CN1798579A - 肿瘤生长抑制的目标 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过操作靶基因表达用于治疗癌症的方法，包括上调，沉默和/或下调所述基因，如分别为EGFR－RP，TRA1，MFGE8，TNFSF13和ZFP236。该方法可用于治疗癌症和/或抑制肿瘤生长，这是通过增强被证实为诸如ICT1030，蛋白，肽药物和基因治疗形式的目标的基因的表达；或通过RNA干扰以沉默和/或下调目标，如ICT1024，ICT1025和ICT1031和ICB1003，它们被证实是抗体，小分子和其他抑制剂药物形式的目标。

Description

肿瘤生长抑制的目标
本申请要求申请日为2003年4月1日的临时申请60/458,948，和申请日为2003年7月24日的临时申请60/489,504的优先权，所述申请的内容被以整体形式收作本文参考。
发明领域
本发明涉及通过操作验证的癌症药物目标的活性或表达治疗疾病的方法，其中，所述目标业已通过在疾病动物模型中操作靶基因表达的方法得到了验证。更具体地讲，本发明涉及诸如ICT 1024，ICT 1025，ICT 1030，ICTB 1031和ICBT 1003的目标的上调，沉默，抑制和/或下调，所述目标是使用siRNA验证的。本发明涉及可用于治疗癌症和/或抑制肿瘤生长的方法，这是通过增强被证实为蛋白，肽和基因治疗药物形式的目标ICT 1030的表达，或通过RNA干扰以便沉默和/或下调被证实为抗体，小分子和其他抑制剂药物形式的目标ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031和ICT 1003的基因。
发明背景
癌或癌前期的生长通常被称为恶性肿瘤，而不是良性肿瘤。良性肿瘤细胞与正常的，周围的细胞类似。只有在肿瘤长大到足以干扰其他器官时才有必要治疗。相反，恶性肿瘤比良性肿瘤生长得更快，并且它们可能穿透并且破坏局部组织。某些恶性肿瘤可能通过血液或淋巴系统扩散到整个身体中。无法预测的和无法控制的生长使得恶性癌症危险，并且在很多场合下是致命的。这些肿瘤与原始组织相比在形态学上不是典型的，并且没有包膜。恶性肿瘤在手术切除之后通常会复发。
很多人类疾病是增殖性细胞病理学的结果。癌或癌前期的生长通常是增殖性细胞病理学的结果，并且，通常被称为恶性肿瘤，而不是良性肿瘤。良性肿瘤细胞与正常的，周围的细胞类似。只有在肿瘤长大到足以干扰其他器官时才有必要治疗。相反，恶性肿瘤比良性肿瘤生长得更快，并且它们可能穿透并且破坏局部组织。某些恶性肿瘤可能通过血液或淋巴系统扩散到整个身体中，并且，它们是无法预测的和不受控制的生长使得恶性癌症危险，并且在很多场合下是致命的。这些肿瘤与原始组织相比在形态学上不是典型的，并且没有包膜。恶性肿瘤在手术切除之后通常会复发。因此，增殖性疾病的治疗通常是针对增殖性细胞活性，如在恶性癌症或恶性肿瘤中所出现的情况，其目的是干预所述增殖过程。
恶性生长的抑制或预防在癌症发展的早期阶段是最有效的。因此，重要的是鉴定并且验证在增强过程中起作用的分子目标，以及它们的诱导，并且，特别是在恶性疾病中，肿瘤形成的早期迹象。具体目标是确定与它相关的潜在的肿瘤生长或基因表达抑制因子或制剂。所述肿瘤生长和/或基因表达和治疗因子或制剂的开发涉及对细胞分裂和分化的遗传控制机制的了解，特别是与肿瘤发生相关。不幸的是，业已确定的适合干预增殖性疾病的蛋白目标是有限的。在少数确定的目标，如生长因子，如EGF及其受体中，少有(如果有)能够适当干预增殖性疾病，如恶性癌症和牛皮癣。
另外，业已证实了鉴定干预细胞增殖性病理学的更好目标的难度。在人类基因组中存在大量的基因和蛋白，并且很多这样的基因和蛋白，以及所述蛋白的翻译后修饰形式与细胞增殖性病理学相关。在许多基因，蛋白，和翻译后修饰的蛋白中，只有少数的特殊因子能够有效靶定干预细胞增殖性病理学。因此，有必要鉴定这些特殊因子。除了必须鉴定特殊基因，蛋白和翻译后修饰的蛋白以便靶定干预增殖性细胞病理学之后，必须证实其他问题，即所靶定的因子在活性病理学组织中的活性病理学中确实提供了有效的干预。不幸的是，在细胞培养条件下的细胞增殖证实了可以靶定的很多因素，但是，最终没有被证实能有效活性病理学组织中的目标。因此，准确鉴定干预增殖性细胞病理学的目标，需要研究活性病理学组织，如在人类疾病的动物模型中。
因此，治疗通常是针对恶性癌症或恶性肿瘤。恶性生长的干预在癌症发育的早期阶段是最有效的。因此，特别重要的是鉴定并且验证肿瘤形成的早期症状的目标，并且确定与它相关的潜在的肿瘤生长或基因表达抑制因子或制剂。所述肿瘤生长和/或基因表达和治疗因子或制剂的开发涉及对细胞分裂和分化的遗传控制机制的了解，特别是与肿瘤形成相关。
RNA干扰(RNAi)是转录后过程，其中，双链RNA(dsRNA)能够以序列特异性方式抑制基因表达。所述RNAi过程是通过至少两个步骤进行的：在第一个步骤中，通过内源性核糖核酸酶将较长的dsRNA裂解成较短的，长度小于100-，50-，30-，23-，或21-核苷酸的dsRNAs，称之为“小的干扰RNAs”或siRNAs。在第二个步骤中，较小的siRNAs介导了目标RNA的降解。可以通过将较长的dsRNA或较短的siRNA导入细胞内的靶序列获得这种RNAi效应。另外，还证实了RNAi效应可以通过导入能产生互补于靶基因的dsRNA的质粒获得。
业已在以下生物中将RNAi成功地用于基因功能确定：果蝇属(Kennerdell等(2000)Nature Biotech 18：896-898；Worby等(2001)Sci STKE Aug 14，2001(95)：PL1；Schmid等(2002)Trends Neurosci 25(2)：71-74；Hammond等(2000)。Nature，404：293-298)，秀丽新杆线虫(Tabara等(1998)Science 282：430-431)Kamath等(2000)Genome Biology 2：2.1-2.10；Grishok等(2000)Science 287：2494-2497)，和斑马鱼(Kennerdell等(2000)Nature Biotech 18：896-898)。在所述模型生物中，业已报道了化学合成的较短的siRNA或体外转录的较长的dsRNA都能有效抑制靶基因表达。有关在非人哺乳动物和人类细胞培养物中成功地获得RNAi效应的越来越多的报道(Manche等(1992)。Mol.Cell.Biol.12：5238-5248；Minks等(1979)。J.Biol.Chem.254：10180-10183；Yang等(2001)Mol.Cell.Biol.21(22)：7807-7816；Paddison等(2002)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(3)：1443-1448；Elbashir等(2001)Genes Dev 15(2)：188-200；Elbashir等(2001)Nature 411：494-498；Caplen等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9746-9747；Holen等(2002)NucleicAcids Research 30(8)：1757-1766；Elbashir等(2001)EMBO J20：6877-6888；Jarvis等(2001)TechNotes 8(5)：3-5；Brown等(2002)TechNotes 9(1)：3-5；Brummelkamp等(2002)Science296：550-553；Lee等(2002)Nature Biotechnol.20：500-505；Miyagishi等(2002)Nature Biotechnol.20：497-500；Paddison等(2002)Genes & Dev.16：948-958；Paul等(2002)NatureBiotechizol.20：505-508；Sui等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6)：5515-5520；Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9)：6047-6052)。
EGFR-RP(验证的目标ICT 1024)：人上皮生长因子受体-相关蛋白，EGFR-RP或EGFR-RS是公开的，GenBank登录号是AK026010，NM_022450，BC014425，AK056708和M99624。
所有真核细胞都包括精细的内在膜系统，它们在细胞内建立了各种膜封闭的区室。质膜在细胞内的细胞器和细胞外流体(ECF)之间起着界面作用，所述流体充满了所有细胞。细胞膜是由脂类和蛋白构成的。质膜中的脂类主要是磷脂，如磷脂酰乙醇胺和胆固醇。磷脂是两亲性的，其分子的烃尾是疏水性的，它的极性头部是亲水性的。由于质膜朝向两侧的水溶液，它的磷脂通过与彼此朝向的疏水性尾形成磷脂双层适应这种情况。与质膜相关的很多蛋白都与它紧密结合。某些与双层中的脂类结合，而另一些是跨膜蛋白-多肽链实际上跨越脂双层。
所有膜蛋白在所述双层中具有特殊的颠倒的或正面向上的取向。某些蛋白是通过具有带正电荷的侧链的残基和带负电荷的端基之间的离子相互作用固定在质膜上的，因为生物学膜倾向于具有净负电荷。其他蛋白是通过烃链的合成后结合固定的，如肉豆蔻酰，棕榈酰，法呢基或gerenyl-gerenyl，或脂类，如糖基磷脂酰肌醇(GPI)，后者将它们限制在靠近它们的蛋白配偶体的区域。其他蛋白是通过离子接触固定在所述表面上的。术语monotopic或外周膜蛋白表示相当浅地穿透到膜表面中的蛋白。很多外周蛋白可以通过提高溶液的离子强度从所述膜中释放。第二种类型的膜蛋白是嵌入或跨膜bitopic或multitopic蛋白。这些蛋白只能够通过用洗涤剂破坏双层从所述膜中释放。
在结构上相关的很多跨膜蛋白在功能上同样是相关的。例如，EGF(上皮生长因子受体)和胰岛素受体属于生长因子受体家族，它们具有非常大的富含二硫化物的细胞外和酪氨酸激酶细胞内结构域，它们是通过一个跨膜螺旋连接的。该家族的大部分成员是单体，并且，配体的结合能诱导所述细胞内酪胺酸激酶结构域的二聚体化和激活。所述胰岛素受体在它的非配体结合状态下是双体，并且在这种场合下，胰岛素的结合可能改变所述单体的亚基间取向，从而可以激活。
跨膜蛋白的另一个重要家族是与受体结合的G蛋白(鸟嘌呤核苷结合蛋白蛋白)的七次跨膜家族。这种受体是哺乳动物细胞中最丰富类型的受体，并且将极其多样的信号导入细胞，这些信号包括从光(视紫红质)到神经递质(毒蝇碱或肾上腺素能受体)，到性相关信号(催产素)。尽管它们的配体激活剂是多样的，这些受体都与G蛋白结合，以便传导它们的信号。在结构上，它们在具有特定拓扑结构的七次跨膜家环方面是类似的。与生长因子受体家族不同，这些蛋白具有较小的膜外环。
转运诸如养分和离子的整合膜蛋白必须与来自周围烃内部的它们的配体隔离。因此，这种蛋白比上述信号传导蛋白更大，并且通常包括若干个亚基。这种类型的一种例子是属于转运蛋白的12次跨膜家族，如GLUT1和抗生素。一种新鉴定的整合膜蛋白家族，菱形家族以来自果蝇的菱形(RHO)蛋白为代表，它是与上皮生长因子(EGF)-依赖性信号传导途径(1，2，3)相关的发育调节剂。它们不仅是在原核生物和真核生物检测到的菱形蛋白的同源物，而且，在该家族中保守的序列形式似乎不是非酶促膜蛋白的典型形式，如转运蛋白(4，5)。具体地讲，有若干种极性氨基酸残基在菱形家族的几乎所有成员中是保守的，表明了具有酶促活性的可能性。由于这些保守残基中有三种是组氨酸，菱形-家族蛋白似乎可能起着金属-依赖性膜蛋白酶(5，6)的作用。不过，最近，业已证实了RHO能够以TGFα-样生长因子Spitz的膜结合前体形式裂解跨膜螺旋(TMH)，使得释放的Spitz激活EGF受体，并且，在RHO中保守的丝氨酸和保守的组氨酸是这种裂解所必须的(7，8)。菱形-家族蛋白似乎是特殊类型的膜内丝氨酸蛋白酶。总之，果蝇属的基因组编码七个RHO共生同源物(paralogs)(现在被命名为RHO1-7，最初的菱形是RHO-1)，其中的至少三种与独特的EGF-依赖性途径相关，表面上通过EGF受体的多种配体的蛋白水解活性。
业已将与多种cDNA序列(登录号.AK026010，NM022450，Z69719，AK056708，BC014425，M99624)具有同源性的人类基因视为小鼠上皮生长因子受体相关序列(EGFR-RS)的直向同源基因，与上皮生长因子受体-相关蛋白类似的假设蛋白，人上皮生长因子受体-相关基因，以及随后的人菱形家族1。所述cDNA序列AK026010，BC014425和NM-022450编码相同的855个氨基酸的蛋白(登录号.BAB 15318，AAH14425和AAA02490)。不过，这种蛋白的生物学活性目前尚不了解。
TRA1(验证的目标ICT1025)：人肿癌排斥抗原，TRA1或热激蛋白gp96或grp94是由GenBank登录号NM_003299，AK025459，BC009195，AY040226，X15187和AF087988公开的。还可参见美国公开号2003/0215874；2003/0054996；和2002/0160496。
通过效力优先形式选择的目标之一，肿瘤排斥抗原-1(TRA-1)被证实在肿瘤中具有增强了的表达，诱导了加速生长。TRA-1又被称作葡萄糖-调控蛋白94(grp94)，gp96，endoplasmiin前体和其他名称，它首先被作为分子伴侣披露的[Hartl FU.(1996)Molecularchaperons in cellular protein folding.Nature381(6583)：571-9]，在内质网中具有与细胞核信号传导，蛋白折叠，分类和分泌相关的重要作用[Nicchitta，C.V.(1998)：Biochemical，cellbiological and immunological issues surrounding theendoplasmic reticulum chaperone GRP94/gp96.Gurrent Opinionin Immunology，10：103-109]。另外，它能产生针对Ca2+消耗应激的保护作用，并且与抗原呈递相关[Tamura，T.P.Peng，K.Liu，M.Daou，P.K.Srivastava，1997：Immunotherapy of tumors withautologous tumor-derived heat shock protein preparation.Science，278：117-120]。另外，它还在肿瘤形成方面发挥重要作用[Udono H，Levey DL，Srivastava PK.(1994)Cellular requirementsfor tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins：tumor rejection antigen gp96 primes CD8＝T cells in vivo.ProNatl Acad Sci USA 91：3077-3081.]。Menoret等[Menoret A，MeflahK，Le Pendu J.(1994)Expression of the 100kDaglucose-regulated protein(GRP100/endoplasmin)is associatedwith tumorigenicity in a model of rat colonadenocarcinoma.IntJ Cancer 56：400-405]报道了在大鼠结肠腺癌的模型中存在TRA-1的超量表达。Gazit等[Gadi Gazit，Jun lu，Amy S.Lee.(1999)De-regulation of GRP stress protein expression in human breastcancer cell lines.Breast Cancer Research and Treatment 54：135-146.]发现了在五个人类乳腺癌细胞系中观察到的TRA-1蛋白的含量与正常人乳腺细胞系相比提高了3-5倍。Cai等[Cai JW.Henderson BW，Shen JW，等(1993)Induction of glucose-regulatedproteins during growth of murine tumor.J Cell Plzysiol 154；229-237]通过研究发现，在肿瘤生长期间，TRA-1的含量增加了，与肿瘤的大小相关。较高的TRA-1含量表明了保护肿瘤细胞和肿瘤免受细胞毒性T-淋巴细胞介导的细胞毒性，并且保护组织培养细胞不受不利的生理学条件的影响[Sugawara S，Takeda K，Lee A，等(1993)Suppression of stress protein GRP78 induction in tumor B/C10MEeliminates resistance to cell mediated cytotoxicity.CancerResearch.53：6001-6005]。公开的结构域数据库揭示了TRA-1在很多人类癌组织中是超量表达的，包括前列腺，乳腺，脑，胃，和软组织肿瘤。在组织培养系统中的超量表达，反义和核糖酶途径直接证实了TRA-1可能保护细胞抗细胞死亡[Little E，Ramakrishnan M，RoyB等(1994)The glucose-regulated proteins(GRP78and GRP94)：Functions，gene regulation，and applications.Crit RevEukaryot Gene Expr 4：1-18，Garrido C，Gurbuxani S，RavagnanL，Kroemer G.(2001).Heat shock proteins：endogenousmodulators of apoptotic cell death.Biochem Biophys Res Commun.286(3)：433-42.，Ramachandra K.Reddy 等(1999).Theendoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94 withCa2+-binding and antiapoptotic properties is a novelproteolytic target of calpain during etoposide-inducedapoptosis.J.Biol.Chem 274：28476-28483]。TRA-1的抗细胞凋亡作用与在肿瘤细胞中的诱导相关，并且可能导致癌症发展和化疗抗性。尽管通常局限于ER，TRA-1业已被证实在若干种细胞类型中能够逃脱KDEL-介导的保留系统。例如，肝细胞和外分泌胰腺细胞通过正常的分泌途径将大量的TRA-1分泌到细胞外空间。在若干种肿瘤细胞系中，TRA-1是可以作为外表面蛋白检测的[Altmeyer A，Maki RG，Feldweg AM，Heike M，Propopov Vt，Masur FK，Srivastava PK(1996)。Tumor-specific cell surface expression of the-KDEL containing，endoplasmic reticular heat shock protein gp96.Int.J.Cancer22；69(4)：340-9]。
业已证实TRA-1能陪伴多种系列的肽，包括来自正常蛋白的肽，以及来自外源和存在于癌或病毒感染细胞中的改变了的蛋白的肽。因此，肿瘤衍生的TRA-1具有肿瘤抗原肽，并且它的来自病毒感染细胞的制剂具有病毒表位。尽管正常情况下TRA-1是细胞内的，坏死的细胞能释放TRA-1肽复合物，这些复合物能够被清除抗原-呈递细胞摄取。所述肽在细胞表面上的呈递导致了T淋巴细胞的刺激，和促炎反应。
业已证实TRA-1与肽的复合物，无论是从细胞中分离的或在体外重建的，可用作有效的疫苗，在动物和人体中产生抗肿瘤免疫反应[Tamura，Y.P.Peng，K.Liu，M.Daou，P.K.Srivastava，1997：Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heatshock protein preparation.Science，278：117-120.]。致癌噬菌体是用单个患者的肿瘤制备的疫苗。业已通过手术从患者体内取出了部分或全部癌组织，并且将一部分组织连夜运送到位于马萨诸塞州的Antigenics′manufacturing facility。在包括胰腺，黑素瘤，肾脏，结肠直肠，胃，和非何杰金淋巴瘤在内的若干种癌中进行的致癌噬菌体临床研究业已获得了非常有希望的结果。它们的分析提供了通过TRA-1呈递的抗原能在患者体内诱导免疫反应和临床反应的非常有利的证据。在用黑素瘤或结肠直肠癌进行的一项研究中，39位黑素瘤患者中有10位对致癌噬菌体治疗出现了临床反应，包括2位患者他们的癌症完全消失了超过2年时间。在评估免疫反应的24位黑色素瘤患者中，有10位表现出增强了的抗黑素瘤T-细胞活性。在结肠直肠癌患者中，在29位患者中的17位患者体内观察到了T-细胞反应，并且似乎与存活相关。致癌噬菌体在黑色素瘤和结肠直肠癌中诱导免疫反应的机制被确定为相同的-证实了大量的潜伏期和早期临床数据，这些数据证实了这种机制在到目前业已试验过的所有癌症和物种中实际上是相同的。
MFGE8(验证的目标ICT 1030)：人乳脂球-EGF因子8蛋白(MFGE8)或乳腺上皮BA46抗原是在GenBank登录号NM_005928和BC003610中披露的。美国专利号6,339,066B1披露了MFGE8相关分子的各个方面，如′蛋白激酶C-eta′(PKC-η)。
TNFSF13(验证的目标ICT 1031)：人肿瘤坏死因子配体超家族成员13(TNFSF13)是在GenBank登录号AK090698和075888中公开的。若干国际专利申请披露了TNFSF13相关分子的特征，如APRIL(增殖诱导配体)，TALL-2(TNF-和APOL-相关的白细胞表达配体2)，和TRDL-1(TNF-相关的死亡配体-1)(例如，参见WO99/12965和WO01/60397)。
ZFP236(验证的目标ICT 1003)：人锌指蛋白236(ZFP236)是在GenBank登录号AK000847中披露的。
发明概述
本发明提供了用于治疗疾病的方法，如治疗癌症，该方法是通过上调，沉默，或下调验证的靶基因表达，通过核酸相互作用，通过导入RNA干扰或其他制剂，如抗体，可溶性受体，和小分子抑制剂等，以调节验证的药物目标的活性，并因此抑制肿瘤生长。
本发明的一方面提供了用于在患有与目标ICT 1030基因的不希望的表达相关的哺乳动物中治疗疾病的方法，例如，癌或癌前期的生长，包括施用能够与目标ICT 1030DNA或RNA相互作用的核酸组合物，其中，所述核酸组合物在导入哺乳动物的组织时能够增强目标ICT 1030基因的表达。
根据本发明的另一方面，将核酸分子导入组织，包括乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，肺组织，淋巴结组织，或卵巢组织，其中，所述核酸分子是诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够增强目标ICT 1030基因表达的分子，或它们的组合。
另一方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织接触能够与目标ICT 1030DNA或RNA相互作用的增强剂，并因此增强目标ICT 1030基因表达。
另一方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织接触能够与目标ICT 1030肽相互作用的增强剂，并因此增强目标ICT 1030基因表达，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，或卵巢组织，其中，所述增强剂是核酸分子，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够增强目标ICT 1030的分子或它们的组合。
本发明的另一方面提供了给有需要的患者施用核酸的方法的方法，其中，所述核酸分子是以裸露的寡核苷酸或载体形式送递的，所述核酸能够与目标ICT 1030基因相互作用。
本发明的另一方面提供了给有需要的患者施用核酸的方法的方法，其中，所述核酸分子是以裸露的寡核苷酸或载体形式送递的，所述核酸能够与目标ICT 1030基因相互作用，其中，所述核酸是作为载体送递的，其中，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒，例如，逆转录病毒或基于腺病毒的载体。
本发明的另一方面提供了通过给有需要的患者施用载体增强基因的体内表达的方法，其中，所述载体包括目标ICT 1030基因，所述核酸能够与目标ICT 1030基因表达相互作用，其中，所述核酸能增强目标ICT 1030基因在哺乳动物细胞内，例如人细胞的表达。
根据本发明的一个方面，本文所披露的目标ICT 1030基因包括选自下组的多核苷酸：a)编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸；b)SEQ ID NO：1所示多核苷酸；和SEQ ID NO：3；或c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
另一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物的与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因的不希望的表达相关的疾病，例如，癌或癌前期的生长的方法，包括施用含有能够与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031DNA或RNA相互作用的抑制剂的核酸组合物，其中，所述核酸组合物在导入哺乳动物的组织时能够减弱目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因的表达。
根据本发明的另一方面，将核酸分子导入组织，包括乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，肺组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物疾病的方法，例如，癌或癌前期的生长，包括施用含有能与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031 DNA或RNA相互作用的抑制剂的核酸组合物，其中，所述抑制剂是siRNA，RNAi，shRNA，反义RNA，反义DNA，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够产生RNA干扰的分子，或它们的组合。
另一方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织接触能够与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031蛋白，DNA或RNA相互作用的抑制剂，并因此减弱目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031活性或基因表达。
另一方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，肺组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
另一方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织与抑制剂接触，其中，所述抑制剂是是siRNA，RNAi，shRNA，反义RNA，反义DNA，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够产生RNA干扰的分子，或它们的组合。
根据本发明的一个方面，上述目标ICT 1031基因包括选自下组的多核苷酸：a)编码SEQ ID NO：5所示多肽的多核苷酸；b)SEQ ID NO：4所示多核苷酸；和c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
根据本发明的一个方面，上述目标ICT 1003基因包括选自下组的多核苷酸：a)编码SEQ ID NO：7所示多肽的多核苷酸；b)SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示多核苷酸；和c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
另一方面，本发明提供了给有需要的患者施用siRNA的方法，其中，所述siRNA分子是以裸露的寡核苷酸形式或以制剂或载体形式送递的，其中，所述siRNA能够与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因或目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031mRNA转录物相互作用，其中，所述siRNA是作为载体送递的，其中，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒，例如，逆转录病毒或基于腺病毒的载体。
本发明的另一方面提供了通过给有需要的患者施用载体而阻断目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因表达的方法，其中，所述载体包括目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031siRNA，其中，所述siRNA能够与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT1003或ICT 1031基因表达相互作用，例如，所述siRNA在诸如人类细胞的哺乳动物细胞中能够导致目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因的转录后沉默。
另一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物的与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因的不希望的表达相关的疾病，例如，癌或癌前期的生长的方法，包括施用含有能够与目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031DNA或RNA相互作用的抑制剂的核酸组合物，其中，所述核酸组合物在导入哺乳动物的组织时能够减弱目标ICT 1024或ICT 1025或ICT 1003或ICT 1031基因的表达。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物疾病，例如，癌或癌前期的生长的方法，包括施用能够与目标ICT 1003 DNA或RNA相互作用的抑制剂的核酸组合物，其中，所述抑制剂是siRNA，RNAi，shRNA，反义RNA，反义DNA，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够产生RNA干扰的分子，或它们的组合。
附图简述
图1表示通过效力优先发现方法鉴定的目标与使用常规方法鉴定的目标不同。所述目标表达的改变是由于送递基因的干扰和疾病过程的动力学。它们更适合药物发现。
图2表示在总共156个选择的目标中，111个目标根据UniGene数据库注释是已知的，并且45种是未知的新型目标。在已知目标中，87％是与肿瘤相关的。如果相同的比例体现了真实情况，我们希望35种目标是新的肿瘤目标。另外，所述命中同样属于若干种肿瘤发生途径。
图3表示验证的两种新的目标：ICT 1030和ICT 1031。在用siRNA体内剔除(knockdown)检验过的特定目标中，2个目标(ICT 1030和ICT 1031)得到了验证，n＝8(每组8个肿瘤)。这两种蛋白是细胞表面因子，具有完全相反的作用。通过特殊siRNA进行的ICT 1030剔除导致了肿瘤生长的增强，与ICT 1031剔除诱导肿瘤生长抑制形成对比。这样，前者可能是蛋白或基因治疗药物，而后者可能是抗体或小分子药物目标。
图4表示选择的目标之一ICT 1003，它是用siRNA剔除在体内进行检验的(每组8个肿瘤)。目标ICT 1003是新的锌指蛋白，并且可能是转录因子。通过特殊siRNA实现了ICT 1003剔除导致了肿瘤生长抑制，因此，这种蛋白可能是siRNA药物目标或小分子药物目标。
图5表示新的目标ICT 1024，登录号.AK026010，NM-022450，人生长因子受体-相关蛋白，EGFR-RP，或EGFR-RS，业已首先通过效力优先发现方法鉴定，这是由于它们在bFGF处理的肿瘤(MDA-MB-435细胞)组织中高度上调的表达。在细胞培养(MDA-MB-435细胞)研究中该基因的siRNA剔除导致了激活的细胞凋亡状态。在异种移植肿瘤(MDA-MB-435细胞)中，该基因的SiRNA剔除导致了肿瘤生长抑制。该基因在若干人类肿瘤中超量表达，包括乳腺和前列腺癌。该基因编码的蛋白具有菱形结构域和跨膜结构域。
图6表示新的目标ICT 1025，NM-003299，人肿瘤排斥抗原，TRA1，HSP gp96，它们是通过效力优先发现方法首先鉴定的，这是因为它们在bFGF治疗的肿瘤(MDA-MB-435细胞)组织中高度上调了的表达。在细胞培养(MDA-MB-435细胞)研究中，该基因的siRNA剔除导致了激活的细胞凋亡状态。在异种移植肿瘤(MDA-MB-435细胞)中该基因的siRNA剔除导致了肿瘤生长抑制。该基因在包括脑，乳腺，结肠，卵巢和前列腺癌在内的若干种人类肿瘤中超量表达。该基因所编码的蛋白具有HSP90的ATP酶结构域和Hsp90蛋白。
图7表示ICT 1024 siRNA设计：选择来自ICT 1024的两个21nt序列作为RNAi-介导的ICT 1024基因表达剔除的目标(SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)。
图8表示ICT 1024 siRNA双链能抑制在裸鼠上形成的异种移植肿瘤的MDA-MB-435细胞生长。
图9表示ICT 1024 siRNA双链在MDA-MB-435细胞培养测定中能诱导细胞凋亡活性。
图10表示根据SAGE/显微阵列分析，ICT 1024在乳腺肿瘤组织中的表达与其他癌基因具有显著的正相关。
图11表示根据Gene Logic GeneExpress分析，ICT 1024在所有I期乳腺肿瘤样品中都得到了高度上调(100％)。
图12表示ICT 1024蛋白与来自各种生物，如酵母，细菌和植物的其他菱形蛋白具有显著的结构同源性(SEQ ID NOs：27-35)。
图13表示ICT 1024是新的人类蛋白，并且仅仅与其他人菱形蛋白在C-末端结构域具有结构同源性(SEQ ID NO：37(ICT 1024)；SEQID NO：38(H菱形2)；SEQ ID NO：39(菱形3)；SEQ ID NO：40(H菱形4)；SEQ ID NO：41(H菱形5)和SEQ ID NO：42(H菱形6)。
图14表示ICT 1024与其他人菱形蛋白不具有DNA或蛋白序列同源性。所述siRNA靶定序列是为了ICT 1024蛋白专门设计的。
图15表示根据多种疏水性分析进行的ICT 1024蛋白的细胞定位和拓扑结构预测。预测了至少6个跨膜结构域，还具有一个有疑问的第7个结构域。不过，所述蛋白的N-末端具有暴露在膜外面的肽的大的部分(1-400或1-590AA)，并且，该区域的至少一部分位于细胞外环境中。
图16表示用于激活EGF相关因子的潜在的蛋白酶活性，基于在昆虫模型中起作用的菱形蛋白的作用的讨论。组氨酸和丝氨酸蛋白酶活性能够膜内裂解EGF样因子的跨膜结构域，导致这些配体的释放，以便激活相应的途径。
图17表示质粒构建体pCI-ICT 1024，它包括全长的cDNA，编码ICT 1024，具有CMV启动子驱动的表达盒。将该质粒转染到MDA-MD-435细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白。
图18表示包括编码N-末端结构域的ICT 1024的cDNA片段的质粒构建体pCI-ICT 1024N。将包括CMV启动子驱动的表达盒的该质粒转染到MDA-MD-435细胞中，导致了高度表达的ICT 1024蛋白片段。
图19表示我们构建的质粒构建体pGEX-5X-3-ICT 1024，它包括编码ICT 1024蛋白的ICT 1024的全长的cDNA。将具有原核启动子驱动的表达盒的该质粒转染到细菌细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白。
图20表示我们构建的质粒构建体pGEX-5X-3-1024N，它包括编码ICT 1024蛋白的N-末端结构域的ICT 1024 cDNA片段。将具有原核启动子驱动的表达盒的该质粒转染到细菌细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白片段。
图21表示我们构建的质粒构建体pGEX-5X-3-ICT 1024C，它包括编码ICT 1024蛋白C-末端结构域的ICT 1024的cDNA片段。将具有原核启动子驱动的表达盒的该质粒转染到细菌细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白片段。
图22表示我们构建的质粒构建体pETBlue-2-ICT 1024，它包括编码ICT 1024蛋白的ICT 1024的全长的cDNA。将具有原核启动子驱动的表达盒的该质粒转染到细菌细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白。
图23表示质粒构建体pETBlue-2-ICT 1024N，它包括编码ICT 1024蛋白N-末端结构域的ICT 1024的cDNA片段。将具有原核启动子驱动的表达盒的该质粒转染到细菌细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白片段。
图24表示我们构建的质粒构建体，它包括编码ICT 1024蛋白C-末端结构域的ICT 1024的cDNA片段。将具有原核启动子驱动的表达盒的该质粒转染到细菌细胞中，得到了高水平表达的ICT 1024蛋白片段。
图25是ICT 1024蛋白编码区1670-3637的验证的序列(SEQ IDNO：58)。
图26(SEQ ID NO：60)是N末端553AA编码区的序列：ICT 1024的1070-2731
图27，(SEQ ID NO：61)是ICT 1024编码区：947-3518的序列
图28，(SEQ ID NO：62)是ICT 1024N末端553aa编码区：947-2600的序列
图29，(SEQ ID NO：64)是ICT 1024编码区的C末端375aa：945-2069的序列
图30，(SEQ ID NO：66)是ICT 1024编码区310-2879的序列
图31，(SEQ ID NO：68)是ICT 1024的N末端400aa的编码区314-1515的序列
图32，(SEQ ID NO：69)ICT 1024的C末端373aa的编码区：308-1431
图33表示ICT 1025cDNA的序列，Genebank登录号NM_003299，肿瘤排斥抗原1或gp96.(SEQ ID NO：70)
图34表示ICT 1025肽的序列，NP003290(SEQ ID NO：71)，被称为肿瘤排斥抗原(gp96)1，葡萄糖调控蛋白，grp94和上皮细胞糖蛋白。
图35表示ICT 1025siRNA设计：选择来自ICT 1025的两种21nt序列作为RNAi-介导的ICT 1025基因表达剔除的目标(SEQ ID NO：72和73)
图36表示ICT 1025特异性siRNA双链在MDA-MB-435细胞中能够剔除TRA-1表达，这种剔除是用RT-PCR检测的信使RNA水平上的和用蛋白质印迹分析检测的蛋白质水平上的。用siRNA剔除ICT1025基因表达已表现出剂量依赖性效果。
图37表示在转染之后48小时之后所观察到了ICT 1025特异性siRNA双链能诱导MDA-MB-435细胞的细胞凋亡活性。
图38表示在转染之后48小时观察到了ICT 1025特异性siRNA双链HT-29细胞的细胞增强的减弱。
图39表示在转染之后48小时观察到了ICT 1025特异性siRNA双链能诱导HT-29细胞的细胞凋亡活性。
图40表示通过重复送递siRNA双链，ICT 1025特异性siRNA双链能抑制在裸鼠上形成异种移植肿瘤的MDA-MB-435细胞的生长。通过ICT 1025剔除导致的肿瘤生长的抑制比hVEGF剔除更强。
图41表示在将对ICT 1025特异的商业单克隆抗体用在MDA-MB-435细胞上时，所述细胞的凋亡活性以剂量依赖性方式急剧提高。
图42表示ICT 1025存在于来自MDA-MB-435细胞和MCF-7/VEGF165细胞的细胞裂解液的膜级份中，它是通过单克隆抗体检测的。
图43表示ICT 1025不仅存在于膜级份中，而且还将细胞外结构域呈递到细胞表面上，是通过生物素化的表面蛋白的单克隆抗体结合检测的。
图44表示在多发性癌组织中的ICT 1025的上调了的表达，是用实质上的RNA分析验证的，使用了由NCI公开的SEGE数据库。
图45表示ICT 1025的结构域构造，具有热激蛋白90结构域和人ATP酶-c结构域。
图46表示人TRA-1和小鼠TRA-1之间的肽序列同源性(SEQ IDNO：71和74)。这两种蛋白是高度相似的。
图47表示TRA-1和热激蛋白90之间的肽序列同源性(SEQ ID NO：71和75)。
图48表示ICT 1025的跨膜结构的预测。
图49表示具有ICT 1025的全长的序列的原核表达载体PGEX53X1025。
图50表示由所述原核系统表达的纯化的ICT 1025蛋白。
图51表示具有ICT 1025的全长的cDNA的真核表达载体pCI-ICT 1025。
图52表示HLa肽基序搜索结果。
图53表示ICT 1025的跨膜生物学的暗示的模型。
图54表示ICT 1025的推测的跨膜片段。
图55表示在乳腺肿瘤细胞中筛选ICT 1025mAB的表面结合活性。
图56表示在结肠瘤细胞中筛选ICT 1025mAB的表面结合活性。
图57表示在接种之前用抗体或siRNA处理肿瘤细胞能抑制肿瘤发生和肿瘤生长。
发明说明
本发明提供了用于抑制肿瘤生长，疾病发展的验证的目标，以及用于抑制和治疗肿瘤和癌症的方法和组合物，例如，哺乳动物，如人的乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌，骨癌，腮腺癌，胰腺癌，肾癌，子宫颈癌，淋巴结癌，或卵巢癌。本发明是基于新目标的发现，如ICT 1024，ICT 1025，ICT 1030，ICT 1031，和ICT 1003。因此可将ICT 1030和/或ICT 1031和/或ICT 1003和/或ICT 1024和/或ICT 1025用作治疗目标，并且，它们还可用于鉴定可用于诊断、预防和治疗肿瘤和癌症(例如，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌，骨癌，腮腺癌，胰腺癌，肾癌，子宫颈癌，淋巴结癌，卵巢癌，或肺癌)的化合物。
本文所披露的目标ICT 1024，ICT 1025，ICT 1030，ICT 1031，和ICT 1003是通过验证药物目标的方法验证的，所述方法确定了控制肿瘤发展的目标，并因此证实抗肿瘤药物的发现(参见美国临时申请号60/326,422和WO 03/063765，被收作本文参考)。这种独特的和专有的肿瘤目标区分方法通过转基因超量表达在动物肿瘤模型中直接验证目标，并且消除缺少疾病控制的目标。所述方法减少了对蛋白制备，抗体，和/或转基因动物的需要-这些都是高成本的和缓慢的，同时提供了清楚的和确定的证据，它们是针对所述疾病的实际控制的。不过，该方法提供了有价值的信息，这些信息在使用仅依赖于细胞培养物的方法时可能丢失，并且缺少了多种细胞类型的复杂的相互作用，这种相互作用可能导致疾病病理学。
本文所披露的平台技术(参见被收作参考的国际申请号WO0147496)是用于验证在肿瘤组织中表达不足的基因的有效工具。不过，为了验证在肿瘤组织中超量表达的基因，获得基因沉默的技术平台是高度理想的。最近，业已证实双连链RNA能通过被称为RNA干扰(RNAi)的现象诱导基因特异性沉默。尽管RNAi的机制尚不完全了解，大量的早期结果表明，这种RNAi作用可能在多种细胞类型中获得，包括哺乳动物细胞。靶定mRNA的双链RNA导致了目标mRNA的降解，导致相应基因的沉默。将大的双链RNA裂解成较小的片段，例如，长度为21-23个核苷酸的片段，通过与酶切割器相关的RNase III样活性裂解。这种较短的片段被称为siRNA(小的干扰RNA)，它被认为能介导mRNA的裂解。业已在秀丽新杆线虫和其他低等生物中研究了RNAi下调基因表达的机制，业已证实了它在哺乳动物细胞中的效果。最近，在小鼠体内使用萤火虫荧光素酶基因报道系统证实了RNAi的作用(Wor by等(2001)Sci STKE Aug 14，2001(95)：PL1)。
我们的独特的PolyTranTM技术(参见国际申请号WO 0147496)能够直接将质粒施用到肿瘤中。这证实了候选靶蛋白在肿瘤中的强的肿瘤表达和活性。
定义
一般，“基因”是基因组上的片段，它能够转录成RNA，RNA具有调控功能，催化功能和/或编码蛋白。真核基因通常具有内含子和外显子，它们可以组织形成不同的RNA剪接变体，这些变体编码其他形式的成熟蛋白。技术人员可以理解的是，本发明包括能够发现的所有内源基因，包括剪接变体，等位变体和由于不同的启动子位点和不同的聚腺苷酸化位点而出现的转录物。本文所披露的内源基因还可以是突变的内源基因，并且所述突变可以在编码区或调控区出现。
″靶基因″表示以不同形式表达的基因，其中，基因表达或基因产物活性水平的调节能抑制和/或缓解疾病发展，例如，肿瘤生长。因此，能调节靶基因表达的化合物，靶基因，或靶基因产物的活性可用于诊断，治疗或预防疾病。具体地讲，本发明的靶基因包括本文所披露的内源基因和它们的变体。
因此，全长的基因或其RNA包括任何天然存在的剪接变体，等位变体，或其他不同的转录物，通过重组技术产生的剪接变体，它与天然存在的变体具有相同的功能，以及所得到的RNA分子。基因片段可以是来自基因的任何部分，它可以是或不是功能性结构域，例如，催化结构域，DNA结合结构域等。片段可优选包括编码至少16个连续的氨基酸，更优选至少25个连续的氨基酸，最优选至少大约30，40，50，60，65，70，75或更多个连续的氨基酸或接近它的或它们之间的任何整数的核苷酸序列。结构基因是DNA序列，它被转录成信使RNA(mRNA)，然后将它翻译成特定多肽所特有的氨基酸序列。
″互补DNA″(cDNA)通常被称作″拷贝DNA″，它是单链DNA分子，它是通过逆转录酶由mRNA模板形成的。通常，将与所述mRNA的一部分互补的引物用于启动逆转录。本领域技术人员还使用术语″cDNA″表示双链DNA分子，该分子包括所述单链DNA分子和它的互补DNA链。
″基因表达″表示基因产物的生物合成。例如，对于结构基因来说，基因表达涉及将所述结构基因转录成mRNA，并且将mRNA翻译成一种或多种多肽。
术语″可操作地结合″被用于表示调控因子和基因或它的编码区之间的连接。就是说，基因表达通常受某些调控因子的控制，包括组成型或诱导型启动子，组织特异性调控因子，和增强子。所述基因或编码区与调控因子″可操作地连接″或″可操作连接″或″可操作地结合″，表示所述基因或编码区是受所述调控因子的控制或影响的。
″序列同源性″被用于表示两种或两种以上核酸，多核苷酸，蛋白，或多肽之间的序列关系，并且在本文中被理解成并且与以下术语结合，包括：(a)参考序列，(b)比较窗口，(c)序列同一性，(d)序列同一性百分比，和(e)显著同一性或″同源的″。
(a)″参考序列″被定义为用作序列比较基础的序列。参考序列可以是特定序列的亚类或全部；例如，全长的cDNA的片段或基因序列或完整的cDNA或基因序列，对于多肽来说，参考多肽序列的长度通常为至少大约16个氨基酸，优选至少大约20个氨基酸，更优选至少大约25个氨基酸，更优选大约35个氨基酸，大约50个氨基酸，或大约100个氨基酸。对于核酸来说，参考核酸序列的长度通常为至少大约50个核苷酸，优选至少大约60个核苷酸，更优选至少大约75个核苷酸，更优选大约100个核苷酸或大约300个核苷酸或接近它的或它们之间的任何整数。
(b)″比较窗口″包括与多核苷酸序列的连续的和特定的片段进行比较，其中，多核苷酸序列可以与参考序列进行比较，并且其中在比较窗口中，所述多核苷酸序列的部分与参考序列(它不包括添加，取代，或缺失)相比包括添加，取代，或缺失(即，空位)，以便最佳比对两种序列。一般，所述比较窗口的长度至少为20个连续的核苷酸序列，并且任选为30，40，50，100或更长。本领域技术人员了解的，为了避免由于在多核苷酸序列上包括空位而导致的与参考序列的误导的高相似性，通常要引入罚分，并且从匹配数量中扣除。
为了比较而进行的序列比对方法是本领域所公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法进行，Adv.Appl.Math.，2：482，1981；通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.，48：443，1970；通过Pearson和Lipman的相似性检索方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8：2444，1988；通过上述算法的计算机执行，包括，但不局限于：Intelligenetics的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics软件包中的Mountain View，California，GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA，Genetics ComputerGfoup(GCG)，7 Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA；所述CLUSTAL程序是由Higgins和Sharp详细披露的，Gene，73：237-244，1988；Corpet等，Nucleic Acids Research，16：881-90，1988；Huang等，Computer Applications In theBiosciencs，8：1-6，1992；和Pearson等，Methods in MolecularBiology，24：7-331，1994。可用于数据库相似性检索的BLAST家族的程序包括：BLASTN，针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTX，针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTP，针对蛋白数据库序列的蛋白查询序列；TBLASTN，针对核苷酸数据库序列的蛋白查询序列；和TBLASTX，针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列。参见，Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 19，Ausubel，等，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1995。将来毫无疑问地会出现上述程序的新的版本或新的程序，并且可用于本发明。
除非另有说明，本文所提供的序列同一性/相似性值表示使用BLAST 2.0程序组，或它们的后续程序，采用预设参数获得的。Altschul等，Nucleic Acids Res，2：3389-3402，1997。可以理解的是，在将来上述参数的预设值可以根据需要方便地改变
正如本领域普通技术人员可以理解的，BLAST检索假定蛋白可以作为随机序列模拟。不过，很多真实的蛋白包括非随机序列区，它们可能是均聚物片段，短期重复，或富含一种或多种氨基酸的区。这种低复杂性区可以在不相关的蛋白之间比对，即使所述蛋白的其他部分是完全不同的。可以使用多种低复杂性过滤程序，以便减少这种低复杂性比对。例如，SEG(Wooten和Federhen，Comput.Chem.，17：149-163，1993)和XNU(Claverie和States，Comput.Chem.，17：191-1，1993)低复杂性过滤器可以单独使用或组合使用。
(c)″序列同一性″或″同一性″在表示两种核酸或多肽序列时，包括表示在比对特定比较窗口上的最大相关性时在这两种序列上的残基是相同的，并且可以考虑添加，缺失和取代。当序列同一性百分比被用于表示蛋白时，它被认为不相同的残基位置通常表现为保守性氨基酸取代的不同，其中，氨基酸残基取代了具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并因此不会对分子的功能特性造成负面影响。当序列之间存在保守性取代差异时，百分序列同一性可以上调，以便纠正所述取代的保守性质。其区别在于这种保守性取代的序列被认为具有序列相似性。用于进行这种调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常，该方法包括将保守性取代记为部分而不是完全错配，从而提高百分序列同一性。因此，例如，当将相同的氨基酸赋予1的得分时，非保守性取代被赋予0的得分。保守性取代被赋予0-1之间的得分。计算保守性取代的得分，例如，根据Meyers和Miller的算法，ComputerApplic.Biol.Sci.，4：11-17，1988，例如，按照PC/GENE程序执行(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)。
(d)″序列同一性百分比″表示通过在比较窗口上比较两个优化比对的序列确定的值，其中，与参考序列(它不包括添加，取代，或缺失)相比，在所述比较窗口上的所述多核苷酸序列部分包括添加，取代，或缺失(即，空位)，以便优化两个序列之间的比对。所述百分比是通过测定在两个序列上出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量计算的，以便得到匹配位置的数量，用比较窗口上的总的位置数量除匹配位置的数量，并且乘以100，得到所述序列同一性百分比。
(e)(i)各种语法形式的术语″显著同一性″或″同源性″表示多核苷酸包括具有理想同一性的序列，例如，与参考序列相比，具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性，使用所披露的比对程序之一，采用标准参数。技术人员可以理解的是，可以对这些值进行适当地调整，以便测定由两种核苷酸序列编码的蛋白的相应的同一性，考虑密码子简并性，氨基酸相似性，和读框定位等。用于上述目的的氨基酸序列的显著同一性通常表示至少60％，更优选至少70％，80％，90％，更优选至少95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。
核苷酸序列基本上相同的另一个指标是，两个分子是否在严格条件下彼此杂交。不过，在严格条件下彼此不能杂交的核酸如果它们所编码的多肽是基本上相同的，仍然是基本上相同的。例如，使用遗传密码允许的最大密码子简并性所产生的核酸拷贝。两种核酸序列基本上相同的一个指标是，第一种核酸所编码的多肽能与第二种核酸所编码的多肽发生免疫学交叉反应，尽管这种交叉反应不是被认为基本上相同的两种多肽所必需的。
(e)(ii)各种语法形式的术语″显著同一性″或″同源性″在修饰肽时，表示肽包括具有理想同一性的序列，例如，在特定比较窗口上与参考序列具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性，更优选80％，更优选更优选85％，更优选与参考序列具有至少90％或95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。优选的是，最佳比对是使用Needleman和Wunsch的同源性比对算法进行的，J.Mol.Biol 48：443，1970。两种肽序列基本上相同的指标是，一种肽能够与针对另一种肽的抗体发生免疫学反应，不过这种交叉反应性不是两种多肽被视为基本上相同所必需的。因此，例如，当两种肽的差别仅在于保守性取代时，就认为一种肽与另一种肽是基本上相同的。″基本上相似的″肽具有上述序列，所不同的是，不同的残基位置可能在于保守性取代氨基酸改变的差别。保守性取代通常包括，但不局限于，在以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯基丙氨酸和酪氨酸，以及本领域技术人员所公知的其他氨基酸。
术语″反义RNA″在真核生物中表示能催化结构基因转录产生mRNA的RNA聚合酶。可以将DNA分子设计成包括RNA聚合酶模板，其中，RNA转录物具有与优选的mRNA互补的序列。所述RNA转录物被称为″反义RNA″。反义RNA分子能够抑制mRNA表达(例如，Rylova等，CancerRes，62(3)：801-8，2002；Shim等，Int.J Cancer，94(1)：6-15，2001)。
术语″反义DNA″或″DNA诱饵″或″诱饵分子″表示针对第一种核酸分子相比的第二种DNA分子或第二种嵌合核酸分子，是用与第一种分子或其部分的互补序列互补或同源的序列制备的，它被称作所述第一种分子的反义DNA或DNA诱饵或诱铒分子。术语″诱饵分子″还包括核酸分子，它可以是单链或双链的，包括DNA或PNA(肽核酸)(Mischiati等，Int.J.Mol.Med.，9(6)：633-9，2002)，并且它包括蛋白结合位点的序列，优选调控蛋白的结合位点，更优选转录因子的结合位点。包括反义DNA和诱铒DNA在内的反义核酸分子的应用是本领域所公知的例如，Morishita等，Ann.N Y Acad.Sci.，947：294-301，2001；Andratschke等，Anticancer Res，21：(5)3541-3550，2001。
″siRNA″表示小的干扰RNAs，它还包括短的发卡RNA(″shRNA″)(Paddison等，Genes & Dev.16：948-958，2002)，它能够导致干扰(在本文中被称为RNAi)并且可能在细胞中导致特定基因的转录后沉默，例如，哺乳动物细胞(包括人类细胞)以及在身体内，例如，哺乳动物体(包括人体)内导致转录后沉默。RNA干扰(RNAi)现象在以下文献中进行过披露和讨论：Bass，Nature，411：428-29，2001；Elbashir等，Nature，411：494-98，2001；和Fire等，Nature，391：806-11，1998，其中，还讨论了制备干扰RNA的方法。本发明的典型的siRNAs可以具有高达29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它的或它们之间的任何整数。
本文所披露的″稳定化的RNAi″，″siRNA″或″shRNA″受到了保护，不被外切核酸酶，包括Rnase降解，例如，使用在核糖的3号位置上修饰过的核苷酸类似物(例如，通过包括上面所定义的取代过的或未取代过的烷基，烷氧基，链烯基，链烯氧基，炔基或炔氧基)。RNAi，siRNA或shRNA还可以是通过包括3′-3′-连接的二核苷酸结构(Ortigao等，Antisense Researcli and Development 2：129-146(1992))和/或两个修饰过的磷酸键，如两个硫代磷酸酯键稳定化的，能抗外切核苷酸在3′末端的降解作用。
正如本文所披露的，在电穿孔方法中使用的RNA分子可以是稳定化的RNAs。本发明的RNAs包括分离的RNAi，siRNA，mRNA或反义RNA分子以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多肽或它的一部分，它能够结合靶基因基序。已知来自GAPDH的肽能够结合并且稳定RNA，并且可以用于在细胞中稳定治疗性siRNA/RNAi/shRNA分子。
术语″癌″表示存在具有致癌细胞所特有的特征的细胞，例如，不受控制的增殖，特化功能的丧失，永生，显著的转移潜力，抗-细胞凋亡活性的显著提高，快速生长和增殖速度，和某些特征性的形态学和细胞标记。在某些场合下，癌细胞是肿瘤形式的：所述细胞能够局部存在于动物体内，或者作为独立的细胞在血流中循环，例如，白血病细胞。
术语″肿瘤″表示所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的或良性的，以及所有癌症前期的和癌细胞和组织。
术语″癌症前期的″表示具有与可能导致恶性或癌的变化相关的特征的细胞或组织。其例子包括组织中的腺瘤生长或状况，例如，发育异常痣综合征，即皮肤恶性黑色素瘤的前体。除了发育异常的痣综合征之外，其例子还包括异常的肿瘤，息肉综合征，前列腺发育异常，和其他这样的肿瘤，无论所述癌症前期的损伤在临床上是否可以鉴定。
术语″复合的DNA″包括与其他分子复合或组合的DNAF分子，例如碳水化合物，例如糖，形成糖-DNA复合物。这种组合物，例如，糖复合的DNA能够通过受体增强或支持有效的基因送递，例如，葡萄糖可以与DNA复合，并且通过受体，如甘露糖受体送递到细胞中。
″包囊的核酸″，包括包囊的DNA或包囊的RNA，表示微球体或微颗粒中的核酸分子，并且用相对非免疫原性的材料包被，并且进行选择性酶促降解，例如，通过材料，例如，凝胶和硫酸软骨素(例如，参见美国专利号6,410,517)的复杂的凝聚合成微球体或微颗粒。存在于微球体或微颗粒中的包囊的核酸是以这种方式包囊的，它保持了诱导其编码序列表达的能力(例如，参见美国专利号6,406,719)。
″抑制剂″表示能抑制和/或阻断特定功能的分子。具有抑制和/或阻断特定功能的任何分子都可以是本文所披露的″测试分子″例如，对于ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031或ICT 1003的致癌功能或抗-细胞凋亡活性来说，所述分子可以通过分别对ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031或ICT 1003进行体外和体内测定鉴定。抑制剂是能够部分或完全阻断ICT 1024，ICT 1025和/或ICT 1031和/或ICT 1003活性，减弱，预防，或防止它们的激活，或使它的细胞反应不敏感的化合物。这一目的可以通过直接或通过其他中间分子结合ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，或ICT 1003蛋白而实现。能阻断ICT 1024，ICT 1025和/或ICT 1031和/或ICT 1003活性的拮抗剂或抗体被认为是这样的抑制剂，所述活性包括抑制ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031和/或ICT 1003的致癌功能或抗-细胞凋亡活性。本发明的抑制剂包括：siRNA，RNAi，shRNA，反义RNA，反义DNA，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够产生RNA干扰的分子，或它们的组合。本发明的抑制剂类型还包括遗传修饰形式的ICT 1024，ICT 1025，ICT 1030，ICT 1031，或ICT 1003，例如，具有改变了的活性的形式。因此，所述类型包括天然存在的蛋白以及合成配体，拮抗剂，刺激剂，抗体，和小的化学分子等。
″抑制剂测定方法″表示实验方法，例如，包括在体外，在细胞中表达ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，或ICT 1003，采用推测的抑制剂化合物，然后按上述方法测定对ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，或ICT 1003活性或转录的功能作用。用潜在的抑制剂处理含有或推测含有ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，或ICT 1003的样品。通过比较来自感兴趣的样品和对照样品的活性测定结果，检查抑制或改变的程度。建立阈值以便评估抑制作用。例如，当ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，或ICT 1003活性值相对对照为80％或更低时就认为获得了ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，或ICT 1003多肽的抑制作用。
ICT 1030：术语″ICT 1030″表示验证的目标ICT 1030，它包括MFGE8(登录号NM-005928，BC003610)，相关分子或共有序列，核酸(DNA和RNA)或蛋白(或多肽)，和它们的多形性变体，突变体，以及种间同源物，它们具有：(i)与GenBank登录号NM_005928(蛋白ID.NP-005919.1)，人乳脂球-EGF因子8蛋白(MFGE8)(蛋白ID.NP-005919.1)的核苷酸序列具有显著的核苷酸序列同源性(例如，至少60％同一性，优选至少70％序列同一性，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％同一性)；或(ii)与GenBank蛋白ID.NP-005919.1(ICT 1030)的氨基酸序列具有至少65％序列同源性；或(iii)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有显著的核苷酸序列同源性(例如，与参考序列具有至少60％，优选至少70％序列同一性，更优选80％，更优选85％，更优选至少90％或95％同一性)；或(iv)与所编码的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2)具有显著的序列同源性。
ICT 1030多核苷酸或多肽通常来自哺乳动物，包括，但不局限于，人，大鼠，小鼠，仓鼠，牛，猪，马，羊，或任何哺乳动物。″ICT 1030多核苷酸″和″ICT 1030多肽″可以是天然存在的，重组的，或合成的(例如，通过化学合成)。
MFGE8DNA序列包括1934个碱基对(参见SEQ ID NO：1)，ICT 1030编码序列包括1164个碱基对(参见SEQ ID N0：3)，编码具有387个氨基酸的蛋白(参见SEQ ID NO：2)。
根据本发明的一个方面，业已确定目标ICT 1030，例如MFGE8是哺乳动物组织中的新的目标，即使肿瘤抑制剂，所述组织包括乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，和卵巢组织。人染色体区15q25是鉴定的新目标之一，它被确定为肿瘤抑制剂。因此，位于染色体区15q25上的肿瘤抑制基因可能在癌症治疗中发挥重要作用，包括乳腺，结肠，前列腺，皮肤，骨，腮腺，胰腺，肾脏，子宫颈，淋巴结，和卵巢癌。
ICT 1031：术语″ICT 1031″表示验证的目标ICT 1031，它包括TNFSF13(登录号.AK090698和075888)，相关的分子，如APRIL，TALL-2和TRDL-1，或共有序列，核酸(DNA和RNA)或蛋白(或多肽)，并且可以包括它们的多形性变体，等位基因，突变体和种间同源物，它们具有：(i)与登录号AK090698，人TNFSF13(登录号.AK090698和075888)的核苷酸序列具有显著的核苷酸序列同源性(例如，至少60％同一性，优选至少70％序列同一性，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％同一性)；或(ii)与登录号075888(TNFSF13)的氨基酸序列具有至少65％序列同源性；或(iii)与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列具有显著的核苷酸序列同源性(例如，与参考序列具有至少60％，优选至少70％序列同一性，更优选80％，更优选85％，更优选至少90％或95％同一性)；或(iv)与编码的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：5)具有显著的序列同源性。
ICT 1031多核苷酸或多肽通常来自哺乳动物，包括，但不局限于，人，大鼠，小鼠，仓鼠，牛，猪，马，羊，或任何哺乳动物。″ICT 1031多核苷酸″和″ICT 1031多肽″，可以是天然存在的，重组的，或合成的(例如，通过化学合成)。
TNFSF13DNA序列(登录号.AK090698)包括2036个碱基对(参见SEQ ID NO：4)，而TNFSF13编码蛋白(登录号.075888)包括250个氨基酸(参见SEQ ID NO：5)。
根据本发明的一个方面，业已确定目标ICT 1031，例如，TNFSF13，是哺乳动物组织中肿瘤生长抑制的新的目标，所述组织包括乳腺组织，结肠组织，食道组织，和卵巢组织。因此，肿瘤促进目标ICT 1031的抑制可以在癌症治疗中发挥重要作用，包括乳腺，结肠，食道，和卵巢癌。
ICT 1003：术语″ICT 1003″表示验证的目标ICT 1003，它包括ZFP236(登录号.AK000847)，相关的分子，或共有序列，核酸(DNA和RNA)或蛋白(或多肽)，并且包括它们的多形性变体，等位基因，突变体和种间同源物，它们具有：(i)与GenBank登录号AK000847，新的人锌指蛋白236(GenBank登录号AK000847.1)的核苷酸序列具有显著的核苷酸序列同源性(例如，至少60％同一性，优选至少70％序列同一性，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％同一性)；或(ii)与蛋白ID.BAA91398.1(ICTB1003)的氨基酸序列具有至少65％序列同源性；或(iii)与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的核苷酸序列具有显著的核苷酸序列同源性(例如，与参考序列具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性，更优选80％，更优选85％，更优选至少90％或95％同一性)；或(iv)与编码的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：7)具有显著的序列同源性。
ICT 1003多核苷酸或多肽通常来自哺乳动物，包括，但不局限于，人，大鼠，小鼠，仓鼠，牛，猪，马，羊，或任何哺乳动物。″ICT 1003多核苷酸″和″ICT 1003多肽″，可以是天然存在的，重组的，或合成的(例如，通过化学合成)。
ZFP236DNA序列包括2241个碱基对(参见SEQ ID NO：6)，ZFP236编码序列包括1419个碱基对(参见SEQ ID NO：8)，具有472个氨基酸的编码蛋白(参见SEQ ID NO：7)。
根据本发明的一个方面，业已确定目标ICT 1003，例如，ZFP236，是哺乳动物组织中肿瘤生长抑制的新的目标，所述组织包括乳腺组织，结肠组织，肺组织，和卵巢组织。因此，肿瘤促进目标ICT 1003的抑制能够在癌症治疗中发挥重要作用，包括乳腺，结肠，肺和卵巢癌。
ICT 1024：术语″ICT 1024″表示验证的目标ICT 1024，基因和蛋白EGF-AP。它们最初是使用被称为效力优先发现的方法鉴定的(参见PCT/US02/31554，它被完整地收作本文参考)。简单地讲，人乳腺肿瘤癌细胞，MDA-MB-435皮下接种到小鼠胸部脂垫中。当异种移植肿瘤的体积生长到200mm3时，将能表达碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)的质粒反复送递到肿瘤内。与未处理过的肿瘤相比，处理过的肿瘤表现出更快的生长。
获得肿瘤组织，并且用于分离总RNA进行显微阵列分析(Affymetrix，U133)。高度上调或下调的基因之一(占U133芯片上总探针的大约1％)ICT 1024，表现出显著上调的表达，信号从585(对照组表达水平)提高到1208(处理组表达水平)。因此选择该基因进行下一级水平的目标验证，采用被称为疾病控制验证的方法，使用基于相同的异种移植肿瘤模型的体内剔除的siRNA。设计各有21个碱基对的两组siRNA双链(图7)(SEQ ID NO：25和26)(aagctggacattcectctgcg，aagagcccagcttcctgcagc)，靶定该ICT1024基因，它在编码区对AK026010，NM_022450和M99624的序列具有特异性。三次将这两组s iRNA双链肿瘤内送递。siRNA-介导的ICT1024基因表达的剔除，导致了肿瘤生长抑制(图8)。在基于细胞培养的研究中的进一步分析证实了在肿瘤细胞MDA-MB-435中剔除ICT 1024基因表达，诱导了细胞凋亡活性的显著提高(图9)。根据上述结果，选择ICT 1024作为作为治疗目标进行进一步的评估。
在细胞培养物和异种移植肿瘤模型中对该基因的生物学功能进行这种鉴定和验证之后，对ICT 1024基因表达特征检索进行了一系列分析，通过公开的结构域数据库和GeneLogic Express分析。上述分析的结果进一步证实了所述生物学功能及其与疾病状态的相关性，特别是在肿瘤生长部位，肿瘤细胞凋亡和肿瘤转移方面。
ICT 1024基因是在各种肿瘤样品中高度表达的。除了来自效力优先研究的发现之外，即在通过接种人乳腺癌细胞MDA-MB-435(有某些证据表明该细胞系可能来自黑色素瘤而不是乳腺癌)形成的异种移植肿瘤在用bFGF处理时ICT 1024被上调了，它发现ICT 1024在肿瘤组织，特别是来自三种不同分析的乳腺癌组织样品中被显著上调了。以上分析是由NCBI′s CANCER GENOME ANATOMY PROJECT的SAGE Genie数据库在线提供的。第一个分析来自SAGE数字Northern(参见表I)(SEQ ID NO：36)，该分析证实了在转移性乳腺癌组织中非常明确地上调的ICT 1024表达。在相同的分析中，在胃癌，前列腺癌，脑成胶质细胞瘤和其他类型肿瘤中也观察到了ICT 1024基因表达的上调。第二种分析来自Monochromatic SAGE/cDNA可视RNA印迹(参见表II)。对于所有类型的组织来说，根据EST数据组和SAGE数据组业已鉴定ICT 1024是高度上调的基因。在乳腺肿瘤组织中，在SAGE数据组该基因被显著上调。脑和前列腺是与正常组织相比在肿瘤组织中表现出显著上调的基因表达的其他组织类型。第二种分析来自二维针列展示(参见图10)。在乳腺肿瘤组织中，ICT 1024表达与一组致瘤基因的表达相关。
采用Gene Logic′s GeneExpress分析，我们发现在乳腺肿瘤组织中，不仅ICT 1024上调了，而且与来自其他时期的肿瘤相比，在来自I期的组织中被上调的更多(图11)。这一发现表明，ICT 1024活跃地参与了肿瘤生长的早期阶段。
通过文献检索，发现ICT 1024与PSMB 1，蛋白体β亚基1具有正相关性。蛋白体是多催化性蛋白酶组合物，并且它能够通过泛素-依赖性过程裂解肽。目标泛素-介导的关键调节剂的降解是得到公认的抗癌目标。
还观察到了与RAP1表达的另一种正相关。RAP1是Ras-相关蛋白-1，并且与Ras致癌基因的激活相关。
ICT1025：术语″ICT1025″表示验证的目标ICT1025。首先采用被称作效力优先发现的方法(参见PCT/US02/31554，它被完整地收作本文参考)鉴定了所述基因和蛋白TRA-1。简单地讲，将人乳腺肿瘤癌细胞，MDA-MB-435皮下接种到小鼠胸部脂垫中。当异种移植肿瘤的体积生长到200mm3时，将能表达碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)的质粒反复送递到肿瘤内。处理过的肿瘤表现出比未处理过的肿瘤生长的更快。
获得肿瘤组织，并且用于分离总RNA进行显微阵列分析(Affymetrix，U133)。高度上调或下调的基因之一(占U133芯片上总探针的大约1％)，ICT1025表现出显著上调的表达，信号从279(对照组表达水平)提高到412(处理组表达水平)。因此选择该基因(登录号.AK025852，NM_003299和BC009195，图33，mRNA序列(SEQID NO：70)；图34蛋白序列(SEQ ID NO：71)采用被称作Disease-ControlTM验证的方法进行下一级水平的目标验证，使用基于相同异种移植肿瘤模型中的体内剔除的siRNA。设计各自具有21个碱基对的两种siRNA双链(图35)(SEQ ID NO.72和73)，靶定该ICT 1025基因，它是对序列aactgttgaggagcccatgga(始于966号核苷酸)和aatctgatgatgaagctgcag(始于1008号核苷酸)的编码区特异。然后将这两种siRNA双链肿瘤内送递三次。siRNA-介导的ICT 1025基因表达的剔除，导致了肿瘤生长抑制(图36)。在基于细胞培养的研究中的进一步分析证实了在肿瘤细胞MDA-MB-435，HT29中剔除ICT 1025基因表达，导致了细胞凋亡活性的显著提高(图37)和细胞增殖的减少。根据以上结果，选择ICT 1025作为治疗目标进行进一步评估。
在细胞培养物和异种移植肿瘤模型上对该基因的生物学功能进行鉴定和验证之后，通过公共结构域数据库和GeneLogic Express分析进行了一系列ICT 1025基因表达特征的检索。上述分析的结果进一步证实了所述疾病状态的生物学功能及其相关性，特别是在肿瘤生长部位，肿瘤细胞凋亡和肿瘤转移。
通过siRNA送递其表达实现的TRA-1的下调，业已证实了它的表达在增殖性疾病中具有“疾病控制”作用，它的在异种移植肿瘤siRNA-介导的TRA-1表达模型的剔除，发现当TRA-1表达受到抑制时，肿瘤生长速度受到抑制。我们还发现了在若干乳腺肿瘤细胞系中剔除这种蛋白的表达，诱导了细胞凋亡活性的显著提高。在用专门针对这种蛋白的单克隆抗体时处理所述细胞时，进一步验证了这一发现。在确定这种蛋白在乳腺肿瘤细胞中的亚细胞定位的过程中，我们发现了这种蛋白不仅是细胞表面膜结合的，而且还具有位于细胞外的主要部分。
根据我们的发现，对有希望的自体同源方法临床结果的一种假设是，施用分离的TRA-1复合物诱导了针对TRA-1本身的抗体，而不仅是自体的患者特异性肽，并且主要导致了肿瘤抑制，或有可能是活性的主要机制。采用细胞表面生物素化技术，我们发现TRA-1蛋白在MDA-MB-435和MCF-7乳腺癌细胞外表面上的存在。为了研究来自乳腺癌细胞的TRA-1的细胞表面定位的生物学关系，我们检查了细胞凋亡和增殖上的mAb。在用TRA-1单克隆抗体处理所述细胞时，观察到了细胞凋亡活性的提高和细胞增殖的抑制。以上结果强烈暗示了细胞表面TRA-1与细胞凋亡和细胞增殖信号途径的关系。因此，TRA-1抑制剂，包括siRNA能减弱它的表达和抗体与它的结合并且抑制它的活性，提供了对乳腺癌，其他恶性癌症，和很多增殖性疾病的新的和有效的治疗方法。抑制TRA-1的mAb的治疗的成功，具有广泛的用途，并且在临床上是可行的。
本发明提供了用于抑制或阻断ICT 1025蛋白的生物学活性的方法和组合物。还提供了用于治疗癌症，自身免疫性疾病和其他疾病的治疗方法和组合物。更具体地讲，本发明提供了能够在核酸和/或蛋白水平上下调ICT 1025的生产和活性，并且能够灭活，抑制，阻断，或下调这种蛋白的生物化学功能的方法和组合物。可以通过以下方法获得所述抑制作用，例如，通过下调所述蛋白的转录或翻译获得所述抑制作用；通过降解编码所述蛋白的mRNA，通过降解所述蛋白，通过阻断和/或灭活RNA，以及通过抑制蛋白功能。本发明提供了ICT 1025的抑制剂，包括，但不局限于抗体，mRNA序列特异性抑制剂，如siRNA和反义，肽拮抗剂，以及小分子蛋白酶抑制剂。本发明还提供了用于制备所述抑制剂的方法，以及使用一种或多种抑制剂获得需要的生物学功能，例如肿瘤，免疫学和/或传染性疾病的治疗和预防的方法。具体地讲，本发明提供了免疫球蛋白制剂，包括抗体和抗体片段，以及利用所述制剂治疗和诊断疾病的方法。临时申请号60/458,948的内容被以它的完整形式收作本文参考。
DNA和蛋白序列同源性分析
ICT 1024：有三种全长的cDNA序列：NM-022450，BC014425和AK026010，它们编码相同的蛋白。所述蛋白包括855个氨基酸，并且分子量为大约130kD。
通过BLAST检索DNA序列的同源性，我们发现在人类，鼠类，家鼠属和河豚等中存在大约325种同源序列。不过，仅发现了非常少的人类同源物。只有一种cDNA序列(AK056708)与上述三种cDNAs具有非常高的同源性，但是具有短的突变序列片段，该片段可能是由克隆假象产生的。因此，所述蛋白编码区被破坏了。还发现了其他部分cDNA序列和染色体序列。在2003年4月22日之前，最初，所述cDNA在NCBI核苷酸数据库中被命名为EGFR相关序列(EGFR-RS)，或EGF相关蛋白(EGFR-RP)。现在，所述cDNA业已被命名为人菱形家族1。
我们还分析了ICT 1024的蛋白序列。这种855 AA蛋白具有通过Conserved Domain Architecture Retrieval Tool从NCBI数据库中鉴定的若干结构域特征。主要的结构域结构之一是覆盖大约146AA的片段。该结构域业已被认为是所述菱形家族的保守片段。该家族包括与果蝇属菱形蛋白相关的整合膜蛋白。在细菌和真核生物中发现了该家族的成员。菱形蛋白能促进膜锚定的TGF-α-样生长因子Spitz的裂解，使它能够激活果蝇属EGF受体(4，5，6，7)。分析表明，菱形-1是新的膜内丝氨酸蛋白酶，它能直接裂解Spitz。上述蛋白在推测的跨膜区包括三个高度保守的组氨酸，它们可能与肽膜功能相关。我们首先比较了ICT 1024菱形结构域和来自各种生物的一组菱形蛋白(图12)。尽管ICT 1024菱形结构域的构架与来自其他生物的十分相似，但它们的序列是非常不同的。在比较ICT 1024菱形结构域和其他人类菱形样蛋白时(图13)，ICT 1024的序列与其他序列相比是非常不同的。另外，用于体外和体内验证目标区的ICT 1024特异性siRNA双链与上述人类菱形蛋白的任意一种都是非常不同的(图14)。
我们还分析了ICT 1024蛋白的疏水性及其潜在的跨膜定位。业已采用了多种预测程序，包括SOSUI模型(表III)，TMHMM模型和Tmpred模型(图15)。根据以上分析可以看出，ICT 1024是整合膜蛋白，具有多个跨膜结构域和细胞内结构域以及细胞外结构域。可以将何种方法用于预测蛋白定位和拓扑结构，业已证实该蛋白具有位于膜外侧的长的N-末端结构域。该N-末端结构域可能位于细胞外或细胞质内。该蛋白的其他区域也暴露在细胞或细胞质的外面。所述膜蛋白ICT 1024具有用于激活EGF-EGF受体途径的蛋白酶活性，并且根据本文所披露的发现，是用于开发各种形式的治疗性药物的非常诱人的目标，包括单克隆抗体，siRNA抑制剂，肽拮抗剂和小分子抑制剂等。合适的单克隆抗体能结合所述蛋白的细胞外或细胞内结构域，并且抑制所述蛋白的功能。
ICT 1025
正如在背景部分所提到的，有三种全长的cDNA序列：NM_003299，AK025459和BC009195，它们编码相同的蛋白。所述蛋白包括803个氨基酸。
通过BLAST检索DNA序列的同源性，我们在人类，鼠类，家鼠属和河豚等中发现了多种同源序列。不过，仅发现了很少几种人类同源物。只有一种cDNA序列(AK025459)与上述三种cDNAs具有非常高的同源性，不过，短的突变序列片段可以通过克隆技术产生。因此，所述蛋白编码区是破坏了的。还发现了其他部分cDNA序列和染色体序列。所述cDNA最初在NCBI核苷酸数据库中被命名为肿瘤排斥蛋白1(TRA-1)。
我们还分析了ICT 1025蛋白的疏水性以及潜在的跨膜定位。将包括DAS模型和Tmpfed模型在内的多种预测程序用于分析(图17)。无论将何种方法用于预测蛋白定位和拓扑学，业已证实该蛋白具有若干跨膜结构域。该N-末端结构域位于细胞外或细胞质内。该蛋白的其他区同样暴露于细胞或细胞质外。ICT 1025的膜呈递可能在肿瘤形成和肿瘤抗原呈递方面发挥重要作用。因此，ICT 1025是开发多种形式的治疗药物的非常诱人的目标，包括单克隆抗体，siRNA抑制剂，肽拮抗剂和小分子抑制剂等。合适的单克隆抗体能结合所述蛋白的细胞外或细胞内结构域，并且抑制所述蛋白的功能。
在肿瘤转移和生长中的作用
ICT 1024
蛋白ICT 1024显然通过它对EGF-EGFR途径的激活，以及其他蛋白酶功能和其他未知功能在肿瘤转移和肿瘤生长中发挥关键作用。我们有证据表明在来自用bFGF表达载体处理过的异种移植肿瘤模型研究中的快速生长的肿瘤中该基因被上调了。根据SAGE实质和数字RNA分析，在来自乳腺癌，前列腺癌，脑癌和其他类型癌症的肿瘤组织中，该基因在mRNA水平上被上调了。通过使用Gene Logic′sGeneExpresse分析也证实该基因被上调了。当所述基因表达在生长中的异种移植肿瘤中用ICT-1024特异性siRNA双链剔除时，肿瘤生长受到了明显抑制(图8)。
细胞凋亡(编程的细胞死亡)是细胞自杀的一种形式，它通常包括质膜起泡，细胞体积收缩，和细胞核浓缩，以及降解细胞DNA的内源内切核苷酸酶的激活达到定点。在胚胎发育和器官发生期间，明确的特定细胞的丧失是关键的。除了它的生理学作用之外，细胞凋亡同样以多种形式的癌细胞形式出现，此时它们接触各种化疗药物，包括抗代谢物，脱氧核苷酸合成抑制剂，DNA拓扑异构酶抑制剂，抗-微管剂，烷化剂，和内质网(ER)应激物。非常有趣的是，当我们在用特异性siRNA双链转染的MDA-MB-435细胞中剔除ICT-1024表达时，细胞凋亡活性显著降低了，这是通过TUNEL测定验证的，其中，末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)能催化溴-脱氧尿苷(BrdU)残基通过切口末端标记掺入到分解的核DNA的3′-羟基末端上。
业已通过RT-PCR验证了siRNA双链的特异性ICT 1024基因沉默。这一发现表明，ICT-1024在肿瘤细胞凋亡的调控中起着关键作用。其他证据倾向于表明EGF-EGFR足以激活主要信号传导途径，导致细胞终止和存活，并且EGFR信号传导足以抑制由血清剥夺所诱导的细胞凋亡(12)。
恶性肿瘤由于高度表达的和激活的生长因子EGF，PDGF和VEGF等而失去控制地生长。它们穿透并且破坏局部组织，而且通过血液或淋巴细胞扩散到身体中。所述肿瘤在形态学上不是原始组织所常有的，并且是没有包囊的。恶性肿瘤在手术切除之后通常会复发。因此，治疗通常是针对恶性癌症或恶性肿瘤。恶性生长的干预在癌症发育的早期阶段是最有效的。因此，重要的是鉴定并且验证肿瘤形成的早期症状并且确定与之相关的潜在的肿瘤生长或基因表达抑制因子或试剂。所述肿瘤生长和/或基因表达和治疗因子或制剂的开发涉及对细胞分裂和分化的遗传学控制机制的理解，特别是与肿瘤形成的联系。
根据GeneExpress分析，该分析是以数千个肿瘤组织和正常组织的临床样品为基础的，我们发现ICT 1024在1期肿瘤样品中具有显著上调了的表达(图11)。1期肿瘤样品的来自Affymetrix阵列U133的信号(283)比来自正常组织的信号(165)更高。所有1期肿瘤样品都表现出ICT 1024基因表达的显著上调。因此，将ICT 1024用作早期癌症诊断的标记。在该基因被特异性地剔除时，对于癌症治疗同样是非常有用的。
在果蝇属细胞中，polytopic膜蛋白菱形-1能促进膜固定TGFα-样生长因子Spitz的裂解，使它能激活果蝇属EGF受体。目前为止，这种关键信号传导调节剂的机制仍然是不明确的，不过，该分析表明，菱形-1是新的膜内丝氨酸蛋白酶，它能直接裂解Spitz。根据推测的菱形活性位点位于膜双层中，Spitz是在它的跨膜结构域中裂解的，因此是通过受调控的膜内蛋白水解激活的生长因子的第一种例子。菱形-1在从古生物到人类的进化中是保守的，并且，以上结果表明，人类菱形蛋白能通过类似的机制促进Spitz裂解。因此，这种生长因子激活机制可能是普遍的(6)。尽管菱形-1不包括任何显著的序列同源性结构域，它具有丝氨酸蛋白酶的特征(7)。它的六个必需残基中的四个与丝氨酸蛋白酶催化性三联体电荷-中继系统和氧阴离子稳定位点(由距离活性甘氨酸两个残基的甘氨酸和丝氨酸本身组成；G215和S217)所需要的残基平行。它们是丝氨酸蛋白酶的两个活性位点决定子，并且这四种必需残基是所有已知的直接参与丝氨酸蛋白酶催化机制的氨基酸(5)。这些残基只能在所有菱形蛋白中观察到，并且它们到更相似残基的突变(即，G215A，S217T，和S217C)，破坏了菱形-1活性。这些是活性位点残基的标记(3)。所述必需残基的定位是丝氨酸蛋白酶活性位点的强烈的暗示；G215和S217都出现在GASGG基序上，它与在200种不同丝氨酸蛋白酶的活性氨基酸周围出现的保守性GDSGG基序非常相似。另外，必需残基N169和H281在它们的跨膜结构域(TMDs)中出现在与GASGG基序相同的高度上，它们与S217结合以便产生催化性三联体的看法吻合。最后，Spitz加工是通过特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂DCI和TPCK直接抑制的，并且菱形-1本身限制了它们的存在，表明菱形-1是它们的直接目标，因此，丝氨酸蛋白酶负责Spitz裂解。在图16中提供了所暗示的模型。
由于我们对该基因及其编码蛋白的理解，及其在人类细胞中的潜在功能，我们将该基因命名为EGF激活蛋白(EGF-AP)。我们还得出这样的结论，EGF-AP是抗肿瘤治疗剂开发的诱人的癌症目标。能够抑制ICT 1024蛋白生产的诸如DNA结合蛋白，RNA结合蛋白，siRNA或其他类型的RNAi，反义，核糖酶和DNAzyme等的抑制剂能有效治疗与增强了的ICT 1024表达相关的疾病。另外，上述疾病还可以用诸如单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，细胞内抗体，蛋白拮抗剂，小分子蛋白酶抑制剂或其他类型的抑制剂的抑制剂治疗，这些抑制剂是ICT 1024蛋白功能的有效抑制剂。我们还认为这种ICT 1024蛋白可能是用于治疗癌症和其他疾病的新型药物目标。
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ICT 1025
蛋白ICT 1025显然在肿瘤转移和肿瘤生长中发挥关键作用，通过它的多种作用，作为细胞凋亡，多种药物抗性基因的增殖和上调的激活剂。我们有证据表明，该基因在来自用bFGF表达载体处理过的异种移植肿瘤模型研究的快速生长的肿瘤中该基因被上调了。根据SAGE实质和数字RNA分析，该基因在来自乳腺癌，前列腺癌，脑癌和其他类型癌症的肿瘤组织中在mRNA水平上上调了。通过Gene Logic′sGeneExpresse分析也证实了该基因被上调了。当在生长异种移植肿瘤中用ICT 1025特异性siRNA双链剔除基因表达时，肿瘤生长被显著抑制了(图38)。
细胞凋亡(编程的细胞死亡)是细胞自杀的一种方式，它通常包括质膜起泡，细胞体积缩小，以及细胞核浓缩，并且最终导致了能降解细胞DNA的内源内切核酸酶的激活。明确的特异性细胞的丧失在胚胎发育和器官发生期间是关键的。除了它的生物学作用之外，细胞凋亡还出现在很多类型的癌细胞中，此时这些细胞接触了各种化疗药物，包括抗代谢物，脱氧核苷酸合成抑制剂，DNA拓扑异构酶抑制剂，抗-微管剂，烷化剂，和内质网(ER)应激物。非常有趣的是，当我们在用特异性siRNA双链转染的MDA-MB-435细胞和HT-29细胞中剔除ICT 1025表达时，细胞凋亡活性显著提高了(图37和38)，这一结果是通过TUNEL测定验证的，其中，末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)能催化溴-脱氧尿苷(BrdU)残基通过切口末端标记掺入分解的细胞核DNA的3＇-羟基末端。
业已通过RT-PCR验证了siRNA双链对特异性ICT 1025基因的沉默(图36)。这一发现表明ICT 1025在肿瘤细胞凋亡的调控中起着关键作用。其他证据倾向于表明，ICT 1025足以激活主要信号传导途径，导致细胞增殖和存活。
治疗细胞增殖性疾病的方法
利用抑制剂抑制ICT 1024和ICT 1025蛋白生产
RNAi，反义，核糖酶和其他核酸治疗剂可用于在患有与细胞增殖相关的疾病的患者中抑制ICT 1003和ICT-1024和ICT 1025和ICT1031的表达。例如，将ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031反义链(RNA或DNA)以能够与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。另外，可以施用包括一种序列的载体，该序列一旦进入靶细胞，就能够转录成合适的反义mRNA。反义核酸能与靶mRNA杂交，通过与正常的单链mRNA转录物结合减少或抑制由基因编码的多肽产物的产生，从而干扰翻译，并因此干扰所述蛋白的表达。例如，包括启动子，例如组织特异性或肿瘤特异性启动子的DNA可操作地与DNA序列(反义模板)连接，它被转录成反义RNA。“可操作地连接”表示编码序列和调控序列(即，启动子)是以这种方式连接的，在合适的分子(例如，转录激活蛋白)与所述调控序列结合时，可以进行基因表达。
可以在体外确定与ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的各个部分互补的寡核苷酸在人类细胞中减少ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031产生的能力(例如，使用FOCUS肝细胞癌(HCC)细胞系)，按照标准方法进行的。与缺少候选组合物的细胞培养物相比，在与候选反义组合物接触的细胞中，ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因产物的减少，是使用ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031-特异性抗体或其他检测方法检测的。然后在大鼠或小鼠中通过体外基于细胞的或无细胞测定体内验证了ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031产量的降低，以便验证在患有恶性肿瘤的动物中降低了ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的产量。
通过标准载体和/或基因送递系统给患者施用反义核酸进行反义治疗。合适的基因送递系统可以包括脂质体，聚合物，受体介导的送递系统，裸露的DNA，和病毒载体，如疱疹病毒，逆转录酶病毒，腺病毒和腺伴随病毒等。在可以药用的载体中制备了治疗性核酸组合物。所述治疗组合物还可以包括上文所述的基因送递系统。可以药用的载体是生物学上相容的媒介物，它们适合给动物施用：例如，生理盐水。治疗有效量的化合物是这样一种用量，它能够产生医学上理想的效果，如减少ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因产物的产量，或在治疗过的动物中减弱细胞增殖。
肠胃外施用，如静脉内，皮下，肌内，和腹膜内送递途径，可用于送递非肽化合物上的核酸或ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031-抑制肽。治疗化合物的脂质体制剂还有利于活性。
用于任何患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体形，体表面积，年龄，要施用的特定核酸，性别，施用时间和途径，一般健康状况，以及同时施用的其他药物。静脉内施用核酸的剂量为大约106-1022个拷贝的核酸分子。
RNA干扰(RNAi)是转录后过程，其中，双链RNA(dsRNA)能以序列特异性形式抑制基因表达。RNAi过程是通过至少两个步骤进行的：在第一个步骤中，通过内源性核糖核酸酶将较长的dsRNA裂解成较短的，长度小于100-，50-，30-，23-，或21-个核苷酸的dsRNAs，称之为“小的干扰RNAs”或siRNAs。在第二个步骤中，较小的siRNAs介导了目标mRNA分子的降解。可以通过将较长的dsRNA或较短的siRNA导入细胞内的靶序列，获得这种RNAi效果。还发现了通过导入能产生与靶基因互补的dsRNA的质粒可以获得RNAi效果。业已将这种RNAi成功地应用在以下生物中进行基因功能确定：果蝇属(Kennerdell等(2000)Nature Biotech 18：896-898；Worby等(2001)Sci STKE Aug 14，2001(95)：PL1；Schmid等(2002)Trends Neuro sci 25(2)：71-74；Hammond等(2000)。Nature，404：293-298)，秀丽新杆线虫(Tabara等(1998)Science 282：430-431；Kamath等(2000)Genome Biology 2：2.1-2.10；Grishok等(2000)Science 287：2494-2497)，和斑马鱼(Kennerdell等(2000)Nature Biotech 18：896-898)。在这些模型生物中，业已报道了化学合成的较短的siRNA或体外转录的较长的dsRNA能有效抑制靶基因表达。在非人哺乳动物和人类细胞培养物中成功地获得RNAi效果的报道日益增多(Manche等(1992)。Mol.Cell.Biol.12：5238-5248；Minks等(1979)。J.Biol.Chem.254：10180-10183；Yang等(2001)Mol.Cell.Biol.21(22)：7807-7816；Paddison等(2002)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(3)：1443-1448；Elbashir等(2001)Genes Dev 15(2)：188-200；Elbashir等(2001)Nature 411：494-498；Caplen等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9746-9747；Holen等(2002)Nucleic Acids Research30(8)：1757-1766；Blbashir等(2001)EMBO J 20：6877-6888；Jarvis等(2001)TechNotes 8(5)：3-5；Brown等(2002)TecltNotes9(1)：3-5；Brummelkamp等(2002)Science 296：550-553；Lee等(2002)Nature Biotechnol.20：500-505；Miyagishi等(2002)Nature Biotechnol.20：497-500；Paddison等(2002)Genes & Dev.16：948-958；Paul等(2002)Nature Bioteclanol.20：505-508；Sui等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6)：5515-5520；Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9)：6047-6052)。我们所使用的两种siRNA双链能够在基于细胞的测定和异种移植肿瘤模型中有效地使ICT1024或EGF-AP表达沉默。不过，ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的mRNA的某些片段可用于siRNA定向剔除。
另一方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织接触能够与目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031DNA或RNA相互作用的抑制剂，并因此阻断目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因表达，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，或卵巢组织，其中，所述抑制剂是核酸分子，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够阻断目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因表达的分子，或它们的组合。
本发明的另一方面提供了给有需要的患者施用抑制剂的方法，其中，所述抑制剂分子是以单克隆抗体，肽拮抗剂，小分子蛋白酶抑制剂，裸露的寡核苷酸或载体形式送递的，其中，所述核酸能够与目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因相互作用。
本发明的另一方面提供了给有需要的患者施用抑制剂的方法，其中，所述抑制剂分子是以裸露的寡核苷酸或载体形式送递的，其中，所述核酸能与目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因相互作用，其中，所述核酸是作为载体送递的，其中，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒，例如，逆转录病毒或基于腺病毒的载体。
本发明的另一方面提供了通过给有需要的患者施用载体抑制基因的体内表达的方法，其中，所述载体包括目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因，其中，所述核酸能与目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因表达相互作用，其中，所述核酸能在哺乳动物细胞，例如，人类细胞中抑制目标ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031基因表达。
根据本发明的另一方面，所述抑制剂分子被导入组织，包括乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，肺组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
利用抑制剂阻断蛋白功能
ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的抗体抑制剂
本发明提供了用于治疗或预防由于细胞增殖而产生的疾病的组合物和方法，如实体肿瘤的增殖或转移，类风湿性关节炎，糖尿病性视网膜病，早发性视网膜病，和牛皮癣等。
本发明的发明人通过免疫细胞染色发现，与ICT 1024结合并且能够识别出现在从N-末端氨基酸开始的1-590号位置的片段上的表位的抗体，能够与人ICT 1024特异性地反应，并且，通过抑制结合能够抑制它的生物学活性。可以通过使用单克隆抗体诊断和治疗上述疾病，其中，所述疾病的病态是通过异常的血管形成产生的，例如实体肿瘤的增殖或转移，类风湿性关节炎，糖尿病性视网膜病，早发性视网膜病和牛皮癣。
因此，本发明提供了能特异性地与人ICT 1024反应的抗体。对于本发明的单克隆抗体来说，所提供的单克隆抗体能够识别出现在1-590号位置的片段上的表位，例如，从N-末端氨基酸开始计算的161-190或451-480号位置。C-末端表位区位于740-855号位置之间，例如826-855号位置。本发明还提供了能抑制人ICT 1024结合，并且还能抑制ICT 1024的生物学活性的单克隆抗体。
本发明的发明人通过免疫细胞染色发现，与ICT 1025结合并且能够识别出现在从N-末端氨基酸开始的1-590号位置的片段上的表位的抗体，能够与人ICT 1025特异性地反应，并且，通过抑制结合能够抑制它的生物学活性。通过使用上述单克隆抗体可以诊断和治疗上述疾病，其中，所述疾病的病态是由异常的血管形成产生的，例如实体肿瘤的增殖或转移，类风湿性关节炎，糖尿病性视网膜病，早发性视网膜病和牛皮癣。
因此，本发明提供了能特异性地与人ICT 1025反应的抗体。对于本发明的单克隆抗体来说，所提供的单克隆抗体能够识别出现在1-300号位置的片段上的表位，例如，从N-末端氨基酸开始计算的161-190或251-280号位置。C-末端表位区位于700-803号位置之间，例如726-803号位置。本发明还提供了能抑制人ICT 1025结合，并且还能抑制ICT 1025的生物学活性的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可以是任何抗体，只要它能与人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031特异性地反应就行。单克隆抗体的例子包括通过杂交瘤产生的抗体和通过用包括所述抗体基因的表达载体转化过的转化体产生的重组抗体。例如，可以制备用鼠类或兔建立的抗体。就是说，抗-人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031单克隆抗体可以通过以下方法获得：制备人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031蛋白作为抗原，用所述抗原对能够提供杂交瘤的动物进行免疫，如小鼠，大鼠，仓鼠，或兔等，以便诱导具有抗原特异性的血浆细胞，通过所述细胞与骨髓瘤细胞系的融合制备能够产生单克隆抗体的杂交瘤，并且随后培养所述杂交瘤。另外，抗-人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031单克隆抗体可以通过以下方法获得：制备能表达人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031蛋白的质粒，使用所述抗原通过DNA接种对能够提供杂交瘤的动物进行免疫，例如小鼠，大鼠，仓鼠，或兔等，以便诱导具有抗原特异性的血浆细胞，通过所述细胞与骨髓瘤细胞系的融合制备能够产生单克隆抗体的杂交瘤，并且随后培养所述杂交瘤。
另外，可以使用噬菌体展示方法从人类抗体文库中分离能结合ICT1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031蛋白的完全的人抗体，例如，参见美国专利5,885,793，其内容被完整地收作本文参考。人类抗体还可以从转基因异种小鼠体内分离，它业已被修饰成编码人类免疫球蛋白所有组成成分的一部分，例如，参见美国专利6,075,181，其内容被完整地收作本文参考。另外，可以使用缺少轻链的骆驼型抗体，例如，参见美国专利5,800,988，其内容被完整地收作本文参考。
能与人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031特异性反应的本发明的单克隆抗体可以是重组抗体。重组抗体的例子包括人源化抗体和抗体片段。本发明的重组抗体可以通过采用基因重组技术修饰本发明的上述单克隆抗体获得。所述重组抗体包括通过基因重组产生的抗体，如人源化抗体和抗体片段(例如，单链抗体，二硫化物稳定化的抗体)。其中，具有单克隆抗体的特征，表现出抗原性，并且在血液中具有长的半衰期的抗体被优选用作治疗剂。本发明的人源化抗体包括人类嵌合抗体和人CDR(互补决定区；以下称之为″CDR″)-嫁接抗体。本发明的抗体片段包括抗原结合片段(以下称之为″Fab″)，Fab′，F(ab′)2，单链抗体(单链Fv；以下称之为″scFv″)，以及二硫化物稳定化的抗体(二硫化物稳定化的Fv；以下称之为″dsFv″)，它能与ICT 1024特异性地反应。所述抗体还可以是在美国专利号5,837,242中所披露类型的“双抗体”，其内容被完整地收作本文参考。
能与人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031反应的抗体可以是人源化抗体，它选自人嵌合抗体和人CDR-嫁接抗体。
本发明抗体的结构可以属于任何免疫球蛋白(Ig)类型，不过，优选包括IgG类型免疫球蛋白的C区，特别是IgG亚类，如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4。
另外，本发明涉及以下方法：
对人进行免疫学检测的方法，包括让人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031与本发明的抗体或肽反应；
用于对在表面上表达人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的细胞进行免疫学检测的方法，包括让人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031与本发明的抗体或肽反应；
抑制人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的结合的方法，包括让人ICT 1024与本发明的抗体或肽反应；
用本发明的抗体或肽抑制人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的生物学活性的方法；
用于检测由于异常的细胞增殖而产生的病态发展的疾病的方法，包括让样品与本发明的抗体或肽反应；和
预防或治疗疾病的方法，包括给需要这种预防或治疗的人施用有效量的本发明的抗体或肽。
在用于对人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT1031进行免疫学检测的上述方法中，所述人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031或ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的片段可以是可溶的。
在用于抑制人ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的生物学活性的上述方法中，例如，人ICT 1003或ICT-1024或ICT1025或ICT 1031的活性受到了抑制。
在上述用于检测疾病的方法中，例如，所述方法可以包括(a)分离人细胞或它的破碎溶液，它的组织或破碎溶液，血清，胸膜液，腹水或眼泪，以便制备样品，(b)让在步骤(a)中制备的分离的样本与本发明的单克隆抗体或肽反应，(c)让在步骤(b)中制备的反应过的样品与标记过的抗-小鼠IgG抗体或结合片段进一步反应，和(d)测定或观察在步骤(c)制备的标记过的样品。
在上述用于预防或治疗疾病的方法中，所述疾病的例子包括通过异常的细胞增殖产生病态的疾病。
通过异常的细胞增殖产生病态的疾病的例子包括实体肿瘤的增殖或转移，慢性类风湿性关节炎，糖尿病性视网膜病，早发性视网膜病，和牛皮癣。实体肿瘤的例子包括乳腺癌，前列腺癌，大肠癌，胃癌和肺癌。
本发明涉及含有本发明的抗体或肽以及诊断性或可以药用的载体的组合物。
患有以表达或超量表达ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031为特征的肿瘤的患者是通过施用ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031抗体治疗的。
ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031-特异性抗体能在细胞培养物和病理学组织中抑制细胞增殖。可以开发不同的ICT-1024或ICT 1025-特异性抗体，并且表现出能抑制细胞增殖。例如，可以将肿瘤细胞(肝癌细胞系，肺癌细胞系和乳腺癌细胞系)接种到96孔平板上，并且与不同浓度的抗体一起培养48小时。可以固定所述细胞，并且通过硫代若丹明B染料测定监测细胞生长。数据表明，与缺少它的情况相比，在使用ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT1031-特异性抗体的情况下，细胞活性和增殖都减弱了。
被动免疫
给诊断患有肿瘤或有患有肿瘤的危险的个体施用纯化的抗体制剂(例如，纯化的单克隆抗体，抗体片段，或单链抗体)。所述抗体制剂是使用本领域公知的被动免疫方法施用的，例如，静脉内或肌内免疫。用于本文所述方法的抗体是用生理学上可接受的赋形剂配制的。例如，所述赋形剂是本领域所公知的生理盐水。
所述抗体优选是高亲和力抗体，例如，IgG-型抗体或它的片段或单链。另外，所述抗体是IgM同种型。抗体是单克隆抗体，例如鼠类单克隆抗体或其片段，或业已人源化的鼠类抗体。所述抗体是人单克隆抗体。特定单克隆抗体的亲和力通过已知方法进一步提高。例如，通过选择不断增高的结合力(例如，根据在以下文献中披露的方法：Boder等，2000，Proc.Natl .Acad.Sci.U.S.A.97：10701-10705)。所述抗体，抗体片段，或高亲和力单链抗体在施用之前任选与有毒部分偶联。适合偶联的有毒部分包括蓖麻毒素，假单胞菌毒素，白喉毒素以及放射性同位素和本领域已知的化疗剂。所述抗体毒素在与肿瘤细胞结合或内化到肿瘤细胞的细胞质中时能破坏或杀伤肿瘤细胞。
抗体制剂或抗体-毒素制剂是以大约0.01-2mL/kg体重的剂量施用的。根据减轻接受治疗的个体的肿瘤负荷的需要，剂量可以是每天，每周，或每月重复施用的。
主动免疫接种是诱导动物对抗原作出反应的过程。在免疫接种期间，能识别抗原的细胞(B细胞或细胞毒性T细胞)被无性繁殖。另外，对所述抗原特异的辅助T细胞群体同样增加了。免疫接种还涉及特化的抗原呈递细胞，它能处理抗原，并且以能够刺激两个途径之一的形式展示。在免疫细胞扩增和激活之后的抗原识别，导致了抗原特异性抗体和抗原特异性细胞免疫反应的产生。成功的免疫接种，表现为与免疫接种之前相比，在免疫个体的血清中ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031-特异性抗体滴度的水平增加。与免疫之前的滴度相比，ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031-特异性抗体滴度优选为至少10％，更优选至少50％，更优选至少100％，最优选200％。
对于主动免疫来说，用ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031多肽或编码所述肽的多核苷酸免疫个体。例如，用全长的ICT1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031对人类患者进行免疫。可以同时施用标准佐剂制剂，以便增强所述免疫多肽的免疫原性。另外，使用了较短的多肽，例如，ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031的免疫原性片段。例如，多肽包括ICT-1024的细胞外催化结构域(例如，ICT-1024的1-590号氨基酸)。ICT-1024的其他免疫原性片段包括位于1-590号氨基酸片段内的片段。包括ICT 1025的细胞外结构域的多肽。
单克隆抗体治疗是被动免疫治疗，因为所述抗体是在体外大量产生的，而不是由人体本身的免疫系统产生的。这种类型的治疗即使在免疫系统减弱的情况下也可能是有效的，这种减弱对于癌症患者来说是常见情况。这种治疗不需要免疫系统在与癌症抗争中采取“主动”作用。抗体是通过将来自小鼠的骨髓瘤细胞与能产生特异性抗体的小鼠B细胞融合大量产生的。通过这种融合产生的细胞被称作杂交瘤。能识别特定抗原的B细胞与永生化的骨髓瘤细胞的结合使得杂交瘤细胞成为永久的抗体生产工厂。由于所述抗体都是由单一的(单个的)杂交瘤细胞产生的相同的克隆，它们被称为单克隆抗体。能够与某些类型癌细胞上的特殊抗原，例如ICT 1003或ICT-1024或ICT 1025或ICT 1031反应的单克隆抗体能够中和目标蛋白或阻断它的生物学功能。结果是，EGF-AP被灭活，并且EGF途径被关闭，并且抑制了肿瘤生长。
抗体治疗可以用以下方法进行：A.裸露的单克隆抗体，所述抗体本身与癌细胞上的特异性抗原结合。B.偶联的单克隆抗体是与药物，毒素，或放射性原子连接的，并且被用作送递媒介物，将这些物质直接携带到癌细胞中。Mab起着归巢装置的作用，在身体中循环，直到它被具有匹配抗原的癌细胞吸引并且和它结合。它将有毒物质送递到最需要它的地方，减轻对身体其他部分的正常细胞的破坏。不过，偶联的抗体通常仍然能导致比裸露的抗体更严重的副作用。C.免疫毒素，它是通过将毒素(来自植物或细菌的有毒物质)与单克隆抗体结合制备的。业已通过将单克隆抗体结合在诸如白喉毒素(DT)或假单胞菌外毒素(PE40)的细菌毒素，或诸如蓖麻毒素A或saporin的植物毒素上制备了多种免疫毒素。D.直到最近，Mab治疗的效果都是有限的，因为所述抗体是由小鼠杂交瘤细胞产生的。在某些场合下，这些抗体最初十分有效。不过，在经过一段时间之后，患者的免疫系统会将所述小鼠抗体识别为“外源的”并且破坏它。为此，通过将小鼠抗体基因的决定识别特定肿瘤抗原的部分与来自人类抗体基因的其他部分结合制备了人源化Mab。这种小鼠-人抗体基因产物，看上去与正常的人类抗体足够相似，避免了被患者自身的免疫系统破坏。这有助于所述抗体更长时间地起作用。上述所有类型的方法都可用于ICT 1024或EGF-AP型抗体治疗。其他方法，如细胞内抗体，单链抗体和DNA疫苗也可用于制备抗体制剂，用于研究，诊断和治疗目的。
在本发明中，抗体抑制剂的两种不同的实施方案根据ICT 1024的跨膜拓扑学：N-末端位于细胞外，以及N-末端位于细胞内。当N-末端位于细胞外时，优选1-409号AA的大的片段作为抗体制备的抗原，使用完整的409AA的肽或该片段上的不同的部分。由于它们与特定HLA类型的结合强度，有若干种序列可用作好的抗原：GLSAPHTPV(174TH)(SEQ ID NO.；43)，GMQKIIDPL(151TH)(SEQ ID NO：44)，KMSFRAAAA(213)(SEQ ID NO：45)和LTAEEPSFL(30)(SEQ ID NO：46)。
设计包括所述序列的抗原的肽，能提高所述诱导抗体的结合活性。在这种场合下，只有若干短的肽片段位于细胞外面，它可能不是用于制备结合ICT 1024的抗体的有效的抗原。当N-末端位于细胞内时，推测来自433-660号AA的另一个长的ICT 1024蛋白片段位于所述细胞外。在这种场合下，所述片段作为整体提供了一种好的抗原，或从该片段上选择的多种抗原。在所述片段上存在若干强的HLA结合基序：SQHETVDSV(433TH)(SEQ ID NO：47)，GVYENVKYV(446TH)(SEQID NO：48)，YVQQENFWI(453TH)(SEQ ID NO：49)，和LLPFLNPEV(641TH)(SEQ  ID NO：50)。
有一种情况是C-末端结构域位于细胞外。来自823-855AA的短的片段也可用作肽抗原，它可以具有完整序列或部分序列。
选择三种30个AA的肽作为制备多克隆抗体和单克隆抗体的例子：
N’-RGRAFRVADDTAEGLSAPHTPVTPGAASLC-C’(161-190th)(SEQ IDNO：51)；
N'-VKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMR-C’(451-480th)(SEQ IDNO：52)；
N'-PVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH-C’(826-855th)(SEQ IDNO：53)。
还可以选择具有14AA至超过100AA的类似的肽序列作为潜在的肽抗原。
在本发明中，根据ICT 1025的跨膜拓扑学存在抗体抑制剂的两种不同的实施方案：N-末端位于细胞外，以及N-末端位于细胞内。当N-末端位于细胞外时，优选从1-300号AA的大的片段作为抗体制备的抗原，使用完整的300AA的肽或该片段上的不同的部分。有若干种序列可用作好的抗原，这是因为它们与特定HLA类型的结合强度：ALWVLGLCC(3TH)(SEQ ID NO：76)，VLGLCCVLL(6TH)(SEQ IDNO：77)，LLHVTDTGV(144TH)(SEQ ID NO：78)和SELIGQFGV(189TH)(SEQ ID NO：79)。设计包括所述序列的抗原的肽，能提高所述诱导抗体的结合活性。在这种场合下，只有若干种短的肽片段位于细胞外面，它可能不是用于制备结合ICT 1025的抗体的强抗原。有一种情况是，C-末端结构域位于细胞外。从823-855AA的短的片段可以用作肽抗原，它具有完整的序列或部分序列。
选择三种30个AA的肽作为制备多克隆抗体和单克隆抗体的例子：
N'-ADDEVDVDGTVEEDLGKSREGSRTDDEVVQ-C’(21-50th)(SEQ ID No：80)；
N’-SAFLVADKVIVTSKHNNDTQHIWESDSNEF-C’(201-230th)(SEQ IDNo：81)；
N'-SEKTKESREAVEKEFEPLLNWMKDKALKDK-C’(701-730th)(SEQ IDNo：82)。
还可以选择大小为14个AA至超过100个AA的类似的肽序列作为潜在的肽抗原。
根据本发明的另一方面，将所述抑制剂分子导入组织，包括乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，肺组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
抑制性蛋白酶抑制剂
还提供了肽拮抗剂，小分子蛋白酶抑制剂和其他类型的ICT 1024以便阻断或抑制ICT 1024活性。
提供以下实施例是为了说明本发明的实施方案，而不应当被视为限定本发明的范围。
实施例：
例1.用于目标验证的基因送递方法：
效力优先发现方法是使用可用作特定疾病途径(例如血管生成)中起着关键角色和完善的疾病模型(例如，异种移植到裸鼠上的人类肿瘤)作用的基因开始的。有效的基因送递工具是关键的，就是说，具有强表达，但是同等重要或更重要的是，具有来自送递工具本身的较少的背景活性的工具。非病毒和基于聚合物的送递系统可以提供用于实体肿瘤的有效送递和低的背景。在治疗之后的病理学，药理学和组织学结果是通过与基因表达和蛋白谱比较进行分析的。根据生物信息分析和生物学分析，以特定方式显著上调和下调的基因和蛋白，可以仔细地选择，并且通过相同的反复的体内验证方法进一步分析。该方法始于基因向肿瘤组织中的有效送递。首先通过生长速度，组织学改变评估受影响的肿瘤，然后收获用Affymetrix芯片进行表达特征分析。鉴定高度上调或下调的目标用于疾病控制验证。新的目标是在体内验证的。
通过效力优先发现方法鉴定的目标与使用常规方法鉴定的目标不同。效力优先发现方法的优点是，通过该方法选择的目标与疾病效力相关，而不是简单地与疾病状态相关(参见图1)。所述目标的表达变化是由于送递的基因的干扰和疾病过程的动力学。它们更适合药物发现。
例2.已知因素对肿瘤的干扰。
用已知能影响肿瘤生长的基因干扰人乳腺癌腺癌细胞诱导的异种移植肿瘤，并且强制生长得更快或更慢。在Ncr nu/nu小鼠上用MDA-MB-435细胞诱导异种移植肿瘤模型。这种验证是使用专有的聚合物介导的IL-2和bFGF送递进行的，基于我们以前的数据，并且bFGF是能促进肿瘤生长的众所周知的药物目标，而IL-2不仅是目标，而且是被认可的癌症抑制药物。采集用IL-2处理的4种肿瘤样品，用bFGF处理的4种肿瘤样品，和作为对照用Luc处理的2种样品并且加工。当肿瘤的大小达到50mm3时，将pCI-IL-2和pCI-bFGF直接送递到肿瘤内，用pCI-Luc作对照。在不同的时间点收获肿瘤组织(一共10个)，并且通过RNAsol分离RNA样品，定量，并且凝胶验证它们的完整性。数据表明，IL-2能够抑制肿瘤生长，而bFGF能促进肿瘤生长。
例3.Affymetrix芯片进行表达分析
用Affymetrix GeneChip U133 A对来自肿瘤组织的总的RNA样品进行表达分析。图片表示原始的阵列图象。当处理样品与对照样品进行比较，并且用生物信息方法对最初的分析数据作进一步的分析。根据肿瘤生长速度和效力数据，结合生物信息数据和文献检索，我们使用了至少两倍的量作为显著调控的目标的基准。所述信号必须超过200。
例4.鉴定的新的目标。
根据对肿瘤生长的干扰作用，生物信息分析和文献检索，根据它们的表达特征变化，只选择了很小百分比的基因目标。例如，根据来自Affymetrix U133 A芯片的大约23,000对的比较，选择了156个目标。在第二次注射IL-2表达载体24小时之后收获肿瘤组织。在156个选择的目标中，其中的111个根据UniGene数据库注释是已知的，而45个是未知的新的目标。在所述已知目标中，87％是与肿瘤相关的。如果可以采用相同的比例，我们希望超过35个目标是新的肿瘤目标。另外，所述命中属于若干肿瘤形成途径。
所述选定的目标中的很多是众所周知的，并且其中的某一些处在临床发育的不同阶段(参见表1)。大量的未知目标(在UniGene数据库中没有说明)具有作为新的肿瘤目标的巨大潜力。为了在异种移植肿瘤模型中进一步验证，从IL-2和bFGF处理过的样品中选择了超过200个目标(参见表2)。所述验证的策略是用业已完善的方法筛选上述目标，然后对每一个阳性目标进行更充分的研究。
在156个选择的目标中(参见表1)，其中的很多是充分表征过的，并且处在临床研究的不同阶段。以上例子表明，所选择的已知或未知目标具有很大的潜力。
根据对用IL-2和bFGF处理过的8种组织样品的表达分析，我们选择了高度上调或下调的目标。根据UniGene数据库注释，所述目标中大约2/3是已知的，1/3是新的。选择的目标，无论是已知的或新的，进行疾病控制验证。
例5.目标验证方法。
使用了最近发现的新的技术平台，将RNAi介导的体内基因沉默用于验证控制肿瘤疾病的药物目标(参见美国临时申请流水号60/4019099)。本发明还通过执行一套完整的实验验证了所述技术平台，研究长有肿瘤的小鼠模型上的有效载荷和送递方法。
1)目标验证：肿瘤相关性或控制
在很多水平的药物目标验证中，最终目标是验证实际控制疾病的候选目标。疾病控制目标是判断药物发现的有高价值的目标。药物开发的目的是能选择性靶定关键途径和这些途径中的关键控制因子的产品，以便提供对所述疾病的有效的治疗控制。所述关键途径和因子的验证，需要验证控制所述疾病的每一种候选目标的添加或扣除，能明确增强或减轻病理学的结果。体外基于细胞的方法业已提供了有助于鉴定和筛选潜在目标的有用信息。不过，目标控制与疾病相关的体外细胞模型的能力，通常不足以证明所述目标确实能控制疾病过程，即多种类型细胞的表达的相互作用导致了疾病病理学。目标对疾病控制的明确验证，只能通过在真实的疾病模型中研究所述目标获得。
通过基因组方法业已大大加快了目标发现过程，但是验证仍然是瓶颈。第一代基因组方法业已产生了在验证步骤中积累起来的大量的候选目标。有很多方法目前被用于研究这些基因目标的功能，并且验证它们在疾病过程中的作用。很多这样的方法尽管具有有效和高处理量的优点，但通常只能在确定对疾病的相关性或关系方面取得成功，而不是在确定控制作用方面取得成功。业已证实更新的基因剔除和正向或逆向基因组方法是有用的，但是，所鉴定的基因的抑制作用或突变可能具有致病作用，缺少有关基因超量表达的潜在的有价值的信息。另外，它们同样主要应用在体外基于细胞的表型中，它们不能体现大部分疾病的复杂的多细胞机制，如肿瘤血管生成，并因此存在丢失在相邻的细胞途径中的重要目标或提供不完全的没有完整的生物学含义的疾病关系的风险。
2)快速的权威的目标验证
最近，我们业已披露了两种用于验证癌症相关的药物目标的技术平台，它们解决了上述多种限制，并且在目标验证过程中具有有价值的互补作用。独特的和专有的目标分辨方法通过在肿瘤组织中超量表达转基因或使内源基因沉默直接在动物肿瘤模型中验证目标。所述方法减少了对成本昂贵的和缓慢步骤的权威性验证的需要，如基因克隆和测序，制备蛋白和抗体或转基因动物。这两种方法的组合大大加快了所述过程，并且，最重要的是，迅速消除了较弱的目标。另外，由所述方法获得的结果提供了实际控制所述疾病的目标的权威性的证据，关键的验证需要在药物发现的高成本步骤中进行。可将所述方法用于完成任何候选目标的验证，如由细胞培养物，模型生物，转基因动物等产生的目标。
3)目标发现：捕获在初步验证中错过的目标
不幸的是，另一个关键因素是，在目标发现和验证中，当体外或疾病相关方法被用作第一道“过滤器”时，很多高价值的疾病-控制目标可能错过。很多疾病控制目标可能只出现在完整的疾病模型中。例如，控制肿瘤血管的目标可能只出现在肿瘤和血管的结合部分。对于肿瘤来说，某些有价值的目标可能只能通过研究包括肿瘤和周围组织的组合体的体内生物学系统发现。
4)高处理量目标发现方案
我们还披露了一种用于发现疾病控制目标的方法，该方法是按比例放大所述基础方法，以便它可应用于以较高的处理操作能力筛选大量的基因目标。通过将所述方法放大到能够通过体内基因送递技术每一刻钟在动物肿瘤模型中处理1000个候选基因，该方法能够提供在很多场合下跳过或缩短初步的功能验证方法的可能性。
5)肿瘤目标消除
所披露的技术还能够快速检测候选目标在控制肿瘤生长方面的能力。考虑到优选对肿瘤生长具有强的作用的因素，消除只表现出对肿瘤生长的弱的或微不足道的控制的候选物。所述肿瘤目标分辨方法能快速将目标区分成三种类型，能促进肿瘤生长的目标，对肿瘤生长有很小作用的目标，以及能抑制肿瘤生长的目标。
例6.验证的新目标
选择已知的和未知的目标(参见例4)用于在肿瘤模型中进行疾病控制验证。根据专有的核酸送递技术，建立了两种不同的平台用于了解每一种目标的疾病控制特征，包括表达的剔除或超量表达。使用siRNA体内送递的高效方法，业已验证了若干类型的目标。鉴定并且验证了新的肿瘤形成相关目标(参见表3)。另一方面，本文还利用超量表达方法在相同的具有专有送递的异种移植肿瘤模型中验证了一种已知的血管生成相关基因。根据它们在肿瘤生长抑制中的作用，IL-12得到了明确的再次验证。相同的方法目前同样被用于新的目标验证。
表3.若干种类型目标的siRNA-介导的验证。
选择每个基因的两种siRNA目标，并且通过BLAST验证，并且由Dharmacon(Lafyette，C0)合成。将10μg每一种基因的特异性siRNA重复送递到MDA-MB-435异种移植模型的肿瘤内。测定肿瘤尺寸，N＝8或N＝10。A.第一种目标是使用异种移植的肿瘤模型验证的。将人VEGF和小鼠VEGFR2用作阳性对照。在第一类目标中验证了三种目标(参见表3，第I组)。B.第II组目标同样是用相同的测定方法验证的。在第II组中验证了两种目标(参见表3，第II组)。
第III组验证包括某些以前验证的目标，和某些新的目标。在第III组中验证了一种新的目标。
当以下目标ICT 1024，ICT 1025，ICT 1031，ICT 1030，和ICT 1003受到特异性siRNA分子的双链的下调时，改变肿瘤生长速度。其中，ICT 1030，乳脂球-EGF因子8蛋白或乳腺上皮BA46抗原，GeneBank登录号：NM_005928，BC003610以及它们的剪接衍生物的表现更像肿瘤抑制剂目标，或蛋白治疗和基因治疗目标。由于siRNA-介导的剔除导致了肿瘤生长加快而不是抑制。其他目标：ICT 1031(GeneBank no.：AK090698，肿瘤坏死因子配体超家族成员13，或TNF相关的增殖诱导配体以及它们的剪接变体，参见图3)，和ICT 1003(GeneBank no.：AK000847，人类新的锌指蛋白236或剪接变体)，在快速生长的肿瘤中都被上调了，并且被验证为合适的抗体，小分子，反义，SiRNA和其他拮抗剂的目标。
在用siRNA剔除体内检验的特定目标中，验证了4个目标(ICT 1024，ICT 1025，ICT 1030和ICT 1031)，n＝8，和n＝10(每一组分别具有8和10个肿瘤)(参见图3-6)。两种蛋白是细胞表面因子，具有完全相反的作用。通过特异性siRNA剔除ICT 1030，导致了肿瘤生长增强，而ICT 1031剔除诱导了肿瘤生长抑制。因此，前者可能是蛋白或基因治疗药物，而后者可能是抗体或小分子药物目标。
通过siRNA剔除体内检验了ICT 1003(每组8个肿瘤)。目标ICT 1003是新的锌指蛋白，并且可能是转录因子。特异性siRNA的ICT 1003剔除导致了肿瘤生长抑制(参见图4)。因此，所述蛋白可以是siRNA药物目标或小分子药物目标。
例7：小的干扰RNA(siRNA)：
根据本文所披露的目标ICT 1024，ICT 1025，ICT 1030，ICT 1031，或ICT 1003的DNA序列的目标区，制备了有义和反义siRNAs双链(例如，参见SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，或其片段)，并且其长度和构成通常小于100个碱基对(″bps″)，并且优选为大约30bps或更短，并且是通过本领域已知方法制备的，包括使用互补DNA链或合成方法。采用多核酸修饰技术，如肽核酸的SiRNA衍生物，也可用于本发明。所述siRNAs能够导致干扰，并且能在细胞，例如，哺乳动物细胞(例如人细胞)中，和在体内，例如，哺乳动物体(包括人)内导致特定基因的转录后沉默。本发明的典型的siRNAs具有最多29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它们的或它们之间的任何整数。
目标区是从DNA序列中选择的(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，或其片段)。在选择目标区和设计siRNA寡聚物时采用了各种方法，例如，应当避免5′或3′UTRs和靠近起始密码子的区域，因为这些区域可能富含调控蛋白结合位点。设计的序列优选包括AA-(N21或更少的核苷酸)-TT，并且具有大约30％-70％G/C-含量。如果没有发现合适的序列，将所述片段大小延长到AA(N29核苷酸)。例如，有义siRNA的序列分别相当于(N21核苷酸)-TT或N29个核苷酸。在后一种情况下，有义siRNA的3′末端被转化成TT。这种序列转化的原理是产生相应有义和反义3′突出末端的序列组成的对称的双链。据信，突出的3′突出末端有助于确保小的干扰核糖核苷蛋白颗粒(siRNPs)以大致相等比例的有义和反义目标RNA-裂解siRNPs形成(E1bashir等Genes & Dev.15：188-200，2001)。
ICT 1024 siRNA：有义或反义siRNAs是根据本文所披露的DNA序列的目标区设计的(参见SEQ ID NO：3)，并且包括最多29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它们的或它们之间的任何整数的片段。例如，靶定mRNA的有义链的21bpssiRNA包括：
5’-AAGCTGGACATTCCCTCTGCG-3’(SEQ ID NO：21)和
5’-AAGAGCCCAGCTTCCTGCAGC-3’(SEQ ID NO：22)。
ICT 1025 siRNA：有义或反义siRNAs是根据本文所披露的DNA序列的目标区设计的(参见SEQ ID NO：3)，并且包括最多29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它们的或它们之间的任何整数的片段。例如，靶定mRNA的有义链的21bpssiRNA包括：
5’-AACTGTTGAGGAGCCCATGGA-3’(SEQ ID NO：23)和
5’-AATCTGATGATGAAGCTGCAG-3’.(SEQ ID NO：24)。
ICT 1030 siRNA：有义或反义siRNAs是根据本文所披露的DNA序列的目标区设计的(参见SEQ ID NO：3)，并且包括最多29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它们的或它们之间的任何整数的片段。例如，21bps的siRNA包括：
目标区(碱基位置编号88-108，5′-aacccctgccacaacggtggt-3′(SEQ ID NO：9)，和相应的有义siRNA(SEQ ID NO：10)，5＇-aaccccUgccacaacggUggU-3′；
目标区(碱基位置编号190-210，SEQ ID NO：11)5＇-aaccactgtgagacgaaatgt-3′，和相应的有义siRNA(SEQ ID NO：12)5′-aaccacUgUgagacgaaaUgU-3′；并且在该过程中延长到ICTE 1030编码序列的末端，正如这里所示出的。
根据ICT 1030-编码序列设计了一组siRNAs/shRNAs(SEQ ID NO：3)。
ICT 1031 siRNA：有义或反义siRNAs是根据本文所披露的DNA序列的目标区设计的(参见SEQ ID NO：4)，并且包括最多29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它们的或它们之间的任何整数的片段。例如，21bps的siRNA包括：
目标区(碱基位置编号90-110，(SEQ ID NO：13)
5′-aactgccccagcgatctctgc-3′，和相应的有义siRNA(SEQ IDNO：14)，5′-aacUgccccagcgaUcUcUgc-3；
目标区(碱基位置编号330-310，(SEQ ID NO：15)
5′-aacctaattctcctgaggctg-3′，和相应的有义siRNA(SEQ IDNO：16)5′-aaccUaaUUcUccUgaggcUg-3′；并且在该过程中延长到ICTE 1031编码序列的末端，正如这里所示出的。
根据ICT 1031-编码序列设计了一组siRNAs/shRNAs(SEQ ID NO：4)。
ICT 1033 siRNA：有义或反义siRNAs是根据本文所披露的DNA序列的目标区设计的(参见SEQ ID NO：6)，并且包括最多29bps，25bps，22bps，21bps，20bps，15bps，10bps，5bps或接近它们的或它们之间的任何整数的片段。例如，21bps的siRNA包括：
目标区(碱基位置编号345-365，(SEQ ID NO：17) 5＇-aatgcggagaacactaattat-3′，和相应的有义siRNA(SEQ ID NO：18)，5′-aaUgcggagaacacUaaUUaU-3′；
目标区(碱基位置编号462-482，(SEQ ID NO：19) 5＇-aatgacaagccacatcgatgt-3′，和相应的有义siRNA(SEQ ID NO：20)5′-aatgacaagccacatcgatgt-3′；并且在该过程中延长到ICTE 1033编码序列的末端，正如这里所示出的。
根据ICT 1033-编码序列设计了一组siRNAs/shRNAs(SEQ ID NO：6)。
开发ICT 1024抗体的实验细节
制备ICT 1024蛋白或肽的表达载体
1.1基于哺乳动物基因表达载体的质粒DNA包括针核基因启动子或病毒基因启动子，多克隆位点序列，和polyA信号序列。所述启动子包括，但不局限于CMV启动子，RSV启动子，SV40启动子，EF启动子，E2F启动子，和腺病毒的E1基因启动子。PolyA序列包括，但不局限于bGH polyA，SV40 polyA和合成的polyA。
1.2基于哺乳动物基因表达载体的病毒基因启动子包括，但不局限于逆转录病毒载体，腺病毒载体，和杆状病毒载体。
1.3细菌表达载体包括，但不局限于基于pQE的载体，基于pGEX的载体，和pEPBlue载体。
1.4酵母表达载体包括，但不局限于pESC载体，p42K-TEF，和pFastBac。
1.5利用原核启动子的细胞质表达载体包括，但不局限于T7启动子，sp6启动子。
例8将ICT 1024全长的cDNA克隆到pCI载体上，用于哺乳动物 细胞表达和DNA免疫
ICT 1024的全长的cDNA(855aa)是通过PCR扩增制备的，使用从ATCC(MGC：20194)购买的cDNA克隆作模板。由于全长的ICT 1024cDNA为2568bp，为了减少在PCR反应期间可能出现的突变，设计了两对引物，以便制备两个较短的DNA片段。这些片段可以连接在一起，以便形成全长的ICT 1024 cDNA。
引物1：1024EcoUp2(28-聚体，相当于ICT 1024基因的111-128号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：54)
5′---C AGG AAT TCC ATG AGT GAG GCC CGCAGG---3′
引物2：1024MidDn(26-聚体，相当于ICT 1024基因的1770-1745号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：55)
5′---CC CTG GGA TCC TGG TGG CAG ACAGAG-3′
引物3：1024Sa1Dn(29-聚体，相当于ICT 1024基因的2678-2661号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：56)
5′---CC GGC GTC GAC TCA GTG GAG CTG AGC GTC---3′
引物4：1024MidUp(26-聚体，相当于ICT 1024基因的1755-1780号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：57)
5′---CA CCA GGA TCC CAG GGT GTG TGA TGA---3′
使用引物1/引物2和MGC 20194模板的PCR反应产生了1679bp的DNA片段，它包括ICT 1024的111-1770号核苷酸。使用引物3/引物4和MGC 20194模板的PCR反应产生了928bp的DNA片段，它包括ICT 1024的1755-2678号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和BamHI消化1679bp的DNA片段，用BamHI和SalI消化928bp的片段，然后通过三个片段的连接反应克隆到用EcoRI和Sal I裂解的pCI载体上。鉴定最终的产物pCI-ICT 1024质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pCI-ICT 1024表达质粒的限制图谱参见图17。有关ICT 1024蛋白编码区1670-3637的序列(SEQ ID NO 58)参见图25。
例9.将编码ICT 1024的N末端肽(553aa)的cDNA片段克隆到 pCI载体上，用于哺乳动物细胞表达和DNA免疫
通过PCR扩增制备编码ICT 1024的N末端553aa的cDNA，用MGC20194 DNA作模板。用一对引物制备1679bp的cDNA片段，该片段在它的5′末端包括EcoRI位点，在它的3′末端包括Sal I位点。另外，将TGA终止密码子整合到编码区末端，以便确保翻译的正确终止。
引物1：1024EcoUp2(28-聚体，相当于ICT 1024基因的111-128号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：54)
5′---C AGG AAT TCC ATG AGT GAG GCC CGCAGG---3′
引物5：1024MDnSal(29-聚体，具有Sal I位点+TGA+ICT 1024基因的1769-1755号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ IDNO：59)
5′---CC CTG GTCGAC TCA cct ggg atc ctg gtg---3′
用引物1/引物5和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了1679bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的111-1769号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和Sal1消化1679bp的DNA片段，然后克隆到用EcoRI和Sal1裂解的pCI载体上。鉴定最终的产物pCI-ICT 1024N质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pCI-ICT 1024N质粒的限制图谱参见图18。有关ICT 1024N末端553氨基酸编码区的1070-2731号核苷酸(SEQ ID NO：60)参见图26。
例10.将ICT 1024全长的cDNA克隆到pGEX-5X-3载体上，用于 在大肠杆菌宿主中进行蛋白表达
ICT 1024(855aa)的全长的cDNA是通过PCR扩增制备的，使用从ATCC(MGC：20194)购买的cDNA克隆作模板。由于全长的ICT 1024cDNA为568bp，为了减少在PCR反应期间可能出现的突变，设计了两对引物，以便制备两种较短的DNA片段，可将这两个片段连接在一起，以便制备全长的ICT 1024cDNA。
引物1：1024EcoUp2(28-聚体，相当于ICT 1024基因的111-128号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：54)
5′---C AGG AAT TCC ATG AGT GAG GCC CGC AGG---3′
引物2：1024MidDn(26-聚体，相当于ICT 1024基因的1770-1745号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：55)
5′---CC CTG GGA TCC TGG TGG CAG ACA GAG---3′
引物3：1024Sal(29-聚体，相当于ICT 1024基因的2678-2661号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：56)5′---CCGGC GTC GAC TCA GTG GAG CTG AGC GTC---3′
引物4：1024MidUp(26-聚体，相当于ICT 1024基因的1755-1780号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：57)
5′---CA CCA GGA TCC CAG GGT GTG TGA TGA---3′
用引物1/引物2和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了1679bp的DNA片段，该片段包括ICT1024的111-1770号核苷酸。用引物3/引物4和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了928bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的1755-2678号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和BamHI消化1679bp的DNA片段，用BamHI和Sal I消化928bp的片段，然后通过三个片段的连接反应克隆到用EcoRI和Sal I裂解的pGEX-5X-3载体(Amersham)上。pGEX-5X-3是细菌表达载体，它利用细菌tac启动子驱动GST结构域(27Kd)融合蛋白的表达。鉴定最终的产物pGEX-5X-3-ICT1024质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pGEX-5X-3-ICT 1024的验证的序列(SEQ ID NO：61)参见图27。
例11.将编码ICT 1024的N末端肽(553aa)的cDNA片段克隆 到pGEX-5X-3载体上，用于在大肠杆菌中进行蛋白表达。
通过PCR扩增制备编码ICT 1024的N末端553aa的cDNA，用MGC20194DNA作模板。将一对引物用于制备1679bp的cDNA片段，该片段的5′末端包括EcoRI位点，而在它的3′末端包括SaI I位点。另外，将TGA终止密码子整合到编码区的末端，以便确保翻译的正确终止。
引物1：1024EcoUp2(28-聚体，相当于ICT 1024基因的111-128号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：54)
5′---C AGG AAT TCC ATG AGT GAG GCC CGC AGG---3′
引物5：1024MDnSal(29-聚体，with SalI site+TGA+ICT 1024基因的1769-1755号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ IDNO：59)
5′---CC CTG GTCGAC TCA cct ggg atc ctg gtg---3′
用引物1/引物5和MGC20194模板进行的PCR反应产生了1679bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的111-1769号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和Sal I消化1679bp的DNA片段，然后克隆到用EcoRI和Sal I裂解的pGEX-5X-3载体上，鉴定最终的产物pGEX-5X-3-ICT 1024N质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pGEX-5X-3-1024N的限制图谱参见图14。有关序列(SEQ IDNO：62)参见图28。
例12.将编码ICT 1024的C末端肽(372aa)的cDNA片段克隆到 pGEX-5X-3载体上，用于在大肠杆菌中进行蛋白表达
通过PCR扩增制备编码ICT 1024的C-末端372aa的cDNA，用MGC20194DNA作模板。将一对引物用于制备1141bp的cDNA片段，该片段在它的5′末端包括EcoRI位点，而在它的3′末端包括Sal I位点。
引物6：1024midEcoUp(30-聚体，具有ICT 1024基因的EcoRI位点1560-1577号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：63)
5′---CCC AGG AAT TCC CAG GTG CAC AGC TTC ATT---3′
引物3：1024SalDn(29-聚体，相当于ICT 1024基因的2678-2661号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：56)
5′---CC GGC GTC GAC TCA GTG GAG CTG AGC GTC-3′
用引物6/引物3和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了1141bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的1560-2678号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和Sal I消化1141bp的DNA片段，然后克隆到用EcoRI和Sal I裂解的pGEX-5X-3载体上。鉴定最终的产物pGEX-5X-3-ICT 1024C质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pGEX-5X-3-ICT 1024C的验证过的序列参见图15。有关序列(SEQ ID NO：64)参见图27。
例13.将ICT 1024全长的cDNA克隆到pETBlue-2载体上，用于 在大肠杆菌宿主中进行蛋白表达
通过PCR扩增制备ICT 1024的全长的cDNA(855aa)，用从ATCC(MGC：20194)购买的cDNA克隆作模板。由于全长的ICT 1024 cDNA为2568bp，为了减少在PCR反应期间可能出现的突变，设计了两对引物，以便制备两个较短的DNA片段，这两个片段可以连接在一起，以便制备全长的ICT 1024 cDNA。
引物1：1024EcoUp2(28-聚体，相当于ICT 1024基因的111-128号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：54)
5′---C AGG AAT TCC ATG AGT GAG GCC CGC AGG---3′
引物2：1024MidDn(26-聚体，相当于ICT 1024基因的1770-1745号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：55)
5′---CC CTG GGA TCC TGG TGG CAG ACA GAG---3′
引物3：1024Sal(29-聚体，相当于ICT 1024基因的2678-2661号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：56)
5′---CC GGC GTC GAC TCA GTG GAG CTG AGC GTC---3′
引物8：1024ClaDn(30-聚体，相当于ICT-1024的2675-2658号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：65)
5′---CGC GGC ATC GAT GTG GAG CTG AGC GTC CAG---3′
用引物1/引物2和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了1679bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的111-1770号核苷酸。用引物3/引物8和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了925bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的1755-2675号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和BamHI消化1679bp的DNA片段，用BamHI和Clal消化928bp的片段，然后通过三个片段的连接反应克隆到用EcoRI和Cla I裂解的pETBlue-2载体(Novagen)上。鉴定最终的产物pETBlue-2-ICT 1024质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pETBlue-2-ICT 1024质粒的限制图谱参见图28。有关序列(SEQ ID NO：66)参见图30。
例14.将编码ICT 1024的N末端肽(400aa)的cDNA片段克隆 到pETBlue-2载体上，用于在大肠杆菌中进杆蛋白表达
编码ICT 1024的N末端400aa的cDNA是通过PCR扩增产生的，用MGC20194DNA作模板。将一对引物用于制备1221bp的cDNA片段，该片段在它的5′末端包括EcoRI位点而在它的3′末端包括Cla I位点。没有终止密码子整合在编码区的末端，因为在pETBlue-2载体的下游具有一个终止密码子。
引物1：1024EcoUp2(28-聚体，相当于ICT 1024基因的111-128号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：54)
5′---C AGG AAT TCC ATG AGT GAG GCC CGCAGG---3′
引物7：1024Cla400Dn(30-聚体，具有ICT 1024基因的1293-1310号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：67)
5′---CGC GGC ATC GAT GTC CAT GTC CTC GATCTG---3′
用引物1/引物7和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了1221bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的111-1310号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和Cla I消化1221bp的DNA片段，然后克隆到用EcoRI和Cla I裂解的pETBlue-2载体上。鉴定最终的产物pETBlue-2-ICT 1024N质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pETBlue-2-ICT 1024N的限制图谱参见图17。有关序列(SEQID NO：68)参见图31。
例15.将编码ICT 1024的C末端肽(372aa)的cDNA片段克隆 到pETBlue-2载体上，用于在大肠杆菌中进行蛋白表达
编码ICT 1024的C-末端372aa的cDNA是通过PCR扩增产生的，用MGC20194DNA作模板。用一对引物制备1139bp cDNA片段，该片段在它的5′末端包括EcoRI位点而在它的3′末端包括Cla I位点。没有终止密码子整合到编码区的末端，因为在pETBlue-2载体的下游有终止密码子。
引物6：1024 midEcoUp(30-聚体，具有ICT 1024基因的EcoRI位点1560-1577号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：63)
5′---CCC AGG AAT TCC CAGGTG CAC AGC TTC ATT-3′
引物8：1024ClaDn(30-聚体，相当于ICT-1024的2675-2658号核苷酸，GenBank登录号：BC014425)(SEQ ID NO：65)
5′---CGC GGC ATC GAT GTG GAG CTG AGC GTC CAG---3′
用引物6/引物3和MGC 20194模板进行的PCR反应产生了1139bp的DNA片段，该片段包括ICT 1024的1560-2675号核苷酸。在纯化PCR产物之后，用EcoRI和Cla I消化1139bp的DNA片段，然后克隆到用EcoRI和Cla I裂解的pETBlue-2载体上。鉴定最终的产物pETBlue-2-ICT 1024C质粒DNA，并且通过DNA测序验证它的序列。
有关pETBlue-2-ICT 1024C质粒的限制图谱参见图18。有关序列(SEQ ID NO：69)参见图32。
ICT 1024蛋白和肽的生产和纯化
需要用纯化的ICT 1024蛋白或肽作抗原通过常规方法制备ICT 1024特异性抗体。ICT 1024蛋白或肽可以用各种表达系统生产，包括，但不局限于哺乳动物培养细胞，酵母，昆虫细胞，和大肠杆菌细胞。仅将能够保存蛋白抗原性的纯化方法用于制备ICT 1024蛋白或肽。一般，第一个步骤是将携带有全长的1024cDNA或编码ICT 1024肽的一段cDNA导入它们相应的宿主系统。例如，使用标准转染方法，如脂质体介导的或电穿孔介导的转染将哺乳动物表达载体导入293细胞。第二个步骤是扩增携带所述表达载体的宿主细胞。一种例子是对用表达载体转化的酵母或大肠杆菌宿主细胞进行发酵。第三个步骤是如果使用诱导型表达载体，在宿主细胞中诱导重组蛋白的表达。如果重组蛋白对宿主细胞有毒，这一点是特别重要的。下一个步骤是从宿主细胞裂介液中分离重组蛋白。最后的步骤是如果所述重组蛋白是以融合蛋白形式产生，除去融合结构域，并且纯化需要的重组蛋白或肽。
例16.用pGEX-5X-3/BL21细胞生产ICT 1024蛋白或肽
谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因融合系统(Amersham)是用于表达，纯化并且检测在大肠杆菌中产生的融合蛋白的多用途系统。该系统提供了基因或基因片段的诱导型，高水平表达，GST部分位于氨基末端，而感兴趣的蛋白位于羧基末端。通过亲和层析，使用固定化的谷胱甘肽从细菌裂解液中纯化GST融合蛋白。GST融合蛋白是由谷胱甘肽介质固定的，并且通过洗涤除去杂质。将还原的谷胱甘肽用于在温和的，非变性条件下洗脱融合蛋白，以便保持蛋白的肿瘤发生能力。为了制备ICT 1024蛋白或肽，作为生产抗体的抗原，用位点特异性蛋白酶将ICT 1024蛋白或肽从GST上裂解下来，这种蛋白酶识别的序列位于pGEX质粒上的多克隆位点的上游。
筛选正确的GST表达菌落
采用由Amersham提供的标准方法将pGEX-5X-3-ICT 1024，pGEX-5x-3-1024N，或pGEX-5x-3-ICT 1024C转入宿主细胞大肠杆菌BL21。
将12个单菌落接种到2ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下摇晃(250rpm)培养，直到OD595达到0.6。
将培养物分为2个1ml，用于IPTG诱导(1)和无-诱导(NI)。向″I″试管中添加IPTG到最终浓度为0.1-0.5mM。
在37℃下继续摇晃(250rpm)3小时，然后将培养物转移到1.5ml微型试管中，通过以14,000rpm的速度离心1分钟回收细胞。
将200μl的蛋白样品缓冲液添加到细胞沉淀中，悬浮细胞，然后在100℃下将样品煮沸2-5分钟。
将15μl的每一种样品加样到10％SDS-Page凝胶上，将蛋白分子量标记加样到平行的泳道上。在对凝胶进行电泳之后，用考马斯蓝对凝胶进行染色。GST蛋白自身的分子量为26Kd，GST-ICT 1024融合蛋白的分子量为122kd，GST-ICT 1024N融合蛋白的分子量为88Kd，GST-ICT 1024C融合蛋白的分子量为57Kd。
选择具有最高表达水平的GST融合蛋白的各个克隆，用于生产相应的GST融合蛋白。
GST-融合蛋白的分离
将选择的单菌落接种到100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中，在37℃下摇晃(250rpm)培养过夜。
将25ml的过夜培养物转移到装在2-L烧瓶中的1升预热的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中，在37℃下摇晃(250rpm)培养，直到OD595达到0.6。
添加IPTG至最终浓度为0.1-0.5mM，以便诱导GST融合蛋白表达，在37℃下摇晃(250rpm)培养3小时。
通过以3,600rpm的速度离心10分钟回收细胞(Servall GS-3转子)。
将细胞重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的20ml R.S.中(有关R.S.缓冲液R.S.缓冲液混合物参见附录)。
对样品进行超声波处理6次，每次30秒。在超声波处理期间，将样品保持在冰上，并且在每次超声波处理之后混合样品。
用Servall GS-3转子以10,000rpm对超声波处理的样品进行离心10分钟。将上清液转移到新的试管中。
向上清液添加谷胱甘肽-琼脂糖球浆(GSH-琼脂糖粉末，sigmaG4510，在4ml RS中平衡的70mg球，在室温下，在15-ml试管中倒转1小时至过夜，更换2-3次缓冲液，得到了1ml紧密的膨胀的球体浆，可以作为50％的浆保存1个月。在50ml的试管中，每1ml树脂使用1.5-2.0升的上清液(37.5-50ml))。
在40℃下柔和地混合上清液/浆0.5-2小时。
以1500rpm的速度离心2分钟，每次用10ml RS进行批量洗涤2次。将10ml RS添加到悬浮样品中，加样到柱上。
用10ml RS漂洗所述柱。
用存在于RS中的50mM GSH(pH 8.0，通过NaOH调整)剥离所述柱。
通过手工或级份收集器采集0.5ml级份。GST融合蛋白应当在5-11号级份中洗脱。
通过将每一个级份的2μl等份样品放入微量滴定板的孔中，并且添加100μl的1x Bradford试剂(Biorad试剂的1∶5稀释液)，并且检查混合物的颜色，对GST融合蛋白进行定位。
为了从ICT1024蛋白或肽中除去GST，在批量洗涤之后，用凝血酶裂解缓冲液(T.C.B.，参见附录)洗涤上清液/浆的混合物1次。然后，添加2ml T.C.B.和10μg(13μl)的凝血酶(0.768μg/μl)，在室温下摇晃1.5小时(Thrumbin，human，lyoph，Cat：605195，Calbiochem Corp.)
附录：
R.S.缓冲液(500ml)
  1M Tris.HCl，pH 7.9   10ml(20mM)
  0.5M EDTA   0.2ml(0.2mM)
  NaCl   29.22g(1M)
R.S.缓冲液鸡尾酒
  R.S.+以下成分   500ml   1升   最终浓度
  2ME(40C)   1ml   2ml   0.2％
  NP-40(RT)   2.5ml   5ml   0.5％
  PMSF(RT)MW174.2   17.42mg(存在于EtOH中)   34.84mg   0.2mM
  抑肽酶(-200C，H2O)   1mg(游离地存在于水中)   2mg   2μg/ml
  亮抑酶肽(40C or-200C)   1mg(存在于水中，1mg/ml)   2mg   2μg/ml
  抑胃酶肽-A(40C or-200C)   1mg(存在于EtOH中，最高达1mg/ml)   2mg   2μg/ml
T.C.B.(凝血酶裂解缓冲液)，30ml：
  1M Tris，pH 8.0   1.5ml(1∶20. 50mM)
  4M NaCl   1.125ml(0.15M)
  1M CaCl2   0.075ml(2.5mM)
  2ME   0.03ml(0.1％)
例17.用pETBlue-2/BL21细胞生产ICT 1024蛋白或肽
ICT 1024是属于RHO家族的膜结合蛋白酶。我们在pGEX-5X-3/BL21表达系统中的初步数据表明，GST-ICT 1024融合蛋白对细菌宿主具有很高的毒性，因此，难于通过IPTG诱导在DH5α-T1或BL21细胞中获得高水平的GST-ICT 1024融合蛋白表达。PETBlue系统(Novagen)可能有助于我们解决毒性问题。pET-Blue2载体利用噬菌体T7启动子驱动感兴趣的基因的表达。噬菌体T7聚合酶在通过IPTG诱导时仅仅在BL(DE3)细胞中表达。当使用BL21(DE3)pLysS细胞时，T7聚合酶活性可以通过表达的T7溶菌酶进一步增加。该系统的所有上述特征使得感兴趣的蛋白的表达具有很高的选择性，并且是严格控制的，这有利于我的目的：表达原本有很高毒性的蛋白。使用pETBlue-2的另一个优点是，使用LacZ基因产物的α-互补，β-半乳糖苷酶，利用质粒构建体的蓝色/白色菌落型筛选。另外，工程产生的融合蛋白的C′-末端包括框内标记：HSV标记和His，它们是串联的标记。这些标记可用于分别纯化和检测融合产物。
利用由Novagen提供的标准方法将pETBlue-2-ICT 1024，pETBlue-2-1024N，或pETBlue-2-ICT 1024C质粒DNA转入宿主细胞大肠杆菌BL21。转化的克隆可以通过蓝色/白色菌落筛选方便地用肉眼鉴定，因为pETBlue-2载体使用弱组成型大肠杆菌启动子(tet)驱动lacZα-肽的表达，而ICT 1024基因的表达是由沿相反方向的T7lac启动子驱动的。将ICT 1024序列插入多克隆位点(MCS)，破坏了lacZα-肽的表达，并且在菌株DH5α中产生了白色菌落表型，所述菌株是在存在X-gal的条件下铺平板的。来自未修饰过的载体的菌落变成蓝色。由于T7-驱动的蛋白表达需要插入片段沿相对tet启动子的反义方向克隆，ICT 1024序列的基础表达实际上是缺乏的。出现在pETBlue-2质粒上的高拷贝数量的pUC复制起点，大大提高了质粒产量，并因此增加了表达的ICT 1024蛋白或肽。
pETBlue-2载体上的ICT 1024基因或片段是高水平表达的，因为插入的序列处在相对T7lac启动子的有义方向上，并且所述读框满足了pETBlue-2载体的翻译要求。蛋白表达是通过将重组pETBlue-2质粒转入宿主菌株TunerTM(DE3)pLacI或OrigamiTM(DE3)pLacI实现的，然后用IPTG诱导。这些宿主携带有受lacUV5控制的染色体拷贝的T7RNA聚合酶基因，并且通过相容性pLacI质粒提供足够的lac阻抑物，以便确保低水平的非诱导表达。Tuner菌株的lacY状态使得允许靶蛋白在培养过程中进行均匀的剂量-依赖性依赖性IPTG诱导，并且Origami菌株增强了细胞质二硫键形成。
另外，由于ICT 1024，ICT 1024N，和ICT 1024C插入片段都缺少内部终止密码子，并且是与C-末端HSV·Tag表位和His·Tag序列框内克隆的。ICT 1024蛋白或肽是以融合蛋白形式表达的，在它的C-末端具有HSV标记和His标记。ICT 1024蛋白和肽是按照Novagen′s的标准方法分离和纯化的。
例18.用293细胞生产ICT 1024蛋白或肽
尽管利用温和的，非变性条件从大肠杆菌中纯化重组蛋白，以便保持它们的抗原性，很多场合下纯化的蛋白都丧失了它们的抗原性，这是因为重组蛋白的较低的可溶性或不令人满意的非折叠。利用哺乳动物培养系统表达重组蛋白，能够克服这一问题，尽管这种系统的重组蛋白产量远远低于大肠杆菌表达系统的产量，
I.通过电穿孔方法转染HEK 293细胞
在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中生长细胞。
用不含FBS的RPMI 1640培养基洗涤细胞，添加胰蛋白酶；
用含有10％FBS的RPMI 1640培养基使胰蛋白酶失活。
用含有2.5％FBS的RPMI 1640培养基(无抗生素)洗涤细胞。
将所述细胞重悬在含有2.5％FBS的RPMI 1640培养基中，密度为5×106细胞/ml。
将200μl细胞转入无菌电穿孔样品池(BTX Cuvettes Model#620∶2mm间隙)中。将10μg质粒DNA(pCI-ICT 1024，pCI-ICT 1024N，或pCI-ICT 1024C)添加到样品池中，并且充分混合。在电穿孔之前，在室温培养细胞和DNA 10分钟。
电穿孔参数：
Figure A20048001519700771
在电穿孔之后，在室温下让所述细胞恢复培养10分钟。
将转染过的细胞(1×106)放入6孔平板的单个孔中，每个孔含有2ml的含有10％血清的预热的RPMI培养基中，并且在37℃的温度下，在5％CO2培养箱中培养48小时。
II.从细胞膜中提取蛋白
由于ICT 1024蛋白是膜结合蛋白，它的C末端残基的大部分位于膜中，在转染细胞中表达的ICT 1204蛋白和C末端肽需要利用M-PER真核膜蛋白提取试剂盒(Cat No：89826，PIERCE)从细胞膜中提取。
通过离心从每份样品中分离5×106个细胞，以850×g的速度离心2分钟收获细胞悬浮液。使细胞(用PBS洗涤)在1.7ml的锥形微型离心管中沉淀。
小心取出并且弃去上清液。
将150μl的制剂A添加到细胞沉淀中。用吸液管吸入和排出，以便获得均匀的细胞悬浮液。在室温下培养10分钟，偶然进行涡旋搅拌，
将裂解的细胞放置在冰上，
用1份试剂B稀释2份试剂C，制备每一份样品的足够的混合物，以便达到450μl(例如，对于10次提取来说，将3.33ml的试剂C与1.67ml的试剂B混合)。注意：一直将试剂C保持在4℃下或保持在冰上。
将450μl的稀释过的试剂C添加到裂解细胞的每一个试管中，并且涡旋搅拌。在冰上培养试管30分钟，每5分钟涡旋搅拌1次。
在4℃下以10,000×g的速度对试管进行离心3分钟。将上清液转移到新的试管中。
在37℃下培养上清液10分钟，以便分离膜蛋白级份。
在室温下以10,000×g的速度离心试管2分钟，以便从亲水性级份中分离疏水性级份(即，含有感兴趣的膜蛋白的级份)。
小心地从疏水蛋白相(底层)中取出亲水相(表层)，并且保存在新的试管中。尽可能快地进行相分离，因为不同层之间的界面在室温下会缓慢消失。
将分离的相放置在冰上。
注意：大部分膜蛋白应当存在于下部黏稠相中。
注意：疏水相现在可用于膜蛋白分析。
III.从完整细胞中提取蛋白
ICT 1024的N末端肽可能不是与细胞膜紧密结合的，因为可以利用M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Cat No：78501，PIERCE)非常容易地将它从细胞裂解液中分离出来。
从贴壁细胞中小心取出(倒出)培养基。
用PBS洗涤细胞1次。
将300μl的M-PERTM试剂添加到每一个平板孔中(6孔平板)。
轻轻摇晃5分钟。
收集裂解液，并且转移到微型离心管中。
以27,000g的速度离心5-10分钟，以便使细胞碎片沉淀。
将上清液转移到干净的试管中，以便进一步分析(SDS page或蛋白质印迹)。
IV.从SDS-Page凝胶中分离ICT1024蛋白或肽
用2×SDS样品缓冲液以1∶1的比例稀释蛋白样品，在100℃下对样品和分子量标准物进行加热5分钟。
将样品加样到10％SDS-Page凝胶上。
在10mA的电流下对所述凝胶进行电泳，直到染料进入分离的凝胶。然后将电流加大到15mA。当染料到达分离凝胶的底部时，关闭电源，并且从凝胶夹心装置中取出。
通过使用取间隔的装置之一小心打开夹心装置，以便使所述平板分离。将叠层凝胶轻轻地切开，并且将分离的凝胶放入新的塑料容器中进行染色。
用固定溶液覆盖凝胶，并且轻柔摇晃15分钟。
将固定液倒出，并且用考马斯蓝染色溶液覆盖。轻柔摇晃至少2小时。将染色溶液倒出，并且用洗涤溶液覆盖凝胶。
切割含有需要的蛋白带的凝胶片段，用标准方法从凝胶中提取蛋白。
例19.ICT 1024抗体的生产
将纯化的ICT 1024蛋白或肽用于制备ICT 1024抗体。将携带ICT 1024全长的cDNA或片段的哺乳动物表达载体用于制备ICT 1024抗体，直接使用DNA接种方法。另外，化学合成一系列ICT 1024肽(15aa-30aa)，作为用于制备ICT 1024抗体的抗原。另外，由于ICT 1024是膜蛋白，要构建质粒DNA，用于在细胞中表达ICT 1024特异性细胞内抗体(单链Fv片段，scFv)，并且抗ICT 1024′的细胞内结构域。
要制备的ICT 1024抗体包括，但不局限于小鼠多克隆抗体，小鼠单克隆抗体(MAb)，兔多克隆抗体，兔单克隆抗体，鸡IgY抗体，和人源化抗体。
例20.通过用DNA直接时小鼠进行免疫制备ICT 1024抗体
业已证实质粒DNA或多核苷酸是传统完整生物或纯化蛋白的良好的替代疫苗。下面列举了与传统方法相比，DNA免疫的优点：简单：与烦琐的并且通常难于执行的抗原蛋白纯化相比，将DNA序列亚克隆到载体(质粒或病毒)中更容易。
更安全：单一的蛋白导致感染的风险很小。如果选择特殊表位序列进行免疫，天然蛋白的毒性，如果有，同样可以减弱。
天然：研究表明，由DNA疫苗在原位产生的抗原(蛋白或多肽)具有天然构像，并且具有在天然感染期间由宿主产生的必要的翻译后修饰。
尽管业已报道了在使用阳离子脂类，基因枪，或射流注射送递DNA疫苗时具有增强了的免疫反应，但是，电穿孔是效率高得多的体外和体内DNA转染方法。质粒DNA注射和电穿孔送递的组合业已在不同的组织上产生了令人信服的阳性结果，如肌肉，皮肤，肿瘤异种移植物等。
由于DNA疫苗和电穿孔的组合提供在小鼠体内制备多克隆抗体的方便的和快速的方法，因此，该方法可用于筛选内部发现的潜在的抗体目标，可将它用于疾病诊断或治疗。
方法
在对Balb/c小鼠进行麻醉之后，将小鼠后背上的一条皮肤的毛刮掉，以便暴露出所述皮肤部位，在一只小鼠身体上刮掉5处的毛。通过皮下途径使用1-ml的注射器和30.5号的针头将存在于20μl生理盐水中的2μg pCI-ICT 1024，pCI-ICT 1024N，或pCI-ICT 1024C质粒DNA注射到每一个剔毛部位的皮肤层中。然后在注射之后马上在注射实施电穿孔，参数设置为：电压＝100V，脉冲长度＝20ms，脉冲次数＝3，和脉冲间隔＝800ms。
7天之后重复DNA接种(免疫)过程，并且1个月之后再重复一次。在最后一次DNA免疫7天之后采集血液样品，用于检测免疫效果。在其他实验中，最后的强化免疫同样是通过注射小鼠或人肿瘤细胞的裂解液完成的。所述细胞事先用相同的DNA转染过。
通过ELISA，蛋白质印迹，或功能测定，如细胞增殖测定，细胞凋亡测定检测用DNA表达免疫的效果。对于ELISA测定来说，用来自转染过的cos-7细胞或293细胞的粗制裂解液作为抗原的来源对塑料支持物表面进行包被，然后用存在于从免疫过的小鼠血清中纯化的免疫球蛋白中的抗体进行检测。在其他实验中，将从免疫过的小鼠体内采集的抗血清用于使存在于转染过的cos-7或293细胞中的ICT 1024蛋白或肽(抗原)沉淀。然后通过蛋白质印迹分析检测沉淀的目标。
可以使用传统方法，DEAE离子交换柱，蛋白-A离子亲和柱等纯化抗ICT 1024的特异性抗体。纯化的抗体可以在通过杂交瘤技术生产单克隆抗体之后获得。
例21.制备抗ICT 1024的兔单克隆抗体
为了制备抗ICT 1024的兔单克隆抗体，将携带ICT 1024全长的cDNA或cDNA片段的表达载体转染到兔细胞系240E中。收集所得到的转染过的细胞，并且用于对兔进行免疫。来自细胞系240E的内源蛋白不能诱导免疫反应，并且只有表达的人蛋白被兔识别为抗原。高的融合效率，更好的杂交瘤稳定性，以及抗体生产细胞的大的备用储库，使它成为多元抗原，用于对一只兔进行免疫。
例22.ICT 1024蛋白或肽作抗原制备抗ICT 1024小鼠的单克隆 抗体
采用常规方法制备并且纯化抗ICT 1024蛋白的小鼠多克隆抗体和单克隆抗体。我们还要利用化学合成的ICT 1024肽，它相当于ICT 1024蛋白的不同的结构域，制备并且纯化抗ICT 1024蛋白的小鼠多克隆抗体和单克隆抗体。它的目的是筛选抗ICT 1024的最好的单克隆抗体，表现为与ICT 1024蛋白的高的亲和力，更重要的是，通过抗体/抗原特异性结合抑制ICT 1024蛋白的生物学功能。
例23.将ICT 1025全长的cDNA克隆到pCI载体中，用于哺乳动 物细胞表达和DNA免疫
通过PCR扩增制备ICT 1025全长的cDNA(803aa)，使用从ATCC购买的cDNA克隆(MGC：20194)作模板。由于全长的ICT 1025cDNA为2780bp，为了减少在PCR反应期间可能出现的突变，设计了两对引物，以便制备两个较短的DNA片段，它们能够连接在一起产生全长的ICT 1025cDNA。
pCI-ICT 1025表达质粒的验证的序列参见图20。
ICT 1025蛋白和肽的生产和纯化
纯化的ICT 1025蛋白或肽是使用常规方法制备ICT 1025特异性抗体作为抗原所需要的。ICT 1025蛋白或肽可以用各种表达系统生产，包括，但不局限于哺乳动物培养细胞，酵母，昆虫细胞和大肠杆菌细胞。只有能保持蛋白抗原性的纯化方法被用于制备ICT 1025蛋白或肽。一般，第一个步骤是将携带有全长的ICT 1025cDNA或编码ICT 1025肽的一段cDNA的表达载体导入相应的宿主系统。例如，使用标准转染方法将哺乳动物表达载体导入293细胞，如脂质体介导的或电穿孔介导的转染。第二个步骤是扩增携带有表达载体的宿主细胞。一个例子是对用所述表达载体转化的酵母或大肠杆菌宿主细胞进行发酵。第三个步骤是如果使用诱导型表达载体，在所述宿主细胞中诱导重组蛋白的表达。如果所述重组蛋白对宿主细胞有毒，这一点是特别重要的。下一个步骤是从宿主细胞裂解液中分离重组蛋白。最后的步骤是如果所述重组蛋白是以融合蛋白形式产生，除去融合结构域，并且纯化需要的重组蛋白或肽。
例24.用pGEX-5X-3/BL21细胞生产ICT 1025蛋白或肽
谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因融合系统(Amersham)是用于表达，纯化，和在大肠杆菌中产生的融合蛋白的多用途系统。该系统提供了诱导型，高水平表达的基因或基因片段，作为与GST的融合体，GST部分位于氨基末端，而感兴趣的蛋白位于羧基末端。GST融合蛋白是通过亲和层析使用固定化的谷胱甘肽从细菌裂解液中纯化的。GST融合蛋白是由谷胱甘肽培养基固定的，并且通过洗涤除去杂质。在温和的，非变性条件下将还原的谷胱甘肽用于洗脱融合蛋白，以便保持蛋白的致肿瘤性。为了制备ICT 1025蛋白或肽作为生产抗体的抗原，使用位点特异性的蛋白酶将ICT 1025蛋白或肽从GST上裂解下来，这种酶的识别序列位于pGEX质粒的多克隆位点的上游。
筛选正确的GST表达菌落
使用由Amersham提供的标准方法将pGEX-5X-3-ICT 1024，pGEX-5x-3-1024N，或pGEX-5x-3-ICT 1024C转入宿主细胞大肠杆菌BL21。
将12个单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2ml的LB培养基中，在37℃下摇晃(250rpm)培养，直到OD595达到0.6。
将培养物分成两个1ml，用于IPTG诱导(I)和非诱导(NI)。向″I″号试管中添加IPTG，使最终浓度为0.1-0.5mM。
在37℃下继续摇晃(250rpm)培养3小时，然后将培养物转移到1.5ml微型试管中，通过以14,000rpm的速度离心1分钟回收细胞。
将200μl的蛋白样品缓冲液添加到细胞沉淀中，悬浮细胞，然后在100℃下将样品煮沸2-5分钟。
将15μl的每一种样品加样到10％SDS-Page凝胶上，将蛋白分子量标记加样到平行泳道上。在对凝胶进行电泳之后，用考马斯蓝对凝胶进行染色。GST蛋白本身的分子量为26Kd，GST-ICT 1025融合蛋白的分子量为122kd，GST-ICT 1024N融合蛋白的分子量为88kd，GST-ICT 1024C融合蛋白的分子量为57Kd。
选择具有最高表达水平的GST融合蛋白的单克隆用于生产相应的GST融合蛋白。
GST-融合蛋白的分离
将选择的单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的100ml LB，在37℃下摇晃(250rpm)培养过夜。
将25ml过夜培养物转移到含有100μg/ml氨苄青霉素的，装在2-L烧瓶中的1升预热的LB中，在37℃下摇晃(250rpm)培养，直到OD595达到0.6。
添加IPTG使最终浓度为0.1-0.5mM，以便诱导GST融合蛋白表达。在37℃下摇晃(250rpm)培养3小时。
通过以3,600rpm的速度离心10分钟收获细胞(Servall GS-3转子)。
将细胞重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的20ml R.S.中(有关R.S.缓冲液和R.S.缓冲液混合物参见附录)。
对样品进行6次超声波处理，每次30秒。在超声波处理期间将样品保持在冰上，并且在每次超声波处理之后混合样品。
使用Servall GS-3转子，以10,000rpm的速度对超声波处理的样品进行离心10分钟。将上清液转移到新的试管中。
向上清液中添加谷胱甘肽-琼脂糖球浆(GSH-琼脂糖粉，sigmaG4510，在4ml RS中平衡的70mg球，在室温下，在15-ml试管中倒转1小时至过夜，更换2-3次缓冲液，得到了1ml紧密的膨胀的球浆，可以以50％的浆保存1个月。在50ml的试管中，每1ml树脂使用来自1.5-2.0升的上清液的材料(37.5-50ml))。
在40℃下，在转子上柔和地混合上清液/浆0.5-2小时。
以1,500rpm的速度离心2分钟，每次用10ml RS进行批量洗涤2次。将10ml RS添加到悬浮样品中，加样到柱上。
用10ml RS漂洗所述柱。
用存在于RS中的50mM GSH(pH 8.0，用NaOH调整)剥离所述柱。
通过手工或级份收集器采集0.5ml级份。GST融合蛋白应当在5-11号级份中洗脱。
通过将2μl每一个级份的等份样品放入微量滴定板的孔中，并且添加100μl的1×Bradford试剂(Biorad试剂的1∶5的稀释液)，并且检查混合物的颜色，对GST融合蛋白进行定位。
为了从ICT 1024蛋白或肽中除去GST，在批量洗涤之后，用凝血酶裂解缓冲液(T.C.B.，参见附录)洗涤上清液/浆的混合物1次，然后，添加2ml T.C.B.和10μg(13μl)凝血酶(0.768μg/μl)，在室温下摇晃1.5小时(Thrumbin，human，lyoph，Cat：605195，Calbiochem Corp.)。
例25.用pETBlue-2/BL21细胞生产ICT 1025蛋白或肽
ICT 1025是属于RHO家族的膜结合蛋白酶。我们在pGEX-5X-3/BL21表达系统中获得的初步数据表明，GST-ICT 1025融合蛋白对细菌宿主具有很高的毒性，因此，难于通过IPTG诱导在DH5α-T1或BL21细胞中获得高水平的GST-ICT 1024融合蛋白表达。PETBlue系统(Novagen)可能有助于我们解决所述毒性问题。pET-Blue2载体利用噬菌体T7启动子驱动感兴趣的基因的表达。在通过IPTG诱导时，只有噬菌体T7聚合酶能够在BL(DE3)细胞中表达。在使用BL21(DE3)pLysS细胞时，T7聚合酶活性可以通过表达的T7溶菌酶进一步提高。该系统的所有上述特征使得感兴趣的蛋白的表达具有很高的选择性，并且是严格控制的，这有利于本人的本发明的目的：表达在其他场合下有很高毒性的蛋白。使用pETBlue-2的另一个优点是，使用LacZ基因产物的α-互补，β-半乳糖苷酶，利用质粒构建体的蓝色/白色菌落型筛选。另外，工程产生的融合蛋白的C′-末端包括框内标记：HSV标记和His。标记是串联的。这些标记可用于分别纯化和检测融合产物。
利用由Novagen提供的标准方法将pETBlue-2-ICT 1025，pETBlue-2-1025N，或pETBlue-2-ICT 1025C质粒DNA转入宿主细胞大肠杆菌BL21。转化过的克隆可以通过蓝色/白色菌落筛选方便地用肉眼鉴定，由于pETBlue-2载体使用弱组成型大肠杆菌启动子(tet)驱动lacZα-肽的表达，而ICT 1025基因的表达是由沿相反方向的T7lac启动子驱动的。将ICT 1025序列插入多克隆位点(MCS)，破坏了lacZα-肽的表达，并且在在存在X-gal的条件下铺平板时在菌株DH5α中产生了白色菌落表型。来自未修饰过的载体的菌落变成蓝色。由于T7-驱动的蛋白表达需要插入片段沿相对tet启动子的反义方向克隆，ICT 1025序列的基础表达实际上是缺乏的。出现在pETBlue-2质粒上的高拷贝数量的pUC复制起点，大大提高了质粒产量，并因此增加了所表达的ICT 1024蛋白或肽。
pETBlue-2载体上的ICT 1025基因或片段是高水平表达的，因为插入的序列处在相对T7lac启动子的有义方向上，并且所述读框满足了pETBlue-2载体的翻译要求。蛋白表达是通过将重组pETBlue-2质粒转入宿主菌株TunerTM(DE3)pLacI或OrigamiTM(DE3)pLacI，然后用IPTG诱导实现的。这些宿主携带有受lacUV5控制的染色体拷贝的T7RNA聚合酶基因，并且通过相容性pLacI质粒提供足够的lac抑制子，以便确保低水平的非诱导表达。Tuner菌株的lacY状态使得允许靶蛋白在培养过程中进行均匀的剂量-依赖性IPTG诱导，并且Origami菌株增强了细胞质二硫键形成，用上述方法纯化的ICT 1025蛋白参见图19。
另外，由于ICT 1025，ICT 1025N，和ICT 1025C插入片段都缺少内在终止密码子，并且是与C-末端HSV·Tag表位和His·Tag序列框内克隆的。ICT 1025蛋白或肽是以融合蛋白形式表达的，在它的C-末端具有HSV标记和His标记。ICT 1025蛋白和肽是按照Novagen′s的标准方法分离和纯化的。
例26.用293细胞生产ICT 1025蛋白或肽
尽管利用温和的，非变性条件从大肠杆菌中纯化重组蛋白，以便保持它们的抗原性，但在很多场合下纯化的蛋白都丧失了它们的抗原性，这是因为重组蛋白的较低的可溶性或令人不满意的非折叠。利用哺乳动物培养系统表达重组蛋白，能够克服这一问题，尽管这种系统的重组蛋白产量远远低于大肠杆菌表达系统的产量。
I.通过电穿孔方法转染HEK 293细胞
在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中生长细胞。
用不含FBS的RPMI 1640培养基洗涤细胞，添加胰蛋白酶；
用含有10％FBS的RPMI 1640培养基使胰蛋白酶失活。
用含有2.5％FBS的RPMI 1640培养基(无抗生素)洗涤细胞数次。
将所述细胞重新悬浮在含有2.5％FBS的RPMI 1640培养基中，密度为5×106细胞/ml。
将200μl细胞转入无菌电穿孔样品池(BTX Cuvettes Model#620∶2mm间隙)中。将10μg质粒DNA(pCI-ICT 1024，pCI-ICT 1024N，或pCI-ICT 1024C)添加到样品池中，并且充分混合。在电穿孔之前，在室温培养细胞和DNA 10分钟。
电穿孔参数：
在电穿孔之后，让所述样品在室温下恢复培养10分钟。
将转染过的细胞(1×106)放入6孔平板的单个孔中，每个孔含有2ml的含有10％血清的预热的RPMI培养基中，并且在37℃的温度下，在5％CO2培养箱中培养48小时。
II.从细胞膜中提取蛋白
由于ICT 1025蛋白是膜结合蛋白，它的C末端残基的大部分位于膜中，在转染细胞中表达的ICT 1205蛋白和C末端肽需要利用M-PER真核膜蛋白提取试剂盒(Cat No：89826，PIERCE)从细胞膜中提取。
通过离心从每份样品中分离5×106个细胞，以850×g的速度离心2分钟收获细胞悬浮液。使细胞(用PBS洗涤)在1.7ml的锥形微型离心管中沉淀。
小心取出并且弃去上清液。
将150μl的制剂A添加到细胞沉淀中。用吸液管吸入和排出，以便获得均匀的细胞悬浮液。在室温下培养10分钟，偶然进行涡旋搅拌。
将裂解的细胞放置在冰上，
用1份试剂B稀释2份试剂C，制备每一份样品的足够的混合物，以便达到450μl(例如，对于10次提取来说，将3.33ml的试剂C与1.67ml的试剂B混合)。注意：一直将试剂C保持在4℃下或保持在冰上。
将450μl的稀释过的试剂C添加到裂解细胞的每一个试管中，并且涡旋搅拌。在冰上培养试管30分钟，每5分钟涡旋搅拌1次。
在4℃下以10,000×g的速度对试管进行离心3分钟。将上清液转移到新的试管中。
在37℃下培养上清液10分钟，以便分离膜蛋白级份。
在室温下以10,000×g的速度离心试管2分钟，以便从亲水性级份中分离疏水性级份(即，含有感兴趣的膜蛋白的级份)。
小心地从疏水蛋白相(底层)中取出亲水相(表层)，并且保存在新的试管中。尽可能快地进行相分离，因为不同层之间的界面在室温下会缓慢消失。
将分离的相放置在冰上。
注意：大部分膜蛋白应当存在于下部黏稠相中。
注意：疏水相现在可用于膜蛋白分析。
III.从完整细胞中提取蛋白
ICT 1025的N末端肽可能不是与细胞膜紧密结合的，因为可以利用M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Cat No：78501，PIERCE)非常容易地将它从细胞裂解液中分离出来。
从贴壁细胞中小心取出(倒出)培养基。
用PBS洗涤细胞1次。
将300μl的M-PERTM试剂添加到每一个平板孔(6孔平板)中。
轻轻摇晃5分钟。
收集裂解液，并且转移到微型离心机试管中，
以27,000g的速度离心5-10分钟，以便使细胞碎片沉淀。
将上清液转移到干净的试管中，以便进一步分析(SDS page或蛋白质印迹)。
IV.从SDS-Page凝胶中分离ICT 1025蛋白或肽
用2×SDS样品缓冲液以1∶1的比例稀释蛋白样品，在100℃下对样品和分子量标准物进行加热5分钟。
将样品加样到10％SDS-Page凝胶上。
在10mA的电流下对所述凝胶进行电泳，直到染料进入分离的凝胶。然后将电流加大到15mA。当染料到达分离凝胶的底部时，关闭电源，并且取出凝胶夹心装置。
通过使用取间隔的装置之一小心打开夹心装置，以便使所述平板分离。将叠层凝胶轻轻地切开，并且将分离的凝胶放入小型塑料容器中进行染色。
用固定溶液覆盖凝胶，并且轻柔摇晃15分钟。
将固定液倒出，并且用考马斯蓝染色溶液覆盖。轻柔摇晃至少2小时。将染色溶液倒出，并且用洗涤溶液覆盖凝胶。
切割含有需要的蛋白带的凝胶片段，用标准方法从凝胶中提取蛋白。
例27 ICT 1025抗体的生产
将纯化的ICT 1025蛋白或肽用于制备ICT 1025抗体。用DNA接种方法，将携带ICT 1025全长的cDNA或片段的哺乳动物表达载体直接用于制备ICT 1025抗体。另外，化学合成一系列ICT 1025肽(15aa-30aa)，用于制备ICT 1025抗体。另外，由于ICT 1025是膜蛋白，要构建质粒DNA，用于在细胞中表达ICT 1025特异性抗体(单链Fv片段，scFv)，并且抗ICT 1025的细胞内结构域。
要制备的ICT 1025抗体包括，但不局限于小鼠多克隆抗体，小鼠单克隆抗体(MAb)，兔多克隆抗体，兔单克隆抗体，鸡IgY抗体，和人源化抗体。
例28.通过用DNA直接对小鼠进行免疫制备ICT 1025抗体
业已证实质粒DNA或多核苷酸是传统完整生物或纯化蛋白的良好的替代疫苗。下面列举了与传统方法相比，DNA免疫的优点：
简单：与烦琐的并且通常难于执行的抗原蛋白纯化相比，将DNA序列亚克隆到载体(质粒或病毒)中更容易。
更安全：单一的蛋白导致感染的风险很小。如果选择特殊表位序列进行免疫，天然蛋白的毒性，如果有，同样可以减弱。
天然：研究表明，由DNA疫苗在原位产生的抗原(蛋白或多肽)具有天然构像，并且具有在天然感染期间由宿主产生的必要的翻译后修饰。
尽管业已报道了在使用阳离子脂类，基因枪，或射流注射送递DNA疫苗时具有增强了的免疫反应，但是，电穿孔是效率高得多的体外和体内DNA转染方法。质粒DNA注射和电穿孔送递的组合业已在不同的组织上产生了令人信服的阳性结果，如肌肉，皮肤，肿瘤异种移植物等。
由于DNA疫苗和电穿孔的组合提供在小鼠体内制备多克隆抗体的方便的和快速的方法，因此，该方法可用于筛选内部发现的潜在的抗体目标，可将它用于疾病诊断或治疗。
在对Balb/c小鼠进行麻醉之后，将小鼠后背上的一条皮肤的毛刮掉，以便暴露出所述皮肤部位。在一只小鼠身体上刮掉5处的毛。通过皮下途径使用1-ml的注射器和30.5号的针头将存在于20μl生理盐水中的2μg pCI-ICT 1025，pCI-ICT 1025N，或pCI-ICT 1025C质粒DNA注射到每一个剔毛部位的皮肤层中。然后在注射之后马上在注射实施电穿孔，参数设置为：电压＝100V，脉冲长度＝20ms，脉冲次数＝3，和脉冲间隔＝800ms。
7天之后重复DNA接种(免疫)过程，并且1个月之后再重复一次。在最后一次DNA免疫7天之后采集血液样品，用于检测免疫效果。在其他实验中，最后的强化免疫同样是通过注射小鼠或人肿瘤细胞的裂解液完成的。所述细胞事先用相同的DNA转染过。
通过ELISA，蛋白质印迹，或功能测定，如细胞增殖测定，细胞凋亡测定检测用DNA表达免疫的效果。对于ELISA测定来说，用来自转染过的cos-7细胞或293细胞的粗制裂解液作为抗原的来源对塑料支持物表面进行包被，然后用存在于从免疫过的小鼠血清中纯化的免疫球蛋白中的抗体进行检测。在其他实验中，将从免疫过的小鼠体内采集的抗血清用于使存在于转染过的cos-7或293细胞中的ICT 1025蛋白或肽(抗原)沉淀。然后通过蛋白质印迹分析检测沉淀的目标。
可以使用传统方法，DEAE离子交换柱，蛋白-A离子亲和柱等纯化抗ICT 1025的特异性抗体。纯化的抗体可以在通过杂交瘤技术生产单克隆抗体之后获得。
例29.制备抗ICT 1025的兔单克隆抗体
为了制备抗ICT 1025的兔单克隆抗体，将携带ICT 1025全长的cDNA或cDNA片段的表达载体转染到兔细胞系240E中。收集所得到的转染过的细胞，并且用于对兔进行免疫。来自细胞系240E的内源蛋白不能诱导免疫反应，并且只有表达的人蛋白被兔识别为抗原。高的融合效率，杂交瘤的更好的稳定性，以及抗体生产细胞的大型储库的组合，使它成为多元抗原，用于对一只兔进行免疫。
例30.用ICT 1025蛋白或肽作抗原制备抗ICT 1025的小鼠单克隆 抗体
采用常规方法制备并且纯化抗ICT 1025蛋白的小鼠多克隆抗体和单克隆抗体。我们还要利用化学合成的ICT 1025肽，它相当于ICT 1025蛋白的不同的结构域，制备并且纯化抗ICT 1025蛋白的小鼠多克隆抗体和单克隆抗体。它的目的是筛选抗ICT 1025的最好的单克隆抗体，表现为与ICT 1025蛋白的高的亲和力，更重要的是，通过抗体/抗原特异性结合抑制ICT 1025蛋白的生物学功能的能力。
制备能产生ICT 1025mAb的杂交瘤
通过标准方法制备抗人ICT 1025蛋白的小鼠单克隆抗体(mAb)。简单地讲，从大肠杆菌细胞中纯化ICT 1025蛋白，所述细胞用编码人ICT 1025cDNA的原核表达载体转化过。然后将纯化的人ICT 1025用于对小鼠进行免疫。在若干次免疫之后，当免疫过的小鼠的血清中ICT 1025抗体滴度超过10,000时，处死小鼠，并且收获脾细胞，以便制备杂交瘤克隆。然后扩增各个杂交瘤克隆，并且收集培养物上清液用于通过基于ELISA的测定验证抗ICT 1025蛋白的mAb。用ICT 1025蛋白免疫的一只小鼠验证了40个杂交瘤克隆产生对人ICT 1025蛋白特异的mAb。
选择具有细胞表面结合活性的ICT 1025mAb
业已证实了在肿瘤细胞中ICT 1025的表达水平被上调了。更重要的是，据信，ICT 1025蛋白从细胞质向细胞膜中的迁移，以及与细胞外区室的接触在肿瘤细胞中是选择性地发生的。因此，为了有效治疗或诊断，ICT 1025mAb必须能够结合ICT 1025蛋白的细胞外结构域。利用活细胞表面染色ELISA筛选能够结合ICT 1025蛋白的细胞表面结构域的ICT 1025mAb。
将两个细胞系，人乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-435和人结肠癌细胞系HT29用于mAb筛选研究，这两种细胞系都能超量表达ICT 1025蛋白。来自用MDA-MB-435细胞(图55)和HT29细胞(图56)中的杂交瘤培养上清液进行的mAb筛选的数据表明在40种mAb表面结合活性存在很大差异，用来自一个细胞系的数据验证来自其他细胞系的数据。
选择具有最高表面结合活性的6个杂交瘤克隆(表1)用于生产和纯化mAb，以便进行进一步的体外和体内表征。还可以选择没有细胞表面结合活性的一个杂交瘤(表1)用于生产和纯化mAb，在将来的功能研究中作为对照mAb。
通过试剂和将处理过的细胞接种到裸鼠体内，处理人乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-435，确定了1025抑制对肿瘤发生和肿瘤生长的影响。由处理过的细胞形成的肿瘤与通过阴性对照处理的细胞相比，在生长速度方面表现出明显的抑制作用(图57)，并且验证了培养物中的细胞上的1025抑制作用同样可应用于肿瘤形成和肿瘤生长。
通过阅读本文所披露的说明书和本发明的实施例，本领域技术人员能够理解本发明的其他实施方案和用途。这里所引用的所有参考文献和材料，包括美国专利和外国专利以及专利申请，被专门地和完整地收作本文参考。本发明的意图是，说明书和实施例仅仅被认为是说明性质的，本发明的实际范围和构思通过下面的权利要求书限定。
表1
检索查询：TGGCCAATAA(SEQ ID NO：36)
I.文库   文库中的总标记数   标记/200,000 色码
  SAGE_White_Blood_Cells_normal_AP   31985   43
  SAGE_Breast_carcinoma_metastasis_B_2   49794   40
  SAGE_Breast_metastatic_carcinoma_B_95-260   45087   35
  SAGE_Breast_carcinoma_CL_ZR75_1_tamoxifen   40052   34
  SAGE_Breast_carcinoma_myoepithelium_AP_DCIS7   37435   32
  SAGE_Breast_carcinoma_AP_DCIS-2   28719   27
  SAGE_Breast_carcinoma_B_IDC-5   60451   26
  SAGE_Breast_carcinoma_CL_ZR75_1_estrogen   38797   25
  SAGE_Placenta_normal_B_1   118083   23
  SAGE_Breast_carcinoma_B_95-348   60343   19
  SAGE_Breast_carcinoma_B_DCIS-4   60605   19
  SAGE_Stomach_cancer_B_G189   63075   19
  SAGE_Pancreas_normal_CS_HX   31985   18
  SAGE_Peritoneum normal_B_13   53527   18
  SAGE_Prostate_adenocarcinoma_MD_PR317   64951   18
SAGE_Prostate_carcinoma_CL_LNCaP-T 43542 18
  SAGE_Brain_glioblastoma_CL_H54+LacZ   66908   17
  SAGE_Breast_carcinoma_myoepithelium_AP_DCIS6   81452   17
  SAGE_Vascular_normal_CS_VEGF+   57316   17
  SAGE_Breast_carcinoma_CL_MCF7estradiol_10H   59583   16
  SAGE_Breast_carcinoma_CL_MCF7estradiol_3h   59583   16
  SAGE_Brain_astrocytoma_grade_II_B_H563   88568   15
  SAGE_Breast_carcinoma_B_95-259   39364   15
  SAGE_Universal_reference_human_RNA_CL   51729   15
  SAGE_Breast_carcinoma_MD_DCIS   40783   14
  SAGE_Ovary_adenocarcinoma_B_OVT-6   41443   14
  SAGE_Brain_astrocytoma_grade_II_B_H388   106285   13
1.表2-实质RNA印迹
簇57988Text Legend的表达模式
  组织   EST数据   SAGE数据   EST数据   SAGE数据
正常 癌 正常 癌 正常 癌   P   正常   癌   P
  所有组织   46/1989425   77/2012352   0.00   78/2516172   196/4801932   0.02
  大脑   6/224322   3/146887   0.38   2/309734   45/1697717   0.02
  小脑 0/4079 0/0 -- 1/90885 5/252749 0.35
  宫颈 -- --   0/1052   0/41849   --   --   --   --
结肠   0/17509   17/145347 0.14 4/98089 4/325836 0.13
眼 -- -- 2/56429 0/45229 0.28 -- -- --
心脏 -- -- 2/57248 -- -- 3/83063 -- --
肾 3/63353 2/75055 0.34 2/106467 0/ --
肝 0/53158 2/72873 0.29 0/66308 0/ --
肺 -- 4/103278 4/161191 0.33 2/88708 -- --
  淋巴结   --   0/77166   0/48390   --   0/   --   --
  乳腺 1/41075 3/88612 0.43 13/375224   100/1256825 0.00
卵巢 0/8152 4/83675 0.39 3/94887 5/179472 0.46
  胰腺   0/7614   3/61447   0.40   5/64208   5/189999   0.11
松果体 -- -- 0/6287 2/8491 0.28 -- -- --
  胎盘   --   7/190882   2/40610   0.43   16/207348   --   --
  合并的组织 --   --   6/303542   2/28022   0.22   --   --   --
  前列腺   0/62862   6/53816   0.04   7/266949   15/491794   0.38
表III.
基于SOSUI检索的跨膜分析：
查询标题：ICT-1 24
总长度：855A.A.
平均疏水度：-0.269240
              2.该氨基酸序列是具有6个跨膜螺旋的膜蛋白的氨基酸序列
 No.   N末端 跨膜区   C末端 类型 长度
  1   409   WLTFVHSIVTILAVCIYGLAPVG   431   一级   23
  2   656   LWLSLFLHAGILHCLVSICFQMT   678   一级   23
  3   698   LSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPA   720   二级   23
  4   745   WRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWI   767   一级   23
  5   773   ISGFISGLFLSFAFLPYISFGK   794   二级   22
  6   803   QIIIFQVVFLGLLAGLWLFYVY   825   一级   23
表4.选择用来基于细胞表面结合活性生产和纯化的mAb的杂交瘤克隆
  杂交瘤名称  ICT1025蛋白结合活性   在MDA-MB-435细胞中的细胞表面结合活性   在HT29细胞中的细胞表面结合活性
  ICT1025-4G4   有   极高(1.5)   极高(1.3)
  ICT1025-1A7   有   高(1.1)   高(0.8)
  ICT1025-3C9   有   高(1.1)   中等(0.6)
  ICT1025-1D9   有   高(0.9)   中等(0.5)
  ICT1025-5F9   有   高(1.0)   高(1.0)
  ICT1025-5E8   有   高(0.9)   中等(0.6)
  ICT1025-4H3   有   无(＜0.1)   无(＜0.1)
                           序列表
SEQ ID NO：1.人乳脂球-EGF因子8蛋白MFGE8(1934bps)。人MFGE8的GeneBank登录号为NM-005928。
   1 agaaccccgc ggggtctgag cagcccagcg tgcccattcc agcgcccgcg tccccgcagc
  61 atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc
 121 ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag
 181 atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc
 241 tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac
 301 attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat
 361 tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc
 421 agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacctgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt
 481 gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg
 541 gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag
 601 gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg
 661 gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt
 721 gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc
 781 atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc
 841 agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg
 901 gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag gtggacctgg gctcctcgaa ggaggtgaca
 961 ggcatcatca cccagggggc ccgtaacttt ggctctgtcc agtttgtggc atcctacaag
1021 gttgcctaca gtaatgacag tgcgaactgg actgagtacc aggaccccag gactggcagc
1081 agtaagatct tccctggcaa ctgggacaac cactcccaca agaagaactt gtttgagacg
1141 cccatcctgg ctcgctatgt gcgcatcctg cctgtagcct ggcacaaccg catcgccctg
1201 cgcctggagc tgctgggctg ttagtggcca cctgccaccc ccaggtcttc ctgctttcca
1261 tgggcccgct gcctcttggc ttctcagccc ctttaaatca ccatagggct ggggactggg
1321 gaaggggagg gtgttcagag gcagcaccac cacacagtca cccctccctc cctctttccc
1381 accctccacc tctcacgggc cctgccccag cccctaagcc ccgtccccta acccccagtc
1441 ctcactgtcc tgttttctta ggcactgagg gatctgagta ggtctgggat ggacaggaaa
1501 gggcaaagta gggcgtgtgg tttccctgcc cctgtccgga ccgccgatcc caggtgcgtg
1561 tgtctctgtc tctcctagcc cctctctcac acatcacatt cccatggtgg cctcaagaaa
1621 ggcccggaag ccccaggctg gagataacag cctcttgccc gtcggccctg cgtcggccct
1681 ggggtaccat gtgccacaac tgctgtggcc ccctgtcccc aagacacttc cccttgtctc
1741 cctggttgcc tctcttgccc cttgtcctga agcccagcga cacagaaggg ggtggggcgg
1801 gtctatgggg agaaagggag cgaggtcaga ggagccggca tgggttggca gggtgggcgt
1861 ttggggccct catgctggct tttcacccca gaggacacag gcagcttcca aaatatattt
1921 atcttcttca cggg
SEQ ID NO：2.人MFGE8多肽序列(387个氨基酸)：蛋白识别编号为NP-005919.1。
NH2-MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVALDICSKNPCHNGGLCEEISQE
VRGDVFPSYTCTCLKGYAGNHCETKCVEPLGMENGNIANSQIAASSVRVTFLGLQHWV
PELARLNRAGMVNAWTPSSNDDNPWIQVNLLRRMWVTGVVTQGASRLASHEYLKAFKV
AYSLNGHEFDFIHDVNKKHKEFVGNWNKNAVHVNLFETPVEAQYVRLYPTSCHTACTL
RFELLGCELNGCANPLGLKNNSIPDKQITASSSYKTWGLHLFSWNPSYARLDKQGNFN
AWVAGSYGNDQWLQVDLGSSKEVTGIITQGARNFGSVQFVASYKVAYSNDSANWTEYQ
DPRTGSSKIFPGNWDNHSHKKNLFETPILARYVRILPVAWHNRIALRLELLGC-COOH
SEQ ID NO：3.人MFGE8编码序列(1164bps)。人MFGE8的GeneBank登录号为NM-005928。
   1 atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc
  61 ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag
 121 atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc
 181 tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac
 241 attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat
 301 tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc
 361 agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacctgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt
 421 gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg
 481 gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag
 541 gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg
 601 gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt
 661 gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc
 721 atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc
 781 agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg
 841 gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag gtggacctgg gctcctcgaa ggaggtgaca
 901 ggcatcatca cccagggggc ccgtaacttt ggctctgtcc agtttgtggc atcctacaag
 961 gttgcctaca gtaatgacag tgcgaactgg actgagtacc aggaccccag gactggcagc
1021 agtaagatct tccctggcaa ctgggacaac cactcccaca agaagaactt gtttgagacg
1081 cccatcctgg ctcgctatgt gcgcatcctg cctgtagcct ggcacaaccg catcgccctg
1141 cgcctggagc tgctgggctg ttag
SEQ ID NO：4.人TNFSF13相关基因。人cDNA FLJ33379fis，克隆BRACE2006397，与人肿瘤坏死因子相关的死亡配体1β(2036bps)高度相似，登录号为AK090698。
   1 agaactcagc cagtttcttg cttccgtgcc cctggttctc ctccccatcg agcccacccc
  61 tcctttccca ccttcagtca cccctagtga actgccccag cgatctctgc tgtgcttgac
 121 cccgagggtc ttccaccctc gccctgaccc tggacactgc ccagcttggc cccccatcct
 181 gctcctggca caatgccctc tagccagcca accttccctc ccccaaccct ggggccgccc
 241 cagggttcct gcgcactgcc tgttcctcct gggtgtcact ggcagccctg tccttcctag
 301 agggactgga acctaattct cctgaggctg agggagggtg gagggtctca aggcaacgct
 361 ggccccacga cggagtgcca ggagcactaa cagtaccctt agcttgcttt cctcctccct
 421 cctttttatt ttcaagttcc tttttatttc tccttgcgta acaaccttct tcccttctgc
 481 accactgccc gtacccttac ccgccccgcc acctccttgc taccccactc ttgaaaccac
 541 agctgttggc agggtcccca gctcatgcca gcctcatctc ctttcttgct agcccccaaa
 601 gggcctccag gcaacatggg gggcccagtc agagagccgg cactctcagt tgccctctgg
 661 ttgagttggg gggcagctct gggggccgtg gcttgtgcca tggctctgct gacccaacaa
 721 acagagctgc agagcctcag gagagaggtg agccggctgc aggggacagg aggcccctcc
 781 cagaatgggg aagggtatcc ctggcagagt ctcccggagc agagttccga tgccctggaa
 841 gcctgggaga gtggggagag atcccggaaa aggagagcag tgctcaccca aaaacagaag
 901 aatgactccg atgtgacaga ggtgatgtgg caaccagctc ttaggcgtgg gagaggccta
 961 caggcccaag gatatggtgt ccgaatccag gatgctggag tttatctgct gtatagccag
1021 gtcctgtttc aagacgtgac tttcaccatg ggtcaggtgg tgtctcgaga aggccaagga
1081 aggcaggaga ctctattccg atgtataaga agtatgccct cccacccgga ccgggcctac
1141 aacagctgct atagcgcagg tgtcttccat ttacaccaag gggatattct gagtgtcata
1201 attccccggg caagggcgaa acttaacctc tctccacatg gaaccttcct ggggtttgtg
1261 aaactgtgat tgtgttataa aaagtggctc ccagcttgga agaccagggt gggtacatac
1321 tggagacagc caagagctga gtatataaag gagagggaat gtgcaggaac agaggcgtct
1381 tcctgggttt ggctccccgt tcctcacttt tcccttttca ttcccacccc ctagactttg
1441 attttacgga tatcttgctt ctgttcccca tggagctccg aattcttgcg tgtgtgtaga
1501 tgaggggcgg gggacgggcg ccaggcattg tccagacctg gtcggggccc actggaagca
1561 tccagaacag caccaccatc tagcggccgc tcgagggaag cacccgccgg ttggccgaag
1621 tccacgaagc cgccctctgc tagggaaaac ccctggttct ccatgccaca cctctctcca
1681 ggtgccctct gcctcttcac cccacaagaa gccttatcct acgtccttct ctccatctat
1741 cggaccccag tttccatcac tatctccaga gatgtagcta ttatgcgccc gtctacaggg
1801 ggtgcccgac gatgacggtg ccttcgcagt caaattactc ttcgggtccc aaggtttggc
1861 tttcacgcgc tccattgccc cggcgtggca ggccattcca agcccttccg ggctggaact
1921 ggtgtcggag gagcctcggg tgtatcgtac gccctggtgt tggtgttgcc tcactcctct
1981 gagctcttct ttctgatcaa gccctgctta aagttaaata aaatagaatg aatgat
SEQ ID NO：5.人TNFSF13多肽序列(250个氨基酸)，登录号075888。
  1 mpasspflla pkgppgnmgg pvrepalsva lwlswgaalg avacamallt qqtelqslrr
 61 evsrlqgtgg psqngegypw qslpeqssda leawengers rkrravltqk qkkqhsvlhl
121 vpinatskdd sdvtevmwqp alrrgrglqa qgygvriqda gvyllysqvl fqdvtftmgq
181 vvsregqgrq etlfrcirsm pshpdrayns cysagvfhlh qgdilsviip raraklnlsp
241 hgtflgfvkl
SEQ ID NO：6.人新的ZFP236多核苷酸序列(2241bps)，公开的登录号为AK000847。
   l cacatggttt aagaagcatc attatggctt ttgtgttt tggtgtgtgt ggctgtgaag
  61 cctcaggaat ttagtttaag cttctgaaaa gcccaccaat atgtatttag aattctgttg
 121 tcccatatct tagtcatctc aatgtttctc atttctaact ttaaaacatg tcaattaaaa
 181 aaattcagta tatcattaat ttcgtctaaa atgtcacata aatctctgac ataatttggt
 241 ttttaaacaa taaccaataa tttgggttta tttatgtgat gagaataaca actggtattt
 301 attgtctata cttatgcaat tttatagatg gagttttaac attgaatgcg gagaacacta
 361 attatgccta tcaagttcca aacttccata aatgtgaaat ctgtctacta tcttttccaa
 421 aagaatccca gtttcaacgc cacatgaggg atcacgagcg aaatgacaag ccacatcgat
 481 gtgaccagtg cccccaaaca tttaatgttg aattcaacct gacacttcat aaatgcaccc
 541 acagcgggga agatcctacc tgccctgtgt gtaacaagaa attctccaga gtggctagtc
 601 tcaaagcgca tattatgcta catgaaaagg aagagaatct catctgttct gagtgtgggg
 661 gtgagtttac tctgcagagt cagctggccg tgcacatgga ggagcaccgc caggagctgg
 721 ctggaacccg gcagcatgcc tgcaaggcct gcaagaaaga gttcgagacc tcctcggagc
 781 tgaaggaaca catgaagact cattacaaaa ttagggtatc aagtacaagg tcttataacc
 841 ggaatatcga cagaagtgga ttcacgtatt cgtgtccgca ctgtggaaag acgtttcaaa
 901 agccaagcca gttaacgcga cacattagga tacacacagg tgaaaggccg ttcaaatgta
 961 gtgaatgtgg aaaggctttt aaccagaagg gggcactgca gacccacatg atcaagcaca
1021 caggtgaaaa accccatgcc tgtgccttct gtcctgccgc cttctctcag aaagggaatc
1081 ttcagtcgca cgtgcagcga gtccactcag aggtcaagaa tggtcctacc tataactgt
1141 cagaatgtag ttgtgtattt aaaagtttag gcagcttaaa cacgcatatc agcaagatgc
1201 atatgggtgg gccacagaat tcaacaagtt ctacagagac tgctcatgtt ttaacggcca
1261 cactttttca gacgttacct cttcaacaga cggaagccca agccacgtcg gcctcaagcc
1321 agccgagctc ccaggcggtg agcgacgtca tccagcagct cctggagctc tcagagccgg
1381 cgccggtgga gtcggggcag tccccgcagc ctgggcagca gctgagcatc acagtgggca
1441 tcaaccagga cattttacag caagccttag aaaacagtgg gctgtcttca attccagctg
1501 cagcacatcc taatgactcc tgccatgcca agacctctgc accacacgct caaaacccag
1561 atgtttccag cgtttcaaat gagcagacgg accccacaga cgcagagcaa gaaaaagaac
1621 aggaaagccc ggagaaactg gataaaaaaa aaaaaaaaag ggccacatgt gctcgagctg
1681 caggtcgcgg ccgctagact agtctagaga aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg
1741 aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac
1801 aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt
1861 tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatccccgg gtaccgagct
1921 cgaattaatt cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg
1981 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat
2041 aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc
2101 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc
2161 tcaagtcaga ggtggcgaac cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga
2221 agctccctcg tgcgctctcc t
SEQ ID N0：7.人新的ZFP236多肽序列(472个氨基酸)，公开的登录号为AK000847，蛋白识别号为BAA91398.1。
NH2-MRITTGIYCLYLCNFIDGVLTLNAENTNYAYQVPNFHKCEICLL
SFPKESQFQRHMRDHERNDKPHRCDQCPQTFNVEFNLTLHKCTHSGEDPTCPVCNKKF
SRVASLKAHIMLHEKEENLICSECGGEFTLQSQLAVHMEEHRQELAGTRQHACKACKK
EFETSSELKEHMKTHYKIRVSSTRSYNRNIDRSGFTYSCPHCGKTFQKPSQLTRHIRI
TGERPFKCSECGKAFNQKGALQTHMIKHTGEKPHACAFCPAAFSQKGNLQSHVQRVH
SEVKNGPTYNCTECSCVFKSLGSLNTHISKMHMGGPQNSTSSTETAHVLTATLFQTLP
LQQTEAQATSASSQPSSQAVSDVIQQLLELSEPAPVESGQSPQPGQQLSITVGINQDI
LQQALENSGLSSIPAAAHPNDSCHAKTSAPHAQNPDVSSVSNEQTDPTDAEQEKEQES
PEKLDKKKKKRATCARAAGRGR -COOH
SEQ ID NO：8.人新的ZFP236编码序列(1419bps)，公开的登录号为AK000847。
   1 atgagaataa caactggtat ttattgtcta tacttatgca attttataga tggagtttta
  61 acattgaatg cggagaacac taattatgcc tatcaagttc caaacttcca taaatgtgaa
 121 atctgtctac tatcttttcc aaaagaatcc cagtttcaac gccacatgag ggatcacgag
 181 cgaaatgaca agccacatcg atgtgaccag tgcccccaaa catttaatgt tgaattcaac
 241 ctgacacttc ataaatgcac ccacagcggg gaagatccta cctgccctgt gtgtaacaag
 301 aaattctcca gagtggctag tctcaaagcg catattatgc tacatgaaaa ggaagagaat
 361 ctcatctgtt ctgagtgtgg gggtgagttt actctgcaga gtcagctggc cgtgcacatg
 421 gaggagcacc gccaggagct ggctggaacc cggcagcatg cctgcaaggc ctgcaagaaa
 481 gagttcgaga cctcctcgga gctgaaggaa cacatgaaga ctcattacaa aattagggta
 541 tcaagtacaa ggtcttataa ccggaatatc gacagaagtg gattcacgta ttcgtgtccg
 601 cactgtggaa agacgtttca aaagccaagc cagttaacgc gacacattag gatacacaca
 661 ggtgaaaggc cgttcaaatg tagtgaatgt ggaaaggctt ttaaccagaa gggggcactg
 721 cagacccaca tgatcaagca cacaggtgaa aaaccccatg cctgtgcctt ctgtcctgcc
 781 gccttctctc agaaagggaa tcttcagtcg cacgtgcagc gagtccactc agaggtcaag
 841 aatggtccta cctataactg tacagaatgt agttgtgtat ttaaaagttt aggcagctta
 901 aacacgcata tcagcaagat gcatatgggt gggccacaga attcaacaag ttctacagag
 961 actgctcatg ttttaacggc cacacttttt cagacgttac ctcttcaaca gacggaagcc
1021 caagccacgt cggcctcaag ccagccgagc tcccaggcgg tgagcgacgt catccagcag
1081 ctcctggagc tctcagagcc ggcgccggtg gagtcggggc agtccccgca gcctgggcag
1141 cagctgagca tcacagtggg catcaaccag gacattttac agcaagcctt agaaaacagt
1201 gggctgtctt caattccagc tgcagcacat cctaatgact cctgccatgc caagacctct
1261 gcaccacacg ctcaaaaccc agatgtttcc agcgtttcaa atgagcagac ggaccccaca
1321 gacgcagagc aagaaaaaga acaggaaagc ccggagaaac tggataaaaa aaaaaaaaaa
1381 agggccacat gtgctcgagc tgcaggtcgc ggccgctag

Claims (73)

1.一种用于治疗哺乳动物的与ICT1030肽的不希望的活性或表达相关的疾病的方法，包括施用能够与ICT1030肽或基因相互作用的组合物，其中，所述组合物在导入所述哺乳动物组织时能够增强ICT1030的表达或活性。
2.如权利要求1的方法，其中，所述疾病是癌或癌前期的生长。
3.如权利要求1的方法，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
4.如权利要求1的方法，其中，所述组合物是核酸。
5.如权利要求4的方法，其中，所述核酸是诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够增强目标ICTE1030基因表达的分子，或它们的组合。
6.如权利要求4的方法，其中，所述核酸分子基本上是双链的，并且长度为大约一百个碱基对或更少。
7.如权利要求4的方法，其中，所述核酸组合物包括siRNA，RNAi或shRNA或能够编码siRNA，RNAi或shRNA的分子。
8.如权利要求4的方法，其中，所述核酸组合物是能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子，并且，其中，所述核酸分子是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒载体。
9.如权利要求8的方法，其中，所述载体是逆转录病毒或腺病毒载体。
10.如权利要求4的方法，其中，所述核酸组合物包括选自下组的至少一种分子：siRNA，RNAi，和shRNA，并且，其中，所述分子能增强目标ICTE1030基因在哺乳动物体内的表达。
11.如权利要求1的方法，其中，所述哺乳动物是人。
12.如权利要求4的方法，其中，所述核酸与目标ICTE1030基因-编码核酸构成了三螺旋。
13.如权利要求1的方法，其中，所述目标ICTE1030基因包括选自下组的多核苷酸：
(a)编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸；
(b)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸；和
(c)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
14.如权利要求1的方法，其中，所述目标ICTE1030基因包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
15.如权利要求1的方法，其中，所述目标ICTE1030基因包括与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
16.如权利要求1的方法，其中，所述目标ICTE1030基因包括与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
17.如权利要求1的方法，其中，所述目标ICTE1030基因包括与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
18.如权利要求13的方法，其中，所述核酸分子基本上是双链的，并且长度为大约一百个碱基对或更少。
19.如权利要求13的方法，其中，所述核酸组合物包括siRNA，RNAi或shRNA或能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子。
20.如权利要求19的方法，其中，所述核酸组合物是能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子，并且，其中，所述核酸分子是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒载体。
21.如权利要求20的方法，其中，所述载体是逆转录病毒或腺病毒载体。
22.一种给有需要的患者施用核酸的方法，其中，所述核酸分子是是以裸露的寡核苷酸或载体形式送递的，所述核酸能够与目标ICT1030基因相互作用。
23.如权利要求22的方法，其中，所述核酸是作为载体送递的，其中，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒。
24.如权利要求23的方法，其中，所述载体是逆转录病毒或基于腺病毒的载体。
25.如权利要求22的方法，其中，所述所述核酸能增强目标ICTE1030基因在哺乳动物细胞内的表达。
26.如权利要求22的方法，其中，所述细胞是人细胞。
27.如权利要求1的方法，其中，所述组合物是SEQ ID NO：2所示的ICT1030多肽或与SEQ ID NO：2所示的多肽具有至少大约90％序列同一性并且具有ICT 1030多肽的生物学活性的多肽。
28.如权利要求1的方法，其中，所述组合物是对SEQ ID NO：2所示的ICT1030多肽或与SEQ ID NO：2所示的多肽具有至少大约90％序列同一性的多肽特异的抗体。
29.一种用于抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织与增强剂接触，所述增强剂能与目标ICT1030相互作用，并因此增强目标ICT1030表达或活性。
30.如权利要求29的方法，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
31.如权利要求29的方法，其中，所述组合物包括选自下组的核酸：siRNA，RNAi，和shRNA，并且，其中，所述分子能增强目标ICTE1030基因在哺乳动物体内的表达。
32.如权利要求29的方法，其中，所述哺乳动物是人。
33.一种用于治疗哺乳动物的与ICT1031，ICT10249，ICT1025，或ICT1003肽的不希望的表达或活性相关的疾病的方法，包括施用含有能够与ICT1031，ICT1024，ICT1025，或ICT1003肽或DNA或RNA相互作用的抑制剂的组合物，其中，所述组合物在导入哺乳动物的组织时能够减弱ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003肽的表达或活性。
34.如权利要求33的方法，其中，所述疾病是癌或癌前期的生长。
35.如权利要求33的方法，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
36.如权利要求33的方法，其中，所述组合物是核酸。
37.如权利要求36的方法，其中，所述抑制剂是siRNA，RNAi，shRNA，反义RNA，反义DNA，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够产生RNA干扰的分子，或它们的组合。
38.如权利要求36的方法，其中，所述核酸分子基本上是双链的，并且长度为大约一百个碱基对或更少。
39.如权利要求38的方法，其中，所述核酸组合物包括siRNA，RNAi或shRNA或能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子。
40.如权利要求39的方法，其中，所述核酸组合物是能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子，并且，其中，所述核酸分子是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒载体。
41.如权利要求40的方法，其中，所述其中，所述载体是逆转录病毒或腺病毒载体。
42.如权利要求36的方法，其中，所述核酸组合物包括选自下组的至少一种分子：siRNA，RNAi，和shRNA，并且，其中，所述分子能够在哺乳动物体内导致目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因的转录后沉默。
43.如权利要求33的方法，其中，所述哺乳动物是人。
44.如权利要求36的方法，其中，所述抑制剂能与目标ICT1031-编码核酸形成三螺旋。
45.如权利要求33的方法，其中，所述目标ICTE1031基因包括选自下组的多核苷酸：
(a)编码SEQ ID NO：5所示多肽的多核苷酸；
(b)SEQ ID NO：4所示的多核苷酸；和
(c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
46.如权利要求45的方法，其中，所述目标ICTE1031基因包括与编码SEQ ID NO：5所示多肽的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
47.如权利要求45的方法，其中，所述目标ICT1031基因包括与SEQ ID NO：4所示多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
48.如权利要求33的方法，其中，所述目标ICT1003基因包括选自下组的多核苷酸：
(a)编码SEQ ID NO：7所示多肽的多核苷酸；
(b)SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的多核苷酸；和
(c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
49.如权利要求48的方法，其中，所述目标ICT1003基因包括与编码SEQ ID NO：7所示多肽的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
50.如权利要求48的方法，其中，所述目标ICT1003基因包括与SEQ ID NO：8所示多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
51.如权利要求33的方法，其中，所述目标ICT1024基因包括选自下组的多核苷酸：
(a)编码SEQ ID NO：37所示多肽的多核苷酸；
(b)SEQ ID NOs：58，60，61，62，64，66，68或69所示的多核苷酸；和
(c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
52.如权利要求51的方法，其中，所述目标ICT1024基因包括与编码SEQ ID NO：37所示多肽的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
53.如权利要求51的方法，其中，所述目标ICT1024基因包括与SEQ ID NOs.58，60，61，62，64，66，68或69所示的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
54.如权利要求33的方法，其中，所述目标ICT1025基因包括选自下组的多核苷酸：
(a)编码SEQ ID NO：71所示多肽的多核苷酸；
(b)SEQ ID NO：70所示的多核苷酸；和
(c)与a)或b)的多核苷酸具有至少大约90％序列同一性的多核苷酸。
55.如权利要求54的方法，其中，所述目标ICT1025基因包括与编码SEQ ID NO：70所示多肽的多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
56.如权利要求54的方法，其中，所述目标ICT1025基因包括与SEQ ID NO：71所示多核苷酸具有至少大约95％序列同一性的多核苷酸。
57.一种抑制哺乳动物组织中癌或癌前期的生长的方法，包括让所述组织接触能够与目标ICT1031，ICT1024，ICT1025，或ICT1003DNA或RNA相互作用的抑制剂，并因此减弱目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因表达。
58.如权利要求57的方法，其中，所述组织是乳腺组织，结肠组织，前列腺组织，皮肤组织，骨组织，腮腺组织，胰腺组织，肾组织，子宫颈组织，淋巴结组织，或卵巢组织。
59.如权利要求57的方法，其中，所述抑制剂是siRNA，RNAi，shRNA，反义RNA，反义DNA，诱铒分子，诱铒DNA，双链DNA，单链DNA，复合DNA，包囊的DNA，病毒DNA，质粒DNA，裸露的RNA，包囊的RNA，病毒RNA，双链RNA，能够产生RNA干扰的分子，或它们的组合。
60.如权利要求57的方法，其中，所述核酸分子基本上是双链的，并且长度为大约一百个碱基对或更少。
61.如权利要求57的方法，其中，所述核酸组合物包括siRNA，RNAi或shRNA或能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子。
62.如权利要求57的方法，其中，所述核酸组合物是能够编码siRNA，RNAi或shRNA的核酸分子，并且，其中，所述核酸分子是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒载体。
63.如权利要求62的方法，其中，所述载体是逆转录病毒或腺病毒载体。
64.如权利要求57的方法，其中，所述核酸组合物包括选自下组的至少一种分子：siRNA，RNAi，和shRNA，并且，其中所述分子能在哺乳动物体内导致目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因的转录后沉默。
65.如权利要求57的方法，其中，所述哺乳动物是人。
66.如权利要求57的方法，其中，所述抑制剂能够与目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003-编码核酸形成三螺旋。
67.一种给有需要的患者施用siRNA的方法，其中，所述siRNA是以裸露的寡核苷酸或载体形式送递的，其中，所述siRNA能够与目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因或目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003 mRNA转录物相互作用。
68.如权利要求67的方法，其中，所述siRNA是作为载体送递的，其中，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体，或病毒。
69.如权利要求68的方法，其中，所述载体是逆转录病毒或基于腺病毒的载体。
70.一种通过给有需要的患者施用载体而阻断目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因的体内表达的方法，其中，所述载体包括目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003 siRNA。
71.如权利要求70的方法，其中，所述siRNA能够干扰目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因表达。
72.如权利要求71的方法，其中，所述siRNA能在哺乳动物细胞体内导致目标ICT1031，ICT1024，ICT 1025，或ICT1003基因的转录后沉默。
73.如权利要求72的方法，其中，所述细胞是人细胞。
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