살충 단백질(A)의 수성 제형물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 별도의 제형물은 각각의 제형물에서 (A) 및/또는 (B)를 안정화하기 위한 추가 첨가제를 포함할 수 있고 상업적으로 이용 가능하다. 두 번째 공정 단계에서, 이러한 미가공 제형물 및 선택적으로 추가 물(구성성분(C))이 첨가된다. 또한, 상기 반응식에 기반한 상기 언급된 성분들의 조합도 마찬가지로, 예를 들어 (A) 및/또는 (B)의 미리 형성된 분산액을 사용하고 이를 고체 (A) 및/또는 (B)와 혼합할 수 있다. 중합체 결합제(B)의 분산액은 화학물질 제조업체에서 이미 제조된 미리 제조된 분산액일 수 있다.
더욱이, "수제" 분산액, 즉 최종 사용자에 의해 소규모로 제조된 분산액을 사용하는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 분산액은 수중 약 20%의 결합제(B)의 혼합물을 제공하고, 혼합물을 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열하고, 혼합물을 몇 시간 동안 집중적으로 교반함으로써 제조될 수 있다. 최종 사용자가 본 발명에 따른 공정에 쉽게 사용할 수 있도록 제형물을 최종 산물로 제조할 수 있다. 그리고 당연히, 사용을 위해 원하는 농도로 최종 사용자에 의해 추가 물(C)로 희석될 수 있는 농축액을 제조하는 것이 물론 유사하게 가능하다.
한 실시양태에서, SSI 적용에 적합한 조성물(TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성됨) 또는 코팅 제형물(TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성됨)은 활성 성분 및 담체, 예컨대 물을 포함하고, 또한 분산제, 수화제, 부동액, 증점제, 보존제, 유화제 및 결합제 또는 스티커로부터 선택되는 하나 이상의 공동-제형제일 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 예시적인 고체 제형물은 일반적으로 원하는 입자 크기, 예컨대 입자 크기 분포 d(0.5)가 일반적으로 3 내지 20, 바람직하게는 5 내지 15, 특히 7 내지 12 μm로 분쇄된다.
또한, 제형물을 적어도 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 제1 구성성분(A); 및 적어도 하나의 중합체 결합제(B)를 포함하는 제2 구성성분을 포함하는 키트로서 최종 사용자에게 운송할 수 있다. 추가 첨가제(D)는 키트의 세 번째 별도 구성성분일 수 있거나 구성성분 (A) 및/또는 (B)와 이미 혼합되어 있을 수 있다. 최종 사용자는 키트의 구성성분에 물(C)을 단순 첨가하고 혼합함으로써 사용하기 위한 제형물을 제조할 수 있다. 키트의 구성성분은 또한 수중 제형물일 수 있다. 물론, 구성성분 중 하나의 수성 제형물을 다른 구성성분(들)의 건조 제형물과 조합할 수 있다. 한 예로서, 키트는 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(A) 및 선택적으로 물(C)의 하나의 제형물으로 구성될 수 있고; 및 적어도 하나의 중합체 결합제(B), 구성성분(C)으로서의 물 및 선택적으로 구성성분(D)의 제2의 별도 제형물로 구성될 수 있다.
구성성분 (A), (B), (C) 및 선택적으로 (D)의 농도는 코팅/처리에 사용될 기술에 따라 당업자에 의해 선택될 것이다. 일반적으로, TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(A)의 양은 조성물의 중량을 기준으로 최대 50, 바람직하게는 1 내지 50, 예컨대 10 내지 40, 특히 15 내지 30중량%일 수 있다. 중합체 결합제(B)의 양은 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 30, 바람직하게는 0.5 내지 15, 더욱 바람직하게는 1 내지 10, 특히 1 내지 5중량% 범위일 수 있다. 존재하는 경우, 일반적으로 추가 구성성분(D)의 양은 조성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 20, 바람직하게는 0.5 내지 15중량%이다. 존재하는 경우, 적합한 양의 안료 및/또는 염료 및/또는 향료는 일반적으로 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 5, 바람직하게는 0.1 내지 3, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 2중량%이다. 바로 사용할 수 있는 전형적인 제형물은 0.1 내지 40, 바람직하게는 1 내지 30%의 구성성분 (A), (B), 및 선택적으로 (D)를 포함하고, 잔여량은 물(C)이다. 최종 사용자가 희석할 농축물의 전형적인 농도는 5 내지 70, 바람직하게는 10 내지 60%의 구성성분 (A), (B) 및 선택적으로 (D)를 포함할 수 있으며, 잔여량은 물(C)이다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)(예를 들어, 표 1에서 발견되는 것들), 및/또는 본원에 기재된 임의의 TVP-살충 단백질; 및/또는 이에 관한 임의의 방법이 본원에 기재된 바와 같은 임의의 상기 분무 가능 조성물, 제형물 및/또는 키트를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
유리화
유리화는 단단한 무정형 유리질 당 매트릭스에서 펩티드의 고정화를 통해 펩티드의 반응 역학이 느려지는 공정을 설명한다: 이는 펩티드의 분해를 극적으로 늦춘다. 문헌(Slade et al., Beyond water activity: recent advances based on an alternative approach to the assessment of food quality and safety, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 30 (1991) 115-360)을 참고한다. 펩티드의 폴딩해제 및 기타 분해 메커니즘은 펩티드의 분자 운동성에 따라 의존한다; 따라서 유리화는 그러한 분해를 늦춘다. 문헌(Change et al., Mechanism of protein stabilization by sugars during freeze-drying and storage: native structure preservation, specific interaction, and/or immobilization in a glassy matrix?, J Pharm. Sci. 94 (2005) 1427-1444; 및 G.O. Poinar and R. Hess, Ultrastructure of 40-million-year-old insect tissue, Science 80 (215) (1982) 1241-1242)을 참고한다.
유리화에 대한 예시적인 설명 및 펩티드 안정화에서 이의 고려사항은 문헌(Mensink et al., How sugars protect proteins in the solid state and during drying (review): Mechanisms of stabilization in relation to stress conditions. Eur J Pharm Biopharm. 2017 May;114:288-295)에 제공되며; 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시예에서, 본 발명의 TVP는 유리화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 TVP는 유리화 공정을 사용하여 안정화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유리화는 당의 사용을 통해 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당은 트레할로스일 수 있다.
트레할로스
트레할로스는 2개의 α-글루코스 단위 사이에 1,1-글리코시드 결합에 의해 형성된 이당류이다. 일부 실시양태에서, 트레할로스에 대한 분자식은 C12H22O11이고; 342.3 g/mol의 분자량을 갖는다.
트레할로스는 자연에서 이당류로 및 일부 중합체에서 단량체로도 발견된다; 그러나 자연에서 발견되지 않는 일부 트레할로스 이성질체가 존재한다. 문헌(Elbein et al., New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 2003 Apr;13(4):17R-27R)을 참고한다.
트레할로스는 열, 냉동 및 건조와 같은 스트레스에 대해 단백질 및 세포를 안정화하는 것으로 나타났다. 문헌(K. Lippert and E. Galinski, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 37, 61-65; J. K. Kaushik and R. Bhat,　J. Biol. Chem., 2003, 278, 26458-26465; R. P. Baptista, S. Pedersen, G. J. Cabrita, D. E. Otzen, J. M. Cabral and E. P. Melo,　Biopolymers, 2008, 89, 538-547; Guo et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18, 168-171; Hengherr et al., FEBS J., 2008, 275, 281-288; Crowe et al., Science, 1984, 223, 701-703; Beattie et al., Diabetes, 1997, 46, 519-523; P. Sundaramurthi and R. Suryanarayanan, J. Phys. Chem. Lett., 2009, 1, 510-514; Duong et al., Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72, 1218-1225)을 참고한다.
실제로 일부 동물은 환경 스트레스에 반응하여 상당한 수준까지 트레할로스를 축적하고, 이에 따라 생물학적 분자를 안정화하는 트레할로스의 능력을 강조한다. 문헌(P. Westh and H. Ramlev, J. Exp. Zool., 1991, 258, 303-311; 및 K. A. C. Madin and J. H. Crowe, J. Exp. Zool., 1975, 193, 335-342)을 참고한다. 또한, 트레할로스는 일반적으로 안전한 것으로 간주되며, 몇몇 약학 약물에서 안정화제로 사용된다. 문헌(N. K. Jain and I. Roy, Protein Sci., 2009, 18, 24-36; 및 S. Ohtake and Y. J. Wang, J. Pharm. Sci., 2011, 100, 2020-2053)을 참고한다.
트레할로스의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 트레할로스는 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능하다. 예를 들어, D-(+)-트레할로스 2수화물(제품 번호 T9531); 및 트레할로스(제품 번호 PHR1344 및 1673715)는 Sigma Aldrich(Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA)로부터 이용 가능하다.
화학물질 초록 서비스(CAS) Reg. 99-20-7(무수물); 및 CAS 등록 번호 6138-23-4(2수화물)를 갖는 예시적인 트레할로스 분자가 본원에 제공된다. 본 개시내용의 예시적인 트레할로스 화합물은 PubChem CID 번호 7427을 갖는다.
펩티드를 안정화하기 위한 트레할로스의 사용에 대한 예시적인 설명은 미국 특허 번호 6,165,981; 6,171,586; 6,991,790; 7,956,028; 10,273,333; 및 10,588,957에 제공되며; 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
조성물에서 트레할로스의 제조 및 사용에 대한 예시적인 설명은 미국 특허 번호 7,678,764에 제공되며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 조성물 및 제형물
본원에 사용된 바와 같이, "제형물" 및 "조성물"은 동의어이다.
조성물 및 제형물 구성성분 범위 및 설명
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 액체 농축물, 수화 분말, 또는 과립 제형물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 아래 기재된 임의의 제형물에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음 제형물: 수화 분말 또는 과립 제형물; 또는 액체 농축물 제형물에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제형물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되며; 부형제는 트레할로스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 말토덱스트린; 및 BIT를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물 중량의 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% wt/wt 범위의 트레할로스 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 99.9%; 약 1% 내지 약 99.9%; 약 2% 내지 약 99.9%; 약 3% 내지 약 99.9%; 약 4% 내지 약 99.9%; 약 5% 내지 약 99.9%; 약 6% 내지 약 99.9%; 약 7% 내지 약 99.9%; 약 8% 내지 약 99.9%; 약 9% 내지 약 99.9%; 약 10% 내지 약 99.9%; 약 11% 내지 약 99.9%; 약 12% 내지 약 99.9%; 약 13% 내지 약 99.9%; 약 14% 내지 약 99.9%; 약 15% 내지 약 99.9%; 약 16% 내지 약 99.9%; 약 17% 내지 약 99.9%; 약 18% 내지 약 99.9%; 약 19% 내지 약 99.9%; 약 20% 내지 약 99.9%; 약 21% 내지 약 99.9%; 약 22% 내지 약 99.9%; 약 23% 내지 약 99.9%; 약 24% 내지 약 99.9%; 약 25% 내지 약 99.9%; 약 26% 내지 약 99.9%; 약 27% 내지 약 99.9%; 약 28% 내지 약 99.9%; 약 29% 내지 약 99.9%; 약 30% 내지 약 99.9%; 약 31% 내지 약 99.9%; 약 32% 내지 약 99.9%; 약 33% 내지 약 99.9%; 약 34% 내지 약 99.9%; 약 35% 내지 약 99.9%; 약 36% 내지 약 99.9%; 약 37% 내지 약 99.9%; 약 38% 내지 약 99.9%; 약 39% 내지 약 99.9%; 약 40% 내지 약 99.9%; 약 41% 내지 약 99.9%; 약 42% 내지 약 99.9%; 약 43% 내지 약 99.9%; 약 44% 내지 약 99.9%; 약 45% 내지 약 99.9%; 약 46% 내지 약 99.9%; 약 47% 내지 약 99.9%; 약 48% 내지 약 99.9%; 약 49% 내지 약 99.9%; 약 50% 내지 약 99.9%; 약 51% 내지 약 99.9%; 약 52% 내지 약 99.9%; 약 53% 내지 약 99.9%; 약 54% 내지 약 99.9%; 약 55% 내지 약 99.9%; 약 56% 내지 약 99.9%; 약 57% 내지 약 99.9%; 약 58% 내지 약 99.9%; 약 59% 내지 약 99.9%; 약 60% 내지 약 99.9%; 약 61% 내지 약 99.9%; 약 62% 내지 약 99.9%; 약 63% 내지 약 99.9%; 약 64% 내지 약 99.9%; 약 65% 내지 약 99.9%; 약 66% 내지 약 99.9%; 약 67% 내지 약 99.9%; 약 68% 내지 약 99.9%; 약 69% 내지 약 99.9%; 약 70% 내지 약 99.9%; 약 71% 내지 약 99.9%; 약 72% 내지 약 99.9%; 약 73% 내지 약 99.9%; 약 74% 내지 약 99.9%; 약 75% 내지 약 99.9%; 약 76% 내지 약 99.9%; 약 77% 내지 약 99.9%; 약 78% 내지 약 99.9%; 약 79% 내지 약 99.9%; 약 80% 내지 약 99.9%; 약 81% 내지 약 99.9%; 약 82% 내지 약 99.9%; 약 83% 내지 약 99.9%; 약 84% 내지 약 99.9%; 약 85% 내지 약 99.9%; 약 86% 내지 약 99.9%; 약 87% 내지 약 99.9%; 약 88% 내지 약 99.9%; 약 89% 내지 약 99.9%; 약 90% 내지 약 99.9%; 약 91% 내지 약 99.9%; 약 92% 내지 약 99.9%; 약 93% 내지 약 99.9%; 약 94% 내지 약 99.9%; 약 95% 내지 약 99.9%; 약 96% 내지 약 99.9%; 약 97% 내지 약 99.9%; 약 98% 내지 약 99.9%; 또는 약 99% 내지 약 99.9% 범위의 트레할로스 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 99%; 약 0.1% 내지 약 98%; 약 0.1% 내지 약 97%; 약 0.1% 내지 약 96%; 약 0.1% 내지 약 95%; 약 0.1% 내지 약 94%; 약 0.1% 내지 약 93%; 약 0.1% 내지 약 92%; 약 0.1% 내지 약 91%; 약 0.1% 내지 약 90%; 약 0.1% 내지 약 89%; 약 0.1% 내지 약 88%; 약 0.1% 내지 약 87%; 약 0.1% 내지 약 86%; 약 0.1% 내지 약 85%; 약 0.1% 내지 약 84%; 약 0.1% 내지 약 83%; 약 0.1% 내지 약 82%; 약 0.1% 내지 약 81%; 약 0.1% 내지 약 80%; 약 0.1% 내지 약 79%; 약 0.1% 내지 약 78%; 약 0.1% 내지 약 77%; 약 0.1% 내지 약 76%; 약 0.1% 내지 약 75%; 약 0.1% 내지 약 74%; 약 0.1% 내지 약 73%; 약 0.1% 내지 약 72%; 약 0.1% 내지 약 71%; 약 0.1% 내지 약 70%; 약 0.1% 내지 약 69%; 약 0.1% 내지 약 68%; 약 0.1% 내지 약 67%; 약 0.1% 내지 약 66%; 약 0.1% 내지 약 65%; 약 0.1% 내지 약 64%; 약 0.1% 내지 약 63%; 약 0.1% 내지 약 62%; 약 0.1% 내지 약 61%; 약 0.1% 내지 약 60%; 약 0.1% 내지 약 59%; 약 0.1% 내지 약 58%; 약 0.1% 내지 약 57%; 약 0.1% 내지 약 56%; 약 0.1% 내지 약 55%; 약 0.1% 내지 약 54%; 약 0.1% 내지 약 53%; 약 0.1% 내지 약 52%; 약 0.1% 내지 약 51%; 약 0.1% 내지 약 50%; 약 0.1% 내지 약 49%; 약 0.1% 내지 약 48%; 약 0.1% 내지 약 47%; 약 0.1% 내지 약 46%; 약 0.1% 내지 약 45%; 약 0.1% 내지 약 44%; 약 0.1% 내지 약 43%; 약 0.1% 내지 약 42%; 약 0.1% 내지 약 41%; 약 0.1% 내지 약 40%; 약 0.1% 내지 약 39%; 약 0.1% 내지 약 38%; 약 0.1% 내지 약 37%; 약 0.1% 내지 약 36%; 약 0.1% 내지 약 35%; 약 0.1% 내지 약 34%; 약 0.1% 내지 약 33%; 약 0.1% 내지 약 32%; 약 0.1% 내지 약 31%; 약 0.1% 내지 약 30%; 약 0.1% 내지 약 29%; 약 0.1% 내지 약 28%; 약 0.1% 내지 약 27%; 약 0.1% 내지 약 26%; 약 0.1% 내지 약 25%; 약 0.1% 내지 약 24%; 약 0.1% 내지 약 23%; 약 0.1% 내지 약 22%; 약 0.1% 내지 약 21%; 약 0.1% 내지 약 20%; 약 0.1% 내지 약 19%; 약 0.1% 내지 약 18%; 약 0.1% 내지 약 17%; 약 0.1% 내지 약 16%; 약 0.1% 내지 약 15%; 약 0.1% 내지 약 14%; 약 0.1% 내지 약 13%; 약 0.1% 내지 약 12%; 약 0.1% 내지 약 11%; 약 0.1% 내지 약 10%; 약 0.1% 내지 약 9%; 약 0.1% 내지 약 8%; 약 0.1% 내지 약 7%; 약 0.1% 내지 약 6%; 약 0.1% 내지 약 5%; 약 0.1% 내지 약 4%; 약 0.1% 내지 약 3%; 약 0.1% 내지 약 2%; 약 0.1% 내지 약 1%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.5% wt/wt 범위의 트레할로스 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 40%; 약 0.5% 내지 약 40%; 약 1% 내지 약 40%; 약 2% 내지 약 40%; 약 3% 내지 약 40%; 약 4% 내지 약 40%; 약 5% 내지 약 40%; 약 6% 내지 약 40%; 약 7% 내지 약 40%; 약 8% 내지 약 40%; 약 9% 내지 약 40%; 약 10% 내지 약 40%; 약 11% 내지 약 40%; 약 12% 내지 약 40%; 약 13% 내지 약 40%; 약 14% 내지 약 40%; 약 15% 내지 약 40%; 약 16% 내지 약 40%; 약 17% 내지 약 40%; 약 18% 내지 약 40%; 약 19% 내지 약 40%; 약 20% 내지 약 40%; 약 21% 내지 약 40%; 약 22% 내지 약 40%; 약 23% 내지 약 40%; 약 24% 내지 약 40%; 약 25% 내지 약 40%; 약 26% 내지 약 40%; 약 27% 내지 약 40%; 약 28% 내지 약 40%; 약 29% 내지 약 40%; 약 30% 내지 약 40%; 약 31% 내지 약 40%; 약 32% 내지 약 40%; 약 33% 내지 약 40%; 약 34% 내지 약 40%; 약 35% 내지 약 40%; 약 36% 내지 약 40%; 약 37% 내지 약 40%; 약 38% 내지 약 40%; 또는 약 39% 내지 약 40% wt/wt 범위의 이염기성 인산칼륨(K2HPO4) 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 40%; 약 0.1% 내지 약 39%; 약 0.1% 내지 약 38%; 약 0.1% 내지 약 37%; 약 0.1% 내지 약 36%; 약 0.1% 내지 약 35%; 약 0.1% 내지 약 34%; 약 0.1% 내지 약 33%; 약 0.1% 내지 약 32%; 약 0.1% 내지 약 31%; 약 0.1% 내지 약 30%; 약 0.1% 내지 약 29%; 약 0.1% 내지 약 28%; 약 0.1% 내지 약 27%; 약 0.1% 내지 약 26%; 약 0.1% 내지 약 25%; 약 0.1% 내지 약 24%; 약 0.1% 내지 약 23%; 약 0.1% 내지 약 22%; 약 0.1% 내지 약 21%; 약 0.1% 내지 약 20%; 약 0.1% 내지 약 19%; 약 0.1% 내지 약 18%; 약 0.1% 내지 약 17%; 약 0.1% 내지 약 16%; 약 0.1% 내지 약 15%; 약 0.1% 내지 약 14%; 약 0.1% 내지 약 13%; 약 0.1% 내지 약 12%; 약 0.1% 내지 약 11%; 약 0.1% 내지 약 10%; 약 0.1% 내지 약 9%; 약 0.1% 내지 약 8%; 약 0.1% 내지 약 7%; 약 0.1% 내지 약 6%; 약 0.1% 내지 약 5%; 약 0.1% 내지 약 4%; 약 0.1% 내지 약 3%; 약 0.1% 내지 약 2%; 약 0.1% 내지 약 1%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.5% wt/wt 범위의 이염기성 인산칼륨(K2HPO4) 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 20%; 약 0.5% 내지 약 20%; 약 1% 내지 약 20%; 약 2% 내지 약 20%; 약 3% 내지 약 20%; 약 4% 내지 약 20%; 약 5% 내지 약 20%; 약 6% 내지 약 20%; 약 7% 내지 약 20%; 약 8% 내지 약 20%; 약 9% 내지 약 20%; 약 10% 내지 약 20%; 약 11% 내지 약 20%; 약 12% 내지 약 20%; 약 13% 내지 약 20%; 약 14% 내지 약 20%; 약 15% 내지 약 20%; 약 16% 내지 약 20%; 약 17% 내지 약 20%; 약 18% 내지 약 20%; 또는 약 19% 내지 약 20% wt/wt 범위의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4) 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 20%; 약 0.1% 내지 약 19%; 약 0.1% 내지 약 18%; 약 0.1% 내지 약 17%; 약 0.1% 내지 약 16%; 약 0.1% 내지 약 15%; 약 0.1% 내지 약 14%; 약 0.1% 내지 약 13%; 약 0.1% 내지 약 12%; 약 0.1% 내지 약 11%; 약 0.1% 내지 약 10%; 약 0.1% 내지 약 9%; 약 0.1% 내지 약 8%; 약 0.1% 내지 약 7%; 약 0.1% 내지 약 6%; 약 0.1% 내지 약 5%; 약 0.1% 내지 약 4%; 약 0.1% 내지 약 3%; 약 0.1% 내지 약 2%; 약 0.1% 내지 약 1%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.5% wt/wt 범위의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4) 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 99.9%; 약 1% 내지 약 99.9%; 약 2% 내지 약 99.9%; 약 3% 내지 약 99.9%; 약 4% 내지 약 99.9%; 약 5% 내지 약 99.9%; 약 6% 내지 약 99.9%; 약 7% 내지 약 99.9%; 약 8% 내지 약 99.9%; 약 9% 내지 약 99.9%; 약 10% 내지 약 99.9%; 약 11% 내지 약 99.9%; 약 12% 내지 약 99.9%; 약 13% 내지 약 99.9%; 약 14% 내지 약 99.9%; 약 15% 내지 약 99.9%; 약 16% 내지 약 99.9%; 약 17% 내지 약 99.9%; 약 18% 내지 약 99.9%; 약 19% 내지 약 99.9%; 약 20% 내지 약 99.9%; 약 21% 내지 약 99.9%; 약 22% 내지 약 99.9%; 약 23% 내지 약 99.9%; 약 24% 내지 약 99.9%; 약 25% 내지 약 99.9%; 약 26% 내지 약 99.9%; 약 27% 내지 약 99.9%; 약 28% 내지 약 99.9%; 약 29% 내지 약 99.9%; 약 30% 내지 약 99.9%; 약 31% 내지 약 99.9%; 약 32% 내지 약 99.9%; 약 33% 내지 약 99.9%; 약 34% 내지 약 99.9%; 약 35% 내지 약 99.9%; 약 36% 내지 약 99.9%; 약 37% 내지 약 99.9%; 약 38% 내지 약 99.9%; 약 39% 내지 약 99.9%; 약 40% 내지 약 99.9%; 약 41% 내지 약 99.9%; 약 42% 내지 약 99.9%; 약 43% 내지 약 99.9%; 약 44% 내지 약 99.9%; 약 45% 내지 약 99.9%; 약 46% 내지 약 99.9%; 약 47% 내지 약 99.9%; 약 48% 내지 약 99.9%; 약 49% 내지 약 99.9%; 약 50% 내지 약 99.9%; 약 51% 내지 약 99.9%; 약 52% 내지 약 99.9%; 약 53% 내지 약 99.9%; 약 54% 내지 약 99.9%; 약 55% 내지 약 99.9%; 약 56% 내지 약 99.9%; 약 57% 내지 약 99.9%; 약 58% 내지 약 99.9%; 약 59% 내지 약 99.9%; 약 60% 내지 약 99.9%; 약 61% 내지 약 99.9%; 약 62% 내지 약 99.9%; 약 63% 내지 약 99.9%; 약 64% 내지 약 99.9%; 약 65% 내지 약 99.9%; 약 66% 내지 약 99.9%; 약 67% 내지 약 99.9%; 약 68% 내지 약 99.9%; 약 69% 내지 약 99.9%; 약 70% 내지 약 99.9%; 약 71% 내지 약 99.9%; 약 72% 내지 약 99.9%; 약 73% 내지 약 99.9%; 약 74% 내지 약 99.9%; 약 75% 내지 약 99.9%; 약 76% 내지 약 99.9%; 약 77% 내지 약 99.9%; 약 78% 내지 약 99.9%; 약 79% 내지 약 99.9%; 약 80% 내지 약 99.9%; 약 81% 내지 약 99.9%; 약 82% 내지 약 99.9%; 약 83% 내지 약 99.9%; 약 84% 내지 약 99.9%; 약 85% 내지 약 99.9%; 약 86% 내지 약 99.9%; 약 87% 내지 약 99.9%; 약 88% 내지 약 99.9%; 약 89% 내지 약 99.9%; 약 90% 내지 약 99.9%; 약 91% 내지 약 99.9%; 약 92% 내지 약 99.9%; 약 93% 내지 약 99.9%; 약 94% 내지 약 99.9%; 약 95% 내지 약 99.9%; 약 96% 내지 약 99.9%; 약 97% 내지 약 99.9%; 약 98% 내지 약 99.9%; 또는 약 99% 내지 약 99.9% wt/wt 범위의 말토덱스트린 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 99%; 약 0.1% 내지 약 98%; 약 0.1% 내지 약 97%; 약 0.1% 내지 약 96%; 약 0.1% 내지 약 95%; 약 0.1% 내지 약 94%; 약 0.1% 내지 약 93%; 약 0.1% 내지 약 92%; 약 0.1% 내지 약 91%; 약 0.1% 내지 약 90%; 약 0.1% 내지 약 89%; 약 0.1% 내지 약 88%; 약 0.1% 내지 약 87%; 약 0.1% 내지 약 86%; 약 0.1% 내지 약 85%; 약 0.1% 내지 약 84%; 약 0.1% 내지 약 83%; 약 0.1% 내지 약 82%; 약 0.1% 내지 약 81%; 약 0.1% 내지 약 80%; 약 0.1% 내지 약 79%; 약 0.1% 내지 약 78%; 약 0.1% 내지 약 77%; 약 0.1% 내지 약 76%; 약 0.1% 내지 약 75%; 약 0.1% 내지 약 74%; 약 0.1% 내지 약 73%; 약 0.1% 내지 약 72%; 약 0.1% 내지 약 71%; 약 0.1% 내지 약 70%; 약 0.1% 내지 약 69%; 약 0.1% 내지 약 68%; 약 0.1% 내지 약 67%; 약 0.1% 내지 약 66%; 약 0.1% 내지 약 65%; 약 0.1% 내지 약 64%; 약 0.1% 내지 약 63%; 약 0.1% 내지 약 62%; 약 0.1% 내지 약 61%; 약 0.1% 내지 약 60%; 약 0.1% 내지 약 59%; 약 0.1% 내지 약 58%; 약 0.1% 내지 약 57%; 약 0.1% 내지 약 56%; 약 0.1% 내지 약 55%; 약 0.1% 내지 약 54%; 약 0.1% 내지 약 53%; 약 0.1% 내지 약 52%; 약 0.1% 내지 약 51%; 약 0.1% 내지 약 50%; 약 0.1% 내지 약 49%; 약 0.1% 내지 약 48%; 약 0.1% 내지 약 47%; 약 0.1% 내지 약 46%; 약 0.1% 내지 약 45%; 약 0.1% 내지 약 44%; 약 0.1% 내지 약 43%; 약 0.1% 내지 약 42%; 약 0.1% 내지 약 41%; 약 0.1% 내지 약 40%; 약 0.1% 내지 약 39%; 약 0.1% 내지 약 38%; 약 0.1% 내지 약 37%; 약 0.1% 내지 약 36%; 약 0.1% 내지 약 35%; 약 0.1% 내지 약 34%; 약 0.1% 내지 약 33%; 약 0.1% 내지 약 32%; 약 0.1% 내지 약 31%; 약 0.1% 내지 약 30%; 약 0.1% 내지 약 29%; 약 0.1% 내지 약 28%; 약 0.1% 내지 약 27%; 약 0.1% 내지 약 26%; 약 0.1% 내지 약 25%; 약 0.1% 내지 약 24%; 약 0.1% 내지 약 23%; 약 0.1% 내지 약 22%; 약 0.1% 내지 약 21%; 약 0.1% 내지 약 20%; 약 0.1% 내지 약 19%; 약 0.1% 내지 약 18%; 약 0.1% 내지 약 17%; 약 0.1% 내지 약 16%; 약 0.1% 내지 약 15%; 약 0.1% 내지 약 14%; 약 0.1% 내지 약 13%; 약 0.1% 내지 약 12%; 약 0.1% 내지 약 11%; 약 0.1% 내지 약 10%; 약 0.1% 내지 약 9%; 약 0.1% 내지 약 8%; 약 0.1% 내지 약 7%; 약 0.1% 내지 약 6%; 약 0.1% 내지 약 5%; 약 0.1% 내지 약 4%; 약 0.1% 내지 약 3%; 약 0.1% 내지 약 2%; 약 0.1% 내지 약 1%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.5% wt/wt 범위의 말토덱스트린 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 말토덱스트린은 총 제형물의 약 2% 내지 약 20%; 약 3% 내지 약 20%; 약 4% 내지 약 20%; 약 5% 내지 약 20%; 약 6% 내지 약 20%; 약 7% 내지 약 20%; 약 8% 내지 약 20%; 약 9% 내지 약 20%; 약 10% 내지 약 20%; 약 11% 내지 약 20%; 약 12% 내지 약 20%; 약 13% 내지 약 20%; 약 14% 내지 약 20%; 약 15% 내지 약 20%; 약 16% 내지 약 20%; 약 17% 내지 약 20%; 약 18% 내지 약 20%; 또는 약 19% 내지 약 20% wt/wt 범위의 덱스트로스 당량을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 말토덱스트린은 총 제형물의 약 2% 내지 약 20%; 약 2% 내지 약 19%; 약 2% 내지 약 18%; 약 2% 내지 약 17%; 약 2% 내지 약 16%; 약 2% 내지 약 15%; 약 2% 내지 약 14%; 약 2% 내지 약 13%; 약 2% 내지 약 12%; 약 2% 내지 약 11%; 약 2% 내지 약 10%; 약 2% 내지 약 9%; 약 2% 내지 약 8%; 약 2% 내지 약 7%; 약 2% 내지 약 6%; 약 2% 내지 약 5%; 약 2% 내지 약 4%; 또는 약 2% 내지 약 3% wt/wt 범위의 덱스트로스 당량을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.01% 내지 약 1%; 약 0.025% 내지 약 1%; 약 0.05% 내지 약 1%; 약 0.075% 내지 약 1%; 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.125% 내지 약 1%; 약 0.15% 내지 약 1%; 약 0.175% 내지 약 1%; 약 0.2% 내지 약 1%; 약 0.225% 내지 약 1%; 약 0.25% 내지 약 1%; 약 0.275% 내지 약 1%; 약 0.3% 내지 약 1%; 약 0.325% 내지 약 1%; 약 0.35% 내지 약 1%; 약 0.375% 내지 약 1%; 약 0.4% 내지 약 1%; 약 0.425% 내지 약 1%; 약 0.45% 내지 약 1%; 약 0.475% 내지 약 1%; 약 0.5% 내지 약 1%; 약 0.525% 내지 약 1%; 약 0.55% 내지 약 1%; 약 0.575% 내지 약 1%; 약 0.6% 내지 약 1%; 약 0.625% 내지 약 1%; 약 0.65% 내지 약 1%; 약 0.675% 내지 약 1%; 약 0.7% 내지 약 1%; 약 0.725% 내지 약 1%; 약 0.75% 내지 약 1%; 약 0.775% 내지 약 1%; 약 0.8% 내지 약 1%; 약 0.825% 내지 약 1%; 약 0.85% 내지 약 1%; 약 0.875% 내지 약 1%; 약 0.9% 내지 약 1%; 약 0.925% 내지 약 1%; 약 0.95% 내지 약 1%; 또는 약 0.975% 내지 약 1% wt/wt 범위의 벤즈이소티아졸리논(BIT) 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.01% 내지 약 1%; 약 0.01% 내지 약 0.975%; 약 0.01% 내지 약 0.95%; 약 0.01% 내지 약 0.925%; 약 0.01% 내지 약 0.9%; 약 0.01% 내지 약 0.875%; 약 0.01% 내지 약 0.85%; 약 0.01% 내지 약 0.825%; 약 0.01% 내지 약 0.8%; 약 0.01% 내지 약 0.775%; 약 0.01% 내지 약 0.75%; 약 0.01% 내지 약 0.725%; 약 0.01% 내지 약 0.7%; 약 0.01% 내지 약 0.675%; 약 0.01% 내지 약 0.65%; 약 0.01% 내지 약 0.625%; 약 0.01% 내지 약 0.6%; 약 0.01% 내지 약 0.575%; 약 0.01% 내지 약 0.55%; 약 0.01% 내지 약 0.525%; 약 0.01% 내지 약 0.5%; 약 0.01% 내지 약 0.475%; 약 0.01% 내지 약 0.45%; 약 0.01% 내지 약 0.425%; 약 0.01% 내지 약 0.4%; 약 0.01% 내지 약 0.375%; 약 0.01% 내지 약 0.35%; 약 0.01% 내지 약 0.325%; 약 0.01% 내지 약 0.3%; 약 0.01% 내지 약 0.275%; 약 0.01% 내지 약 0.25%; 약 0.01% 내지 약 0.225%; 약 0.01% 내지 약 0.2%; 약 0.01% 내지 약 0.175%; 약 0.01% 내지 약 0.15%; 약 0.01% 내지 약 0.125%; 약 0.01% 내지 약 0.1%; 약 0.01% 내지 약 0.075%; 약 0.01% 내지 약 0.05%; 또는 약 0.01% 내지 약 0.025% wt/wt 범위의 벤즈이소티아졸리논(BIT) 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, BIT는 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온일 수 있다. CAS 번호 2634-33-5를 갖는 예시적인 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온이 본원에 제공된다. 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온을 어떻게 제조하는지 설명하는 예시적인 설명이 WIPO 공개 번호 WO2014173716A1에 제공되며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 또한, 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온은 상업적 공급업체에서 쉽게 구할 수 있으며, 예를 들어 PROXEL® AQ Preservative; 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액은 Lonza Group Ltd. Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland로부터 이용 가능하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.125% 내지 약 1%; 약 0.15% 내지 약 1%; 약 0.175% 내지 약 1%; 약 0.2% 내지 약 1%; 약 0.225% 내지 약 1%; 약 0.25% 내지 약 1%; 약 0.275% 내지 약 1%; 약 0.3% 내지 약 1%; 약 0.325% 내지 약 1%; 약 0.35% 내지 약 1%; 약 0.375% 내지 약 1%; 약 0.4% 내지 약 1%; 약 0.425% 내지 약 1%; 약 0.45% 내지 약 1%; 약 0.475% 내지 약 1%; 약 0.5% 내지 약 1%; 약 0.525% 내지 약 1%; 약 0.55% 내지 약 1%; 약 0.575% 내지 약 1%; 약 0.6% 내지 약 1%; 약 0.625% 내지 약 1%; 약 0.65% 내지 약 1%; 약 0.675% 내지 약 1%; 약 0.7% 내지 약 1%; 약 0.725% 내지 약 1%; 약 0.75% 내지 약 1%; 약 0.775% 내지 약 1%; 약 0.8% 내지 약 1%; 약 0.825% 내지 약 1%; 약 0.85% 내지 약 1%; 약 0.875% 내지 약 1%; 약 0.9% 내지 약 1%; 약 0.925% 내지 약 1%; 약 0.95% 내지 약 1%; 또는 약 0.975% 내지 약 1% wt/wt 범위의 리그노설포네이트 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.1% 내지 약 0.975%; 약 0.1% 내지 약 0.95%; 약 0.1% 내지 약 0.925%; 약 0.1% 내지 약 0.9%; 약 0.1% 내지 약 0.875%; 약 0.1% 내지 약 0.85%; 약 0.1% 내지 약 0.825%; 약 0.1% 내지 약 0.8%; 약 0.1% 내지 약 0.775%; 약 0.1% 내지 약 0.75%; 약 0.1% 내지 약 0.725%; 약 0.1% 내지 약 0.7%; 약 0.1% 내지 약 0.675%; 약 0.1% 내지 약 0.65%; 약 0.1% 내지 약 0.625%; 약 0.1% 내지 약 0.6%; 약 0.1% 내지 약 0.575%; 약 0.1% 내지 약 0.55%; 약 0.1% 내지 약 0.525%; 약 0.1% 내지 약 0.5%; 약 0.1% 내지 약 0.475%; 약 0.1% 내지 약 0.45%; 약 0.1% 내지 약 0.425%; 약 0.1% 내지 약 0.4%; 약 0.1% 내지 약 0.375%; 약 0.1% 내지 약 0.35%; 약 0.1% 내지 약 0.325%; 약 0.1% 내지 약 0.3%; 약 0.1% 내지 약 0.275%; 약 0.1% 내지 약 0.25%; 약 0.1% 내지 약 0.225%; 약 0.1% 내지 약 0.2%; 약 0.1% 내지 약 0.175%; 약 0.1% 내지 약 0.15%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.125% wt/wt의 리그노설포네이트 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.125% 내지 약 1%; 약 0.15% 내지 약 1%; 약 0.175% 내지 약 1%; 약 0.2% 내지 약 1%; 약 0.225% 내지 약 1%; 약 0.25% 내지 약 1%; 약 0.275% 내지 약 1%; 약 0.3% 내지 약 1%; 약 0.325% 내지 약 1%; 약 0.35% 내지 약 1%; 약 0.375% 내지 약 1%; 약 0.4% 내지 약 1%; 약 0.425% 내지 약 1%; 약 0.45% 내지 약 1%; 약 0.475% 내지 약 1%; 약 0.5% 내지 약 1%; 약 0.525% 내지 약 1%; 약 0.55% 내지 약 1%; 약 0.575% 내지 약 1%; 약 0.6% 내지 약 1%; 약 0.625% 내지 약 1%; 약 0.65% 내지 약 1%; 약 0.675% 내지 약 1%; 약 0.7% 내지 약 1%; 약 0.725% 내지 약 1%; 약 0.75% 내지 약 1%; 약 0.775% 내지 약 1%; 약 0.8% 내지 약 1%; 약 0.825% 내지 약 1%; 약 0.85% 내지 약 1%; 약 0.875% 내지 약 1%; 약 0.9% 내지 약 1%; 약 0.925% 내지 약 1%; 약 0.95% 내지 약 1%; 또는 약 0.975% 내지 약 1% wt/wt 범위의 석고 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.1% 내지 약 0.975%; 약 0.1% 내지 약 0.95%; 약 0.1% 내지 약 0.925%; 약 0.1% 내지 약 0.9%; 약 0.1% 내지 약 0.875%; 약 0.1% 내지 약 0.85%; 약 0.1% 내지 약 0.825%; 약 0.1% 내지 약 0.8%; 약 0.1% 내지 약 0.775%; 약 0.1% 내지 약 0.75%; 약 0.1% 내지 약 0.725%; 약 0.1% 내지 약 0.7%; 약 0.1% 내지 약 0.675%; 약 0.1% 내지 약 0.65%; 약 0.1% 내지 약 0.625%; 약 0.1% 내지 약 0.6%; 약 0.1% 내지 약 0.575%; 약 0.1% 내지 약 0.55%; 약 0.1% 내지 약 0.525%; 약 0.1% 내지 약 0.5%; 약 0.1% 내지 약 0.475%; 약 0.1% 내지 약 0.45%; 약 0.1% 내지 약 0.425%; 약 0.1% 내지 약 0.4%; 약 0.1% 내지 약 0.375%; 약 0.1% 내지 약 0.35%; 약 0.1% 내지 약 0.325%; 약 0.1% 내지 약 0.3%; 약 0.1% 내지 약 0.275%; 약 0.1% 내지 약 0.25%; 약 0.1% 내지 약 0.225%; 약 0.1% 내지 약 0.2%; 약 0.1% 내지 약 0.175%; 약 0.1% 내지 약 0.15%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.125% wt/wt 범위의 석고 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.5% 내지 약 8%; 약 0.75% 내지 약 8%; 약 1% 내지 약 8%; 약 1.25% 내지 약 8%; 약 1.5% 내지 약 8%; 약 1.75% 내지 약 8%; 약 2% 내지 약 8%; 약 2.25% 내지 약 8%; 약 2.5% 내지 약 8%; 약 2.75% 내지 약 8%; 약 3% 내지 약 8%; 약 3.25% 내지 약 8%; 약 3.5% 내지 약 8%; 약 3.75% 내지 약 8%; 약 4% 내지 약 8%; 약 4.25% 내지 약 8%; 약 4.5% 내지 약 8%; 약 4.75% 내지 약 8%; 약 5% 내지 약 8%; 약 5.25% 내지 약 8%; 약 5.5% 내지 약 8%; 약 5.75% 내지 약 8%; 약 6% 내지 약 8%; 약 6.25% 내지 약 8%; 약 6.5% 내지 약 8%; 약 6.75% 내지 약 8%; 약 7% 내지 약 8%; 약 7.25% 내지 약 8%; 약 7.5% 내지 약 8%; 또는 약 7.75% 내지 약 8% wt/wt 범위의 소르비톨 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.5% 내지 약 8%; 약 0.5% 내지 약 7.75%; 약 0.5% 내지 약 7.5%; 약 0.5% 내지 약 7.25%; 약 0.5% 내지 약 7%; 약 0.5% 내지 약 6.75%; 약 0.5% 내지 약 6.5%; 약 0.5% 내지 약 6.25%; 약 0.5% 내지 약 6%; 약 0.5% 내지 약 5.75%; 약 0.5% 내지 약 5.5%; 약 0.5% 내지 약 5.25%; 약 0.5% 내지 약 5%; 약 0.5% 내지 약 4.75%; 약 0.5% 내지 약 4.5%; 약 0.5% 내지 약 4.25%; 약 0.5% 내지 약 4%; 약 0.5% 내지 약 3.75%; 약 0.5% 내지 약 3.5%; 약 0.5% 내지 약 3.25%; 약 0.5% 내지 약 3%; 약 0.5% 내지 약 2.75%; 약 0.5% 내지 약 2.5%; 약 0.5% 내지 약 2.25%; 약 0.5% 내지 약 2%; 약 0.5% 내지 약 1.75%; 약 0.5% 내지 약 1.5%; 약 0.5% 내지 약 1.25%; 약 0.5% 내지 약 1%; 또는 약 0.5% 내지 약 0.75% wt/wt 범위의 소르비톨 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.125% 내지 약 1%; 약 0.15% 내지 약 1%; 약 0.175% 내지 약 1%; 약 0.2% 내지 약 1%; 약 0.225% 내지 약 1%; 약 0.25% 내지 약 1%; 약 0.275% 내지 약 1%; 약 0.3% 내지 약 1%; 약 0.325% 내지 약 1%; 약 0.35% 내지 약 1%; 약 0.375% 내지 약 1%; 약 0.4% 내지 약 1%; 약 0.425% 내지 약 1%; 약 0.45% 내지 약 1%; 약 0.475% 내지 약 1%; 약 0.5% 내지 약 1%; 약 0.525% 내지 약 1%; 약 0.55% 내지 약 1%; 약 0.575% 내지 약 1%; 약 0.6% 내지 약 1%; 약 0.625% 내지 약 1%; 약 0.65% 내지 약 1%; 약 0.675% 내지 약 1%; 약 0.7% 내지 약 1%; 약 0.725% 내지 약 1%; 약 0.75% 내지 약 1%; 약 0.775% 내지 약 1%; 약 0.8% 내지 약 1%; 약 0.825% 내지 약 1%; 약 0.85% 내지 약 1%; 약 0.875% 내지 약 1%; 약 0.9% 내지 약 1%; 약 0.925% 내지 약 1%; 약 0.95% 내지 약 1%; 또는 약 0.975% 내지 약 1% wt/wt 범위의 벤조산나트륨 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.1% 내지 약 0.975%; 약 0.1% 내지 약 0.95%; 약 0.1% 내지 약 0.925%; 약 0.1% 내지 약 0.9%; 약 0.1% 내지 약 0.875%; 약 0.1% 내지 약 0.85%; 약 0.1% 내지 약 0.825%; 약 0.1% 내지 약 0.8%; 약 0.1% 내지 약 0.775%; 약 0.1% 내지 약 0.75%; 약 0.1% 내지 약 0.725%; 약 0.1% 내지 약 0.7%; 약 0.1% 내지 약 0.675%; 약 0.1% 내지 약 0.65%; 약 0.1% 내지 약 0.625%; 약 0.1% 내지 약 0.6%; 약 0.1% 내지 약 0.575%; 약 0.1% 내지 약 0.55%; 약 0.1% 내지 약 0.525%; 약 0.1% 내지 약 0.5%; 약 0.1% 내지 약 0.475%; 약 0.1% 내지 약 0.45%; 약 0.1% 내지 약 0.425%; 약 0.1% 내지 약 0.4%; 약 0.1% 내지 약 0.375%; 약 0.1% 내지 약 0.35%; 약 0.1% 내지 약 0.325%; 약 0.1% 내지 약 0.3%; 약 0.1% 내지 약 0.275%; 약 0.1% 내지 약 0.25%; 약 0.1% 내지 약 0.225%; 약 0.1% 내지 약 0.2%; 약 0.1% 내지 약 0.175%; 약 0.1% 내지 약 0.15%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.125% wt/wt 범위의 벤조산나트륨 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.125% 내지 약 1%; 약 0.15% 내지 약 1%; 약 0.175% 내지 약 1%; 약 0.2% 내지 약 1%; 약 0.225% 내지 약 1%; 약 0.25% 내지 약 1%; 약 0.275% 내지 약 1%; 약 0.3% 내지 약 1%; 약 0.325% 내지 약 1%; 약 0.35% 내지 약 1%; 약 0.375% 내지 약 1%; 약 0.4% 내지 약 1%; 약 0.425% 내지 약 1%; 약 0.45% 내지 약 1%; 약 0.475% 내지 약 1%; 약 0.5% 내지 약 1%; 약 0.525% 내지 약 1%; 약 0.55% 내지 약 1%; 약 0.575% 내지 약 1%; 약 0.6% 내지 약 1%; 약 0.625% 내지 약 1%; 약 0.65% 내지 약 1%; 약 0.675% 내지 약 1%; 약 0.7% 내지 약 1%; 약 0.725% 내지 약 1%; 약 0.75% 내지 약 1%; 약 0.775% 내지 약 1%; 약 0.8% 내지 약 1%; 약 0.825% 내지 약 1%; 약 0.85% 내지 약 1%; 약 0.875% 내지 약 1%; 약 0.9% 내지 약 1%; 약 0.925% 내지 약 1%; 약 0.95% 내지 약 1%; 또는 약 0.975% 내지 약 1% wt/wt 범위의 소르브산칼륨 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.1% 내지 약 0.975%; 약 0.1% 내지 약 0.95%; 약 0.1% 내지 약 0.925%; 약 0.1% 내지 약 0.9%; 약 0.1% 내지 약 0.875%; 약 0.1% 내지 약 0.85%; 약 0.1% 내지 약 0.825%; 약 0.1% 내지 약 0.8%; 약 0.1% 내지 약 0.775%; 약 0.1% 내지 약 0.75%; 약 0.1% 내지 약 0.725%; 약 0.1% 내지 약 0.7%; 약 0.1% 내지 약 0.675%; 약 0.1% 내지 약 0.65%; 약 0.1% 내지 약 0.625%; 약 0.1% 내지 약 0.6%; 약 0.1% 내지 약 0.575%; 약 0.1% 내지 약 0.55%; 약 0.1% 내지 약 0.525%; 약 0.1% 내지 약 0.5%; 약 0.1% 내지 약 0.475%; 약 0.1% 내지 약 0.45%; 약 0.1% 내지 약 0.425%; 약 0.1% 내지 약 0.4%; 약 0.1% 내지 약 0.375%; 약 0.1% 내지 약 0.35%; 약 0.1% 내지 약 0.325%; 약 0.1% 내지 약 0.3%; 약 0.1% 내지 약 0.275%; 약 0.1% 내지 약 0.25%; 약 0.1% 내지 약 0.225%; 약 0.1% 내지 약 0.2%; 약 0.1% 내지 약 0.175%; 약 0.1% 내지 약 0.15%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.125% wt/wt 범위의 소르브산칼륨 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.125% 내지 약 1%; 약 0.15% 내지 약 1%; 약 0.175% 내지 약 1%; 약 0.2% 내지 약 1%; 약 0.225% 내지 약 1%; 약 0.25% 내지 약 1%; 약 0.275% 내지 약 1%; 약 0.3% 내지 약 1%; 약 0.325% 내지 약 1%; 약 0.35% 내지 약 1%; 약 0.375% 내지 약 1%; 약 0.4% 내지 약 1%; 약 0.425% 내지 약 1%; 약 0.45% 내지 약 1%; 약 0.475% 내지 약 1%; 약 0.5% 내지 약 1%; 약 0.525% 내지 약 1%; 약 0.55% 내지 약 1%; 약 0.575% 내지 약 1%; 약 0.6% 내지 약 1%; 약 0.625% 내지 약 1%; 약 0.65% 내지 약 1%; 약 0.675% 내지 약 1%; 약 0.7% 내지 약 1%; 약 0.725% 내지 약 1%; 약 0.75% 내지 약 1%; 약 0.775% 내지 약 1%; 약 0.8% 내지 약 1%; 약 0.825% 내지 약 1%; 약 0.85% 내지 약 1%; 약 0.875% 내지 약 1%; 약 0.9% 내지 약 1%; 약 0.925% 내지 약 1%; 약 0.95% 내지 약 1%; 또는 약 0.975% 내지 약 1% wt/wt 범위의 EDTA 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 총 제형물의 약 0.1% 내지 약 1%; 약 0.1% 내지 약 0.975%; 약 0.1% 내지 약 0.95%; 약 0.1% 내지 약 0.925%; 약 0.1% 내지 약 0.9%; 약 0.1% 내지 약 0.875%; 약 0.1% 내지 약 0.85%; 약 0.1% 내지 약 0.825%; 약 0.1% 내지 약 0.8%; 약 0.1% 내지 약 0.775%; 약 0.1% 내지 약 0.75%; 약 0.1% 내지 약 0.725%; 약 0.1% 내지 약 0.7%; 약 0.1% 내지 약 0.675%; 약 0.1% 내지 약 0.65%; 약 0.1% 내지 약 0.625%; 약 0.1% 내지 약 0.6%; 약 0.1% 내지 약 0.575%; 약 0.1% 내지 약 0.55%; 약 0.1% 내지 약 0.525%; 약 0.1% 내지 약 0.5%; 약 0.1% 내지 약 0.475%; 약 0.1% 내지 약 0.45%; 약 0.1% 내지 약 0.425%; 약 0.1% 내지 약 0.4%; 약 0.1% 내지 약 0.375%; 약 0.1% 내지 약 0.35%; 약 0.1% 내지 약 0.325%; 약 0.1% 내지 약 0.3%; 약 0.1% 내지 약 0.275%; 약 0.1% 내지 약 0.25%; 약 0.1% 내지 약 0.225%; 약 0.1% 내지 약 0.2%; 약 0.1% 내지 약 0.175%; 약 0.1% 내지 약 0.15%; 또는 약 0.1% 내지 약 0.125% wt/wt 범위의 EDTA 농도로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 약 5 내지 약 11; 약 5.5 내지 약 11; 약 6 내지 약 11; 약 6.5 내지 약 11; 약 7 내지 약 11; 약 7.5 내지 약 11; 약 8 내지 약 11; 약 8.5 내지 약 11; 약 9 내지 약 11; 약 9.5 내지 약 11; 약 10 내지 약 11; 또는 약 10.5 내지 약 11 범위의 pH에서 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 약 5 내지 약 11; 약 5 내지 약 10.5; 약 5 내지 약 10; 약 5 내지 약 9.5; 약 5 내지 약 9; 약 5 내지 약 8.5; 약 5 내지 약 8; 약 5 내지 약 7.5; 약 5 내지 약 7; 약 5 내지 약 6.5; 약 5 내지 약 6; 또는 약 5 내지 약 5.5 범위의 pH에서 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서 제형물은 과립 형태(과립 제형물)로 제형화될 수 있다. 과립 제형물을 생성하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 결정화, 침전, 팬 코팅, 유동층 코팅, 응집(예를 들어 유동층 응집), 회전 분무화, 압출, 구슬화, 구형화, 크기 감소 방법, 드럼 과립화 및/또는 고전단 과립화 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 과립 제형물은 응집, 예를 들어 분무-건조 응집; 재수화 응집; 유동층 응집 등을 통해 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 응집 유형은 유동층 응집일 수 있다. 예시적인 유동층 응집 방법은 미국 특허 번호 7,582,147에 제공되며; 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 과립 제형물은 유동층 응집을 통해 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 과립 제형물은 활성 및 불활성 성분을 유동층의 블랭크 담체 상으로 분무함으로써 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 과립 제형물은 활성 및 불활성 성분(부형제)을 블랭크 담체 상에 분무함으로써 생성되고 팬 제립기에서 과립화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 과립 제형물은 활성 및 불활성 분말(즉, 본원에 기재된 하나 이상의 부형제) 및 물을 혼합함으로써 생성된 후, 압출기를 통해 성분을 통과시켜 과립화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 과립 제형물은 활성 및 불활성 분말(즉, 본원에 기재된 하나 이상의 부형제)을 물과 혼합함으로써 생성되고, 롤 압축에 의해 과립화될 수 있다.
임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 본원 및 아래에 기재된 임의의 제형물에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 수화 분말 또는 과립 제형물; 또는 액체 농축물 제형물의 제형화에서 사용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태
본 개시내용은 하나 이상의 TVP, 또는 하나 이상의 TVP-살충 단백질을 포함하거나, 트랜스제닉 유기체의 경우에 이를 발현하거나 달리 생산하는 조성물, 산물, 및 트랜스제닉 유기체를 고려한다.
일부 실시양태에서, 예시적인 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 구성된다.
일부 실시양태에서, 예시적인 조성물은 (1) TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이의 조합; 및 (2) 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 구성된다.
일부 실시양태에서, 예시적인 조성물은 (1) 하나 이상의 TVP, 하나 이상의 TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 구성된다.
일부 실시양태에서, 예시적인 조성물은 (1) 하나 이상의 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 하나 이상의 TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) 하나 이상의 TVP, 또는 하나 이상의 TVP-살충 단백질; 및 (2) 하나 이상의 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) 하나 이상의 TVP, 또는 하나 이상의 TVP-살충 단백질; 및 (2) 하나 이상의 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 구성되며; 상기 (1) 또는 (2) 중 어느 하나는 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
TVP, 또는 TVP-살충 단백질(본원에 기재된 바와 같음)을 활용하는 임의의 조성물, 산물, 폴리펩티드 및/또는 식물은 해충, 이의 성장 및/또는 이의 작용에 의해 유발되는 손상, 특히 식물에 대한 손상을 제어하기 위해 사용될 수 있다.
TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 부형제로 구성되는 조성물은 농약 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 농약 조성물은 에어로졸 및/또는 에어로졸화 제품(예를 들어, 분무제, 훈증제, 분말, 분진 및/또는 가스); 종자 드레싱; 경구 제조물(예를 들어 곤충 식품 등); 또는 일시적으로 및/또는 안정적으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질을 발현 및/또는 생산하는 트랜스제닉 유기체(예를 들어, 세포, 식물 또는 동물)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 활성 성분은 조성물의 형태로 적용될 수 있고, 다른 비-활성 화합물과 동시에 또는 연속적으로 처리될 작물 영역 또는 식물에 적용될 수 있다. 이러한 화합물은 비료, 잡초 제초제, 동결보호제, 계면활성제, 세제, 비누, 휴면 오일, 중합체 및/또는 제형물의 단회 적용 후 표적 영역의 장기간 투여를 허용하는 시간 방출 또는 생분해성 담체 제형물일 수 있다. 이들 비활성 화합물 중 하나 이상은 원하는 경우 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 추가의 농업적으로 허용 가능한 담체, 계면활성제 또는 적용 촉진 보조제와 함께 제조될 수 있다. 적합한 담체 및 보조제는 고체 또는 액체일 수 있고 제형 기술에서 일반적으로 사용되는 물질, 예를 들어 천연 또는 재생 미네랄 물질, 용매, 분산제, 수화제, 점착부여제, 결합제 또는 비료에 해당한다. 유사하게, 제형물은 살해충 제형물의 표적 해충에 의한 섭식 또는 섭취를 허용하기 위해 식용 "미끼"로 제조되거나 해충 "덫"으로 형성될 수 있다.
본 개시내용의 활성 성분 또는 본 개시내용의 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 바와 같은, TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 부형제로 구성되는 본 개시내용의 농약 조성물을 적용하는 방법은 잎 적용, 종자 코팅 및 토양 적용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적용 횟수 및 적용 속도는 해당 해충의 만연 강도에 의존한다.
TVP 또는 TVP 살충 단백질 및 부형제로 구성되는 조성물은 분말, 분진, 펠렛, 과립, 분무제, 에멀젼, 콜로이드, 용액 등으로 제형화될 수 있으며, 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강, 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포 배양물의 농축과 같은 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 이러한 살해충 폴리펩티드를 포함하는 이러한 모든 조성물에서, 폴리펩티드는 약 1중량% 내지 약 99중량%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질로 구성되는 조성물은 민감한 해충, 예를 들어 나비목 및/또는 딱정벌레목 해충의 만연을 방지하기 위해 환경 영역에 예방적으로 적용될 수 있으며, 이는 본 발명의 방법에 의해 주어진 영역에서 사멸되거나 수가 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 해충은 살해충 유효량의 폴리펩티드를 섭취하거나 이와 접촉하게 된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 살해충제 조성물은 원하는 농업적으로 허용 가능한 담체와 함께 TVP 또는 TVP-살충-단백질 형질전환 박테리아, 효모, 또는 기타 세포, 결정 및/또는 포자 현탁액, 또는 단리된 단백질 구성성분을 제형화함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 전에 동결건조, 냉동건조, 건조와 같은 적절한 수단으로, 또는 수성 담체, 매질 또는 적절한 희석제, 예컨대 식염수 및/또는 기타 완충액 중 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형화된 조성물은 분진 또는 과립 물질, 또는 오일(식물성 또는 미네랄) 중 현탁액, 또는 물 또는 오일/물 에멀젼 형태, 또는 수화 분말로서, 또는 농업 적용에 적합한 임의의 다른 담체 물질과 조합될 수 있다. 적합한 농업용 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며 당분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 제형물은 하나 이상의 고체 또는 액체 보조제와 혼합될 수 있고 다양한 수단에 의해, 예를 들어 통상적인 제형화 기술을 사용하여 살해충 조성물을 적합한 보조제와 균질하게 혼합, 배합 및/또는 연마함으로써 제조될 수 있다. 적합한 제형물 및 적용 방법은 본원에 그 전체가 참조로 포함된, 미국 특허 번호 6,468,523에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되며, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되고, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되고, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되고, TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되고, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 제형물은 제형물 중량의 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%인 TVP를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP, 및 하나 이상의 부형제로 구성되며; TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고, X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP로 구성되며, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP로 구성되며, TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP로 구성되며, TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP로 구성되고, TVP는 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 링커를 갖는 TVP로 구성되며, 링커는 절단가능 링커이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 절단가능 링커를 갖는 TVP로 구성되며, 절단가능 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 링커를 갖는 TVP로 구성되며, 링커는 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP, 및 하나 이상의 부형제로 구성되며; TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고; X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되고, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제로 구성되며, 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 2% 내지 약 16% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 5% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.01% 내지 약 0.1% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 10% 내지 약 50% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 1% 내지 약 5% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.10% 내지 약 1% wt/wt 범위이고; 발효 고체는 약 15% 내지 약 40% wt/wt 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 7% 내지 약 9% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 20% 내지 약 30% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.025% 내지 약 0.075% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 30% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2% 내지 약 3% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.2% 내지 약 0.6% 범위이고; 발효 고체는 약 20% 내지 약 30% 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 8.5% wt/wt이고; 트레할로스는 약 25% wt/wt이고; BIT는 약 0.05% wt/wt이고; 말토덱스트린은 약 36.3% wt/wt이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2.6% wt/wt이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.4% wt/wt이고; 발효 고체는 약 26.85% wt/wt이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본질적으로 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP 또는 TVP-살충 단백질은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고 X7은 글리신인, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고 X7은 부재하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고 X6 및 X7은 부재하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP는 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; 링커는 절단가능 링커인, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; 절단가능 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단 가능한, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; 링커는 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되고; Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 본원 및 아래에 기재된 임의의 제형물에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음 제형물: 수화 분말 또는 과립 제형물; 또는 액체 농축물 제형물에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다).
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); X1은 Q이고, Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, 제형물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하기 부형제: 말토덱스트린; 트레할로스; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 및/또는 벤즈이소티아졸리논(BIT) 중 하나 이상으로 구성되며, TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제로 구성되는 제형물은 총 제형물 중량의 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%인 TVP를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP, 및 하나 이상의 부형제로 구성되며; TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP로 구성되며, TVP는 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP로 구성되며, TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP, 및 하나 이상의 부형제로 구성되며; TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되고, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제로 구성되며, 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 2% 내지 약 16% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 5% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.01% 내지 약 0.1% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 10% 내지 약 50% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 1% 내지 약 5% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.10% 내지 약 1% wt/wt 범위이고; 발효 고체는 약 15% 내지 약 40% wt/wt 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 7% 내지 약 9% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 20% 내지 약 30% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.025% 내지 약 0.075% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 30% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2% 내지 약 3% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.2% 내지 약 0.6% 범위이고; 발효 고체는 약 20% 내지 약 30% 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 8.5% wt/wt이고; 트레할로스는 약 25% wt/wt이고; BIT는 약 0.05% wt/wt이고; 말토덱스트린은 약 36.3% wt/wt이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2.6% wt/wt이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.4% wt/wt이고; 발효 고체는 약 26.85% wt/wt이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본질적으로 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되며; TVP 또는 TVP-살충 단백질은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되고; Z1은 T이고 TVP는 글리코실화되는, TVP 또는 TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되고; TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되고; TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합; 및 (2) 복수의 부형제로 구성되고; TVP 또는 TVP-살충 단백질은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허 구용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되고; Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되고, X1은 Q이고; Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고; 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고; 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP는 약 2% 내지 약 16% w/w 범위이고; 트레할로스는 약 5% 내지 약 40% w/w 범위이고; BIT는 약 0.01% 내지 약 0.1% w/w 범위이고; 말토덱스트린은 약 10% 내지 약 50% w/w 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 1% 내지 약 5% w/w 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.10% 내지 약 1% w/w 범위이고; 발효 고체는 약 15% 내지 약 40% w/w 범위이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP는 약 7% 내지 약 9% w/w 범위이고; 트레할로스는 약 20% 내지 약 30% w/w 범위이고; BIT는 약 0.025% 내지 약 0.075% w/w 범위이고; 말토덱스트린은 약 30% 내지 약 40% w/w 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2% 내지 약 3% w/w 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.2% 내지 약 0.6% 범위이고; 발효 고체는 약 20% 내지 약 30% 범위이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP는 약 8.5% w/w이고; 트레할로스는 약 25% w/w이고; BIT는 약 0.05% w/w이고; 말토덱스트린은 약 36.3% w/w이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2.6% w/w이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.4% w/w이고; 발효 고체는 약 26.85% w/w이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 본질적으로 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP; 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되며, TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP; 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, 및 복수의 부형제로 구성되고; TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되며; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, 및 복수의 부형제로 구성되고; TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되며; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성되고; Z1이 T인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, 및 복수의 부형제로 구성되고; TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되며; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성되고; X1은 Q이고; Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 TVP, 및 복수의 부형제로 구성되고; TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고; 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되며; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성된다.
임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 본원 및 아래에 기재된 임의의 제형물에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음 제형물: 수화 분말 또는 과립 제형물; 또는 액체 농축물 제형물에서 사용될 수 있다.
본 발명을 사용하는 방법
식물, 식물 부분 및 종자를 보호하는 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 무척추동물 해충 또는 그 환경, 식물 표면 또는 이의 일부를 포함하는 고체 표면을 생물학적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 TVP, 또는 적어도 하나의 TVP를 포함하는 살충 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 농경 및/또는 비농경 적용에서 무척추동물 해충을 제어하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 무척추동물 해충 또는 그 환경, 식물 표면 또는 이의 일부를 포함하는 고체 표면을 생물학적 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 TVP 및 부형제로 구성되는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 농경 및/또는 비농경 적용에서 무척추동물 해충을 제어하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 무척추동물 해충 또는 그 환경, 식물 표면 또는 이의 일부를 포함하는 고체 표면을 생물학적 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 TVP-살충 단백질 및 부형제로 구성되는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 농경 및/또는 비농경 적용에서 무척추동물 해충을 제어하는 방법을 제공한다.
(1) 적어도 하나의 본 발명의 TVP; 본 발명의 2개 이상의 TVP; TVP-살충 단백질; 및/또는 2개 이상의 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 적합한 조성물의 예는 액체 용액, 에멀젼, 분말, 과립, 나노입자, 마이크로입자, 또는 이의 조합의 형태로 전달될 비활성 성분으로 제형화된 상기 조성물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 무척추동물 해충으로부터 농작물을 보호하기 위해 본 발명의 화합물, 혼합물 또는 조성물과의 접촉을 달성하기 위해, 화합물 또는 조성물은 전형적으로 심기 전에 작물의 종자로, 농작물의 관엽(예를 들어, 잎, 줄기, 꽃, 과일)으로 또는 작물을 심기 전이나 후에 토양 또는 기타 성장 매질에 적용된다.
접촉 방법의 한 실시양태는 분무에 의한 것이다. 대안적으로, TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 부형제로 구성되는 과립 조성물이 식물 관엽 또는 토양으로 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 액체 제형물의 토양 관주, 토양으로의 과립 제형물, 육묘장 처리 또는 이식물 침지로서 적용되는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물과 식물을 접촉시킴으로써 식물 흡수를 통해 효과적으로 전달될 수 있다. 토양 관주 액체 제형물 형태의 본 개시내용의 조성물이 주목된다. 또한 무척추동물 해충 또는 그 환경을 생물학적 유효량의 TVP 또는 TVP-살충 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 무척추동물 해충을 제어하는 방법이 주목된다. 일부 예시적인 실시양태에서, 예시적인 방법은 토양 환경을 고려함이 추가로 주목되며, 조성물은 토양 관주 제형물로서 토양에 적용된다. TVP 또는 TVP-살충 단백질이 만연 서식지에 편재된 적용에 의해서도 효과적임이 추가로 주목된다. 다른 접촉 방법은 직접 및 잔류 분무, 공중 분무, 겔, 종자 코팅, 마이크로캡슐화, 전신 흡수, 미끼, 귀 태그, 볼루스, 분무기, 훈증제, 에어로졸, 분진 및 다수의 다른 것들에 의한 본 발명의 화합물 또는 조성물의 적용을 포함한다. 접촉 방법의 한 실시양태는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는 치수적으로 안정한 비료 과립, 스틱 또는 정제이다. 본 발명의 화합물은 또한 무척추동물 제어 장치를 제작하기 위한 물질 내로(예를 들어, 곤충 그물, 의복 상으로의 적용, 양초 제형물 내로의 적용 등) 함침될 수 있다.
일부 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질은 또한 무척추동물 해충으로부터 종자를 보호하기 위한 종자 처리에 유용하다. 본 개시내용 및 청구범위의 맥락에서, 종자를 처리하는 것은 종자를 생물학적 유효량의 TVP 또는 TVP-살충 단백질과 접촉시키는 것을 의미하며, 이는 전형적으로 본 발명의 조성물로서 제형화된다. 이러한 종자 처리는 무척추동물 토양 해충으로부터 종자를 보호하고 일반적으로 발아 종자로부터 발생하는 묘목의 토양과 접촉하는 뿌리 및 기타 식물 부분을 또한 보호할 수 있다. 종자 처리는 또한 발생 식물에서 TVP 또는 TVP 살충 단백질의 전위에 의해 관엽의 보호를 제공할 수 있다. 종자 처리는 특수 형질을 발현하도록 유전적으로 형질전환된 식물이 발아할 종자를 포함하는 모든 유형의 종자에 적용될 수 있다. 또한, TVP 또는 TVP-살충 단백질은 식물 또는 이의 일부, 예를 들어 이미 형질전환된 식물 세포 또는 식물 종자, 예를 들어 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제와 같은 제초제 내성을 발현하는 것들 내로 형질전환될 수 있다.
종자 처리의 한 방법은 종자를 파종하기 전에 TVP 또는 TVP-살충 단백질(즉, TVP 또는 TVP-살충 단백질 및 부형제로 구성되는 제형화된 조성물로서)을 종자에 분무하거나 분무하는 것이다. 종자 처리를 위해 제형화된 조성물은 일반적으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 필름 형성제 또는 접착제로 구성된다. 따라서, 전형적으로 본 개시내용의 종자 코팅 조성물은 생물학적 유효량의 TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 필름 형성제 또는 접착제로 구성된다. 종자는 유동성 현탁 농축물을 종자의 텀블링 베드에 직접 분무한 다음 종자를 건조시켜 코팅될 수 있다. 대안적으로, 수화된 분말, 용액, 유탁액, 유화 농축액 및 수중 에멀젼과 같은 다른 제형물 유형이 종자 상에 분무될 수 있다. 이 공정은 종자 상에 필름 코팅을 적용하는 데 특히 유용하다. 다양한 코팅 기계 및 공정이 당업자에게 이용 가능하다. 적합한 공정은 문헌(P. Kosters et al., Seed Treatment: Progress and Prospects, 1994 BCPC Monograph No. 57), 및 여기에 열거된 참고문헌에 열거된 것들을 포함하며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
처리된 종자는 전형적으로 종자 100 kg당 약 0.01 g 내지 1 kg(즉, 처리 전 종자의 약 0.00001 내지 1중량%) 범위의 양으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질을 포함한다. 종자 처리를 위해 제형화된 유동성 현탁액은 전형적으로 약 0.5 내지 약 70%의 활성 성분, 약 0.5 내지 약 30%의 필름 형성 접착제, 약 0.5 내지 약 20%의 분산제, 0 내지 약 5%의 증점제, 0 내지 약 5%의 안료 및/또는 염료, 0 내지 약 2%의 소포제, 0 내지 약 1%의 보존제, 및 0 내지 약 75%의 휘발성 액체 희석제를 포함한다.
제형물 및 조성물을 사용하는 방법
일부 실시양태에서, 본 발명은 곤충을 제어하기 위해, (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 조성물을 사용하는 방법을 제공하며; TVP는 본원에 기재된 TVP, 예를 들어 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP) 중 하나 또는 임의의 조합으로부터 선택되고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 상기 방법은 조성물을 제조하는 단계, 이어서 상기 조성물을 곤충의 서식지에 적용하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 곤충을 제어하기 위해, (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 조성물을 사용하는 방법을 제공하며; TVP는 본원에 기재된 TVP, 예를 들어 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP) 중 하나 또는 임의의 조합으로부터 선택되고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G;
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 상기 방법은 조성물을 제조하는 단계, 이어서 상기 조성물을 곤충의 서식지에 적용하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 곤충을 제어하기 위해 조성물을 사용하는 방법을 제공하며, 상기 조성물은 (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 (2) 부형제로 구성되고; 곤충은 아케마 스핑크스(Achema Sphinx) 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬(Eumorpha achemon)); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메(Colias eurytheme)); 아몬드나방(카우드라 카우텔라(Caudra cautella)); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나(Amorbia humerosana)); 거염벌레(스포로도프테라(Spodoptera) spp., 예를 들어 엑시구아(exigua), 프루기페르다(frugiperda), 리토랄리스(littoralis), 슈달레티아 유니펑크타(Pseudaletia unipuncta)); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라(Platyptilia carduidactyla)); 진달래애벌레(다타나 메이저(Datana major)); 주머니나방(티리돕테릭스(Thyridopteryx)); 에페메래포르미스(ephemeraeformis)); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아(Hypercompe scribonia)); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스(Erionota thrax)); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나(Acleris gloverana)); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카(Phryganidia californica)); 봄구충(팔레아크리타 메리카타(Paleacrita merriccata)); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디(Grapholita packardi)); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타(Nymphula stagnata)); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스(Xylomyges curialis)); 코들링나방(사이디아 포모넬라(Cydia pomonella)); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이(Acrobasis vaccinii)); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스(Evergestis rimosalis)); 검거세미밤나방(녹투이드(Noctuid) 종, 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타(Orgyia pseudotsugata)); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로(Erinnyis ello)); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria)); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나(Lobesia botrana)); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(Thymelicus lineola(에섹스 스키퍼)); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스(Melissopus latiferreanus); 필버트잎말이나방(아르킵스 로사누스(Archips rosanus); 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아(Archips argyrospilia); 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나(Paralobesia viteana); 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나(Platynota stultana); 포도알락나방(해리시나 아메리카나(Harrisina americana(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라(Plathypena scabra); 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다(Dryocampa rubicunda); 검모소스-바트라케드라(Gummosos-Batrachedra); 코모새(핫지(Hodges)); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르(Lymantria dispar)); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아(Lambdina fiscellaria)); 박각시나방(만두카(Manduca) spp.)); 배추흰나비(피어리스 라패(Pieris rapae)); Io나방(오토메리스 아이오(Automeris io)); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스((Choristoneura pinus)); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나(Epiphyas postvittana)); 멜론웜(디아파니아 히알리나타(Diaphania hyalinata)); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라(Homadaula anisocentra)); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나(Choristoneura rosaceana)); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스(Syntomeida epilais)); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나(Playnota stultana)); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타(Sabulodes aegrotata)); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스(Papilio cresphontes)); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나(Argyrotaenia citrana)); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라(Anarsia lineatella)); 소나무나비(네오파시아 메나피아(Neophasia menapia)); 파드웜(헬리오코베르파 제아(Heliocoverpa zea)); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나(Argyrotaenia velutinana)); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나(Schizura concinna)); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아(Sibine stimulea)); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타(Heterocampa guttivitta)); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아(Estigmene acrea)); 잔디웹웜(크람부스(Crambus) spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria)); 가을철구충(알소필라 포메타리아(Alsophila pometaria)); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana)); 텐트애벌레(다양한 솔나방과(Lasiocampidae)); 테클라-테클라 바실리데스(게이르(Geyr)) 테클라 바실리데스(Thecla basilides)); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타(Manduca sexta)); 담배나방(에페스티아 엘루텔라(Ephestia elutella)); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스(Platynota idaeusalis)); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella)); 점박이야도충(페리드로마 사우시아(Peridroma saucia)); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나(Platynota flavedana)); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스(Anticarsia gemmatalis)); 호두애벌레(다타나 인테게리마(Datana integerrima)); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아(Hyphantria cunea)); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타(Orgyia vetusta)); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스(Diatraea crambidoides)); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스(Listronotus maculicollis)); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아(Maladera castanea)); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스(Rhizotroqus majalis)); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다(Cotinis nitida)); 알풍뎅이(포필리아 자포니카(Popillia japonica)); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가(Phyllophaga) sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스(Cyclocephala borealis)); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis)); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida)); 바구미(쿠르쿨리오노이데아(Curculionoidea)); 이집트숲모기(Aedes aegypti); 브루세올라 푸스카(Busseola fusca); 칠로 서프레살리스(Chilo suppressalis); 컬렉스 피피엔스(Culex pipiens); 컬렉스 퀸퀘파시아투스(Culex quinquefasciatus); 디아브로티카 비르기페라(Diabrotica virgifera); 디아트래아 사카랄리스(Diatraea saccharalis); 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera); 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea); 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens); 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata); 오스트리니아 푸르나칼리스(Ostrinia furnacalis); 오스트리니아 누빌알리스(Ostrinia nubilalis); 펙티노포라 가시피엘라(Pectinophora gossypiella); 플로디아 인터펑크텔라(Plodia interpunctella); 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella); 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens); 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua); 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 스포도프테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis); 트리코플루시아 나이(Trichoplusia ni); 및 잔토갈레루카 루테올라(Xanthogaleruca luteola)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다).
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, TVP는 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공하며, 식물은 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나 ; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택된 곤충으로부터 보호된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 그 게놈에 안정하게 혼입된 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 식물을 곤충에게 제공하는 단계를 포함하는, 곤충을 제어하는 방법을 제공하며, 상기 안정적으로 혼입된 핵산 작제물은 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법의 방법을 제공하며; TVP는 본원에 기재된 TVP, 예를 들어 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP) 중 하나 또는 임의의 조합으로부터 선택되고, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 조성물은 해충의 서식지, 또는 해충에 의한 공격에 민감한 식물 또는 동물에 적용된다.
본원에 기재된 임의의 조성물은 (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법을 제공하며; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 링커를 갖는 TVP로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 링커는 절단가능 링커이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 절단가능 링커를 갖는 TVP로 구성되며, 절단가능 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 링커를 갖는 TVP로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 링커는 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 TVP 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법을 제공하며; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고; X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되며, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 2% 내지 약 16% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 5% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.01% 내지 약 0.1% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 10% 내지 약 50% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 1% 내지 약 5% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.10% 내지 약 1% wt/wt 범위이고; 발효 고체는 약 15% 내지 약 40% wt/wt 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 7% 내지 약 9% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 20% 내지 약 30% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.025% 내지 약 0.075% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 30% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2% 내지 약 3% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.2% 내지 약 0.6% 범위이고; 발효 고체는 약 20% 내지 약 30% 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 8.5% wt/wt이고; 트레할로스는 약 25% wt/wt이고; BIT는 약 0.05% wt/wt이고; 말토덱스트린은 약 36.3% wt/wt이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2.6% wt/wt이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.4% wt/wt이고; 발효 고체는 약 26.85% wt/wt이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본질적으로 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기: 조성물의 총 중량을 기준으로 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량을 기준으로 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 글리신인, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7은 부재하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7은 부재하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 링커는 절단가능 링커인, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 절단가능 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 링커는 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 I]
E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재한다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량을 기준으로 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되고; Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 본원 및 아래에 기재된 임의의 제형물에서 사용될 수 있고, 예를 들어 임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음 제형물: 수화 분말 또는 과립 제형물; 또는 액체 농축물 제형물에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 살충 유효량의 조성물을 해충의 서식지로 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법을 제공하며, 해충은 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법을 제공하며; TVP는 본원에 기재된 TVP, 예를 들어 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP) 중 하나 또는 임의의 조합으로부터 선택되고, 상기 TVP는 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 해충의 서식지, 또는 해충에 의한 공격에 민감한 식물 또는 동물에 적용된다.
본원에 기재된 임의의 조성물은 (1) TVP 또는 TVP-살충 단백질; 및 (2) 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법의 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법을 제공하며; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, Z1은 T이고 TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, X1은 Q이고; Z1은 A이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 임의의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, TVP는 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 갖는 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 링커는 절단가능 링커이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 절단가능 링커를 갖는 TVP로 구성되며, 절단가능 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 링커를 갖는 TVP로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 링커는 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TVP 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어, 또는 억제하는 방법을 제공하며; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되고; Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고, 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 2% 내지 약 16% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 5% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; BIT는 약 0.01% 내지 약 0.1% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 10% 내지 약 50% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 1% 내지 약 5% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.10% 내지 약 1% wt/wt 범위이고; 발효 고체는 약 15% 내지 약 40% wt/wt 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 7% 내지 약 9% wt/wt 범위이고; 트레할로스는 약 20% 내지 약 30% wt/wt범위이고; BIT는 약 0.025% 내지 약 0.075% wt/wt 범위이고; 말토덱스트린은 약 30% 내지 약 40% wt/wt 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2% 내지 약 3% wt/wt 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.2% 내지 약 0.6% 범위이고; 발효 고체는 약 20% 내지 약 30% 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 하나 이상의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP 또는 TVP-살충 단백질은 약 8.5% wt/wt이고; 트레할로스는 약 25% wt/wt이고; BIT는 약 0.05% wt/wt이고; 말토덱스트린은 약 36.3% wt/wt이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)은 약 2.6% wt/wt이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)은 약 0.4% wt/wt이고; 발효 고체는 약 26.85% wt/wt이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본질적으로 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP 또는 TVP-살충 단백질; 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; Z1은 T이고 TVP는 글리코실화되는, TVP 또는 TVP-살충 단백질; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; X1은 Q이고; Z1은 A인, TVP 또는 TVP-살충 단백질; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 서열 번호 17, 54, 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP는 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 링커는 절단가능 링커인, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 절단가능 링커는 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; 링커는 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP 또는 TVP-살충 단백질.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (1) TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 조합 및 (2) 복수의 부형제로 구성되는 살해충 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하고; TVP 또는 TVP-살충 단백질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
[화학식 II]
E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G
(식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이다); 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% wt/wt인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 하기: 조성물의 총 중량의 25% wt/wt인 양의 트레할로스; 0.05% wt/wt인 양의 BIT; 36.3% wt/wt인 양의 말토덱스트린; 2.6% wt/wt인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% wt/wt인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% wt/wt인 양의 발효 고체로 구성되고; Z1이 T 또는 S인 경우, TVP는 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이 폴리펩티드(TVP)를 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이 폴리펩티드(TVP)를 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이 폴리펩티드(TVP)를 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이 폴리펩티드(TVP)를 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이 폴리펩티드(TVP)를 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 살해충 유효량의 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이 폴리펩티드(TVP)를 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.
임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 본원에 기재된 임의의 조성물에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 임의의 상기 TVP, TVP-살충 단백질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 해충을 박멸, 제어 또는 억제하기 위해 및/또는 해충의 서식지에 적용하기 위해 사용될 수 있으며, 해충은 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택된다.
작물 및 해충
이러한 방법으로 제어될 수 있는 특정 작물 해충 및 곤충은 하기: 바퀴목(Dictyoptera)(바퀴); 흰개미목(Isoptera)(흰개미); 메뚜기목(Orthoptera)(메뚜기(locust), 메뚜기(grasshopper) 및 귀뚜라미); 파리목(집파리, 모기, 체체파리, 꾸정모기 및 초파리); 벌목(Hymenoptera)(개미, 말벌, 벌, 톱파리, 맵시벌파리 및 쓸개미말벌); 이아목(Anoplura)(무는이 및 흡혈이); 시포나프테라(Siphonaptera)(벼룩); 및 노린재목(벌레 및 진딧물)뿐만 아니라 진드기(Acari)(진드기 및 응애)와 같은 거미류 및 이러한 각 유기체에 서식하는 기생충을 포함한다.
"해충"은 곤충, 진균, 박테리아, 선충, 응애, 진드기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
곤충 해충은 딱정벌레목, 파리목, 벌목, 나비목, 새털이아목, 매미목, 노린재목, 메뛰기목, 총채벌레목, 집게벌레목, 바퀴목, 이아목, 시포나프테라, 날도래목 등의 목으로부터 선택된 곤충을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 곤충 해충은 딱정벌레목, 나비목 및 파리목을 포함한다.
살충 폴리펩티드를 사용한 처리에 적합한 농업, 가정 및/또는 의학적/수의학적 중요성을 지닌 곤충은 하기 과 및 목의 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
딱정벌레목은 식육아목(Adephaga) 및 풍뎅이아목(Polyphaga)의 아목을 포함한다. 아목 식육아목은 딱정벌레상과(Caraboidea) 및 물맴이상과(Gyrinoidea)의 상위과를 포함한다. 아목 풍뎅이아목은 물땡땡이상과(Hydrophiloidea), 반날개상과(Staphylinoidea), 칸타로이데아(Cantharoidea), 개미붙이상과(Cleroidea), 방아벌레상과(Elateroidea), 다스킬루스상과(Dascilloidea), 드리오포이데아(Dryopoidea), 둥근가시벌레상과(Byrrhoidea), 머리대장상과(Cucujoidea), 가뢰상과(Meloidea), 꽃벼룩과(Mordelloidea), 거저리상과(Tenebrionoidea), 개나무좀상과(Bostrichoidea), 풍뎅이상과(Scarabaeoidea), 하늘소상과(Cerambycoidea), 잎벌레상과(Chrysomeloidea), 및 쿠르쿨리오노이데아(Curculionoidea)의 상과를 포함한다. 상과 딱정벌레상과는 신신델리대(Cicindelidae), 딱정벌레과(Carabidae) 및 물방개과(Dytiscidae)의 과를 포함한다. 상과 물맴이상과는 물맴이과(Gyrinidae)의 과를 포함한다. 상과 물땡땡이상과는 물땡땡이과(Hydrophilidae)의 과를 포함한다. 상과 반날개상과는 송장벌레과(Silphidae) 및 반날개과(Staphylinidae)의 과를 포함한다. 상과 칸타로이데아는 병대벌레과(Cantharidae) 및 반딧불이과(Lampyridae)의 과를 포함한다. 상과 개미붙이상과는 개미붙이과(Cleridae) 및 수시렁이과(Dermestidae)의 과를 포함한다. 상과 방아벌레상과는 방아벌레과(Elateridae) 및 비단벌레과(Buprestidae)의 과를 포함한다. 상과 머리대장상과는 무당벌레과(Coccinellidae)의 과를 포함한다. 상과 가뢰상과는 가뢰과(Meloidae)의 과를 포함한다. 상과 거저리상과는 거저리과(Tenebrionidae)의 과를 포함한다. 상과 풍뎅이상과는 사슴벌레붙이과(Passalidae) 및 풍뎅이과(Scarabaeidae)의 과를 포함한다. 상과 하늘소상과는 하늘소과(Cerambycidae)의 과를 포함한다. 상과 잎벌레상과는 크리소멜리대(Chrysomelidae)의 과를 포함한다. 상과 쿠르쿨리오노이데아(Curculionoidea)는 바구미과(Curculionidae) 및 스코라이티대(Scolytidae)의 과를 포함한다.
딱정벌레목의 예는 미국콩바구미 아칸토셀리데스 오베텍투스(Acanthoscelides obtectus), 잎벌레 아겔라스티카 알니(Agelastica alni), 방아벌레(아그리오테스 리네아투스(Agriotes lineatus), 아그리오테스 옵스쿠러스(Agriotes obscurus), 아그리오테스 바이컬러(Agriotes bicolor)), 곡류딱정벌레 아하스베루스 아드베나(Ahasverus advena), 여름철샤퍼 앰피말론 솔스티티알리스(Amphimallon solstitialis), 가구좀벌레 아노비움 펑크타툼(Anobium punctatum), 안토노무스(Anthonomus) spp.(바구미), 피그미비트딱정벌레 아토마리아 리네아리스(Atomaria linearis), 수시렁이(안트레누스(Anthrenus) spp., 아타게누스(Attagenus) spp.), 녹두딱정벌레 칼로소브루커스 마쿨라테스(Callosobruchus maculates), 튀긴과일딱정벌레 카르포필러스 헤미프테루스(Carpophilus hemipterus), 양배추싹바구미 세우토린쿠스 아시밀리스(Ceutorhynchus assimilis), 유채겨울철줄기바구미 세우토린쿠스 피시타르시스(Ceutorhynchus picitarsis), 방아벌레유충 코노데루스 베스페르티누스(Conoderus vespertinus) 및 코노데루스 팔리(Conoderus falli), 바나나바구미 코스모폴리테스 소르디두스(Cosmopolites sordidus), 뉴질랜드풀유충 코스테라이트라 질랜디카(Costelytra zealandica), 유월딱정벌레 코티니스 니티다(Cotinis nitida), 해바라기줄기바구미 실린드로콥투러스 아드스페르수스(Cylindrocopturus adspersus), 황띠수시렁이 데르메스테스 라르다리우스(Dermestes lardarius), 서부옥수수뿌리벌레 디아브로티카 비르기페라(Diabrotica virgifera), 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera), 및 디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi), 멕시코콩딱정벌레 에피라크나 바리베스티스(Epilachna varivestis), 구축천공충 하일로트로페스 바줄러스(Hylotropes bajulus), 자주개자리바구미 하이페라 포스티카(Hypera postica), 혹딱정벌레 기비움 사일리오데스(Gibbium psylloides), 담배딱정벌레 라시오데르마 세리코르네(Lasioderma serricorne), 콜로라도감자딱정벌레 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata), 릭투스딱정벌레(릭투스(Lyctus) spp.), 꽃가루딱정벌레 멜리게테스 애네우스(Meligethes aeneus), 일반왕풍뎅이 멜로론타 멜로론타(Melolontha melolontha), 미국거미딱정벌레 메지움 아메리카눔(Mezium americanum), 금빛거미딱정벌레 닙투스 홀로레우쿠스(Niptus hololeucus), 곡류딱정벌레 오리재필러스 수리나멘시스(Oryzaephilus surinamensis) 및 오리재필러스 메르카토르(Oryzaephilus mercator), 포도나무바구미 오티오린쿠스 설카투스(Otiorhynchus sulcatus), 겨자딱정벌레 패돈 코클레아리애(Phaedon cochleariae), 십자벼룩잎벌레 필로트레타 크루시페래(Phyllotreta cruciferae), 줄무늬벼룩잎벌레 필로트레타 스트리올라타(Phyllotreta striolata), 양배추김벼룩잎벌레 사일리오데스 크리소세팔라(Psylliodes chrysocephala), 프티누스(Ptinus) spp.(거미딱정벌레), 장두 리조페르타 도미니카(Rhizopertha dominica), 완두 및 콩바구미 시토나 리네아투스(Sitona lineatus), 쌀 및 보리바구미 시토필러스 오리재(Sitophilus oryzae), 및 시토필러스 그라나리에스(Sitophilus granaries), 적색해바라기씨바구미 스미크로닉스 풀부스(Smicronyx fulvus), 창고좀벌레 스테고비움 파니세움(Stegobium paniceum), 황색밀웜딱정벌레 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 쌀도둑거저리 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum) 및 트리볼리움 콘푸섬(Tribolium confusum), 창고 및 캐비넷딱정벌레(트로고데르마(Trogoderma) spp.), 및 해바라기딱정벌레 자이고그라마 엑스클라메이션스(Zygogramma exclamation's)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
집게벌레목(집게벌레)의 예는 양집게벌레 포르피쿨라 아우리쿨라리아(Forficula auricularia), 및 줄무늬집게벌레 라비두라 리파리아(Labidura riparia)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
딕트본테라(Dictvontera)의 예는 진날개바퀴 블라타 오리엔탈리스(Blatta orientalis), 독일바퀴 블라텔라 게르마니카(Blatella germanica), 마데이라바퀴 류코패아 마데래(Leucophaea maderae), 미국바퀴 피페플라네타 아메리카나(Periplaneta americana), 및 먹바퀴 피페플라네타 풀리기노사(Periplaneta fuliginosa)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
노래기강(Diplonoda)의 예는 반점뱀노래기 블라니울러스 구툴라투스(Blaniulus guttulatus), 평평한등받이노래기 브라키데스무스 수페루스(Brachydesmus superus), 및 온실노래기 옥시두스 그라실리스(Oxidus gracilis)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
목 파리목은 긴뿔파리아목(Nematocera), 짧은뿔파리아목(Brachycera) 및 사이클로라파(Cyclorrhapha)의 아목을 포함한다. 아목 긴뿔파리아목은 각다귀과(Tipulidae), 나방파리과(Psychodidae), 모기과(Culicidae), 좀모기과(Ceratopogonidae), 깔다구과(Chironomidae), 먹파리과(Simuliidae), 털파리과(Bibionidae) 및 혹파리과(Cecidomyiidae)의 과를 포함한다. 아목 짧은뿔파리아목은 동애등에과(Stratiomyidae), 등에과(Tabanidae), 테레비대(Therevidae), 파리매과(Asilidae), 마이디대(Mydidae), 재니등에과(Bombyliidae) 및 장다리파리과(Dolichopodidae)의 과를 포함한다. 아목 사이클로라파는 아쉬자(Aschiza) 및 아쉬자(Aschiza)의 문을 포함한다. 문 아쉬자는 벼룩파리과(Phoridae), 꽃등에과(Syrphidae) 및 벌붙이파리과(Conopidae)의 과를 포함한다. 문 아쉬자는 아칼리프트라태(Acalyptratae) 및 유판류아집단(Calyptratae)의 절을 포함한다. 절 아칼리프트라태는 띠날개파리과(Otitidae), 과실파리과(Tephritidae), 배잎굴나방(Agromyzidae) 및 초파리과(Drosophilidae)의 과를 포함한다. 절 유판류아집단은 이파리과(Hippoboscidae), 쇠파리과(Oestridae), 기생파리과(Tachinidae), 꽃파리과(Anthomyiidae), 집파리과(Muscidae), 검정파리과(Calliphoridae) 및 쉬파리과(Sarcophagidae)의 과를 포함한다.
파리목의 예는 집파리(무스카 도메스티카), 아프리카툼부파리(코르딜로비아 안트로포파가(Cordylobia anthropophaga), 등에모기(쿨리코이데스(Culicoides) spp.), 꿀벌이(브루눌라(Braula) spp.), 비트파리 페고마이아 베태(Pegomyia betae), 먹파리(크네필라(Cnephia) spp., 유시물리움(Eusimulium) spp., 시물리움(Simulium) spp.), 말파리(쿠테레브라(Cuterebra) spp., 가스트로필러스(Gastrophilus) spp., 오에스트루스(Oestrus) spp.), 꾸정모기(티풀라(Tipula) spp.), 눈각다귀(히펠라테스(Hippelates) spp.), 쓰레기번식파리(칼리포라(Calliphora) spp., 판니아(Fannia) spp., 헤르메티아(Hermetia) spp., 루실리아(Lucilia) spp., 무스카(Musca) spp., 무시나(Muscina) spp., 패니시아(Phaenicia) spp., 포르미아(Phormia) spp.), 쉬파리(사르코파가(Sarcophaga) spp., 볼프파르티아(Wohlfahrtia) spp.); 플릿파리 오시넬라 프릿(Oscinella frit), 초파리(다쿠스(Dacus) spp., 드로소필라(Drosophila) spp.), 헤드앤드캐논파리(하이드로테아(Hydrotea) spp.), 밀혹파리 마예티올라 데스트럭토르(Mayetiola destructor), 혼앤드버팔로파리(해마토비아(Haematobia) spp.), 등에(크리솝스(Chrysops) spp., 해마토포타(Haematopota) spp., 타바누스(Tabanus) spp.), 양이파리(리포프테나(Lipoptena) spp., 라인키아(Lynchia) spp., 및 슈도라인키아(Pseudolynchia) spp.), 지중해광대파리(세라티투스(Ceratitus) spp.), 모기(애데스(Aedes) spp., 아노펠레스(Anopheles) spp., 컬렉스(Culex) spp., 소로포라(Psorophora) spp.), 나방파리(플레보토무스(Phlebotomus) spp., 룻조마이아(Lutzomyia) spp.), 나선-벌레파리(치소마이아 베지아나(Chtysomya bezziana) 및 코클리오마이아 호미니보락스(Cochliomyia hominivorax)), 날개없는흡혈파리(멜로파거스(Melophagus) spp.); 쇠파리(스토목시스(Stomoxys) spp.), 체체파리(글로시나(Glossina) spp.) 및 쇠파리(하이포데르마(Hypoderma) spp.)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이손테라(Isontera)(흰개미)의 예는 호도텐니티대(Hodotennitidae), 칼로테르미티대(Kalotermitidae), 마스토테르미티대(Mastotermitidae), 리노텐니티대(Rhinotennitidae), 세리테르미티대(Serritermitidae), 테르미티대(Termitidae), 터몹시대(Termopsidae)의 과로부터의 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
헤테로프테라(Heteroptera)의 예는 빈대 시멕스 렉툴라리우스(Cimex lectularius), 별박이노린재 디스데르쿠스 인터메디우스(Dysdercus intermedius), 선햄프해충 유리가스터 인테그리셉스(Eurygaster integriceps), 장님노린재 라이구스 리네올라리스(Lygus lineolaris), 풀색노린재 네자라 안텐나타(Nezara antennata), 남쪽풀색노린재 네자라 비리둘라(Nezara viridula), 및 트리아토미드벌레 판스트로길러스 메기스투스(Panstrogylus megistus), 로드니우스 에쿠아도리엔시스(Rhodnius ecuadoriensis), 로드니우스 팔레스칸스(Rhodnius pallescans), 로드니우스 프롤릭수스(Rhodnius prolixus), 로드니우스 로부스투스(Rhodnius robustus), 트리아토마 디미디아타(Triatoma dimidiata), 트리아토마 인페스탄스(Triatoma infestans), 및 트리아토마 소르디다(Triatoma sordida)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
매미목의 예는 캘리포니아레드스케일(Aonidiella aurantii), 검은콩진딧물 애피스 파배(Aphis fabae), 목화 또는 멜론진딧물 아피스 가시피이(Aphis gossypii), 그린애플진딧물 애피스 포미(Aphis pomi), 감귤류가시가루이 알류로칸투스 스피니페루스(Aleurocanthus spiniferus), 협죽도스케일 아스피디오투스 헤데래(Aspidiotus hederae), 고구마가루이 베메시아 타바시(Bemesia tabaci), 양배추진딧물 브레비코리네 브라시캐(Brevicoryne brassicae), 배나무이 카콥실라 피리콜라(Cacopsylla pyricola), 커런트진딧물 크립토마이주스 리비스(Cryptomyzus ribis), 포도뿌리진디 닥툴로스파이라 비티폴리애(Daktulosphaira vitifoliae), 감귤류나무이 디아포리나 시트리(Diaphorina citri), 감자매미충 엠포아스카 파배(Empoasca fabae), 콩매미충 엠포아스카 솔라나(Empoasca solana), 포도쌍점애매미충 엠포아스카 비티스(Empoasca vitis), 목화진딧물 에리오소마 라니게룸(Eriosoma lanigerum), 유럽과일스케일 율레카니움 코르니(Eulecanium corni), 복숭아가루진딧물 하이알로프테루스 아룬디니스(Hyalopterus arundinis), 애멸구 라오델팍스 스트리아텔루스(Laodelphax striatellus), 감자진딧물 마크로시펌 유포르비애(Macrosiphum euphorbiae), 자두진딧물 마이주스 페르시캐(Myzus persicae), 녹미매미충 메포테틱스 신티셉스(Nephotettix cinticeps), 멸구 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens), 충영-형성진딧물(펨피구스(Pemphigus) spp.), 홉진딧물 포로돈 후물리(Phorodon humuli), 벚나무진딧물 로팔로시펌 파디(Rhopalosiphum padi), 블랙스케일 사이세티아 올레애(Saissetia oleae), 녹색진디 시자피스 그라미눔(Schizaphis graminum), 보리수염진딧물 시토비온 아베내(Sitobion avenae), 및 온실가루이 트리알류로데스 바포라리오룸(Trialeurodes vaporariorum)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이소포다(Isopoda)의 예는 공벌레 아르마딜리디움 불가레(Armadillidium vulgare) 및 유럽쥐며느리 오니스쿠스 아셀루스(Oniscus asellus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
나비목은 호랑나비과(Papilionidae), 흰나비과(Pieridae), 부전나비과(Lycaenidae), 네발나비과(Nymphalidae), 왕나비아과(Danaidae), 뱀눈나비아과(Satyridae), 팔랑나비과(Hesperiidae), 박각시과(Sphingidae), 산누에나방과(Saturniidae), 자나방과(Geometridae), 불나방과(Arctiidae), 밤나방과(Noctuidae), 라이만트리이대(Lymantriidae), 유리나방과(Sesiidae), 및 곡식좀나방과(Tineidae)의 과를 포함한다.
나비목의 예는 아독소파이에스 오라나(Adoxophyes orana)(여름철과일잎말이나방), 아그로티스 입솔론(Agrotis ipsolon)(검거세미밤나방), 아르킵스 포다나(Archips podana)(과일나무잎말이나방), 부쿨라트릭스 피리보렐라(Bucculatrix pyrivorella)(배잎굴나방), 부쿨라트릭스 투르베리엘라(Bucculatrix thurberiella)(목화잎천공충), 부팔루스 피니아리우스(Bupalus piniarius)(소나무자벌레), 카르포캅사 포모넬라(Carpocapsa pomonella)(코들링나방), 칠로 수프레살리스(Chilo suppressalis)(이화명나방), 코리스토뉴라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana)(가문비나무잎말이나방), 코킬리스 호스페스(Cochylis hospes)(줄무늬해바라기나방), 디아트래아 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)(남서부옥수수천공충), 얼스 인술라나(Earls insulana)(이집트볼웜), 유페스티아 쿠에니엘라(Euphestia kuehniella)(지중해밀가루나방), 유로에실리아 암비구엘라(Eupoecilia ambiguella)(유럽포도베리나방), 유프록티스 크리소로에아(Euproctis chrysorrhoea)(갈색꼬리나방), 유프록티스 서브플라바(Euproctis subflava)(오리엔탈터삭나방), 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella)(꿀벌부채명나방), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)(왕담배나방), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)(왕담배나방), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)(왕담배나방), 호프만노필라 슈도프레텔라(Hofmannophila pseudopretella)(갈색집나방), 호메오소마 엘렉텔룸(Homeosoma electellum)(해바라기나방), 호모나 마그나니마(Homona magnanima)(오리엔탈티트리잎말이나방), 리토콜레티스 블란카르델라(Lithocolletis blancardella)(점박이가는나방), 라이만트리아 디스파르(Lymantria dispar)(매미나방), 말라코소마 뉴스트리아(Malacosoma neustria)(텐트애벌레), 마메스트라 브라시캐(Mamestra brassicae)(양배추밤나방), 마메스트라 콘피구라타(Mamestra configurata)(버서밤나방), 박각시나방 만두카 섹스타(Manduca sexta) 및 마누두카 퀸퀘마쿨라타(Manuduca quinquemaculata), 오페로프테라 브루마타(Operophtera brumata)(겨울나방), 오스트리니아 누빌알리스(Ostrinia nubilalis)(조명충나방), 파놀리스 플람메아(Panolis flammea)(소나무밤나비), 펙티노포라 가시피엘라(Pectinophora gossypiella)(솜패나방), 필록니스티스 시트렐라(Phyllocnistis citrella)(귤굴나방), 피어리스 브라시캐(Pieris brassicae)(배추흰나비), 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella)(배추좀나방), 라키플루시아 니(Rachiplusia ni)(콩자벌레), 스필로소마 비르지니카(Spilosoma virginica)(노랑곰나방), 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)(파밤나방), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(가을철거염벌레), 스포도프테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis)(목화잎벌레), 스포도프테라 리투라(Spodoptera litura)(일반뿌리벌레), 스포도프테라 프래피카(Spodoptera praefica)(노랑줄무늬밤나방), 사일렙타 데로가타(Sylepta derogata)(목화잎말이나방), 티네올라 비셀리엘라(Tineola bisselliella)(웨빙옷좀나방), 티네올라 펠리오넬라(Tineola pellionella)(옷좀나방), 토르트릭스 비리다나(Tortrix viridana)(유럽참나무잎말이나방), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(은무늬나방), 및 이포노메우타 파델라(Yponomeuta padella)(버드체리어민)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
메뚜기목의 예는 일반메뚜기 아케타 도메스티쿠스(Acheta domesticus), 트리로커스트(아나크리디움(Anacridium) spp.), 풀무치 로커스타 마이그라토리아(Locusta migratoria), 두줄무늬메뚜기 멜라노플러스 비비타투스(Melanoplus bivittatus), 빗살무늬미국메뚜기 멜라노플러스 디퍼렌티알리스(Melanoplus dfferentialis), 붉은다리메뚜기 멜라노플러스 페무루브룸(Melanoplus femurrubrum), 풀무치 멜라노플러스 생귀니페스(Melanoplus sanguinipes), 북부땅강아지 네오쿠르틸라 헥사덱틸라(Neocurtilla hexadectyla), 홍날개메뚜기 노마다크리스 셉템파시아타(Nomadacris septemfasciata), 짧은날개땅강아지 스캅테리스쿠스 아브레비아투스(Scapteriscus abbreviatus), 남부땅강아지 스캅테리스쿠스 보렐리이(Scapteriscus borellii), 황갈색땅강아지 스캅테리스쿠스 비시누스(Scapteriscus vicinus), 및 사막메뚜기 스키스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이목(Phthiraptera)의 예는 소새털이 보비콜라 보비스(Bovicola bovis), 새털이(다말리니아(Damalinia) spp.), 고양이이 펠리콜라 서브로스트라타(Felicola subrostrata), 짧은코소이 해마토피누스 엘로이스테르누스(Haematopinus eloysternus), 테일-스위치이 해마토피누스 콰드리페리우서스(Haematopinus quadriperiussus), 돼지이 해마토피누스 수이스(Haematopinus suis), 얼굴이 리노그나투스 오빌루스(Linognathus ovillus), 발이 리노그나투스 페달리스(Linognathus pedalis), 개흡혈이 리노그나투스 세토수스(Linognathus setosus), 긴코소이 리노그나투스 비툴리(Linognathus vituli), 큰참닭털이 메나칸투스 스트라미네우스(Menacanthus stramineus), 가금깃대이 메노폰 갈리내(Menopon gallinae), 인체이 페디쿨러스 휴마누스(Pediculus humanus), 사면발이 프티루스 푸비스(Phthirus pubis), 리틀블루소이 솔레노포테스 카필라투스(Solenopotes capillatus), 및 개털이 트리코덱테스 카니스(Trichodectes canis)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다듬이벌레목(Psocoptera)의 예는 다듬에벌레 리포셀리스 보스트리코필라(Liposcelis bostrychophila), 리포셀리스 데콜라(Liposcelis decolor), 리포셀리스 엔토모필라(Liposcelis entomophila), 및 트로기움 펄사토리움(Trogium pulsatorium)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 시포나프테라의 예는 새벼룩 세라토필러스 갈리내(Ceratophyllus gallinae), 개벼룩 크테노세팔리데스 카니스(Ctenocephalides canis), 고양이벼룩 크테노세팔리데스 펠스(Ctenocephalides fells), 인간벼룩 풀렉스 이리탄스(Pulex irritans), 및 오리엔탈쥐벼룩 제놉실라 체오피스(Xenopsylla cheopis)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
결합강(Symphyla)의 예는 정원심필라 스쿠티게렐라 임마쿨라테(Scutigerella immaculate)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
좀목(Thysanura)의 예는 양좀 크테노레피스마 롱기카우다타(Ctenolepisma longicaudata), 네줄양좀 크테노레피스마 콰드리세리아타(Ctenolepisma), 양좀 레피스마 사카리나(Lepisma saccharina), 및 얼룩좀 텐노비아 도메스티카(Thennobia domestica)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다;
총채벌레목의 예는 담배총채벌레 프랭클리니엘라 푸스카(Frankliniella fusca), 꽃총채벌레, 프랭클리니엘라 인톤사(Frankliniella intonsa), 서부꽃총채벌레 프랭클리니엘라 옥시덴탈리스(Frankliniella occidentalis), 목화싹꽃총채벌레 프랭클리니엘라 슐체이(Frankliniella schultzei), 고사리그물총채벌레 헤르시노트립스 페모랄리스(Hercinothrips femoralis), 대두총채벌레 네오하이다토트립스 바리아빌리스(Neohydatothrips variabilis), 켈리감귤류총채벌레 페조트립스 켈리아누스(Pezothrips kellyanus), 아보카도총채벌레 셔르토트립스 페르세애(Scirtothrips perseae), 멜론총채벌레 트립스 팔미(Thrips palmi), 및 양파총채벌레 트립스 타바시(Thrips tabaci)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선충의 예는 헤테로데라(Heterodera) spp., 멜로이도자이네(Meloidogyne) spp. 및 글로보데라(Globodera) spp.을 포함하는 뿌리혹, 낭종, 및 병변 선충과 같은 기생 선충; 특히 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)(대두낭종선충); 헤테로데라 샤크티이(Heterodera schachtii)(비트낭종선충); 헤테로데라 아베내(Heterodera avenae)(곡물낭종선충); 및 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis) 및 글로보데라 파일리다(Globodera pailida)(감자낭종선충)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 낭종 선충의 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 병변 선충은 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) spp.을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 TVP에 민감한 다른 곤충 종은 공중 및 동물 건강 문제를 유발하는 절지동물 해충, 예를 들어 모기, 예를 들어 애데스, 아노펠레스 및 컬렉스 속의 모기, 진드기, 벼룩 및 파리 등을 포함한다.
한 실시양태에서, TVP 또는 TVP-살충 단백질, 및 부형제로 구성되는 살충 조성물은 외부기생충을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 외부기생충은 벼룩, 진드기, 옴, 응애, 모기, 성가신무는파리, 이, 및 상기 외부기생충 중 하나 이상을 포함하는 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "벼룩"은 벼룩목의 기생벼룩의 일반 또는 부대 종, 특히 크테노세팔리데스(Ctenocephalides)의 종, 특히 크테노세팔리데스 펠스(C. fells) 및 크테노세팔리데스 캄스(C.cams), 쥐벼룩(제놉실라 케오피스(Xenopsylla cheopis)) 및 인간벼룩(풀렉스 이리탄스(Pulex irritans))을 포함한다.
주요 작물에 대한 본 발명의 곤충 해충은 옥수수: 오스티리니아 누빌알리스, 조명충나방; 아그로티스 입실론, 검거세미밤나방; 헬리코베르파 제아, 왕담배나방; 스포도프테라 프루기페르다, 가을철거염벌레; 디아트래아 그란디오셀라, 남서부옥수수천공충; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus), 레서옥수수줄기천공충; 디아트래아 사카랄리스, 사탕수수천공충; 디아브로티카 비르기페라, 서부옥수수뿌리벌레; 디아브로티카 롱기코르니스 바베리(Diabrotica longicornis barberi), 북부옥수수뿌리벌레; 디아브로티카 운데심펑크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi), 남부옥수수뿌리벌레; 멜라노투스(Melanotus spp.), 방아벌레유충; 사이클로세팔라 보레알리스, 북부마스크드풍뎅이(흰색유충); 사이클로세팔라 임마쿨라타, 남부마스크드풍뎅이(흰색유충); 포필리아 자포니카, 알풍뎅이; 캐톡네마 풀리카리아(Chaetocnema pulicaria), 옆두옥수수뿌리잎벌레; 스페노포러스 마이디스(Sphenophorus maidis), 옥수수바구미; 로팔리시펌 마이디스(Rhopalosiphum maidis), 옥수수잎진딧물; 아누라피스 마이디라디시스(Anuraphis maidiradicis), 옥수수뿌리진딧물; 블리서스 류콥테루스 류콥테루스(Blissus leucopterus leucopterus), 긴노린재; 멜라노플러스 페무루브룸, 붉은다리메뚜기; 멜라노플러스 생귀니페스, 풀무치; 하일레마이아 플라투라(Hylemya platura), 옥수수씨구더기; 아그로마이자 파르비코르니스(Agromyza parvicornis), 옥수수블롯잎벌레; 아나포트립스 옵스크루러스(Anaphothrips obscrurus), 풀총채벌레; 솔레놉시스 밀레스타(Solenopsis milesta), 도둑개미; 테트라나이쿠스 우르티캐(Tetranychus urticae), 2점응애; 수수: 칠로 파르텔루스(Chilo partellus), 수수천공충; 스포도프테라 프루기페르다, 가을철거염벌레; 헬리코베르파 제아, 왕담배나방; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 레서옥수수줄기천공충; 펠티아 서브테라네아(Feltia subterranea), 입상물컷웜; 필로파가 크리니타(Phyllophaga crinita), 흰색유충; 엘레오데스(Eleodes), 코노데루스(Conoderus), 및 애올루스(Aeolus) spp., 방아벌레유충; 아울레마 멜라노푸스(Oulema melanopus), 노란다리긴가슴잎벌레; 캐톡네마 풀리카리아, 옆두옥수수뿌리잎벌레; 스페노포러스 마이디스, 옥수수바구미; 로팔리시펌 마이디스, 옥수수잎진딧물; 시파 플라바(Sipha flava), 노란색사탕수수진딧물; 블리서스 류콥테루스 류콥테루스, 긴노린재; 콘타리니아 소르기콜라(Contarinia sorghicola), 수수깔따구; 테트라나이쿠스 신나바리누스(Tetranychus cinnabarinus), 진홍색응애; 테트라나이쿠스 우르티캐, 2점응애; 밀: 슈달레티아 유니펑크타타(Pseudaletia unipunctata), 거염벌레; 스포도프테라 프루기페르다, 가을철거염벌레; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 레서옥수수줄기천공충; 아그로티스 오르소고니아(Agrotis orthogonia), 서부 컷웜; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 레서옥수수줄기천공충; 아울레마 멜라노푸스, 노란다리긴가슴잎벌레; 하이페라 펑크타타, 클로버잎바구미; 디아브로티카 운데심펑크타타 호와르디, 남부옥수수뿌리벌레; 러시아밀진드기; 시자피스 그라미눔, 녹색진디; 마크로시펌 아베내(Macrosiphum avenae), 보리수염진딧물; 멜라노플러스 페무루브룸, 붉은다리메뚜기; 멜라노플러스 디퍼렌티알리스(Melanoplus differentialis), 빗살무늬미국메뚜기; 멜라노플러스 생귀니페스, 풀무치; 마예티올라 데스트럭토르(Mayetiola destructor), 밀혹파리; 시토디플로시스 모셀라나(Sitodiplosis mosellana), 밀각다귀; 메로마이자 아메리카나(Meromyza americana), 밀줄기구더기; 하일레미아 코아크타타(Hylemya coarctata), 소맥구근파리; 프랭클리니엘라 푸스카, 담배총채벌레; 세푸스 신크투스(Cephus cinctus), 밀줄기잎벌; 아세리아 툴리패(Aceria tulipae), 밀오갈응애; 해바라기: 술레이마 헬리안타나(Suleima helianthana), 해바라기싹나방; 호모에오소마 엘렉텔룸(Homoeosoma electellum), 해바라기나방; 자이고그람마 엑스클라마티오니스(Zygogramma exclamationis), 해바라기딱정벌레; 보티루스 기보수스(Bothyrus gibbosus), 당근딱정벌레; 네오라시오프테라 무르트펠티아나(Neolasioptera murtfeldtiana), 해바라기씨각다귀; 목화: 헬리오티스 비레센스, 왕담배나방; 헬리코베르파 제아, 왕담배나방; 스포도프테라 엑시구아, 파밤나방; 펙티노포라 가시피엘라, 솜패나방; 안토노무스 그란디스, 목화바구미; 아피스 가시피이, 목화진딧물; 슈다토모셀리스 세리아투스(Pseudatomoscelis seriatus), 목화벼룩잎벌레; 트리알류로데스 아부틸로네아(Trialeurodes abutilonea), 구부러진날개가루이; 라이구스 리네올라리스, 장님노린재; 멜라노플러스 페무루브룸, 붉은다리메뚜기; 멜라노플러스 디퍼렌티알리스, 빗살무늬미국메뚜기; 트립스 타바시, 양파총채벌레; 프란클린키엘라 푸스카, 담배총채벌레; 테트라나이쿠스 신나바리누스, 진홍색응애; 테트라나이쿠스 우르티캐, 2점응애; 쌀: 디아트래아 사카랄리스, 사탕수수천공충; 스포도프테라 프루기페르다, 가을철거염벌레; 헬리코베르파 제아, 왕담배나방; 콜라스피스 브룬네아(Colaspis brunnea), 포도콜라스피스; 리소롭트루스 오리조필러스(Lissorhoptrus oryzophilus), 미음바구미; 시토필러스 오리재, 쌀바구미; 네포테틱스 니그로픽투스(Nephotettix nigropictus), 쌀매미충; 블리서스 류콥테루스(Blissus leucopterus), 긴노린재; 아크로스테르눔 힐라레, 녹색노린재; 대두: 슈도플루시아 인클루덴스, 대두자벌레; 안티카르시아 젬마탈리스, 벨벳콩애벌레; 플라티페나 스카브라, 녹색클로버벌레; 오스트리니아 누빌알리스, 조명충나방; 아그로티스 입실론, 검거세미밤나방; 스포도프테라 엑시구아, 파밤나방; 헬리오티스 비레센스, 왕담배나방; 헬리코베르파 제아, 왕담배나방; 에피라크나 바리베스티스, 멕시코콩딱정벌레; 마이주스 페르시캐, 자두진딧물; 엠포아스카 파배, 감자매미충; 아크로스테르눔 힐라레, 녹색노린재; 멜라노플러스 페무루브룸, 붉은다리메뚜기; 멜라노플러스 디퍼렌티알리스, 빗살무늬미국메뚜기; 하일레마이아 플라투라, 옥수수씨구더기; 세리코트립스 바리아빌리스(Sericothrips variabilis), 대두총채벌레; 트립스 타바시, 양파총채벌레; 테트라나이쿠스 투르케스타니(Tetranychus turkestani), 딸기응애; 테트라나이쿠스 우르티캐, 2점응애; 보리: 오스트리니아 누빌알리스, 조명충나방; 아그로티스 입실론, 검거세미밤나방; 시자피스 그라미눔, 녹색진디; 블리서스 류콥테루스 류콥테루스, 긴노린재; 아크로스테르눔 힐라레, 녹색노린재; 유스키스투스 세르부스(Euschistus servus), 갈색노린재; 델리아 플라투라(Delia platura), 옥수수씨구더기; 마예티올라 데스트럭토르, 밀혹파리; 페트로비아 라텐스(Petrobia latens), 보리응애; 오일 종자 유채: 브레비코리네 브라시캐, 양배추진딧물; 필로트레타 크루시패래, 줄무늬벼룩잎벌레; 마메스트라 콘피구라타, 버서밤나방; 플루텔라 자일로스텔라, 배추좀나방; 델리아(Delia) ssp., 뿌리구더기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 살충 조성물은 상기 곤충 중 하나 이상을 포함하는 조합을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 민감한 곤충은 하기: 바퀴목(Blattaria ), 딱정벌레목, 톡토기목(Collembola), 파리목(Diptera), 극구흡충목(Echinostomida), 노린재목, 벌목, 바퀴목, 나비목, 풀잠자리목(Neuroptera), 메뚜기목, 원충목(Rhabditida), 벼룩목(Siphonoptera), 총채벌레목과 같은 과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
속-종은 하기와 같이 표시된다: 악테비아-펜니카(Actebia - fennica), 아그로티스-입실론(Agrotis-ipsilon), 아그로티스-세게툼(A.- segetum), 안티카르시아-젬마탈리스(Anticarsia-gemmatalis), 아르자이로태니아-시트라나(Argyrotaenia -citrana), 아르토게이아-라패(Artogeia - rapae), 봄빅스-모리(Bombyx - mori), 부세올라-푸스카(Busseola-fusca), 카시레우스-마샬(Cacyreus -marshall), 칠로-서프레살리스(Chilo-suppressalis), 크리스토뉴라-푸미페라나(Christoneura-fumiferana), 크리스토뉴라-옥시덴탈리스(C.-occidentalis), 크리스토뉴라-피누스 피누스(C.-pinus pinus), 크리스토뉴라-로사세나(C.-rosacena), 크나팔로크로시스-메디날리스(Cnaphalocrocis-medinalis), 코노포모르파-크라메렐라(Conopomorpha-cramerella), 크테놉수에스티스-오블리콰나(Ctenopsuestis - obliquana), 사이디아-포모넬라(Cydia-pomonella), 다나우스-플렉시푸스(Danaus-plexippus), 디아트래아-사카랄리스(Diatraea-saccharallis), 디아트래아-그란디오셀라(D.-grandiosella), 에아리아스-비텔라(Earias-vittella), 엘라스몰팔푸스-리그노셀리우스(Elasmolpalpus-lignoselius), 엘다나-사카리나(Eldana-saccharina), 에페스티아-쿠에니엘라(Ephestia-kuehniella), 에피노티아-아포레마(Epinotia - aporema), 에피파이아스-포스비타나(Epiphyas-postvittana), 갈레리아-멜로넬라(Galleria -mellonella), 종-속, 헬리코베르파-제아(Helicoverpa - zea), 헬리코베르파-펑크티게라(H.-punctigera), 헬리코베르파-아르미게라(H.-armigera), 헬리오티스-비레센스(Heliothis-virescens), 하이판트리아-쿠네아(Hyphantria-cunea), 람브디나-피셀라리아(Lambdina-fiscellaria), 레구미니보라-글리시니보렐라(Leguminivora-glycinivorella), 로베시아-보트라나(Lobesia-botrana), 라이만트리아-디스파(Lymantria-dispar), 말라코소마-디스트리아(Malacosoma - disstria), 마메스트라-브라시캐(Mamestra-brassicae), 마메스트라-콘피구라타(M. configurata), 만두카-섹스타(Manduca-sexta), 마라스미아-파트날리스(Marasmia - patnalis), 마루카-비트라타(Maruca-vitrata), 오르가이아-류코스티그마(Orgyia-leucostigma), 오스트리니아-누빌알리스(Ostrinia-nubilalis), 오스트리니아-푸르나칼리스(O.-furnacalis), 판데미스-파이루사나(Pandemis-pyrusana), 펙티노포라-가시피엘라(Pectinophora-gossypiella), 페리류코프테라-커피엘라(Perileucoptera-coffeella), 프토리매아-오페르쿨렐라(Phthorimaea-opercullela), 피아노토르트릭스-옥토(Pianotortrix -octo), 피아타이노타-스툴타나(Piatynota - stultana), 피에리스-브라시캐(Pieris- brassicae), 플로디아-인터펑크탈라(Plodia - interpunctala), 플루텔라-자일로스텔라(Plutella-xylostella), 슈도플러시아-인클루덴스(Pseudoplusia-includens), 라키플러시아-누(Rachiplusia-nu), 시로포파가-인세르툴라스(Sciropophaga-incertulas), 세사미아-칼라미스티스(Sesamia-calamistis), 스필로소마-비르기니카(Spilosoma-virginica), 스포도프테라-엑시구아(Spodoptera-exigua), 스포도프테라-프루기페르다(S.-frugiperda), 스포도프테라-리토랄리스(S.- littoralis), 스포도프테라-엑셈프타(S.-exempta), 스포도프테라-리투라(S.- litura), 테시아-솔라니보라(Tecia-solanivora), 타우메토포에아-피타이오캄파(Thaumetopoea - pityocampa), 트리코플루시아-니(Trichoplusia-ni), 위세아나-세르비나타(Wiseana-cervinata), 위세아나-코풀라리스(Wiseana-copularis), 위세아나-조코사(Wiseana-jocosa), 블라타리아-블라텔라(Blattaria-Blattella), 콜렘볼라-제나일라(Collembola-Xenylla), 콜렘볼라-폴소미아(C.-Folsomia), 에키노스토미다-파시올라(Echinostomida-Fasciola), 헤미프테라-온코펠트루스(Hemiptera - Oncopeltrus), 헤미프테라-베미시아(He.-Bemisia), 헤미프테라-마크로시펌(He.- Macrosiphum), 헤미프테라-로팔로시펌(He.-Rhopalosiphum), 헤미프테라-마이주스(He.- Myzus), 하이메노프테라-디프리온(Hymenoptera-Diprion), 하이메노프테라-아피스(Hy.-Apis), 하이메노프테라-마크로센트루스(Hy.-Macrocentrus), 하이메노프테라-메테오루스(Hy.-Meteorus), 하이메노프테라-나소니아(Hy.-Nasonia), 하이메노프테라-솔레놉시스(Hy.-Solenopsis), 이소포다-포르셀리오(Isopoda-Porcellio), 이소프테라-레티쿨리테르메스(Isoptera-Reticulitermes), 오르소프테라-아크타(Orthoptera- Achta), 프로스티그마타-테트라나이커스(Prostigmata - Tetranychus), 라비티다-아크로벨로이데스(Rhabitida-Acrobeloides), 라비티다-캐노랍디티스(R.-Caenorhabditis), 라비티다-디스톨아브렐루스(R.-Distolabrellus), 라비티다-파나그렐루스(R.-Panagrellus), 라비티다-프리스티온쿠스(R.-Pristionchus), 라비티다-프라틸렌쿠스(R.-Pratylenchus), 라비티다-안사일로스토마(R.-Ancylostoma), 라비티다-니포스트롱길러스(R.-Nippostrongylus), 라비티다-파나그렐러스(R.-Panagrellus), 라비티다-해몬쿠스(R.-Haemonchus), 라비티다-멜로이도자이네(R.-Meloidogyne), 및 시포나프테라-크테노세팔리데스(Siphonaptera-Ctenocephalides).
본 개시내용은 단자엽 및 쌍자엽을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있는 식물 형질전환 방법을 제공한다. 트랜스제닉 접근 또는 식물 혼입 보호제(PIP)가 특히 유용한 접근일 작물은 알팔파, 목화, 토마토, 옥수수(maize), 밀, 옥수수(corn), 단옥수수, 자주개자리, 대두, 수수, 완두, 아마씨, 홍화, 평지씨, 오일 종자 평지, 쌀, 대두, 보리, 해바라기, 나무(침엽수 및 낙엽수 포함), 꽃(상업적으로 및 온실에서 재배되는 것들 포함), 필드 루핀, 스위치그래스, 사탕수수, 감자, 토마토, 담배, 십자화과 식물, 고추, 사탕무, 보리, 및 오일 종자 평지, 브라시카 sp., 호밀, 기장, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤류 나무, 코코아, 차 식물, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 귀리, 야채, 관상식물 및 침엽수를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 자벌레; 잡식성입말이나방; 박각시나방; 배추흰나비; 배추좀나방; 녹색클로버벌레; 미국흰불나방; 염습지애벌레; 거염벌레; 검거세미밤나방; 십자배추벌레; 파드나방; 벨벳콩애벌레; 대두자벌레; 왕담배나방; 점박이야도충; 멜론웜(Melonworms); 린드웜컴플렉스; 과일나무잎말이나방; 감귤류컷웜; 헬리오티스(Heliothis); 왕호랑나비; 감귤류컷웜; 레드험프드애벌레(Redhumped Caterpillar); 텐트애벌레; 미국흰불나방; 호두애벌레; 구충; 매미나방; 점박이잎말이나방; 빨간줄잎말이나방; 술모양사과싹나방; 복숭아순나방; 개암나무잎말이나방; 사선밴드형잎말이나방; 코들링나방; 비단벌레; 포도알락나방; 포도잎말이나방; 아케마 스핑크스 나방(박각시나방); 오렌지잎말이나방; 왕담배나방; 포도베리나방; 느릅나무스팬웜; 알팔파바구미; 왕담배나방; 헤드 나방; 아모르비아(Amorbia) 나방; 잡식성자벌레; 엘로나방(박각시나방); Io 나방; 협죽도호크나방; 진달래애벌레; 박각시나방; 잎말이나방; 바나나스키퍼; 바트라체드라 코모새(Batrachedra comosae)(홋지); 테클라나방; 아티초크관모나방; 작은멋쟁이나비; 주머니나방; 봄가을철구충; 느릅나무스팬웜; 캘리포니아오크웜; 소나무나비; 가문비나무잎말이나방; 새들프로미넌트애벌레; 미송터삭나방; 서부터삭나방; 블랙헤드버드웜; 미모사웹웜; 잭소나무버드웜; 말안장등애벌레; 로지메이플나방; 또는 햄록루퍼로 구성되는 군으로부터 선택된 곤충 및/또는 해충의 서식지에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택되는 곤충 및/또는 해충의 서식지에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 밤색우산풍뎅이(말라데라 카스타네아(Maladera castanea)); 금색참나무천공충(아그릴러스 콕살리스 오우로구타투스(Agrilus coxalis auroguttatus)); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다(Cotinis nitida)); 알풍뎅이(포필리아 자포니카(Popillia japonica)); 오월 또는 유월풍뎅이류(필로파가(Phyllophaga) sp.); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis)); 및 솝베리천공충(아그릴러스 프리오누러스(Agrilus prionurus))으로 구성되는 군으로부터 선택되는 성체 딱정벌레의 서식지에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우산풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 및 바구미(쿠르쿨리오노이데아)로 구성되는 군으로부터 선택된 유충(일년생 흰유충)인 곤충 및/또는 해충의 서식지에 적용될 수 있다.
실시예
본 명세서의 실시예는 본 발명을 제한하려는 의도가 아니며 이렇게 사용되어서도 안 된다; 이들은 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공된다.
실시예 1: TVP 발현 벡터의 생성
다양한 TVP의 DNA 작제물을 코돈 최적화하고 클루이베로마이세스 락티스 알파 교배 인자 프리/프로 서열(αMF)과의 융합체로 합성하고 pKlac1(New England Biolabs)의 NotI 및 HindIII 제한 부위 내로 결찰했다. 벡터를 SacII로 소화시켜 선형화하고 박테리아 Ori 및 선택 마커를 제거한 다음 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 세포로 전기천공했다. 단일 질소원으로서 아세트아미드를 포함하는 선택 플레이트 상에서 다중 유전자 카피 형질전환체를 선택했다. TVP를 발현하는 클론을 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 100 mm)에서 HPLC로 평가하고 2 mL 분-1의 유속 및 8분에 걸쳐 15-33% 아세토니트릴의 구배로 용출했다. 도 1.
실시예 2: TVP의 소화 및 염기성 아미노산의 알라닌 스캔
나비목 장 프로테아제에 노출될 때 TVP의 안정성을 결정한다. 간략하게, 5령 만두카 섹스타를 장 내용물이 튜브에 수집될 수 있도록 장 내벽에 작은 절개를 가하여 해부했다. 여러 해부체를 풀링하여 즉시 사용하기 위해 얼음 상에 유지하거나 향후 사용하기 위해 -80℃에 보관했다. 단리된 중장(이하 만두카 장 추출물 또는 MGE로 지칭함)을 소화 검정을 위해 사용했다. 다음으로, 1 mg/mL TVP를 0.1 mg/mL 소 트립신 또는 50 mM 트리스-HCl, pH 8.8로 1/10 희석된 MGE와 인큐베이션하여 알칼리성 pH를 유지했다. 시점을 취해 200 mM HCl을 첨가하여 소화물을 켄칭했다. 분해를 HPLC 분석에 의해 정량하고 속도를 단일 지수 붕괴에 대한 적합도에 의해 결정했다.
나비목 장은 Arg 또는 Lys 아미노산 뒤를 절단하는 트립신 유사 프로테아제를 포함한다; 임의의 특정 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 이러한 아미노산을 알라닌으로 단일 돌연변이시키면 나비목 장에서 분해를 유발하는 부위(들)를 확인할 수 있다고 가정했다. 상기 가설을 시험하기 위해, 야생형 Ta1b 아미노산 서열에 존재하는 각각의 염기성 아미노산을 알라닌으로 개별적으로 돌연변이시킴으로써 TVP를 생성했다. 다음으로, 이들 TVP 각각의 안정성을 위에서 기재된 바와 같은 소화 조건에 TVP를 대면시켜 평가했다. 이 실험 결과, 아미노산 위치 9의 아르기닌의 알라닌(R9A)으로의 치환은 트립신 소화를 완전히 폐지하는 반면, K18A 및 R38A의 치환은 소화율이 현저하게 감소하기는 하지만 중등도 폐지를 나타냄이 밝혀졌다. 따라서, R9A 및 R38A를 MGE 검정에서 나비목 장 프로테아제에 대한 안정성에 대해 추가 평가했으며, 돌연변이는 Ta1b를 각각 247배 및 8.6배 안정화하는 것이 발견되었다. 표 3을 참고한다.
염기성 아미노산 알라닌 스캔 소화 분석.
반감기(분)
돌연변이체 소 트립신 만두카
장 추출물
(MGE) 		변화 배율
(트립신) 		변화 배율
(MGE)
WT Ta1b 288 1.5 -- --
R7A 132 시험되지 않음 0.5 시험되지 않음
R9A >6000 370 >20 247
K13A 294 시험되지 않음 1.0 시험되지 않음
K18A 1194 시험되지 않음 4.1 시험되지 않음
R38A 1860 19 6.5 8.6
실시예 3: 곤충 장 프로테아제에 내성인 서열에 대한 조합 펩티드 스크리닝
나비목 장 프로테아제의 존재 하에 소화를 감소시킬 수 있는 위치를 확인하기 위한 FRET 기반 펩티드 라이브러리 스크리닝. FRET 분석은 상업적으로 이용 가능한 FRET 키트(Cat. 번호 PSREPLI005, Mimotopes, Victoria, Australia)를 사용하여 수행했다. FRET 분석은 하기와 같다: FRET 분자(염료 및 켄칭제)에 커플링된 펩티드 라이브러리를 곤충 장 환경 또는 시뮬레이션된 인간 위장관 환경에서 절단하는 펩티드의 확인을 위한 리포터 검정으로 사용했다. 간략하게, FRET 키에는 염료 또는 켄칭제에 부착된 일련의 글리신 아미노산으로 묶인 3개의 가변 아미노산 서열 스트레치가 있는 FRET 분자 풀을 포함한다. 각 FRET 분자는 가변 영역이 절단되지 않으면 신호를 제공하지 않지만, 분자가 절단되면 여기될 수 있다. 절단이 일어나는 속도(즉, 프로테아제에 대한 서열의 특이성)는 경시적으로 형광 신호가 발생하는 속도(즉, 기울기)에 의해 순위를 매길 수 있다.
사용된 FRET 키트는 풀당 최대 8개의 서로 다른 FRET 분자의 512개 풀을 포함한다. FRET 반응은 다중채널 로딩 피펫을 사용하여 풀링된 물질 플레이트에 효소를 추가한 다음 검출 가능한 형광에 대해 플레이트를 1분에 한 번 판독하여, 매우 높은 처리량을 제공한다. 형광 검출의 출력을 각 반응에 대해 기록한다.
FRET 샘플은 제조업체에서 권장되는 대로 검정 직전에 제조했다(각 웰에 수중 50% 아세토니트릴 5 μL를 첨가하고 진탕기 상에서 플레이트를 5분 동안 진탕한 다음, 검정 완충액 45 μL를 첨가하고 5분 동안 다시 진탕함). 이 시점에서, FRET 풀은 반응을 시작하기 위해 50 μL의 작업 효소 스톡을 첨가할 준비가 되었다. 다중채널 반복 피펫을 사용하여, 50 μL의 작업 효소 스톡(시험된 각 효소 유형에 대해)을 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 즉시 플레이트 판독기(SoftMax Pro 6.0 소프트웨어가 포함된 SpectraMax 플레이트 판독기, Molecular Devices, Sunnyvale CA)에 배치하고 방출을 420 nm의 컷오프와 함께 여기 320 nm, 방출 420 nm의 설정을 사용하여 판독했다. 15분 동안 1분마다 판독했다. 플레이트가 완료되면, 알루미늄 실링기로 밀봉하고 -80℃에서 보관했다.
나비목 해충의 장 효소에 의한 FRET 풀 절단을 시험하기 위해, 장 효소를 왕담배나방(헬리코베르파 제아)으로부터 단리했다. 왕담배나방 곤충은 Benzon Research(Carlisle, PA)에서 알로서 상업적으로 입수했다. 부화된 유충은 장을 단리하기 전에 4/5령(길이 20 mm)까지 인공 식이로 키웠다. 장 추출 전에, 유충을 CO2를 사용하여 마취했다. 그런 다음 유충을 머리 및 꼬리 모두에서 해부 플레이트 상에 핀으로 고정했다. 해부 가위를 사용하여, 큐티클에 흠집을 냈다. 그런 다음 해부 가위를 흠집 안으로 삽입하고 큐티클을 곤충을 따라 세로 방향으로 했다. 그런 다음 큐티클을 조심스럽게 뒤로 당기고 핀으로 고정하며 개방하여 소화관을 드러냈다. 증류수를 사용하여, 곤충을 철저히 헹구어 혈액림프를 제거했다. 그런 다음 장을 핀셋으로 절제하고 500 μL의 200 mM 트리스-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl(검정 완충액) 용액에 넣었다. 튜브의 무게를 사전 측량하고 사후 측량하여 첨가된 장의 총량을 계산했다. 왕담배나방 장을 200 mM 트리스-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl에서 7 mg/mL(10x)의 스톡 농도로 희석했다. 이를 검정 완충액으로 20x만큼 각 플레이트를 신선 희석했다. 다중채널 반복 피펫을 사용하여, 50 μL의 1X 장 추출물을 각 웰에 첨가하고 위에서 기재된 바와 같이 즉시 판독했다.
다음으로, FRET 키트로 나비목 장 시뮬레이션된 프로테아제 환경에 대해 시험하고 데이터를 회수했다. 표 11는 위치 P2, P1, P1' 및 P2'에서의 아미노산 치환을 강조하는 조합 펩티드 스크리닝 결과를 나타내며, P1은 R9 위치에 해당한다. 라이브러리는 메티오닌을 포함하지 않으므로, 유사한 아미노산인 류신 및 이소류신이 M10(위치 P1')의 절단 가능성을 근사하는 것으로 가정했다. 몇몇 돌연변이(표 4에 진하게 나타냄)는 나비목 프로테아제의 존재 하에 향상된 안정성을 나타냈고, 이들 중 일부를 Ta1b의 안정성 및 활성에 대해 추가 특성규명했다.
펩티드 소화 속도의 감소 배율.
P2 P1 P1' P2'
A R M T
A/V -- 5.1 0.9 0.9
D/E 3.4 58.1 0.9 3.0
F/Y 1.7 2.7 0.5 0.7
I/L 1.8 33.9 -- 0.7
K/R 3.0 -- 0.6 0.6
N/Q 3.6 10.8 0.7 1.4
P 305.3 5.1 18.5 9.9
S/T 3.3 9.0 0.6 --
돌연변이체 안정성 및 활성 프로필분석
FRET 기반 돌연변이를 TVP에 혼입하고 프로테아제 안정성 및 활성에 대해 평가했다. 위치 R9가 활성에 중요한 약전 잔기인 것으로 드러났기 때문에, 본 발명자들은 이 위치에서 유사한 활성 프로필을 유지할 가능성이 더 높은 큰 극성 측쇄를 가진 보존적 돌연변이를 우선시했다. 예시적인 FRET 스크리닝 방법은 "절단 가능 펩티드 및 이를 포함하는 살충 및 살선충 단백질"이라는 제목의 미국 특허 출원 번호 15/727,277에 개시되어 있으며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
조합 라이브러리는 N- 및 C-말단에 FRET 염료/켄칭제 쌍을 갖는, 글리신으로 둘러싸인 3개의 무작위화 아미노산을 포함한다. 펩티드의 절단은 절단의 양과 비례하는 신호 증가를 초래하고 장 프로테아제에 대한 다양한 펩티드 서열의 민감성 순위 정렬을 허용한다. 앞서 언급된 MGE 기술과 동일한 방식으로 단리된 헬리코베르파 제아 장 추출물의 존재 하에 조합 라이브러리로 소화를 거쳤다.
MGE의 존재 하에 TVP를 안정성에 대해 평가했다(상기 기재된 바와 같음). 활성을 집파리(무스카 도메스티카)에 주사하여 평가했다: 평균 질량이 18 mg인 집파리에 0.5를 흉부내 주사했다. 50% 녹다운에 필요한 용량 및 사망률을 주사 후 24시간째에 결정했다.
시험된 TVP 중, 몇몇 돌연변이가 활성에 부정적인 영향을 미쳤다. 그러나 몇몇 TVP는 천연 Ta1b와 유사한 활성을 유지할 수 있었으며, 예를 들어, 하기 치환: A8S, R9N, R9Q 및 T11P를 갖는 TVP는 조합 라이브러리 펩티드 결과와 일치하게, 만두카 장 추출물(MGE)에 의한 소화율에서 상당한 감소를 나타내었다.
알라닌 돌연변이의 활성을 평가하기 위해, 돌연변이 R38A 및 R9A를 갖는 TVP를 성충 집파리의 등쪽 흉부내 영역에 주사했다. R38A는 야생형 Ta1b에 비해 임의의 활성 감소를 나타내지 않았지만, R9A는 활성이 9배 감소했다. 표 5를 참고한다.
돌연변이체 안정성 및 활성 프로필분석.
돌연변이체 안정성 개선 배율 활성 감소 배율
A8D 시험되지 않음 >10
A8N 1.8 시험되지 않음
A8P 시험되지 않음 >10
A8S 12.1 1.3
R9A 247 8.7
R9E 시험되지 않음 >10
R9H 16.2 2.5
R9N >50 1.5
R9Q >50 0.8
T11D 시험되지 않음 >10
T11P 92.9 1.4
R38A 8.6 1.0
실시예 4: 집파리 주사 검정
돌연변이체 안정성 검정에서 확인된 TVP의 활성을 집파리(무스카 도메스티카)로의 주사에 의해 평가했다. 야생형 Ta1b 및 위치 R9Q 및 R9N에서 아미노산 치환을 갖는 TVP를 0.5 μL의 독소 또는 대조군의 주사 용량으로, 평균 질량 18 mg을 갖는 집파리에 흉부내 주사했다. 이어서, 50% 녹다운에 필요한 TVP의 용량(KD50)을 주사 후 24시간째에 결정했다. 이 실험 결과는 KD50에 도달하는 데 필요한 더 낮은 용량 및 집파리에서 표시된 바와 같이(물 및 CO2를 사용한 대조군은 녹다운 효과를 나타재지 않음), R9Q TVP가 야생형 Ta1b에 비해 더 활성이 크다는 것을 예시한다. 도 2.
실시예 5: 총채벌레 생존 검정
서부꽃총채벌레(프랭클리니엘라 옥시덴탈리스)의 야생 집단을 온실에서 재배된 플록스 파니쿨라타(Phlox paniculata)로부터 수집했다. 미처리 대조군(UTC)인 물 또는 400 μg의 독소를 8 x 33 mm 여과지(85.6 μg/cm2)에 적용하고 총채벌레와 식품으로 10% 수크로스를 포함하는 밀봉된 용기 내부에 배치하였다. 총채벌레 사망률을 4일째에 측정했다.
총채벌레 생존 검정은 미처리 대조군(UTC) 및 야생형 U1-아가톡신-Ta1b에서 12.5%의 사망률이 있음을 밝혔다; 그러나 위치 R9Q에서 아미노산 치환을 갖는 TVP의 사용은 100% 사망률을 초래했다. 도 3.
실시예 6: 클루이베로마이세스 락티스에서 TVP의 번역 후 변형
클루이베로마이세스 락티스에서 발현되고 분비되는 TVP는 번역 후 변형을 겪는다. 이 번역 후 변형을 더 잘 이해하기 위해, TVP-R9Q를 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 100 mm) 상으로 주사하고 2 mL 분-1의 유속 및 8분에 걸쳐 15-33% 아세토니트릴 구배로 용출했다. 그런 다음 질량 스펙트럼을 ESI LC-TOF Micromass LCT 기기(Waters)에서 수집했다.
TVP에서 발생하는 번역 후 변형은 +162 Da의 질량 이동으로 입증된다. 도 4. 이 번역 후 이벤트는 글리코실화, 특히 세린 또는 트레오닌 잔기의 O-연결 만노실화일 가능성이 높다. 도 4는 TVP 피크 상 쇼울더(검정색 화살표로 표시)를 나타내는, TVP-R9Q의 HPLC 크로마토그램 판독을 도시한다. 도 5는 TVP-R9Q의 질량 스펙트럼을 도시한다. 다중 하전 종(삽입도)의 데콘볼루션은 5732 및 5894 Da의 질량을 계산한다. 완전 산화된 TVP-R9Q의 예상 분자량은 5731.3 Da이다. 도 5.
실시예 7: 글리코실화 부위 제거 및 C-말단 보호
TVP 변이체를 추가 특성규명하기 위해, 추정 글리코실화 부위를 제거하는 효과 및 C-말단 아미노산이 제공하는 보호 효과를 분석했다. TVP 변이체를 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 100 mm) 상으로 주사하고 2 mL 분-1의 유속 및 8분에 걸쳐 15-33% 아세토니트릴 구배로 용출했다. 질량 스펙트럼을 ESI LC-TOF Micromass LCT 기기(Waters)에서 수집했다.
하기 TVP를 분석했다: (1) TVP-R9Q; (2) TVP-R9QΔG; (3) TVP-R9Q/T43A/ΔG; (4) TVP-R9Q/T43A; (5) TVP-R9Q/T43A/ΔK-G. 상기 TVP의 분자량에 대한 예상/관측 질량 스펙트럼 결과를 표 6에 보고한다.
TVP에 대한 예상/관찰 분자량.
서열 예상 분자량 관찰 분자량
(1) TVP-R9Q 5731.3 5732
(2) TVP-R9QΔG
(3) TVP-R9Q/T43A/ΔG 5644.2 5645
(4) TVP-R9Q/T43A 5701.3 5702
(5) TVP-R9Q/T43A/ΔK-G 5516.0 5516
TVP-R9Q의 HPLC에 의해 나타난 바와 같이, 그리고 왼쪽 쇼울더 피크로 표시된 바와 같이, 추정 글리코실화 이벤트가 확인되었다. 도 6. Ta1b로부터 C-말단 글리신의 제거는(예를 들어 TVP-R9QΔG 및 TVP-R9Q/T43A/ΔG) K. 락티스에서의 발현 동안 말단 라이신(K50)의 부분적 단백분해를 초래한다. 도 7-8.
단일 종의 TVP는 말단 글리신이 다시 부가되거나(예를 들어 TVP-R9Q/T43A) 말단 라이신도 제거될 때(TVP-R9Q/T43A/ΔK-G) 발현될 수 있다. 도 9 및 10.
도 11-14는 (1) TVP-R9Q; (2) TVP-R9QΔG; (3) TVP-R9Q/T43A/ΔG; (4) TVP-R9Q/T43A; (5) TVP-R9Q/T43A/ΔK-G의 질량 스펙트럼을 나타내는 ESI-MS 분석 결과를 나타낸다.
실시예 8: 글리코실화 부위 제거 후 TVP를 사용한 집파리 주사 검정
TVP: (1) TVP-R9Q; (2) TVP-R9QΔG; (3) TVP-R9Q/T43A/ΔG; (4) TVP-R9Q/T43A; 및 (5) TVP-R9Q/T43A/ΔK-G를 집파리 주사 검정에서 분석했다. 집파리 주사를 본원에서 이전에 기재된 바와 같이 수행했다. 표 7은 집파리 주사 검정 결과를 나타낸다. 여기서, 모든 TVP는 WT Ta1b와 비교할 때 더 높은 활성을 나타내었다.
집파리 주사 검정 결과.
시험된 펩티드 파리 KD 50 ( pmol /g)
야생형 167
TVP-R9Q 149
TVP-R9Q/ΔG 136
TVP-R9Q/T43A/ΔG 157
TVP-R9Q/T43A 180
TVP-R9Q/T43A/ΔK-G 157
여기서, 글리코실화 부위 및 C-말단 아미노산의 제거(즉, ΔG 및/또는 ΔK-G)는 WT Ta1b와 비교할 때 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 생성했다. 도 15.
실시예 9: 왕담배나방 생물검정
WT Ta1b 및 TVP-R9Q를 비교하기 위해, 주사 및 경구 엽면 생물검정을 수행했다. 여기서, WT Ta1b 및 TVP-R9Q가 왕담배나방의 사망률에 미치는 영향을 평가했다. 주사 및 경구 생물검정 결과를 아래 표에 나타낸다.
먼저, WT Ta1b(WT) 및 Ta1b의 R9Q 돌연변이(TVP-R9Q)를 나비목 주사 검정에서 평가했다. 실험 유닛은 펩티드 용량당 8개의 주사된 개별 왕담배나방(헬리코베르파 제아)로 구성되었다. 펩티드당 4개의 실험 복제물이 있었다. 주사 전에, 왕담배나방 유충을 표준 나비목 식이로 4령까지 사육했다. 정확한 용량 계산을 결정하기 위해 유충을 측량했다. 왕담배나방 유충 질량의 변화로 인해 정확한 용량은 복제물마다 약간 변하지만, 주사된 대략적인 용량은 1000, 2000, 4000 및 8000 pmol/g이었다. 주사는 핸드 마이크로어플리케이터 및 30 게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 수행했다. 유충은 가장 뒤쪽의 앞다리 중 하나의 기부에 주사했다. 유충에 1 μL의 처리 용액을 주사했다.
주사 후, 유충을 표준 나비목 식이 5 mL이 충전된 32웰 트레이의 웰에 넣었다. 그런 다음 트레이를 28℃ 인큐베이터에 넣었다. 유충의 상태를 주사 후 24시간째에 평가했다. 유충은 살아있는 개체가 정상적으로 움직이고 정상적으로 먹이를 먹고 정상적으로 탐침에 반응하는 "살아있는" 또는 "넉다운"으로 평가했다; 녹다운 개체는 조정된 움직임이 없었고, 먹이를 먹을 수 없었고, 탐침에 반응하지 않았다.
경구 엽면 생물검정에서, 실험 단위는 신생 왕담배나방(헬리코베르파 제아)이 섭식하도록 허용되는 5.5 mL(각 면당 2.75 mL)의 총 분무 부피로 분무된(전면 및 후면) 12개의 잎 디스크(펩티드 농도당)로 구성되었다. 펩티드당 4개의 실험 복제물이 있었다.
로메인 상추를 지름 30 mm 디스크로 자른 다음, 140 ppm 표백 용액을 사용하여 살균했다; 그 후 디스크를 물로 3회 헹구었다. 이어서 로메인 상추 디스크를 스티로폼 판에 핀으로 고정하고 주어진 처리를 분무했다; 디스크를 뒤집고, 다시 분무하고, 건조시킨 다음 분석장에 배치했다.
분석장은 1% 한천 5 mL를 포함하는 32웰 사육 트레이였다. 1개의 로메인 상추 디스크를 각 웰에 놓고, 잎 디스크당 단일 1령 왕담배나방(헬리코베르파 제아)을 두었다. 그런 다음 트레이를 28℃ 인큐베이터에 넣었다.
왕담배나방의 사망률을 잎 디스크로의 분무 및 유충 적용 후 4일째에 평가했다. 유충은 살아있는(정상적으로 움직이고 섭식함) 또는 죽은(움직이지 않고 변색됨)으로 점수를 매겼다.
주사 및 경구 생물검정 결과를 아래 표에 제시한다.
주사 및 경구 사망률 검정. WT = 야생형. 오차는 평균의 표준 오차로 나타낸다(n = 3). "ppt" = 천분율.
명칭 주사 경구 생물검정
LD50(pmol/g) 3 ppt에서의 사망률%
WT 2933 ± 827 6 ± 3
TVP-R9Q 3406 ± 516 21 ± 7
실시예 10: 안정성 제형물
액체 농축물 안정성
액체 농축물(LC) 제형물을 경시적으로 상이한 온도에서 평가했다. 2% TVP-R9Q/T43A; 0.03% 벤즈이소티아졸리논(BIT); 2% 소르비톨을 포함하고; LC 제형물의 나머지 양은 발효 맥주, 즉 세포 분리 발효 맥주의 농축물인 LC 제형물을 HPLC를 사용해서 평가하여 상이한 온도 및 경시적인 TVP-R9Q/T43A의 안정성을 결정했다. 평가된 온도는 4℃, 21℃, 37℃, 45℃ 및 54℃였다. 평가된 시간은 0, 16, 31, 42, 98 및 114일째였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 액체 제형물은 현장 관련 온도에서 빠르게 분해된다.
분무 건조 분말(SDP) 안정성 검정
다음으로 TVP-R9Q/T43A의 안정성을 분무 건조 분말(SDP) 형태로 평가했다. 여기서, SDP 제형물은 건조 발효 맥주로 생성했다: 간략하게, 발효 맥주를 반응기에서 가져와 농축하고 분무 건조하고 모든 물을 제거했다. SDP의 TVP-R9Q/T43A 안정성을 HPLC를 사용해서 평가하여 0, 7, 14, 28, 42 및 62일째에 21℃, 37℃ 및 45℃에서, 산소/수분 포획제 패킷(Mitsubishi Gas Chemical America, Inc., 제품 번호 AS-100; 655 3rd Ave #24, New York, NY 10017 USA)을 포함하거나 포함하지 않는 상태에서 TVP-R9Q/T43A의 양을 mg/mL로 정량하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 고체 상태의 TVP-R9Q/T43A는 액체 상태에 비해 훨씬 더 안정적이다(위, 도 16과 비교). 더욱이, 산소/수분 포획제 패킷과의 인큐베이션은 TVP-R9Q/T43A의 안정성을 추가 증가시켰다. 도 17.
안정성이 추가 증가되는 동안 산소/수분 포획제 패킷의 사용. 여기서, 패킷은 시험 전에 샘플과 함께 Mylar 백 안에 밀봉했다. 21℃에서 62일 동안 인큐베이션 후, 산소/수분 포획제 패킷을 포함하는 TVP-R9Q/T43A의 양(mg/mL)은 산소/수분 포획제 패킷을 포함하지 않는 TVP-R9Q/T43A에서 관찰된 15.4% 감소와 비교하여 3.5% 감소했다. 도 17. 유사하게, 37℃에서 62일 후, 산소/수분 포획제 패킷을 포함하는 TVP-R9Q/T43A의 감소는 산소/수분 포획제 패킷을 포함하지 않고 관찰된 19.5% 감소와 비교하여 13.0%였다. 마지막으로, 45℃에서 62일 후 산소/수분 포획제 패킷을 포함하는 TVP-R9Q/T43A의 감소는 산소/수분 포획제 패킷을 포함하지 않고 관찰된 29.5% 감소와 비교하여 24.7%였다. 여기서, 펩티드의 분해는 온도가 증가함에 따라 증가한다. 도 17.
실시예 11: 추가 부형제를 사용한 예비 안정성 검정
안정성 제형물
당업자는 높은 유리 전이 온도(Tg)를 갖는 장쇄 및 단쇄 당류의 조합이 낮은 운동성(예를 들어, α 이완 및 β 이완)을 촉진한다는 것을 인식할 것이다. 문헌(Mensink et al., How sugars protect proteins in the solid state and during drying (review): Mechanisms of stabilization in relation to stress conditions. Eur J Pharm Biopharm. 2017 May;114:288-295)을 참고한다.
분해 검정을 수행하여 예비 안정성 제형물을 평가했다. 예비 안정성 제형물의 구성성분을 아래의 표에 제공한다. 제형물을 2주 동안 54℃, 37℃ 및 21℃에서 시험했다. 예비 안정성 검정 결과를 도 18에 나타낸다.
예비 안정성 제형물. 양은 그램(% w/w)이며; "-"는 성분의 부재를 표시한다.
제형물
번호 		SDP LC w/
BIT 		리그노설포네이트 석고 말토덱스트린 트레할로스 말토스 H 2 O
7 320 - 40 - 40 - - 244
18 425 - - 150 75 -
21 200 - 40 40 200 - 241
2-1 - 425 - - 150 150 - -
2-2 - 425 - - 150 75 75 -
2-3 - 425 - - 150 - 150 -
실시예 12: TVP와의 벤조이소티아졸리논(BIT)의 상용성
두 가지 건조 제형물-TVP-R9Q/T43A를 갖는 세포 분리 농축 발효 맥주 제형물 및 SDP 제형물-을 BIT 상용성에 대해 평가했다. TVP-R9Q/T43A의 세포 분리 농축 발효 맥주 제형물은 상기 기재된 바와 같이 하여 얻었다. SDP 제형물은 하기와 같이 발효 맥주로부터 얻었다: Buchi 분무 건조기(모델 B-290)를 하기 조건 하에 사용했다: 입구 온도: 160℃; 출구 온도: 65-70℃; 펌프 속도: 35-40 rpm; 압력 강하: 45-50 psi; 흡인기는 100%로 설정; 및 분무화 압력 50 psi.
샘플을 T0(제형화 및 분무 건조기로의 건조 직후 시간, 실온에서 수행됨)에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다. 각 제형물은 4℃, 21℃, 37℃ 및 45℃에서 시험했다.
도 19에 나타낸 바와 같이, BIT의 사용은 TVP-R9Q/T43A가 고체 상태로 제형화되었을 때 및 다른 첨가제 없이 사용했을 때 안정성을 감소시켰다.
그러나, 도 20에 나타낸 바와 같이, 제형물이 분무 건조되고 BIT와 조합되는 경우, 경시적으로 TVP의 안정성이 감소했고, 이는 더 높은 온도에 의해 악화되었다. 도 20.
BIT는 일반적으로 항균제로 사용된다. 그러나 여기에 표시된 것처럼 BIT의 사용은 분무 건조 시 TVP의 분해를 초래한다. 도 19-20.
실시예 13: pH 안정성 스크리닝
pH 안정성 스크리닝을 수행하여 TVP-R9Q/T43A의 안정성에 대한 pH의 효과를 결정하였다. 여기서, 1 ppt(천분율)의 TVP-R9Q/T43A를 Slice pH 키트(Hampton Research, 카탈로그 번호 HR2-070; 34 Journey Aliso Viejo, CA 92656-3317 USA)를 사용하여 다양한 pH 값에서 인큐베이션했다. TVP-R9Q/T43A를 7일 동안 45℃에서 인큐베이션하고 HPLC에 의해 분석하여 남아 있는 펩티드%를 결정했다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 최적 pH는 6.5 내지 7.5인 것으로 결정되었다.
미생물 오염을 방지하기 위해 사용되는 일반적인 보존제는 특히 벤조에이트, 프로피오네이트 및 소르베이트를 포함한다. 보존제의 선택은 pH에 크게 의존한다. 일반적으로 효과적인 pH 상한은 벤조에이트의 경우 약 4.5; 프로피오네이트의 경우 약 5.5; 및 소르베이트의 경우 약 6.5이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 약산성 산물(pH 5.5-6.0)의 pH 수준에서 사용될 때, 소르베이트가(벤조에이트 또는 프로피오네이트와 대조적으로) 더 넓은 스펙트럼의 유해 미생물에 대해 더 효과적이다.
실시예 14: 보존제 및 미생물 형성
몇몇 상이한 조합의 보존제를 평가하여 미생물 오염에 대한 이의 효과를 결정하였다. 발효 맥주에서 얻은 2% TVP-R9Q/T43A 제형물을 2% 소르비톨 및 기타 첨가제와 조합했다. 제형물을 개방된 상태에서 혼합하고, 21℃에서 2일 동안 보관했다. 2일 후, 제형물을 플레이팅하고 콜로니 형성 단위(CFU)에 대해 평가했다.
이전 실시예에서 수집된 정보에 기반하여, BIT 대체가 가능한지 이해하기 위해 하기 표에서 소르베이트를 사용했다. 아래 표에 기재된 제형물에서 사용된 성분은 하기와 같다: 소르비톨(Neosorb 70/20 B; Roquette; 카탈로그 번호 421112980; 1347 Beaver Channel Parkway Clinton, IA 52732-5933 USA); 벤조산나트륨(Alfa Aesar; 카탈로그 번호 A15946; 2 Radcliff Rd, Tewksbury, MA 01876 USA); 소르브산칼륨(Alfa Aesar; 카탈로그 번호 A12844); 시트르산나트륨(Fisher Scientific, 카탈로그 번호 BP327-500).
아래 표는 상이한 제형물 및 콜로니 형성 단위(CFU)에 대한 이의 효과의 요약을 제공한다.
보존제 및 미생물 오염. 평가된 TVP는 TVP-R9Q/T43A였다. "Na"는 나트륨을 의미한다. "K"는 칼륨을 의미하며, 0.2% w/w의 양이다.
온도(℃) 제형물 CFU pH
4 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.03% BIT 0 n/a
4 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 0 n/a
4 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 n/a
4 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 n/a
21 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.03% BIT 0 5.12
21 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 0 5.2
21 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 5 5.22
21 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 5.3
37 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.03% BIT 0 n/a
37 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 0 n/a
37 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 n/a
37 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 n/a
45 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.03% BIT 0 n/a
45 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 0 n/a
45 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 n/a
45 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA 0 n/a
위에 나타낸 바와 같이, 21℃에서 2% TVP + 2% 소르비톨 + 0.2% Na 벤조에이트 + K 소르베이트 + 0.2% EDTA로 구성되는 제형물만 임의의 CFU를 생성했다; 따라서, 이 예외를 제외하고, 상기 제형물은 미생물 성장을 방지한다.
실시예 15: 안정성 패널 파트 I
실시예 10에 나타난 결과에 비추어, 액체 농축물 및 SDP 형태에서 TVP의 안정성과 관련하여, TVP를 안정화할 제형물을 확인하기 위한 작업을 추구했다. 평가된 제형물은 아래 표에서 찾을 수 있다. 시험된 성분은 하기: 액체 농축물(LC) 형태의 TVP-R9Q/T43A, 즉, 세포 분리 발효 맥주의 농축물; H2O(역삼투); 말토덱스트린(MALTRIN®; Grain Processing Corporation, 카탈로그 번호 M100; 1600 Oregon Street Muscatine, Iowa 52761-1494, USA); 트레할로스; 말토스; K2HPO4(무수, 이염기성 인산칼륨; ICL Food Specialties; CAS 번호 7758-11-4; 622 Emerson Road, Suite 500, St. Louis, MO 63141 USA); KH2PO4(일염기성 인산칼륨; ICL Specialty Fertilizers; CAS 번호 7778-77-0; 2755 W 5th N St N, Summerville, SC 29483); 및 BIT(Lonza; PROXEL® AQ Preservative; 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액; Lonza Group Ltd. Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland)를 포함한다.
분무 건조 매개변수는 하기와 같았다: 입구 온도: 160℃; 출구 온도: 65-70℃; 펌프 속도: 35-40 rpm; 압력 강하: 45-50 psi; 흡인기 100% 설정; 및 분무화 압력 50 psi.
샘플을 T0(제형화 및 분무 건조기로의 건조 직후 시간, 실온에서 수행됨)에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다.
안정성 제형물 파트 I. 이 표는 TVP를 안정화하기 위해 사용된 제형물을 나타낸다. 여기서, 양은 달리 표시되지 않는 한 그램으로 나타낸다. "LC"는 액체 농축물을 의미하며 TVP-R9Q/T43A를 발현하는 세포의 세포 분리 발효 맥주의 농축물이다. "Theor. Conc."는 이론적 농도를 의미한다. "T0 moist."는 시간 0(T0)의 수분%를 의미한다. "-"는 주어진 성분이 부재한다는 것을 표시한다.
제형물 번호 희석도 H 2 O LC(mL) 말토덱스 트린 트레할로스 말토스 K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 BIT
(%) 		pH Theor.
Conc.
(%) 		T0 moist. (%)
1 2배 200.0 100.0 108.9 - - 0.0 0.0 0.014 5.2 3.74 10.00
2 2배 200.0 100.0 81.7 27.2 - 0.0 0.0 0.014 5.2 3.74 9.60
3 2배 200.0 100.0 81.7 - 27.2 0.0 0.0 0.014 5.2 3.74 8.00
4 2배 200.0 100.0 71.9 35.9 - 0.0 0.0 0.014 5.2 3.77 8.00
5 2배 200.0 100.0 81.7 27.2 - 2.15 1.04 0.014 7.2 3.74 8.00
6 2배 200.0 100.0 71.9 35.9 - 2.15 1.04 0.014 7.8 3.77 8.00
7 2배 200.0 100.0 51.7 17.22 - 2.15 1.04 0.000 7.2 5.38 8.00
8 2배 200.0 100.0 51.7 - 17.22 2.15 1.04 0.000 5.2 5.38 8.00
9 4배 150.0 50.0 45.5 22.7 - 0.00 0.00 0.000 5.2 2.06 10.00
10 4배 150.0 50.0 45.5 22.7 - 2.15 1.04 0.000 7.2 2.06 8.00
11 4배 150.0 50.0 0.0 68.2 - 7.20 1.00 0.000 7.2 2.06 10.00
12 4배 150.0 50.0 0.0 68.2 - 17.00 1.04 0.000 7.8 2.06 7.80
13 4배 150.0 50.0 0.0 68.2 0.0 17.00 1.00 0.000 7.8 2.06 10.00
14 8배 175.0 25.0 50.0 0 0.0 0.25 0.13 0.000 7.2 1.45 10.00
15 2배 100.0 100.0 50.0 0 0.0 0.50 0.25 0.000 7.2 4.84 10.00
16 1배 0.0 200.0 50.0 0 0.0 1.00 0.50 0.000 7.2 7.93 10.00
17 1배 0.0 200.0 50.0 0 0.0 1.00 0.50 0.000 7.2 7.93 7.80
상기 표에 제시된 제형물은 T0(제형화 및 분무 건조기로의 건조 직후 시간, 실온에서 수행됨)에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다. 분석 결과를 도 22에 나타낸다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 말토스 또는 말토덱스트린을 포함하는 제형물에서 상당한 분해가 관찰되었다. 그러나, 트레할로스 및 포스페이트의 조합은 TVP-R9Q/T43A를 안정화하는 것으로 나타났다. 여기서, 말토덱스트린 또는 말토스 단독(제형물 번호 1, 3, 15-17)은 안정성을 제공하지 않는다; 그러나 트레할로스 및 포스페이트의 사용은 개선된 안정성을 나타내었다(제형물 번호 11-13). 도 22.
실시예 16: 안정성 패널 파트 II
추가 시험 세트를 수행하여 하기를 결정했다: (1) 상이한 제조업체의 트레할로스가 안정성에 영향을 미치는지 여부; (2) 설정된 양의 트레할로스로 안정화될 수 있는 펩티드의 양; (3) 안정화를 위해 KH2PO4가 필요한지 여부; (4) 리그노설포네이트가 물리적 안정성 문제를 방지하는지 여부; 및 (5) BIT의 효과.
이 실시예에서 각 제형물을 아래 표에 제공된 설명에 따라 생성했다; 여기서 구성성분을 조합하고 철저히 혼합 및/또는 용해시킨 다음 분무 건조했다. 시험된 성분은 하기: 액체 농축물(LC) 형태의 TVP-R9Q/T43A, 즉, 세포 분리 발효 맥주의 농축물; H2O(역삼투); 말토덱스트린(MALTRIN®; Grain Processing Corporation, 카탈로그 번호 M100; 1600 Oregon Street Muscatine, Iowa 52761-1494, USA); 트레할로스; 말토스; K2HPO4(무수, 이염기성 인산칼륨; ICL Food Specialties; CAS 번호 7758-11-4; 622 Emerson Road, Suite 500, St. Louis, MO 63141 USA); KH2PO4(일염기성 인산칼륨; ICL Specialty Fertilizers; CAS 번호 7778-77-0; 2755 W 5th N St N, Summerville, SC 29483); 및 BIT(Lonza; PROXEL® AQ 보존제; 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액; Lonza Group Ltd. Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland); 및 리그노설포네이트(Borregaard LignoTech; Vanisperse CB; CAS 번호 8061-51-6; Borregaard AS, PO BOX162, NO-1701 Sarpsborg, Norway)를 포함했다.
시험된 트레할로스 제조업체는 Bulk Supplements(B)(카탈로그 번호 TREH100; 7511 Eastgate Rd, Henderson, NV 89011 USA) 및 Swanson®(S)(카탈로그 번호 478; PO BoX2803. Fargo, ND 58108-2803 USA)이었다.
분무 건조 매개변수는 하기와 같다: 입구 온도: 160℃; 출구 온도: 65-70℃; 펌프 속도: 35-40 rpm; 압력 강하: 45-50 psi; 흡인기 100% 설정; 및 분무화 압력 50 psi.
샘플을 T0에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다.
안정성 제형물 파트 II. 이 표는 다음을 평가하기 위해 사용된 제형물을 나타낸다: (1) 상이한 제조업체의 트레할로스가 안정성에 영향을 미치는지 여부; (2) 설정된 양의 트레할로스로 안정화될 수 있는 펩티드의 양; 및 (3) 안정화를 위해 KH2PO4가 필요한지 여부. 양은 달리 표시되지 않는 한 그램으로 나타낸다. "LC"는 액체 농축물을 의미하며, TVP-R9Q/T43A를 발현하는 세포의 세포 분리 발효 맥주의 농축물이다. "Mfg"는 제조업체를 의미하며 트레할로스 제조업체를 지칭한다: B = Bulk Supplements; S = Swanson. "Theor. Peptide"는 이론적 펩티드%를 의미한다. BIT의 양은 0.03% wt/wt였고, 제형물 중 그 존재 또는 부재는 각각 "+" 또는 "-"로 표시한다.
제형물 번호 H 2 O LC(mL) 트레할로 스 Mfg. K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 리그노설 포네이트 BIT pH Theor. Peptide%
18 150.0 50.0 68.2 S 7.20 1.00 0.00 - 7.2 1.88
19 150.0 50.0 68.2 B 7.20 1.00 0.0 - 7.2 1.88
20 100.0 100.0 68.2 S 7.20 1.00 0.00 - 7.2 3.46
21 100.0 100.0 68.2 B 7.20 1.00 0.0 - 7.2 3.46
22 50.0 150.0 68.2 B 7.20 1.00 0.00 - 7.2 4.82
23 25.0 175.0 68.2 B 17:00 1.00 0.0 - 7.8 4.94
24 150.0 50.0 68.2 B 0.00 0.00 0.00 - 5.2 2.06
25 100.0 100.0 68.2 B 7.20 1.00 0.00 + 7.2 5.02
26 100.0 100.0 68.2 S 7.20 1.00 0.00 + 7.2 5.02
27 100 100 68.2 B 7.20 1.00 0.00 + 7.2 5.02
28 100.0 100.0 68.2 B 0.00 0.00 5.00 + 5.2 5.42
상이한 제조업체로부터 얻은 트레할로스는 TVP-R9Q/T43A의 안정성에 영향을 미치지 않았다(예를 들어, 제형물 번호 20, 21, 26, 27 참고). 도 23.
안정화될 수 있는 펩티드의 양은 2%(이전 실시예의 제형물 참고)에서 약 5%(제형물 번호 25-28 참고)로 증가되었다. 도 23.
여기서, 안정화를 위해 KH2PO4가 필요한지 여부는 결정적이지 않았다. 위의 표에서 마지막 줄은 리그노설포네이트를 갖는 제형물(제형물 번호 28)만 나타낸다. 리그노설포네이트는 예상치 못한 물리적 안정성 문제의 발생으로 인해 첨가했다: 54℃에서 보관 동안, 제형물 번호 18-27은 가벼운 분말에서 취성 고체 응집체로 변화하는 물리적 형태를 가졌다. 도 24.
이러한 응집을 방지하기 위해 리그노설포네이트를 제형물 번호 28에 첨가함으로써 제형물을 건조 유동성 분말 형태로 유지했다. 리그노설포네이트의 첨가는 취성 고체의 형성을 방지했지만, 그럼에도 불구하고 덩어리화를 방지하지는 못했다. 도 25.
마지막으로, 제형물 번호 8-11에 의해 실증된 바와 같이, BIT의 첨가는 TVP-R9Q/T43A의 안정성에 대한 효과를 갖지 않았다.
일부 샘플에서는 펩티드의 명백한 증가가 드러났다; 이 결과는 발생한 예상치 못한 물리적 안정성 문제로 인한 인공물일 수 있다. 도 23. 위에서 언급된 바와 같이, 54℃에서의 보관은 가벼운 분말에서 취성 고체 응집체로의 물리적 형태의 변화를 초래한다. 결과적으로, 분말의 응집으로 인해 정확한 측정이 어려워졌고, 펩티드의 명백한 증가(예를 들어 제형물 22)는 대표 샘플을 획득하는 문제에 기인할 수 있다.
실시예 17: 안정성 패널 파트 III
실시예 15 및 16에서 수집된 정보에 기반하여, 추가 분무 건조 실험을 수행했다: 여기서, 의도는 물리적 안정성(즉, 건조 유동성 분말 형태)을 유지하면서도 펩티드를 안정화하는 것이었다.
제형물을 아래 표에 따른 성분을 사용하여 제조하고, 본원에 기재된 바와 같이 HPLC를 사용하여 평가했다. 구성성분을 조합하고, 철저히 혼합 및/또는 용해시킨 다음, 분무 건조했다. 시험된 성분은 하기를 포함한다: 액체 농축물(LC) 형태의 TVP-R9Q/T43A, 즉, 세포 분리 발효 맥주의 농축물; H2O(역삼투); 트레할로스; 리그노설페이트(Borregaard LignoTech; Vanisperse CB; CAS 번호 8061-51-6; Borregaard AS, PO BOX162, NO-1701 Sarpsborg, Norway); 말토덱스트린(MALTRIN®; Grain Processing Corporation, 카탈로그 번호 M100; 1600 Oregon Street Muscatine, Iowa 52761-1494, USA); K2HPO4(무수, 이염기성 인산칼륨; ICL Food Specialties; CAS 번호 7758-11-4; 622 Emerson Road, Suite 500, St. Louis, MO 63141 USA); KH2PO4(일염기성 인산칼륨; ICL Specialty Fertilizers; CAS 번호 7778-77-0; 2755 W 5th N St N, Summerville, SC 29483); 및 BIT(Lonza; PROXEL® AQ Preservative; 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온의 9.25% 수용액; Lonza Group Ltd. Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland). 시험된 트레할로스 제조업체는 Swanson®(S)(카탈로그 번호 478; PO BoX2803. Fargo, ND 58108-2803 USA); 및 Nagase America LLC.(N)(TREHA®; α,α-1,1 연결로 결합된 2개의 글루코스 분자로 구성되는 비환원 이당류; 546 5th Avenue, Floor 19, New York, NY 10036-5000 USA)였다.
분무 건조 매개변수는 하기와 같다: 입구 온도: 160℃; 출구 온도: 65-70℃; 펌프 속도: 35-40 rpm; 압력 강하: 45-50 psi; 흡인기 100% 설정; 및 분무화 압력 50 psi.
샘플을 T0에 및 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 평가했다. 펩티드 농도는 본원에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 통해 정량했다.
이론적 펩티드 농도 계산 공식은 하기와 같다:
Figure pct00014
공식 IV
안정성 제형물 파트 III. 이 표는 펩티드 안정화 및 물리적 안정성에 대한 조성물 효과를 평가하기 위해 사용된 제형물을 나타낸다. 양은 달리 표시되지 않는 한 그램으로 나타낸다. "LC"는 액체 농축물을 의미하며 TVP-R9Q/T43A를 발현하는 세포의 세포 분리 발효 맥주의 농축물이다. "Mfg"는 제조업체를 의미하며 트레할로스 제조업체를 지칭한다. S = Swanson; N = Nagase. "M100"은 말토덱스트린을 지칭한다. "Theor. Peptide"는 이론적 펩티드%를 의미한다.
제형물 번호 H 2 O LC
(mL) 		트레할로 스 Mfg. 리그노설 포네이트 M100 K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 BIT pH Theor. Peptide%
29 150.0 50.0 68.2 S 0.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 2.8
30 150.0 50.0 68.2 N 0.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 2.8
31 100.0 100.0 68.2 N 0.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 5.0
32 50.0 200.0 68.2 N 0.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 8.1
33 0.0 300.0 68.2 N 0.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 10.3
34 0.0 200.0 34.1 N 0.0 0.0 3.60 0.50 + 7.2 11.8
35 155.0 145.0 68.2 N 0.0 34.1 7.20 1.00 + 7.2 5.0
36 110.0 190.0 68.2 N 0.0 68.2 7.20 1.00 + 7.2 5.0
37 110.0 115.0 68.2 N 10.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 5.0
38 110 127 68.2 N 20.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 5.0
39 0.0 200.0 0 N 0.0 0.0 7.20 1.00 + 7.2 18.6
40 150 50 68.2 S 0.0 0.0 7.20 1.00 - 7.2 1.9
도 26에 나타낸 바와 같이, 막대 그래프는 위의 표(검은색 막대)에 기재된 조성 설계에 기반한 이론적 펩티드 농도를 나타낸다. T0에서 펩티드의 실제 %를 회색 막대에 나타낸다. 54℃에서 2주 인큐베이션 후 펩티드의 실제 %는 빗금친 막대에 나타낸다. 도 26.
여기서, 리그노설포네이트의 첨가는 물리적 불안정성을 방지하지 못했다. 그러나, 이 실시예의 제형물은 펩티드를 안정화할 수 있었고 또한 건조 유동성 분말 형태로 물리적 안정성을 유지할 수 있었다. 제형물 번호 35 및 36은 우수한 펩티드 안정성을 나타내었고 건조 유동성 분말 형태를 생성했다. 도 27-28.
제형물 번호 31-34는 우수한 펩티드 안정성을 나타내었지만, 그럼에도 불구하고 덩어리화 및/또는 응집을 초래했다.
실시예 18: 건조 및 과립 제형물
건조 제형물 설계
불안정한 TVP 활성 성분에 안정성을 부여하는 과립 제품을 생성할 목적으로 유동층 건조기를 사용하여 4개의 프로토타입 제형물을 파일럿 규모로 생성했다.
프로토타입 제형물은 건조 전에 TVP-R9Q/T43A를 포함하는 액체 농축물(LC)에 다양한 양의 트레할로스를 첨가하여 생성했다.
시험 설정은 아래 표에 나와 있다. 유동층 공정 전에 말토덱스트린을 제외한 모든 성분을 첨가했다. 유동층 건조 공정 동안, 제형화된 액체를 말토덱스트린의 유동층 상으로 분무하여 과립을 생성했다. 사용된 성분은 위의 실시예에서 기재된 것과 동일하다.
프로토타입 제형물 . "LC"는 액체 농축물을 의미한다. "LC DS"는 액체 농축물 용존 고체를 의미한다.
시험 번호 LC 펩티드
(g/L) 		LC DS (g/kg) LC (mL) 트레할로스
(g) 		말토덱스트린
(g) 		K 2 HPO 4
(g) 		KH 2 PO 4
(g)
1 58 226 4000 697.2 1000 73.4 9.96
2 58 226 1000 300 100 29 4
3 58 226 1000 200 100 29 4
4 58 226 1000 100 100 29 4
유동층 건조 공정 이후의 프로토타입에 대한 이론적 종결% w/w를 아래 표에 제시한다. TVP-R9Q/T43A 활성 성분%(% AI)은 액체 농축물 용존 고체(% LC DS)인 것으로 간주된다.
프로토타입 제형물에 대한 이론적 종결% w/w. "%AI"는 활성 성분(TVP-R9Q/T43A)%를 지칭한다. "LC DS"는 액체 농축물 용존 고체를 의미한다. 양은 % w/w로 나타낸다.
시험 번호 % AI % LCDS % 트레할로스 % 말토덱스트린 % K 2 HPO 4 % KH 2 PO 4 % BIT
1 8.42 35.37 25.29 36.27 2.66 0.36 0.05
2 8.57 36.00 44.31 14.77 4.28 0.59 0.05
3 10.05 42.24 34.66 17.33 5.03 0.69 0.06
4 12.16 51.09 20.96 20.96 6.08 0.84 0.07
4개의 프로토타입의 이론적 제형물(평균값)을 아래 표에 제시된 데이터에 기반하여, 도 29에 제시한다.
이론적 제형물 데이터. "R"은 복제물을 의미하고, 펩티드 측정을 위한 검정의 복제물을 지칭한다(즉, 기술적 복제물이 아님). "Avg"는 평균을 의미한다. T0은 시간 0을 의미한다. T2w는 2주째의 시간을 의미한다. Std. Dev.는 표준 편차를 의미한다.
시험 번호 T0 TVP
(% wt/wt) 		Avg. T0
(% wt/wt) 		Std. Dev. T2w TVP
(% wt/wt) 		Avg. T2w
(% wt/wt) 		T2w 샘플의 Std. Dev. T0에서의 예상 TVP
% wt/wt
시험 번호 1 R1 7.99 8.22 0.23 8.24 8.15 0.06 8.64%
시험 번호 1 R2 8.13 8.10
시험 번호 1 R3 8.53 8.12
시험 번호 2 R1 7.92 7.85 0.09 8.43 8.39 0.04 8.80%
시험 번호 2 R2 7.72 8.39
시험 번호 2 R3 7.92 8.33
시험 번호 3 R1 9.94 9.52 0.30 9.80 9.62 0.15 10.32%
시험 번호 3 R2 9.38 9.44
시험 번호 3 R3 9.24 9.61
시험 번호 4 R1 10.85 11.01 0.22 11.05 10.99 0.05 12.64%
시험 번호 4 R2 11.31 10.93
시험 번호 4 R3 10.86 10.99
4개의 프로토타입을 산소/수분 포획제 패킷(Mitsubishi Gas Chemical America, Inc., 제품 번호 AS-100; 655 3rd Ave # 24, New York, NY 10017 USA)의 존재 하에, 2주 동안 54℃에서의 인큐베이션을 통해 고온 안정성에 대해 평가했다. TVP-R9Q/T43A 펩티드의 측정은 t=0(제형화 및 건조 후) 및 t=14일에 HPLC-UV를 사용하여 수행했다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 4개의 프로토타입 모두 54℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 안정했다.
이후의 제형화 공정을 상기 실험 세트에 기반하여 개발했다. 제형화 공정은 발효, 즉 하류 공정에서 액체 농축물, 용존 고체(LC DS)을 측정하고, 건조 후 불안정한 TVP-R9Q/T43A 펩티드에 안정성을 부여하기 위해 적절한 비율로 트레할로스를 첨가한다.
평가된 시험 비 범위는 트레할로스당 약 0.81 내지 약 2.44 LC DS(0.81-2.44 LC DS:트레할로스)였으며 아래 표에 제시한다.
TVP 대 트레할로스의 비 범위. "LC DS"는 액체 농축물, 용존 고체를 의미한다. 매트릭스 DS는 제형물의 상류 발효/하류 가공 단계에서 잔여하는 용존 고체를 지칭한다.
시험 번호 트레할로스 (g) 계산된 LC DS (g) 매트릭스 DS:트레할로스
1 697 975 1.40
2 300 244 0.81
3 200 244 1.22
4 100 244 2.44
상기 실험은 또한 이들이 건조 유동성 과립 형태인 한, 물리적으로 안정했다. 시험 번호 1, 2, 3, 4에 대한 물리적 형태 결과를 도 31-34에 나타낸다.
실시예 19: 트레할로스 안정화의 원형 이색성(CD) 검정
원형 이색성(CD)은 흡수 분광법이다. CD는 왼쪽 및 오른쪽 원형 편광의 흡수차를 사용한다. 이러한 현상으로 인해 얻어지는 스펙트럼을 CD 스펙트럼이라고 하며, 여기서 CD 신호는 밀리도(mdeg)로 나타낸다.
광학 활성 키랄 분자는 원형 편광의 한 방향을 우선적 방식으로 흡수할 것이다; 그리고 이 흡수-즉, 왼쪽 또는 오른쪽 원형 편광-의 차이를 측정하고 정량할 수 있다. 자외선(UV) CD는 단백질 2차 구조, 예를 들어 알파 나선, 베타 시트, 랜덤 코일 등의 측면을 결정하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어 CD의 가장 널리 사용되는 적용 중 하나는 단백질이 정확히 폴딩되는지 여부 및/또는 주어진 돌연변이가 해당 단백질의 안정성 또는 입체형태에 영향을 미치는지 여부를 평가하는 것이다. 문헌(N. Greenfield, Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure, Nat Protoc. 2006; 1(6): 2876-2890)을 참고한다.
TVP의 안정화에 대해 트레할로스가 갖는 효과 및 이의 생물리적 특성을 추가로 평가하기 위해, CD를 사용하여 최소 및 고순도 구성성분을 포함하는 조성물을 조사했다. 여기서, 조성물은 10% 트레할로스 및 0.5 ppt(0.05% w/v) TVP-R9Q/T43A로 이루어졌다. 트레할로스와 Ta1b를 제외하고, 유일한 다른 구성성분은 10 mM 인산나트륨 완충액이다. CD 스펙트럼은 Jasco J-1500 분광광도계(JASCO Inc., 28600 Mary's Court, Easton, MD 21601 USA)에서 기록했다. TVP-R9Q/T43A를 0.1 cm 석영 큐벳에서 10 mM 인산나트륨, pH 7.0 중에서 0.5 mg/mL로 희석했다. 스펙트럼은 20℃에서 100 nm 분-1의 스캔 속도에서 0.1 nm 간격으로 기록했다. 고정 파장 용융 곡선을 10℃ 분-1의 온도 경사로 1℃마다 생성했다. 용융 곡선을 볼츠만 S자형에 피팅하여 용융점(Tm)을 결정했다.
10% 트레할로스의 첨가는 펩티드가 그 3D 구조와 일치하는, 더욱 알파 나선이 되었음을 나타내는 214 nm 및 220 nm에서 CD 스펙트럼이 깊어짐에 의해 표시된 바와 같이 TVP-R9Q/T43A의 2차 구조를 안정화한다. 도 35. 또한, 10% 트레할로스의 첨가는 TVP-R9Q/T43A의 용융점을 71.6℃에서 73.6℃로 증가시켜 트레할로스 존재 하에 그 증가된 안정성을 뒷받침한다. 도 36.
실시예 20: 안정한 제형물의 요약
아래 표는 안정한 TVP의 제형물을 생성하기 위해 사용된 구성성분에 대한 요약을 제공한다.
예시적인 제형물. 아래에 기재된 % w/w 양은 실시예 섹션에서 얻은 결과에 기반한 예시적 제형물의 요약이다.
구성성분 % w/w
TVP 8.50%
1,2-벤조이소티아졸린-3-온 0.05%
말토덱스트린(M100) 36.30%
트레할로스 25.30%
무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4) 2.60%
일염기성 인산칼륨(KH2PO4) 0.40%
발효 고체 26.85%
실시예 21: 위치 스캔 및 장 환경 검정
TVP를 시뮬레이션된 나비목 장 환경에서 이의 안정성을 결정하기 위해 나비목 장 프로테아제에 노출시켰다.
TVP 발현 벡터의 생성
다양한 TVP의 DNA 작제물을 코돈 최적화하고 클루이베로마이세스 락티스 알파 교배 인자 프리/프로 서열(αMF)과의 융합체로 합성하고 pKlac1(New England Biolabs®)의 NotI 및 HindIII 제한 부위 내로 결찰했다. 벡터를 SacII로 소화시켜 선형화하고 박테리아 Ori 및 선택 마커를 제거한 다음, 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 세포에 전기천공했다. 단독 질소원으로서 아세트아미드를 포함하는 선택 플레이트 상에서 다중 유전자 카피 형질전환체를 선택했다. TVP를 발현하는 클론을 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 25 mm) 상에서 HPLC에 의해 평가하고 2 mL 분-1의 유속 및 2분에 걸쳐 10-30% 아세토니트릴의 구배로 용출했다.
TVP의 소화
나비목 장 프로테아제에 노출되었을 때 TVP의 안정성을 결정하기 위해, 초기 5령 헬리코베르파 제아 유충을 해부하여 다른 조직 및 혈액림프로부터 온전한 소화관을 제거했다. 헬리코베르파 장 추출물(HGE)을 얻기 위해, 장 내용물을 튜브에 수집할 수 있도록 장 내벽에 작은 절개를 가했다. 여러 해부체를 풀링하여 즉시 사용하기 위해 얼음 상에 유지하거나 향후 사용하기 위해 -80℃에 보관했다.
야생형 Ta1b(서열 번호 1)를 주형으로 사용하고, 위치 9의 아미노산 치환에서 돌연변이시켜(즉, R9; 서열 번호 1) 여기서 평가된 TVP를 생성하였고; 이들 TVP는 야생형 아미노산 서열(서열 번호 1)의 위치 9에서 아르기닌(즉, R9)이 아미노산 F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, D, V, M, I, Q, C, E, T 및 S 중 하나로 치환된다; 또한, R9Q + T43A 돌연변이(야생형 Ta1b 대비)를 갖는 TVP를 마찬가지로 평가했다(서열 번호 85). 여기서 시험된 각 TVP 및 그 아미노산 치환(들)을 표 19에 나타낸다.
위에 기재되고 표 19에 나타낸 TVP를 나비목 장 환경에서 소화를 시뮬레이션하기 위해 헬리코베르파 장 추출물(HGE)과 대면시켰다. 여기서, TVP를 헬리코베르파 딥 웰 세포 성장에서 얻은 6배 희석된 양의 HGE와 함께 인큐베이션했다. 6x 희석된 HGE에 30 mM 트리스-HCl, pH 8.8을 보충하여 헬리코베르파 장 환경의 알칼리성 pH를 유지했다.
소화된 TVP의 샘플을 0, 3 및 22.5시간째 시점에 수집했다. 소화 공정을 켄칭하기 위해, 30 mM 글리신, pH 2.0을 샘플에 첨가하고, 분해된 TVP의 샘플을 역상 HPLC를 사용하여 즉시 분석하여 TVP 피크 면적을 정량했다. 표 19에 나타낸 바와 같이, WT Ta1b를 6x 희석된 HGE와 함께 인큐베이션할 때, 이는 3시간 내지 22.5시간에 완전히 소화되며 반감기는 1.9시간이다.
하기 표 19에 나타낸 바와 같이, R9를 아미노산 A, G, N, L, D, V, M, I, Q + T43A, Q, C, E, T 또는 S로 치환하면(서열 번호 77-90으로 예시됨), HGE 소화를 완전히 폐지했다. 대조적으로, R9의 아미노산 F, P, Y, K, W 또는 H로의 치환(서열 번호 71-76으로 예시됨)은 야생형 Ta1b에서 관찰된 안정성에 비해 안정성의 실질적 증가를 제공하지 않았다.
전체 아미노산 스캔 소화 분석.
아미노산
(위치 9) 		반감기
(시간) 		서열 번호 서열 결과
R(WT) 1.9 1 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG NA
F 2.0 71 EPDEICRAFMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG 불안정
P 2.1 72 EPDEICRAPMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
Y 4.4 73 EPDEICRAYMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
K 6.3 74 EPDEICRAKMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
W 9.1 75 EPDEICRAWMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
H 9.6 76 EPDEICRAHMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
A 10.7 77 EPDEICRAAMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG 안정
G 12.7 78 EPDEICRAGMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
N 13.8 79 EPDEICRANMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
L 17.5 80 EPDEICRALMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
D 22.6 81 EPDEICRADMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
V 23.6 82 EPDEICRAVMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
M 26.4 83 EPDEICRAMMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
I 31.8 84 EPDEICRAIMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
Q + T43A 36.8 85 EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG
Q 42.2 86 EPDEICRAQMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
C 63.4 87 EPDEICRACMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
E 67.9 88 EPDEICRAEMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
T 95.8 89 EPDEICRATMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
S 139.4 90 EPDEICRASMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
실시예 22: 글리코실화 부위의 제거
TVP 발현 벡터의 생성
다양한 TVP의 DNA 작제물을 코돈 최적화하고 클루이베로마이세스 락티스 알파 교배 인자 프리/프로 서열(αMF)과의 융합체로 합성하고 pKlac1(New England Biolabs)의 NotI 및 HindIII 제한 부위 내로 결찰했다. 벡터를 SacII로 소화시켜 선형화하고 박테리아 Ori 및 선택 마커를 제거한 다음 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 세포에 전기천공했다. 단일 질소원으로서 아세트아미드를 포함하는 선택 플레이트 상에서 다중 유전자 카피 형질전환체를 선택했다. TVP를 발현하는 클론을 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 25 mm) 상에서 HPLC에 의해 평가하고 2 mL 분-1의 유속 및 2분에 걸쳐 10-30% 아세토니트릴의 구배로 용출했다. TVP는 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 100 mm) 상에서 LC-MS에 의해 글리코실화(MW에서 +162)에 대해 평가하고 1 mL/분-1의 유속으로 용출하고 위의 실시예에 기재된 바와 같이 질량 분광측정법을 통해 분석했다.
표 20에 나타낸 바와 같이, 위치 43을 치환한 아미노산 중, 트레오닌(T) 및 세린(S)(서열 번호 108 및 109)만 글리코실화종을 생산했고, 다른 18개의 상이한 아미노산(서열 번호 91-107 및 110)은 임의의 글리코실화된 종을 생산하지 않았다.
글리코실화 부위 제거 결과.
아미노산
(위치 43) 		글리코실화 (Y/N) 서열 번호 서열
F 아니오 91 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYFACHEAQKG
P 아니오 92 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYPACHEAQKG
Y 아니오 93 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYYACHEAQKG
K 아니오 94 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYKACHEAQKG
W 아니오 95 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYWACHEAQKG
H 아니오 96 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYHACHEAQKG
A 아니오 97 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYAACHEAQKG
G 아니오 98 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYGACHEAQKG
N 아니오 99 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYNACHEAQKG
L 아니오 100 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYLACHEAQKG
D 시험되지 않음 101 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYDACHEAQKG
V 아니오 102 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYVACHEAQKG
M 아니오 103 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYMACHEAQKG
I 아니오 104 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYIACHEAQKG
Q 아니오 105 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYQACHEAQKG
C 아니오 106 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYCACHEAQKG
E 아니오 107 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYEACHEAQKG
T(WT) 예 108 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYTACHEAQKG
S 예 109 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNCGDQVAACEAECFRNDVYSACHEAQKG
R 아니오 110 EPDEICRARMTNKEFTYKSNVCNNCGDQVAACEAECFRNDVYRACHEAQKG
SEQUENCE LISTING <110> Vestaron Corporation <120> PROTEOLYTICALLY STABLE U1-AGATOXIN-TA1B VARIANT POLYPEPTIDES FOR PEST CONTROL <130> 225312-490536 <150> 63/012,755 <151> 2020-04-20 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 51 <212> PRT <213> Eratigena agrestis <400> 1 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Gly 50 <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9Q <400> 2 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Gly 50 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9QdG <400> 3 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Gln Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 4 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-K18A <400> 4 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Ala Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Gly 50 <210> 5 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-K18AdG <400> 5 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Ala Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 6 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R38A <400> 6 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 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Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 10 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-A8S <400> 10 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ser Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Gly 50 <210> 11 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-A8SdG <400> 11 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ser Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 12 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9N <400> 12 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Asn Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Gly 50 <210> 13 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9NdG <400> 13 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Asn Met Thr Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 14 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T11P <400> 14 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Pro Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Gly 50 <210> 15 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T11PdG <400> 15 Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Pro Asn Lys Glu Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Asn Cys Gly Asp Gln Val Ala Ala Cys 20 25 30 Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys His Glu Ala 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 16 <211> 153 <212> DNA <213> Eratigena agrestis <400> 16 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 17 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9Q <400> 17 gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 18 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9QdG <400> 18 gaaccagacg agatatgcag agcacaaatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150 <210> 19 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-K18A <400> 19 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta tgcttccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 20 <211> 150 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gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 24 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-A8NdG <400> 24 gaaccagacg agatatgcag aaacaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150 <210> 25 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-A8S <400> 25 gaaccagacg agatatgcag atcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 26 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-A8SdG <400> 26 gaaccagacg agatatgcag atcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150 <210> 27 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9N <400> 27 gaaccagacg agatatgcag agcaaacatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 28 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-R9NdG <400> 28 gaaccagacg agatatgcag agcaaacatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150 <210> 29 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T11P <400> 29 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg cctaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 30 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T11PdG <400> 30 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg cctaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa 150 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IGER <400> 31 Ile Gly Glu Arg 1 <210> 32 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Artificial sequence <220> <223> TVP-T43A <400> 137 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacgctg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 138 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43G <400> 138 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacggtg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 139 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43N <400> 139 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacaatg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 140 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43L <400> 140 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacttag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 141 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43D <400> 141 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacgatg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 142 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43V <400> 142 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacgtcg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 143 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43M <400> 143 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacatgg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 144 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43I <400> 144 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacattg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 145 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43Q <400> 145 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttaccaag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 146 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43C <400> 146 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttactctg cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 147 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43E <400> 147 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacgaag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 148 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43T <400> 148 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacacag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 149 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43S <400> 149 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttactcag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153 <210> 150 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TVP-T43R <400> 150 gaaccagacg agatatgcag agcaaggatg accaacaaag aatttaccta taagtccaac 60 gtatgcaata attgtggcga ccaggtggca gcctgcgagg cagagtgctt tcgtaatgac 120 gtttacagag cttgtcacga ggctcagaaa ggt 153

Claims (148)

  1. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재함.
  2. 제1항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는 TVP.
  3. 제1항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인 TVP.
  4. 제1항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는 TVP.
  5. 제1항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는 TVP.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는 TVP.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 TVP.
  8. 제1항에 있어서, TVP가 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이한, TVP.
  9. 제1항에 있어서, TVP가 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는, TVP.
  10. 제9항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인, TVP.
  11. 제10항에 있어서, 절단가능 링커가 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, TVP.
  12. 제11항에 있어서, 링커가 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Z1이 T 또는 S인 경우, 글리코실화되는 TVP.
  14. TVP 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 조성물로서; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재하고; 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 조성물.
  16. 제14항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는, 조성물.
  18. 제14항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는, 조성물.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, TVP가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 조성물.
  21. 제14항에 있어서, TVP가 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이한, 조성물.
  22. 제14항에 있어서, TVP가 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인, TVP.
  24. 제23항에 있어서, 절단가능 링커가 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, TVP.
  25. 제24항에 있어서, 링커가 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP가 글리코실화되는, 조성물.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 부형제가 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 조성물의 총 중량의 TVP가 약 2% 내지 약 16% w/w 범위이고; 트레할로스가 약 5% 내지 약 40% w/w 범위이고; BIT가 약 0.01% 내지 약 0.1% w/w 범위이고; 말토덱스트린이 약 10% 내지 약 50% w/w 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)이 약 1% 내지 약 5% w/w 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)이 약 0.10% 내지 약 1% w/w 범위이고; 발효 고체가 약 15% 내지 약 40% w/w 범위인, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 조성물의 총 중량의 TVP가 약 7% 내지 약 9% w/w 범위이고; 트레할로스가 약 20% 내지 약 30% w/w 범위이고; BIT가 약 0.025% 내지 약 0.075% w/w 범위이고; 말토덱스트린이 약 30% 내지 약 40% w/w 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)이 약 2% 내지 약 3% w/w 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)이 약 0.2% 내지 약 0.6% w/w 범위이고; 발효 고체가 약 20% 내지 약 30% w/w 범위인, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 조성물의 총 중량의 TVP가 약 8.5% w/w이고; 트레할로스가 약 25% w/w이고; BIT가 약 0.05% w/w이고; 말토덱스트린이 약 36.3% w/w이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)이 약 2.6% w/w이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)이 약 0.4% w/w이고; 발효 고체가 약 26.85% w/w인, 조성물.
  31. 제14항에 있어서, 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP; 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 필수적으로 구성되는 조성물.
  32. 제14항에 있어서, 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP; 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 필수적으로 구성되는 조성물.
  33. TVP, 및 복수의 부형제로 구성되는 조성물로서; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재하고; 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되며; 복수의 부형제는 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성되는, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 조성물.
  35. 제33항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인, 조성물.
  36. 제33항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는, 조성물.
  37. 제33항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 X1, X2, X3, X4, 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는, 조성물.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, TVP가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 조성물.
  40. 제33항에 있어서, TVP가 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이한, 조성물.
  41. 제33항에 있어서, TVP가 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 절단가능 링커가 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 링커가 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  45. 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP가 글리코실화되는, 조성물.
  46. TVP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, TVP는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재함.
  47. 제46항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
  48. 제46항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인, 폴리뉴클레오티드.
  49. 제46항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는, 폴리뉴클레오티드.
  50. 제46항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는, 폴리뉴클레오티드.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
  53. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP가 글리코실화되는, 폴리뉴클레오티드.
  54. 다음 단계를 포함하는, TVP를 생산하는 방법:
    (a) TVP 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계로서, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단계:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재함;
    (b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및
    (c) TVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하에 성장 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계.
  55. 제54항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인, 방법.
  57. 제54항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는, 방법.
  58. 제54항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는, 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, TVP가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 벡터가 알파-MF 신호를 포함하는 플라스미드인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 알파-MF 신호가 알파-MF 신호 펩티드를 발현하도록 작동 가능한, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 벡터가 숙주 세포로 형질전환되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 진핵생물 세포가 효모 세포인, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속에 속하는 임의의 종으로부터 선택되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비지애 및 피치아 파스토리스로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스인, 방법.
  70. 제54항에 있어서, TVP가 성장 배지로 분비되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, TVP가 알파-MF 신호 펩티드에 작동 가능하게 연결된, 방법.
  72. 제54항에 있어서, TVP의 발현이 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L, 또는 적어도 100,000 mg/L의 효모 배양 배지 리터당 TVP의 수율을 제공하는, 방법.
  73. 제71항에 있어서, TVP의 발현이 적어도 100 mg/L의 배지 리터당 TVP의 수율을 제공하는, 방법.
  74. 제54항에 있어서, 배지에서 TVP의 발현이 배지에서 단일 TVP의 발현을 초래하는, 방법.
  75. 제54항에 있어서, 배지에서 TVP의 발현이 배지에서 2개 이상의 TVP 폴리펩티드를 포함하는 TVP 융합 중합체의 발현을 초래하는, 방법.
  76. 제54항에 있어서, 벡터가 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 TVP를 암호화하도록 작동 가능한, 방법.
  77. 제54항에 있어서, 벡터가 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 TVP, 또는 상이한 발현 카세트의 TVP를 암호화하도록 작동 가능한, 방법.
  78. 제54항에 있어서, 제1 발현 카세트가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 TVP를 암호화하도록 작동 가능한, 방법.
  79. 제54항에 있어서, TVP가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  80. 제54항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, Z1이 T 또는 S인 경우, TVP가 글리코실화되는, 방법.
  81. 곤충의 서식지에 제14항의 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충을 제어하기 위해 제14항의 조성물을 사용하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 곤충이 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  83. TVP 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 TVP가 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재함.
  85. 제84항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 방법.
  86. 제84항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인, 방법.
  87. 제84항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는, 방법.
  88. 제84항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는, 방법.
  89. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 방법.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  91. 제83항에 있어서, TVP가 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이한, 방법.
  92. 제83항에 있어서, TVP가 절단 가능 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는, 방법.
  93. 제83항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인, 방법.
  94. 제83항에 있어서, 절단가능 링커가 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, 방법.
  95. 제83항에 있어서, 링커가 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  96. 제83항에 있어서, 곤충이 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 곤충이 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  98. 살해충 유효량의 제14항의 조성물을 해충의 서식지, 또는 해충에 의한 공격에 민감한 식물 또는 동물에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 박멸, 제어 또는 억제하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 해충이 아케마 스핑크스 나방(박각시나방)(유모르파 아케몬); 큰미국노랑나비(콜리아스 유리테메); 아몬드나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아나방(아모르비아 휴메로사나); 거염벌레(스포로도프테라 spp., 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 유니펑크타); 아티초크관모나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 진달래애벌레(다타나 메이저); 주머니나방(티리돕테릭스); 에페메래포르미스); 바나나나방(하이퍼콤페 스크리보니아); 바나나스키퍼(에리오노타 트락스); 블랙헤드버드웜(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아오크웜(프리가니디아 캘리포니카); 봄구충(팔레아크리타 메리카타); 체리과일벌레(그라폴리타 패카르디); 차이나마크나방(님풀라 스타그나타); 감귤류컷웜(자일로마이게스 쿠리알리스); 코들링나방(사이디아 포모넬라); 크랜베리과일벌레(아크로바시스 박시니이); 격자줄무늬양배추벌레(에버게스티스 리모살리스); 검거세미밤나방(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 미송터삭나방(오르자이아 슈도추가타); 엘로나방(박각시나방)(에린나이스 엘로); 느릅나무스팬웜(엔노모스 서브시그나리아); 유럽포도나무나방(로베시아 보트라나); 두만강꼬마팔랑나비(타이멜리쿠스 리네올라(에섹스 스키퍼); 미국흰불나방(멜리소푸스 라티페레아누스; 개암나무잎말이나방(아르킵스 로사누스; 과일나무잎말이나방(아르킵스 아르자이로스필리아; 포도베리나방(파랄로베시아 비테아나; 포도잎말이나방(플라타이노타 스툴타나; 포도알락나방(해리시나 아메리카나(땅에서만); 녹색클로버벌레(플라티페나 스카브라; 로지메이플나방(드리오캄파 루비쿤다; 검모소스-바트라케드라; 코모새(핫지); 유럽매미나방(라이만트리아 디스파르); 햄록루퍼(람브디나 피셀라리아); 박각시나방(만두카 spp.); 배추흰나비(피어리스 라패); Io나방(오토메리스 아이오); 잭소나무버드웜(코리스토뉴라 피너스); 연갈색사과나방(에피피야스 포스트비타나); 멜론웜(디아파니아 히알리나타); 미모사웹웜(호마다울라 아니소센트라); 사선밴드형잎말이나방(코리스토뉴라 로사세아나); 협죽도호크나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성잎말이나방(플레이노타 스툴타나); 잡식성자벌레(사불로데스 애그로타타); 왕호랑나비(파필리오 크레스폰테스); 오렌지잎말이나방(아르자이로태니아 시트라나); 복숭아순나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아가지천공충(아나시아 리네아텔라); 소나무나비(네오파시아 메나피아); 파드웜(헬리오코베르파 제아); 빨간줄잎말이나방(아르자이로태니아 벨루티나나); 레드험프드애벌레(시주라 콘신나); 린드웜컴플렉스(다양한 Leps.); 말안장등애벌레(시비네 스티물레아); 새들프로미넌트애벌레 헤테로캄파 구티비타); 염습지애벌레(에스티그메네 아크레아); 잔디웹웜(크람부스 spp.); 자나방(엔노모스 서브시그나리아); 가을철구충(알소필라 포메타리아); 가문비나무잎말이나방(코리스토뉴라 푸미페라나); 텐트애벌레(다양한 솔나방과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르) 테클라 바실리데스); 박각시나방애벌레(만두카 섹스타); 담배나방(에페스티아 엘루텔라); 술모양사과싹나방(플라타이노타 이대우살리스); 비단벌레(아나르시아 리네아텔라); 점박이야도충(페리드로마 사우시아); 점박이잎말이나방(플라타이노타 플라베다나); 벨벳콩애벌레(안티카르시아 젬마탈리스); 호두애벌레(다타나 인테게리마); 미국흰불나방(하이판트리아 쿠네아); 서부터삭나방(오르자이아 베투스타); 남부옥수수줄기천공충(디아트래아 크람비도이데스); 왕담배나방; 고구마바구미; 고추바구미; 감귤류뿌리바구미; 딸기뿌리바구미; 피칸바구미; 개암나무바구미; 미음바구미; 알팔파바구미; 클로버바구미; 차천공충; 뿌리바구미; 사탕수수장수풍뎅이; 커피베리천공충; 일년생블루그래스바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 밤색우단풍뎅이(말라데라 카스타네아); 유럽풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색유월딱정벌레(코티니스 니티다); 알풍뎅이(포필리아 자포니카); 오월 또는 유월딱정벌레(필로파가 sp.); 북부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 보레알리스); 알락풍뎅이(아노말라 오리엔탈리스); 남부마스크드풍뎅이(사이클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 곤충이 이집트숲모기; 브루세올라 푸스카; 칠로 서프레살리스; 컬렉스 피피엔스; 컬렉스 퀸퀘파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트래아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌알리스; 펙티노포라 가시피엘라; 플로디아 인터펑크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 나이; 및 잔토갈레루카 루테올라로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  101. 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 서열과 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  102. 제101항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는, 벡터.
  103. TVP를 암호화하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 효모 균주로서, 상기 TVP는 화학식 I에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 효모 균주:
    [화학식 I]
    E-P-D-E-I-C-R-X1-X2-M-X3-N-K-E-F-T-Y-X4-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-X5-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-X6-X7,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 A, S, 또는 N이고; X2는 R, Q, N, A, G, N, L, D, V, M, I, C, E, T, 또는 S이고; X3은 T 또는 P이고; X4는 K 또는 A이고; X5는 R 또는 A이고; Z1은 T, S, A, F, P, Y, K, W, H, A, G, N, L, V, M, I, Q, C, E, 또는 R이고; X6은 K이거나 부재하고; X7은 G이거나 부재함.
  104. 제103항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖는, 효모 균주.
  105. 제103항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 글리신인, 효모 균주.
  106. 제103항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X7이 부재하는, 효모 균주.
  107. 제103항에 있어서, TVP가 X1, X2, X3, X4 또는 X5에서 하나의 아미노산 치환을 갖고; X6 및 X7이 부재하는, 효모 균주.
  108. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, TVP가 서열 번호 2-15, 49-53, 또는 77-110 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 효모 균주.
  109. 제103항에 있어서, TVP가 서열 번호 17-30, 54-58, 또는 117-150 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 효모 균주.
  110. 제103항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속에 속하는 임의의 종으로부터 선택되는, 효모 균주.
  111. 제110항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비지애 및 피치아 파스토리스로 구성되는 군으로부터 선택되는, 효모 균주.
  112. 제111항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스인, 방법.
  114. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP:
    [화학식 II]
    E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A임.
  115. 제114항에 있어서, Z1이 T인 경우, 글리코실화되는 TVP.
  116. 제114항에 있어서, X1은 Q이고; Z1은 A인, TVP.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는 TVP.
  118. 제116항에 있어서, 서열 번호 17, 54 또는 56 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 TVP.
  119. TVP, 및 하나 이상의 부형제로 구성되는 조성물로서; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
    [화학식 II]
    E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이고; 하나 이상의 부형제는 트레할로스; 말토덱스트린; 말토스; 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 리그노설포네이트; 석고; 소르비톨; 벤조산나트륨; 소르브산칼륨; EDTA; 벤즈이소티아졸리논(BIT); 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  120. 제119항에 있어서, Z1이 T인 경우, TVP가 글리코실화되는, 조성물.
  121. 제119항에 있어서, X1이 Q이고; Z1이 A인, 조성물.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 조성물.
  123. 제119항에 있어서, TVP가 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이한, 조성물.
  124. 제119항에 있어서, TVP가 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는, 조성물.
  125. 제124항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인, TVP.
  126. 제125항에 있어서, 절단가능 링커가 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, TVP.
  127. 제125항에 있어서, 링커가 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP.
  128. 제119항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 부형제가 트레할로스; 말토덱스트린; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); BIT; 및 발효 고체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  129. 제128항에 있어서, 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP가 약 2% 내지 약 16% w/w 범위이고; 트레할로스가 약 5% 내지 약 40% w/w 범위이고; BIT가 약 0.01% 내지 약 0.1% w/w 범위이고; 말토덱스트린이 약 10% 내지 약 50% w/w 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)이 약 1% 내지 약 5% w/w 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)이 약 0.10% 내지 약 1% w/w 범위이고; 발효 고체가 약 15% 내지 약 40% w/w 범위인, 조성물.
  130. 제129항에 있어서, 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP가 약 7% 내지 약 9% w/w 범위이고; 트레할로스가 약 20% 내지 약 30% w/w 범위이고; BIT가 약 0.025% 내지 약 0.075% w/w 범위이고; 말토덱스트린이 약 30% 내지 약 40% w/w 범위이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)이 약 2% 내지 약 3% w/w 범위이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)이 약 0.2% 내지 약 0.6% 범위이고; 발효 고체가 약 20% 내지 약 30% 범위인, 조성물.
  131. 제130항에 있어서, 조성물의 총 중량을 기준으로 TVP가 약 8.5% w/w이고; 트레할로스가 약 25% w/w이고; BIT가 약 0.05% w/w이고; 말토덱스트린이 약 36.3% w/w이고; 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)이 약 2.6% w/w이고; 일염기성 인산칼륨(KH2PO4)이 약 0.4% w/w이고; 발효 고체가 약 26.85% w/w인, 조성물.
  132. 제119항에 있어서, 본질적으로 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP; 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성되는 조성물.
  133. 제119항에 있어서, 하기: 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP; 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성되는 조성물.
  134. TVP, 및 복수의 부형제로 구성되는 조성물로서; TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 화학식 II에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며:
    [화학식 II]
    E-P-D-E-I-C-R-A-X1-M-T-N-K-E-F-T-Y-K-S-N-V-C-N-N-C-G-D-Q-V-A-A-C-E-A-E-C-F-R-N-D-V-Y-Z1-A-C-H-E-A-Q-K-G,
    식 중, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 U1-아가톡신-Ta1b의 야생형 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, X1은 R 또는 Q이고; Z1은 T 또는 A이고; 조성물은 조성물의 총 중량의 8.5% w/w인 양의 TVP로 구성되고; 복수의 부형제는 조성물의 총 중량의 25% w/w인 양의 트레할로스; 0.05% w/w인 양의 BIT; 36.3% w/w인 양의 말토덱스트린; 2.6% w/w인 양의 무수 이염기성 인산칼륨(K2HPO4); 0.4% w/w인 양의 일염기성 인산칼륨(KH2PO4); 및 26.85% w/w인 양의 발효 고체로 구성되는, 조성물.
  135. 제134항에 있어서, Z1이 T인 경우, TVP가 글리코실화되는, 조성물.
  136. 제134항에 있어서, X1이 Q이고; Z1이 A인, 조성물.
  137. 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노 서열을 포함하는, 조성물.
  138. 제134항에 있어서, TVP가 2개 이상의 TVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이한, 조성물.
  139. 제134항에 있어서, TVP가 절단가능 링커 또는 절단불가능 링커에 의해 분리된 2개 이상의 TVP를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 TVP의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는, 조성물.
  140. 제139항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인, TVP.
  141. 제140항에 있어서, 절단가능 링커가 곤충의 장 또는 혈액림프 내부에서 절단될 수 있는, TVP.
  142. 제141항에 있어서, 링커가 서열 번호 61-70 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, TVP.
  143. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 TVP.
  144. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 서열 번호 2, 49 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 TVP.
  145. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 2, 49, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 구성되는 TVP.
  146. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TVP.
  147. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TVP.
  148. 살충 U1-아가톡신-Ta1b 변이체 폴리펩티드(TVP)로서, 상기 TVP 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 TVP.
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