JP2007525447A - 腫瘍増殖阻害の標的 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＥＧＦＲ−ＲＰ、ＴＲＡ１、ＭＦＧＥ８、ＴＮＦＳＦ１３およびＺＦＰ２３６の各遺伝子などの遺伝子のアップレギュレーション、サイレンシングおよび／またはダウンレギュレーションにより標的遺伝子発現を操作することによって癌を治療する方法に関する。この方法は、タンパク質、ペプチドおよび遺伝子療法薬物理学療法のための標的ＩＣＴ１０３０として検証された遺伝子の発現を増強することによる；または抗体、小分子およびその他の阻害剤薬物理学療法について検証されたＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１およびＩＣＴ１００３などの標的をサイレンシングおよび／またはダウンレギュレーションするＲＮＡ干渉による、癌の治療および／または腫瘍増殖の阻害に有用である。

Description

発明の背景
本願は、２００３年４月１日出願の仮出願第６０／４５８，９４８号および２００３年６月２４日出願の仮出願第６０／４８９，５０４号に基づく優先権を主張するものであり、これらの明細書の全開示内容は引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
発明の分野
本発明は、検証された癌薬物標的の活性または発現を操作することにより疾病を治療するための方法に関し、ここで、これらの標的は動物疾病モデルにおいて標的遺伝子発現を操作する方法により検証されたものである。より具体的には、本発明は、ｓｉＲＮＡを用いて検証されたＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３０、ＩＣＴＢ１０３１およびＩＣＢＴ１００３などの標的のアップレギュレーション、サイレンシング、阻害および／またはダウンレギュレーションに関する。本発明は、タンパク質、ペプチドおよび遺伝子療法薬物理学療法のための標的ＩＣＴ１０３０として検証された遺伝子の発現を増強することによる、またはＲＮＡ干渉により抗体、小分子およびその他の阻害剤薬物理学療法のための標的ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１およびＩＣＴ１００３として検証された遺伝子をサイレンシングおよび／またはダウンレギュレーションすることによる、癌の治療および／または腫瘍増殖の阻害に有用な方法に関する。
背景技術
癌または前癌増殖は一般に、良性腫瘍ではなく悪性腫瘍と呼ばれている。良性腫瘍細胞は正常な周囲の細胞と同じである。腫瘍増殖が他の器官の妨げとなるほど大きくなった場合にのみ治療が必要となる。これに対して悪性腫瘍は良性腫瘍よりも速く増殖し、浸潤し、その場所の組織を破壊する。血液またはリンパ系を介して体中へ拡がる悪性腫瘍もある。このような予測できない制御不能の増殖のために、悪性癌は危険で、多くの場合死に至るものとなる。これらの腫瘍は形態学的にもとの組織に典型的なものではなく、封入もされていない。悪性腫瘍は手術により摘出しても再発することが多い。
多くのヒト疾病は増殖性細胞病態の結果である。癌または前癌増殖は増殖性細胞病態の結果であることが多く、一般に、良性腫瘍ではなく悪性腫瘍と呼ばれている。良性腫瘍細胞は正常な周囲の細胞と同じである。腫瘍増殖が他の器官の妨げとなるほど大きくなった場合にのみ治療が必要となる。これに対して悪性腫瘍は良性腫瘍よりも速く増殖し、浸潤し、その場所の組織を破壊する。血液またはリンパ系を介して体中へ拡がる悪性腫瘍もあり、それらの予測できない制御不能の増殖のために、悪性癌は危険で、多くの場合死に至るものとなる。このような腫瘍は形態学的にもとの組織に典型的なものではなく、封入もされていない。悪性腫瘍は手術により摘出しても再発することが多い。よって、増殖性疾患の治療は、通常、悪性癌または悪性腫瘍で見られるような増殖性細胞活性を標的とし、その目標は増殖プロセスへの介入である。
悪性増殖の阻害または予防は癌発達の初期段階で最も効果的である。従って、増殖プロセスおよびそれらの誘導、また、特に悪性疾患においては腫瘍形成の初期兆候に役割を果たす分子標的を同定および検証することが重要である。具体的な目標は、有力な腫瘍増殖もしくは遺伝子発現抑制要素またはそれに関連する薬剤を決定することである。このような腫瘍増殖および／または遺伝子発現ならびに治療要素または薬剤の開発には、特に腫瘍形成に関連した細胞分裂および分化の遺伝制御メカニズムに関する理解が必要となる。残念なことに、増殖性疾患における介入に好適な、確立されているタンパク質標的の数には限りがある。ＥＧＦおよびその受容体のような増殖因子など、少数の確立された標的のうち、悪性癌および乾癬などの増殖性疾患に十分な介入が可能なものは、あったとしても少数である。
さらに、細胞増殖性病態における介入のためのよりよい標的を同定することは困難であることが分かっている。ヒトのゲノムには多数の遺伝子およびタンパク質が存在し、これらの遺伝子およびタンパク質の多く、ならびにそれらタンパク質の翻訳後修飾型が細胞増殖性病態に関連している。これら多くの遺伝子、タンパク質および翻訳後修飾タンパク質のうち、細胞増殖性病態に効果的に介入するために標的化できる特定の因子は少数しかない。よって、これらの特定因子の同定が必要である。増殖性細胞病態における介入を標的化するために特定の遺伝子、タンパク質、および翻訳後修飾タンパク質を同定する必要に加え、もう一つの問題として、その標的化された因子が実際に活動中の病理組織内で活動中の病態に効果的な介入をもたらすということを検証する必要がある。残念なことに、細胞培養条件における細胞の増殖は標的化可能な多くの因子を示すが、最終的に、活動中の病理組織において介入標的として有効であることは分かっていない。結果として、増殖性細胞病態における効果的介入のための標的の正確な同定には、ヒト疾病の動物モデルなど、活動中の病理組織に関する研究が必要となる。
よって、治療は通常、悪性癌または悪性腫瘍を標的とする。悪性増殖の妨害は癌発達の初期段階において最も効果的である。このように、腫瘍形成の初期兆候の標的を同定および検証すること、ならびに有力な腫瘍増殖もしくは遺伝子発現抑制要素もしくはそれに関連する薬剤を決定することは極めて重要である。このような腫瘍増殖および／または遺伝子発現および治療要素または薬剤の開発には、特に腫瘍形成に関連した細胞分裂および分化の遺伝制御メカニズムに関する理解が必要となる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が配列特異的に遺伝子発現を阻害する転写後プロセスである。このＲＮＡｉプロセスは少なくとも２つの段階で起こり、第一段階では、長いｄｓＲＮＡが、内因性のリボヌクレアーゼにより、「小干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる、１００、５０、３０、２３、または２１未満のヌクレオチド長の短いｄｓＲＮＡに切断される。第二段階では、これらの小さなｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ分子の分解を媒介する。このＲＮＡｉの作用は、細胞内の標的配列に長いｄｓＲＮＡまたは短いｓｉＲＮＡかのいずれかを導入することで達成できる。また、ＲＮＡｉ作用は標的遺伝子と相補的なｄｓＲＮＡを生成するプラスミドを導入することでも達成できることが示されている。
ＲＮＡｉはショウジョウバエ (Kennerdell et al. (2000) Nature Biotech 18: 896-898; Worby et al. (2001) Sci STKE Aug 14, 2001 (95):PL1; Schmid et al. (2002) Trends Neurosci 25(2):71-74; Hammond et al. (2000). Nature, 404:293-298)、線虫(C. elegans)(Tabara et al. (1998) Science 282:430-431; Kamath et al. (2000) Genome Biology 2:2.1-2.10; Grishok et al. (2000) Science 287:2494-2497)、およびゼブラフィッシュ(Kennerdell et al. (2000) Nature Biotech 18:896-898) の遺伝子機能決定に首尾よく用いられてきた。これらのモデル生物では、化学的に合成された短いｓｉＲＮＡまたはin vitroで転写された長いｄｓＲＮＡの両者とも、標的遺伝子発現を有効に阻害できることが報告されている。非ヒト哺乳類およびヒト細胞培養においてもＲＮＡｉ作用が首尾よく達成されたという報告が増えている(Manche et al. (1992).Mol. Cell. Biol. 12:5238-5248; Minks et al. (1979). J. Biol. Chem. 254:10180-10183; Yang et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(22):7807-7816; Paddison et al. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(3):1443-1448; Elbashir et al. (2001) Genes Dev 15(2):188-200; Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; Caplen et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9746-9747; Holen et al. (2002) Nucleic Acids Research 30(8):1757-1766; Elbashir et al.(2001) EMBO J20:6877-6888; Jarvis et al.(2001) TechNotes 8(5):3-5; Brown et al. (2002) TechNotes 9(1):3-5; Brummelkamp et al. (2002) Science 296:550-553; Lee et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002) Genes & Dev. 16:948-958; Paul et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052)。
ＥＧＦＲ−ＲＰ（検証された標的ＩＣＴ１０２４）：ホモ・サピエンス上皮増殖因子受容体関連タンパク質ＥＧＦＲ−ＲＰまたはＥＧＦＲ−ＲＳはＧｅｎＢａｎｋ受託番号が公開されており、ＡＫ０２６０１０、ＮＭ＿０２２４５０、ＢＣ０１４４２５、ＡＫ０５６７０８およびＭ９９６２４である。
真核細胞は総て、細胞内に、種々の膜で囲まれたコンパートメントを形成する精巧な内膜系を含んでいる。この原形質膜は、細胞の内膜機構と総ての細胞が浸っている細胞外液（ＥＣＦ）との間の界面として働く。細胞膜は脂質とタンパク質から構成されている。原形質膜内の脂質は主としてホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールのようなリン脂質である。リン脂質は、分子テールが疎水性で、極性頭部が親水性の両親媒性である。原形質膜は、その両側が水溶液に面しているので、そのリン脂質は、互いに疎水性テールを対面させた脂質二重層を形成することでこれに対応している。この原形質膜に会合しているタンパク質の多くはそれに強固に結合している。二重層の脂質に結合しているものもあれば、ポリペプチド鎖が実際に脂質二重層を横切っているトランスメンブランタンパク質もある。
膜タンパク質は総て、二重層中において逆さまたは表が上の配向を有する。生体膜は正味負電荷を有する傾向があるので、タンパク質残基と正電荷を有する側鎖および負電荷を有する脂質頭部基との間のイオン的相互作用によって膜に固定されているタンパク質もある。また、ミリストイル、パルミトイル、ファルネシルまたはゲレニル−ゲレニルなどの炭化水素鎖、またはそれらをそれらのタンパク質相手に近接した領域に制限するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）などの脂質の合成後付着により固定されるタンパク質もある。また、イオン的接触により表面に固定されるタンパク質もある。一回膜貫通または表在性膜タンパク質とは、膜表面のかなり浅い貫通を有するタンパク質をさす。多くの表在性タンパク質は溶液のイオン強度を高めることで膜から遊離させることができる。膜タンパク質の第二のカテゴリーとして、二回または多回内在型または膜貫通タンパク質がある。これらのタンパク質は界面活性剤で二重層を崩壊させることではじめて膜から遊離させることができる。
構造上関連のある多くのトランスメンブランタンパク質はまた、機能上も関連がある。例えば、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子受容体）およびインスリン受容体は、一重トランスメンブランらせんによって接続された極めて大きなジスルフィド豊富な細胞外ドメインとチロシンキナーゼ細胞内ドメインを有する増殖因子受容体のファミリーに属する。このファミリーのほとんどのメンバーは単量体であり、リガンドの結合は細胞内チロシンキナーゼドメインの二量体形成と活性化を誘導する。インスリン受容体は、リガンドが結合していない状態で二量体であり、この場合、インスリンの結合がそれらの単量体のサブユニット間配向を変化させ、活性化が可能となる可能性がある。
トランスメンブランタンパク質のもう１つの重要なファミリーは、Ｇタンパク質（グアニンヌクレオチド結合タンパク質）共役受容体の７回膜貫通ファミリーである。これらの受容体は哺乳類細胞において最も存在量の多いクラスであり、光（ロドプシン）から神経伝達物質（ムスカリンまたはアドレナリン受容体）、性関連シグナル（オキシトシン）まで、極めて多様な範囲のシグナルを細胞に伝達する。それらのリガンドアクチベーターは多様であるが、これらの受容体はシグナルを伝達するために総てＧタンパク質と結合する。構造上、それらは、定義されたトポロジーで７回膜貫通ループを持つという点で類似している。増殖因子受容体ファミリーとは対照的に、これらのタンパク質は比較的小さな膜外ループを有する。
栄養素およびイオンなどの種を輸送する内在性膜タンパク質は、周囲の炭化水素内部からそれらのリガンドを保護することができなければならない。従って、これらのタンパク質は上述のシグナル伝達タンパク質よりもずっと大きく、多くの場合、数個のサブユニットを含む。このクラスの例として、ＧＬＵＴ１および抗生物質など、輸送体に属する１２回膜貫通ファミリーがある。内在性膜タンパク質の新たに同定されたファミリーであるＲｈｏｍｂｏｉｄファミリーは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）依存性シグナル伝達経路に関与する発達レギュレーター、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来のｒｈｏｍｂｏｉｄ（ＲＨＯ）タンパク質により例示される（１、２、３）。原核生物および真核生物でｒｈｏｍｂｏｉｄの同族体が検出されただけでなく、このファミリーの配列保存のパターンは、輸送体など、非酵素膜タンパク質の特徴とは異なるようである（４、５）。具体的には、いくつかの極性アミノ酸残基はこのｒｈｏｍｂｏｉｄファミリーのほとんど総てのメンバーで保存されており、このことは酵素活性の潜在性を示唆している。これらの保存されている残基のうちの３つはヒスチジンであったことから、ｒｈｏｍｂｏｉｄファミリータンパク質は金属依存性膜プロテアーゼとして働いている可能性があるようである（５、６）。しかしながら、最近、ＲＨＯがＴＧＦα様の増殖因子Ｓｐｉｔｚの膜結合前駆体におけるトランスメンブランヘリックス（ＴＭＨ）を切断し、放出されたＳｐｉｔｚにＥＧＦ受容体を活性化させることを可能とすること、およびこの切断にはＲＨＯにおいて保存されているセリンおよび保存されているヒスチジンが不可欠であることが示された（７、８）。従って、ｒｈｏｍｂｏｉｄファミリータンパク質は膜内セリンプロテアーゼの明瞭な一群であるのが明らかである。これらを考え合わせると、ショウジョウバエのゲノムは７つのＲＨＯパラログ（現在、もとのｒｈｏｍｂｏｉｄをＲＨＯ−１とし、ＲＨＯ１〜７で表されている）をコードし、そのうち少なくとも３つは、明らかにＥＧＦ受容体の多様なリガンドのタンパク質分解性の活性化を介して、明瞭なＥＧＦ依存性経路に関与している。
複数のｃＤＮＡ配列（受託番号ＡＫ０２６０１０、ＮＭ＿０２２４５０、Ｚ６９７１９、ＡＫ０５６７０８、ＢＣ０１４４２５、Ｍ９９６２４）と相同性を共有する１つのヒト遺伝子は、マウス上皮細胞増殖因子受容体関連配列（ＥＧＦＲ−ＲＳ）のオーソログ、上皮細胞増殖因子受容体関連タンパク質と類似の仮説タンパク質、ヒト上皮細胞増殖因子受容体関連遺伝子、およびその後、ヒトｒｈｏｍｂｏｉｄファミリー１と注釈が付けられた。これらのｃＤＮＡ配列ＡＫ０２６０１０、ＢＣ０１４４２５およびＮＭ＿０２２４５０は同じ８５５アミノ酸のタンパク質（受託番号ＢＡＢ１５３１８、ＡＡＨ１４４２５およびＡＡＡ０２４９０）をコードする。しかしながら、このタンパク質の生物活性は現在まだ分かっていない。
ＴＲＡ１（検証された標的ＩＣＴ１０２５）：ホモ・サピエンス腫瘍拒絶抗原ＴＲＡ１または熱ショックタンパク質ｇｐ９６もしくはｇｒｐ９４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２９９、ＡＫ０２５４５９、ＢＣ００９１９５、ＡＹ０４０２２６、Ｘ１５１８７およびＡＦ０８７９８８として公開されている。米国公開番号２００３／０２１５８７４；２００３／００５４９９６；および２００２／０１６０４９６も参照されたい。
Efficacy-Firstを用いて選択した標的の１つである腫瘍拒絶抗原−１（ＴＲＡ−１）は、増殖が加速化された腫瘍において発現が増加することが判明した。ＴＲＡ−１は、グルコース調節型タンパク質９４（ｇｒｐ９４）、ｇｐ９６、エンドプラスミン前駆体およびその他の名称としても知られるが、最初は、核シグナル伝達、タンパク質の折りたたみ、選別および分泌に関する小胞体における重要な役割を有する[Nicchitta, C. V. (1998): Biochemical, cell biological and immunological issues surrounding the endoplasmic reticulum chaperone GRP94/gp96. Current Opinion in Immunology, 10:103-109]、分子シャペロン[Hartl FU. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381(6583):571-9]として報告されたものである。さらに、それはＣａ２＋欠乏ストレスに対して特異的保護を発揮し、抗原提示に関与する[Tamura, Y. P. Peng, K. Liu, M. Daou, P. K. Srivastava, 1997: Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparation. Science,278:117-120]。さらに、それはまた腫瘍形成性に重要な役割を持つ[Udono H, Levey DL, Srivastava PK. (1994) Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection gp96 primes CD8=T cells in vivo. Pro Natl Acad Sci USA 91:3077-3081]。Menoret et al. [Menoret A, Meflah K, Le Pendu J. (1994) Expression of the 100 kDa glucose-regulated protein (GRP100/endoplasmin) is associated with tumorigenicity in a model of rat colon adenocarcinoma. Int J Cancer 56:400-405]は、ラット結腸腺癌のモデルにおいてＴＲＡ−１の過剰発現があったことを報告している。Gazit et al. [Gadi Gazit, Jun lu, Amy S. Lee. (1999) De-regulation of GRP stress proteinexpression in human breast cancer cell lines. Breast Cancer Research and Treatment 54:135-146]は、正常ヒト乳房系統に比べて、５種類のヒト乳癌系統で見られたＴＲＡ−１タンパク質のレベルに３〜５倍の上昇があったことを見出した。Cai et al. [Cai JW. Henderson BW, Shen JW, et al (1993) Inductiob of glucose-regulated proteins during growth of murine tumor. J Cell Physiol 154;229-237]は、腫瘍増殖中の研究を通じて、ＴＲＡ−１のレベルが上昇し、それは腫瘍の大きさと相関があったことを見出した。ＴＲＡ−１レベルの上昇は細胞傷害性Ｔリンパ球媒介細胞傷害性に対する新生物細胞および腫瘍の保護に関連づけられており、組織培養細胞を有害な生理条件から保護した[Sugawara S, Takeda K, Lee A, et al. (1993) Suppression of stress protein GRP78 induction in tumor B/C10ME eliminates resistance to cell mediated cytotoxicity. Cancer Research. 53:6001-6005]。公開データベースでは、ＴＲＡ−１は、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、胃癌および柔組織腫瘍をはじめとする多くのヒト癌組織において過剰発現することが明らかである。組織培養系における過剰発現、アンチセンスおよびリボザイムアプローチから、ＴＲＡ−１は細胞死から細胞を保護することができることが直接示された[Little E, Ramakrishnan M, Roy B, et al. (1994) The glucose-regulated proteins (GRP78 and GRP94): Functions, gene regulation, and applications. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 4: 1-18, Garrido C, Gurbuxani S, Ravagnan L, Kroemer G. (2001). Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death. Biochem Biophys Res Commun. 286(3):433-42., Ramachandra K. Reddy, et al. (1999). The endoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94 with Ca2+-binding and antiapoptotic properties is a novel proteolytic target of calpain during etoposide-induced apoptosis. J. Biol. Chem 274:28476-28483]。ＴＲＡ−１のこれらの抗アポトーシス作用は新生物細胞における誘導と関連し、癌の進行および化学療法耐性を導き得る。通常はＥＲに閉じこめられているが、ＴＲＡ−１はいくつかの細胞種ではＫＤＥＬ媒介保持系へ逃れることが示されている。例えば、相当なＴＲＡ−１画分が肝細胞および内分泌膵細胞により通常の分泌経路を介して細胞外空間へ分泌される。いくつかの腫瘍細胞系統では、ＴＲＡ−１は外面タンパク質として検出することができる[Altmeyer A, Maki RG, Feldweg AM, Heike M, Protopopov VP, Masur SK, Srivastava PK (1996). Tumor-specific cell surface expression of the-KDEL containing, endoplasmic reticular heat shock protein gp96. Int. J. Camcer 22;69(4):340-9]。
ＴＲＡ−１は、正常タンパク質ならびに癌またはウイルス感染細胞に存在する外来タンパク質および変更されたタンパク質に由来するものをはじめ、幅広いペプチドアレイに付き添っている(chaperone)ことが示されている。従って、腫瘍由来ＴＲＡ−１は腫瘍抗原性ペプチドを有し、ウイルス感染細胞からの調製物はウイルスエピトープを有する。ＴＲＡ−１は通常は細胞内にあるが、壊死細胞はＴＲＡ−１ペプチド複合体を放出し、これがスカベンジャー抗原提示細胞によって取り込まれる。これらの細胞の表面でのペプチドの提示は、Ｔリンパ球の刺激および炎症性応答をもたらす。
ＴＲＡ−１とペプチドの複合体は、細胞から単離されたものであれ、in vitroで再構成されたものであれ、有効なワクチンとして働き、動物およびヒトで抗腫瘍免疫応答を生じることが証明されている[Tamura, Y. P. Peng, K. Liu, M. Daou, P. K. Srivastava, 1997: Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparation. Science, 278:117-120]。オンコファージは個々の患者の腫瘍から作られたワクチンである。患者は癌組織の一部または全部を摘出する手術を受け、この組織の一部が一晩でマサチューセッツ州のAntigenicsの製造工場に送られる。膵臓癌、黒色腫、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌および非ホジキンリンパ腫をはじめとするいくつかの癌におけるオンコファージの臨床研究から極めて有望な結果が得られている。それらの分析により、ＴＲＡ−１による抗原提示が患者の免疫応答および臨床奏功を誘導し得るという強い示唆が得られる。ある研究における黒色腫または結腸直腸癌では、３９名の黒色腫患者のうち１０名がオンコファージ治療に臨床奏功を示し、２年を超えて完全に癌が消失した２名の患者を含んでいた。免疫応答に関して評価した２４名の黒色腫患者のうち１０名で抗黒色腫Ｔ細胞活性の上昇が示された。結腸直腸癌患者では、２９名の患者のうち１７名でＴ細胞応答が見られ、生存率と相関しているものと思われた。黒色腫および結腸直腸癌においてオンコファージが免疫応答を誘導するメカニズムは同じであると判定され、このメカニズムがこれまでに試験した総ての癌および種で事実上同じであるということを証明する前臨床データおよび初期臨床データの価値が検証される。
ＭＦＧＥ８（検証された標的ＩＣＴ１０３０）：ホモ・サピエンス乳汁脂肪小球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧＥ８）または乳房上皮ＢＡ４６抗原はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９２８およびＢＣ００３６１０として公開されている。米国特許第６，３３９，０６６Ｂ１号明細書には、「タンパク質キナーゼＣ−ｅｔａ」（ＰＫＣ−η）などのＭＦＧＥ８関連分子の態様が記載されている。
ＴＮＦＳＦ１３（検証された標的ＩＣＴ１０３１）：ホモ・サピエンス腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０９０６９８およびＯ７５８８８で公開されている。いくつかの国際特許出願では、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）、ＴＡＬＬ−２（ＴＮＦおよびＡＰＯＬ関連白血球発現リガンド２）、およびＴＲＤＬ−１（ＴＮＦ関連細胞死リガンド−１）などのＴＮＦＳＦ１３関連分子の態様が記載されている（例えば、ＷＯ９９／１２９６５およびＷＯ０１／６０３９７参照）。
ＺＦＰ２３６（検証された標的ＩＣＴ１００３）：ホモ・サピエンスジンクフィンガータンパク質２３６（ＺＦＰ２３６）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０００８４７として公開されている。
発明の概要
本発明は、検証された標的遺伝子発現のアップレギュレーション、サイレンシング、またはダウンレギュレーションにより、核酸相互作用により、ＲＮＡ干渉または抗体、可溶性受容体、小分子阻害剤などのような他の薬剤の導入により、検証された薬物標的の活性を調節し、その結果として腫瘍増殖を阻害することによって、癌などの疾病を治療するための方法を提供する。
本発明の一つの態様によれば、標的ＩＣＴ１０３０遺伝子の望ましくない発現に関連する哺乳類の疾病、例えば癌または前癌増殖を治療するための方法であって、ＩＣＴ１０３０ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用し、哺乳類の組織に導入されたときに標的ＩＣＴ１０３０遺伝子の発現を増強し得る核酸組成物を適用することを含んでなる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、核酸分子は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、肺組織、リンパ節組織、または卵巣組織をはじめとする組織に導入され、その核酸分子はデコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、標的ＩＣＴ１０３０遺伝子の発現を増強し得る分子、またはそれらの組合せである。
本発明の他の態様によれば、哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を、標的ＩＣＴ１０３０ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用するエンハンサーと接触させ、それにより標的ＩＣＴ１０３０遺伝子発現を増強することを含んでなる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を、標的ＩＣＴ１０３０ペプチドと相互作用するエンハンサーと接触させ、それにより標的ＩＣＴ１０３０遺伝子発現を増強することを含んでなる方法が提供され、その組織は乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、または卵巣組織であり、そのエンハンサーは核酸分子、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、標的ＩＣＴ１０３０を増強し得る分子、またはそれらの組合せである。
本発明の他の態様によれば、核酸をそれを必要とする患者に投与する方法であって、その核酸分子が裸のオリゴヌクレオチドまたはベクターの形態で送達され、その核酸が標的ＩＣＴ１０３０遺伝子と相互作用する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、核酸をそれを必要とする患者に投与する方法であって、その核酸分子が裸のオリゴヌクレオチドまたはベクターの形態で送達され、その核酸が標的ＩＣＴ１０３０遺伝子と相互作用する方法が提供され、その核酸はベクターとして送達され、そのベクターはプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルス、例えばレトロウイルスもしくはアデノウイルスに基づくベクターである。
本発明の他の態様によれば、ベクターをそれを必要とする患者に投与することにより遺伝子のin vivo発現を増強する方法であって、そのベクターが標的ＩＣＴ１０３０遺伝子を含み、その核酸が標的ＩＣＴ１０３０遺伝子発現と相互作用し、その核酸が哺乳類細胞、例えばヒト細胞において標的ＩＣＴ１０３０遺伝子発現を増強する方法が提供される。
本発明の一つの態様によれば、本明細書に記載される標的ＩＣＴ１０３０遺伝子は、ａ）配列番号２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｂ）配列番号１および配列番号３で示されるポリヌクレオチド；またはｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる。
本発明の他の態様にれば、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子の望ましくない発現に関連する哺乳類における疾病、例えば癌または前癌増殖を治療するための方法であって、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１のＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する阻害剤を含む核酸組成物を適用することを含んでなる方法が提供され、その核酸組成物は、哺乳類の組織に導入されたときに標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子の発現を低下させ得るものである。
本発明の他の態様によれば、核酸分子は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、肺組織、リンパ節組織、または卵巣組織をはじめとする組織に導入される。
本発明の他の態様によれば、哺乳類において疾病、例えば、癌または前癌増殖を治療するための方法であって、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１のＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する阻害剤を含む核酸組成物を適用することを含んでなる方法が提供され、その阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じ得る分子、またはそれらの組合せである。
本発明の他の態様によれば、哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１のタンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する阻害剤と接触させ、それにより標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１の活性または遺伝子発現を低下させることを含んでなる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織が乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、肺組織、リンパ節組織、または卵巣組織である方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を阻害剤と接触させることを含んでなる方法が提供され、その阻害剤はｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じ得る分子、またはそれらの組合せである。
本発明の一つの態様によれば、本明細書に記載の標的ＩＣＴ１０３１遺伝子は、ａ）配列番号５で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｂ）配列番号４で示されるポリヌクレオチド；およびｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる。
本発明の一つの態様によれば、本明細書に記載の標的ＩＣＴ１００３遺伝子は、ａ）配列番号７で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｂ）配列番号６または配列番号８で示されるポリヌクレオチド；およびｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる。
本発明の他の態様によれば、ｓｉＲＮＡをそれを必要とする患者に投与する方法が提供され、ここで、そのｓｉＲＮＡ分子は裸の形態または製剤もしくはベクター中のオリゴヌクレオチドの形態で送達され、そのｓｉＲＮＡは標的ＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０３１の遺伝子、または標的ＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０３１のｍＲＮＡ転写物と相互作用し、そのｓｉＲＮＡはベクターとして送達され、そのベクターはプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルス、例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである。
本発明の他の態様によれば、ベクターをそれを必要とする患者に投与することにより標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子のin vivo発現を遮断する方法であって、そのベクターが標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１のｓｉＲＮＡを含むものである方法が提供され、そのｓｉＲＮＡは、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子発現と干渉するものであり、例えば、そのｓｉＲＮＡは、ヒト細胞などの哺乳類細胞において標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子の転写後サイレンシングを起こす。
本発明の他の態様によれば、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子の望ましくない発現に関連する哺乳類における疾病、例えば、癌または前癌増殖を治療するための方法であって、標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１のＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する阻害剤を含む核酸組成物を適用することを含んでなり、その核酸組成物が、哺乳類の組織に導入されたときに標的ＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０３１遺伝子の発現を低下させ得るものである方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、哺乳類において疾病、例えば、癌または前癌増殖を治療するための方法であって、標的ＩＣＴ１００３ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する阻害剤を含む核酸組成物を適用することを含んでなる方法が提供され、その阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じ得る分子、またはそれらの組合せである。
発明の具体的説明
本発明は、腫瘍増殖、疾病の進行の阻害のための検証された標的、ならびに哺乳類、例えばヒトにおいて腫瘍および癌、例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、骨癌、耳下腺癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頚癌、リンパ節癌、または卵巣癌を阻害および治療するための組成物を提供する。本発明は、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３０、ＣＴ１０３１、およびＩＣＴ１００３などの新規な標的の発見に基づくものである。従って、ＩＣＴ１０３０および／またはＩＣＴ１０３１および／またはＩＣＴ１００３および／またはＩＣＴ１０２４および／またはＩＣＴ１０２５は治療のための標的として使用でき、それらはまた、腫瘍および癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、骨癌、耳下腺癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頚癌、リンパ節癌、卵巣癌、または肺癌）の診断、予防、および治療に有用な化合物を同定するために使用できる。
本明細書で開示されるように、標的ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３０、ＩＣＴ１０３１、およびＩＣＴ１００３は、それらの標的が腫瘍の進行を制御し、従って、抗腫瘍薬物の開発を正当化するかどうかを判定する薬物標的のバリデーション法によって検証される（引用することにより本明細書の一部とされる、米国仮出願第６０／３２６，４２２号明細書およびＷ００３／０６３７６５公報）。この特許にかかる独特の腫瘍標的識別法は、導入遺伝子の過剰発現によって動物腫瘍モデルで直接的に標的を検証し、疾病制御を欠いた標的を排除する。本方法では、タンパク質生成、抗体および／またはトランスジェニック動物(総てコストがかかり、時間がかかる)の必要性が少なくなるとともに、標的が実際にその疾病を制御するという明らかで決定的な証拠が得られる。さらに、本方法では、細胞培養だけに頼り、病態をもたらす複数の細胞種の複雑な相互作用を見逃してしまう方法では得難い有用な情報が得られる。
上記のような基盤技術（引用することにより本明細書の一部とされる、国際出願ＷＯ０１４７４９６参照）は、腫瘍組織では十分に発現しない遺伝子のバリデーションの有力な手段である。しかしながら、遺伝子サイレンシングを達成するための技術的基盤は、腫瘍組織で過剰発現される遺伝子のバリデーションに極めて望ましい。最近、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象によって遺伝子特異的サイレンシングを誘導することが示された。ＲＮＡｉのメカニズムはまだ完全には理解されていないが、圧倒的な初期の研究結果により、このＲＮＡｉ効果が哺乳類種を含む種々の細胞種で達成され得ることが示唆されている。ｍＲＮＡに対して標的化された二本鎖ＲＮＡは標的ｍＲＮＡの分解をもたらし、対応する遺伝子のサイレンシングを起こす。大きな二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素に含まれるＲＮアーゼIII様活性により、より小さな断片、例えば２１〜２３ヌクレオチド長の断片に切断される。ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）として知られるこれらのより短い断片は、ｍＲＮＡの切断を媒介すると考えられている。遺伝子発現のダウンレギュレーションのためのＲＮＡｉのメカニズムは、線虫(C.elegans)およびその他の下等生物において研究されており、哺乳類細胞におけるその有効性が証明されている。最近では、このＲＮＡｉ作用が、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子リポーター系を用いてマウスで証明されている(Worby et al. (2001) Sci STKE Aug 14, 2001(95):PL1)。
本発明者らの独特なＰｏｌｙＴｒａｎＴＭ技術（国際出願ＷＯ０１４７４９６参照）によれば、プラスミドを直接腫瘍へ投与することができる。これにより、腫瘍における候補標的タンパク質の強い腫瘍発現および活性が得られる。
定義
一般に、「遺伝子」は、調節機能、触媒機能を有すか、かつ／またはタンパク質をコードするＲＮＡへと転写され得るゲノム上の領域である。真核生物遺伝子は典型的にはイントロンとエキソンを有し、これらは、成熟タンパク質の選択的形態をコードする種々のＲＮＡスプライス変異体を生成するように組織され得る。当業者ならば、本発明が、選択的プロモーター部位または選択的ポリアデニル化部位のために生じるスプライス変異体、対立遺伝子変異体および転写物をはじめ、見られ得る総ての内在遺伝子を包含することが分かるであろう。本明細書に記載のこの内在遺伝子は突然変異型内在遺伝子でもあってもよく、その突然変異はコード領域または調節領域におけるものであってもよい。
「標的遺伝子」とは、遺伝子発現のレベルまたは遺伝子産生活性のレベルの調節が疾病の進行、例えば腫瘍増殖を予防および／または改善する、示差的発現遺伝子をさす。従って、標的遺伝子の発現または標的遺伝子産物の活性を調節する化合物は、疾病の診断、治療または予防に使用できる。特に、本発明における標的遺伝子は、本明細書に記載の内在遺伝子およびそれらの変異体を含む。
よって、全長遺伝子またはＲＮＡは、天然に存在するスプライス変異体、対立遺伝子変異体、その他の選択的転写物、天然に存在する変異体と同じ機能を有する組換え技術によって作製されたスプライス変異体、および結果として生じたＲＮＡ分子を包含する。遺伝子の断片は、例えば、触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインなどの機能的ドメインに相当するものであっても相当しないものであってもよい、その遺伝子のいずれの部分であってもよい。断片は好ましくは少なくとも１６の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５の連続するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５またはそれ以上、またはその付近もしくはその間のいずれかの整数値の連続するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。構造遺伝子は、次に特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列である。
「相補的ＤＮＡ」（ｃＤＮＡ）は、しばしば「コピーＤＮＡ」とも呼ばれ、逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。一般に、ｍＲＮＡの部分に相補的なプライマーが逆転写の開始に用いられる。当業者はまた、このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖を含んでなる二本鎖ＤＮＡ分子をさして「ｃＤＮＡ」を用いる。
「遺伝子発現」とは、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、遺伝子発現はその構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
「作動可能なように結合される」とは、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域の間の結合を表すのに用いられる。すなわち、遺伝子発現は一般に、構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーを含む、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子またはコード領域は、調節エレメントと「作動可能なように連結」され、または「作動可能なように結合」されるが、これは、この遺伝子またはコード領域が調節エレメントにより制御または影響を及ぼされることを意味する。
「配列相同性」は、２以上の核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドの間の配列の関連性を表すのに用いられ、（ａ）参照配列、（ｂ）比較枠、（ｃ）配列同一性、（ｄ）配列同一性パーセンテージ、および（ｅ）実質的同一または相同を含む用語の文脈で、またそれらの用語に関して理解される。
（ａ）「参照配列」は配列比較の基準として用いられる定義された配列である。参照配列は特定の配列：例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列のサブセットまたは全体であってよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは通常、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、いっそうより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸である。核酸に関しては、参照核酸配列は通常、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、いっそうより好ましくは約１００ヌクレオチド、または約３００ヌクレオチド、またはその付近もしくはその間のいずれかの整数である。
（ｂ）「比較枠」は、あるポリヌクレオチドの連続する特定のセグメントに対する言及を含み、比較枠におけるこのポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのために参照配列（付加、置換または欠失を含まない）と比較される付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、この比較枠は少なくとも２０の連続するヌクレオチド、場合によっては３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の長さである。当業者ならば、そのポリヌクレオチド配列がギャップを含むために、参照配列との誤解を導くような高い類似性を避けるために、通常はギャップペナルティーを設け、マッチの数から差し引かれることが分かるであろう。
比較のための配列アライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アライメントは、Smith andWaterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981のローカルホモロジーアルゴリズムにより；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988の類似性検索法により；限定されるものではないが、Intelligenetics, Mountain View, California, GAPによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 7 Science Dr., Madison, Wisconsin, USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡをはじめとする、これらのアルゴリズムのコンピューター実行により行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムはHiggins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, et al., Nucleic Acids Research, 16:881-90, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:1-6, 1992; およびPearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994によって十分記載されている。データベース類似性検索に使用できるＢＬＡＳＴ系列のプログラムとしては、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995参照。上記プログラムの新バージョンまたは新規プログラムはともに、将来確実に利用でき、本発明とともに使用できるであろう。
特に断りのない限り、本明細書に示された配列同一性／類似性の値は、ＢＬＡＳＴ２プログラムまたはその後継種を用い、デフォルトパラメータを用いて得られた値を示す。Altschul et al., Nucleic Acids Res, 2:3389-3402, 1997。これらのパラメータのデフォルト設定は、将来必要があれば、容易に変更することができると理解すべきである。
当業者ならば分かるであろうが、ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質がランダムな配列としてモデル化できるものと仮定する。しかしながら、実際の多くのタンパク質は、ホモポリマートラクトであったり、短い周期でのリピートであったり、または１以上のアミノ酸が豊富な領域であったりする非ランダム配列の領域を含む。このような複雑性の低い領域は、たとえそのタンパク質の他の領域に全く類似性がなかったとしても、関連のないタンパク質の間でもアラインされ得る。いくつかの低複雑性フィルタープログラムが、このような複雑性の低いアライメントを減らすために使用できる。例えば、ＳＥＧ(Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17:149-163, 1993)およびＸＮＵ(Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-1, 1993)低複雑性フィルターを単独または組み合わせて使用することができる。
（ｃ）２つの核酸またはポリペプチド配列に関して「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較枠で最大の一致を得るためにアラインした場合に同じである、その２つの配列中の残基に対する言及を含み、付加、欠失および置換を考慮することができる。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージを用いる場合、同一ではない残基の位置は多くの場合、保存的がアミノ酸置換によって異なり、この場合、アミノ酸残基は化学特性（例えば、電荷または疎水性）が同じである他のアミノ酸残基で置換されており、従って、その分子の機能的特性は有害なほどには変化していない。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性パーセントは、その置換の保存特性を適正化すべく上方調節され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、配列類似性を有するといわれる。この調節をなすためのアプローチは当技術分野で周知である。一般に、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコアリングし、それにより、配列同一性パーセンテージを高めることを含む。従って、例えば、同一のアミノ酸をスコア１とし、非保存的置換をスコア０とすると、保存的置換はスコア０と１の間となる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ(Intelligenetics, Mountain View, California, USA)で実行されるような、例えば、Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17, 1988のアルゴリズムに従って計算される。
（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」は、最適にアラインされた２つの配列を比較枠で比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較枠のポリヌクレオチド配列の部分が、その２配列の最適アライメントのために参照配列（付加、置換、または欠失を含まない）と比較した場合に付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を判定してマッチした位置の数を求め、そのマッチした位置の数を比較枠の全部の位置の数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算される。
（ｅ）（ｉ）「実質的同一」または「相同」とは、それらの様々な文法形において、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを用いて表されるアライメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較した場合に、所望の同一性、例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、さらにいっそうより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を意味する。当業者ならば、これらの値はコドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することにより２つのヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質の対応する同一性を判定するために適宜調節できることが分かるであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性とは、通常、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を意味する。
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることを示す別の指標としては、２つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。しかしながら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、やはり実質的に同一である。これは、例えば、遺伝コードにより許容される最大限のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作り出される場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示す１つの指標は、第一の核酸がコードするポリペプチドが、第二の核酸によってコードされているポリペプチドと免疫学的に交差反応性があるということであるが、２つのポリペプチドが実質的に同一であると考えるのに、このような交差反応性が必ずしも必要なわけではない。
（ｅ）（ii）ペプチドに関して「実質的に同一」または「相同」とは、それらの様々な文法形において、ペプチドが、特定の比較枠で参照配列に対して所望の同一性、例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは８０％、いっそうより好ましくは８５％、さらにいっそうより好ましくは少なくとも９０％または９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでなることを示す。好ましくは、最適アライメントは、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムを用いて行われる。２つのペプチド配列が実質的に同一であることを示す指標は、一方のペプチドがもう１つのペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性があるということであるが、２つのポリペプチドが実質的に同一であると考えるのに、このような交差反応性が必ずしも必要なわけではない。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、あるペプチドは別のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似する」ペプチドは、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得る場合を除き、上記のような配列を共有する。保存的置換は一般に、限定されるものではないが、以下の群：グリシンとアラニン；バリンとイソロイシンとロイシン；アスパラギン酸とグルタミン酸；アスパラギンとグルタミン；セリンとトレオニン；リシンとアルギニン；およびフェニルアラニンとチロシンならびに当業者に知られているその他のものの中での置換を含む。
「アンチセンスＲＮＡ」とは、ＲＮＡポリメラーゼが構造遺伝子の転写を触媒してｍＲＮＡを産生する真核生物において用いられる。ＤＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼ鋳型を含むようにデザインすることができ、ここで、ＲＮＡ転写物は好ましいｍＲＮＡの配列と相補的な配列を有する。このＲＮＡ転写物が「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子はｍＲＮＡの発現を阻害する（例えば、Rylova et al., Cancer Res, 62(3):801-8, 2002; Shim et al., Int. J. Cancer, 94(1):6-15, 2001）。
「アンチセンスＤＮＡ」または「ＤＮＡデコイ」または「デコイ分子」とは、第一の核酸分子に対して、第一の分子またはその一部の相補的配列であるか、またはその相補的配列と相同である配列を用いて作られている第二のＤＮＡ分子または第二のキメラ核酸分子が、第一の分子のアンチセンスＤＮＡまたはＤＮＡデコイまたはデコイ分子と呼ばれることを意味する。「デコイ分子」とはまた、ＤＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）(Mischiati et al., Int. J. Mol. Med., 9(6):633-9, 2002)を含んでなり、かつ、タンパク質結合部位、好ましくは調節タンパク質の結合部位、より好ましくは転写因子の結合部位の配列を含む核酸分子（一本鎖であっても二本鎖であってもよい）を含む。アンチセンスＤＮＡおよびデコイＤＮＡ分子をはじめとするアンチセンス核酸分子の適用は当技術分野で公知である（例えば、Morishita et al., Ann. N Y Acad. Sci., 947:294-301, 2001; Andratschke et al., Anticancer Res, 21:(5)3541-3550, 2001）。
「ｓｉＲＮＡ」とは、干渉を起こすことができ（本明細書でＲＮＡｉに関して記載の通り）、かつ、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳類身体（ヒトを含む）において特定の遺伝子の転写後サイレンシングを起こすことができる小干渉ＲＮＡを意味し、これはまたショートヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）(Paddison et al., Gene Dev. 16:948-958, 2002)も含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の現象はBass, Nature, 411:428-29, 2001; Elbashir et al., Nature, 411:494-98, 2001;およびFire et al., Nature, 391:806-11, 1998に記載および考察されており、その中で、干渉ＲＮＡの作製方法も考察されている。本発明の例示的ｓｉＲＮＡは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近またはその間のいずれかの整数を有するものであり得る。
本明細書に記載の「安定化ＲＮＡｉ」、「ｓｉＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、タンパク質とリボース糖の３位において修飾された（例えば、上記で定義されたような置換または非置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニルまたはアルキニルオキシ基を含めることによる）ヌクレオチド類似体を用いて、ＲＮアーゼをはじめとするエキソヌクレアーゼによる分解から保護する。ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡはまた、３’−３’結合ジヌクレオチド構造(Ortigao et al., Antisense Research and Development 2:129-146 (1992))および／または２つの修飾ホスホ結合（２つのホスオロチオエート結合など）を含めることにより、エキソヌクレアーゼによる３’末端における分解に対して安定化させることもできる。
本明細書に記載のようなエレクトロポレーション法において使用されるＲＮＡ分子は安定化ＲＮＡであり得る。本発明のこのＲＮＡとしては、単離されたＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子およびグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ポリペプチドまたは標的遺伝子モチーフと結合し得るその一部が挙げられる。ＧＡＰＤＨ由来のペプチドはＲＮＡと結合してそれを安定化させることが知られており、細胞における治療ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ／ｓｈＲＮＡ分子の安定化に有用であり得る。
「癌」とは、癌発症細胞に典型的な特徴、例えば制御できない増殖、特定の機能の欠如、不死化、著しい転移力、抗アポトーシス活性の著しい増強、速い成長および増殖速度、ならびにある特徴的な形態および細胞マーカーを有する細胞の存在を意味する。ある場合には、癌細胞は腫瘍の形態であり、このような細胞は動物内に局在する場合もあるし、例えば白血球などにような独立細胞として血流中を循環する場合もある。
「腫瘍」とは、悪性であれ良性であれ、あらゆる新生細胞の成長または増殖、および前癌および癌細胞および組織を意味する。
「前癌」とは、悪性疾患または癌をもたらし得る変化に関連する特徴を有する細胞または組織を意味する。例としては、組織における腺腫様増殖、または例えば異形成神経症候群、皮膚の悪性黒色腫の前段階などの症状が挙げられる。例としてまた、異形成神経症候群の他、異常な新生物、ポリープ症候群、前立腺異形成、および他のこのような新生物（前癌病変が臨床上検出できるものであれ検出できないものであれ）が挙げられる。
「複合化ＤＮＡ」とは、別の分子、例えば、炭水化物、例えば糖（糖−ＤＮＡ複合体が形成される）と複合化または結合したＤＮＡ分子を含む。このような複合体、例えば糖複合化ＤＮＡは受容体を介した効率的遺伝子送達を促進または補助することができ、例えば、グルコースをＤＮＡと複合化し、マンノース受容体などの受容体を介して細胞に送達することができる。
封入ＤＮＡまたは封入ＲＮＡをはじめとする「封入核酸」は、小球または微粒子中の、比較的非免疫原性で、選択的酵素分解を受ける材料でコーティングした核酸分子、例えば、ゼラチンおよびコンドロイチン硫酸などの材料の複雑なコアセルべーションによって合成された小球または微粒子（例えば、米国特許第６，４１０，５１７号明細書参照）を意味する。小球または微粒子中に封入された核酸は、それがそのコード配列の発現を誘導する能力を保持するように封入される（例えば、米国特許第６，４０６，７１９号明細書参照）。
「阻害剤」とは同定された機能を阻害および／または遮断する分子を意味する。同定された機能を阻害および／または遮断する能力を有する分子は、本明細書に記載のような「試験分子」であり得る。例えば、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１またはＩＣＴ１００３の発現機能または抗アポトーシス活性に関しては、このような分子はそれぞれＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１またはＩＣＴ１００３のin vitroおよびin vivoアッセイを用いて同定することができる。阻害剤は、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５および／またはＩＣＴ１０３１および／またはＩＣＴ１００３活性を部分的または全面的に遮断する、それらの活性化を低下させる、妨げるまたは遅延させる、あるいはその細胞応答を脱感作する化合物である。これは、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３タンパク質との直接的または他の中間体分子を介しての結合によって達成され得る。ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１および／またはＩＣＴ１００３の発癌機能または抗アポトーシス活性の阻害をはじめ、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５および／またはＩＣＴ１０３１および／またはＩＣＴ１００３活性を遮断するアンタゴニストまたは抗体は、このような阻害剤であると考えられる。本発明の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じ得る分子、またはそれらの組合せである。本発明の阻害剤の群はまた、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３０、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３の遺伝的に改変された形態、例えば、活性が変更された形態も含む。よって、この群は、天然に存在するタンパク質、ならびに合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小化学分子などを含む。
「阻害剤に関するアッセイ」とは、in vitroにおいて例えばＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３を発現させ、推定阻害化合物を適用し、その後、上記のようにＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３の活性または転写に対する機能的作用を決定することを含む試験手順を意味する。ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３を含有するまたは含有することが疑われるサンプルを可能性のある阻害剤で処理する。この阻害または変化の程度を、目的サンプルの活性測定値と対照サンプルの活性測定値を比較することにより調べる。阻害を評価するために閾値レベルを確立する。例えば、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３ポリペプチドの阻害は、対照に対するＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３活性値が８０％以下であるときに達成されたとみなされる。
ＩＣＴ１０３０：「ＩＣＴ１０３０」とは、ＭＦＧＥ８（受託番号ＮＭ＿００５９２８、ＢＣ００３６１０）、関連の分子またはコンセンサス、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）またはタンパク質（またはポリペプチド）を含み、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９２８（タンパク質識別番号ＮＰ＿００５９１９．１）、ホモ・サピエンス乳汁脂肪小球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧＥ８）（タンパク質識別番号ＮＰ＿００５９１９．１のヌクレオチド配列との実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％）を有するか、または（ii）ＧｅｎＢａｎｋタンパク質識別番号ＮＰ＿００５９１９．１（ＩＣＴ１０３０）のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列相同性を有するか、または（iii）配列番号１または配列番号３で示されるヌクレオチド配列との実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、参照配列と少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは８０％、いっそう好ましくは８５％、いっそうより好ましくは少なくとも ９０％または９５％）を有するか、または（iv）コードされているアミノ酸配列（例えば、配列番号２）との実質的な配列相同性を有する、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログを含み得る、検証された標的ＩＣＴ１０３０を意味する。
ＩＣＴ１０３０ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは一般に、限定されるものではないが、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはいずれかの哺乳類を含む哺乳類に由来するものである。「ＩＣＴ１０３０ポリヌクレオチド」および「ＩＣＴ１０３０ポリペプチド」は天然に存在するものでも、組換え体であっても、合成物（例えば、化学合成によるもの）であってもよい。
ＭＦＧＥ８ＤＮＡ配列は１９３４塩基対（配列番号１参照）を含み、ＩＣＴ１０３０コード配列は、３８７アミノ酸のタンパク質（配列番号２参照）をコードする１１６４塩基対（配列番号３参照）を含む。
本発明の一つの態様によれば、標的ＩＣＴ１０３０、例えばＭＦＧＥ８は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、および卵巣組織をはじめとする哺乳類組織における新規な標的、腫瘍サプレッサーであると判定された。ヒト染色体領域１５ｑ２５は腫瘍サプレッサーとして検証されることが確認された新規な標的の１つである。従って、染色体領域１５ｑ２５に位置する腫瘍抑制遺伝子は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、骨癌、耳下腺癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頚癌、リンパ節癌、および卵巣癌をはじめとする癌の治療において重要な役割を果たし得る。
ＩＣＴ１０３１：「ＩＣＴ１０３１」とは、ＴＮＦＳＦ１３（受託番号ＡＫ０９０６９８およびＯ７５８８８）、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＬＬ−２およびＴＲＤＬ−１などの関連分子、またはコンセンサス、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）またはタンパク質（またはポリペプチド）を含み、（ｉ）受託番号ＡＫ０９０６９８、ホモ・サピエンスＴＮＦＳＦ１３（受託番号ＡＫ０９０６９８およびＯ７５８８８）のヌクレオチド配列との実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％）を有するか、または（ii）受託番号Ｏ７５８８８（ＴＮＦＳＦ１３）のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列相同性を有するか、または（iii）配列番号４で示されるヌクレオチド配列との実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、参照配列と少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは８０％、いっそうより好ましくは８５％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％または９５％）を有するか、または（iv）コードされているアミノ酸配列（例えば、配列番号５）との実質的な配列相同性を有する、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログを含み得る、検証された標的ＩＣＴ１０３１を意味する。
ＩＣＴ１０３１ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは一般に、限定されるものではないが、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはいずれかの哺乳類を含む哺乳類に由来するものである。「ＩＣＴ１０３１ポリヌクレオチド」および「ＩＣＴ１０３１ポリペプチド」は天然に存在するものでも、組換え体であっても、合成物（例えば、化学合成によるもの）であってもよい。
ＴＮＦＳＦ１３ＤＮＡ配列（受託番号ＡＫ０９０６９８）は２０３６塩基対（配列番号４参照）を含み、ＴＮＦＳＦ１３コードタンパク質（受託番号Ｏ７５８８８）は２５０アミノ酸（配列番号５参照）を含む。
本発明の一つの態様によれば、標的ＩＣＴ１０３１、例えばＴＮＦＳＦ１３は、乳房組織、結腸組織、食道組織、および卵巣組織をはじめとする哺乳類組織における腫瘍増殖阻害のための新規な標的であると判定された。従って、腫瘍促進標的ＩＣＴ１０３１の阻害は、乳癌、結腸癌、食道癌、および卵巣癌をはじめとする癌の治療に重要な役割を果たし得る。
ＩＣＴ１００３：「ＩＣＴ１００３」とは、ＺＦＰ２３６（受託番号ＡＫ０００８４７）、関連分子、またはコンセンサス、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）またはタンパク質（またはポリペプチド）を含み、（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０００８４７、新規なホモ・サピエンスジンクフィンガータンパク質２３６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０００８４７．１）のヌクレオチド配列との実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％）を有するか、または（ii）タンパク質識別番号ＢＡＡ９１３９８．１（ＩＣＴＢ１００３）のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列相同性を有するか、または（iii）配列番号６または配列番号８で示されるヌクレオチド配列との実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、参照配列と少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは８０％、いっそう好ましくは８５％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％または９５％）を有するか、または（iv）コードされているアミノ酸配列（例えば、配列番号７）との実質的な配列相同性を有する、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログを含み得る、検証された標的ＩＣＴ１００３を意味する。
ＩＣＴ１００３ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは一般に、限定されるものではないが、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはいずれかの哺乳類を含む哺乳類に由来するものである。「ＩＣＴ１００３ポリヌクレオチド」および「ＩＣＴ１００３ポリペプチド」は天然に存在するものでも、組換え体であっても、合成物（例えば、化学合成によるもの）であってもよい。
ＺＦＰ２３６ＤＮＡ配列は２２４１塩基対（配列番号６参照）を含み、ＺＦＰ２３６コード配列は、４７２アミノ酸のタンパク質（配列番号７参照）をコードする１４１９塩基対（配列番号８参照）を含む。
本発明の一つの態様によれば、標的ＩＣＴ１００３、例えばＺＦＰ２３６は、乳房組織、結腸組織、肺組織、および卵巣組織をはじめとする哺乳類組織における腫瘍増殖阻害の新規な標的であると判定された。従って、腫瘍促進標的ＩＣＴ１００３の阻害は、乳癌、結腸癌、肺癌および卵巣癌をはじめとする癌の治療において重要な役割を果たし得る。
ＩＣＴ１０２４：「ＩＣＴ１０２４」とは、検証された標的ＩＣＴ１０２４、その遺伝子およびタンパク質ＥＧＦ−ＡＰを意味する。これは最初にEfficacy-First（商標） Discovery（引用することによりそのまま本明細書の一部とされるＰＣＴ／ＵＳ０２／３１５５４に記載）と呼ばれる方法を用いて同定されたものである。要するに、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５をマウス乳房脂肪パッドに皮下接種した。この異種移植腫瘍の体積が２００ｍｍ３まで増殖したとき、塩基性繊維芽増殖因子（ＦＧＦ−２）を発現するプラスミドを腫瘍内に繰り返し送達した。処置した腫瘍は、非処置腫瘍よりもはるかに速い増殖を示した。
腫瘍組織を得、マイクロアレイ分析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｕ１３３）のための全ＲＮＡ単離のために用いた。調節されなかったか、または著しくダウンレギュレートされた遺伝子の１つ（Ｕ１３３チップ上の全プローブの約１％）であるＩＣＴ１０２４は、５８５（対照群の発現レベル）から１２０８（処置群の発現レベル）のシグナルを有する有意にアップレギュレートされた発現を示した。従って、この遺伝子を、同じ異種移植腫瘍モデルにおけるin vivoノックダウンに基づくｓｉＲＮＡを用いるDisease-Control（商標）バリデーションと呼ばれる方法により次のレベルの標的バリデーションのために選択した。各２１塩基対の２つのｓｉＲＮＡ二重らせん（図７）（配列番号２５および２６）は、そのコード領域（ａａｇｃｔｇｇａｃａｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｇ、ａａｇａｇｃｃｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｃ）においてＡＫ０２６０１０、ＮＭ＿０２２４５０およびＭ９９６２４の配列に特異的な、このＩＣＴ１０２４遺伝子を標的とするようにデザインされたものである。次にこの２つのｓｉＲＮＡ二重らせんを３回腫瘍内に送達した。このｓｉＲＮＡにより媒介されるＩＣＴ１０２４遺伝子発現のノックダウンの結果、腫瘍増殖の阻害がもたらされた（図８）。細胞培養に基づくさらなる研究では、腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５におけるＩＣＴ１０２４遺伝子発現のノックダウンがアポトーシス活性の顕著な増強を誘導した（図９）。これらに結果に基づき、治療標的としてのさらなる評価のためにＩＣＴ１０２４を選択した。
細胞培養および異種移植腫瘍モデルにおけるこの遺伝子の生物学的機能のこの同定およびバリデーションの後、公開データベースとGeneLogic Express Analysisの双方により、ＩＣＴ１０２４遺伝子発現特性検索の一連の解析を行った。これらの解析からの結果からさらに、特に腫瘍増殖、腫瘍細胞アポトーシスおよび腫瘍転移の分野における、生物学的機能およびその病態との関連性が示された。
ＩＣＴ１０２４遺伝子は様々な腫瘍サンプルで発現が高い。ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（この細胞系は乳癌ではなく黒色腫に由来する可能性があるという証拠がいくつかある）の接種によって形成された異種移植腫瘍をｂＦＧＦで処理したものでＩＣＴ１０２４がアップレギュレートされたというEfficacy-First（商標）から得られた知見に加え、３つの異なる解析から、ＩＣＴ１０２４は腫瘍組織、特に乳癌組織サンプルにおいて有意にアップレギュレートされるということも分かった。これらの解析はNCBI’s CANCER GENOME ANATOMY PROJECTのSAGE Genieデータベースからオンライン提供されたものである。最初の解析はＳＡＧＥデジタルノーザンからのものであり（表Ｉ参照）（配列番号３６）、転移性乳癌組織において極めて明瞭にアップレギュレートされたＩＣＴ１０２４発現を示した。同じ解析から、胃癌、前立腺癌、脳膠芽腫およびその他の腫瘍種においてもＩＣＴ１０２４遺伝子発現のアップレギュレーションが見られた。第二の解析は、Monochromatic SAGE/cDNA Virtual Northern（表II参照）からのものである。総ての組織種に関して、ＥＳＴデータセットおよびＳＡＧＥデータセットの双方から、ＩＣＴ１０２４は著しくアップレギュレートされる遺伝子であると同定された。乳腺腫瘍組織では、この遺伝子はＳＡＧＥデータセットにおいて有意にアップレギュレートされた。他の組織種としては、脳および前立腺が、正常組織よりも腫瘍組織で有意にアップレギュレートされた遺伝子発現を示した。第三の解析は、Two Dimensional Array Display（図１０参照）からのものである。ＩＣＴ１０２４の発現は、乳癌組織における腫瘍形成遺伝子群の発現と相関している。
Gene Logic’s GeneExpress解析を用い、本発明者らは、乳癌組織においてＩＣＴ１０２４がアップレギュレートされるだけでなく、他のステージの腫瘍よりもステージＩの腫瘍由来の組織においてはるかに高くアップレギュレートされることが分かった（図１１）。この知見は、ＩＣＴ１０２４が腫瘍増殖の初期ステージに積極的に関与していることを示す。
文献検索によれば、ＩＣＴ１０２４はＰＳＭＢ１、プロテオソームβサブユニット１の発現と正の相関を有することが分かった。プロテオソームは多重触媒性のプロテイナーゼ複合体であり、ユビキチン依存的なプロセスでペプチドを切断することができる。このユビキチンにより媒介される重要なレギュレーターの分解はこれまでに十分認識されている抗癌標的である。
ＲＡＰ１発現との別の正の相関も見出されている。ＲＡＰ１はＲａｓ関連タンパク質−１であり、Ｒａｓ癌遺伝子の活性化に関与している。
ＩＣＴ１０２５：「ＩＣＴ１０２５」は検証された標的ＩＣＴ１０２５を意味する。本発明者らは、まず、Efficacy-First（商標）Discovery（引用することによりそのまま本明細書の一部とされるＰＣＴ／ＵＳ０２／３１５５４に記載）と呼ばれる方法を用いてこの遺伝子およびタンパク質ＴＲＡ−１を同定した。要するに、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５をマウス乳棒脂肪パッドに皮下接種した。この異種移植腫瘍の体積が２００ｍｍ３まで増殖したとき、塩基性繊維芽増殖因子（ＦＧＦ−２）を発現するプラスミドを腫瘍内に繰り返し送達した。処置した腫瘍は、非処置腫瘍よりもはるかに速い増殖を示した。
腫瘍組織を得、マイクロアレイ分析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｕ１３３）のための全ＲＮＡ単離のために用いた。調節されなかったか、または著しくダウンレギュレートされた遺伝子の１つ（Ｕ１３３チップ上の全プローブの約１％）であるＩＣＴ１０２５は、２７９（対照群の発現レベル）から４１２（処置群の発現レベル）のシグナルを有する有意にアップレギュレートされた発現を示した。従って、この遺伝子（受託番号ＡＫ０２５８５２、ＮＭ＿００３２９９およびＢＣ００９１９５、図３３、ｍＲＮＡ配列（配列番号７０）；図３４タンパク質配列（配列番号７１）を、同じ異種移植腫瘍モデルにおけるin vivoノックダウンに基づくｓｉＲＮＡを用いるDisease-Control（商標）バリデーションと呼ばれる方法により次のレベルの標的バリデーションのために選択した。各２１塩基対の２つのｓｉＲＮＡ二重らせん（図３５）（配列番号７２および７３）は、ａａｃｔｇｔｔｇａｇｇａｇｃｃｃａｔｇｇａ（ｎｔ９６６で開始）およびａａｔｃｔｇａｔｇａｔｇａａｇｃｔｇｃａｇ（ｎｔ１００８で開始）のコード領域の配列に特異的な、このＩＣＴ１０２５遺伝子を標的とするようにデザインされたものである。次にこの２つのｓｉＲＮＡ二重らせんを３回腫瘍内に送達した。このｓｉＲＮＡにより媒介されるＩＣＴ１０２５遺伝子発現のノックダウンの結果、腫瘍増殖の阻害がもたらされた（図３６）。細胞培養に基づくさらなる研究では、腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＨＴ２９におけるＩＣＴ１０２５遺伝子発現のノックダウンがアポトーシス活性の顕著な増強（図３７）と細胞増殖の低下を誘導した。これらに結果に基づき、治療標的としてのさらなる評価のためにＩＣＴ１０２５を選択した。
細胞培養および異種移植腫瘍モデルにおけるこの遺伝子の生物学的機能のこの同定およびバリデーションの後、公開データベースとGeneLogic Express Analysisの双方により、一連のＩＣＴ１０２５遺伝子発現特性検索を行った。これらの解析からの結果からさらに、特に腫瘍増殖、腫瘍細胞アポトーシスおよび腫瘍転移の分野における、生物学的機能およびその病態との関連性が示された。
その発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡの送達によるＴＲＡ−１のダウンレギュレーションは、その発現が増殖性疾患における「疾病制御」の役割を有することを示した。異種移植腫瘍モデルにおいて、ｓｉＲＮＡにより媒介されるＴＲＡ−１の発現のノックダウンを用いることにより、ＴＲＡ−１の発現が阻害された際に腫瘍増殖速度が阻害されることが分かった。発明者らはさらに、いくつかの乳癌細胞系における、このタンパク質の発現のノックダウンがアポトーシス活性の有意な増強を誘導することも見出した。この知見はさらに、それらの細胞をこのタンパク質に特異的なモノクローナル抗体で処理した場合でも確認した。乳癌細胞においてこのタンパク質の細胞下の位置を特定する過程で、本発明者らは、このタンパク質が細胞表面の膜と結合指定だけでなく、実質的部分が細胞外にも存在していることを見出した。
発明者らの知見を考えれば、有望な自己プロトコール臨床結果の１つの仮説としては、単離されたＴＲＡ−１複合体の投与は、自己の患者特異的ペプチドだけでなく、ＴＲＡ−１それ自体に対する抗体を誘導し、腫瘍の阻害に実質的に寄与するか、または可能性としてはそれが主要な活性のメカニズムであるということである。細胞表面ビオチニル化技術を用い、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７乳癌細胞の外面におけるＴＲＡ−１タンパク質の存在を観察した。乳癌細胞由来のＴＲＡ−１の細胞表面局在の生物学的な関連性を探求するため、本発明者らは、細胞のアポトーシスおよび増殖に関するｍＡｂを調べた。細胞をＴＲＡ−１モノクローナル抗体で処理すると、アポトーシス活性の増強および細胞増殖の阻害が見られた。これらの結果は、アポトーシスおよび細胞増殖のシグナル伝達経路における細胞表面ＴＲＡ−１の関与を強く示唆している。従って、その発現を低下させるためのｓｉＲＮＡ薬剤およびそれと結合してその活性を阻害するための抗体を含むＴＲＡ−１阻害剤は、乳癌、その他の悪性疾患、および多くの増殖性疾患の新規で有効な治療を提供する。ＴＲＡ−１を阻害するｍＡｂ療法の成功は広い適用を持ち、臨床上実現可能である。
本発明はＩＣＴ１０２５タンパク質の生物活性を阻害または遮断するための方法および組成物を提供する。また、癌、自己免疫疾患およびその他の疾病の処置のための治療方法および組成物も提供される。より具体的には、本発明は、核酸および／またはタンパク質 レベルにおいてＩＣＴ１０２５の産生および活性のダウンレギュレーションを可能とする方法および組成物、ならびにこのタンパク質の生化学的機能の活性化の解除、阻害、遮断またはダウンレギュレーションを可能とする方法および組成物を提供する。この阻害は、例えば、そのタンパク質の転写または翻訳のダウンレギュレーションによって；そのタンパク質をコードするｍＲＮＡを分解することによって；そのタンパク質を分解することによって；ＲＮＡを遮断および／または活性化解除することによって、また、タンパク質機能を阻害することによって達成することができる。本発明は、限定されるものではないが、抗体、ｍＲＮＡ配列特異的阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスなど）、ペプチドアンタゴニスト、および小分子プロテアーゼ阻害剤をはじめとするＩＣＴ１０２５の阻害剤を提供する。本発明はまた、これらの阻害剤を作製するための方法、および１以上の阻害剤を用いて、新生物性疾患、免疫疾患および／または感染性疾患の治療および予防など、目的の生物学的機能を達成するための方法を提供する。特に、本発明は、抗体および抗体フラグメントを含む免疫グロブリン剤、これらの薬剤を疾病の治療および診断のための用いる方法を提供する。仮出願第６０／４５８，９４８号明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
ＤＮＡおよびタンパク質配列相同性解析
ＩＣＴ１０２４：同じタンパク質をコードする３つの全長ｃＤＮＡ配列：ＮＭ＿０２２４５０、ＢＣ０１４４２５およびＡＫ０２６０１０が存在する。このタンパク質は８５５のアミノ酸を含み、分子量は約１３０ｋＤである。
ＤＮＡ配列の相同性に関するＢＬＡＳＴ検索を用い、本発明者らは、ヒト、ネズミ、クマネズミ、およびフグなどで約３２５の相同配列を発見した。しかしながら、ヒトホモログは極めて少数しか発見されなかった。上記３つのｃＤＮＡと極めて高い相同性を有するのはただ１つのｃＤＮＡ配列（ＡＫ０５６７０８）しかなかったが、これはクローニング人工物によって生じ得る突然変異配列の短いストレッチも有する。従って、このタンパク質コード領域を分割した。他の部分的ｃＤＮＡ配列および染色体配列も見出された。このｃＤＮＡは当初、２００３年４月２２日までは、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおいて、ＥＧＦＲ関連配列（ＥＧＦＲ−ＲＳ）、またはＥＧＦＲ関連タンパク質（ＥＧＦＲ−ＲＰ）と呼ばれていた。現在、このｃＤＮＡはホモ・サピエンスｒｈｏｍｂｏｉｄファミリー１と呼ばれている。
本発明者らは、ＩＣＴ１０２４のタンパク質配列をさらに解析した。この８５５ＡＡのタンパク質は、ＮＣＢＩデータベースのConserved Domain Architecture Retrieval Toolによって同定されているいくつかのドメインサインを有する。主要なドメイン構造の１つは約１４６ＡＡにわたる領域である。このドメインはＲｈｏｍｂｏｉｄファミリーの保存された領域として認識されている。このファミリーは、ショウジョウバエｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質に関連のある内在性膜タンパク質を含む。このファミリーのメンバーは細菌および真核生物で見られる。Ｒｈｏｍｂｏｉｄは膜に固定されたＴＧＦ−α様増殖因子Ｓｐｉｔｚの切断を促進し、それにショウジョウバエＥＧＦ受容体を活性化させる（４、５、６、７）。分析によれば、Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１は、Ｓｐｉｔｚを直接切断する新規な膜内セリンプロテアーゼである。これらのタンパク質は、ペプチダーゼ機能に関与する可能性のある推定トランスメンブラン領域に強固に保存された３つのヒスチジンを含む。本発明者らはまず、ＩＣＴ１０２４ｒｈｏｍｂｏｉｄドメインと様々な生物に由来するｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質群と比較した（図１２）。ＩＣＴ１０２４ｒｈｏｍｂｏｉｄドメインのフレームワークは他の生物のものと全く同じであるが、それらの配列は著しく異なっている。ＩＣＴ１０２４ｒｈｏｍｂｏｉｄドメインと他のヒトｒｈｏｍｂｏｉｄ様タンパク質とを比較すると（図１３）、ＩＣＴ１０２４の配列は他のものと著しく異なっている。さらに、in vitroおよびin vivo双方のバリデーションで用いられるＩＣＴ１０２４特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんは、ヒトｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質のいずれとも全く異なる領域を標的とする（図１４）。
本発明者らはまた、ＩＣＴ１０２４タンパク質の疎水性とその可能性のあるトランスメンブランの位置を解析した。ＳＯＳＵＩモデル（表III）、ＴＭＨＭＭモデルおよびＴＭｐｒｅｄモデル（図１５）をはじめとする複数の推定プログラムを適用した。これらの解析から、ＩＣＴ１０２４は、複数のトランスメンブランドメインと細胞内ドメインと細胞外ドメインを有する内在性膜タンパク質であると思われる。タンパク質位置およびトポロジーの推定に用いられる方法は何であれ、このタンパク質は膜外に長いＮ末端ドメインを有することが示されている。このＮ末端ドメインは細胞の外部にあるか、または細胞質の内部にあるかのいずれかである。また、細胞または細胞質の外部に露出したこのタンパク質の他の領域も存在する。膜タンパク質ＩＣＴ１０２４は、ＥＧＦ−ＥＧＦ受容体経路の活性化のためにプロテイナーゼ活性を有し、かつ、本明細書に記載の発見に基づけば、モノクローナル抗体、ｓｉＲＮＡ阻害剤、ペプチドアンタゴニストおよび小分子阻害剤などをはじめとする薬剤の様々な理学療法の治療薬開発の非常に魅力的な標的である。好適なモノクローナル抗体はそのタンパク質の細胞外ドメインか、または細胞内ドメインのいずれかに結合し、そのタンパク質の機能を遮断する。
ＩＣＴ１０２５：
背景の節で述べたように、同じタンパク質をコードする３つの全長ｃＤＮＡ配列：ＮＭ＿００３２９９、ＡＫ０２５４５９およびＢＣ００９１９５が存在する。このタンパク質は８０３のアミノ酸を含む。
ＤＮＡ配列の相同性に関するＢＬＡＳＴ検索を用い、本発明者らはヒト、ネズミ、クマネズミおよびフグなどで多くの相同配列を見出した。しかしながら、ヒトホモログは極めて少数しか発見されなかった。上記３つのｃＤＮＡと極めて高い相同性を有するのはただ１つのｃＤＮＡ配列（ＡＫ０２５４５９）しかなかったが、これはクローニング人工物によって生じ得る突然変異配列の短いストレッチも有する。従って、このタンパク質コード領域を分割した。他の部分的ｃＤＮＡ配列および染色体配列も見出された。このｃＤＮＡは当初、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおいて、腫瘍拒絶タンパク質１（ＴＲＡ−１）と呼ばれていた。
本発明者らはまた、ＩＣＴ１０２５タンパク質の疎水性とその可能性のあるトランスメンブランの位置を解析した。分析にはＤＡＳモデルおよびＴＭｐｒｅｄモデルをはじめとする複数の推定プログラムを用いた（図１７）。タンパク質位置およびトポロジーの推定に用いられる方法は何であれ、このタンパク質はいくつかのトランスメンブランドメインを有することが示されている。このＮ末端ドメインは細胞の外部にあるか、または細胞質の内部にあるかのいずれかである。また、細胞または細胞質の外部に露出したこのタンパク質の他の領域も存在する。ＩＣＴ１０２５の膜提示はは腫瘍形成および腫瘍抗原提示において極めて重要な役割を果たしている可能性がある。従って、ＩＣＴ１０２５は、モノクローナル抗体、ｓｉＲＮＡ阻害剤、ペプチドアンタゴニストおよび小分子阻害剤などをはじめとする薬剤の様々な理学療法の治療薬開発の非常に魅力的な標的である。好適なモノクローナル抗体はそのタンパク質の細胞外ドメインか、または細胞内ドメインのいずれかに結合し、そのタンパク質の機能を遮断する。
腫瘍の転移および増殖における役割
ＩＣＴ１０２４：
タンパク質ＩＣＴ１０２４は明らかに、そのＥＧＦ−ＥＧＦＲ経路の活性化、および他のプロテイナーゼ機能およびさらなる未知の機能を介して腫瘍転移および腫瘍増殖に重要な役割を果たしている。本発明者らは、この遺伝子が、ｂＦＧＦ発現ベクターで処理した異種移植腫瘍モデル研究から得られた増殖の速い腫瘍においてアップレギュレートされることを示す証拠を得ている。ＳＡＧＥ仮想およびデジタルノーザン解析に基づけば、この遺伝子は、乳癌、前立腺癌、脳癌および他の種の癌に由来する腫瘍組織のｍＲＮＡレベルにおいてアップレギュレートされている。この遺伝子はまた、Logic's GeneExpress解析を用いても、アップレギュレートされることが示されている。増殖中の異種移植腫瘍において遺伝子発現がＩＣＴ１０２４特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんでノックダウンされた場合、腫瘍増殖は有意に阻害された（図８）。
アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、一般に、原形質膜の突出、細胞容積の収縮、および核の凝縮を含み、細胞ＤＮＡを分解する内在性のエンドヌクレアーゼの活性化で終わる、細胞の自殺の一形態である。胚発達および器官形成の際には、十分定義された特定の細胞の消失が重要である。アポトーシスは、その生理学的役割の他、多くの種類の癌細胞で、それらが代謝拮抗物質、デオキシヌクレオチド合成阻害剤、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、抗微小管剤、アルキル化剤、および小胞体（ＥＲ）ストレッサーをはじめとする種々の化学療法薬に曝された際にも起こる。本発明者らが特定のｓｉＲＮＡ二重らせんでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞においてＩＣＴ１０２４発現をノックダウンした場合、ＴＵＮＥＬアッセイで試験したところ、アポトーシス活性が劇的に上昇したことは十分興味深いことであり、ここでは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が、ニック末端標識により、フラグメント化核ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端へのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）残基の組み込みを触媒する。
ｓｉＲＮＡ二重らせんによる特異的なＩＣＴ１０２４遺伝子サイレンシングはＲＴ−ＰＣＲにより確認された。この発見は、ＩＣＴ１０２４が腫瘍細胞アポトーシスの調節に重要な役割を果たすことを示唆した。他の証拠は、ＥＧＦ−ＥＧＦＲが細胞の増殖および生存をもたらす主要なシグナル伝達経路を活性化するに十分であり、ＥＧＦＲシグナル伝達は血清採取によって誘導されるアポトーシスを抑制するのに十分であることを示す傾向にある（１２）。
悪性腫瘍は、高度に発現する活性化された増殖因子、ＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦなどにより、制御されることなく増殖する。それらは浸潤し、その場所の組織を破壊し、血液またはリンパ系を介して体中へ拡がる。これらの腫瘍は形態学的にもとの組織に典型的なものではなく、封入もされていない。悪性腫瘍は手術により摘出しても再発することが多い。従って、通常、悪性癌または悪性腫瘍が治療の標的となる。悪性増殖への介入は癌発達の初期段階において最も効果的である。このように、腫瘍形成の初期兆候の標的を同定および検証すること、ならびに有力な腫瘍増殖もしくは遺伝子発現抑制要素またはそれに関連する薬剤を決定することが重要である。このような腫瘍増殖および／または遺伝子発現および治療要素または薬剤の開発には、特に腫瘍形成に関連した細胞分裂および分化の遺伝制御メカニズムに関する理解が必要となる。
数千の腫瘍組織および正常組織の臨床サンプルに基づくＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ解析に基づき、本発明者らは、ＩＣＴ１０２４がステージ１の腫瘍サンプルで有意にアップレギュレートされたことを見出した（図１１）。ステージ１腫瘍サンプルに関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイＵ１３３から得られたシグナル（２８３）は、正常組織から得られたもの（１６５）よりもはるかに高い。総てのステージ１腫瘍サンプルが、ＩＣＴ１０２４遺伝子発現の有意なアップレギュレーションを示した。従って、ＩＣＴ１０２４は早期癌診断のマーカーとして有用である。また、この遺伝子が特異的にノックダウンされれば、癌治療に極めて有用である。
ショウジョウバエ細胞では、多元膜タンパク質Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１は膜に固定されたＴＧＦα様増殖因子Ｓｐｉｔｚの切断を促進し、ショウジョウバエＥＧＦ受容体を活性化させる。これまでのところ、この重要なシグナル伝達レギュレーターのメカニズムは依然として不明であるが、この解析は、Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１がＳｐｉｔｚを直接切断する新規な膜内セリンプロテアーゼであることを示唆する。膜二重層内にある推定Ｒｈｏｍｂｏｉｄ活性部位によれば、Ｓｐｉｔｚはそのトランスメンブランドメイン内で切断され、従って、これは調節された膜内タンパク質分解によって活性化される増殖因子のはじめての例である。Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１はヒトの太古からの進化にわたって保存され、これらの結果は、ヒトＲｈｏｍｂｏｉｄが類似のメカニズムによりＳｐｉｔｚの切断を促進することを示す。従って、この増殖因子活性化のメカニズムは拡がっている（６）。Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１はいずれの明確な配列相同性ドメインも含まないが、それはセリンプロテアーゼの特徴を有する（７）。その６つの必須残基のうちの４つは、セリンプロテアーゼ触媒トリアッド電荷依存系およびオキシアニオン安定化部位（活性セリンから２残基離れたグリシンおよびそのセリン自体からなる；Ｇ２１５およびＳ２１７）に必要な残基と平行している。。セリンプロテアーゼには２つの活性部位決定基があり、これらの４つの必須残基はセリンプロテアーゼ触媒メカニズムに直接関与することが知られている総てのアミノ酸を見込んでいる（５）。これらの残基は総てのＲｈｏｍｂｏｉｄで絶対的に保存されており、それらの極めてよく似た残基への突然変異であっても（すなわち、Ｇ２１５Ａ、Ｓ２１７Ｔ、およびＳ２１７Ｃ）、Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１活性を無効にする。これらは活性部位の残基のホールマークである（３）。これら必須残基の位置はセリンプロテアーゼ活性部位に関して極めて示唆に富んでおり、Ｇ２１５とＳ２１７はいずれも、２００の異なるセリンプロテアーゼの活性セリンを取り巻く保存されたＧＤＳＧＧモチーフと著しくよく似た、保存されたＧＡＳＧＧモチーフに存在する。さらに、必須残基Ｎ１６９およびＨ２８１は、それらのトランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）においてＧＡＳＧＧモチーフと同じ高さに存在し、これはそれらがＳ２１７と会合して触媒トリアッドを形成するという提案と一致している。最後に、Ｓｐｉｔｚプロセシングは特定のセリンプロテアーゼ阻害剤ＤＣＩおよびＴＰＣＫによって直接阻害され、Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１自体がそれらの存在における制限因子となるが、Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１はそれらの直接の標的であり、従って、Ｓｐｉｔｚ切断を担うセリンプロテアーゼであることを示唆するものである。この提案モデルは図１６に示されている。
この遺伝子とそのコードされているタンパク質、およびヒト細胞におけるその潜在的機能についての本発明者らの理解により、本発明者らはこの遺伝子をＥＧＦ活性化タンパク質（ＥＧＦ−ＡＰ）と呼んだ。本発明者らはまた、ＥＧＦ−ＡＰは抗腫瘍療法の開発のための魅力的な癌標的であると結論付ける。ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ｓｉＲＮＡまたはその他の種のＲＮＡｉ、アンチセンス、リボザイムおよびＤＮＡザイムなど、ＩＣＴ１０２４タンパク質の発現を遮断し得る阻害剤はＩＣＴ１０２４発現の増強に関連した疾病の治療に有効である。さらに、これらの疾病はまた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イントラボディー、タンパク質アンタゴニスト、小分子プロテアーゼ阻害剤またはその他の種の阻害剤などの阻害剤を用いても治療することができ、ＩＣＴ１０２４タンパク質機能の有効な遮断薬となる。本発明者らはまた、このＩＣＴ１０２４タンパク質が、癌およびその他の疾病の治療に有用な新規なクラスの薬物標的となる可能性があると認識している。
参照文献
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ＩＣＴ１０２５：
タンパク質ＩＣＴ１０２５は、アポトーシスの阻害剤、増殖のアクチベーターおよび複数の薬剤耐性遺伝子のアップレギュレーションとしてのその複数の役割を通じて、明らかに腫瘍転移と腫瘍増殖に重要な役割を果たす。本発明者らは、この遺伝子がｂＦＧＦ発現ベクターで処理した異種移植腫瘍モデル研究からの増殖の速い腫瘍においてアップレギュレーションされることを実証する証拠を得ている。この遺伝子は、ＳＡＧＥ仮想およびデジタルノーザン解析に基づけば、乳癌、前立腺癌、脳癌およびその他の種類の癌に由来の腫瘍組織においてｍＲＮＡレベルでアップレギュレートされる。この遺伝子はまた、Logic’s GeneExpresse解析においてもアップレギュレートされることが示されている。この遺伝子発現を、増殖中の異種移植腫瘍においてＩＣＴ１０２５特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんでノックダウンした場合、腫瘍増殖は有意に阻害された（図３８）。
アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、一般に、原形質膜の突出、細胞体積の収縮、および核の凝縮を含み、細胞ＤＮＡを分解する内在性のエンドヌクレアーゼの活性化で終わる細胞自殺の一形態である。胚発達および器官形成の際には、十分定義された特定の細胞の消失が重要である。アポトーシスは、その生理学的役割の他、多くの種類の癌細胞で、それらが代謝拮抗物質、デオキシヌクレオチド合成阻害剤、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、抗微小管剤、アルキル化剤、および小胞体（ＥＲ）ストレッサーをはじめとする種々の化学療法薬に曝された際にも起こる。本発明者らが特定のｓｉＲＮＡ二重らせんでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞およびＨＴ−２９細胞においてＩＣＴ１０２５発現をノックダウンした場合、ＴＵＮＥＬアッセイでの試験において、アポトーシス活性が劇的に上昇したことは（図３７および３８）十分興味深いことであり、ここでは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が、ニック末端標識により、フラグメント化核ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端へのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）残基の組み込みを触媒する。
ｓｉＲＮＡ二重らせんによる特異的なＩＣＴ１０２５遺伝子サイレンシングはＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図３６）。この発見は、ＩＣＴ１０２５が腫瘍細胞アポトーシスの調節に重要な役割を果たすことを示唆した。他の証拠は、ＩＣＴ１０２５が細胞の増殖および生存をもたらす主要なシグナル伝達経路を活性化するに十分であることを示す傾向にある。
ＩＣＴ１０２４およびＩＣＴ１０２５タンパク質産生を遮断する阻害剤を用いた細胞増殖性疾患の治療方法
ＲＮＡｉ、アンチセンス、リボザイムおよびその他の核酸治療薬は、細胞増殖を伴う疾病を患う患者において、ＩＣＴ１００３およびＩＣＴ１０２４およびＩＣＴ１０２５およびＩＣＴ１０３１の発現を阻害するために用いることができる。例えば、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１のアンチセンス鎖（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）が、ｍＲＮＡ転写物と結合し得る形で直接細胞に導入される。あるいは、ひと度標的細胞内に入れば、適当なアンチセンスｍＲＮＡへと転写される配列を含むベクターを投与することもできる。標的ｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンス核酸は、正常な一本鎖ｍＲＮＡ転写物と会合し、それにより翻訳、ひいてはタンパク質の発現を妨げることにより、遺伝子にコードされているポリペプチド産物の産生を低減または阻害する。例えば、プロモーター、例えば組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターを含むＤＮＡを、アンチセンスＲＮＡへと転写されるＤＮＡ配列（アンチセンス鋳型）と作動可能なように連結する。「作動可能なように連結される」とは、コード配列と調節配列（すなわち、プロモーター）を、適当な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が調節配列と結合した際に遺伝子発現が可能な様式で接続されることを意味する。
標準的な方法に従い、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の様々な部分に相補的なオリゴヌクレオチドの、ヒト細胞（例えば、ＦＯＣＵＳ肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞系統を用いる）におけるＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の産生を低下させる能力をin vitroで判定することができる。候補組成物の不在下で培養した細胞に比べた場合の、候補アンチセンス組成物と接触させた細胞におけるＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１遺伝子産物の低下は、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の特異的抗体またはその他の検出戦略を用いて検出される。次に、in vitroにおいて細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイにおいてＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の産生を低下させた配列を、ラットまたはマウスでin vivoにて試験し、悪性新生物を有する動物におけるＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１産生の低下を確認する。
アンチセンス療法は標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系によりアンチセンス核酸を患者に投与することによって行う。好適な遺伝子送達系としては、リポソーム、ポリマー、受容体媒介送達系、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクター（中でも、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど）が挙げられる。治療核酸組成物は医薬上許容される担体中に調剤する。この治療組成物はまた、上記のような遺伝子送達系を含んでもよい。医薬上許容される担体は、動物に投与するのに好適な、生物学的に適合するビヒクル、例えば生理食塩水である。化合物の治療上有効な量とは、ＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１０３１遺伝子産物の産生の低下、または処置される動物の細胞増殖の低下などの医学上望ましい結果をもたらし得る量である。
静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内送達経路などの非経口投与を用いて、非ペプチド化合物上の核酸、またはＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１０３１阻害ペプチドを送達してもよい。また、治療化合物のリポソーム処方物も活性を補助し得る。
各患者の用量は、患者の大きさ、体表面積、齢、投与する特定の核酸、性別、投与時間および投与経路、健康状態、および同時に投与するその他の薬物をはじめとする多くの要因によって異なる。核酸の静脈投与量は、約１０６〜１０２２の核酸分子コピーである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が配列特異的に遺伝子発現を阻害する転写後プロセスである。このＲＮＡｉプロセスは少なくとも２つの段階で起こり、第一段階では、長いｄｓＲＮＡが内因性のリボヌクレアーゼにより、「小干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる、１００、５０、３０、２３、または２１未満のヌクレオチド長の短いｄｓＲＮＡに切断される。第二段階では、これらの小さなｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ分子の分解を媒介する。このＲＮＡｉの作用は、細胞内の標的配列に長いｄｓＲＮＡかまたは短いｓｉＲＮＡかのいずれかを導入することで達成できる。また、ＲＮＡｉ作用は標的遺伝子と相補的なｄｓＲＮＡを生成するプラスミドを導入することでも達成できることが示されている。ＲＮＡｉはショウジョウバエ (Kennerdell et al. (2000) Nature Biotech 18: 896-898; Worby et al. (2001) Sci STKE Aug 14, 2001 (95):PL1; Schmid et al. (2002) Trends Neurosci 25(2):71-74; Hammond et al. (2000). Nature, 404:293-298)、線虫(C. elegans)(Tabara et al. (1998) Science 282:430-431; Kamath et al. (2000) Genome Biology 2:2.1-2.10; Grishok et al. (2000) Science 287:2494-2497)、およびゼブラフィッシュ(Kennerdell et al. (2000) Nature Biotech 18:896-898) の遺伝子機能決定に首尾よく用いられてきた。これらのモデル生物では、化学的に合成された短いｓｉＲＮＡまたはin vitroで転写された長いｄｓＲＮＡの両者とも、標的遺伝子発現を有効に阻害できることが報告されている。非ヒト哺乳類およびヒト細胞培養においてもＲＮＡｉ作用が首尾よく達成されたという報告が増えている(Manche et al. (1992).Mol. Cell. Biol. 12:5238-5248; Minks et al. (1979). J. Biol. Chem. 254:10180-10183; Yang et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(22):7807-7816; Paddison et al. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(3):1443-1448; Elbashir et al. (2001) Genes Dev 15(2):188-200; Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; Caplen et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9746-9747; Holen et al. (2002) Nucleic Acids Research 30(8):1757-1766; Elbashir et al.(2001) EMBO J20:6877-6888; Jarvis et al.(2001) TechNotes 8(5):3-5; Brown et al. (2002) TechNotes 9(1):3-5; Brummelkamp et al. (2002) Science 296:550-553; Lee et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002) Genes & Dev. 16:948-958; Paul et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052)。本発明者らが用いた２つのｓｉＲＮＡ二重らせんは、細胞に基づくアッセイと異種移植腫瘍モデルの双方でＩＣＴ１０２４またはＥＧＦ−ＡＰの発現を効率的にサイレンシングすることができる。しかしながら、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１のｍＲＮＡの領域は、ｓｉＲＮＡ標的ノッ
クダウンに有用である。
本発明の他の態様によれば、哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を、標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１のＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用し、それにより、標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の遺伝子発現を阻害する阻害剤と接触させることを含んでなる方法が提供され、その組織は乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、または卵巣組織であり、その阻害剤は核酸分子、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の遺伝子発現を遮断し得る分子、またはそれらの組合せである。
本発明の他の態様によれば、阻害剤をそれを必要とする患者に投与する方法が提供され、その阻害剤分子はモノクローナル抗体、ペプチドアンタゴニスト、小分子プロテアーゼ遮断薬、裸のオリゴヌクレオチドまたはベクターの形態で送達され、その核酸は標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１遺伝子と相互作用する。
本発明の他の態様によれば、阻害剤をそれを必要とする患者に投与する方法が提供され、その阻害剤分子は裸のオリゴヌクレオチドまたはベクターの形態で送達され、その核酸は標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１遺伝子と相互作用し、その核酸はベクターとして送達され、そのベクターはプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルス、例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである。
本発明の他の態様によれば、ベクターをそれを必要とする患者に投与することによって遺伝子のin vivo発現を遮断する方法が提供され、そのベクターは標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１遺伝子を含み、その核酸は標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の遺伝子発現と相互作用し、その核酸は哺乳類細胞、例えばヒト細胞におて標的ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の遺伝子発現を阻害する。
本発明の他の態様によれば、この阻害剤分子は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、肺組織、リンパ節組織、または卵巣組織をはじめとする組織に導入される。
タンパク質機能を遮断するための阻害剤の使用
ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の抗体阻害剤
本発明によれば、固形腫瘍の増殖または転移などの細胞増殖により進行する疾病、慢性関節リウマチの関節炎、糖尿病性網膜症、早期網膜症、乾癬などの治療または診断のための組成物および方法が提供される。
本発明の発明者らは、ＩＣＴ１０２４と結合し、そのＮ末端アミノ酸から１番〜５９０番の領域に存在するエピトープを認識し得る抗体が、免疫細胞染色により、ヒトＩＣＴ１０２４と特異的に反応すること、および生物活性が結合の阻害によって阻害できることを見出している。固形腫瘍の増殖または転移などの細胞増殖により進行する疾病、慢性関節リウマチの関節炎、糖尿病性網膜症、早期網膜症、乾癬など、異常な脈管形成によって病態が進行する上記の疾病の診断および治療は、これらのモノクローナル抗体を用いることで行うことができる。
従って、本発明によれば、ヒトＩＣＴ１０２４と特異的に反応する抗体が提供される。本発明によるモノクローナル抗体に関して、Ｎ末端アミノ酸から測って１番〜５９０番、例えば、１６１〜１９０番または４５１〜４８０番の間の領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体が提供される。Ｃ末端エピトープ領域は７４０〜８５５番、例えば、８２６〜８５５番の間である。また、本発明によれば、ヒトＩＣＴ１０２４の結合を阻害し、かつ、ＩＣＴ１０２４の生物活性を阻害するモノクローナル抗体も提供される。
本発明の発明者らは、ＩＣＴ１０２５と結合し、そのＮ末端アミノ酸から１番〜３００番の領域に存在するエピトープを認識し得る抗体が、免疫細胞染色により、ヒトＩＣＴ１０２５と特異的に反応すること、および生物活性が結合の阻害によって阻害できることを見出している。固形腫瘍の増殖または転移などの細胞増殖により進行する疾病、慢性関節リウマチの関節炎、糖尿病性網膜症、早期網膜症、乾癬など、異常な脈管形成によって病態が進行する上記の疾病の診断および治療は、これらのモノクローナル抗体を用いることで行うことができる。
従って、本発明によれば、ヒトＩＣＴ１０２５と特異的に反応する抗体が提供される。本発明によるモノクローナル抗体に関して、Ｎ末端アミノ酸から測って１番〜３００番、例えば、１６１〜１９０番または２５１〜２８０番の間の領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体が提供される。Ｃ末端エピトープ領域は７００〜８０３番、例えば、７２６〜８０３番の間である。また、本発明によれば、ヒトＩＣＴ１０２５の結合を阻害し、かつ、ＩＣＴ１０２５の生物活性を阻害するモノクローナル抗体も提供される。
本発明によるモノクローナル抗体は、ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１と特異的に反応する限り、いずれの抗体であってもよい。モノクローナル抗体の例としては、ハイブリドーマによって産生される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体によって産生される組換え抗体が挙げられる。例えば、ネズミまたはウサギハイブリドーマを用いて確立されるものを調製することができる。すなわち、抗ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１モノクローナル抗体は、抗原としてのヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１タンパク質を準備し、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、ハイブリドーマを提供し得る動物をその抗原で免疫化し、それにより抗原特異性を有する血漿細胞を誘導し、それらの細胞とミエローマ細胞系統との融合によってモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを作製し、その後、そのハイブリドーマを培養することにより得ることができる。あるいは、抗ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１モノクローナル抗体は、ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１タンパク質を発現するプラスミドを作製し、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、ＤＮＡワクチン接種を用いてハイブリドーマを提供し得る動物をその抗原で免疫化し、それにより、抗原特異性を有する血漿細胞を誘導し、それらの細胞とミエローマ細胞系統との融合によってモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを作製し、その後、そのハイブリドーマを培養することにより得ることもできる。
あるいは、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１タンパク質と結合する完全ヒト抗体を、その全内容が引用することにより本明細書の一部とされる、例えば米国特許第５，８８５，７９３号明細書に記載されているようなファージディスプレー法を用い、ヒト抗体ライブラリーから単離することができる。また、ヒト抗体は、その全内容が引用することにより本明細書の一部とされる、例えば米国特許第６，０７５，１８１号明細書に記載されているような、ヒト免疫グロブリンレパートリーの一部をコードするように改変されたトランスジェニックキセノマウスから単離することもできる。あるいは、その全内容が引用することにより本明細書の一部とされる、例えば米国特許第５，８００，９８８号明細書に記載されているような、軽鎖を欠いたラクダ型抗体を用いてもよい。
本発明によるヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１と特異的に反応するモノクローナル抗体は組換え抗体であってもよい。組換え抗体の例としては、ヒト化抗体および抗体フラグメントが挙げられる。本発明による組換え抗体は、遺伝子組換え技術を用い、本発明による上記モノクローナル抗体を改変することにより得ることができる。組換え抗体としては、ヒト化抗体および抗体フラグメントなど、遺伝子組換えにより生産された抗体（例えば、単鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体）も含む。これらの中でも、モノクローナル抗体の特徴を有し、低い抗原性を示し、かつ、血中での半減期が長い抗体が治療薬として好ましい。本発明によるヒト化抗体としては、ヒトキメラ抗体およびヒトＣＤＲ（相補性決定領域；以下「ＣＤＲ」と呼ぶ）グラフト抗体が挙げられる。本発明による抗体フラグメントとしては、ＩＣＴ１０２４と特異的に結合する抗原結合フラグメント（以下「Ｆａｂ」と呼ぶ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ、以下「ｓｃＦｖ」と呼ぶ）、およびジスルフィド安定化抗体（ジスルフィド安定化Ｆｖ；以下「ｄｓＦｖ」と呼ぶ）が挙げられる。抗体はまた、その全内容が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，８３７，２４２号明細書に記載されている種の「ダイアボディー」であってもよい。
本発明によるヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１と反応する抗体は、ヒトキメラ抗体およびヒトＣＤＲグラフト抗体から選択されるヒト化抗体であってもよい。
本発明による抗体の構造はいずれの免疫グロブリン（Ｉｇ）種に属するものでもよいが、好ましくは、ＩｇＧ型免疫グロブリン、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などのＩｇＧサブクラスのＣ領域を含む。
さらに、本発明は、以下の方法に関するものである：
ヒトを免疫学的に検出するための方法であって、ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１を本発明による抗体またはペプチドと反応させることを含んでなる方法；
表面でヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１が発現される細胞を免疫学的に検出するための方法であって、ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１を本発明による抗体またはペプチドと反応させることを含んでなる方法；
ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の結合を阻害するための方法であって、ヒトＩＣＴ１０２４を本発明による抗体またはペプチドと反応させることを含んでなる方法；
ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の生物活性を、本発明による抗体またはペプチドで阻害するための方法；
病態が異常な細胞増殖によって進行する疾病を検出するための方法であって、サンプルを本発明による抗体またはペプチドと反応させることを含んでなる方法；および
疾病を予防または治療するための方法であって、そのような予防または治療を必要とするヒトまたは動物に、有効量の本発明による抗体またはペプチドを投与する工程を含んでなる方法。
ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１を免疫学的に検出するための上記の方法では、ヒトＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１０３１、またはＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１０３１の断片は可溶であり得る。
ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の生物活性を阻害するための上記の方法では、例えば、ヒトＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の活性が阻害される。
疾病を検出するための上記方法では、例えば、その方法は、（ａ）ヒト細胞もしくはその破砕液、組織もしくはその破砕液、血清、胸膜液、腹水、または眼水を分離してサンプルを調製すること、（ｂ）工程（ａ）で作製された分離サンプルを本発明によるモノクローナル抗体またはペプチドと反応させること、（ｃ）さらに、工程（ｂ）で作製された反応サンプルを標識抗マウスＩｇＧ抗体または結合フラグメントと反応させること、および（ｄ）工程（ｃ）で作製された標識サンプルを測定または観測することを含み得る。
疾病を予防または治療するための上記方法では、疾病の例として、病態が異常な細胞増殖により進行する疾病が挙げられる。
病態が異常な細胞増殖により進行する疾病の例としては、固形腫瘍の増殖または転移、慢性関節リウマチの関節炎、糖尿病性網膜症、早期網膜症、および乾癬が挙げられる。固形腫瘍の例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、および肺癌が挙げられる。
本発明は、本発明による抗体またはペプチドと診断上または医薬上許容される担体を含んでなる組成物に関する。
腫瘍など、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の発現または過剰発現を特徴とする腫瘍患者は、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１抗体を投与することによって治療される。
ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１特異的抗体は、培養組織および病理組織の細胞の増殖を阻害する。種々のＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５特異的抗体を開発し、細胞増殖を阻害することを証明することができる。例えば、腫瘍細胞（肝癌細胞系統、肺癌細胞系統、および乳癌細胞系統）を９６穴プレートに播種し、種々の濃度の抗体とともに４８時間インキュベートすればよい。これらの細胞を固定化し、スルホローダミンＢ色素結合アッセイを用いて細胞増殖をモニタリングすることができる。このデータは、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１特異的抗体の存在下のほうが、不在下よりも細胞活性および増殖が低下していることを示している。
受動免疫
腫瘍または腫瘍発症のリスクを持つと診断された個体に、診断精製抗体調製物（例えば、精製モノクローナル抗体、抗体フラグメント、または単鎖抗体）を投与する。これらの抗体調製物は、受動免疫の分野で公知の方法を用い、例えば、静脈投与または筋肉内投与される。本明細書に記載の方法で用いる抗体は生理学上許容される賦形剤中に調剤される。このような賦形剤、例えば生理食塩水は当技術分野で公知のものである。
抗体は、高親和性抗体、例えば、ＩｇＧクラスの抗体、またはそのフラグメントもしくは単鎖であるのが好ましい。あるいは、この抗体はＩｇＭイソ型とされる。抗体はモノクローナル、例えば、ネズミモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、またはヒト化されたネズミモノクローナル抗体である。抗体はヒトモノクローナル抗体である。あるモノクローナル抗体の親和性は、公知の方法を用い、例えば、より高い結合能に関して選択することにより（例えば、Boder et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:10701-10705に記載の方法による）、さらに増強される。所望により、抗体、抗体フラグメント、または高親和性単鎖抗体を投与前に毒性部分と結合させてもよい。結合させるのに好適な毒性部分としては、リシン、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素ならびに当技術分野で公知の放射性同位元素および化学療法薬が挙げられる。このような抗体毒素は、腫瘍細胞と結合した際に、または腫瘍細胞の細胞質中へインターナライズされた際に腫瘍細胞に傷害を与えるか、死滅させる。
抗体調製物または抗体−毒素調製物は約０．０１〜２ｍＬ／ｋｇ体重の用量で投与される。治療個体の腫瘍負荷を軽減するのに必要であれば、毎日、毎週または毎月、再投与する。
能動的ワクチン接種は、動物に抗原応答を誘導するプロセスである。ワクチン接種の際、抗原を認識する細胞（Ｂ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）がクローンとして増殖する。さらに、その抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の産生も増える。ワクチン接種にはまた、抗原を処理でき、２つの経路のうちの一方を刺激し得る形態でそれを提示し得る特殊な抗原提示細胞も含む。抗原認識、その後の免疫細胞の増殖および活性化により、抗原特異的抗体の産生および抗原特異的な細胞性免疫応答がもたらされる。免疫化の成功は、免疫個体の血清中のＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１特異的抗体力価のレベルが免疫化前のレベルよりも高いことで示される。ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１特異的抗体力価は免疫前の力価よりも少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは２００％高いことが好ましい。
能動免疫に関しては、個体をＩＣＴ１００３もしくはＩＣＴ１０２４もしくはＩＣＴ１０２５もしくはＩＣＴ１０３１ポリペプチド、またはそのペプチドをコードするポリヌクレオチドで免疫化する。例えば、ヒト患者を全長ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１で免疫化する。免疫ポリペプチドの免疫原性を高めるために、標準的なアジュバント処方物を同時投与してもよい。あるいは、例えばＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１の免疫原性フラグメントなどのより短いポリペプチドを用いる。例えば、ポリペプチドはＩＣＴ１０２４の細胞外触媒ドメイン（例えば、ＩＣＴ１０２４のアミノ酸１〜５９０）を含む。ＩＣＴ１０２４の他の免疫原性フラグメントとしては、アミノ酸１〜５９０の領域内のフラグメントが挙げられる。ＩＣＴ１０２５の細胞外ドメインを含むポリペプチド。
モノクローナル抗体療法は、ヒトの身体自体の免疫系によるものではなく、その大きな部分が体外で産生されることから、受動免疫療法である。このタイプの療法では、癌患者に典型的なケースである、免疫系が弱まった場合でも効果的であり得る。これらの処置では、免疫系に癌と闘うのに「積極的な」役割をとらせる必要はない。抗体は、マウス由来のミエローマ細胞と特異的な抗体を産生するマウスＢ細胞とを融合させることによって大量生産される。この融合の結果として得られる細胞はハイブリドーマと呼ばれる。特定の抗原を認識できるＢ細胞と、際限なく生きるミエローマ細胞との組合せにより、このハイブリドーマ細胞は、一種の永久的抗体生産工場となる。これらの抗体は総て、１つのハイブリドーマ細胞から作られた同じクローンであることから、それらはモノクローナル抗体と呼ばれる。特定種の癌細胞上の特異的抗原、例えば、ＩＣＴ１００３またはＩＣＴ１０２４またはＩＣＴ１０２５またはＩＣＴ１０３１と反応するモノクローナル抗体は、標的タンパク質を中和するか、またはその生物学的機能を遮断することができる。結果として、ＥＧＦ−ＡＰは活性解除され、ＥＧＦ経路は遮断され、腫瘍増殖が阻害される。
抗体療法は以下のようにして適用することができる：Ａ．裸のモノクローナル抗体、この抗体はそれ自体、癌細胞上の特異的抗原に付着する。Ｂ．結合モノクローナル抗体は薬物、毒素、または放射性原子と結合され、これらの物質を直接癌細胞へ持っていく送達ビヒクルとして用いられる。このＭＡｂは、適合する抗原を有する癌細胞により誘因され、それ自体その癌細胞に付着するまで、体内を循環するホーミング装置として働く。それは、身体の他の部分の正常細胞への損傷を最小限として、それが最も必要な所へ有毒物質を送達する。しかし、やはり一般には、結合抗体のほうが、裸の抗体よりも副作用が多い。Ｃ．免疫毒は毒素（植物または細菌由来の誘導物質）をモノクローナル抗体に付着させることにより作製される。モノクローナル抗体を、ジフテリア毒素（ＤＴ）もしくはシュードモナス外毒素（ＰＥ４０）などの細菌毒素、またはリシンＡもしくはサポリンなどの植物毒素に付着させることで、種々の免疫毒が作製されている。Ｄ．最近まで、ＭＡｂ療法の有効性は、その抗体がマウスハイブリドーマ細胞によって作り出されたものであるという事実によって限定されたものであった。場合によっては、これらの抗体は最初は十分な働きをする。しかし、しばらくすると、患者の免疫系はマウス抗体を「外来」と認識し、それらを破壊する。このため、ヒト化Ｍａｂは、特定の腫瘍抗原の認識を担うマウス抗体遺伝子の一部とヒト抗体遺伝子由来の他の部分とを組み合わせることで作製されたものである。このマウス−ヒト抗体遺伝子の産物は患者固有の免疫系により破壊されるのを避けるに十分、正常なヒト抗体に似ている。これは、その抗体をより長期間有効とする助けとなる。上記のアプローチは総て、ＩＣＴ１０２４またはＥＧＦ−ＡＰに基づく抗体療法に有用である。体内の単鎖抗体およびＤＮＡワクチンなどの他のアプローチを用いて、研究、診断および治療用途の抗体薬剤を作製することもできる。
本発明では、ＩＣＴ１０２４のトランスメンブラントポロジーに従う抗体阻害剤の２つの異なる態様は、Ｎ末端が細胞外にあるものと、Ｎ末端が細胞内にあるものである。Ｎ末端が細胞外にある場合、１〜４０９番ＡＡの大きな断片を抗体生成のための抗原とするのが好ましく、全４０９ＡＡペプチドか、またはこの断片内の種々の部分を用いる。所定のＨＬＡ種に対するそれらの連結力のため、良好な抗原として働く配列がいくつかある：ＧＬＳＡＰＨＴＰＶ（１７４番）（配列番号４３）、ＧＭＱＫＩＩＤＰＬ（１５１番）（配列番号４４）、ＫＭＳＦＲＡＡＡＡ（２１３）（配列番号４５）およびＬＴＡＥＥＰＳＦＬ（３０）（配列番号４６）。これらの配列を含む抗原ペプチドをデザインすると、誘導された抗体の結合活性が高まる。この筋書きでは、細胞の外側には数個の短いペプチド断片しかなく、これはＩＣＴ１０２４と結合する抗体の作製のための強力な抗原とはいえない。Ｎ末端が細胞内にある場合、ＩＣＴ１０２４タンパク質の、４３３〜６６０番ＡＡの、もう１つの長い断片がおそらく細胞外にある、この場合、この断片は、完全、またはその領域内で選択される複数の抗原として良好な抗原を提供する。この領域には強いＨＬＡ結合モチーフがいくつかある：ＳＱＨＥＴＶＤＳＶ（４３３番）（配列番号４７）、ＧＶＹＥＮＶＫＹＶ（４４６番）（配列番号４８）、ＹＶＱＱＥＮＦＷＩ（４５３番）（配列番号４９）、およびＬＬＰＦＬＮＰＥＶ（６４１番）（配列番号５０）。
Ｃ末端ドメインが細胞外にあるという１つの筋書きがある。８２３〜８５５ＡＡの短い断片もまた、完全配列または部分配列のいずれかでペプチド抗原として働き得る。
３つの３０ＡＡペプチドがポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製の例として選択された：
Ｎ’−ＲＧＲＡＦＲＶＡＤＤＴＡＥＧＬＳＡＰＨＴＰＶＴＰＧＡＡＳＬＣ−Ｃ’（１６１〜１９０番）（配列番号５１）；
Ｎ’−ＶＫＹＶＱＱＥＮＦＷＩＧＰＳＳＥＡＬＩＨＬＧＡＫＦＳＰＣＭＲ−Ｃ’（４５１〜４８０番）（配列番号５２）；
Ｎ’−ＰＶＲＣＥＷＣＥＦＬＴＣＩＰＦＴＤＫＦＣＥＫＹＥＬＤＡＱＬＨ−Ｃ’（８２６〜８５５番）（配列番号５３）。
また、１４ＡＡ〜１００ＡＡを超える大きさの、可能性のあるペプチド抗原としても同じペプチド配列を選択することができる。
本発明では、ＩＣＴ１０２５のトランスメンブラントポロジーに従う抗体阻害剤の２つの異なる態様は、Ｎ末端が細胞外にあるものと、Ｎ末端が細胞内にあるものである。Ｎ末端が細胞外にある場合、１〜３００番ＡＡの大きな断片を抗体生成のための抗原とするのが好ましく、全３００ＡＡペプチドか、またはこの断片内の種々の部分を用いる。所定のＨＬＡ種に対するそれらの連結力のため、良好な抗原として働く配列がいくつかある：ＡＬＷＶＬＧＬＣＣ（３番）（配列番号７６）、ＶＬＧＬＣＣＶＬＬ（６番）（配列番号７７）、ＬＬＨＶＴＤＴＧＶ（１４４番）（配列番号７８）およびＳＥＬＩＧＱＦＧＶ（１８９番）（配列番号７９）。これらの配列を含む抗原ペプチドをデザインすると、誘導された抗体の結合活性が高まる。この筋書きでは、細胞の外側には数個の短いペプチド断片しかなく、これはＩＣＴ１０２５と結合する抗体の作製のための強力な抗原とはいえない。Ｃ末端ドメインが細胞外にあるという１つの筋書きがある。８２３〜８５５ＡＡの短い断片もまた、完全配列かまたは部分配列のいずれかでペプチド抗原として働き得る。
３つの３０ＡＡペプチドがポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製の例として選択された：
Ｎ’−ＡＤＤＥＶＤＶＤＧＴＶＥＥＤＬＧＫＳＲＥＧＳＲＴＤＤＥＶＶＱ−Ｃ’（２１〜５０番）（配列番号８０）；
Ｎ’−ＳＡＦＬＶＡＤＫＶＩＶＴＳＫＨＮＮＤＴＱＨＩＷＥＳＤＳＮＥＦ−Ｃ’（２０１〜２３０番）（配列番号８１）；
Ｎ’−ＳＥＫＴＫＥＳＲＥＡＶＥＫＥＦＥＰＬＬＮＷＭＫＤＫＡＬＫＤＫ−Ｃ’（７０１〜７３０番）（配列番号８２）。
また、１４ＡＡ〜１００ＡＡを超える大きさの、可能性のあるペプチド抗原としても同じペプチド配列を選択することができる。
本発明の他の態様によれば、この阻害剤分子は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、肺組織、リンパ節組織、または卵巣組織をはじめとする組織に導入される。
阻害プロテアーゼ阻害剤
ペプチドアンタゴニスト、小分子プロテアーゼ阻害剤およびその他の種のＩＣＴ１０２４阻害剤も、ＩＣＴ１０２４活性の遮断または阻害のために提供される。
以下の実施例は本発明の実施形態を説明するために示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１．標的バリデーションのための遺伝子送達方法：
Efficacy-First Discovery（商標）法は、定義された疾病経路（例えば、脈管形成）や明確な疾病モデル（例えば、ヒト腫瘍を異種移植したヌードマウス）において中心的存在としての役割を果たす既知の遺伝子から開始される。効果的な遺伝子送達手段、すなわち、強力な発現を示すものであり、同等以上に重要なことには、その送達手段自体にバックグラウンド活性がほとんどないものが非常に重要である。非ウイルス性でポリマーに基づく送達系は、固形腫瘍への強力な送達と低バックグラウンドの両方を提供し得る。処置後に読み出した病理学的、薬学的および組織学的情報を遺伝子発現およびタンパク質特性と比較して解析する。バイオインフォマティクス解析と生物学的解析の両解析に基づき、定義された経路において有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子およびタンパク質を慎重に選択し、それらを同じ反復in vivoバリデーション作業工程によりさらに解析することができる。この工程は腫瘍組織への効果的な遺伝子送達から開始した。患部の腫瘍をまず、増殖速度、組織学的変化により評価し、次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを用いた発現特性解析用に採取した。著しくアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた標的を疾病制御バリデーション用に同定した。新規標的がin vivoで検証された。
Efficacy-First Discovery（商標）法によって同定された標的は、従来のアプローチを用いて同定されたものとは異なっている。Efficacy-First Discovery（商標）方法の利点は、その方法によって選択された標的が単に病態とのみ関連しているのではなく、疾病有効性と関連しているということにある（図１参照）。標的の発現変化は送達される遺伝子の摂動と疾病過程の動態による。それらは創薬によりよく適している。
実施例２．既知因子による腫瘍摂動
ヒト乳癌細胞により誘導した異種移植腫瘍に、腫瘍増殖に影響を及ぼすことが分かっている遺伝子を利用して摂動を起こし、増殖を促進させるか、または増殖を緩慢にさせた。異種移植腫瘍モデルは、Ｎｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を用いて作製した。この実証は、本発明者らの過去データと、ｂＦＧＦが腫瘍増殖を増強する周知の薬物標的であり、ＩＬ−２が単に標的であるだけではなく、認可された発癌抑制薬でもあるということに基づき、特許ポリマー媒介ＩＬ−２およびｂＦＧＦ送達を利用して行った。ＩＬ−２で処置される４つの腫瘍サンプル、ｂＦＧＦで処置される４つの腫瘍サンプル、および対照としてＬｕｃで処置される２つのサンプルを採取し、処置を行った。腫瘍の大きさが５０ｍｍ３に達したところで、ｐＣＩ−ＩＬ−２およびｐＣＩ−ｂＦＧＦ、対照としてｐＣＩ−Ｌｕｃを直接腫瘍内に送達させた。腫瘍組織（合計１０）を異なる時点に採取し、ＲＮＡサンプルをＲＮＡｓｏｌにより単離し、定量し、ゲルをそれらの完全性について確認した。データより、ＩＬ−２による腫瘍増殖の阻害とｂＦＧＦによる腫瘍増殖の増強が分かる。
実施例３．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを用いた発現解析
腫瘍組織の全ＲＮＡサンプルについて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップＵ１３３ Ａを用いた発現解析を行った。写真はアレイ原画像である。処置したサンプルを対照サンプルと比較し、最初の解析データをバイオインフォマティクスによる取り組みによりさらに解析した。本発明者らは、腫瘍増殖速度および有効性データにバイオインフォマティクスデータと文献調査を合わせ考え、有意にレギュレートされた標的の基準として少なくとも２倍のものを使用した。シグナルは２００を超えていなければならない。
実施例４．新規標的の同定
腫瘍増殖への摂動効果、バイオインフォマティクス解析および文献調査に従い、それらの発現特性の変化に基づいてごく少数の遺伝子標的を選択した。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ Ａチップでの約２３，０００対の比較に基づいて、１５６の標的を選択した。ＩＬ−２発現ベクターの第２回目の注射から２４時間後に腫瘍組織を採取した。選択した１５６の標的では、ＵｎｉＧｅｎｅデータベース注釈に基づき、それらのうちの１１１の標的が既知のものであり、これに対して、４５の標的が未知の新規な標的であった。既知の標的においては、８７％が腫瘍関連のものである。同じ比が適用できるならば、３５を超える標的が新規腫瘍標的であると思われる。さらに、ヒットしたものはいくつかの腫瘍形成経路にも属するものである。
選択したこれらの標的の多くは周知のものであるが、それらのうちのいくつかは異なる臨床開発段階にある（表１参照）。多くの未知標的（ＵｎｉＧｅｎｅデータベースにおいて注釈はない）は新規腫瘍標的として有望である。異種移植腫瘍モデルでのさらなるバリデーションでは、ＩＬ−２処置サンプルおよびｂＦＧＦ処置サンプルの両方から２００を超える標的を選択した（表２参照）。このバリデーション戦略では、確立された手順によりこれらの標的をスクリーニングし、その後、スクリーニングされた各々の標的に対しより包括的に研究を行う。
選択した１５６の標的（表１参照）では、それらのうちの多くが十分に特徴付けられたものであり、異なる臨床研究段階にある。これらの例により、既知標的または未知標的のいずれを選択しても有望であることが示される。
ＩＬ−２およびｂＦＧＦの両方で処置した８組織サンプルの発現解析に基づき、本発明者らは著しくアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた標的を選択した。ＵｎｉＧｅｎｅデータベースの注釈に従って、標的の約２／３が既知のものであり、１／３が新規のものである。選択した既知または新規の標的について疾病制御バリデーションを行った。
実施例５．標的バリデーション工程
腫瘍疾病を制御する薬物標的を検証するため、最近開示された、ＲＮＡｉ媒介in vivo遺伝子サイレンシングを利用する新しい技術基盤を使用した（米国仮出願番号６０／４０１，０２９を参照）。本発明は、担癌マウスモデルにおけるペイロードおよび送達方法を調べる一連の試験を全て行うことにより、この技術基盤をさらに検証する。
１）標的バリデーション：腫瘍相関または制御
多様なレベルの薬物標的バリデーションのうち、最終のバリデーションが、候補標的が実際に疾病を制御することを実証することである。疾病を制御する標的は高価値を有する標的であり、このような標的が創薬の対象となる。薬剤開発の目標は、疾病の効果的な治療制御を提供するために主要経路およびそれらの経路の主要制御因子を選択的に標的化する製品にある。このような主要経路および因子のバリデーションでは、候補標的の加減によって疾病が制御されること、すなわち、結果として、病変の明らかな増減が生じることを実証する必要がある。in vitroでの細胞に基づいた戦略では、有望な標的を同定し、選択する際に役立つ情報が得られた。しかしながら、疾病と関連するin vitro細胞モデルを制御する標的の能力が、標的が実際に疾病プロセス、すなわち、結果として、疾病病変を引き起こす複数の細胞種の複雑な相互作用を制御することを立証するには十分ではないことが多い。標的による疾病制御の決定的な実証は、真の疾病モデルでのそれらの標的の研究によってのみ得られる。
標的探索発見工程はゲノム法によって大きく加速されたが、バリデーションには依然として障害があり、第１世代ゲノム法では、バリデーション段階でできた候補標的の大プールが生じた。これらの遺伝子標的の機能を調べ、疾病プロセスにおけるそれらの役割を検証するために多くのアプローチが現在利用されている。これらのアプローチの多くは、効率がよく、ハイスループットであるという利益があるが、制御する役割を決定することよりもむしろ疾病プロセスとの相関または関連を確立することにのみ成功した場合が多かった。最新の遺伝子ノックダウンおよびフォワードまたはインバースゲノムアプローチが有用であることが証明されており、その阻害または突然変異が疾病的役割を有していると思われる遺伝子を同定するが、遺伝子の過剰発現から見込まれる有益情報がない。さらに、それらのアプローチでは、主として、腫瘍脈管形成のような多数の疾病の複雑な多細胞機構を反映していないin vitro細胞系の表現型を使用するため、隣接する細胞経路における重要な標的を見逃す危険性があるが、十分な生物学的背景なしでは不完全である疾病の関連性も提供する。
２）迅速な決定的標的バリデーション
本発明者らは最近、癌関連薬物標的を検証するための２つの技術基盤を開示した。これによりこれらの制限の多くに対処し、このことが標的バリデーション工程において重要な相補的役割を果たす。独特かつ独占的な標的識別方法は、腫瘍組織において導入遺伝子を過剰発現させるか、または内因性遺伝子をサイレンシングすることにより、動物腫瘍モデルにおける標的を直接検証する。これらの方法は、遺伝子クローニングおよび配列決定、タンパク質および抗体の作製またはトランスジェニック動物などの費用と時間のかかる決定的確認段階の必要性を低減する。これらの２つの方法を組み合わせることによってこの工程は非常に加速され、最も重要なことには、弱い標的が迅速に削除される。さらに、これらの方法により得られた結果から標的が実際に疾病を制御するという明確かつ決定的な証拠が提供され、この重要な確認により費用のかかる創薬段階へと進むことが必要となった。細胞培養物、モデル生物、トランスジェニック動物などから作製されたものなどの候補標的のバリデーションを完了させるためにこれらの方法を使用してもよい。
３）標的探索：事前バリデーションで見逃した標的の捕捉
もう１つの考慮すべき重大なことが、残念なことに、標的探索およびバリデーションにおける最初の「フィルター」としてin vitro法または疾病関連付け方法を使用する場合に、高価値を有する多くの疾病制御標的が失われる可能性があるということである。疾病制御要素である多くの標的は、完全な疾病モデルにおいてのみ見ることができる。例えば、腫瘍の脈管形成を制御する標的は腫瘍と血管との融合部においてのみ見られる。腫瘍の場合、特定の価値ある標的は、腫瘍と周囲組織の集合体を含むin vivo生物系を研究することによってのみ見出される。
４）ハイスループット標的探索解決法
本発明者らは、疾病制御要素である標的を探索するための方法も開示した。その方法は、基本的なアプローチをより高度なスループット操作でより多くの遺伝子標的セットをスクリーニングするように適合させることを目的として、その基本的なアプローチをスケールアップするためのものである。本発明者らのin vivo遺伝子送達技術によって、その方法を動物腫瘍モデルにおいて、各四半期につき１０００個の候補遺伝子を処理するまでにスケールとすることにより、このアプローチでは、多くの場合、事前の機能バリデーション方法を省略するか、または短くする機会が提供される。
５）腫瘍標的排除
開示した技術では、候補標的を腫瘍増殖におけるそれらの制御能力について迅速に試験することも可能となる。弱いか、またはごくわずかな腫瘍増殖制御しか示さない候補は、腫瘍増殖に強い影響を及ぼすものを有利にするため、検討材料から排除することができる。これらの腫瘍標的識別方法では、標的を３つのカテゴリー：腫瘍増殖を増強するもの、腫瘍増殖に大した影響を及ぼさないもの、および腫瘍増殖を阻害するものに迅速に分類する。
実施例６．新規標的のバリデーション
腫瘍モデルにおける疾病制御バリデーション用に既知および未知標的の両方（実施例４を参照）を選択した。各標的の疾病制御特性を理解するために、特許核酸送達技術に基づき、発現のノックダウンまたは過剰発現のいずれかによる２つの異なる基盤を確立する。効率性の高いin vivo ｓｉＲＮＡ送達方法を用いて、いくつかの標的群が検証された。新規の腫瘍形成関連標的が同定され、検証されている（表３参照）。もう一方で、本発明者らは過剰発現アプローチを適用し、特許送達により同じ異種移植腫瘍モデルにて既知の脈管形成関連遺伝子標的群も検証した。ＩＬ−１２は、腫瘍増殖阻害におけるそれらの役割に基づき、明確に再検証された。そのアプローチは現在、新規標的のバリデーションにも使用されている。
表３．いくつかの標的群のｓｉＲＮＡ媒介によるバリデーション
各遺伝子に対して２つのｓｉＲＮＡ標的を選択し、それらをＢＬＡＳＴにより確認し、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ(Lafyette, CO)により合成した。各遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ １０μｇをＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植モデルに繰り返し腫瘍内送達した。Ｎ＝８またはＮ＝１０の場合の腫瘍の大きさを測定した。Ａ．異種移植腫瘍モデルを用いて群Ｉの標的を検証した。ヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦＲ２を陽性対照として使用した。群Ｉの標的においては３種類の標的が検証された（表３、群Ｉ参照）。Ｂ．群IIの標的も同タイプのアッセイにより検証した。群IIにおいては２種類の標的が検証された（表３、群II参照）。
群IIIのバリデーションでは、これまでに検証された標的のいくつかと新規標的のいくつかを含めた。群IIIにおいては、１種類の新規標的が検証された。
以下の標的、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０３０およびＩＣＴ１００３を特異的ｓｉＲＮＡ分子の２つの二本鎖によりダウンレギュレートすると、腫瘍増殖速度が変化した。それらのうち、ＩＣＴ１０３０、乳汁脂肪小球−ＥＧＦ因子８タンパク質または乳房上皮ＢＡ４６抗原、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００５９２８、ＢＣ００３６１０およびそれらのスプライシング誘導体は、腫瘍抑制標的またはタンパク質療法標的および遺伝子療法標的様に作用した。ｓｉＲＮＡ媒介によるノックダウンによって、腫瘍増殖の阻害よりもむしろ腫瘍増殖の加速化が生じたことによる。他の標的：ＩＣＴ１０３１（ＧｅｎｅＢａｎｋ番号：ＡＫ０９０６９８、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３またはＴＮＦ関連増殖誘導リガンドおよびそれらのスプライシング変異体、図３参照）およびＩＣＴ１００３（ＧｅｎｅＢａｎｋ番号：ＡＫ０００８４７、ヒト新規ジンクフィンガータンパク質２３６またはそのスプライシング変異体）は、急速に増殖している腫瘍において総てアップレギュレートされ、これらの標的は抗体、小分子、アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他のアンタゴニスト薬に好適な標的として証明されている。
in vivoでのｓｉＲＮＡノックダウンにより試験した選択標的においては、ｎ＝８およびｎ＝１０（それぞれ、１コホートあたり８および１０腫瘍）の場合、４つの標的（ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３０およびＩＣＴ１０３１）が検証された（図３〜６参照）。２つのタンパク質は正反対の効果を有する細胞表面因子である。特異的ｓｉＲＮＡによるＩＣＴ１０３０ノックダウンによって腫瘍増殖の増強が生じたものと、これに対し、ＩＣＴ１０３１ノックダウンによって腫瘍増殖の阻害が引き起こされたものであった。その結果から、前者はタンパク質または遺伝子療法薬である可能性があり、後者は抗体または小分子薬物標的であると思われる。
選択した標的の１つ、ＩＣＴ１００３をin vivoでのｓｉＲＮＡノックダウンにより試験した（１コホートあたり８腫瘍）。標的ＩＣＴ１００３は新規ジンクフィンガータンパク質であり、転写因子であると思われる。特異的ｓｉＲＮＡによるＩＣＴ１００３ノックダウンによって、腫瘍増殖の阻害が生じた（図４参照）。その結果から、このタンパク質はｓｉＲＮＡ薬物標的または小分子薬物標的であると思われる。
実施例７：小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：
本明細書で開示される標的ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０３０、ＩＣＴ１０３１またはＩＣＴ１００３のＤＮＡ配列の標的領域に基づき（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８またはその断片を参照）、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ二本鎖を作製する。これらは、一般に、１００塩基対（「ｂｐ」）未満の長さおよび構成であり、好ましくは、約３０ｂｐ以下であり、相補的ＤＮＡ鎖の利用をはじめとする当技術分野で公知のアプローチまたは合成アプローチにより作製される。ポリ核酸改変技術を施行したｓｉＲＮＡ誘導体、例えば、ペプチド核酸を、本発明に従って使用することもできる。ｓｉＲＮＡは、干渉を生じ得るものであり、細胞内、例えば、哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および体内、例えば、哺乳類体内（ヒトを含む）において特定遺伝子の転写後サイレンシングを起こし得るものでもある。本発明の典型的なｓｉＲＮＡは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近もしくはその間のいずれかの整数値を有するものである。
標的領域はＤＮＡ配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８またはその断片）から選択される。種々の戦略は、標的領域を選択し、ｓｉＲＮＡオリゴ、例えば、５’または３’ＵＴＲを設計することによって進められるが、開始コドンに近い領域は調節タンパク質結合部位をより多く含むため、これらは避ける必要がある。設計された配列は、好ましくは、ＡＡ−（Ｎ２１以下のヌクレオチド）−ＴＴを含み、Ｇ／Ｃ含量が約３０％〜７０％である。好適な配列が見つからない場合には、断片の大きさを配列ＡＡ（Ｎ２９ヌクレオチド）まで拡大する。センスｓｉＲＮＡの配列は、例えば、（Ｎ２１ヌクレオチド）−ＴＴまたはＮ２９ヌクレオチド各々に相当する。後者のケースでは、センスｓｉＲＮＡの３’末端がＴＴに変換されている。この配列変換の理論的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称的な二本鎖を作製することにある。対称的な３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＰにほぼ等比のセンスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断を行って、小干渉リボヌクレオタンパク質粒子（ｓｉＲＮＰ）の作製を確保するのに役立っていると考えられる(Elbashir et al. Genes & Dev. 15: 188-200, 2001)。
ＩＣＴ１０２４ ｓｉＲＮＡ：本明細書で開示されるＤＮＡ配列の標的領域に基づき（配列番号３を参照）、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを設計する。これらは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近もしくはその間のいずれかの整数値を有する断片を含む。例えば、ｍＲＮＡのセンス鎖を標的化する２１ｂｐのｓｉＲＮＡとしては、
５’−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＧ−３’（配列番号２１）および
５’−ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２２）
が挙げられる。
ＩＣＴ１０２５ ｓｉＲＮＡ：本明細書で開示されるＤＮＡ配列の標的領域に基づき（配列番号３を参照）、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを設計する。これらは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近もしくはその間のいずれかの整数値を有する断片を含む。例えば、ｍＲＮＡのセンス鎖を標的化する２１ｂｐのｓｉＲＮＡとしては、
５’−ＡＡＣＴＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡ−３’（配列番号２３）および
５’−ＡＡＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号２４）
が挙げられる。
ＩＣＴ１０３０ ｓｉＲＮＡ：本明細書で開示されるＤＮＡ配列の標的領域に基づき（配列番号３を参照）、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを設計する。これらは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近もしくはその間のいずれかの整数値を有する断片を含む。例えば、２１ｂｐのｓｉＲＮＡとしては、
標的領域（塩基位置番号８８〜１０８、（配列番号９）５’−ａａｃｃｃｃｔｇｃｃａｃａａｃｇｇｔｇｇｔ−３’、およびその対応するセンスｓｉＲＮＡ（配列番号１０）、５’−ａａｃｃｃｃＵｇｃｃａｃａａｃｇｇＵｇｇＵ−３’；
標的領域（塩基位置番号１９０〜２１０、配列番号１１）５’−ａａｃｃａｃｔｇｔｇａｇａｃｇａａａｔｇｔ−３’、およびその対応するセンスｓｉＲＮＡ（配列番号１２）５’−ａａｃｃａｃＵｇＵｇａｇａｃｇａａａＵｇＵ−３’
が挙げられ、本明細書にて示されるように、これがこのままＩＣＴＥ１０３０コード配列の最後に続く。
ＩＣＴ１０３０−コード配列（配列番号３）に基づき、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡセットを設計する。
ＩＣＴ１０３１ ｓｉＲＮＡ：本明細書で開示されるＤＮＡ配列の標的領域に基づき（配列番号４を参照）、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを設計する。これらは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近もしくはその間のいずれかの整数値を有する断片を含む。例えば、２１ｂｐのｓｉＲＮＡとしては、
標的領域（塩基位置番号９０〜１１０、（配列番号１３）
５’−ａａｃｔｇｃｃｃｃａｇｃｇａｔｃｔｃｔｇｃ−３’、およびその対応するセンスｓｉＲＮＡ（配列番号１４）、５’−ａａｃＵｇｃｃｃｃａｇｃｇａＵｃＵｃＵｇｃ−３；
標的領域（塩基位置番号３３０〜３１０、（配列番号１５）
５’−ａａｃｃｔａａｔｔｃｔｃｃｔｇａｇｇｃｔｇ−３’、およびその対応するセンスｓｉＲＮＡ（配列番号１６）５’−ａａｃｃＵａａＵＵｃＵｃｃＵｇａｇｇｃＵｇ−３’
が挙げられ、本明細書にて示されるように、これがこのままＩＣＴＢ１０３１コード配列の最後に続く。
ＩＣＴ１０３１−コード配列（配列番号４）に基づき、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡセットを設計する。
ＩＣＴ１００３ ｓｉＲＮＡ：本明細書で開示されるＤＮＡ配列の標的領域に基づき（配列番号６を参照）、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを設計する。これらは、最大２９ｂｐ、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその付近もしくはその間のいずれかの整数値を有する断片を含む。例えば、２１ｂｐのｓｉＲＮＡとしては、
標的領域（塩基位置番号３４５〜３６５、（配列番号１７）５’−ａａｔｇｃｇｇａｇａａｃａｃｔａａｔｔａｔ−３’、およびその対応するセンスｓｉＲＮＡ（配列番号１８）、５’−ａａＵｇｃｇｇａｇａａｃａｃＵａａＵＵａＵ−３；
標的領域（塩基位置番号４６２〜４８２、（配列番号１９）５’−ａａｔｇａｃａａｇｃｃａｃａｔｃｇａｔｇｔ−３’、およびその対応するセンスｓｉＲＮＡ（配列番号２０）５’−ａａｔｇａｃａａｇｃｃａｃａｔｃｇａｔｇｔ−３’
が挙げられ、本明細書にて示されるように、これがこのままＩＣＴＢ１００３コード配列の最後に続く。
ＩＣＴＢ１００３−コード配列（配列番号６）に基づき、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡセットを設計する。
ＩＣＴ１０２４抗体の開発に関する試験詳細
ＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの発現ベクターの作製
１．１ プラスミドＤＮＡに基づく哺乳類遺伝子発現ベクターは、真核生物遺伝子プロモーターまたはウイルス遺伝子プロモーター、多重クローニング部位配列およびポリＡシグナル配列からなる。プロモーターとしては、限定されるものではないが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦプロモーター、Ｅ２ＦプロモーターおよびアデノウイルスのＥ１遺伝子プロモーターが挙げられる。ポリＡ配列としては、限定されるものではないが、ｂＧＨポリＡ、ＳＶ４０ポリＡおよび合成ポリＡが挙げられる。
１．２ ウイルスベクターに基づく哺乳類遺伝子発現ベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびバキュロウイルスベクターが挙げられる。
１．３ 細菌発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＱＥ系ベクター、ｐＧＥＸ系ベクターおよびｐＥＴＢｌｕｅベクターが挙げられる。
１．４ 酵母発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＥＳＣベクター、ｐ４２Ｋ−ＴＥＦおよびｐＦａｓｔＢａｃが挙げられる。
１．５ 原核生物プロモーターを利用した細胞質発現用ベクター。原核生物プロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｔ７プロモーター、ｓｐ６プロモーターが挙げられる。
実施例８ 哺乳類細胞発現およびＤＮＡワクチン接種用ｐＣＩベクターへのＩＣＴ１０２４全長ｃＤＮＡのクローニング
ＡＴＣＣから購入したｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：２０１９４）を鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４の全長ｃＤＮＡ（８５５ ａａ）を作製した。ＩＣＴ１０２４ ｃＤＮＡの全長が２５６８ｂｐであるため、ＰＣＲ反応中に起こり得る突然変異を減少させることを目的として、互いに連結して全長ＩＣＴ１０２４ ｃＤＮＡを生成し得るより短い２ＤＮＡ断片を作製するよう２対のプライマーを設計した。
プライマー１：１０２４ＥｃｏＵｐ２（２８マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１１１〜１２８ｎｔに相当する）（配列番号５４）
５’−−−Ｃ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ−−−３’
プライマー２：１０２４ＭｉｄＤｎ（２６マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７７０〜１７４５ｎｔに相当する）（配列番号５５）
５’−−−ＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＧ−−−３’
プライマー３：１０２４ＳａｌＤｎ（２９マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の２６７８〜２６６１ｎｔに相当する）（配列番号５６）
５’−−−ＣＣ ＧＧＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＴＣ−−−３’
プライマー４：１０２４ＭｉｄＵｐ（２６マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７５５〜１７８０ｎｔに相当する）（配列番号５７）
５’−−−ＣＡ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＧＡ ＴＧＡ−−−３’
プライマー１／プライマー２とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１１１〜１７７０ｎｔを含む１６７９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。プライマー３／プライマー４とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１７５５〜２６７８ｎｔを含む９２８ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１６７９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、９２８ｂｐ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、次いで、３断片連結反応によりＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したｐＣＩベクターにクローニングした。最終産物ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４プラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４発現プラスミドの制限地図については図１７を参照。ＩＣＴ１０２４タンパク質コード領域１６７０〜３６３７の配列（配列番号５８）については図２５を参照。
実施例９．ＩＣＴ１０２４のＮ末端ペプチド（５５３ ａａ）をコードするｃＤＮＡ断片の哺乳類細胞発現およびＤＮＡワクチン接種用ｐＣＩベクターへのクローニング
ＭＧＣ２０１９４ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４のＮ末端５５３ ａａをコードするｃＤＮＡを作製した。１対のプライマーを使用して、その５’末端にＥｃｏＲＩ部位およびその３’末端にＳａｌＩ部位を有する１６７９ｂｐのｃＤＮＡ断片を作製した。さらに、ＴＧＡ終止コドンをコード領域の終わりに組み込んで、翻訳の正確な停止を確保した。
プライマー１：１０２４ＥｃｏＵｐ２（２８マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１１１〜１２８ｎｔに相当する）（配列番号５４）
５’−−−Ｃ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ−−−３’
プライマー５：１０２４ＭＤｎＳａｌ（２９マー、ＳａｌＩ部位＋ＴＧＡ＋ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７６９〜１７５５ｎｔを含む）（配列番号５９）
５’−−−ＣＣ ＣＴＧ ＧＴＣＧＡＣ ＴＣＡ ｃｃｔ ｇｇｇ ａｔｃ ｃｔｇ ｇｔｇ−−−３’
プライマー１／プライマー５とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１１１〜１７６９ｎｔを含む１６７９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１６７９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したｐＣＩベクターにクローニングした。最終産物ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４ＮプラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４Ｎプラスミドの制限地図については図１８を参照。ＩＣＴ１０２４Ｎ末端５５３アミノ酸コード領域ｎｔ．１０７０〜２７３１の配列（配列番号６０）については図２６を参照。
実施例１０．大腸菌宿主でのタンパク質発現用ｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターへのＩＣＴ１０２４全長ｃＤＮＡのクローニング
ＡＴＣＣから購入したｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：２０１９４）を鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４の全長ｃＤＮＡ（８５５ ａａ）を作製した。ＩＣＴ１０２４ ｃＤＮＡの全長が２５６８ｂｐであるため、ＰＣＲ反応中に起こり得る突然変異を減少させることを目的として、互いに連結して全長ＩＣＴ１０２４ ｃＤＮＡを生成し得るより短い２ＤＮＡ断片を作製するよう２対のプライマーを設計した。
プライマー１：１０２４ＥｃｏＵｐ２（２８マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１１１〜１２８ｎｔに相当する）（配列番号５４）
５’−−−Ｃ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ−−−３’
プライマー２：１０２４ＭｉｄＤｎ（２６マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７７０〜１７４５ｎｔに相当する）（配列番号５５）
５’−−−ＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＧ−−−３’
プライマー３：１０２４ＳａｌＤｎ（２９マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の２６７８〜２６６１ｎｔに相当する）（配列番号５６）
５’−−−ＣＣ ＧＧＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣＧＴＣ−−−３’
プライマー４：１０２４ＭｉｄＵｐ（２６マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７５５〜１７８０ｎｔに相当する）（配列番号５７）
５’−−−ＣＡ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＧＡ ＴＧＡ−−−３’
プライマー１／プライマー２とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１１１〜１７７０ｎｔを含む１６７９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。プライマー３／プライマー４とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１７５５〜２６７８ｎｔを含む９２８ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１６７９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、９２８ｂｐ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、次いで、３断片連結反応によりＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクター(Amersham)にクローニングした。ｐＧＥＸ−５Ｘ−３は細菌発現ベクターであり、細菌ｔａｃプロモーターを利用してＧＳＴドメイン（２７Ｋｄ）融合タンパク質の発現を駆動する。最終産物ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４プラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
確認されたｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４の配列（配列番号６１）については図２７を参照。
実施例１１．ＩＣＴ１０２４のＮ末端ペプチド（５５３ ａａ）をコードするｃＤＮＡ断片の大腸菌でのタンパク質発現用ｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターへのクローニング
ＭＧＣ２０１９４ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４のＮ末端５５３ ａａをコードするｃＤＮＡを作製した。１対のプライマーを使用して、その５’末端にＥｃｏＲＩ部位およびその３’末端にＳａｌＩ部位を有する１６７９ｂｐのｃＤＮＡ断片を作製した。さらに、ＴＧＡ終止コドンをコード領域の終わりに組み込んで、翻訳の正確な停止を確保した。
プライマー１：１０２４ＥｃｏＵｐ２（２８マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１１１〜１２８ｎｔに相当する）（配列番号５４）
５’−−−Ｃ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ−−−３’
プライマー５：１０２４ＭＤｎＳａｌ（２９マー、ＳａｌＩ部位＋ＴＧＡ＋ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７６９〜１７５５ｎｔを含む）（配列番号５９）
５’−−−ＣＣ ＣＴＧ ＧＴＣＧＡＣ ＴＣＡ ｃｃｔ ｇｇｇ ａｔｃ ｃｔｇ ｇｔｇ−−−３’
プライマー１／プライマー５とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１１１〜１７６９ｎｔを含む１６７９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１６７９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターにクローニングした。最終産物ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４ＮプラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−１０２４Ｎの制限地図については図１４を参照。配列（配列番号６２）については図２８を参照。
実施例１２．ＩＣＴ１０２４のＣ末端ペプチド（３７２ ａａ）をコードするｃＤＮＡ断片の大腸菌でのタンパク質発現用ｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターへのクローニング
ＭＧＣ２０１９４ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４のＣ末端３７２ ａａをコードするｃＤＮＡを作製した。１対のプライマーを使用して、その５’末端にＥｃｏＲＩ部位およびその３’末端にＳａｌＩ部位を有する１１４１ｂｐのｃＤＮＡ断片を作製した。
プライマー６：１０２４ｍｉｄＥｃｏＵｐ（３０マー、ＥｃｏＲＩ部位 ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１５６０〜１５７７ｎｔを含む）（配列番号６３）
５’−−−ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＴＣ ＡＴＴ−−−３’
プライマー３：１０２４ＳａｌＤｎ（２９マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の２６７８〜２６６１ｎｔに相当する）（配列番号５６）
５’−−−ＣＣ ＧＧＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＴＣ−−−３’
プライマー６／プライマー３とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１５６０〜２６７８ｎｔを含む１１４１ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１１４１ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクターにクローニングした。最終産物ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４ＣプラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
確認されたｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４Ｃの配列については図１５を参照。配列（配列番号６４）については図２７を参照。
実施例１３．大腸菌宿主でのタンパク質発現用ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターへのＩＣＴ１０２４全長ｃＤＮＡのクローニング
ＡＴＣＣから購入したｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：２０１９４）を鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４の全長ｃＤＮＡ（８５５ ａａ）を作製した。ＩＣＴ１０２４ ｃＤＮＡの全長が２５６８ｂｐであるため、ＰＣＲ反応中に起こり得る突然変異を減少させることを目的として、互いに連結して全長ＩＣＴ１０２４ ｃＤＮＡを生成し得るより短い２ＤＮＡ断片を作製するよう２対のプライマーを設計した。
プライマー１：１０２４ＥｃｏＵｐ２（２８マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１１１〜１２８ｎｔに相当する）（配列番号５４）
５’−−−Ｃ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ−−−３’
プライマー２：１０２４ＭｉｄＤｎ（２６マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１７７０〜１７４５ｎｔに相当する）（配列番号５５）
５’−−−ＣＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＧ−−−３’
プライマー３：１０２４ＳａｌＤｎ（２９マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の２６７８〜２６６１ｎｔに相当する）（配列番号５６）
５’−−−ＣＣ ＧＧＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＴＣ−−−３’
プライマー８：１０２４ＣｌａＤｎ（３０マー、ＩＣＴ−１０２４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の２６７５〜２６５８ｎｔに相当する）（配列番号６５）
５’−−−ＣＧＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＴＣ ＣＡＧ−−−３’
プライマー１／プライマー２とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１１１〜１７７０ｎｔを含む１６７９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。プライマー３／プライマー８とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１７５５〜２６７５ｎｔを含む９２５ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１６７９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、９２８ｂｐ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化し、次いで、３断片連結反応によりＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで切断したｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクター(Novagen)にクローニングした。最終産物ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４プラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４プラスミドの制限地図については図２８を参照。配列（配列番号６６）については図３０を参照。
実施例１４．ＩＣＴ１０２４のＮ末端ペプチド（４００ ａａ）をコードするｃＤＮＡ断片の大腸菌でのタンパク質発現用ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターへのクローニング
ＭＧＣ２０１９４ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４のＮ末端４００ ａａをコードするｃＤＮＡを作製した。１対のプライマーを使用して、その５’末端にＥｃｏＲＩ部位およびその３’末端にＣｌａＩ部位を有する１２２１ｂｐのｃＤＮＡ断片を作製した。ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターの下流に停止コドンが存在しているため、停止コドンをコード領域の終わりに組み込まなかった。
プライマー１：１０２４ＥｃｏＵｐ２（２８マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１１１〜１２８ｎｔに相当する）（配列番号５４）
５’−−−Ｃ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ−−−３’
プライマー７：１０２４Ｃｌａ４００Ｄｎ（３０マー、ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５のｗ／１２９３〜１３１０ｎｔ）（配列番号６７）
５’−−−ＣＧＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＡＴ ＣＴＧ−−−３’
プライマー１／プライマー７とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１１１〜１３１０ｎｔを含む１２２１ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１２２１ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、次いでＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで切断したｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターにクローニングした。最終産物ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４ＮプラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４Ｎの制限地図については図１７を参照。配列（配列番号６８）については図３１を参照。
実施例１５．ＩＣＴ１０２４のＣ末端ペプチド（３７２ ａａ）をコードするｃＤＮＡ断片の大腸菌でのタンパク質発現用ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターへのクローニング
ＭＧＣ２０１９４ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２４のＣ末端３７２ ａａをコードするｃＤＮＡを作製した。１対のプライマーを使用して、その５’末端にＥｃｏＲＩ部位およびその３’末端にＣｌａＩ部位を有する１１３９ｂｐのｃＤＮＡ断片を作製した。ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターの下流に停止コドンが存在しているため、停止コドンをコード領域の終わりに組み込まなかった。
プライマー６：１０２４ｍｉｄＥｃｏＵｐ（３０マー、ＥｃｏＲＩ部位 ＩＣＴ１０２４遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の１５６０〜１５７７ｎｔを含む）（配列番号６３）
５’−−−ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＴＣ ＡＴＴ−−−３’
プライマー８：１０２４ＣｌａＤｎ（３０マー、ＩＣＴ−１０２４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４４２５の２６７５〜２６５８ｎｔに相当する）（配列番号６５）
５’−−−ＣＧＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＴＣ ＣＡＧ−−−３’
プライマー６／プライマー３とＭＧＣ ２０１９４鋳型を用いたＰＣＲ反応により、ＩＣＴ１０２４の１５６０〜２６７５ｎｔを含む１１３９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ産物の精製後、１１３９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで切断したｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターにクローニングした。最終産物ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４ＣプラスミドＤＮＡを同定し、その配列をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４Ｃプラスミドの制限地図については図１８を参照。配列（配列番号６９）については図３２を参照。
ＩＣＴ１０２４タンパク質およびペプチドの製造および精製
ＩＣＴ１０２４特異的抗体を従来の方法を用いて産生させるための抗原として、精製したＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドが必要である。ＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドは種々の発現系により生産することができ、その発現系としては、限定されるものではないが、哺乳類培養細胞、酵母、昆虫細胞および大腸菌細胞が挙げられる。ＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの作製には、タンパク質の抗原性が保持される精製方法のみ使用される。一般に、第１段階は、全長１０２４ ｃＤＮＡまたはＩＣＴ１０２４ペプチドをコードするｃＤＮＡの断片を有する発現ベクターをそれらの対応する宿主系に導入することである。例えば、哺乳類発現ベクターは、リポソームを介したトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによるトランスフェクションなどの標準的なトランスフェクション手順を用いて２９３細胞に導入される。第２段階は、発現ベクターを有する宿主細胞を増幅することである。一例が発現ベクターで形質転換した酵母または大腸菌宿主細胞の発酵である。誘導可能な発現ベクターを使用している場合、第３段階は、宿主細胞において組換え型タンパク質の発現を誘導することである。組換え型タンパク質が宿主細胞に対する毒性を有する場合、このことが特に重要である。次の段階は、宿主細胞溶解物から組換え型タンパク質を単離することである。組換え型タンパク質が融合タンパク質として作製された場合、最終段階は、融合ドメインを取り出し、所望の組換え型タンパク質またはペプチドを精製することである。
実施例１６．ｐＧＥＸ−５Ｘ−３／ＢＬ２１細胞を利用したＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの製造
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合系(Amersham)は、大腸菌で生産された融合タンパク質の発現、精製および検出向けの汎用性の高い系である。この系は、ＧＳＴと、アミノ末端のＧＳＴ部分とカルボキシル末端の目的のタンパク質との融合物として、遺伝子または遺伝子断片の誘導可能な高レベル発現を提供する。ＧＳＴ融合タンパク質は、固定化グルタチオンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細菌溶解物から精製される。ＧＳＴ融合タンパク質はグルタチオンにより捕捉され、洗浄により不純物が除去される。穏和な、非変性条件下での融合タンパク質の溶出には還元型グルタチオンを使用し、タンパク質の腫瘍原性を保持する。抗体産生用の抗原としてＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドを作製するため、部位特異的プロテアーゼ（その認識配列はｐＧＥＸプラスミドの多重クローニング部位のすぐ上流に位置する）を使用してＧＳＴからＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドを切断する。
適切なＧＳＴ発現コロニーについてのスクリーニング
Amershamにより提供される標準的なプロトコールを用いて、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４、ｐＧＥＸ−５ｘ−３−１０２４ＮまたはｐＧＥＸ−５ｘ−３−ＩＣＴ１０２４Ｃを宿主細胞大腸菌ＢＬ２１に形質転換する。
１２の単一コロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地２ｍｌに接種し、ＯＤ５９５が０．６に達するまで、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にてインキュベートする。
ＩＰＴＧ誘導（Ｉ）用および非誘導（ＮＩ）用に、培養物を１ｍｌ量のもの２つに分ける。「Ｉ」チューブに終濃度０．１〜０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加する。
振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて３時間インキュベーションを続けた後、培養物を１．５ｍｌマイクロチューブに移し、１４，０００ｒｐｍにて１分間の遠心分離により細胞を回収する。
この細胞ペレットにタンパク質サンプルバッファー２００μｌを添加し、細胞を懸濁した後、１００℃にて２〜５分間サンプルを煮沸する。
各サンプル１５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、平行するレーンにタンパク質分子量マーカーを添える。ゲルを泳動した後、クーマシーブルーでゲルを染色する。ＧＳＴタンパク質単独での分子量は２６Ｋｄであり、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４の融合タンパク質の分子量は１２２ｋｄであり、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４Ｎの融合タンパク質の分子量は８８Ｋｄであり、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４Ｃの融合タンパク質の分子量は５７Ｋｄである。
ＧＳＴ融合タンパク質各々の製造には、最高レベルのＧＳＴ融合タンパク質発現を示す各クローンを選択する。
ＧＳＴ−融合タンパク質の単離
選択した単一コロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ１００ｍｌに接種し、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて一晩インキュベートする。
一晩培養物２５ｍｌを２−Ｌフラスコに入った１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有予温ＬＢ １リットルに移し、ＯＤ５９５が０．６に達するまで、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にてインキュベートする。
終濃度０．１〜０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加してＧＳＴ融合タンパク質発現を誘導し、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて３時間インキュベートする。
３，６００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離（Ｓｅｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローター）により細胞を回収する。
プロテアーゼ阻害剤を添加したＲ．Ｓ．２０ｍｌに細胞を再懸濁する（Ｒ．Ｓ．バッファーおよびＲ．Ｓ．バッファーカクテルについては別表を参照）。
サンプルを６回、各回３０秒間超音波処理する。超音波処理中はサンプルを氷上に置き、各回超音波処理済みサンプルを混合する。
超音波処理したサンプルをＳｅｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローターを用いて１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移す。
上清にグルタチオン−アガロースビーズスラリー（ＧＳＨ−アガロース粉末、ｓｉｇｍａ Ｇ４５１０、ビーズ７０ｍｇをＲＳ ４ｍｌで平衡化し、１５−ｍｌチューブに入れ、室温にて１時間〜一晩、２〜３回バッファーを取り替えて戻す。その結果、緻密な膨張ビーズスラリー１ｍｌが得られ、このビーズスラリーは５０％スラリーとして１ヶ月間保存できる。この材料は５０ｍｌチューブ内、樹脂１ｍｌ当たり上清１．５〜２．０リットル（３７．５〜５０ｍｌ）で使用する。）を添加する。
スーパー／スラリーを回転装置で４０℃にて０．５〜２時間ゆっくりと混合する。
１，５００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、２回、各回ＲＳ １０ｍｌでバッチ洗浄する。ＲＳ １０ｍｌを添加し、サンプルを懸濁し、カラムに載せる。
ＲＳ １０ｍｌでカラムを洗い流す。
ＲＳ中５０ｍＭ ＧＳＨ（ｐＨ ８．０、ＮａＯＨにより調整）でカラムを溶出する。
手動またはフラクションコレクターにより０．５ｍｌ画分を収集する。ＧＳＴ融合タンパク質は画分５〜１１中に溶出されるはずである。
各画分の２μｌアリコートをマイクロプレートの穴に入れ、１×Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Biorad試薬の１：５希釈物）１００μｌを添加することによりＧＳＴ融合タンパク質を確認し、混合物の色をチェックする。
ＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドからＧＳＴを取り除くため、スーパー／スラリー混合物を、バッチ洗浄後、トロンビン切断バッファー（Ｔ．Ｃ．Ｂ．、別表を参照）で１回洗浄する。次いで、Ｔ．Ｃ．Ｂ．２ｍｌおよびトロンビン（０．７６８μｇ／μｌ）１０μｇ（１３μｌ）を添加し、室温にて１．５時間振盪する。(Thrumbin, human, lyoph, Cat: 605195, Calbiochem Corp.)
別表：
Figure 2007525447
Figure 2007525447
Figure 2007525447
実施例１７．ｐＥＴＢｌｕｅ−２／ＢＬ２１細胞を利用したＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの製造
ＩＣＴ１０２４はＲＨＯファミリーに属する膜結合性プロテイナーゼである。ｐＧＥＸ−５Ｘ−３／ＢＬ２１発現系における本発明者らの予備データは、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４融合タンパク質が細菌宿主に対する高い毒性を有することから、ＤＨ５α−Ｔ１またはＢＬ２１細胞において、ＩＰＴＧ誘導により高レベルのＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４融合タンパク質発現を得ることが難しいことを示した。この毒性の問題はｐＥＴＢｌｕｅ系(Novagen)によりを解決できそうである。ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２ベクターは、バクテリオファージＴ７プロモーターを利用して目的の遺伝子の発現を駆動するベクターである。ＩＰＴＧにより誘導すると、ＢＬ（ＤＥ３）細胞ではバクテリオファージＴ７ポリメラーゼのみ発現する。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を使用すれば、発現したＴ７リゾチームによりＴ７ポリメラーゼ活性がさらに抑えられる。この系のこれら総ての特徴によって、目的のタンパク質の発現が極めて選択的で厳しく制御されたものとなり、本発明者の目的に有利に働く、言い換えれば、毒性の高いタンパク質を発現させる。ｐＥＴＢｌｕｅ−２を使用するもう１つの利点は、青／白コロニーに基づくプラスミド構築物の選択に使用されるＬａｃＺ遺伝子産物、β−ガラクトシダーゼのα−相補性が利用できることである。さらに、作製された融合タンパク質のＣ末端にはインフレームタグ：タンデムに連結されたＨＳＶタグおよびＨｉｓタグが付く。これらのタグは、融合産物各々の精製および検出に使用することができる。
Novagenにより提供される標準的なプロトコールを用いて、ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４、ｐＥＴＢｌｕｅ−２−１０２４ＮまたはｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４ＣプラスミドＤＮＡを宿主細胞大腸菌ＢＬ２１に形質転換する。ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターは、弱い構成的大腸菌プロモーター（ｔｅｔ）を利用してｌａｃＺ α−ペプチドの発現を駆動し、一方、ＩＣＴ１０２４遺伝子の発現がＴ７１ａｃプロモーターにより反対方向に駆動されるベクターであるため、形質転換されたクローンが青／白コロニースクリーニングにより視覚的に容易に確認される。多重クローニング部位（ＭＣＳ）にＩＣＴ１０２４配列が挿入されるとｌａｃＺ α−ペプチドの発現が阻止され、Ｘ−ｇａｌの存在下でプレーティングした場合には株ＤＨ５ａにおいて白色コロニー表現型を生じる。挿入されていないベクターに由来するコロニーは青色に変わる。Ｔ７によるタンパク質発現にはインサートがｔｅｔプロモーターに対してアンチセンス方向でクローニングされることが必要であるため、ＩＣＴ１０２４配列の基底発現は事実上生じない。ｐＥＴＢｌｕｅ−２プラスミドに存在する高コピー性ｐＵＣ複製起点はプラスミドの収量を大幅に高めるため、ＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの発現も高まる。
挿入された配列がＴ７ｌａｃプロモーターに対してセンス方向であり、リーディングフレームがｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターの翻訳要件を満たしているため、ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターにおけるＩＣＴ１０２４遺伝子または断片は高レベルに発現される。タンパク質発現は、組換え型ｐＥＴＢｌｕｅ−２プラスミドを宿主株Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）ｐＬａｃＩまたはＯｒｉｇａｍｉ（商標）（ＤＥ３）ｐＬａｃＩに形質転換した後、ＩＰＴＧにより誘導を行うことで実現される。これらの宿主は、ｌａｃＵＶ５制御下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有しており、和合性ｐＬａｃＩプラスミドを介して十分なｌａｃリプレッサーを供給し、非誘導時の発現を確実に低く抑える。Ｔｕｎｅｒ株のｌａｃＹは培養を通じて標的タンパク質の用量依存的な特有のＩＰＴＧ誘導を可能にし、Ｏｒｉｇａｍｉ株は細胞質内でのジスルフィド結合の形成を促進する。
さらに、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２４ＮおよびＩＣＴ１０２４Ｃインサートは総て、内部に停止コドンがないため、Ｃ末端ＨＳＶタグ（登録商標）エピトープおよびＨｉｓタグ（登録商標）配列とともにインフレームでクローニングされた。ＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドは、そのＣ末端にあるＨＳＶタグおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現される。ＩＣＴ１０２４タンパク質およびペプチドは、Novagenの標準的な手順に従って、単離し、精製する。
実施例１８．２９３細胞を利用したＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの製造
大腸菌から組換え型タンパク質を精製する際に、穏和な、非変性条件を用いてそれらの抗原性を保持した場合でも、組換え型タンパク質の溶解度の低さまたはアンフォールディングの不十分さから精製したタンパク質がそれらの抗原性を喪失することが多かった。組換え型タンパク質のこの困難は、発現用に哺乳類培養系を利用することで克服することができるが、このような系からの組換え型タンパク質の収量は、通常、大腸菌発現系の場合よりもずっと低い。
Ｉ．エレクトロポレーションアプローチを利用したＨＥＫ ２９３細胞のトランスフェクション
１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を増殖させる。
ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、トリプシンを添加し、
１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地でトリプシンを失活させる。
２．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地（抗生物質は含まない）で細胞を数回洗浄する。
２．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を５×１０６細胞／ｍｌの密度に再懸濁する。
細胞２００ｕｌをエレクトロポレーション用滅菌キュベット（ＢＴＸ キュベットモデル＃６２０：２ｍｍギャップ）に移す。そのキュベットにプラスミドＤＮＡ（ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４、ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４ＮまたはｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４Ｃ）１０μｇを添加し、十分に混合する。細胞とＤＮＡを室温にて１０分間インキュベートした後、エレクトロポレーションを行う。
Figure 2007525447
エレクトロポレーション後、細胞を回収し、室温にて１０分間インキュベーションを行う。
トランスフェクトされた細胞（１×１０６）を１０％血清含有予温ＲＰＭＩ培地２ｍｌの入った６穴プレートの１つの穴に入れ、３７℃、５％Ｃ０２インキュベーター内で４８時間インキュベートする。
II．細胞膜からのタンパク質抽出
ＩＣＴ１０２４タンパク質は膜結合性タンパク質であり、そのＣ末端残基の大部分が膜中に存在するため、トランスフェクトされた細胞で発現したＩＣＴ１２０４タンパク質およびＣ末端ペプチドを、Ｍ−ＰＥＲ真核生物膜タンパク質抽出試薬キット（カタログ番号８９８２６，ＰＩＥＲＣＥ）を使用して細胞膜から抽出する必要がある。
回収した細胞の懸濁液を８５０×ｇにて２分間遠心分離し、１サンプル当たり５×１０６細胞を単離する。１．７ｍｌ円錐型微量遠心チューブに入れ、細胞（ＰＢＳで洗浄済み）をペレット化する。
上清を慎重に取り除き、廃棄する。
細胞ペレットに試薬Ａ １５０μｌを添加する。ピペットで上下操作を行って、均質な細胞懸濁液を得る。時々攪拌しながら、室温にて１０分インキュベートする。
溶解した細胞を氷上に置く。
試薬Ｃを試薬Ｂで２対１希釈し、各サンプルが４５０μｌを受けるのに十分な混合物を作製する（例えば、１０回抽出する場合には、試薬Ｃ ３．３３ｍｌを試薬Ｂ １．６７ｍｌと合わせる）。注意：試薬Ｃは４℃で保存するか、または常に氷上に置いておく。
希釈した試薬Ｃ ４５０μｌを溶解した細胞の各チューブに添加し、攪拌する。５分おきに攪拌しながら、氷上で３０分間チューブをインキュベートする。
チューブを４℃、１０，０００×ｇにて３分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移す。
上清を３７℃にて１０分間インキュベートし、膜タンパク質画分を分離する。
チューブを室温、１０，０００×ｇにて２分間遠心分離し、親水性画分から疎水性画分（すなわち、目的の膜タンパク質を含有する画分）を単離する。
疎水性タンパク質相（最下層）から親水性相（最上層）を慎重に取り出し、新しいチューブに保存する。層の界面は室温にて徐々になくなるため、可能な限り速やかに相分離を行う。分離した画分を氷上に置く。
注意：膜タンパク質の大部分が低粘性相に含まれているはずである。
注意：膜タンパク質の解析には疎水性画分を使用する。
III．全細胞からのタンパク質抽出
ＩＣＴ１０２４のＮ末端ペプチドは細胞膜と強く結合していないと思われるため、Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（カタログ番号：７８５０１，ＰＩＥＲＣＥ）を使用して細胞溶解物から単離することは非常に容易である。
接着細胞から培養培地を慎重に取り除く（デカントする）。
細胞をＰＢＳで１回洗浄する。
Ｍ−ＰＥＲ（商標）試薬３００μｌを各プレートの穴（６穴プレート）に添加する。
５分間ゆっくりと振盪する。
溶解物を集め、微量遠心チューブに移す。
サンプルを２７，０００ｇにて５〜１０分間遠心分離し、細胞残屑をペレット化する。
さらなる解析（ＳＤＳ ｐａｇｅまたはウエスタンブロット解析）用に上清を清浄なチューブに移す。
IV．ＳＤＳ−ＰａｇｅゲルからのＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドの単離
タンパク質サンプルを２×ＳＤＳサンプルバッファーで１：１希釈し、サンプルと分子量標準を１００℃にて５分間を加熱する。
このサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せる。
色素が分離ゲルに入るまで、１０ｍＡにてゲルを泳動する。次いで、電流を１５ｍＡに上げる。色素が分離ゲルの底に達したら、電源を切り、ゲルサンドイッチを取り出す。
スペーサーの１つを利用してサンドイッチを慎重に開き、プレートをこじ開ける。スタッキングゲルを優しく切り取り、分離ゲルを染色用の小型プラスチック容器に入れる。
ゲルを定着液に浸し、１５分間ゆっくりと振盪する。
定着液を捨て、そのゲルをクーマシーブルー染色液に浸す。少なくとも２時間ゆっくりと振盪する。染色液を捨て、そのゲルを洗浄液に浸す。
所望のタンパク質のバンドを含むゲル断片を切り取り、標準的な手順を用いて、そのゲルからタンパク質を抽出する。
実施例１９ ＩＣＴ１０２４抗体の製造
精製したＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドを使用してＩＣＴ１０２４抗体を作製する。ＩＣＴ１０２４全長ｃＤＮＡまたは断片を有する哺乳類発現ベクターを使用し、ＤＮＡワクチン接種方法を利用して、直接ＩＣＴ１０２４抗体を産生させる。加えて、ＩＣＴ１０２４抗体を産生させるための抗原として、一連のＩＣＴ１０２４ペプチド（１５ ａａ〜３０ ａａ）を化学合成する。さらに、ＩＣＴ１０２４が膜タンパク質であることから、ＩＣＴ１０２４特異的イントラボディ（単鎖Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ）の細胞内発現用にプラスミドＤＮＡを構築し、ＩＣＴ１０２４の細胞内ドメインに向ける。
作製するＩＣＴ１０２４抗体としては、限定されるものではないが、マウスポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ウサギポリクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリＩｇＹ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。
実施例２０．マウスの直接ＤＮＡワクチン接種によるＩＣＴ１０２４抗体の作製
プラスミドＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、病原体そのものまたは精製タンパク質を使用した従来のワクチンの優れた代替物であることが分かっている。従来の方法よりもＤＮＡワクチン接種の有利な点を以下に列挙する：
簡易：ＤＮＡ配列のベクター（プラスミドまたはウイルス）へのサブクローニングが、抗原タンパク質の精製を行うことが冗長で非常に困難なことが多かった従来の方法よりもずっと容易である。
より安全：個々のタンパク質が感染を引き起こす危険性が低い。ワクチン接種用に特定のエピトープ配列を選択する場合、天然タンパク質に毒性がもしあるならば、最小限に抑える方がよい。
自然：研究により、ＤＮＡワクチンからin situ産生した抗原（タンパク質またはポリペプチド）が天然構造を示し、必要な翻訳後修飾が自然感染中に宿主により行われることが示されている。
ＤＮＡワクチンを陽イオン性脂質、遺伝子ガンまたはジェット式注射によって送達した場合に免疫応答が増強したことが報告されているが、in vitroおよびin vivoＤＮＡトランスフェクションではエレクトロポレーションがずば抜けて最も効率的な方法である。プラスミドＤＮＡ注射とエレクトロポレーション送達を組み合わせることで、筋肉、皮膚、腫瘍異種移植他などの異なる組織に対して納得のいく良い成果が得られた。
ＤＮＡワクチンとエレクトロポレーションを組み合わせることで、マウスにおいてポリクローナル抗体を生産させるための便宜でスピーディーな方法が提供されるため、従って、組織内で見つけられた、疾病診断または治療に適用される可能性のある抗体標的についてスクリーニングするのにこのアプローチを使用することができる。
手順
Ｂａｌｂ／ｃマウスに麻酔をかけた後、マウス背部の皮膚片をそぎ、皮膚領域を露出させる。１マウスにつき５箇所をそいだ。そいだ各領域の皮膚層に１−ｍｌシリンジと３０．５ゲージ針を使用して、２０μｌ生理食塩水中ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４、ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４ＮまたはｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４ＣプラスミドＤＮＡ ２ｕｇを皮下経路経由で注射する。次いで、注射後、注射した領域に直接エレクトロポレーションを適用する。その際のパラメータは：電圧＝１００Ｖ、パルス長＝２０ｍｓ、パルス数＝３およびパルス間隔＝８００ｍｓに設定する。
７日後にＤＮＡワクチン接種（免疫化）手順を繰り返し、１ヶ月後にもう一度繰り返した。免疫化の効果を試験するため、最後のＤＮＡワクチン接種の７日後に血液サンプルを採取する。別の試験では、最後の追加免疫を同じＤＮＡによって事前にトランスフェクトしたマウスまたはヒト腫瘍細胞の溶解物を注射することにより行った。
ＤＮＡ発現による免疫化の効果をＥＬＩＳＡ法、ウエスタン法または機能解析様細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイにより試験した。ＥＬＩＳＡ法では、後に、免疫化したマウスの血清から精製した免疫グロブリンに存在する抗体により検出されることとなる抗原の供給源としてのトランスフェクトｃｏｓ−７細胞または２９３細胞の未精製溶解物でプラスチック支持体表面をコーティングした。別の試験では、免疫化したマウスから採取した抗血清を使用して、トランスフェクトｃｏｓ−７または２０３細胞の溶解物中に存在するＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチド（抗原）を沈降させた。沈降した標的は、その後、ウエスタンブロット法によって検出される。
ＩＣＴ１０２４に対して特異的な抗体は、従来の方法、ＤＥＡＥイオン交換カラム、プロテイン−Ａアフィニティーカラム他を用いて精製することができる。純粋な抗体は、ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体を作製した後に得ることができる。
実施例２１．ＩＣＴ１０２４に対するウサギモノクローナル抗体の作製
ＩＣＴ１０２４に対するウサギモノクローナル抗体を作製するため、ＩＣＴ１０２４全長ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を有する発現ベクターをウサギ細胞系統２４０Ｅにトランスフェクトする。生じたトランスフェクト細胞をプールし、これを使用してウサギを免疫化する。細胞系統２４０Ｅ由来の内因性タンパク質は免疫反応を誘導せず、発現されたヒトタンパク質だけがウサギによって抗原として認識される。高融合効率で、優れた安定性のハイブリドーマと豊富な抗体産生細胞とを組み合わせることで、１羽のウサギを免疫化するための抗原を多様化することが可能である。
実施例２２．抗原としてＩＣＴ１０２４タンパク質またはペプチドを用いた、ＩＣＴ１０２４に対するマウスモノクローナル抗体の作製
従来の方法を使用して、ＩＣＴ１０２４タンパク質に対するマウスポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、精製する。また、本発明者らはＩＣＴ１０２４タンパク質に対するマウスポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、精製するために、ＩＣＴ１０２４タンパク質の異なるドメインに対応する化学合成したＩＣＴ１０２４ペプチドも利用する。このようにする目的は、ＩＣＴ１０２４タンパク質との高い結合親和性、さらに重要なことには、抗体／抗原特異的結合を通じてＩＣＴ１０２４タンパク質の生物学的機能を遮断する能力で示される、ＩＣＴ１０２４に対する最良のモノクローナル抗体をスクリーニングすることである。
実施例２３．哺乳類細胞発現およびＤＮＡワクチン接種用ｐＣＩベクターへのＩＣＴ１０２５全長ｃＤＮＡのクローニング
ＡＴＣＣから購入したｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：２０１９４）を鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ＩＣＴ１０２５の全長ｃＤＮＡ（８０３ ａａ）を作製した。ＩＣＴ１０２５ ｃＤＮＡの全長が２７８０ｂｐであるため、ＰＣＲ反応中に起こり得る突然変異を減少させることを目的として、互いに連結して全長ＩＣＴ１０２５ ｃＤＮＡを生成し得るより短い２ＤＮＡ断片を作製するよう２対のプライマーを設計した。
確認されたｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５発現プラスミドの配列については図２０を参照。
ＩＣＴ１０２５タンパク質およびペプチドの製造および精製
ＩＣＴ１０２５特異的抗体を従来の方法を用いて産生させるための抗原として、精製したＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドが必要である。ＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドは種々の発現系により生産することができ、その発現系としては、限定されるものではないが、哺乳類培養細胞、酵母、昆虫細胞および大腸菌細胞が挙げられる。ＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドの作製には、タンパク質の抗原性が保持される精製方法のみ使用される。一般に、第１段階は、全長１０２５ ｃＤＮＡまたはＩＣＴ１０２５ペプチドをコードするｃＤＮＡの断片を有する発現ベクターをそれらの対応する宿主系に導入することである。例えば、哺乳類発現ベクターは、リポソームを介したトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによるトランスフェクションなどの標準的なトランスフェクション手順を用いて２９３細胞に導入される。第２段階は、発現ベクターを有する宿主細胞を増幅することである。一例が発現ベクターで形質転換した酵母または大腸菌宿主細胞の発酵である。誘導可能な発現ベクターを使用している場合、第３段階は、宿主細胞において組換え型タンパク質の発現を誘導することである。組換え型タンパク質が宿主細胞に対する毒性を有する場合、このことが特に重要である。次の段階は、宿主細胞溶解物から組換え型タンパク質を単離することである。組換え型タンパク質が融合タンパク質として作製された場合、最終段階は、融合ドメインを取り出し、所望の組換え型タンパク質またはペプチドを精製することである。
実施例２４．ｐＧＥＸ−５Ｘ−３／ＢＬ２１細胞を利用したＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドの製造
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合系(Amersham)は、大腸菌で生産された融合タンパク質の発現、精製および検出向けの汎用性の高い系である。この系は、ＧＳＴと、アミノ末端のＧＳＴ部分とカルボキシル末端の目的のタンパク質との融合物として、遺伝子または遺伝子断片の誘導可能な高レベル発現を提供する。ＧＳＴ融合タンパク質は、固定化グルタチオンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細菌溶解物から精製される。ＧＳＴ融合タンパク質はグルタチオンにより捕捉され、洗浄により不純物が除去される。穏和な、非変性条件下での融合タンパク質の溶出には還元型グルタチオンを使用し、タンパク質の腫瘍原性を保持する。抗体産生用の抗原としてＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドを作製するため、部位特異的プロテアーゼ（その認識配列はｐＧＥＸプラスミドの多重クローニング部位のすぐ上流に位置する）を使用してＧＳＴからＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドを切断する。
適切なＧＳＴ発現コロニーについてのスクリーニング
Amershamにより提供される標準的なプロトコールを用いて、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４、ｐＧＥＸ−５ｘ−３−１０２４ＮまたはｐＧＥＸ−５ｘ−３−ＩＣＴ１０２４Ｃを宿主細胞大腸菌ＢＬ２１に形質転換する。
１２の単一コロニーを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地２ｍｌに接種し、ＯＤ５９５が０．６に達するまで、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にてインキュベートする。
ＩＰＴＧ誘導（Ｉ）用および非誘導（ＮＩ）用に、培養物を１ｍｌ量のもの２つに分ける。「Ｉ」チューブに終濃度０．１〜０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加する。
振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて３時間インキュベーションを続けた後、培養物を１．５ｍｌマイクロチューブに移し、１４，０００ｒｐｍにて１分間の遠心分離により細胞を回収する。
この細胞ペレットにタンパク質サンプルバッファー２００ｕｌを添加し、細胞を懸濁した後、１００℃にて２〜５分間サンプルを煮沸する。
各サンプル１５ｕｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、平行するレーンにタンパク質分子量マーカーを添える。ゲルを泳動した後、クーマシーブルーでゲルを染色する。ＧＳＴタンパク質単独での分子量は２６Ｋｄであり、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２５の融合タンパク質の分子量は１２２ｋｄであり、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４Ｎの融合タンパク質の分子量は８８Ｋｄであり、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２４Ｃの融合タンパク質の分子量は５７Ｋｄである。
ＧＳＴ融合タンパク質各々の製造には、最高レベルのＧＳＴ融合タンパク質発現を示す各クローンを選択する。
ＧＳＴ−融合タンパク質の単離
選択した単一コロニーを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ１００ｍｌに接種し、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて一晩インキュベートする。
一晩培養物２５ｍｌを２−Ｌフラスコに入った１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン含有予温ＬＢ １リットルに移し、ＯＤ５９５が０．６に達するまで、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にてインキュベートする。
終濃度０．１〜０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加してＧＳＴ融合タンパク質発現を誘導し、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃にて３時間インキュベートする。
３，６００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離（Ｓｅｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローター）により細胞を回収する。
プロテアーゼ阻害剤を添加したＲ．Ｓ．２０ｍｌに細胞を再懸濁する（Ｒ．Ｓ．バッファーおよびＲ．Ｓ．バッファーカクテルについては別表を参照）。
サンプルを６回、各回３０秒間超音波処理する。超音波処理中はサンプルを氷上に置き、各回超音波処理済みサンプルを混合する。
超音波処理したサンプルをＳｅｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローターを用いて１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移す。
上清にグルタチオン−アガロースビーズスラリー（ＧＳＨ−アガロース粉末、ｓｉｇｍａ Ｇ４５１０、ビーズ７０ｍｇをＲＳ ４ｍｌで平衡化し、１５−ｍｌチューブに入れ、室温にて１時間〜一晩、２〜３回バッファーを取り替えて戻す。その結果、緻密な膨張ビーズスラリー１ｍｌが得られ、このビーズスラリーは５０％スラリーとして１ヶ月間保存できる。この材料は５０ｍｌチューブ内、樹脂１ｍｌ当たり上清１．５〜２．０リットル（３７．５〜５０ｍｌ）で使用する。）を添加する。
スーパー／スラリーを回転装置で４０℃にて０．５〜２時間ゆっくりと混合する。
１，５００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、２回、各回ＲＳ １０ｍｌでバッチ洗浄する。ＲＳ １０ｍｌを添加し、サンプルを懸濁し、カラムに載せる。
ＲＳ １０ｍｌでカラムを洗い流す。
ＲＳ中５０ｍＭ ＧＳＨ（ｐＨ ８．０、ＮａＯＨにより調整）でカラムを溶出する。
手動またはフラクションコレクターにより０．５ｍｌ画分を収集する。ＧＳＴ融合タンパク質は画分５〜１１中に溶出されるはずである。
各画分の２ｕｌアリコートをマイクロプレートの穴に入れ、１×Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Biorad試薬の１：５希釈物）１００ｕｌを添加することによりＧＳＴ融合タンパク質を確認し、混合物の色をチェックする。
ＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドからＧＳＴを取り除くため、スーパー／スラリー混合物を、バッチ洗浄後、トロンビン切断バッファー（Ｔ．Ｃ．Ｂ．、別表を参照）で１回洗浄する。次いで、Ｔ．Ｃ．Ｂ．２ｍｌおよびトロンビン（０．７６８μｇ／μｌ）１０μｇ（１３ｕｌ）を添加し、室温にて１．５時間振盪する。(Thrumbin, human, lyoph, Cat: 605195, Calbiochem Corp.)
実施例２５．ｐＥＴＢｌｕｅ−２／ＢＬ２１細胞を利用したＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドの製造
ＩＣＴ１０２５はＲＨＯファミリーに属する膜結合性プロテイナーゼである。ｐＧＥＸ−５Ｘ−３／ＢＬ２１発現系における本発明者らの予備データは、ＧＳＴ−ＩＣＴ１０２５融合タンパク質が細菌宿主に対する高い毒性を有することから、ＤＨ５α−Ｔ１またはＢＬ２１細胞において、ＩＰＴＧ誘導により高レベルのＧＳＴ−ＩＣＴ１０２５融合タンパク質発現を得ることが難しいことを示した。この毒性の問題はｐＥＴＢｌｕｅ系(Novagen)によりを解決できそうである。ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２ベクターは、バクテリオファージＴ７プロモーターを利用して目的の遺伝子の発現を駆動するベクターである。ＩＰＴＧにより誘導すると、ＢＬ（ＤＥ３）細胞ではバクテリオファージＴ７ポリメラーゼのみ発現する。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を使用すれば、発現したＴ７リゾチームによりＴ７ポリメラーゼ活性がさらに抑えられる。この系のこれら総ての特徴によって、目的のタンパク質の発現が極めて選択的で厳しく制御されたものとなり、本発明者の目的に有利に働く、言い換えれば、毒性の高いタンパク質を発現させる。ｐＥＴＢｌｕｅ−２を使用するもう１つの利点は、青／白コロニーに基づくプラスミド構築物の選択に使用されるＬａｃＺ遺伝子産物、β−ガラクトシダーゼのα−相補性が利用できることである。さらに、作製された融合タンパク質のＣ末端にはインフレームタグ：タンデムに連結されたＨＳＶタグおよびＨｉｓタグが付く。これらのタグは、融合産物各々の精製および検出に使用することができる。
Novagenにより提供される標準的なプロトコールを用いて、ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２５、ｐＥＴＢｌｕｅ−２−１０２５ＮまたはｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２５ＣプラスミドＤＮＡを宿主細胞大腸菌ＢＬ２１に形質転換する。ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターは、弱い構成的大腸菌プロモーター（ｔｅｔ）を利用してｌａｃＺ α−ペプチドの発現を駆動し、一方、ＩＣＴ１０２５遺伝子の発現がＴ７１ａｃプロモーターにより反対方向に駆動されるベクターであるため、形質転換されたクローンが青／白コロニースクリーニングにより視覚的に容易に確認される。多重クローニング部位（ＭＣＳ）にＩＣＴ１０２５配列が挿入されるとｌａｃＺ α−ペプチドの発現が阻止され、Ｘ−ｇａｌの存在下でプレーティングした場合には株ＤＨ５ａにおいて白色コロニー表現型を生じる。挿入されていないベクターに由来するコロニーは青色に変わる。Ｔ７によるタンパク質発現にはインサートがｔｅｔプロモーターに対してアンチセンス方向でクローニングされることが必要であるため、ＩＣＴ１０２５配列の基底発現は事実上生じない。ｐＥＴＢｌｕｅ−２プラスミドに存在する高コピー性ｐＵＣ複製起点はプラスミドの収量を大幅に高めるため、ＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドの発現も高まる。
挿入された配列がＴ７ｌａｃプロモーターに対してセンス方向であり、リーディングフレームがｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターの翻訳要件を満たしているため、ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクターにおけるＩＣＴ１０２５遺伝子または断片は高レベルに発現される。タンパク質発現は、組換え型ｐＥＴＢｌｕｅ−２プラスミドを宿主株Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）ｐＬａｃＩまたはＯｒｉｇａｍｉ（商標）（ＤＥ３）ｐＬａｃＩに形質転換した後、ＩＰＴＧにより誘導を行うことで実現される。これらの宿主は、ｌａｃＵＶ５制御下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有しており、和合性ｐＬａｃＩプラスミドを介して十分なｌａｃリプレッサーを供給し、非誘導時の発現を確実に低く抑える。Ｔｕｎｅｒ株のｌａｃＹは培養を通じて標的タンパク質の用量依存的な特有のＩＰＴＧ誘導を可能にし、Ｏｒｉｇａｍｉ株は細胞質内でのジスルフィド結合の形成を促進する。上記の手順により精製したＩＣＴ１０２５タンパク質については図１９を参照。
さらに、ＩＣＴ１０２５、ＩＣＴ１０２５ＮおよびＩＣＴ１０２５Ｃインサートは総て、内部に停止コドンがないため、Ｃ末端ＨＳＶタグ（登録商標）エピトープおよびＨｉｓタグ（登録商標）配列とともにインフレームでクローニングされた。ＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドは、そのＣ末端にあるＨＳＶタグおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現される。ＩＣＴ１０２５タンパク質およびペプチドは、Novagenの標準的な手順に従って、単離し、精製する。
実施例２６．２９３細胞を利用したＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドの製造
大腸菌から組換え型タンパク質を精製する際に、穏和な、非変性条件を用いてそれらの抗原性を保持した場合でも、組換え型タンパク質の溶解度の低さまたはアンフォールディングの不十分さから精製したタンパク質がそれらの抗原性を喪失することが多かった。組換え型タンパク質のこの困難は、発現用に哺乳類培養系を利用することで克服することができるが、このような系からの組換え型タンパク質の収量は、通常、大腸菌発現系の場合よりもずっと低い。
Ｉ．エレクトロポレーションアプローチを利用したＨＥＫ ２９３細胞のトランスフェクション
１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を増殖させる。
ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、トリプシンを添加し、
１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地でトリプシンを失活させる。
２．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地（抗生物質は含まない）で細胞を数回洗浄する。
２．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を５×１０６細胞／ｍｌの密度に再懸濁する。
細胞２００ｕｌをエレクトロポレーション用滅菌キュベット（ＢＴＸ キュベットモデル＃６２０：２ｍｍギャップ）に移す。そのキュベットにプラスミドＤＮＡ（ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５、ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５ＮまたはｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５Ｃ）１０ｕｇを添加し、十分に混合する。細胞とＤＮＡを室温にて１０分間インキュベートした後、エレクトロポレーションを行う。
Figure 2007525447
エレクトロポレーション後、細胞を回収し、室温にて１０分間インキュベーションを行う。
トランスフェクトされた細胞（１×１０６）を１０％血清含有予温ＲＰＭＩ培地２ｍｌの入った６穴プレートの１つの穴に入れ、３７℃、５％Ｃ０２インキュベーター内で４８時間インキュベートする。
II．細胞膜からのタンパク質抽出
ＩＣＴ１０２５タンパク質は膜結合性タンパク質であり、そのＣ末端残基の大部分が膜中に存在するため、トランスフェクトされた細胞で発現したＩＣＴ１２０５タンパク質およびＣ末端ペプチドを、Ｍ−ＰＥＲ真核生物膜タンパク質抽出試薬キット（カタログ番号８９８２６，ＰＩＥＲＣＥ）を使用して細胞膜から抽出する必要がある。
回収した細胞の懸濁液を８５０×ｇにて２分間遠心分離し、１サンプル当たり５×１０６細胞を単離する。１．７ｍｌ円錐型微量遠心チューブに入れ、細胞（ＰＢＳで洗浄済み）をペレット化する。
上清を慎重に取り除き、廃棄する。
細胞ペレットに試薬Ａ １５０μｌを添加する。ピペットで上下操作を行って、均質な細胞懸濁液を得る。時々攪拌しながら、室温にて１０分インキュベートする。
溶解した細胞を氷上に置く。
試薬Ｃを試薬Ｂで２対１希釈し、各サンプルが４５０μｌを受けるのに十分な混合物を作製する（例えば、１０回抽出する場合には、試薬Ｃ ３．３３ｍｌを試薬Ｂ １．６７ｍｌと合わせる）。注意：試薬Ｃは４℃で保存するか、または常に氷上に置いておく。
希釈した試薬Ｃ ４５０μｌを溶解した細胞の各チューブに添加し、攪拌する。５分おきに攪拌しながら、氷上で３０分間チューブをインキュベートする。
チューブを４℃、１０，０００×ｇにて３分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移す。
上清を３７℃にて１０分間インキュベートし、膜タンパク質画分を分離する。
チューブを室温、１０，０００×ｇにて２分間遠心分離し、親水性画分から疎水性画分（すなわち、目的の膜タンパク質を含有する画分）を単離する。
疎水性タンパク質相（最下層）から親水性相（最上層）を慎重に取り出し、新しいチューブに保存する。層の界面は室温にて徐々になくなるため、可能な限り速やかに相分離を行う。分離した画分を氷上に置く。
注意：膜タンパク質の大部分が低粘性相に含まれているはずである。
注意：膜タンパク質の解析には疎水性画分を使用する。
III．全細胞からのタンパク質抽出
ＩＣＴ１０２５のＮ末端ペプチドは細胞膜と強く結合していないと思われるため、Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（カタログ番号：７８５０１，ＰＩＥＲＣＥ）を使用して細胞溶解物から単離することは非常に容易である。
接着細胞から培養培地を慎重に取り除く（デカントする）。
細胞をＰＢＳで１回洗浄する。
Ｍ−ＰＥＲ（商標）試薬３００μｌを各プレートの穴（６穴プレート）に添加する。
５分間ゆっくりと振盪する。
溶解物を集め、微量遠心チューブに移す。
サンプルを２７，０００ｇにて５〜１０分間遠心分離し、細胞残屑をペレット化する。
さらなる解析（ＳＤＳ ｐａｇｅまたはウエスタンブロット解析）用に上清を清浄なチューブに移す。
IV．ＳＤＳ−ＰａｇｅゲルからのＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドの単離
タンパク質サンプルを２×ＳＤＳサンプルバッファーで１：１希釈し、サンプルと分子量標準を１００℃にて５分間を加熱する。
このサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せる。
色素が分離ゲルに入るまで、１０ｍＡにてゲルを泳動する。次いで、電流を１５ｍＡに上げる。色素が分離ゲルの底に達したら、電源を切り、ゲルサンドイッチを取り出す。
スペーサーの１つを利用してサンドイッチを慎重に開き、プレートをこじ開ける。スタッキングゲルを優しく切り取り、分離ゲルを染色用の小型プラスチック容器に入れる。
ゲルを定着液に浸し、１５分間ゆっくりと振盪する。
定着液を捨て、そのゲルをクーマシーブルー染色液に浸す。少なくとも２時間ゆっくりと振盪する。染色液を捨て、そのゲルを洗浄液に浸す。
所望のタンパク質のバンドを含むゲル断片を切り取り、標準的な手順を用いて、そのゲルからタンパク質を抽出する。
実施例２７ ＩＣＴ１０２５抗体の製造
精製したＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドを使用してＩＣＴ１０２５抗体を作製する。ＩＣＴ１０２５全長ｃＤＮＡまたは断片を有する哺乳類発現ベクターを使用し、ＤＮＡワクチン接種方法を利用して、直接ＩＣＴ１０２５抗体を産生させる。加えて、ＩＣＴ１０２５抗体を産生させるための抗原として、一連のＩＣＴ１０２５ペプチド（１５ ａａ〜３０ ａａ）を化学合成する。さらに、ＩＣＴ１０２５が膜タンパク質であることから、ＩＣＴ１０２５特異的イントラボディ（単鎖Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ）の細胞内発現用にプラスミドＤＮＡを構築し、ＩＣＴ１０２５の細胞内ドメインに向ける。
作製するＩＣＴ１０２５抗体としては、限定されるものではないが、マウスポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ウサギポリクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリＩｇＹ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。
実施例２８．マウスの直接ＤＮＡワクチン接種によるＩＣＴ１０２５抗体の作製
プラスミドＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、病原体そのものまたは精製タンパク質を使用した従来のワクチンの優れた代替物であることが分かっている。従来の方法よりもＤＮＡワクチン接種の有利な点を以下に列挙する：
簡易：ＤＮＡ配列のベクター（プラスミドまたはウイルス）へのサブクローニングが、抗原タンパク質の精製を行うことが冗長で非常に困難なことが多かった従来の方法よりもずっと容易である。
より安全：個々のタンパク質が感染を引き起こす危険性が低い。ワクチン接種用に特定のエピトープ配列を選択する場合、天然タンパク質に毒性がもしあるならば、最小限に抑える方がよい。
自然：研究により、ＤＮＡワクチンからin situ産生した抗原（タンパク質またはポリペプチド）が天然構造を示し、必要な翻訳後修飾が自然感染中に宿主により行われることが示されている。
ＤＮＡワクチンを陽イオン性脂質、遺伝子ガンまたはジェット式注射によって送達した場合に免疫応答が増強したことが報告されているが、in vitroおよびin vivoＤＮＡトランスフェクションではエレクトロポレーションが群を抜いて最も効率的な方法である。プラスミドＤＮＡ注射とエレクトロポレーション送達を組み合わせることで、筋肉、皮膚、腫瘍異種移植他などの異なる組織に対して納得のいく良い成果が得られた。
ＤＮＡワクチンとエレクトロポレーションを組み合わせることで、マウスにおいてポリクローナル抗体を生産させるための便宜でスピーディーな方法が提供されるため、従って、組織内で見つけられた、疾病診断または治療に適用される可能性のある抗体標的についてスクリーニングするのにこのアプローチを使用することができる。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに麻酔をかけた後、マウス背部の皮膚片をそぎ、皮膚領域を露出させる。１マウスにつき５箇所をそいだ。そいだ各領域の皮膚層に１ｍｌシリンジと３０．５ゲージ針を使用して、２０μｌ生理食塩水中ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５、ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５ＮまたはｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５ＣプラスミドＤＮＡ ２μｇを皮下経路経由で注射する。次いで、注射後、注射した領域に直接エレクトロポレーションを適用する。その際のパラメータは：電圧＝１００Ｖ、パルス長＝２０ｍｓ、パルス数＝３およびパルス間隔＝８００ｍｓに設定する。
７日後にＤＮＡワクチン接種（免疫化）手順を繰り返し、１ヶ月後にもう一度繰り返した。免疫化の効果を試験するため、最後のＤＮＡワクチン接種の７日後に血液サンプルを採取する。別の試験では、最後の追加免疫を同じＤＮＡによって事前にトランスフェクトしたマウスまたはヒト腫瘍細胞の溶解物を注射することにより行った。
ＤＮＡ発現による免疫化の効果をＥＬＩＳＡ法、ウエスタン法または機能解析様細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイにより試験した。ＥＬＩＳＡ法では、後に、免疫化したマウスの血清から精製した免疫グロブリンに存在する抗体により検出されることとなる抗原の供給源としてのトランスフェクトｃｏｓ−７細胞または２９３細胞の未精製溶解物でプラスチック支持体表面をコーティングした。別の試験では、免疫化したマウスから採取した抗血清を使用して、トランスフェクトｃｏｓ−７または２０３細胞の溶解物中に存在するＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチド（抗原）を沈降させた。沈降した標的は、その後、ウエスタンブロット法によって検出される。
ＩＣＴ１０２５に対して特異的な抗体は、従来の方法、ＤＥＡＥイオン交換カラム、プロテイン−Ａアフィニティーカラム他を用いて精製することができる。純粋な抗体は、ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体を作製した後に得ることができる。
実施例２９．ＩＣＴ１０２５に対するウサギ抗体の作製
ＩＣＴ１０２５に対するウサギモノクローナル抗体を作製するため、ＩＣＴ１０２５全長ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を有する発現ベクターをウサギ細胞系統２４０Ｅにトランスフェクトする。生じたトランスフェクト細胞をプールし、これを使用してウサギを免疫化する。細胞系統２４０Ｅ由来の内因性タンパク質は免疫反応を誘導せず、発現されたヒトタンパク質だけがウサギによって抗原として認識される。高融合効率で、優れた安定性のハイブリドーマと豊富な抗体産生細胞とを組み合わせることで、１羽のウサギを免疫化するための抗原を多様化することが可能である。
実施例３０．抗原としてＩＣＴ１０２５タンパク質またはペプチドを用いた、ＩＣＴ１０２５に対するマウスモノクローナル抗体の作製
従来の方法を使用して、ＩＣＴ１０２５タンパク質に対するマウスポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、精製する。また、本発明者らはＩＣＴ１０２５タンパク質に対するマウスポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、精製するために、ＩＣＴ１０２５タンパク質の異なるドメインに対応する化学合成したＩＣＴ１０２５ペプチドも利用する。このようにする目的は、ＩＣＴ１０２５タンパク質との高い結合親和性、さらに重要なことには、抗体／抗原特異的結合を通じてＩＣＴ１０２５タンパク質の生物学的機能を遮断する能力で示される、ＩＣＴ１０２５に対する最良のモノクローナル抗体をスクリーニングすることである。
ＩＣＴ１０２５ ｍＡｂを産生するハイブリドーマの作製
標準的な手順を用いて、ヒトＩＣＴ１０２５タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。要するに、ヒトＩＣＴ１０２５ ｃＤＮＡの原核生物発現ベクターで形質転換した大腸菌細胞からヒトＩＣＴ１０２５タンパク質を精製した。次いで、精製したヒトＩＣＴ１０２５タンパク質を使用してマウスを免疫化した。数回免疫処置した後、免疫化マウスの血清中のＩＣＴ１０２５抗体力価が１０、０００を超えたらそのマウスを犠牲にし、脾臓細胞を摘出し、ハイブリドーマクローンを作製した。続いて、各ハイブリドーマクローンを増幅させ、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイによりＩＣＴ１０２５タンパク質に対するｍＡｂを確認するために培養上清を回収した。ＩＣＴ１０２５タンパク質で免疫化した１マウスから、ヒトＩＣＴ１０２５タンパク質に特異的なｍＡｂを産生する４０のハイブリドーマクローンが確認された。
細胞表面結合性によるＩＣＴ１０２５ ｍＡｂの選択
ＩＣＴ１０２５の発現レベルが腫瘍細胞においてアップレギュレートされることは証明されている。さらに重要なことには、ＩＣＴ１０２５タンパク質の細胞質から細胞膜への移動や細胞外コンパートメントへの露出は選択的に腫瘍細胞で起こると考えられている。従って、治療または診断に有効なものにするには、ＩＣＴ１０２５ ｍＡｂがＩＣＴ１０２５タンパク質の細胞外ドメインと結合できなければならない。生存細胞表面染色ＥＬＩＳＡを利用して、ＩＣＴ１０２５タンパク質の細胞表面ドメインと結合可能なＩＣＴ１０２５ ｍＡｂをスクリーニングした。
２細胞系統、ヒト乳房腫瘍細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびヒト結腸腫瘍細胞系統ＨＴ２９（いずれもがＩＣＴ１０２５タンパク質を過剰発現している）をｍＡｂスクリーニング研究に使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（図５５）およびＨＴ２９細胞（図５６）におけるハイブリドーマ培養上清を使用したｍＡｂスクリーニングデータから、４０のｍＡｂの間では表面結合性に大きなばらつきがあることが示され、同時に、一方の細胞系統のデータからもう一方の細胞系統のデータを確認した。
さらなるin vitroおよびin vivo特性化に向け、ｍＡｂの製造および精製用に最大の細胞表面結合性を有する６ハイブリドーマクローン（表１）を選択した。細胞表面結合性のない１ハイブリドーマ（表１）も将来の機能研究での対照ｍＡｂとしてｍＡｂの製造および精製用に選択した。
腫瘍形成および腫瘍増殖に対する１０２５の阻害効果は、ヒト乳房腫瘍細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−４３５をいずれかの薬剤で処置し、処置した細胞をヌードマウスに接種することにより判定した。処置した細胞から形成した腫瘍は、陰性対照で処置した細胞（図５７）に対し、増殖速度の実質的な阻害を示し、培養細胞に対する１０２５の阻害効果が腫瘍形成および腫瘍増殖にも当てはまることが確認された。
本発明のその他の実施形態および使用は、本明細書で開示した本発明の詳細な説明および実施を考慮することによって当業者には明らかであろう。米国特許および特許出願ならびに外国特許および特許出願の総てを含む、本明細書で引用した総ての参考文献および資料は、明確かつ完全に引用することにより本明細書の一部とされる。詳細な説明および実施例は例示にすぎず、本発明の真の範囲および精神は特許請求の範囲により示される。
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配列表
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Efficacy-First Discovery（商標）法によって同定された標的が従来のアプローチを用いて同定されたものとは異なることを示す。これらの標的の発現変化は送達される遺伝子の摂動および病理過程の動態による。それらは創薬によりよく適合している。 選択された全標的１５６のうち、１１１がデータベース注釈に基づいて既知であり、４５が未知の新規な標的であったことを示す。既知の標的のうち、８７％が腫瘍関連である。同じ比が適用できるならば、３５を超える標的が新規な腫瘍標的であると思われる。さらに、これらのヒットはいくつかの腫瘍形成経路にも属する。 検証された新規な標的：ＩＣＴ１０３０およびＩＣＴ１０３１を示す。in vivoにおいてｓｉＲＮＡノックダウンを用いて試験した選択標的のうち、２つの標的（ＩＣＴ１０３０およびＩＣＴ１０３１）がｎ＝８（１コホートあたり８腫瘍）が検証された。２つのタンパク質は正反対の作用を有する細胞表面因子である。特定のｓｉＲＮＡによるＩＣＴ１０３０のノックダウンの結果として腫瘍増殖の増強が起こるのに対し、ＩＣＴ１０３１のノックダウンは腫瘍増殖の阻害を誘発した。従って、前者はタンパク質または遺伝子療法薬物であり得、後者は抗体または小分子薬物標的であり得る。 in vivoｓｉＲＮＡノックダウン（１コホートあたり８腫瘍）を用いて試験した選択標的の１つＩＣＴ１００３を示す。この標的ＩＣＴ１００３は新規なジンクフィンガータンパク質であり、転写因子に相当し得る。特定のｓｉＲＮＡによるＩＣＴ１００３のノックダウンの結果として腫瘍増殖の阻害が起こった。従って、このタンパク質はｓｉＲＮＡ薬物標的または小分子薬物標的であり得る。 新規な標的、ＣＴ１０２４、受託番号ＡＫ０２６０１０、ＮＭ０２２４５０、ヒト増殖因子受容体関連タンパク質ＥＧＦＲ−ＲＰまたはＥＧＦＲ−ＲＳを示し、これは最初に、ｂＦＧＦで処理した腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）組織におけるその高いアップレギュレーション発現のために、Efficacy-First Discovery法により同定された。細胞培養（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）研究におけるこの遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンの結果、アポトーシスの状態が活性化された。異種移植腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）におけるこの遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンの結果、腫瘍増殖の阻害がもたらされた。この遺伝子は、乳癌および前立腺癌をはじめとするいくつかのヒト腫瘍において過剰発現された。この遺伝子のコードタンパク質はＲｈｏｍｂｏｉｄドメインとトランスメンブランドメインを有する。 新規な標的、ＩＣＴ１０２５、ＮＭ００３２９９、ヒト腫瘍拒絶抗原、ＴＲＡ１、ＨＳＰ ｇｐ９６を示し、これは最初に、ｂＦＧＦで処理した腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）組織におけるその高いアップレギュレーション発現のために、Efficacy-First Discovery法により同定された。細胞培養（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）研究におけるこの遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンの結果、アポトーシスの状態が活性化された。異種移植腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）におけるこの遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンの結果、腫瘍増殖の阻害がもたらされた。この遺伝子は、脳癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌および前立腺癌をはじめとするいくつかのヒト腫瘍において過剰発現された。この遺伝子のコードタンパク質はＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼドメインとＨｓｐ９０タンパク質を有する。 ＩＣＴ１０２４ ｓｉＲＮＡのデザイン：ＩＣＴ１０２４由来の２つの２１ｎｔ配列がＲＮＡｉにより媒介される、ＩＣＴ１０２４遺伝子発現のノックダウンの標的として選択されたことを示す（配列番号２５および配列番号２６）。 ＩＣＴ１０２４ ｓｉＲＮＡ二重らせんがヌードマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞により形成された異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。 ＩＣＴ１０２４ ｓｉＲＮＡ二重らせんがＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞培養アッセイにおいてアポトーシス活性を誘導することを示す。 ＳＡＧＥ／マイクロアレイ分析に基づき、乳癌組織におけるＩＣＴ１０２４の発現は、他の癌遺伝子と有意な正の相関を有することを示す。 Gene Logic GeneExpress分析に基づき、ＩＣＴ１０２４は総てのステージＩ乳癌サンプル（１００％）で著しくアップレギュレートされることを示す。 ＩＣＴ１０２４タンパク質は、酵母、細菌および植物などの種々の生物に由来する他のｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質（配列番号２７〜３５）と有意な構造的相同性を有することを示す。 ＩＣＴ１０２４は新規なヒトタンパク質であり、Ｃ末端ドメインにおいて他のヒトｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質と構造的相同性を有するだけである。配列番号３７（ＩＣＴ１０２４）；配列番号３８（ＨＲｈｏｍｂｏｉｄ ２）；配列番号３９（Ｒｈｏｍｂｏｉｄ ３）；配列番号４０（ＨＲｈｏｍｂｏｉｄ ４）；配列番号４１（ＨＲｈｏｍｂｏｉｄ ５）および配列番号４２（ＨＲｈｏｍｂｏｉｄ ６）。 ＩＣＴ１０２４は他のヒトｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質とＤＮＡまたはタンパク質配列相同性を持たないことを示す。ｓｉＲＮＡが標的とする配列はＩＣＴ１０２４タンパク質に対して独自にデザインされたものである。 多重疎水性分析に基づく、ＩＣＴ１０２４タンパク質の細胞内の位置およびトポロジー推定を示す。少なくとも６つのトランスメンブランドメインが推定され、さらに１つ、疑問のある７番目のドメインもあった。しかしながら、このタンパク質のＮ末端部分は膜の外部に露出したペプチドの大きな領域（１〜４００または１〜５９０ＡＡ）と細胞外環境に存在するこの領域の少なくとも一部を有している。 昆虫モデルにおけるｒｈｏｍｂｏｉｄタンパク質機能の役割についての考察に基づく、ＥＧＦ関連因子に対する潜在的プロテイナーゼ活性を示す。ヒスチジンおよびセリンプロテアーゼ活性はＥＧＦ様因子のトランスメンブランドメインを膜内で切断し、これらのリガンドの放出をもたらして対応する経路を活性化させることができる。 ＣＭＶプロモーターにより駆動される発現カセットとともにＩＣＴ１０２４をコードする全長ｃＤＮＡを含むプラスミド構築物ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４を示す。このプラスミドをＭＤＡ−ＭＤ−４３５細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質の高い発現が得られた。 Ｎ末端ドメインをコードするＩＣＴ１０２４のｃＤＮＡ断片を含むプラスミド構築物ｐＣＩ−ＩＣＴ１０２４Ｎを示す。ＣＭＶプロモーターにより駆動される発現カセットを含むこのプラスミドをＭＤＡ−ＭＤ−４３５細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質断片の高い発現が得られる。 本発明者らが構築した、ＩＣＴ１０２４タンパク質をコードするＩＣＴ１０２４の全長ｃＤＮＡを含むプラスミド構築物ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４を示す。このプラスミドを原核生物プロモーターにより駆動される発現カセットとともに細菌細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質の高い発現が得られた。 本発明者らが構築した、ＩＣＴ１０２４タンパク質Ｎ末端ドメインをコードするＩＣＴ１０２４のｃＤＮＡ断片を含むプラスミド構築物ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−１０２４Ｎを示す。このプラスミドを原核生物プロモーターにより駆動される発現カセットとともに細菌細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質断片の高い発現が得られた。 本発明者らが構築した、ＩＣＴ１０２４タンパク質Ｃ末端ドメインをコードするＩＣＴ１０２４のｃＤＮＡ断片を含むプラスミド構築物ｐＧＥＸ−５Ｘ−３−ＩＣＴ１０２４Ｃを示す。このプラスミドを原核生物プロモーターにより駆動される発現カセットとともに細菌細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質断片の高い発現が得られた。 本発明者らが構築した、ＩＣＴ１０２４タンパク質をコードするＩＣＴ１０２４の全長ｃＤＮＡを含むプラスミド構築物ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４を示す。このプラスミドを原核生物プロモーターにより駆動される発現カセットとともに細菌細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質の高い発現が得られた。 ＩＣＴ１０２４タンパク質Ｎ末端ドメインをコードするＩＣＴ１０２４のｃＤＮＡ断片を含むプラスミド構築物ｐＥＴＢｌｕｅ−２−ＩＣＴ１０２４Ｎを示す。このプラスミドを原核生物プロモーターにより駆動される発現カセットとともに細菌細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質断片の高い発現が得られた。 本発明者らが構築した、ＩＣＴ１０２４タンパク質Ｃ末端ドメインをコードするＩＣＴ１０２４のｃＤＮＡ断片を含む、プラスミド構築物を示す。このプラスミドを原核生物プロモーターにより駆動される発現カセットとともに細菌細胞へトランスフェクトすると、ＩＣＴ１０２４タンパク質断片の高い発現が得られた。 ＩＣＴ１０２４タンパク質コード領域１６７０−３６３７（配列番号５８）の確認された配列である。 （配列番号６０）はＩＣＴ１０２４のＮ末端５５３ＡＡコード領域：１０７０−２７３１の配列である。 （配列番号６１）はＩＣＴ１０２４コード領域：９４７−３５１８の配列である。 （配列番号６２）はＩＣＴ１０２４Ｎ末端５５３ａａコード領域：９４７−２６００の配列である。 （配列番号６４）はＣ末端３７５ａａ：９４５−２０６９のＩＣＴ１０２４コード領域の配列である。 （配列番号６６）ＩＣＴ１０２４コード領域３１０−２８７９の配列である。 （配列番号６８）ＩＣＴ１０２４のＮ末端４００ａａ：３１４−１５１５のコード領域の配列である。 （配列番号６９）ＩＣＴ１０２４のＣ末端３７３ａａ：３０８−１４３１のコード領域。 ＩＣＴ１０２５ ｃＤＮＡ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２９９、腫瘍拒絶抗原１またはｇｐ９６（配列番号７０）の配列を示す。 腫瘍拒絶抗原（ｇｐ９６）１、グルコース調節タンパク質ｇｒｐ９４および内皮細胞糖タンパク質と呼ばれる、ＣＴ１０２５ペプチド、ＮＰ＿００３２９０（配列番号７１）の配列を示す。 ＩＣＴ１０２５ ｓｉＲＮＡデザイン：ＩＣＴ１０２５由来の２つの２１ｎｔ配列がＲＮＡｉにより媒介される、ＩＣＴ１０２５遺伝子発現のノックダウンの標的として選択されたことを示す（配列番号７２および７３）。 ＩＣＴ１０２５特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんが、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるメッセージＲＮＡレベルとウエスタンブロット解析により検出されるタンパク質レベルの双方において、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞においてＴＲＡ−１発現をノックダウンすることができることを示す。ｓｉＲＮＡによるＩＣＴ１０２５遺伝子発現は用量依存的な作用であることが示された。 ＩＣＴ１０２５特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんはトランスフェクション４８時間後に観察される、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のアポトーシス活性を誘導することを示す。 ＩＣＴ１０２５特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんはトランスフェクション４８時間後に観察される、ＨＴ−２９細胞の細胞増殖を低下させることを示す。 ＩＣＴ１０２５特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんはトランスフェクション４８時間後の観察される、ＨＴ−２９細胞のアポトーシス活性を誘導することを示す。 ＩＣＴ１０２５特異的ｓｉＲＮＡ二重らせんは、そのｓｉＲＮＡ二重らせんの繰り返し送達を用いた場合、ヌードマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞によって形成された異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。ＩＣＴ１０２５ノックダウンにより引き起こされる腫瘍増殖の阻害は、ｈＶＥＧＦノックダウンの場合よりもはるかに強い。 ＩＣＴ１０２５に特異的な市販のモノクローナル抗体をＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に適用した場合、それらの細胞のアポトーシス活性が用量依存的に劇的に上昇したことを示す。 モノクローナル抗体により検出したところ、ＩＣＴ１０２５がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞およびＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞の双方からの細胞溶解物の膜画分に存在することを示す。 ビオチニル化表面タンパク質のモノクローナル抗体結合によって検出したところ、ＩＣＴ１０２５は膜画分に存在するだけでなく、細胞表面の細胞外ドメインにも存在することを示す。 ＮＣＩが公開しているＳＥＧＥデータベースを用いた仮想ノーザン解析で示された複数の癌組織におけるＩＣＴ１０２５の発現のアップレギュレーションを示す。 熱ショックタンパク質９０ドメインおよびヒトＡＴＰアーゼ＿ｃドメインを含むＩＣＴ１０２５のドメイン構築物を示す。 ヒトＴＲＡ−１とマウスＴＲＡ−１（配列番号７１と７４）の間のペプチド配列の相同性を示す。この２つのタンパク質は類似性が高い。 ＴＲＡ−１と熱ショックタンパク質９０（配列番号７１と７５）の間のペプチド配列の相同性を示す。 ＩＣＴ１０２５のトランスメンブラン構造の推定を示す。 全長ＩＣＴ１０２５配列を含む原核生物発現ベクターＰＧＥＸ５３Ｘ１０２５を示す。 原核生物系から発現された精製ＩＣＴ１０２５タンパク質を示す。 ＩＣＴ１０２５の全長ｃＤＮＡを含む真核生物発現ベクターｐＣＩ−ＩＣＴ１０２５を示す。 ＨＬａペプチドモチーフ検索結果を示す。 ＩＣＴ１０２５のトランスメンブラン生物学の提案モデルを示す。 ＩＣＴ１０２５の推定トランスメンブランセグメントを示す。 乳癌細胞における表面結合活性に関するＩＣＴ１０２５ ｍＡＢのスクリーニングを示す。 結腸癌細胞における表面結合活性に関するＩＣＴ１０２５ ｍＡＢのスクリーニングを示す。 腫瘍細胞を接種前に抗体またはｓｉＲＮＡで処理することによる、腫瘍形成および腫瘍増殖の阻害を示す。

Claims (73)

  1. ＩＣＴ１０３０ペプチドの望ましくない活性または発現に関連する哺乳類の疾病を治療するための方法であって、ＩＣＴ１０３０ペプチドまたは遺伝子と相互作用し、哺乳類の組織に導入されたときにＩＣＴ１０３０の発現または活性を増強し得る組成物を適用することを含んでなる、方法。
  2. 前記疾病が癌または前癌増殖である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記組織が乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、または卵巣組織である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記組成物が核酸である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記核酸がデコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、標的ＩＣＴＥ１０３０遺伝子の発現を増強し得る分子、またはそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記核酸分子が実質的に二本鎖であり、約１００塩基対以下の長さである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記核酸組成物が、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子を含んでなるものである、請求項４に記載の方法。
  8. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子であり、その核酸分子がプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
  9. 前記ベクターがレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の分子を含んでなり、その分子が哺乳類において標的ＩＣＴＥ１０３０遺伝子の発現を増強するものである、請求項４に記載の方法。
  11. 哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記核酸が標的ＩＣＴＥ１０３０遺伝子コード核酸と三重らせんを形成するものである、請求項４に記載の方法。
  13. 前記標的ＩＣＴ１０３０遺伝子が、
    （ａ）配列番号２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号１または配列番号３で示されるポリヌクレオチド、および
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記標的ＩＣＴ１０３０遺伝子が、配列番号１または配列番号３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
  15. 前記標的ＩＣＴ１０３０遺伝子が、配列番号２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記標的ＩＣＴ１０３０遺伝子が、配列番号２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
  17. 前記標的ＩＣＴ１０３０遺伝子が、配列番号２で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の方法。
  18. 前記核酸分子が実質的に二本鎖であり、約１００塩基対以下の長さである、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記核酸組成物が、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子を含んでなるものである、請求項１３に記載の方法。
  20. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子であり、その核酸分子がプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ベクターがレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
  22. 核酸をそれを必要とする患者に投与する方法であって、その核酸分子が裸のオリゴヌクレオチドまたはベクターの形態で送達され、その核酸が標的ＩＣＴ１０３０遺伝子と相互作用する、方法。
  23. 前記核酸がベクターとして送達され、そのベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ベクターがレトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記核酸が哺乳類細胞における標的ＩＣＴ１０３０遺伝子発現を増強する、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記細胞がヒト細胞である、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記組成物が、配列番号２で示されるＩＣＴ１０３０ポリペプチド、または配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性およびＩＣＴ１０３０ポリペプチドの生物活性を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  28. 前記組成物が、配列番号２で示されるＩＣＴ１０３０ポリペプチド、または配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
  29. 哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を、標的ＩＣＴ１０３０と相互作用するエンハンサーと接触させ、それにより標的ＩＣＴ１０３０の発現または活性を増強することを含んでなる、方法。
  30. 前記組織が乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、または卵巣組織である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含んでなり、その分子が哺乳類において標的ＩＣＴ１０３０遺伝子の発現を増強する、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記哺乳類がヒトである、請求項２９に記載の方法。
  33. ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３ペプチドの望ましくない発現または活性に関連する哺乳類の疾病を治療するための方法であって、ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３のペプチドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡと相互作用する阻害剤を含有する組成物を適用することを含んでなり、その組成物が、哺乳類の組織に導入されたときにＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３ペプチドの発現または活性を低下させ得るものである、方法。
  34. 前記疾病が癌または前癌増殖である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記組織が乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、または卵巣組織である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記組成物が核酸である、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じ得る分子、またはそれらの組合せである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記核酸分子が実質的に二本鎖であり、約１００塩基対以下の長さである、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記核酸組成物が、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子を含んでなるものである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子であり、その核酸分子がプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ベクターがレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の分子を含んでなり、その分子が哺乳類において標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３遺伝子の転写後サイレンシングを起こすものである、請求項３６に記載の方法。
  43. 前記哺乳類がヒトである、請求項３３に記載の方法。
  44. 前記阻害剤が標的ＩＣＴ１０３１コード核酸と三重らせんを形成するものである、請求項３６に記載の方法。
  45. 前記標的ＩＣＴ１０３１遺伝子が、
    （ａ）配列番号５で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号４で示されるポリヌクレオチド、および
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項３３に記載の方法。
  46. 前記標的ＩＣＴ１０３１遺伝子が、配列番号５で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記標的ＩＣＴ１０３１遺伝子が、配列番号４で示されるポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記標的ＩＣＴ１００３遺伝子が、
    （ａ）配列番号７で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号６または配列番号８で示されるポリヌクレオチド、および
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項３３に記載の方法。
  49. 前記標的ＩＣＴ１００３遺伝子が、配列番号７で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記標的ＩＣＴ１００３遺伝子が、配列番号８で示されるポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記標的ＩＣＴ１０２４遺伝子が、
    （ａ）配列番号３７で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号５８、６０、６１、６２、６４、６６、６８または６９で示されるポリヌクレオチド、および
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項３３に記載の方法。
  52. 前記標的ＩＣＴ１０２４遺伝子が、配列番号３７で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記標的ＩＣＴ１０２４遺伝子が、配列番号５８、６０、６１、６２、６４、６６、６８または６９で示されるポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記標的ＩＣＴ１０２５遺伝子が、
    （ａ）配列番号７１で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号７０で示されるポリヌクレオチド、および
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項３３に記載の方法。
  55. 前記標的ＩＣＴ１０２５遺伝子が、配列番号７０で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記標的ＩＣＴ１０２５遺伝子が、配列番号７１で示されるポリヌクレオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるものである、請求項５４に記載の方法。
  57. 哺乳類組織において癌または前癌増殖を阻害するための方法であって、その組織を、標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３のＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する阻害剤と接触させ、それにより標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３遺伝子発現を低下させることを含んでなる、方法。
  58. 前記組織が乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頚組織、リンパ節組織、または卵巣組織である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合化ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じ得る分子、またはそれらの組合せである、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記核酸分子が実質的に二本鎖であり、約１００塩基対以下の長さである、請求項５７に記載の方法。
  61. 前記核酸組成物が、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子を含んでなるものである、請求項５７に記載の方法。
  62. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡをコードし得る核酸分子であり、その核酸分子がプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターである、請求項５７に記載の方法。
  63. 前記ベクターがレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記核酸組成物がｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の分子を含んでなり、その分子が哺乳類において標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３遺伝子の転写後サイレンシングを起こすものである、請求項５７に記載の方法。
  65. 前記哺乳類がヒトである、請求項５７に記載の方法。
  66. 前記阻害剤が標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３コード核酸と三重らせんを形成するものである、請求項５７に記載の方法。
  67. ｓｉＲＮＡをそれを必要とする患者に投与する方法であって、そのｓｉＲＮＡ分子が裸のオリゴヌクレオチドまたはベクターの形態で送達され、そのｓｉＲＮＡが標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、もしくはＩＣＴ１００３遺伝子、または標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、もしくはＩＣＴ１００３のｍＲＮＡ転写物と相互作用する、方法。
  68. 前記ｓｉＲＮＡがベクターとして送達され、そのベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスである、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記ベクターがレトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである、請求項６８に記載の方法。
  70. ベクターをそれを必要とする患者に投与することにより標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３遺伝子のin vivo発現を遮断する方法であって、そのベクターが標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３のｓｉＲＮＡを含むものである、方法。
  71. 前記ｓｉＲＮＡが標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３遺伝子発現と干渉するものである、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ｓｉＲＮＡが、哺乳類細胞において標的ＩＣＴ１０３１、ＩＣＴ１０２４、ＩＣＴ１０２５、またはＩＣＴ１００３遺伝子の転写後サイレンシングを起こすものである、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記細胞がヒト細胞である、請求項７２に記載の方法。
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