CN105420316B - 一种杀虫性融合蛋白的发酵制备方法及其发酵产物的杀虫组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀虫性融合蛋白的发酵制备方法及其发酵产物的杀虫组合物，属于害虫防治领域，其发酵制备方法包括：融合蛋白种子液的准备、接种融合蛋白种子液，融合蛋白发酵产物大量表达阶段，其特征在于：在步接种融合蛋白种子液之前需要完成发酵培养基的预培养，在融合蛋白发酵产物大量表达阶段具有动态调整的补料的过程，这种制备发酵方法能够实现了来实现蛋白的高效稳定表达。将表达后的产物通过筛选与其相匹配的溶剂、保护剂、乳化剂、分散剂、保湿剂组成杀虫组成物，具有杀虫物质稳定性好、分散效果好、田间实用性强、杀虫广谱的优点，对多种害虫均具有高效灭杀的效果。

Description

一种杀虫性融合蛋白的发酵制备方法及其发酵产物的杀虫组 合物

技术领域：

本发明属于害虫防治领域，具体涉及一种杀虫性融合蛋白的发酵制备方法及其发酵产物的杀虫组合物。

背景技术：

在害虫防治领域，采用基因技术来实现害虫防治较为成熟的仅有Bt和CpTI基因。随着采用生物技术来进行害虫防治需求的增大，将两个或多个对害虫具有抑制作用的基因序列重组形成融合蛋白来实现害虫的防治进一步受到人们的关注。

然而利用毒素蛋白或者对害虫具有抑制作用的基因序列重组形成融合蛋白的技术在实际应用上存在蛋白表达量不可控、获得成本高、蛋白不易纯化、活性蛋白产物少、蛋白活性易受应用环境的影响而造成其活性的丧失等一系列问题，从而造成了融合蛋白在害虫防治领域的应用方面受到限制。

因此，需要一种适合于融合蛋白表达方法来实现杀虫性融合蛋白稳定大量的表达。同时，对于蛋白表达产物采用适当的方法制作成合适的制剂来满足害虫防治的田间应用。

发明内容：

本发明根据抗虫性融合蛋白在蛋白表达过程中的需要、蛋白表达产物特点、以及田间害虫防治的应用需求，采用一种杀虫性融合蛋白规模发酵制备方法来实现蛋白的高效稳定表达，并将表达后的产物通过筛选与其相匹配的物质的组合来开发出一种基于融合蛋白发酵产物的杀虫组合物，来满足目标害虫防治的田间需求。

技术方案如下：

1、一种杀虫性融合蛋白的发酵制备方法，其步骤包括：

（1）融合蛋白种子液的准备，

（2）接种融合蛋白种子液，

（3）融合蛋白发酵产物大量表达阶段；

其特征在于：

在步骤（2）接种融合蛋白种子液之前需要完成发酵培养基的预培养，

在步骤（3）融合蛋白发酵产物大量表达阶段具有补料过程，其中，补料液的流速可随着接种的时间的延长进行动态调整。

在融合蛋白表达过程中，增加了对发酵培养基预培养的步骤，使发酵罐的环境达到适合真核酵母的生长，有助于融合蛋白的表达；在融合蛋白发酵产物大量表达阶段采用动态调整的方式进行补料，有助于融合蛋白高效稳定的表达，从而获得含量高、杀虫活性强的发酵产物融合蛋白。

2、根据技术方案1所述的发酵制备方法，其特征在于：所述融合蛋白至少包括：一种植物凝集素蛋白、一种毒素蛋白，其特征在于，融合蛋白的连接顺序为：所述植物凝集素蛋白与毒素蛋白连接，所述融合蛋白具有杀虫效果。

采用植物凝集素蛋白和毒素蛋白重组形成融合蛋白，其中植物凝集素能结合到昆虫消化道上皮细胞糖蛋白受体上，对昆虫产生局部或系统的毒害作用，从而抑制其生长，甚至将其杀死；它还能在昆虫消化道内诱发病灶，促进消化道中细菌的繁殖，对害虫本身造成伤害，抑制害虫生长发育繁殖，对昆虫的作用部位主要在中肠的表皮细胞，引起其中肠微绒毛膜破裂，边缘部分发生病变,引起细菌在微绒毛区增殖，使细胞溶解；中肠表皮细胞发生异常变化，功能结构受到破坏，引起死亡，有的甚至可以穿过消化系统进入血淋巴循环系统。而毒素蛋白可作用于昆虫的神经元离子通道，融合蛋白同时在昆虫的消化道和神经系统发挥作用，从而起到防治害虫的作用。选用蛋白特定的连接顺序是考虑到该连接序列在翻译后形成的氨基酸序列不影响毒素蛋白和植物凝集素的空间结构，并更好的发挥融合蛋白的杀虫作用。

3、根据技术方案2所述的融合蛋白，其特征在于：所述毒素蛋白为蜘蛛毒素蛋白或者与蜘蛛毒素蛋白功能等同的毒性蛋白。蜘蛛毒素对于靶向昆虫的神经系统具有损伤作用，但对哺乳动物、蜜蜂无毒，无害，对环境无污染。

4、根据技术方案3所述的融合蛋白，其特征在于：所述植物凝集素为雪花莲凝集素（GNA）或者与雪花莲凝集素功能等同的植物凝集素。

雪花莲凝集素可以和昆虫围食膜表面、消化道上皮细胞的糖缀合物、或糖基化的消化酶等结合，诱发昆虫消化道产生病灶而达到杀虫的目的。同时，克服了蜘蛛毒素易被昆虫消化道中消化蛋白水解的难题。与雪花凝集素功能等同的植物凝集素包括伴刀豆凝集素（ConA）、大蒜凝集素等植物凝集素，上述植物凝集素对人、畜以及蜜蜂无害。

5、根据技术方案1所述的发酵制备方法，其特征在于：所述融合蛋白发酵产物是由毕赤酵母将融合蛋白运用真核发酵的方式进行蛋白表达。

选择毕赤酵母真核表达体系进行融合蛋白的表达，具有表达量高，发酵产物易纯化，易实现高密度发酵等优点，并在表达过程中，可使融合蛋白经过正确的糖基化和蛋白酶剪切，从而得到活性高的融合蛋白。

6、根据技术方案6所述的融合蛋白发酵产物，其特征在于：所述毕赤酵母为SMD1168H、KM71、GS115、YPH499、 YPH500 、YPH501的一个株系或几个株系的混合物。在毕赤酵母的众多株系中经过试验筛选出以上株系，对融合蛋白的表达效果更好。

7、根据技术方案1所述的发酵制备方法，所述发酵培养基的预培养的具体方法如下：

向发酵罐中按体积比加入20%-35%的BSM培养基，pH调节剂为30%-60%的氨水，参数设置为空气压力0.03MPa-0.06MPa，温度23℃-32℃，pH为3-4.5，转速200rpm-300rpm，运行55h-75h，完成培养基的预培养，其中，BSM培养基为最小缓冲甲醇培养基。该步骤为接种种子液后的酵母菌落提供最佳生长环境，缩短了种子液在发酵罐中的适应期。

8、根据技术方案1所述的发酵制备方法，所述融合蛋白种子液的准备的具体方法如下：

挑取含有融合蛋白基因片段的毕赤酵母菌株单菌落接种于的无抗性的YPG液体培养基中，在28℃-32℃，180rpm-250rpm环境中摇床培养48-75h，其中，YPG液体培养基为酵母提取物、蛋白胨、蔗糖培养基。该方法适合于表达融合蛋白的酵母菌落的生长，使酵母生长进入对数生长期，菌落生命力旺盛、适宜环境快、生长繁殖快，缩短在发酵罐中的非产物合成时间。

9、根据技术方案1所述的发酵制备方法，所述接种融合蛋白种子液的具体方法如下：

（1）向预培养的发酵罐中加入PTM1，PTM1与BSM培养基的体积比为3:1000-7:1000；

（2）在发酵罐中接种种子液，其中种子液与BSM培养基的体积比为1:20-3:20，完成后进行发酵培养，培养条件为：转速400rpm-750rpm，pH为3.7-4.1，温度28℃-32℃。

该方法为酵母菌种生长提供合适的营养成分，使进入新环境发酵罐中的种子液迅速进入快速生长期，显著提高了融合蛋白的表达量。

10、根据技术方案1所述的发酵制备方法，所述融合蛋白发酵产物大量表达阶段的具体方法如下：

补料过程：在接种后10h进行补料，补料液的流速为5mL/h，补料时间为12h-20h，将转速调至700rpm-1000rpm，补料液流速调整为10mL/h，补料时间为12h-15h，此后，补料流速在上次补料流速的基础上逐级递增4-8mL/h，单次补料时间为12h-15h；

本阶段共持续70h-90h，在本阶段需要保持溶氧25%-35%，连接消泡剂；大量表达阶段结束后可直接离心获得融合蛋白发酵产物；

所述补料液的主要成份包括消泡剂、50%的甘油、PTM1，其中，50%的甘油与消泡剂、PTM1体积比为125:20:1-200:40:3。

该阶段为蛋白分泌到酵母细胞外提供合适的条件，为酵母快速生长提供最佳条件，显著提高了融合蛋白的表达量。其中，所述50%的甘油为甘油与水的体积比为1:1。

11、一种杀虫组合物，其特征包含利用根据技术方案1所述的方法制造的融合蛋白发酵产物以及溶剂、保护剂、乳化剂、分散剂、保湿剂，其特征在于：各组分按照杀虫组合物的质量比分别为：融合蛋白发酵产物5%-35%、溶剂30%-60%、保护剂1%-20%、乳化剂0.1%-10%、分散剂0.1%-10%、以及保湿剂1%-10%。

将融合蛋白的发酵产物作为有效成分，通过筛选溶剂、保护剂、乳化剂、分散剂、保湿剂，制备成稳定性好、分散效果好，具有对半翅目的盲蝽蟓、同翅目桃蚜、豌豆蚜等、鳞翅目的甘蓝夜蛾等多种害虫具有明显的抗虫作用，具有杀虫谱广的优点。

12、根据技术方案11所述的杀虫组合物，其特征在于：所述的溶剂为磷酸盐缓冲液、磷酸盐-氯化盐的缓冲液中的一种或两种组合，其溶剂的pH6-8。

溶剂是pH6-8为磷酸盐缓冲液、磷酸盐-氯化盐的缓冲液中的一种或两种组合，代替农用杀虫剂中常用的有机溶剂，减少了环境污染，而且融合蛋白在该pH范围稳定性最佳。

13、根据技术方案11所述的杀虫组合物，其特征在于：所述保护剂为乙二醇、氯化钙、葡萄糖、山梨酸钾中的一种或几种组合。

乙二醇可以抵御田间环境温度变化，氯化钙可以维持蛋白正确的空间结构，葡萄糖可以增强对环境的抗逆耐受力，山梨酸钾可以抑制有害微生物分解融合蛋白。

14、根据技术方案11所述的杀虫组合物，其特征在于：所述乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、烷基苯硫酸钙中的一种或几种组合。

15、根据技术方案11所述的杀虫组合物，其特征在于：所述分散剂为有机硅聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯醚中的一种或几种组合。

以上几种物质的组合物可以有效的降低水的表面张力，使发酵产物融合蛋白在田间使用时形成稳定、易于分散的水溶液体系。

综上所述，本发明提供一种杀虫性融合蛋白发酵制备方法，通过筛选适合的发酵工艺来实现融合蛋白的高效表达，具有操作简易、生长速度快、表达量高、易于回收、成本低等优点，其融合蛋白表达量可达1.5 %。将采用本方法获得的融合蛋白的发酵产物作为主要成分，并根据其特点，通过筛选合适的溶剂、保护剂、乳化剂、分散剂、保湿剂组成杀虫组成物，具有杀虫物质稳定性好、分散效果好、田间实用性强、杀虫广谱的优点，对半翅目的盲蝽蟓、同翅目桃蚜、豌豆蚜等、鳞翅目的甘蓝夜蛾、棉铃虫等多种害虫均具有高效灭杀的效果，其防治效果可达95%以上。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步的说明，实施例不应该当作对本发明的限制。

实施例一：

本发明：采用本专利所述方法进行融合蛋白产物的发酵，具体方法如下：

发酵培养基预培养：向发酵罐中加入20%（V/V)的BSM培养基，pH调节剂为30%的氨水，参数设置为空气压力0.03MPa，温度23℃，pH为3，转速200rpm，运行55h，完成培养基的预培养，其中，BSM培养基为最小缓冲甲醇培养基。

融合蛋白种子液的准备：挑取含有融合蛋白基因片段的融合蛋白的单菌落接种于无抗性的YPG液体培养基中，在28℃，180rpm环境中摇床培养48h，其中，YPG液体培养基为酵母提取物、蛋白胨、蔗糖培养基。

接种融合蛋白种子液：向预培养的发酵罐中加入PTM1，PTM1与BSM培养基的体积比为3:1000；在发酵罐中接种种子液，其中种子液与BSM培养基的体积比为1:20，完成后进行发酵培养，培养条件为：转速400rpm，pH为3.7，温度为28℃。

融合蛋白发酵产物大量表达阶段：

补料过程：在接种后10h进行补料，补料液的流速为5mL/h，补料时间为12h，将转速调至700rpm，补料液流速调整为10mL/h，补料时间为12h，此后，补料流速在上次补料流速的基础上逐级递增4mL/h，单次补料时间为12h；

本阶段共持续70h，在本阶段需要保持溶氧25%，连接消泡剂；大量表达阶段结束后可直接离心获得融合蛋白发酵产物；

所述补料液的主要成份包括消泡剂、50%的甘油、PTM1，其中，50%的甘油与消泡剂、PTM1体积比为125:20:1。

上述步骤得到：抗虫性的融合蛋白发酵产物A。

对比实验1：与本发明相比，除减少发酵培养基预培养步骤外，其余融合蛋白种子液的准备、接种融合蛋白种子液、融合蛋白发酵产物大量表达阶段步骤操作均相同，得到抗虫性的融合蛋白发酵产物B。

将抗虫性融合蛋白发酵产物A与抗虫性融合蛋白发酵产物B在融合蛋白浓度方面进行比较，结果如下：

不同方法融合蛋白表达量比较表1

融合蛋白发酵产物	融合蛋白浓度
		A	1.52%
B	0.58%

由上表1可知：本发明所采用的发酵方法所获得融合蛋白的发酵产物A的蛋白浓度为1.52%，而对比试验1获得的融合蛋白的发酵产物B的融合蛋白浓度仅为0.58%，是发酵产物A的蛋白浓度的38%。

用人工饲料带毒法进行棉铃虫幼虫的生物测定，用蛋白发酵产物A、蛋白发酵产物B分别配成成含融合蛋白0.2%的人工饲料，对照为水，每个处理24头大小一致的2龄幼虫，每个处理3次重复，其中：

死亡率=（对照死亡数-处理死亡数），

每天记录死亡情况，具体如下：

蛋白发酵产物对棉铃虫致死率分析表2

	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天
								融合蛋白发酵产物A	87.5%	95.83%	100%	100%	100%	100%	100%
融合蛋白发酵产物B	33.33%	45.83%	50%	50%	50%	50%	50%
								对照（水）	0	0	0	0	0	0	0

通过对棉铃虫的效果测定分析，具有预培养步骤的获得的蛋白发酵产物A的融合蛋白第3天就能引起棉铃虫幼虫的全部死亡，而无预培养步骤的蛋白发酵产物B对棉铃虫幼虫的效果明显不如蛋白发酵产物A，饲喂7天的致死率仅50%。

实施例二：

本发明：采用本专利所述方法进行融合蛋白产物的发酵，具体方法如下：

发酵培养基预培养：向发酵罐中加入35%（V/V)的BSM培养基，pH调节剂为60%的氨水，参数设置为空气压力0.06MPa，温度32℃，pH为4.5，转速300rpm，运行75h，完成培养基的预培养，其中，BSM培养基为最小缓冲甲醇培养基。

融合蛋白种子液的准备：挑取含有融合蛋白基因片段的融合蛋白的单菌落接种于无抗性的YPG液体培养基中，在32℃，250rpm环境中摇床培养75h，其中，YPG液体培养基为酵母提取物、蛋白胨、蔗糖培养基。

接种融合蛋白种子液：向预培养的发酵罐中加入PTM1，PTM1与BSM培养基的体积比为7:1000；在发酵罐中接种种子液，其中种子液与BSM培养基的体积比为3:20，完成后进行发酵培养，培养条件为：转速750rpm，pH为4.1，温度32℃。

融合蛋白发酵产物大量表达阶段：

补料过程：在接种后10h进行补料，补料液的流速为5mLl/h，补料时间为20h，将转速调至1000rpm，补料液流速调整为10mL/h，补料时间为15h，此后，补料流速在上次补料流速的基础上逐级递增8mL/h，单次补料时间为15h；

本阶段共持续90h，在本阶段需要保持溶氧35%，连接消泡剂；大量表达阶段结束后可直接离心获得融合蛋白发酵产物；

所述补料液的主要成份包括消泡剂、50%的甘油、PTM1，其中，50%的甘油与消泡剂、PTM1体积比为200:40:3。

上述步骤得到：抗虫性融合蛋白发酵产物A。

对比实验1：与本发明相比，除融合蛋白发酵产物大量表达阶段，补料过程中，补料液流速全程无调整，均为5mLl/h以外，其余发酵操作步骤均相同，得到抗虫性融合蛋白发酵产物C。

将抗虫性融合蛋白发酵产物A与抗虫性融合蛋白发酵产物C在蛋白表达量方面进行比较，结果如下：

不同方法融合蛋白表达量比较表3

融合蛋白发酵产物	融合蛋白浓度
		A	1.46%
C	0.42%

由上表可知：本发明所采用的发酵方法所获得融合蛋白的发酵产物A的蛋白浓度为1.46%，而对比试验1获得的融合蛋白的发酵产物C的融合蛋白浓度仅为0.42%，是发酵产物A的蛋白浓度的29%，明显低于发酵产物A的蛋白浓度。

用融合蛋白发酵产物A、融合蛋白发酵产物C分别配置成含0.2%的融合蛋白发酵产物，20%的蔗糖的溶液，取上述溶液1.5mL分别滴加至棉球上（以棉球湿润不流淌液滴为准），将棉球放在培养皿中，进行绿盲蝽成虫的防治。

每个处理30头绿盲蝽成虫，每个处理3个重复。

对照为20%的蔗糖溶液。

每12小时记录绿盲蝽的死亡情况，具体如下：

不同融合蛋白发酵产物引起绿盲蝽的致死率分析表4

	12h	24h	36h	48h	60h	72h	84h	96h
									融合蛋白发酵产物A	83.33%	90%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
融合蛋白发酵产物C	23.33%	33.33%	40%	40%	40%	40%	40%	40%
									对照（水）	0	0	0	0	0	0	0	0

通过对绿盲蝽的效果测定，采用本发明发酵制备方法的制备融合蛋白产物A在36h时，就能引起棉铃虫的全部死亡，而采用对比实验1补料液流速全程无调整的发酵方式制备的融合蛋白产物B对绿盲蝽的防治效果明显差于融合蛋白产物A，饲喂96h的死亡率仅为40%。

实施例三：

杀虫组成物1：将以下组分按照杀虫组合物的质量比分别为：根据实施例1本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物35%、溶剂磷酸盐缓冲液45%、保护剂乙二醇1%、乳化剂烷基酚聚氧乙烯醚0.05%、蓖麻油聚氧乙烯醚0.05%、分散剂有机硅聚氧乙烯醚0.1%、保湿剂黄原胶5%，其余为水，形成杀虫组合物1。

处理A：杀虫组合物2，除未添加溶剂磷酸盐缓冲液外，其他组分按照杀虫组合物的质量比分别为：融合蛋白发酵产物35%、保护剂乙二醇1%、乳化剂烷基酚聚氧乙烯醚0.05%、蓖麻油聚氧乙烯醚0.05%、分散剂有机硅聚氧乙烯醚0.1%、保湿剂黄原胶5%，其余为水，形成杀虫组合物2。

对照：将水代替杀虫组合物。

采用定点定株调查药效， 每种杀虫组合物定点调查20株。于药前先调查棉铃虫虫口基数，药后1、3、7、14天调查防治效果， 分别记录各小区棉铃虫幼虫数量。

虫口减退率＝（药前虫口基数－药后虫口数）×100%/药前虫口基数；

防治效果＝(处理区虫口减退率－对照区虫口减退率)×100%/(1-对照区虫口减退率)。

进行不同杀虫组合物对棉铃虫田间防治效果实验，具体见下表：

不同杀虫组合物对棉铃虫田间防治效果表5

杀虫组合物	1天	3天	7天
				1	84%	92%	97%
2	50%	52%	42%

由上表5可知：杀虫组合物组成成分中未包含磷酸盐缓冲液溶剂的杀虫组合物2对棉铃虫的田间防治效果明显低于杀虫组合物1。

实施例四：

杀虫组成物1：将以下组分按照杀虫组合物的质量比分别为：根据实施例1本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物5%，溶剂磷酸盐-氯化盐缓冲液60%，保护剂氯化钙10%，乳化剂壬基酚聚氧乙烯醚10%、分散剂脂肪醇聚氧乙烯醚5%、保湿剂甘油1%，其余为水。

处理B：杀虫组合物3，除未添加保护剂氯化钙外，其他组分按照杀虫组合物的质量比分别为：根据实施例1本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物5%，溶剂磷酸盐-氯化盐缓冲液60%，乳化剂壬基酚聚氧乙烯醚10%、分散剂脂肪醇聚氧乙烯醚5%、保湿剂甘油1%，其余为水。

对照：水

采用五点采样法调查药效， 每点调查5株，每个处理共调查25株。于药前先调查麦长管蚜虫口基数，药后1、3、7、14天调查防治效果， 分别记录各小区麦长管蚜数量。

虫口减退率＝（药前虫口基数－药后虫口数）×100%/药前虫口基数；

防治效果＝(处理区虫口减退率－对照区虫口减退率)×100%/(1-对照区虫口减退率)。

进行不同杀虫组合物对麦长管蚜田间防治效果实验，具体见下表：

不同杀虫组合物对麦长管蚜田间防治效果分析表6

杀虫组合物	1天	3天	7天	14天
					1	89%	95%	98%	98%
3	68%	43%	31%	23%

由上表6可知：杀虫组合物组成成分中未包含保护剂氯化钙的杀虫组合物3对麦长管蚜的田间防治效果明显低于杀虫组合物1，而且杀虫组合物1的持效期长达21天。

实施例五：

杀虫组成物1：将以下组分按照杀虫组合物的质量比分别为：根据实施例2本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物15%，溶剂磷酸盐缓冲液30%，保护剂葡萄糖10%、山梨酸钾10%，乳化剂苯乙基酚聚氧乙烯醚5%，分散剂脂肪醇聚氧乙烯醚4%、脂肪酸聚氧乙烯醚6%，保湿剂甘油2.5%，其余为水。

处理C：杀虫组合物4，除未添加乳化剂苯乙基酚聚氧乙烯醚外，其他组分按照杀虫组合物的质量比分别为：本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物15%，溶剂磷酸盐缓冲液30%，保护剂葡萄糖10%、山梨酸钾10%，分散剂脂肪醇聚氧乙烯醚4%、脂肪酸聚氧乙烯醚6%，保湿剂甘油2.5%，其余为水。

对照：水

采用五点采样法调查药效， 每点调查5株，每个处理共调查25株。于药前先调查绿盲蝽虫口基数，药后1、3、7、14天调查防治效果， 分别记录各小区绿盲蝽数量。

虫口减退率＝（药前虫口基数－药后虫口数）×100%/药前虫口基数；

防治效果＝(处理区虫口减退率－对照区虫口减退率)×100%/(1-对照区虫口减退率)。

进行不同杀虫组合物对绿盲蝽的田间防治效果实验，具体见下表：

不同杀虫组合物对绿盲蝽的田间防治效果表7

杀虫组合物	1天	3天	7天
				1	89%	95%	98%
4	48%	33%	21%

由上表7可知：杀虫组合物组成成分中未包含乳化剂苯乙基酚聚氧乙烯醚的杀虫组合物4对绿盲蝽的田间防治效果明显低于杀虫组合物1，并且杀虫效果随着药后时间的延长而急剧下降。

实施例六：

杀虫组成物1：将以下组分按照杀虫组合物的质量比分别为：根据实施例2本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物27%，溶剂磷酸盐缓冲液35%，保护剂乙二醇2%、山梨酸钾3%，乳化剂壬基酚聚氧乙烯醚0.7%，烷基苯硫酸钙2%，分散剂脂肪酸聚氧乙烯醚2.5%，保湿剂黄原胶1.5%，其余为水。

处理D：杀虫组合物5，除未添加分散剂脂肪酸聚氧乙烯醚外，其他组分按照杀虫组合物的质量比分别为：根据实施例2本发明发酵制备方法所得到的融合蛋白发酵产物27%，溶剂磷酸盐缓冲液35%，保护剂乙二醇2%、山梨酸钾3%，乳化剂壬基酚聚氧乙烯醚0.7%，烷基苯硫酸钙2%，保湿剂黄原胶1.5%，其余为水。

对照：水

采用五点采样法调查药效， 每点调查5株，每个处理共调查25株。于药前先调查甘蓝夜蛾虫口基数，药后1、3、7、14天调查防治效果， 分别记录各小区甘蓝夜蛾数量。

虫口减退率＝（药前虫口基数－药后虫口数）×100%/药前虫口基数；

防治效果＝(处理区虫口减退率－对照区虫口减退率)×100%/(1-对照区虫口减退率)。

进行不同杀虫组合物对甘蓝夜蛾的田间防治效果实验，具体见下表：

不同杀虫组合物对甘蓝夜蛾的田间防治效果分析表8

杀虫组合物	1天	3天	7天
				1	92%	96%	98%
5	42%	30%	18%

由上表8可知：杀虫组合物组成成分中未包含分散剂脂肪酸聚氧乙烯醚的杀虫组合物5对甘蓝夜蛾的田间防治效果，药后第一天的防治效果最好仅为42%，显著低于杀虫组合物1。

Claims (10)

1.一种杀虫性融合蛋白的发酵制备方法，其步骤包括：

（1）融合蛋白种子液的准备，

（2）接种融合蛋白种子液，

（3）融合蛋白发酵产物大量表达阶段；

其特征在于：

在步骤（2）接种融合蛋白种子液之前需要完成发酵培养基的预培养；

在步骤（3）融合蛋白发酵产物大量表达阶段具有补料过程，其中补料液的流速随着接种的时间的延长进行动态调整；

所述融合蛋白发酵产物大量表达阶段的具体方法如下：

补料过程：在接种后10h进行补料，补料液的流速为5mL/h，补料时间为12h-20h，将转速调至700rpm-1000rpm，补料液流速调整为10mL/h，补料时间为12h-15h，此后，补料流速在上次补料流速的基础上逐级递增4-8mL/h，单次补料时间为12h-15h；

本阶段共持续70h-90h，在本阶段需要保持溶氧25%-35%，连接消泡剂。

2.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于：所述融合蛋白至少包括：一种植物凝集素蛋白、一种毒素蛋白；所述毒素蛋白为蜘蛛毒素蛋白；所述植物凝集素为雪花莲凝集素、伴刀豆凝集素（ConA）或者大蒜凝集素。

3.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于：所述融合蛋白发酵产物由毕赤酵母或啤酒酵母将融合蛋白运用真核发酵的方式进行蛋白表达；所述毕赤酵母为SMD1168H、KM71、GS115的一个株系或几个株系的混合物，所述啤酒酵母为YPH499、 YPH500、YPH501的一个株系或几个株系的混合物。

4.根据权利要求1所述的发酵制备方法，所述发酵培养基的预培养的具体方法如下：

向发酵罐中按体积比加入20%-35%的BSM培养基，pH调节剂为30%-60%的氨水，参数设置为空气压力0.03MP-0.06MPa，温度23℃-32℃，pH为3-4.5，转速200rpm-300rpm，运行55h-75h，完成培养基的预培养，其中，BSM培养基为最小缓冲甲醇培养基。

5.根据权利要求1所述的发酵制备方法，所述融合蛋白种子液的准备的具体方法如下：

挑取含有融合蛋白基因片段的毕赤酵母菌株单菌落接种无抗性的YPG培养基中，在28℃-32℃，180-250rpm环境中摇床培养48h-75h，其中，YPG培养基为酵母提取物、蛋白胨、蔗糖培养基。

6.根据权利要求1所述的发酵制备方法，所述接种融合蛋白种子液的具体方法如下：

（1）向预培养的发酵罐中加入PTM1，PTM1与BSM培养基的体积比为3:1000-7:1000；

（2）在发酵罐中接种种子液，其中种子液与BSM培养基的体积比为1:20-3:20，完成后进行发酵培养，培养条件为：转速400rpm-750rpm，pH为3.7-4.1，温度28℃-32℃。

7.根据权利要求1所述的发酵制备方法，所述融合蛋白发酵产物大量表达阶段结束后离心获得融合蛋白发酵产物；所述补料液的主要成份包括消泡剂、50%的甘油、PTM1；其中，50%的甘油与消泡剂、PTM1体积比为125:20:1，或者为200:40:3。

8.一种杀虫组合物，其特征包含利用根据权利要求1所述的方法制造的融合蛋白发酵产物以及溶剂、保护剂、乳化剂、分散剂、保湿剂；各组分按照杀虫组合物的质量比分别为：融合蛋白发酵产物5%-35%、溶剂30%-60%、保护剂1%-20%、乳化剂0.1%-10%、分散剂0.1%-10%、以及保湿剂1-10%。

9.根据权利要求8所述的杀虫组合物，其特征在于：所述的溶剂为磷酸盐缓冲液、磷酸盐-氯化盐的缓冲液中的一种或两种组合，其溶剂的pH6-8；所述保护剂为乙二醇、氯化钙、葡萄糖、山梨酸钾中的一种或几种组合。

10.根据权利要求8所述的杀虫组合物，其特征在于：所述乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、烷基苯硫酸钙中的一种或几种组合；所述分散剂为有机硅聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯醚中的一种或几种组合。