WO2007010853A1 - エレクトロポレーション装置の制御方法 - Google Patents

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WO2007010853A1
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acid construct
electrode
tissue
gene
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Yoshifumi Takei
Kenji Kadomatsu
Tatsuya Fujishima
Takashi Muramatsu
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Definitions

  • the present invention relates to a technique for introducing a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression into a living body by electroporation (electroporation) and use thereof.
  • Atelocollagen is a matrix with excellent biocompatibility, and the delivery system based on atelocollagen greatly contributes to the improvement of sustained release and the in vivo stability (sustainability), but it is introduced into cells in vivo. There is still room for improvement in terms of efficiency. Therefore, the delivery method of nucleic acid constructs using atelocollagen is not necessarily a sufficient method for gene silencing in various modes using RNA interference. It is also desirable to introduce the nucleic acid construct as naked as possible.
  • an object of the present invention is to provide an effective technique for introducing a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression into a living body and use thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a technique for effectively introducing the nucleic acid construct into a target tissue near the epidermis via the epidermis and use thereof.
  • the present inventor found that gene silencing is possible in the living body by introducing a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression into the living body by electoporation, and completed the present invention. did. That is, according to the present invention, the following means are provided.
  • a method for controlling an electrovolatility apparatus in animals including humans and non-human animals wherein in the presence of a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression in the animals, Applying a voltage to an electrode of the electoporation device placed against the animal's biological tissue is provided.
  • the nucleic acid construct can be selected from single-stranded or double-stranded DNA, single-stranded or double-stranded RNA, DNA-RNA hybrids and DNA-RNA chimeric oligonucleotides.
  • the nucleic acid construct may be a nucleic acid construct capable of expressing RNA interference in the animal.
  • the nucleic acid construct is preferably siRNA.
  • siRNA siRNA
  • the nucleic acid construct preferably has a half-life in human serum of 50 hours or more. The half-life is a half-life when the unstabilized nucleic acid construct having the same structure has a half-life in human serum of 2 hours or less.
  • the nucleic acid construct is a gene that promotes angiogenesis. It is preferably a construct capable of expressing RNA interference using as a target.
  • a vascular endothelial growth factor gene is a suitable gene.
  • the living tissue can include a solid tumor.
  • the living tissue can be a tissue existing in the epidermis or epidermis.
  • the method includes a step of supplying a biodegradable matrix material to the living tissue or the vicinity thereof before, after or simultaneously with applying a voltage to the electrode.
  • the voltage applying step may be a step of applying a voltage to the electrodes arranged with respect to the living tissue after or while supplying the nucleic acid construct to the living tissue or the vicinity thereof.
  • the electrode may include at least one plate-like electrode, or the electrode may include one or more needle-like electrodes. Furthermore, this needle-like electrode can also be provided with a hollow portion and an opening through which the liquid containing the nucleic acid construct can pass.
  • the elect port positioner can include a plate-like electrode and a needle-like electrode as the counter electrode.
  • the plate-like electrode is arranged with respect to the surface of the biological tissue into which the nucleic acid construct is to be introduced, and the needle-like electrode is arranged by puncturing the biological tissue or the vicinity thereof.
  • the biological tissue is a subcutaneous solid tumor
  • the plate-like electrode is disposed in contact with the surface of the epidermis covering the subcutaneous solid tumor
  • the needle-shaped electrode is punctured and disposed at or near the biological tissue.
  • the voltage applied to the electrode can be 50V or more and 70V or less.
  • the animal is a human, and the affected tissue preferably comprises a tissue that can be suppressed, improved, or treated by inhibiting angiogenesis.
  • the nucleic acid construct is preferably a nucleic acid construct capable of expressing RNA interference targeting a disease-related gene.
  • a method for producing a non-human animal which can be established as a human disease model, gene mutation, or expression of a biological tissue or cell. And a step of introducing a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression in the non-human animal into cells of a living tissue of the non-human animal by an electoporation. Is done.
  • a method for searching for a therapeutic agent wherein the non-human having a disease state, gene mutation, or biological tissue or cell phenotype that can be established as a human disease model.
  • a method for searching for a therapeutic agent comprising a nucleic acid constrain capable of suppressing gene expression in a non-human animal living tissue cell.
  • Introducing Assignment by electo-poration to form a pathology or biological tissue or cell phenotype in a human disease in at least a part of the non-human animal, and one or more of the non-human animal And a method of analyzing the pathological condition or the tissue or phenotype of a cell by administering the compound.
  • a method for searching for a target compound for drug discovery wherein a disease-related gene in a non-human animal is inserted into a cell of a living tissue of the non-human animal.
  • a method comprising: introducing a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression as a target by an electoral position; and analyzing the expression type of the biological tissue or cell into which the nucleic acid construct has been introduced.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an electo-portion position device.
  • FIG. 2 is a diagram showing examples (a) to (d) of an operation flow for introducing a nucleic acid construct into cells of a living tissue by an electoral position.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an operation for introducing a nucleic acid construct using an electopore positioner.
  • FIG. 4 is a diagram showing a target site sequence of siRNA against hVEGF-A mRNA (CDS).
  • FIG. 5 shows the structures of various siRNAs.
  • FIG. 6 Diagram showing the inhibitory effect of various siRNAs on hVEGF-A expression in PC-3 cells
  • FIG. 7 is a graph showing the inhibitory effect of VEGF-A expression in PC-3 cells by stabilized siRNA, unmodified siRNA, and these scrambled siRNAs.
  • FIG. 8 is a graph showing the antitumor effect (therapeutic effect) of siRNA electoral position.
  • FIG. 9 Pictures of appearance of tumors (a) to (d) on day 40 after the start of treatment.
  • FIG. 10 shows immunochemically stained images of the stabilized siRNA-administered group and the stabilized siRNA-administered group having a scrambled sequence using CD31 as a marker for intratumoral microvessel density.
  • FIG. 11 is a graph showing the antitumor effect (therapeutic effect) by siRNA electoral position in Example 6.
  • a method for controlling an electrovolution device in animals including humans and non-human animals includes the living body of the animal in the presence of a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression in the animal. And a step of applying a voltage to an electrode of the electoral position device arranged with respect to the tissue.
  • the cell surface constituting the living tissue is perforated by applying a voltage to the electrode arranged in the living tissue of the animal, and the nucleic acid construct can be introduced into the cell.
  • a nucleic acid construct is introduced into a cell, it suppresses the expression of a specific gene. Can do.
  • a method for producing a non-human animal comprising: a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression in a non-human animal cell in a living tissue of the non-human animal. And a step of introducing by means of an electo-portion.
  • a nucleic acid construct is introduced into cells of the living tissue by electoporation, thereby obtaining a non-human animal in which gene expression is suppressed in the cells.
  • a method for searching for a therapeutic agent is the above-mentioned non-human having a pathological condition, gene mutation, or biological tissue or cell phenotype that can be established as a human disease model.
  • a step of analyzing a pathological condition in the model animal or a phenotype of the living tissue or cell was introduced.
  • the effectiveness of the nucleic acid construct against the disease can be easily evaluated by analyzing a disease state or the like in a non-human animal in which the nucleic acid construct is introduced into a cell and gene expression is suppressed. Can do. As a result, a nucleic acid construct useful for treatment or prevention of a predetermined disease can be screened.
  • a method for searching for a therapeutic agent wherein a nucleic acid construct capable of suppressing gene expression in a non-human animal is elected into a living tissue cell of the non-human animal. Introducing by oral positioning to form a pathology in human disease or a phenotype of biological tissue or cells in at least some of the non-human animals, and administering one or more compounds to the non-human animals And analyzing the pathological condition or the phenotype of the living tissue or cell.
  • the efficacy of the compound against the above-mentioned diseases can be easily evaluated by analyzing the disease state and the like in the non-human animal. As a result, it is possible to screen for a drug useful for the treatment and prevention of a predetermined disease.
  • a method for searching for a target compound for drug discovery uses a nucleic acid construct capable of suppressing the expression of one or more disease-related genes present in at least a part of a living tissue or cell of a non-human animal as a target by using an oral mouth position.
  • the method includes a step of introducing into a cell, and a step of analyzing a phenotype of the biological tissue or cell into which the nucleic acid construct has been introduced. According to this search method, by analyzing the phenotype of the biological tissue or cell, a compound that is activated or increased in expression by suppressing the expression of the disease-related gene or a compound that is inactivated or decreased in expression is found.
  • Such a compound or an inhibitor of the activity of the compound can be a target compound for a drug for preventing or treating the above-mentioned diseases, and according to the search method of the present invention, a new target compound for drug discovery is provided. Therefore, it is possible to provide a screening system for drugs useful for the prevention and treatment of the above diseases.
  • the nucleic acid construct is introduced into cells of a living body tissue of an animal by electrovolution. Furthermore, by using a needle-like electrode as at least one of the electrodes of the electopore position, the nucleic acid construct is effectively introduced into the target tissue near the epidermis via the epidermis.
  • nucleic acid construct that expresses RNA interference and the like are introduced into cells of a living tissue by electoporation, so that a good expression suppression effect is achieved. It is inferred that the phenomenon that exerts the effect of the introduction efficiency by the electoral position, the size of the molecule outside the nucleic acid construct (the Stokes diameter of the molecule), and the like. First of all, since the electopore position can introduce the nucleic acid construct into the cell in a very short time, the nucleic acid construct that would otherwise be broken down before introduction into the cell is intracellular.
  • RNA construct such as siRNA, which is generally regarded as unstable, is considered to have a high expression suppressing effect.
  • the cell membrane is electrically perforated.
  • a low-molecular nucleic acid construct such as siRNA. It is considered that the compatibility was high, or such a nucleic acid construct could be easily passed because it was a small molecule compared to a conventional general DNA expression vector.
  • the present inventors when pores are usually formed in a cell membrane by electroporation, the relationship between the pore diameter and the diameter of the molecule to be introduced is established. I infer.
  • a low molecular weight compound having a molecular weight of about 1000 is likely to be introduced into the cell through the pores, but since this reaction is an equilibrium reaction, the introduced low molecular weight compound is likely to go out of the cell at the same time.
  • Low-molecular-weight nucleic acid constructs such as siRNA have the advantage that they have moderate molecular weight (molecular diameter) and are unlikely to go out of the cell once introduced into the cell by electroporation. .
  • Such a tendency is considered to be more conspicuous in the electoral position on the living tissue than in the electoral position at the cellular level.
  • nucleic acid construct can be maintained at a high concentration in the vicinity of the cell or tissue to which the nucleic acid construct is to be introduced. It is considered that a nucleic acid construct was introduced into
  • the control method of the electopore position apparatus of the present invention relates to the use of the electopore position apparatus in animals including human and non-human animals.
  • non-human animal as used herein includes animals such as non-human primates, non-primate mammals, birds, reptiles, amphibians and fish.
  • mammals include livestock animals such as rats, mice, rabbits, pigs, hidges, rabbits, horses and goats, and pet animals such as dogs and cats.
  • fish include zebrafish and medaka. In particular, rats, mice, rabbits, dogs, pigs, zebrafish, medaka and the like are preferably used for disease models and research.
  • the human and non-human animals in the present invention include all states of embryos, embryos and postnatal individuals, but besides the control method of the present invention, a method for producing non-human animals, a method for searching for therapeutic agents, In the method of searching for a target gene for drug discovery, it is preferable to use an individual after birth.
  • a voltage is applied to the electrodes of the electoral position device arranged in the living tissue of such an animal.
  • the animal tissue There are no particular limitations on the animal tissue.
  • the living tissue is preferably epidermis or epidermis (directly under or near the epidermis).
  • a voltage can be easily applied to such a region.
  • a living tissue that is percutaneously introduced through percutaneous operation various joints such as knees can be cited. The joint is also preferable because it is directly under the epidermis and protrudes from the body.
  • oral cavity such as periodontal tissue is also preferable.
  • a biological tissue that can be reached via a blood vessel or the like is also preferable.
  • a living tissue in which electrodes can be arranged by an oral, transanal, transvaginal or transperitoneal method by an endoscopic surgical method is also preferable.
  • the biological tissue is preferably a tissue containing a solid tumor. This is because a nucleic acid construct can be introduced into a solid tumor cell according to the electrovolatility apparatus. In particular, according to this method, a transcutaneous treatment is possible for a solid tumor directly under or near the epidermis.
  • FIG. 1 shows an example of an elect mouth positioning apparatus 2.
  • the electrification position apparatus 2 can include a main body 4 and an electrode member 20 connected to the main body 4 via a cable 14 and a holder 12.
  • the main body 4 can be provided with pulse generating means 5.
  • the pulse generating means 6 can apply a voltage to the electrodes 10a and 10b through a lead wire passing through the cable 10 and the holder 14.
  • a DC A device capable of applying a (DC) pulse or the like is known. Although not particularly limited, those capable of applying a DC pulse are preferred.
  • As the pulse waveform a square wave is preferable.
  • a square wave is a waveform that rapidly rises to the set voltage, maintains that voltage for a predetermined time (pulse length), and then suddenly drops to zero again.
  • pulse generating means capable of applying such a square wave at a frequency of a plurality of times per second, preferably up to 99 times is used.
  • one cycle means the sum of time of pulse ON time and OFF time.
  • the main body 4 can also be provided with impedance measuring means 8.
  • the impedance measuring means 8 can measure the impedance (resistance value) between the electrodes 10a and 10b before or after applying the pulse.
  • the apparatus 2 can include at least a pair of electrodes 10 a and 10 b that are electrically connected to the pulse generating means 6 of the main body 4.
  • the electrode 10a illustrated in FIG. 1 is a rectangular plate-shaped conductor (for example, platinum), and the electrode 10b has three needle-like bodies aligned to form a fork shape as a whole. It arrange
  • a plate-like electrode is preferably used in contact with a living tissue such as epidermis, mucous membrane, organ and organ, that is, a living tissue into which a nucleic acid construct is to be introduced.
  • the three needle-like bodies of the electrode 10b are gently bent in the same manner, making it easy to enter the subcutaneous tissue.
  • the needle-like electrode that can be used in the present invention only needs to be composed of one or more needle-like bodies. Further, the arrangement state of the plurality of needle-like bodies is not particularly limited. For example, the needle-like bodies can be aligned in parallel or in a single row. Such a needle-shaped electrode is preferably used by puncturing a living tissue to which a nucleic acid construct is to be introduced or in the vicinity thereof.
  • a plate-like electrode and a needle-like electrode are used, the plate-like electrode is arranged with respect to the surface of the biological tissue into which the nucleic acid construct is to be introduced, and the needle-like electrode is the biological tissue or It can be punctured in the vicinity.
  • the living tissue is a subcutaneous solid tumor
  • the plate-like electrode is placed in contact with the epidermis surface covering the subcutaneous solid tumor, and the needle-like electrode is placed by puncturing the living tissue or the vicinity thereof. Also it can. By doing so, the subcutaneous solid tumor can be stably maintained, and as a result, the nucleic acid construct can be introduced reliably and efficiently.
  • the nucleic acid construct is effectively introduced into the subepidermal tissue by bringing the plate-like electrode into contact with the epidermis and placing the needle electrode under the target tissue such as a solid tumor under the epidermis. can do.
  • the amount of current tends to vary and the force tends to decrease.
  • a sufficient amount of current can be supplied to the construct to ensure introduction efficiency, and the minimally invasive procedure can be improved.
  • a plate-like electrode and a needle-like electrode especially one in which two or more needle-like electrodes are aligned
  • disposing electrodes on the surface and inside of a living tissue containing target cells thus, it can be said that there is an advantage that the intended amount of current can be stably supplied to the living tissue.
  • a stable supply of the intended amount of current is advantageous in order to realize a stable and reliable introduction of the nucleic acid construct by the electoral position.
  • the electrodes 10a and 10b are not limited to such a combination of a plate-like electrode and a needle-like electrode.
  • the electrode combination used in the present invention may be, for example, a plate electrode or an electrode provided with one or more needle-like bodies.
  • the electrodes do not have to be a pair, but may be a combination of one or two or more positive electrodes and one or two or more cathodes.
  • the shape of the plate portion of the plate-like electrode can take various forms such as a circular shape, an elliptical shape, and a square shape.
  • a flow path through which liquid can flow it is possible to provide a discharge port at the tip thereof.
  • a liquid containing the nucleic acid construct can be supplied to the flow path, thereby injecting the nucleic acid construct into the living body.
  • a voltage can be applied while injecting. This can prevent the nucleic acid construct from diffusing from the target site.
  • the electrodes 10a and 10b are preferably connected to the pulse generating means 6 via the holder 12 and the cable 14.
  • the holder 12 has a pair of leg portions 12a and 12b that can be opened and closed by holding with one hand, and can be provided with electrodes 10a and 10b at the respective tips.
  • a cable 14 having terminals 14a and 14b at the distal ends may be fixed from the base end portions of the pair of leg portions 12a and 12b of the holder 12.
  • Conductors connected to the electrodes 10a and 10b are inserted into the holder and the cable 14, respectively. It may be connected to the network.
  • the electrodes 10 a and 10 b, the holder 12, and the cable 14 can constitute an electrode unit (member) 20 that is replaceable with respect to the main body 4.
  • the electoporation device 2 provided with such electrodes 10a and 10b is a device for introducing a nucleic acid construct into a living tissue (especially subcutaneous tissue) of a human and a non-human animal, a gene expression suppressing device, and a treatment outside the nucleic acid construct. It can be used as a device (especially a treatment device for a subcutaneous disease site such as a subcutaneous solid tumor).
  • 10b is also a device for introducing a nucleic acid construct into a living tissue (especially subcutaneous tissue) of human and non-human animals, a gene expression suppressing device, and a therapeutic electrode for nucleic acid construct (subcutaneous solid tumor, etc. It can be used as an electrode for treatment of diseased sites in
  • the nucleic acid construct in the present invention is constructed so that gene expression can be suppressed.
  • to suppress gene expression means transcription by an antigene nucleic acid method in which transcription is inhibited by an interaction such as hybridization with DNA encoding a gene or the like, or an interaction such as hybridization with RNA such as mRNA.
  • Antisense nucleic acid method that inhibits translation RNA interference method that degrades transcripts or inhibits translation based on interactions such as hybridization with transcripts such as mRNA, decoy nucleic acid method, ribozyme method, etc. Is mentioned.
  • Abutama can also be introduced by electoporation.
  • nucleic acid means a polynucleotide such as deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid.
  • the term also includes single stranded (DNA or RNA, sense or antisense) or double stranded polynucleotide (DNA or RNA).
  • RNA interference means a phenomenon in which a double-stranded RNA degrades a transcription product such as mRNA of a target gene in a sequence-specific manner or inhibits translation.
  • RNA interference can suppress the expression of the target gene.
  • suppressing the expression of the target gene means that the mRNA encoded by the target gene is inhibited from being translated into a polypeptide, or the expression level of the protein that is the translation product is reduced. .
  • the target gene is not particularly limited. It may be a gene for preventing or treating a disease, a gene for which functional analysis is required, and the like.
  • vascular endothelial growth factor VEGF
  • fibroblast growth factor such as aFGF and bFGF
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor a
  • An angiogenesis-inducing substance such as angiogenin
  • a gene encoding an epithelial cell growth factor (EGF) that promotes the growth of cancer cells can be used as a target gene.
  • EGF epithelial cell growth factor
  • VEGF has a strong angiogenic action
  • the VEGF gene is very useful as a target gene for cancer treatment, as well as diseases whose main cause is VEGF overexpression other than cancer, such as the eye It can be used as a target gene for the treatment of neovascular diseases such as diabetic retinopathy and retinal vein occlusion and arteriosclerosis.
  • VEGF has a structure in which subunits with a molecular weight of about 22,000 form a dimer, promotes the proliferation and migration of vascular endothelial cells and formation of lumens, and enhances angiogenesis at the individual level. Wake up.
  • 3 ⁇ 4a induces increased production of coagulation / fibrinolytic factors such as weaving factor and plasminogenactivator (PA), and increased expression of matrix 'meta-oral proteinase PA receptor.
  • PA weaving factor and plasminogenactivator
  • VEGF enhances vascular permeability as shown by the alias VPF.
  • VEGF (VEGF-A) has five different sizes of isoforms (ie VEGF, VEGF, VEGF, VEGF, VEGF: subscript by alternativesplicing)
  • VEGF and VEGF are known to exist (Tischer, E. et al .: J. Biol. Chem., 266: 11947—11954, 1991). Cells are producing several subtypes simultaneously. VEGF and VEGF are usually better
  • Nucleic acid constructs such as siRNAs that target one or more of the five VEGF subtype genes biosynthesized by splicing are also useful. It can also target VEGF—B PLGF (placenta growth factor). From the above, the nucleic acid construct of the present invention can target the VEGF family including VEGF-A VEGF-B, PLGF and the like. Furthermore, VEGFR family genes such as VEGFR-1 123 may be targeted. Other cancer-related genes include mutated p53 gene and ez h2 gene.
  • the target biological tissue is a tumor tissue (particularly, a subcutaneous tumor tissue)
  • the target gene is intravascular.
  • a nucleic acid construct that is an angiogenesis-related gene that promotes angiogenesis such as skin growth factor (VEGF).
  • VEGF skin growth factor
  • Nucleic acid constructs are preferred.
  • the target gene may not be an endogenous gene of a human or non-human animal into which a nucleic acid construct is to be introduced.
  • prevention of diseases caused by viral infection RNA sequences in RNA viruses can be targeted.
  • RNA sequences such as HIV-1 virus, hepatitis C virus, poliovirus, rous sarcoma virus, papilloma virus, influenza virus can be targeted.
  • a gene encoding an endogenous factor necessary for virus growth may be used as a target gene.
  • An inflammatory disease-related gene can also be used as a target gene.
  • inflammatory disease-related genes include IL-1 and j3), IL_6, IL_4 and the like. These are associated with inflammatory diseases such as rheumatism and chronic joints.
  • it is effective in the present invention to target genes related to inflammatory diseases of the joints from the viewpoint that the introduction operation percutaneously from outside the body is blocked.
  • Other inflammatory disease-related genes include TNFa gene and TNFa receptor family genes, which are dermatitis disease-related genes such as atopic dermatitis. According to the present invention, the percutaneous introduction operation is easy even for dermatitis diseases.
  • Anti-apoptosis-related genes are oncogenes related to the onset and progression of cancer.
  • these genes include bcl-2 family genes such as bcl-2 gene, bcl-x, bcl-w, mcl-1, bfl-1 / A1, bax, bad, bik.
  • bcl-2 family genes such as bcl-2 gene, bcl-x, bcl-w, mcl-1, bfl-1 / A1, bax, bad, bik.
  • siRNA having a bcl2_ gene as a target gene is described in JP-A-2005-13199.
  • a nucleic acid construct capable of expressing RNA interference is constructed such that the expression of these target genes can be suppressed by targeting at least a part of the transcription product such as mRNA of the target genes.
  • a nucleic acid construct is an RNA construct having a double-stranded structure of oligoribonucleotides that hybridize to each other. That is, naked RNA.
  • a nucleotide short hairpin RNA: shRNA
  • These RNA constructs are preferred in that they can cause direct RNA interference.
  • single-stranded oligonucleotides that do not form hairpin structures Ribonucleotide RNA constructs can also express RNA interference.
  • the siRNA has a sense sequence and an antisense sequence corresponding to the target sequence, and these sense sequence and antisense sequence are hybridized with a certain length to form a double-stranded structure. That is, the sense sequence and the antisense sequence each have a double strand paired with a predetermined length.
  • the sense sequence and the antisense sequence may have an unpaired part in a part of the ability to hybridize with each other. For example, it may have one or several mismatched bases and a Z or base deletion in the sense sequence.
  • the sense sequence and antisense sequence in siRNA may or may not have a protruding 3 ′ end (blunt end type). In the case of having an overhang, it is not always necessary that the 3 ′ terminal side of the overhang has a sense sequence match with the target sequence on the mRNA and the complementarity of the antisense sequence.
  • shRNA Similar to siRNA, shRNA has a sense sequence corresponding to the target sequence on the 5 'side and an antisense sequence on the 3' side, and these paired with a certain length to form a stem. It has a loop site having a site to be processed by nuclease between these sequences. For this reason, shRNA is processed into intracellular siRNA. As described for siRNA, even in the sense sequence and the antisense sequence corresponding to the overhang site of siRNA derived from shRNA, matching and complementarity with the target sequence is not essential.
  • the length of the duplex in which the sense sequence and the antisense sequence in the nucleic acid construct of the present embodiment are paired is not particularly limited as long as an RNA interference effect is obtained, but is preferably 50 base pairs or less. It is typically 13 to 28 base pairs, more preferably 13 to 27 base pairs, and even more preferably 19 to 21 base pairs. Most preferred is 19 or 20 base pairs.
  • the sense sequence and antisense sequence including the 3′-side structure that does not form a duplex are typically 15 to 30 nt, more preferably 15 to 29 nt, and still more preferably Is 2: ⁇ 23nt. Most preferably, it is 21 or 22 nt.
  • the 3 ′ end protruding in siRNA is 2 to 4 nt.
  • the loop site in the shRNA forms a duplex (stem in shRNA) and a 3 ′ end structure in this manner. It shouldn't be difficult to hold, it should have the length of the loop part.
  • the target sequence of the target gene of the nucleic acid construct of this embodiment can be determined by appropriately applying the following rules, for example, and an appropriate siRNA or shRNA can be designed.
  • Target sequences that are AA (N19) TT, AA (N21), NA (N21), etc. in the CDS of the target gene (siRNA has 19 bases from the 3rd to 21st bases of these sequences) use),
  • the GC content should be around 50% (especially 47-52%).
  • siRNA design method including the determination method of other target sequences is http: http desig n.rnai.jp/sidirect/index.php ⁇ http://www.rockefeiler.edu/labheads/tuschl/sirna.html
  • Rational siRNAdesign for RNA interference (Nature Biotechnology, vol. 22, 326-330 (2004), Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese, Stephen Scaringe, William S Marshall & Anastasia Khvorova), Improved and automated prediction of effectiv e siRNA ( Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18; 319 (1): 264_74, Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL.) Etc.
  • VEGF siRNA for example, expression of human VEGF mRNA (GenBANK accession number NM_003376, Leung, DWetal .: Science, 246, 1306-1309, 1989; Keck, PJet al .: Science, 246, 1309-1312))
  • Examples of siRNA that can be suppressed include VEGF siRNA of # 1 to # 4 described in JP-A-2004-313141.
  • the sense sequence and the antisense sequence each have a 2 nt overhang site at the 3 ′ end.
  • the target sequence of these siRNAs is either 5A end of either AA or CA.
  • Such a nucleic acid construct can be synthesized by a known chemical synthesis method of polyribonucleotides such as a phosphoramidite method. It can also be synthesized using in vitro transcription methods. For example, a DNA encoding such a polyribonucleotide is synthesized and transcribed using a primer having an RNA promoter sequence such as a T7 RNA promoter and a DNA polymerase using the PCR method. A double-stranded DNA template can be synthesized and an in vitro transcription reaction can be performed on this double-stranded DNA template for transcription using RNA polymerase. In this way, a desired single-stranded RNA can be obtained.
  • a DNA encoding such a polyribonucleotide is synthesized and transcribed using a primer having an RNA promoter sequence such as a T7 RNA promoter and a DNA polymerase using the PCR method.
  • a double-stranded DNA template can be synthesized and an
  • siRNA a double-stranded RNA is prepared by hybridizing the antisense RNA and the sense RNA thus obtained, the ends are appropriately digested with RNase, etc., and the resulting double-stranded RNA is purified.
  • siRNA can be obtained.
  • shRNA a single-stranded RNA comprising a sense sequence and an antisense sequence, and a loop sequence trimmed by various base-specific RNases between these sequences is prepared, and the sense sequence and the antisense sequence are prepared. It can be obtained by annealing the sequence.
  • the thus obtained shRNA loop sequence can be treated with a base-specific nuclease to obtain siRNA.
  • the in vitro transcription method is not limited to this, and various methods are known and can be carried out using various commercially available in vitro transcription kits.
  • RNA construct such as siRNA or shRNA
  • the term “half life” refers to the half life when the half-life of the same unmodified RNA construct that is not stabilized in the same human serum is within 2 hours.
  • stabilized RNA constructs of this type can be found in any part of the polynucleotide.
  • Various known modifying groups for clease resistance can also be provided.
  • Such modifications can, for example, stabilize the 3 ′ overhang site against degradation.
  • they can be selected to be composed of purine nucleotides, particularly adenosine or guanosine nucleotides.
  • the lack of 2 'hydroxyl groups significantly enhances the nuclease resistance of overhangs in tissue culture media.
  • This type of nucleic acid construct can also include at least one modified nucleotide.
  • the modified nucleotide is located at a location where target-specific activity, e.g., RNA interference mediated activity, is not substantially affected, e.g., within the 5 'and / or 3' end region of a double stranded RNA molecule be able to.
  • overhangs can be stabilized by incorporating modified nucleotide analogs.
  • Preferred nucleotide analogs are selected from sugars or backbone modified ribonucleotides.
  • ribonucleotides with modified nucleobases ie, ribonucleotides containing non-naturally occurring nucleobases as described below, rather than naturally occurring nucleobases are also suitable.
  • non-naturally occurring nucleobases include uridine or cytidine modified at position 5, such as 5- (2-amino) propyluridine, 5-bromouridine; adenosine and guanosine modified at position 8, such as Dibromonucleotides, such as 7-diaza-adenosine; O- and N-alkylated nucleotides, such as N6-methyladenosine.
  • Preferred sugar-modified ribonucleotides have the ability to replace the 2 ′ OH group with a group selected from the group consisting of H, ⁇ R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 or CN, where R is C1 ⁇ C6 arnolequinole, alkenyl or alkynyl, halo is F, Cl, Br or I.
  • the phosphodiester group that binds the ribonucleotide that contacts P is substituted, for example, with a modifying group of a phosphoroate group.
  • nucleic acid construct is an embodiment of the RNA construct of the above-described embodiment, that is, a vector encoding the siRNA or shRNA so that it can be expressed.
  • a nucleic acid construct is preferable in that it can achieve continuous RNA interference.
  • the shRNA expression vector can be constructed so that a continuous single-stranded RNA capable of constructing shRNA by intracellular transcription is transcribed from the antisense sequence and the other loop sequence of the sense sequence.
  • the siRNA expression vector has a predetermined sense sequence and If it is configured to transcribe RNA with an antisense sequence.
  • the sense and antisense sequences may be expressed by a single vector or may be expressed by different vectors.
  • the promoter used in such an expression vector may be either polll or polIII as long as it can produce the corresponding RNA from each of the above DNAs.
  • the polIII promoter include a U6 promoter, a tRNA promoter, a retrowinores-dedicated LTR promoter, an adenovirus val promoter, a 5SrRNA promoter, a 7SK RNA promoter, a 7SL RNA promoter, and an HI RNA promoter.
  • polll promoters examples include cytomegalovirus promoter, ⁇ 7 promoter, ⁇ 3 promoter, S ⁇ 6 promoter, RSV promoter, EF-1 ⁇ promoter, ⁇ -actin promoter, ⁇ globulin promoter, SRa promoter, etc. it can.
  • the expression vector can take the form of a plasmid vector or a viral vector.
  • the type of vector is not particularly limited and can be selected according to the cell to be introduced.
  • retrovirus vectors for example, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (AAV), vaccinia virus vectors, lentiwinoles vectors, henolepus unoinoles vectors, anorefinoinoles vectors WINORELESS BETTER, such as EB WINORES BETTER, NO, PYRO-MA WINORES VECTOR, FORMY WINORES BETTER.
  • retrovirus vectors for example, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (AAV), vaccinia virus vectors, lentiwinoles vectors, henolepus unoinoles vectors, anorefinoinoles vectors WINORELESS BETTER, such as EB WINORES BETTER, NO, PYRO-MA WINORES VECTOR
  • Nucleic acid constructs in the form of these expression vectors are commercially available vectors constructed for the production of siRNA and shRNA, their protocols, and separate experimental medicine revised RNAi experimental protocols (Yodosha, 2004) (Established on October 1), etc.
  • the nucleic acid construct may be an antigene nucleic acid, an antisense nucleic acid, a decoy nucleic acid, or a ribozyme.
  • Antigene nucleic acid is DNA or RNA that has a base sequence complementary to DNA and suppresses the expression of a gene encoded by DNA by forming a double strand or triple strand with DNA.
  • Antisense nucleic acid has a complementary nucleotide sequence to any RNA (genomic RNA and mRNA) and forms a double strand with them. Those that suppress the expression (transcription, translation) of gene information encoded by the RNA.
  • the antisense sequence does not necessarily have to be completely complementary to the target sequence as long as it blocks the translation or transcription of the gene, or a modified base may be used.
  • the length of the antisense nucleic acid sequence to be designed is not particularly limited as long as it can inhibit gene expression, but it is, for example, 10 to 50 bases, preferably 15 to 25 bases.
  • a decoy nucleic acid (RNA) is, for example, a gene encoding a binding protein of an arbitrary transcription factor or an RNA having a binding site sequence of a transcription factor or a similar sequence, and these are used as “bait” in a cell. Introducing it suppresses the action of transcription factors.
  • a ribozyme refers to a substance that cleaves the mRNA of a specific protein and inhibits the translation of the protein.
  • a ribozyme can be designed from a gene sequence encoding a specific protein. For example, as a hammerhead ribozyme, the method described in FEBS Letter, 228; 228-230 (1988) can be used. Also, it can be used in the present invention if it cleaves the mRNA of a specific protein such as hairpin ribozyme and delta ribozyme, which are not limited to hammerhead ribozymes, and inhibits the translation of these specific proteins. Yes.
  • FIG. 2 shows an example of the flow of this operation.
  • Fig. 2 shows four types of flow with different timings of voltage application and addition forms of matrix materials.
  • Figures 2 (a) and (b) show the flow of applying voltage after the supply and arrival of the nucleic acid construct to the target tissue.
  • Figures 2 (c) and (d) show the supply of the nucleic acid construct to the target biological tissue. And the flow of applying voltage as it reaches is shown. Note that these operation flows are clearly shown for ease of explanation. The operations shown in these four types of flows may be used in combination. A part of these four types of flows may be used in combination.
  • the nucleic acid construct is supplied to the living tissue in advance or substantially simultaneously with the application of the voltage prior to the application of the voltage.
  • the nucleic acid construct may be supplied to the target biological tissue in any form. For example, injection, infusion, nasopharyngeal inhalation, skin absorption, oral, etc. is there.
  • the nucleic acid construct may be supplied systemically or locally.
  • a nucleic acid construct is administered by intravenous injection, oral administration, or the like, it is preferable to use a system that is preferably delivered to a target biological tissue.
  • a surgical method involving incision of the epidermis or the like may be used, or a percutaneous transluminal method may be used.
  • an endoscopic technique can be used.
  • the nucleic acid construct may be supplied around the target biological tissue or may be supplied to the inside thereof. Further, in consideration of the direction of voltage application, a larger number of nucleic acid constructs may be supplied to locations where they move in the direction of biological tissue. The specific supply site of such a nucleic acid construct is appropriately set in relation to the electrode form and the target tissue.
  • the nucleic acid construct is preferably supplied to a living tissue with an appropriate medium.
  • a biocompatible medium such as a predetermined buffer solution or physiological saline can be used.
  • a vasoconstrictor or the like may be included in the medium or supplied separately in order to suppress diffusion of the nucleic acid construct from the living tissue before voltage application.
  • a medium according to the dosage form of such dosage form can be used.
  • the nucleic acid construct may be supplied together with a matrix material capable of forming a biodegradable matrix in a living tissue.
  • a matrix material capable of forming a biodegradable matrix in a living tissue.
  • matrix materials that can supply biodegradable matrix to biological tissues include polysaccharides such as starch, alginic acid, hyanorelonic acid, chitin, chitosan, pectinic acid, agarose and their derivatives, or gelatin.
  • biopolymer materials such as various collagens such as atelocollagen (any type of collagen and its extraction method may be used).
  • polymers such as heat-sensitive polymers and polylactic acid-based polymers such as polylactic acid darlicolate, Matrigel (trade name, manufactured by BD Japan) and Pull Knick (trade name, manufactured by BASF Japan Ltd.) can also be used. it can.
  • collagen can be preferably used.
  • soluble collagen or solubilized collagen can be used.
  • soluble collagen include those that are soluble in acidic or neutral water or water containing a salt.
  • solubilized collagen include enzyme-solubilized collagen that is solubilized by an enzyme and alkali-solubilized collagen that is solubilized by an alkali.
  • the origin of collagen is not particularly limited, and those extracted from vertebrate force or their genetic recombinants can be used.
  • those extracted from mammals, birds, fish, or genetically modified organisms thereof can be used.
  • type I collagen extracted from the dermis of mammals or a recombinant thereof may be mentioned.
  • More preferable examples include type 1 collagen extracted from calf dermis and type 1 collagen produced by genetic engineering.
  • the type 1 collagen produced by genetic engineering is preferably derived from calf dermis or human dermis.
  • atelocollagen that has been obtained by enzymatically removing highly antigenic telopeptide or genetically produced atelocollagen is desired. More preferred.
  • collagen when used as a matrix material, for example, it can be set to about 0.001 v / v% or more and ⁇ / v% or less. Preferably, it is about 0 lv / v% or more and about 5 vZv% or less, and more preferably about 1.5 v / v% or more and 3.75 vZv% or less.
  • the nucleic acid construct may be supplied to the living tissue prior to reaching the living tissue separately from the nucleic acid construct.
  • the matrix material may be supplied to the site after the nucleic acid construct is supplied to or reached the living tissue. If the presence of the matrix material may reduce the efficiency of introduction of the nucleic acid construct, the matrix material may be supplied to the biological tissue after voltage application.
  • the matrix material is preferably administered locally to the target living tissue by injection, injection, or the like.
  • a voltage is applied to an electrode placed in a living tissue in the presence of a nucleic acid construct.
  • the cell membrane is perforated, and the nucleic acid construct is introduced into the cell.
  • the other is the timing of applying voltage while supplying the nucleic acid construct to the living tissue (Figs. 2 (c) and (d)).
  • an electrode is set at a predetermined position in the living tissue in advance, and in this state, the voltage is applied at a timing when the nucleic acid construct is supplied to and reached the living tissue. Will do.
  • the electrode is set on the living tissue at an appropriate timing prior to voltage application.
  • the voltage applied to the electrode may be 50 V or more and 70 V or less. Within this range, a current amount of about 0.2 A can be secured in a target living tissue such as a solid tumor. According to the present inventors, it has been found that this amount of current is an amount of current suitable for introducing a nucleic acid construct such as siRNA. If it is less than 50V, it is difficult to introduce a nucleic acid construct, and if it exceeds 70V, cell damage becomes strong and tissue is destroyed.
  • the electrode can be arranged in various modes with respect to the living tissue depending on the site of the living tissue, the form of the electrode, and the like.
  • the electrode in the case of a living tissue including a diseased tissue such as a solid tumor, the electrode can be arranged so that the diseased tissue is sandwiched between two or more electrodes, or at least one needle electrode is attached to the diseased tissue part. The remaining electrode may be brought into contact with the periphery of the affected tissue in a state where it is invaded.
  • a needle-like electrode is inserted under the bottom of the diseased tissue, and the other electrode is brought into contact with the epidermis covering the diseased tissue.
  • FIG. 3 shows the use of the electoral position device 2 shown in FIG. 1, and the presence of a nucleic acid construct such as siRNA using the solid tumor directly under the epidermis as the target biological tissue based on the flow on the left side of FIG.
  • a liquid containing a nucleic acid construct is injected into the central part of a solid tumor through the epidermis. The liquid is injected by injecting the injection needle at two or more central portions of the solid tumor so that the nucleic acid construct is evenly supplied and reached the solid tumor.
  • the needle-like electrode 10b is inserted below the bottom of the solid tumor supplied with the nucleic acid construct, and the plate-like electrode 10a is brought into contact with the epidermis covering the upper part of the solid tumor, so that the electrodes 10a, 10b Hold the legs 12a and 12b of the holder 12 firmly so as to maintain a constant distance as much as possible, and in this state, operate the pulse transmission means 6 of the main body 4 to apply square wave noise at a fixed period for a fixed time. To do. As a result, the cells in the living tissue to which the voltage is applied are perforated, and the nucleic acid construct is introduced into the cells from the pores.
  • the electrode 10b By connecting the electrode 10b to the negative terminal of the pulse generating means 6 and applying a voltage with the electrode 10a also connected to the positive terminal, it is supplied to the vicinity of the bottom of the solid tumor. Is thought to move to the upper side of solid tumors and be introduced into cells by perforation.
  • the plate-like electrode 10a and the needle-like electrode (preferably fork-like) 10b a pair of plate-like electrodes are used because the needle-like electrode 10b is inserted into the tissue side. It is presumed that the electric resistance value is lower than that.
  • the needle-like electrode 1 Ob and the plate-like electrode 10a face each other so that the subcutaneous tissue can be directly sandwiched between the two electrodes, or the needle-like electrode 10b is placed subcutaneously and the plate-like electrode 10a touches the epidermis. Even if it is sandwiched in contact with each other, it is possible to securely clamp a living tissue such as a solid tumor and to keep the distance between the electrodes constant.
  • the combination of the plate-like electrode 10a and the needle-like electrode 10b is preferable for realizing the electoral position by holding the living tissue directly or the subcutaneous tissue indirectly through the epidermis. It can be said.
  • nucleic acids capable of suppressing gene expression by RNA interference or the like in the cells of the target biological tissue by controlling the electoral position apparatus in the operations exemplified above.
  • the construct can be delivered easily, quickly and in large quantities.
  • naked nucleic acid constructs can be delivered without necessarily requiring a vector such as a viral vector categorized collagen. Therefore, the expression of the target gene can be effectively suppressed by the expression of the RNA interference effect or the like.
  • coexistence of a matrix such as collagen with the nucleic acid construct can improve the stability of the nucleic acid construct itself and maintain the introduction efficiency by maintaining the nucleic acid construct near the target tissue when a voltage is applied. it can.
  • this method also provides a method for preventing or treating a disease and improving a disease state by suppressing the expression of the target gene.
  • a nucleic acid construct that targets a gene that promotes angiogenesis is used, angiogenesis in a living tissue such as a tumor tissue into which the nucleic acid construct has been introduced can be suppressed.
  • angiogenesis can be inhibited by suppressing the expression of the target gene, the progression of cancer such as solid tumors, prevention or treatment methods, and intraocular neovascular diseases caused by angiogenesis (diabetic retinopathy and Also provided are methods for suppressing, preventing or treating the progression of diseases such as arteriosclerosis, and the method for inhibiting, preventing or treating the progression of inflammatory diseases such as rheumatism and atopic dermatitis.
  • the target gene is a viral gene or an endogenous gene related to the growth of the virus, a method for suppressing, preventing or treating the progression of infection by the virus is also provided.
  • the method for producing a non-human animal of the present invention one or two or more nucleic acid constructs capable of suppressing gene expression by RNA interference or the like in the non-human animal cells in the living tissue of the non-human animal are elected. It is characterized by being introduced by a position. That is, this production method is an embodiment in which the method for controlling the electoral position apparatus of the present invention is applied only to non-human animals. Therefore, non-human animals, nucleic acid constructs and electoral poles Regarding the Chillon device, its operation, etc., all of the above ranges apply to the method for producing non-human animals.
  • a non-human animal for example, a non-human animal in which expression of a desired gene is suppressed in a site-specific manner can be obtained. Even if the expression of a gene that is lethal according to embryo manipulation is suppressed, such gene expression can be easily suppressed, so a wide range of applications is expected.
  • two or more genes can be easily knocked down, and therefore, there is a research use such as a complex disease by suppressing the expression of two or more genes.
  • a non-human animal in which angiogenesis in living tissue is suppressed can be obtained.
  • Such a non-human animal can easily evaluate the therapeutic effect by suppressing angiogenesis or the effect of combination with other treatments.
  • the non-human animal is a post-natal individual.
  • Such non-human animals have, for example, cells or living tissues in which expression of one or more target genes is suppressed.
  • the method for producing a non-human animal of the present invention knockdown of one or more genes in a desired cell or biological tissue can be easily realized.
  • nucleic acid constructs such as siRNA that can suppress gene expression by RNA interference, etc.
  • targeting disease-related genes as nucleic acid constructs
  • the resulting non-human animals may have transient or local diseases. Since it becomes a model animal, a screening system for searching for therapeutic agents using such non-human animals is also provided.
  • a non-human animal having a disease state, gene mutation, or biological tissue or cell phenotype that can serve as a human disease model such as a disease model animal is prepared as the non-human animal.
  • One or two or more nucleic acid constructs capable of suppressing gene expression by RNA interference or the like can be introduced into this non-human animal by targeting related genes such as these diseases.
  • a non-human animal for introducing a nucleic acid construct a commercially available disease model animal may be used, or a normal non-human animal may be used. It is also possible to pre-treat non-human animals so that they become human disease models.
  • a non-human animal may be artificially formed with a tumor or infected with a virus.
  • administration of a mutagen, viral infection, transplantation of a tumor cell or tumor tissue, growth of the tumor cell at the transplantation site, expansion of the tumor tissue, or transplantation of the tumor This may be caused by forming a metastatic site originating from the site.
  • the analysis of morbidity and the phenotype of biological tissue or cells include all analyzes for evaluating whether the disease has been improved, treated or prevented. Is included.
  • pathological analysis includes observation of diet, excretion, activity, etc., appearance and observation of whole body and body part
  • analysis of biological tissue or cell phenotype includes observation of biological tissue or cell or tissue
  • cell-specific gene and protein expression and activation measurement, metabolite measurement, and the like can be mentioned.
  • RNA in a non-human animal is inserted into a cell of a non-human animal living tissue having a disease state, gene mutation, or living tissue or cell phenotype that is a model of a human disease.
  • One or two or more nucleic acid constructs capable of suppressing gene expression due to interference or the like are introduced by electoporation, and the disease state or biological tissue or cell phenotype in the non-human animal into which the nucleic acid construct is introduced is determined. It is characterized by analysis. According to this method, since the nucleic acid construct is introduced by electopore position, it is possible to easily evaluate the effectiveness of the introduced nucleic acid construct against the disease.
  • an effective screening system capable of selecting a nucleic acid construct as a gene therapy agent is provided.
  • non-human animal the nucleic acid construct, the electoral position device and the operation thereof in the search method of the present invention.
  • a non-human animal having a disease state or gene mutation that can serve as a human disease model can be produced by the technique described in the above-mentioned method for producing a non-human animal.
  • Method for searching for therapeutic agents drugs such as low molecular weight compounds
  • one or two or more nucleic acid constructs capable of suppressing gene expression by RNA interference or the like in the non-human animal cell in a living tissue of a non-human animal are elected.
  • a nucleic acid construct is introduced into a non-human animal by an electoral position to form a human disease state, and a compound is administered to analyze the effect, the non-human animal is analyzed.
  • a compound is administered to analyze the effect
  • the non-human animal is analyzed.
  • an effective screening system capable of selecting a drug containing a low molecular compound as an active ingredient.
  • the administration mode of drug candidates such as low molecular compounds is not particularly limited, and various conventionally known forms such as oral, injection, infusion and the like can be adopted.
  • the method of searching for a target compound for drug discovery comprises one or more types capable of suppressing gene expression by targeting RNA associated with a disease-related gene in a non-human animal living tissue.
  • Two or more kinds of nucleic acid constructs are introduced by an electoral position, and the phenotype of the biological tissue or cell into which the nucleic acid construct is introduced is analyzed.
  • a target compound for preventing or treating the disease can be found by analyzing the phenotype of the cell or biological tissue.
  • a screening system for searching for a compound that activates or inhibits the compound is provided.
  • the expression type analysis of cells or biological tissues includes, for example, observation of such cells or biological tissues, cell activation state, expression level and activation of proteins, measurement of various metabolites, etc.
  • the disease-related gene is not limited to a gene that is clearly related to a disease but may be a gene that may be related to a disease.
  • one or more nucleic acid constructs that can suppress gene expression by RNA interference or the like are used as animal cells or living organisms. By introducing it into at least a part of the tissue with electo mouth position, Knockdown by gene silencing due to RNA interference or the like can be realized in a living body simply and quickly.
  • siRNA or shRNA, and more preferably siRNA RNA constructs can be directly silenced in the living body by directly performing gene silencing in the living body.
  • hVEGF-A human VEGF-A (GenBank accession number NM-003376), and its knockdown effect was examined in vitro. .
  • the target sequences of hVEGF-A of five types of siRNA are shown in FIG. 4 and SEQ ID NOs ::!-5. Note that the gene sequence in FIG. 4 is CDS.
  • the sense sequence of the synthesized siRNA is shown in SEQ ID NOs: 6 to 10 and the form as a double-stranded RNA is shown in FIG. All siRNAs were synthesized by Dharmacon based on the target sequence.
  • siRNAs were evaluated by their inhibitory effect on hVEGF-A expression in PC-3 cells.
  • Human prostate cancer cell PC-3 (ATCC) is plated in a 35mm dish (2 X 105 cells / dish), left to stand for 1 ⁇ , and then each siRNA is treated with a cationic lipid reagent (lipofectamine's brass under serum-free conditions). : Invitrogen Corp.) (37 ° C, 4 hours). After introduction, 10% F BSlml was added, cultured for 6 hours, replaced with serum-free medium containing 20 ig / ml heparin, and cultured for 16 hours. The culture supernatant was collected, and the Quantikinehuman VEGF ELISA kit (R & DSystems HVEGF-A concentration was measured. The results are shown in FIG.
  • siRNAs # 2 and # 3 showed a high level of hVEGF-A inhibitory effect, and # 3 siRNA showed the highest level of inhibitory effect.
  • Example 2 In this example, using # 3 siRNA of Example 1 (modified with a stabilizing modification group) and siRNA stabilized based on the same target sequence as # 3 siRNA, The inhibitory effect of hVEGF-A expression was confirmed.
  • the stabilized siRNA was synthesized as siSTABLE (trademark of Dharmacon), a siRNA modified by the company's stabilization modification group based on the target sequence of # 3. .
  • siRNAs were evaluated by their inhibitory effect on hVEGF- ⁇ expression in PC-3 cells.
  • Human prostate cancer cell PC-3 (ATCC) is plated in a 35mm dish (2 X 105 cells / dish), left to stand for 1 ⁇ , and each siRNA is cation lipid reagent (Lipofectamine 'plus under serum-free conditions: Invitrogen Corp.) (37 ° C, 4 hours). After the introduction, 10% FBSlml was added, cultured for 6 hours, and then replaced with a serum-free medium containing 20 ⁇ g / ml heparin, and the culture was continued.
  • the culture supernatant was collected 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours later, and the hVEGF A concentration was measured with a Quantikinehuman VEGF ELISA kit (R & DSystems).
  • the VEGF-A concentration was measured in the same manner for the unmodified siRNA for the scrambled sequence with respect to the # 3 target sequence and the siRNA stabilized by siSTABLE by Dharmacon. These results are shown in Figure 7.
  • # 3 stabilized siRNA had a knockdown rate of about 70% 48 hours after introduction, but it tended to exert a strong RNAi effect over time.
  • # 3 Unmodified siRNA showed a tendency to gradually attenuate the RNAi effect After 168 hours, RNAi effect of # 3 unmodified siRNA still maintained about half of that of stabilized siRNA .
  • # 3 All siRNAs with siRNA scrambled sequences were potent at all with no RNAi effect. In addition, even with mock (introduced lipid reagent only), hVEGF-vaginal secretion did not change.
  • the optimum voltage for introducing siRNA into the tumor was determined by electoral positioning.
  • the introduction method by the elect mouth position is shown below.
  • V (Short axis) 2 X (Long axis) ⁇ 2
  • a plate and fork-type electrode with the configuration shown in Fig. 1 (platinum rectangular plate electrode: 6.67 mm x 3.87 mm, stainless steel fork electrode: three forks, length 6.67 mm, A pad pre-soaked with PBS was pasted on the plate electrode side with an interval of 1.3 mm (manufactured by Nepagene). Stable baboon siRNA in PBS was injected into the central part of the raised subcutaneous tumor at a total of 20 ⁇ l in two, 10 / il.
  • the fork-like electrode side was stabbed into the lower part of the subcutaneous tumor, and the plate-like electrode was placed on the epidermis of the upper part of the tumor.
  • power was supplied with CUY21 (Neppa Gene).
  • the antitumor effect (therapeutic effect) of siRNA by electo mouth position was evaluated.
  • the method is shown below.
  • PBS was injected into the tumor (10 ⁇ IX twice), and a group to be energized was also set.
  • Figs. 9 (a) to 9 (d) photographs of the appearance of the tumor on the 40th day from the start of treatment are shown in Figs. 9 (a) to 9 (d).
  • Fig. 9 (a) shows the tumor appearance of a stabilized siRNA with a siRNA amount of 500 pmolZ (with electoral mouth position)
  • Fig. 9 (b) shows the tumor appearance of only PBS (with electoral mouth position).
  • Fig. 9 (c) is a scrambled and stabilized siRNA with a scrambled sequence, and the appearance of the tumor with an siRNA amount of 500 pmol / tumor (with electoral position).
  • Fig. 9 (d) No treatment (elect It is the appearance of the tumor (without mouth position).
  • tumors and scrambles treated with stabilized siRNA 500 pmol / tumor
  • intratumoral microvessel density was measured by immunochemical staining using CD31 (surface antigen on vascular endothelial cells) as a marker. Tumors at 10, 20, and 30 days from the start of treatment were examined. The result is shown in FIG.
  • siRNA delivery by electoporation is a simple and rapid technique, is excellent in local application, and has a high therapeutic effect.
  • the intratumoral microvessel density was clearly reduced in the group treated with the stable siRNA compared to the group treated with the stabilized siRNA having a scrambled sequence. From the above results, it was proved that the cancer growth inhibitory effect of this treatment was due to the mechanism of the suppression of intratumoral angiogenesis caused by the decrease of intratumoral hVEG F_A amount by siRNA.
  • m 3 ) (10 ⁇ IX 2 times) immediately pierce the fork side of the plate and fork electrode into the lower part of the tumor, and place the plate electrode in contact with the epidermis to hold the subcutaneous tumor and energize ( Set voltage is uniform 70V).
  • siRNA was introduced so as to be 250 pmol per tumor.
  • a solution containing unmodified # 3 siRNA (12.5 ⁇ ) and atelocollagen (1.75%) was injected into the subcutaneous tumor so that the siRNA amount was the same (10 ⁇ 1 X 2 times ) To be set.
  • PBS was injected into the subcutaneous tumor (10 ⁇ IX twice), and a group was energized. The first treatment day was dayO, and the above treatment was performed again 20 days later, and the size of each tumor was measured until 40 days later. The results are shown in FIG.
  • the group in which the stabilized # 3 siRNA alone was introduced by electoral position was the group in which unmodified # 3 siRNA was introduced with atelocollagen (comparison) Example) There was more therapeutic effect than (black triangle mark). From the above, it was found that the siRNA electrophoretic introduction method can provide a better siRNA action expression effect than the atelocollagen introduction method, that is, a gene expression suppression effect and a tumor suppression effect. .
  • CUY21 manufactured by Nepagene
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • the subcutaneous electrode may be directly sandwiched between both electrodes by making the needle-like electrode and the plate-like electrode face each other. Even if the needle-like electrode is placed under the skin and the plate-like electrode is sandwiched through the epidermis, a living tissue such as a solid tumor can be securely sandwiched and the distance between the electrodes can be kept constant. . For this reason, it is estimated that a high amount of current is easily obtained. In addition, since angiogenesis is active inside the tumor and vascular permeability is high, it is considered that the amount of current can be easily secured by inserting a needle-like electrode near the tissue.
  • the combination of the plate-like electrode and the needle-like electrode is preferable for realizing an electoral position by directly holding the living tissue or indirectly holding the subcutaneous tissue through the epidermis.
  • the target biological tissue is a tumor tissue (especially a subcutaneous tumor tissue) and the target gene of a nucleic acid construct such as siRNA to be introduced is vascular endothelial growth factor (VEGF), a plate
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present invention is useful in the manufacture and use of an electo-portion positioner. Sequence listing free text

Abstract

　ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロポレーション装置の制御方法を、前記動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトの存在下、前記動物の生体組織に対して配置される前記エレクトロポレーション装置の電極に電圧を印加する工程、を備えるようにする。こうすることで、核酸コンストラクトは効率的に生体内の細胞に導入される。

Description

明 細 書
エレクト口ポレーシヨン装置の制御方法
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨン（ electroporation:電気穿孔法）により生体に導入する技術及びその利用に関する。 背景技術
[0002] 近年、細胞に RNA干渉により遺伝子の発現の抑制を引き起こす核酸コンストラクト を導入することにより、細胞内において所望の遺伝子の発現を抑制する試みが行わ れている。 RNA干渉による遺伝子発現の抑制は、各種疾患の予防又は治療への適 用が期待されており、生体へのこうした核酸の有効な導入手法や RNAの安定化など が試みられている。
[0003] 例えば、ァテロコラーゲンを用いた標的組織へのデリバリー法が既に開示されてい る（Y. Takeiら、 CANCER RESEARCH 64, 3365-3370, MAY 15, 2004) 0このデリバリ 一法により、マウスにおいて高い抗腫瘍効果が認められている。ァテロコラーゲンは、 siRNAと複合体を構成した状態で組織に投与されるため、細胞への取り込み効率が 高まるとともに siRNAが安定化されるものと考えられてレ、る。 発明の開示
[0004] siRNA等の核酸コンストラクトによって RAN干渉を発現させるにあたっては、細胞 への導入効率が最も重要である。ァテロコラーゲンは生体適合性に優れるマトリック スであり、ァテロコラーゲンによるデリバリーシステムは徐放性の向上と生体内安定性 (持続性）の向上への寄与が大きい反面、生体内への細胞への導入効率という面か らみるとまだ改善の余地がある。したがって、ァテロコラーゲンによる核酸コンストラクト のデリバリー法は、必ずしも RNA干渉を利用した各種の態様の遺伝子サイレンシン グに十分な方法ではなかった。また、できるだけ核酸コンストラクトを nakedな状態で 導入することも望まれている。
[0005] 現在までに、エレクト口ポレーシヨンによりプラスミド DNAの生体組織への導入が試 みられており、 in vivoでの遺伝子産物の発現に成功している。一方、 siRNAなどの R NA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトの各種細胞に対する デリバリーは、その手法により大きく遺伝子発現抑制効果が異なることが知られている 。また、 siRNAなどの RNA干渉を発現する核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨン によって導入することにより in vivoで遺伝子サイレンシングを実現したことは確認され てはいない。
[0006] そこで、本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを生体に導入す るための有効な技術及びその利用を提供することを一つの目的とする。また、本発明 は、表皮経由で表皮下近傍の標的組織に効果的に前記核酸コンストラクトを導入す るための技術及びその利用を提供することを他の一つの目的とする。
[0007] 本発明者は、遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーショ ンにより生体内に導入することにより、前記生体において遺伝子サイレンシングが可 能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が 提供される。
[0008] 本発明の一つの態様によれば、ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロボ レーシヨン装置の制御方法であって、前記動物において遺伝子の発現を抑制可能な 核酸コンストラクトの存在下、前記動物の生体組織に対して配置される前記エレクト口 ポレーシヨン装置の電極に電圧を印加する工程、を備える、方法が提供される。
[0009] この態様においては、前記核酸コンストラクトは、一本鎖又は二本鎖 DNA、一本鎖 又は二本鎖 RNA、 DNA—RNAハイブリッド及び DNA—RNAキメラオリゴヌクレオ チドから選択することができる。また、前記核酸コンストラクトは、前記動物において R NA干渉を発現可能な核酸コンストラクトとすることもできる。さらに、前記核酸コンスト ラクトは、 siRNAであることが好ましレ、。核酸コンストラクトが siRNAのとき、修飾により 血清中での安定性が向上されていることが好ましぐ前記核酸コンストラクトは、ヒト血 清中での半減期が 50時間以上であることが好ましい。なお、この半減期とは、安定化 されていない同一構成の核酸コンストラクトが、ヒト血清中における半減期が 2時間以 内のときの半減期である。
[0010] また、この態様においては、前記核酸コンストラクトは、血管新生を促進する遺伝子 を標的として RNA干渉を発現可能なコンストラクトであることが好ましい。こうした遺伝 子として、例えば、血管内皮増殖因子遺伝子が好適な遺伝子である。
[0011] さらに、この態様においては、前記生体組織は固形腫瘍を含むことができる。さらに また、この態様においては、前記生体組織は表皮又は表皮下に存在する組織とする こと力 Sできる。
[0012] 本発明の一つの態様によれば、前記電極に電圧を印加するのに先立って若しくは 印加後又は同時に、前記生体組織又はこれらの近傍に生分解性マトリックス材料を 供給する工程を備えることが好ましい。また、前記電圧印加工程は、前記核酸コンス トラタトを前記生体組織又はその近傍に供給した後又は供給しつつ前記生体組織に 対して配置される前記電極に電圧を印加する工程とすることができる。
[0013] さらにまた、この態様においては、前記電極は少なくとも一つのプレート状電極を備 えることもできるし、前記電極は、 1本又は 2本以上のニードル状電極を備えることもで きるし、さらに、このニードル状電極には、前記核酸コンストラクトを含む液体が通過 可能な中空部と開口とを備えることもできる。また、前記エレクト口ポレーシヨン装置は 対極となる電極としてプレート状電極とニードル状電極とを備えることもできる。
[0014] 本発明においては、前記プレート状電極は前記核酸コンストラクトを導入しようとす る生体組織の表面に対して配置し、前記ニードル状電極は前記生体組織又はその 近傍に穿刺して配置することもできる。また、前記生体組織は皮下固形腫瘍であり、 前記プレート状電極は、前記皮下固形腫瘍を覆う表皮表面に当接して配置し、前記 ニードル状電極は、前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することもできる。さ らに、前記電極に印加する電圧は 50V以上 70V以下とすることもできる。
[0015] 本発明の別の一つの態様によれば、ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレク トロポレーシヨン装置の制御方法であって、前記動物において RNA干渉を発現可能 な siRNAの存在下、前記動物の表皮下の罹患組織の下部に配置されたニードル状 電極と前記罹患組織を覆う表皮表面に配置されたプレート状電極とに対して所定の 電圧を印加する工程、を備える、方法が提供される。この態様においては、前記動物 はヒトであり、前記罹患組織は血管新生阻害によって進行抑制、改善又は治療が可 能な組織を含んでレ、ることが好ましレ、態様である。 [0016] また、本発明のさらに別の一つの態様によれば、非ヒト動物の作製方法であって、 前記非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制 可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入する工程、を備える方法 が提供される。この態様においては、前記核酸コンストラクトは、疾患関連遺伝子を標 的として RNA干渉を発現可能な核酸コンストラクトであることが好ましい態様である。
[0017] さらにまた、本発明の別の一つの態様によれば、非ヒト動物の作製方法であって、ヒ トの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表 現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、該非ヒト動物の生体組織の細胞内 に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口 ポレーシヨンにより導入する工程、を備える方法が提供される。
[0018] 本発明の別の一つの態様によれば、治療剤の探索方法であって、ヒトの疾患モデ ルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有する 前記非ヒト動物を準備する工程と、該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動 物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンに より導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記モデル動物における病 態又は前記生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備える、方法が提 供される。
[0019] 本発明の別の一つの態様によれば、治療剤の探索方法であって、非ヒト動物の生 体組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンス トラタトをエレクト口ポレーシヨンにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部におい てヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、こ の非ヒト動物に 1種又は 2種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織若しく は細胞の表現型を解析する工程と、を備える、方法が提供される。
[0020] さらに、本発明の別の一つの態様によれば、創薬のための標的化合物の探索方法 であって、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を 標的として遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンによ り導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表 現型を解析する工程と、を備える、方法が提供される。 図面の簡単な説明
[0021] [図 1]エレクト口ポレーシヨン装置の一例を示す図。
[図 2]核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンによって生体組織の細胞内に導入す る操作フローの例（a)〜（d)を示す図。
[図 3]エレクト口ポレーシヨン装置を用いて核酸コンストラクトを導入する操作の一例を 示す図。
[図 4]hVEGF— Aの mRNA(CDS)に対する siRNAの標的部位配列を示す図。
[図 5]各種 siRNAの構造を示す図。
[図 6]各種 siRNAによる PC— 3細胞における hVEGF— A発現の抑制効果を示す図
[図 7]安定化 siRNA、非修飾 siRNA及びこれらのスクランブル siRNAによる PC - 3 細胞における VEGF— A発現の抑制効果を示す図。
[図 8]siRNAのエレクト口ポレーシヨンによる抗腫瘍効果（治療効果）を示す図。
[図 9]治療開始 40日目の腫瘍の外観写真 (a)〜（d)を示す図。
[図 10]腫瘍内微小血管密度を CD31をマーカーとして用いた安定化 siRNA投与群 及びスクランブル配列を有する安定化 siRNA投与群の免疫化学的染色像を示す図
[図 11]実施例 6における siRNAのエレクト口ポレーシヨンによる抗腫瘍効果（治療効 果)を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明の一つの態様としてのヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロボレ ーシヨン装置の制御方法は、前記動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コ ンストラタトの存在下、前記動物の生体組織に対して配置される前記エレクト口ポレー シヨン装置の電極に電圧を印加する工程、を備えることを特徴としている。この方法に よれば、前記動物の生体組織に配置される電極への電圧に印加により、生体組織を 構成する細胞表面が穿孔され、細胞内に核酸コンストラクトが導入可能な状態となる 。核酸コンストラクトは細胞内に導入された際、所定の遺伝子の発現を抑制すること ができる。
[0023] また、本発明の他の一つの態様としての非ヒト動物の作製方法は、前記非ヒト動物 の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コ ンストラタトをエレクト口ポレーシヨンにより導入する工程、を備えることを特徴としてレヽ る。この方法によれば、前記生体組織の細胞内にエレクト口ポレーシヨンにより核酸コ ンストラタトが導入されることにより、その細胞内において遺伝子の発現が抑制された 非ヒト動物が取得される。
[0024] また、本発明のさらに他の一つの態様としての治療剤の探索方法は、ヒトの疾患モ デルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有 する前記非ヒト動物を準備する工程と、該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒ ト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーショ ンにより導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記モデル動物におけ る病態又は前記生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備えることを 特徴としている。この探索方法によれば、細胞内に前記核酸コンストラクトが導入され 、遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物における病態等を解析することにより、核酸 コンストラクトの前記疾患に対する有効性を容易に評価することができる。この結果、 所定の疾患の治療や予防に有用な核酸コンストラクトをスクリーニングすることができ る。
[0025] さらに、本発明のさらに他の一つの態様としての治療剤の探索方法は、非ヒト動物 の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸 コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部 においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成するェ 程と、この非ヒト動物に 1種又は 2種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織 若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備えることを特徴としている。この探索方 法によれば、前記非ヒト動物における病態等を解析することにより、前記化合物の前 記疾患に対する有効性を容易に評価することができる。この結果、所定の疾患の治 療ゃ予防に有用な薬剤をスクリーニングすることができる。
[0026] さらにまた、本発明の他の一つの態様としての創薬のための標的化合物の探索方 法は、非ヒト動物の少なくとも一部の生体組織又は細胞に存在する 1種又は 2種以上 の疾患関連遺伝子を標的として遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを、ェ レクト口ポレーシヨンによって前記生体組織又は細胞に導入する工程と、前記核酸コ ンストラタトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析する工程と、を備え ることを特徴としている。この探索方法によれば、前記生体組織又は細胞の表現型を 解析することにより前記疾患関連遺伝子の発現抑制によって活性化若しくは発現量 が増大する化合物や不活性化又は発現量が低下する化合物を見出すことができる。 こうした化合物又はその化合物の活性を阻害剤は、前記疾患を予防又は治療する薬 剤のための標的化合物となりえ、本発明の探索方法によれば、創薬のための新たな 標的化合物を提供して前記疾患の予防や治療に有用な薬剤のスクリーニング系を 提供すること力 Sできる。
[0027] これら本発明のいずれの態様においても、前記核酸コンストラクトはエレクトロボレ ーシヨンにより動物の生体組織の細胞に導入される。さらに、エレクト口ポレーシヨンの 電極の少なくとも一つとしてニードル状電極を用いることで、表皮経由で表皮下近傍 の標的組織に対して効果的に核酸コンストラクトが導入される。
[0028] 本発明を拘束するものではないが、本発明者が見出した、 RNA干渉を発現する核 酸コンストラクト等がエレクト口ポレーシヨンにより生体組織の細胞内に導入されること で良好な発現抑制効果を発揮する現象は、エレクト口ポレーシヨンによる導入効率、 核酸コンストラ外分子の大きさ（分子のストークス径)等が関与しているものと推論さ れる。まず、第一に、エレクト口ポレーシヨンは、極めて短時間で細胞内へと核酸コン ストラクトを導入できるため、従来であれば細胞内に導入するまでに分解されてしまう であろう核酸コンストラクトが細胞内に導入されることで導入時点において高い核酸コ ンストラタトの細胞内濃度が達成され、それにより予想外の発現抑制効果が発揮され ていると考えられる。したがって、 DNAコンストラクトの他、一般的に不安定とされる si RNA等の RNAコンストラクトなど比較的低分子の核酸コンストラクトであっても高い 発現抑制効果が得られると考えられる。
[0029] また、エレクト口ポレーシヨン法によれば、細胞膜が電気的に穿孔されるのであるが 、こうした電気的刺激による穿孔部分と siRNAなどの低分子の核酸コンストラクトに親 和性が高レ、かあるいはこうした核酸コンストラクトが従来の一般的な DNA発現べクタ 一等に比較して小さい分子であるために容易に通過できたことが考えられる。本発明 者らによれば、通常、電気穿孔法により細胞膜に孔 (pore)が形成された場合、その p ore径と導入される分子の径にある一定の平衡状態の関係が構築されると推論して いる。すなわち、例えば、分子量 1000程度の低分子化合物は、 poreを通過して細 胞に導入されやすいが、この反応は平衡反応であるため、導入された低分子化合物 は、同時に細胞外へ出やすいという不利益をあわせ持つ。 siRNA (分子量約 13000 )などの低分子の核酸コンストラクトは、ほどよい分子量 (分子径）をもち、電気穿孔に より一たび細胞内に導入されれば、細胞外へ出にくいという利点を備えている。こうし た傾向は、細胞レベルでのエレクト口ポレーシヨンよりも生体組織に対するエレクト口 ポレーシヨンにぉレ、てより顕著であると考えられる。
[0030] さらに、コラーゲン等のマトリックスを核酸コンストラクトと共存させることで、核酸コン ストラクトを導入しょうとする細胞又は組織近傍に核酸コンストラクトを高濃度に維持で きること力考えられ、これにより、効率的に核酸コンストラクトが導入されたものと考えら れる。
[0031] 以下、本発明を実施するための最良の形態について、本発明の上記した各種態様 について説明する。
[0032] (エレクト口ポレーシヨン装置の制御方法）
(ヒト及び非ヒト動物）
本発明のエレクト口ポレーシヨン装置の制御方法は、ヒト及び非ヒト動物を含む動物 におけるエレクト口ポレーシヨン装置の使用に関連してレ、る。本明細書にぉレ、て非ヒト 動物とは、ヒト以外の霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等 の動物を包含している。哺乳類としては、ラット、マウス、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、ゥ マ、ャギなどの家畜動物、ィヌ、ネコなどのペット動物が挙げられる。魚類としては、ゼ ブラフィッシュ、メダカなどが挙げられる。特に、疾患モデルや研究用としては、ラット、 マウス、ゥサギ、ィヌ、ブタ、ゼブラフィッシュ、メダカなどが好ましく用いられる。なお、 本発明におけるヒト及び非ヒト動物は、胚、胎生及び生後個体のいずれの状態も包 含するが、本発明の制御方法のほか、非ヒト動物の作製方法、治療剤の探索方法、 創薬のための標的遺伝子の探索方法等においては、生後の個体を用いることが好ま しい。
[0033] (生体組織）
本発明の制御方法は、こうした動物の生体組織に配置されたエレクト口ポレーシヨン 装置の電極に電圧を印加する。動物の生体組織としては、特に限定しない。後述す るように生体組織に配置される電極の形態を選択すること及び電極の配置のための 生体組織の切開等の処置の採用により、動物の表皮近傍のみならず、内部の生体 組織の全てを対象とすることができる。電圧の印加を経皮的に行うことを考慮すれば 生体組織は表皮又は表皮下 (表皮直下あるいはその近傍）であることが好ましい。こ のような部位であれば、電極の少なくとも一部がニードル状などであって表皮に侵入 可能な形態であれば、容易にこうした部位に電圧を印加することができる。例えば、 経皮的に導入操作のしゃすい生体組織としては、膝などの各種関節が挙げられる。 関節は、表皮直下にあるとともに体外へ突出している点からも好ましい。その他、歯 周組織などの口腔内も好ましい。なお、電極形態によっては血管などを介して経管 的に到達できる生体組織も好ましい。また、内視鏡手術の手法により経口、経肛門又 は経膣的若しくは経腹腔的な手法によって電極を配置可能な生体組織も好ましい。
[0034] また、生体組織としては固形腫瘍を含む組織であることが好ましい。エレクトロボレ ーシヨン装置によれば、固形腫瘍細胞内に核酸コンストラクトを導入できるからである 。特に、本方法によれば、表皮直下又はその近傍の固形腫瘍に対しては経皮的な治 療が可能となる。
[0035] (エレクト口ポレーシヨン装置）
本発明におけるエレクト口ポレーシヨン装置としては、一般的なエレクト口ポレーショ ン装置を利用できる。図 1には、エレクト口ポレーシヨン装置 2の一例を示す。エレクト 口ポレーシヨン装置 2は、本体 4と、本体 4にケーブル 14とホルダー 12とを介して接続 される電極部材 20を備えることができる。本体 4にはパルス発生手段 5を備えることが できる。パルス発生手段 6は、ケーブル 10及びホルダー 14内を揷通する導線を介し て電極 10a、 10bに電圧を印加することができる。パルス発生手段 6としては、一般交 流電源を用いて電気パルスとして AC (交流）パルス、ェクスポネンシャルパルス、 DC (直流）パルスなどを印加できるものが知られている。特に限定しないが、 DCパルス を印加できるものが好ましい。パルス波形としては、方形波が好ましい。方形波は、セ ットされた電圧まで急激に上昇し所定時間（パルス長）だけその電圧を維持し、再び 急激に 0値にまで降下する波形である。より好ましくはこうした方形波を 1秒間に複数 回、好ましくは 99回までの周期で印加できるパルス発生手段を用いる。なお、ここで 一周期とは、パルスのオン時間とオフ時間との時間和をいう。
[0036] なお、本体 4には、インピーダンス測定手段 8を備えることもできる。インピーダンス 測定手段 8は、パルス印加前又はその後において電極 10a、 10b間のインピーダンス (抵抗値)を測定することができる。
[0037] 本装置 2は、本体 4のパルス発生手段 6に電気的接続される少なくとも一対の電極 1 0a、 10bを備えることができる。図 1に例示する電極 10aは、長方形状のプレート状の 導体（例えば白金）であり、電極 10bは、 3本のニードル状体が整列して全体としてフ オーク状を形成して、電極 10aに対向するように配置されている。こうしたプレート状 電極は、表皮、粘膜、器官及び臓器などの生体組織、すなわち、核酸コンストラクトを 導入しょうとする生体組織に当接させて用いることが好ましい。電極 10bの 3本のニー ドル状体は、 3本がほぼ同様に緩やかに屈曲して、皮下の生体組織に侵入させやす くなつている。なお、本発明において用いることのできるニードル状電極は、 1本又は 2本以上のニードル状体で構成されていればよレ、。また、複数本のニードル状体の 配列状態は特に限定しないが、例えば、互いに平行に一列又は複数列に整列させ ることができる。こうしたニードル状電極は、核酸コンストラクトを導入しょうとする生体 組織又はその近傍に穿針して用いることが好ましい。
[0038] 本発明においては、プレート状電極とニードル状電極とを用いるとともに、プレート 状電極は核酸コンストラクトを導入しょうとする生体組織の表面に対して配置し、ニー ドル状電極は前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することができる。こうする ことで、生体組織に核酸コンストラクトを導入しやすい電流量を容易に確保でき、核酸 コンストラクトを確実に導入することができるようになる。また、生体組織が皮下固形腫 瘍であるときには、プレート状電極は、皮下固形腫瘍を覆う表皮表面に当接して配置 し、前記ニードル状電極は、前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することも できる。こうすることで、安定して皮下固形腫瘍を保持でき、この結果、核酸コンストラ タトを確実にかつ効率的に導入することができるようになる。
[0039] さらに、プレート状電極を表皮に当接させるとともにニードル状電極を表皮下の固 形腫瘍等の標的組織下に配置することにより、表皮下の組織に対して効果的に核酸 コンストラクトを導入することができる。特に、表皮を介した場合には、通常、電流量が バラツキやすくし力も低下しやすレ、が、表皮下の生体組織に対して電極をこのように 配置することによって、相対的に低い電圧であってもコンストラクトに十分な電流量を 供給して導入効率を確保するほか、処置の低侵襲性を向上させることができる。
[0040] 本発明者らによれば、後述する実施例で形成した固形腫瘍に対してプレート状電 極とプレート状電極との組み合わせ（固形腫瘍を挟むように保持）で通電した場合に 比して、プレート状電極とニードル状電極との組み合わせ（固形腫瘍の底部にニード ル状電極を差し込むとともに固形腫瘍の上部にプレート状電極を配置して挟むように して保持）を用いた方が、十分な電流量を確保できることを確認している。すなわち、 プレート状電極とニードル状電極（特に 2本以上のニードル状電極が整列されたもの )を用いること又は標的細胞を含む生体組織に対してその表面とその内部とに対して 電極を配置することにより、生体組織に意図した電流量を安定して供給できるという 利点があるといえる。意図した電流量の安定した供給は、エレクト口ポレーシヨンによ る核酸コンストラクトの安定かつ確実な導入を実現するために有利である。
[0041] なお、電極 10a、 10bはこうしたプレート状電極とニードル状電極の組み合わせに 限定するものではなレ、。また、本発明において用いる電極の組み合わせは、例えば 、双方がプレート状電極または 1本または 2本以上のニードル状体を備える電極であ つてもよレ、。また、電極は一対である必要はなぐ 1個又は 2個以上の正極と 1個又は 2個以上の陰極との組み合わせとしてもよレ、。さらに、プレート状電極のプレート部の 形状は、円形状、楕円状、正方形状等各種の形態を採ることができる。さらにまた、二 一ドル状電極を採用する場合には、その内部に液体が流通可能な流路を設けるとと もにその先端に排出口を設けることができる。この場合、例えば、ニードル状電極の 流路に注入用シリンジの先端を接続するなどして流路に対して核酸コンストラクトを含 む液体を供給可能に構成することで、核酸コンストラクトを生体内に注入後直ちにあ るいは注入しつつ電圧を印加することが可能となる。これにより、核酸コンストラクトが 標的部位から拡散するのを抑制することができる。
[0042] こうした電極 10a、 10bは、ホルダー 12とケーブル 14とを介してパルス発生手段 6に 接続されていることが好ましい。ホルダー 12は、片手で把持して開閉可能な一対の 脚部 12a、 12bを有し、その各先端に電極 10a、 10bを備えることができる。ホルダー 12の一対の脚部 12a、 12bの基端部からは先端に端子 14a及び 14bを有するケー ブル 14が固定されていてもよレ、。ホルダー及びケーブル 14内には電極 10a、 10bに それぞれ接続される導線が挿通しており、ケーブル 14の先端側においてこれらの導 線の端部が端子 14a、 14bとされてパルス発生手段 6に電気的に接続されていてもよ レ、。以上のようにして、本装置 2においては、電極 10a、 10b、ホルダー 12及びケー ブル 14は、本体 4に対して交換可能な電極ユニット（部材） 20を構成することができる 。後述するように、こうした電極 10a、 10bを備えるエレクト口ポレーシヨン装置 2は、ヒト 及び非ヒト動物の生体組織 (特に皮下組織）への核酸コンストラクトの導入装置及び 遺伝子発現抑制装置並びに核酸コンストラ外による治療装置 (特に皮下の固形腫 瘍等の皮下疾患部位の治療装置）として用いることができる。また、こうした電極 10a
、 10bは、同様に、ヒト及び非ヒト動物の生体組織（特に皮下組織)への核酸コンストラ 外の導入装置及び遺伝子発現抑制装置並びに核酸コンストラクト用の治療用電極（ 皮下の固形腫瘍等など特に皮下における疾患部位の治療用電極）として用いること ができる。
[0043] (核酸コンストラクト）
本発明における核酸コンストラクトは、遺伝子の発現を抑制可能に構築されている。 本明細書において遺伝子の発現を抑制するとは、遺伝子等をコードする DNAとのハ イブリダィズなどの相互作用により転写を阻害するアンチジーン核酸法、 mRNAなど の RNAとのハイブリダィズなどの相互作用により転写又は翻訳を阻害するアンチセ ンス核酸法、 mRNAなどの転写物とのハイブリダィズ等の相互作用に基づレ、て転写 物を分解又は翻訳を阻害する RNA干渉法、デコイ核酸法、リボザィム法等によるも のが挙げられる。なお、遺伝子発現を抑制するものではないがアブタマ一をエレクト 口ポレーシヨンにより導入することもできる。また、核酸コンストラクトとしては、前駆体 マイクロ RNA (miRNA)や成熟 miRNAなどの miRNAやその作用を制御する小 RNA分子 を含んでいる。ここに、本明細書において「核酸」とは、デォキシリボ核酸及びリボ核 酸のようなポリヌクレオチドを意味している。また、この用語には、一本鎖（DNA又は RNA、センス又はアンチセンス）又は二本鎖ポリヌクレオチド（DNA又は RNA)が包 含される。また、 DNA— RNAノヽイブリツド（二本鎖）や DNA—RNAキメラオリゴヌク レオチド（一本鎖）、ペプチド核酸（PNA)、モルホリノオリゴヌクレオチドも包含される 。さらにまた、ポリヌクレオチドには天然あるいは人工的な修飾が施されていてもょレヽ 。なお、本明細書において「RNA干渉」とは、二本鎖 RNAによってその配列特異的 に標的遺伝子の mRNAなどの転写産物を分解するか又は翻訳を阻害する現象を意 味するものとする。 RNA干渉によれば、結果として標的遺伝子の発現を抑制すること ができる。ここで標的遺伝子の発現を抑制するとは、標的遺伝子がコードする mRN Aがポリペプチドに翻訳されるのを抑制し又はその翻訳産物であるタンパク質の発現 量が低下することを意味してレ、る。
[0044] 標的遺伝子としては、特に限定しない。疾患の予防又は治療のための遺伝子、機 能解析が必要される遺伝子などであってもよい。例えば、固形腫瘍等の治療目的に は、ガン細胞によって放出され血管新生を誘導する血管内皮増殖因子 (VEGF)を 始め、 aFGF、 bFGFなどの線維芽細胞増殖因子、腫瘍壊死因子 a (TNF— α )、ァ ンジォゲニンなどの血管新生を誘導する物質やガン細胞の増殖を促進する上皮細 胞増殖因子 (EGF)などをコードする遺伝子を標的遺伝子とすることができる。これら の血管新生関連遺伝子を標的とすることにより腫瘍特異性が高く福作用が抑制され た治療が可能となる。また、血管新生に起因する各種の疾患の予防又は治療が可能 となる。
[0045] なかでも VEGFは強力な血管新生作用を持つことから、 VEGF遺伝子はガン治療 の標的遺伝子として非常に有用である他、ガン以外の VEGF過剰発現をその主病 因とする疾患、例えば眼内血管新生病 (糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症など）、動 脈硬化症などの治療の標的遺伝子とすることができる。また、 VEGFは分子量約 22 ， 000のサブユニットが二量体を形成する構造を持ち、血管内皮細胞の増殖 ·遊走- 管腔形成を促進し、個体レベルでの血管新生'血管透過性の亢進を起こす。また、 ¾a織因子やプラスミノーゲンァクチべ一ター（plasminogenactivator： PA)などの凝 固系 ·線溶系因子の産生亢進、マトリックス 'メタ口プロティナーゼゃ PA受容体の発 現などの亢進を誘導し、血管基底膜を分解する（Ferrara, N. ： J. Mol. Med.， 77 ， 527- 543, 1999)。また、 VEGFは VPFという別名が示す如ぐ血管透過性を亢 進する。 VEGF (VEGF-A)は alternativesplicingにより、 5個のサイズの異なるァ イソフォーム（すなわち VEGF , VEGF , VEGF , VEGF , VEGF ：下付
121 145 165 189 206 の数字は構成アミノ酸数を示す）として存在することが知られている（Tischer, E. et al. ： J. Biol. Chem. , 266 : 11947— 11954, 1991) VEGFを産生している細胞 は、何種類かのサブタイプを同時に産生している。通常、 VEGF と VEGF が優
121 165 位であるが、 VEGF も多くの細胞で発現が観察されている。このような alternative
189
splicingによって生合成される 5種の VEGFサブタイプの遺伝子の 1又は 2以上を標 的遺伝子とする siRNAなどの核酸コンストラクトもまた有用である。また、 VEGF— B PLGF (placenta growth factor)を標的とすることもできる。以上のことから、本発明 の核酸コンストラクトは、 VEGF— A VEGF— B、 PLGFなどを含む VEGFファミリー を標的とすることができる。さらに、 VEGFR— 1 2 3等の VEGFRファミリーの 遺伝子を標的としてもよい。他のガン関連遺伝子としては、変異した p53遺伝子や ez h2遺伝子などが挙げられる。
[0046] また、標的とする生体組織が腫瘍組織 (特に、皮下腫瘍組織)である場合には、腫 瘍内部は、血管新生が活発であり血管透過性の高いことから、標的遺伝子が血管内 皮増殖因子 (VEGF)などの血管新生を促進する血管新生関連遺伝子とする核酸コ ンストラタトを用いることが好ましいが、こうした組織においては、血管透過性も高くし 力も水分が多いため、エレクト口ポレーシヨンによる核酸コンストラクトが好ましい。特に 、後述するプレート状電極及びニードル状電極との組み合わせによれば、腫瘍組織 近傍にニードル状電極を刺し込むために、こうした血管透過性や高水分により電流 量が安定的にし力も容易に確保することができるため、効率的な核酸コンストラクトの 導入が可能となる。
[0047] 標的遺伝子としては、核酸コンストラクトを導入しょうとするヒト及び非ヒト動物の内在 性遺伝子でなくてもよい。例えば、ウィルス感染によって引き起こされる疾患の予防 又は治療目的には、 RNAウィルス中の RNA配列を標的とすることができる。例えば 、 HIV—1ウィルス、 C型肝炎ウィルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウィルス、パピロー マウィルス、インフルエンザウイルスなどの RNA配列を標的とすることができる。なお 、こうしたウィルス感染疾患においては、ウィルス増殖に必要な内在性因子をコード する遺伝子も標的遺伝子としてもよい。
[0048] また、炎症性疾患関連遺伝子も標的遺伝子とすることができる。例えば、炎症性疾 患関連遺伝子としては IL—1 及び j3 )、 IL_ 6、 IL_4等が挙げられる。これらは、 リウマチや慢性関節等の炎症性疾患に関連している。特に、体外から経皮的に導入 操作がしゃすいという観点から、こうした関節の炎症性疾患の関連遺伝子を標的とす ることは本発明において効果的である。また、別の炎症性疾患関連遺伝子としては、 アトピー性皮膚炎などの皮膚炎疾患関連遺伝子である TNF a遺伝子及び TNF a 受容体ファミリーの遺伝子などが挙げられる。本発明によれば、皮膚炎疾患に対して も経皮的な導入操作が容易である。
[0049] さらに他の標的遺伝子としては、抗アポトーシス関連遺伝子も挙げられる。抗アポト 一シス関連遺伝子は、癌の発症や進行に関連する癌遺伝子である。こうした遺伝子 としては、 bcl— 2遺伝子を始めとする、 bcl— x、 bcl— w、 mcl— 1、 bfl— 1/A1、 ba x、 bad, bikなどの bcl— 2ファミリー遺伝子が挙げられる。特に、 bcl— 2遺伝子を標 的とすることが好ましい。 bcl2 _遺伝子を標的遺伝子とする siRNAは、例えば、特開 2005— 13199に記載されてレヽる。
[0050] RNA干渉を発現可能な核酸コンストラクトは、こうした標的遺伝子の mRNA等の転 写産物の少なくとも一部を標的としてこれら標的遺伝子の発現を抑制可能に構築さ れている。こうした核酸コンストラクトの一つの態様は、互いにハイブリダィズするオリ ゴリボヌクレオチドの二本鎖構造を有する RNAコンストラクトである。すなわち、裸の（ Naked) RNAである。具体的には、突出した 3 '末端をそれぞれ有するあるいは有しな い比較的短い二本鎖オリゴリボヌクレオチド（small interfering RNA： siRNA)及びへ ァピン構造を形成する（又は有する）単一のオリゴリボヌクレオチド（short hairpin RNA ： shRNA)が挙げられる。これらの RNAコンストラクトは、直接 RNA干渉を引き起こ すことができる点において好ましい。また、ヘアピン構造を形成しない一本鎖オリゴヌ リボヌクレオチドの RNAコンストラクトも RNA干渉を発現することができる。
[0051] siRNAは、ターゲット配列に対応するセンス配列及びアンチセンス配列を有してお り、これらセンス配列及びアンチセンス配列が一定長さでハイブリダィズして二本鎖 構造を形成している。すなわち、センス配列及びアンチセンス配列は所定長さで対 合する二重鎖をそれぞれ有している。なお、センス配列とアンチセンス配列は互いに ハイブリダィズする力 一部において不対合部分を有していてもよレ、。例えば、センス 配列において 1又は数個のミスマッチ塩基及び Z又は塩基欠損を有していてもよレ、。 siRNAにおけるセンス配列及びアンチセンス配列は、突出する 3 '末端を有していて もよいし、有していなくてもよい（ブラントエンドタイプ)。オーバーハングを有する場合 、オーバーハングする 3'末端側は mRNA上の標的配列に対するセンス配列の一致 性及びアンチセンス配列の相補性は必ずしも必要ではない。
[0052] shRNAは、 siRNAと同様にターゲット配列に対応するセンス配列を 5'側に、アン チセンス配列を 3'側に有し、これらは一定長さで対合してステムを形成し、これらの 配列間にヌクレアーゼによるプロセッシングを受ける部位を有するループ部位を有し ている。このため、 shRNAは、細胞内においてプロセッシングを受けて siRNAとなる 。 siRNAについて説明したように、 shRNAから誘導される siRNAのオーバーハング 部位に相当するセンス配列及びアンチセンス配列においても標的配列との一致性及 び相補性は必須ではない。
[0053] 本態様の核酸コンストラクトにおけるセンス配列及びアンチセンス配列が対合する 二重鎖の長さは、 RNA干渉効果が得られる限り特に限定しなレ、が、好ましくは 50塩 基対以下であり、典型的には 13〜28塩基対であることが好ましぐより好ましくは 13 〜27塩基対の範囲であり、さらに好ましくは 19〜21塩基対である。最も好ましくは、 19又は 20塩基対である。また、二重鎖を形成しない 3'側構造を含めたセンス配列 及びアンチセンス配列は、典型的には 15〜30ntであることが好ましぐより好ましく は 15〜29ntの範囲であり、さらに好ましくは 2：!〜 23ntである。最も好ましくは、 21又 は 22ntである。また、 siRNAにおいて突出する 3'末端は、 2〜4nt
であることが好ましぐより好ましくは 2ntである。さらに、 shRNAにおけるループ部位 は、こうした態様の二重鎖（shRNAにおいてはステム)及び 3 '末端構造を形成し維 持するのを妨げなレ、程度のループ部位の長さを備えてレ、ればよレ、。
[0054] この態様の核酸コンストラクトの標的遺伝子のターゲット配列は、例えば、以下のよ うなルールを適宜適用して決定し、適当な siRNAや shRNAを設計することができる
(1)標的する遺伝子の CDSにおいて AA (N19) TT、 AA (N21)、 NA (N21)等とな る配列をターゲットとする（siRNAとしてはこれらの配列の第 3〜21塩基の 19塩基を 使用する）、
(2)転写因子の結合部位を避けるためスタートコドンから下流 50〜100塩基以上下 流側とする、
(3)標的 mRNAの予想される二次構造を確認して立体障害により結合しにくい部位 を避ける、
(4) BLAST等によるホモロジ一サーチによって他の遺伝子と相同性のない配列を 選択する、
(5) GC含量を 50%前後（特に、 47〜52%)とする、等である。
なお、この他ターゲット配列の決定方法を含む siRNAの設計方法は、 http：〃 desig n.rnai.jp/ sidirect/ index. php^ http://www.rockefeiler.edu/labheads/tuschl/ sirna.html や Rational siRNAdesign for RNA interference (Nature Biotechnology , vol. 22， 326 - 330 (2004), Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese, Stephen Scaringe,Willia m S Marshall & Anastasia Khvorova)、 Improved and automated prediction ofeffectiv e siRNA(Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18;319(1):264_74、 Chalk AM, W ahlestedt C, Sonnhammer EL.)等公開された各種のルールを適宜適用して行うことが できる。
[0055] 例えば、ヒト VEGFの mRNA (GenBANKァクセッション番号 NM_003376、 Leung ,D.W.etal. :Science,246, 1306-1309, 1989;Keck,P.J.et al. :Science，246, 1309-1312))の 発現を抑制することができる siRNAとしては、例えば、特開 2004-313141に示す # 1〜： # 4の VEGFsiRNAが挙げられる。これらの各 siRNAにおいては、センス配列 及びアンチセンス配列はそれぞれ 3 '末端側に 2ntのオーバーハング部位を有してい る。なお、これらの siRNAのターゲット配列は、 AAおよび CAのいずれかを 5 '末端 側に有するターゲット配列より GC含有量が 45〜55%の 21塩基の候補配列 14種を 選択し、「GCの偏り」が比較的少ない配列 7種に候補を絞り、さらにこの 7種について 、 BLASTサーチによる類似配列の検索を行レ、、類似配列の少ないターゲットを選択 し、かつその近傍の二次構造解析結果を参考に、比較的立体障害の影響の少ない と想定できたものである。
[0056] このような核酸コンストラクトは、ホスホアミダイト法など公知のポリリボヌクレオチドの 化学合成方法により合成することができる。また、 in vitro転写法を用いて合成しても よレ、。例えば、こうしたポリリボヌクレオチドをコードする DNAを合成し、この DNAに 対して、 PCR法を利用して T7RNAプロモータなどの RNAプロモータ配列を有する プライマーを用レ、るとともに DNAポリメラーゼを用レ、て転写用二本鎖 DNAテンプレ ートを合成し、この転写用二本鎖 DNAテンプレートに対して RNAポリメラーゼを利用 して in vitro転写反応を実施することもできる。こうすることで、所望の一本鎖 RNAを 得ることが出来る。 siRNAの場合には、こうして得たアンチセンス RNAとセンス RNA とをハイブリダィズさせて二本鎖 RNAを作製し、適宜末端を RNase等で分解して、 得られた二本鎖 RNAを精製することにより siRNAを得ることができる。また、 shRNA の場合には、センス配列とアンチセンス配列と、さらにこれらの配列間に各種の塩基 特異的 RNaseによってトリミングされるループ配列とを備える一本鎖 RNAを作製し、 センス配列とアンチセンス配列とをァニールさせて得ることができる。こうして得た shR NAのループ配列を塩基特異的ヌクレアーゼで処理して siRNAを得ることもできる。 なお、 in vitro転写法はこれに限らず各種の方法が知られているとともに、商業的に 入手可能な各種の in vitro転写キットを用いて実施することができる。
[0057] siRNAや shRNAなどの RNAコンストラクトとしては、ヒト血清中での半減期が 30時 間以上、好ましくは 50時間以上、より好ましくは 60時間以上、さらに好ましくは 80時 間以上の RNAコンストラクトを用いる。こうした核酸コンストラクトを用いることにより、 R NA干渉の効果を容易に持続させることができ、投与回数を低減することができる。な お、ここでレ、う半減期とは、同じヒト血清中において安定化されてない非修飾の同一 の RNAコンストラクトの半減期が 2時間以内のときの半減期をレ、うものとする。こうした 安定化されたこの種の RNAコンストラクトは、ポリヌクレオチドのいずれかの部分にヌ クレアーゼ耐性のための各種公知の修飾基を備えることもできる。こうした修飾として は、例えば、 3'オーバーハング部位を分解に対して安定化させることができる。例え ば、これらが、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからな るように、選択すること力 Sできる。また、 2'ヒドロキシル基の欠如により、組織培地中の 突出部のヌクレアーゼ耐性が有意に増強される。また、この種の核酸コンストラクトは 、少なくとも 1つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、標的特 異的活性、例えば、 RNA干渉の媒介活性が実質的に影響を受けない位置、例えば 、二本鎖 RNA分子の 5 '末端および/または 3 '末端の領域内に配置することができ る。特に、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことにより、突出部を安定化させること ができる。好ましいヌクレオチド類似体は、糖または骨格鎖修飾リボヌクレオチドから 選択する。しかし、核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在す る核酸塩基ではなぐ下記のように天然に存在しない核酸塩基を含むリボヌクレオチ ドも好適である。すなわち、天然に存在しない核酸塩基としては、 5位置で修飾され たゥリジンまたはシチジン、例えば、 5—（2—ァミノ）プロピルゥリジン、 5—ブロモウリ ジン； 8位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、 8—ブロモグアノシン； デァザヌクレオチド、例えば、 7—デァザ—アデノシン； O—および N—アルキル化ヌ クレオチド、例えば、 N6—メチルアデノシンなどである。好ましい糖修飾リボヌクレオ チドでは、 H、〇R、ハロ、 SH、 SR、 NH2、 NHR、 NR2または CNからなる群より選 択される基で 2' OH基を置換する力 ここで、 Rは、 C1〜C6ァノレキノレ、アルケニルま たはアルキニルであり、ハロは、 F、 Cl、 Brまたは Iである。好ましい骨格鎖修飾リボヌ クレオチドでは、 P 接するリボヌクレオチドを結合するホスホジエステル基を、例えば、 ホスホロチォエート基の修飾基で置換する。
核酸コンストラクトのもう一つの態様は、上記の態様の RNAコンストラクト、すなわち 、 siRNAや shRNAを発現可能にコードするベクターの態様である。こうした態様の 核酸コンストラクトは、継続性のある RNA干渉を実現できる点において好ましレ、。この 態様において、 shRNA発現ベクターは、アンチセンス配列及びセンス配列の他ルー プ配列を、細胞内転写により shRNAを構築可能な連続した一本鎖 RNAが転写され るように構成することができる。また、 siRNA発現ベクターは、所定のセンス配列及び アンチセンス配列を有する RNAが転写されるように構成すればょレ、。 siRNA発現べ クタ一においては、センス配列及びアンチセンス配列は単一のベクターによって発現 されるようにしてもよいし、また、それぞれ異なるベクターから発現されるようにしてもよ レ、。
[0059] こうした発現ベクターに用いるプロモータとしては、上記各 DNAより対応する RNA を産生し得るものであれば、 polll系、 polIII系のいずれであってもよレ、。この polIII系 のプロモータとしては、例えば、 U6プロモータ、 tRNAプロモータ、レトロウイノレス十生 L TRプロモータ、アデノウイルス valプロモータ、 5SrRNAプロモータ、 7SK RNAプ 口モータ、 7SL RNAプロモータ、 HI RNAプロモータなどが挙げられる。 polll系プ 口モータとしては、サイトメガロウィルスプロモータ、 Τ7プロモータ、 Τ3プロモータ、 S Ρ6プロモータ、 RSVプロモータ、 EF— 1 αプロモータ、 βーァクチンプロモータ、 γ グロブリンプロモータ、 SR aプロモータなどを挙げることができる。
[0060] 発現ベクターは、プラスミドベクターやウィルスベクターの形態を採ることができる。
ベクターの種類は特に問わないで、導入したい細胞などに対応して選択することがで きる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスべ クタ一、アデノ随伴ウィルスベクター（AAV)、ワクシニアウィルスベクター、レンチウイ ノレスベクター、へノレぺスゥイノレスベクター、ァノレファゥイノレスベクター、 EBウイノレスベタ ター、ノ、°ピロ一マウイノレスベクター、フォーミーウイノレスベタターなどのゥイノレスべクタ 一が挙げられる。
[0061] こうした発現ベクターの態様を採る核酸コンストラクトは、商業的に入手可能な siRN Aや shRNA作製用に構築されたベクターやそれらのプロトコールや実験医学別冊 改訂 RNAi実験プロトコール（羊土社、 2004年 10月 1日発行）等に基づいて容易に 構築すること力 Sできる。
[0062] なお、核酸コンストラクトは、アンチジーン核酸、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又 はリボザィムであってもよレ、。アンチジーン核酸は、 DNAと相補的な塩基配列を有し 、 DNAと 2本鎖又は 3本鎖を形成することにより DNAにコードされる遺伝子の発現を 抑制する DNA又は RNAである。また、アンチセンス核酸は、任意の RNA (ゲノム R NA及び mRNA)と相補的な塩基配列を有し、これらと 2本鎖を形成することによって 該 RNAにコードされる遺伝子情報の発現 (転写、翻訳）を抑制するものをいう。アン チセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り必ずしも標的配列に対し て完全に相補的でなくてもよいし、修飾した塩基などを用レ、てもよい。通常、設計す べきアンチセンス核酸配列の長さは、遺伝子の発現を阻害し得る限り特に限定される ものではないが、例えば 10〜50塩基、好ましくは 15〜25塩基である。デコイ核酸（R NA)は、例えば、任意の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転 写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有する RNAであって、これらを「おとり」 として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものである。また、リ ボザィムとは、特定のタンパク質の mRNAを切断して、このタンパク質の翻訳を阻害 するものをいう。リボザィム は特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計す ること力 Sでき、例えば、ハンマーヘッド型リボザィムとしては、 FEBS Letter, 228; 228-2 30(1988)に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザィムだけ ではなぐヘアピン型リボザィム、デルタ型リボザィムなどの、特定のタンパク質の mR NAを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれ ば本発明において使用しうる。
[0063] (核酸コンストラクトの導入）
次に、こうした核酸コンストラクトを、エレクト口ポレーシヨン装置を用いて生体内の細 胞に導入する操作及びエレクト口ポレーシヨン装置の制御について説明する。図 2に は、この操作のフローの例を示す。図 2には、電圧印加のタイミングやマトリックス材料 の添加形態の異なる 4種類のフローを示している。図 2 (a)及び（b)は、核酸コンストラ タトの標的組織への供給及び到達後に電圧印加するフローを示し、図 2 (c)及び (d) は、核酸コンストラクトの標的生体組織への供給及び到達に伴って電圧印加するフロ 一を示す。なお、これら操作フローは説明の容易化のために明示した力 これら 4種 のフローに示す操作を組み合わせて用いてもよレ、。また、これらの 4種のフローの一 部分を組み合わせて用いてもよい。
[0064] 核酸コンストラクトは、電圧の印加に先立って予め又は電圧の印加と実質的に同時 に生体組織に供給される。核酸コンストラクトは、どのような形態で標的となる生体組 織に供給してもよい。例えば、注射、注入、鼻咽頭吸入、皮膚吸収、経口等で可能で ある。核酸コンストラクトは全身に供給してもよいし、局所的に供給してもよい。静脈注 射や経口等にて核酸コンストラクトを投与した場合には、好ましくは標的となる生体組 織にデリバリーされるシステムを用いることが好ましい。また、核酸コンストラクトの供給 には、表皮の切開等を伴う外科的手法を用いてもよいし、経皮経管的手法を用いる こともできる。さらに、内視鏡的手法を用レ、ることもできる。
[0065] 核酸コンストラクトは、標的となる生体組織の周囲に供給してもよいし、その内部に 供給するようにしてもよレ、。また、電圧の印加方向を考慮してより多くの核酸コンストラ タトが生体組織方向に移動するような箇所に供給してもよい。こうした核酸コンストラタ トの具体的供給部位は、電極形態や標的組織との関係で適宜設定される。
[0066] 核酸コンストラクトは、適当な媒体を伴って生体組織に供給されることが好ましい。
例えば、注射や注入による場合には、所定の緩衝液や生理的食塩液などの生体適 合性のある媒体を用いることできる。また、局所に注入する場合には、電圧印加以前 に核酸コンストラクトが生体組織から拡散するのを抑制するために、血管収縮剤など を媒体に含めるか又は別個に供給してもよい。さらに、経口、鼻咽頭吸入、皮膚吸収 等による場合には、そうした投与形態の製剤形態に準じた媒体を用いることができる
[0067] また、核酸コンストラクトは、生体組織にぉレ、て生分解性マトリックスを形成可能なマ トリックス材料とともに供給されてもよレ、。こうしたマトリックス材料が生体組織に存在す ることで、核酸コンストラクトの分解を抑制できるとともに、供給箇所からの核酸コンスト ラタトの拡散を抑制して、エレクト口ポレーシヨンにより導入効果を高めることができる。 生体組織にぉレ、て生分解性マトリックスを供給可能なマトリックス材料としては、デン プン、アルギン酸、ヒアノレロン酸、キチン、キトサン、ぺクチン酸、ァガロースおよびこ れらの誘導体などの多糖類、あるいはゼラチン、ァテロコラーゲンなどの各種コラー ゲン (コラーゲンのタイプおよびその抽出法はいずれでもよい）などの生体高分子系 材料が挙げられる。また、感熱応答性ポリマー、ポリ乳酸ダリコール酸などのポリ乳酸 系ポリマーなどのポリマーのほか、マトリゲル（日本 BD社製、商標）、プル口ニック（B ASFジャパン社製、商標）なども用いることができる。
[0068] こうしたマトリックス材料としては、コラーゲンを好ましく用いることができる。コラーゲ ンとしては、可溶性コラーゲン又は可溶化コラーゲンを用いることができる。「可溶性 コラーゲン」としては、酸性あるいは中性の水または塩を含有する水に可溶であるも の等が挙げられる。「可溶化コラーゲン」としては、例えば、酵素により可溶化される酵 素可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲン等が挙げ られる。
[0069] コラーゲンの由来は特に問わないで、脊椎動物力 抽出されたものまたはそれらの 遺伝子組換え体を用いることができる。例えば、哺乳類、鳥類、魚類から抽出された ものまたはそれらの遺伝子組換体を用いることができる。コラーゲンは I型〜 V型まで の種類があるが特に限定しないで用いることができる。なかでも、哺乳動物の真皮か ら酸抽出した I型コラーゲンまたはそれらの遺伝子組換体が挙げられる。より望ましく は、例えば、仔牛の真皮から酸抽出した 1型コラーゲン、遺伝子工学的に生産される 1型コラーゲンなどが挙げられる。遺伝子工学的に生産される 1型コラーゲンとしては 仔牛の真皮由来またはヒトの真皮由来のものが好ましい。また、安全性の面から抗原 性の高いテロペプチドを酵素的に除去したァテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的 に生産されるァテロコラーゲンが望ましぐ 1分子あたりチロシン残基が 3以下であるァ テロコラーゲンがより好ましい。
[0070] コラーゲンをマトリックス材料として用いる場合、例えば、 0. 001v/v%以上 ΙΟν/ v%以下程度とすることができる。好ましくは、 0. lv/v%以上 5vZv%以下程度で あり、より好ましくは、 1. 5v/v%以上 3. 75vZv%以下程度である。
[0071] なお、こうした生分解性マトリックス材料は、図 2 (b)及び（d)のフローに示すように、 核酸コンストラクトと実質的に同時に生体組織に供給するほか、図 2 (a)及び (c)のフ ローに示すように、核酸コンストラクトとは別個に、核酸コンストラクトの生体組織への 供給到達に先立って当該生体組織に供給されてもよい。さらに、図 2 (a)及び (c)の フローに示すように、核酸コンストラクトの生体組織への供給又は到達後にマトリック ス材料を当該部位に供給してもよい。マトリックス材料の存在が核酸コンストラクトの導 入効率を低下させる可能性がある場合には、マトリックス材料は電圧印加後に生体組 織に供給してもよい。なお、マトリックス材料は、注射、注入等により局所的に標的と なる生体組織に投与されることが好ましレ、。 [0072] 本方法においては、核酸コンストラクトの存在下、生体組織に配置される電極に対 して電圧を印加する。これにより細胞膜が穿孔され、核酸コンストラクトが細胞内へ導 入されることになる。電圧印加のタイミングには、 2種類ある。一つは、核酸コンストラタ トを電圧印加に先立って予め生体組織に供給到達させておき、核酸コンストラクトが 当該生体組織に供給され到達すると同時にあるいはその後（好ましくは速やかに）、 生体組織の所定位置に配置された電極に所定条件で電圧を印加するタイミングであ る（図 2 (a)及び (b) )。他の一つは、核酸コンストラクトを生体組織に供給しながら電 圧を印加するタイミングである（図 2 (c)及び (d) )。後者のタイミングで電圧を印加す る場合には、予め生体組織の所定位置に電極をセットしておき、その状態で、核酸コ ンストラタトが当該生体組織に供給され到達されつつあるタイミングで電圧を印加する ことになる。なお、いずれの場合においても、電極の生体組織へのセットは、電圧印 加に先立つ適切なタイミングで実施されることが好ましい。
[0073] なお、電極に印加する電圧は 50V以上 70V以下とすることもできる。この範囲であ ると、固形腫瘍などの標的生体組織に 0. 2A程度の電流量を確保することができる。 この電流量は、本発明者らによれば、 siRNAなどの核酸コンストラクトを導入するの に適した電流量であることがわかってレ、る。 50V未満であると核酸コンストラクトを導 入するのが困難となり、 70Vを超えると細胞障害が強くなり組織が破壊されてしまうか らでなる。
[0074] 電極は生体組織に対して生体組織の部位や電極の形態等によって様々な態様で 配置することができる。例えば、固形腫瘍などの罹患組織を含む生体組織の場合に は、当該罹患組織を 2以上の電極で挟持するように電極を配置することもできるし、 少なくとも一本のニードル状電極を罹患組織部分に侵入させた状態で残りの電極を 罹患組織の周囲に当接させるようにしてもよい。また、表皮下の固形腫瘍などの罹患 組織に対して電極を配置する場合には、罹患組織の底部の下側にニードル状電極 を侵入させるとともに、罹患組織を覆う表皮に他方の電極を当接させてもよい。また、 血管などの生体組織には、血管を一対のプレート状電極で挟持するように電極を配 置する。こうした各種の電極配置形態は、当業者であれば必要に応じ適切に設定す ること力 Sできる。 [0075] 図 3に、図 1に示すエレクト口ポレーシヨン装置 2を用レ、、図 2の左側のフローに基づ いて、表皮直下の固形腫瘍を標的生体組織として siRNA等の核酸コンストラクトの存 在下に電圧を印加する操作の一例について示す。先ず、固形腫瘍の中央部分に、 表皮を介して核酸コンストラクトを含む液体を注射する。固形腫瘍に核酸コンストラタ トが均等に供給及び到達されるように固形腫瘍の中央部分の 2箇所以上において注 射用ニードルを侵入させて前記液体を注射する。
[0076] 次いで、核酸コンストラクトが供給された固形腫瘍の底部下側にニードル状電極 10 bを挿入するとともに、固形腫瘍の上部を覆う表皮にプレート状電極 10aを当接させ て、電極 10a、 10bとができるだけ安定して一定距離を保てるようにホルダー 12の脚 部 12a、 12bを強く把持し、その状態で本体 4のパルス発信手段 6を操作して方形波 ノ ルスを一定周期で一定時間印加する。これにより、電圧が印加された生体組織内 の細胞が穿孔され、その孔部から核酸コンストラクトが細胞内に導入される。なお、電 極 10bをパルス発生手段 6のマイナス端子に接続し、電極 10aを同じくプラス端子に 接続した状態で電圧を印加することで、固形腫瘍の底部近傍に供給されマイナスに 荷電した核酸コンストラ外は、固形腫瘍の上部側に移動するとともに穿孔により細胞 内に導入されると考えられる。
[0077] なお、プレート状電極 10aとニードル状電極（好ましくはフォーク状） 10bとの配置態 様によれば、ニードル状電極 10bが組織側に刺し込まれるために、一対のプレート状 電極を用いるよりも電気抵抗値が低下するものと推測される。また、ニードル状電極 1 Obとプレート状電極 10aとを対向させることで、両電極で皮下組織を直接挟持しても 、あるいはニードル状電極 10bは皮下に配置しプレート状電極 10aについては表皮 に当接させて挟持しても、固形腫瘍等の生体組織を確実に挟持するとともに、電極 間距離を一定とするように挟持することができる。このために、相対的に低い電圧で 高い電流量を安定して得られやすいと推測される。さらに、腫瘍内部は、血管新生が 活発であり血管透過性も高いため、こうした組織近傍にニードル状電極 10bが差し込 まれることで、電流量を確保しやすいと考えられる。以上のことから、プレート状電極 1 0aとニードル状電極 10bとの組み合わせが生体組織を直接あるいは皮下組織を低 侵襲的に表皮を介して間接的に挟持してエレクト口ポレーシヨンを実現するのに好ま しいといえる。
[0078] 本発明方法によれば、上記例示した操作におけるエレクト口ポレーシヨン装置の制 御によって、標的生体組織の細胞内に RNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能 な 1種又は 2種以上の核酸コンストラクトを容易に、しかも迅速にかつ大量に送達させ ることができる。さらに、必ずしもウィルスベクターゃァテロコラーゲンなどの媒介物も 必要とせずに nakedな核酸コンストラクトを送達させることができる。このため、 RNA干 渉効果等の発現によって標的遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。また 、複数の核酸コンストラクトを導入することも容易である。また、コラーゲンなどのマトリ ックスを核酸コンストラクトと共存させることにより、核酸コンストラクト自体の安定性を 向上させるほか電圧印加時において核酸コンストラクトを標的組織近傍に保持できる こと等により導入効率を維持向上することができる。
[0079] また、核酸コンストラクトにより標的遺伝子の発現を抑制することができることから、こ の方法によれば、標的遺伝子の発現抑制による疾患の予防又は治療方法や病態の 改善方法も提供される。特に、血管新生を促進する遺伝子を標的とする核酸コンスト ラクトを用いた場合には、核酸コンストラクトが導入された腫瘍組織などの生体組織に おける血管新生を抑制することができる。この結果、標的遺伝子の発現抑制により血 管新生を阻害できる場合には、固形腫瘍などのガンの進行抑制、予防又は治療方 法、血管新生が起因となる眼内血管新生病 (糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症など） 、動脈硬化症などの疾患の進行抑制、予防又は治療方法、リウマチやアトピー性皮 膚炎などの炎症性疾患の進行抑制、予防又は治療方法も提供される。また、標的遺 伝子が、ウィルスの遺伝子やウィルスの増殖に関連する内在性遺伝子の場合等には 、ウィルスによる感染症の進行抑制、予防又は治療方法も提供される。
[0080] (非ヒト動物の作製方法）
本発明の非ヒト動物の作製方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動 物において RNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な 1種又は 2種以上の核酸 コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入することを特徴としている。すなわち、 本作製方法は、本発明のエレクト口ポレーシヨン装置の制御方法を非ヒト動物のみに 適用した態様である。したがって、非ヒト動物、核酸コンストラクト及びエレクト口ポレー シヨン装置、その操作等については、上記した範囲の全てが非ヒト動物の作製方法に ついても適用される。
[0081] この非ヒト動物作製方法によれば、例えば、部位特異的に所望の遺伝子の発現が 抑制された非ヒト動物を得ることができる。胚操作によれば致死的であるような遺伝子 の発現抑制であっても、容易にこうした遺伝子発現を抑制できるため、広い用途が期 待される。また、この方法によれば、 2種以上の遺伝子を容易にノックダウンすること ができるため、 2種以上の遺伝子の発現抑制による複合的な疾患等の研究用途があ る。
[0082] また、血管新生を促進する遺伝子を標的とする核酸コンストラクトを用いた場合には 、生体組織における血管新生が抑制された非ヒト動物を得ることができる。このような 非ヒト動物は、血管新生の抑制による治療的効果又は他の治療との組み合わせの効 果等を容易に評価できる。本発明の非ヒト動物の作製方法においては、特に、非ヒト 動物は生後の個体であることが好ましい。こうした非ヒト動物は、例えば、 1種又は 2種 以上の標的遺伝子の発現が抑制された細胞又は生体組織を有している。
[0083] 以上のように、本発明の非ヒト動物作製方法によれば、容易に所望の細胞又は生 体組織での 1種又は 2種以上の遺伝子のノックダウンを実現できる。また、核酸コンス トラタトとして、疾患関連遺伝子を標的として RNA干渉等により遺伝子の発現を抑制 可能な siRNAなどの核酸コンストラクトを用いる場合には、得られる非ヒト動物は、一 過性又は局所的な疾患モデル動物となるので、こうした非ヒト動物を用いる治療剤を 探索するためのスクリーニング系も提供される。
[0084] 非ヒト動物の作製にあたっては、この非ヒト動物として疾患モデル動物などヒトの疾 患のモデルとなるような病態、遺伝子変異又は生体組織又は細胞の表現型を有する 非ヒト動物を準備し、この非ヒト動物に対して、これらの疾患等の関連遺伝子を標的と して RNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な 1種又は 2種以上の核酸コンスト ラクトを導入することができる。こうした非ヒト動物の作製方法によって得られる非ヒト動 物の病態の解析又は生体組織又は細胞の表現型を解析することにより、核酸コンス トラタトの有効性評価を行うことができる。なお、核酸コンストラクトを導入するための非 ヒト動物としては、商業的に入手可能な疾患モデル動物を用いてもよいし、正常な非 ヒト動物にヒトの疾患モデルとなるように非ヒト動物に予め処置を施すこともできる。例 えば、非ヒト動物に腫瘍を人為的に形成させたり、ウィルスを感染させたりしてもよい。 腫瘍を人為的に形成するには、変異原の投与や、ウィルス感染、腫瘍細胞又は腫瘍 組織を移植し、該移植部位において前記腫瘍細胞を増殖させ、前記腫瘍組織を拡 大させ、又は前記移植部位を原発とする転移部を形成させることなどによることがで きる。
[0085] なお、本明細書でレ、う病態の解析及び生体組織又は細胞の表現型の解析には、 疾患が改善され、治療され、又は予防されたかどうかを評価するためのすべての解 析を包含している。例えば、病態の解析としては、食餌、排泄、活動等の観察、全身 及び身体部位の外観及び観察等が挙げられ、生体組織又は細胞の表現型の解析と は、生体組織又は細胞の観察や組織又は細胞特異的な遺伝子やタンパク質の発現 や活性化の測定、代謝産物の測定等が挙げられる。
[0086] (治療剤の探索方法:遺伝子治療剤）
本発明の治療剤の探索方法は、ヒトの疾患のモデルとなるような病態、遺伝子変異 又は生体組織又は細胞の表現型を有する非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記 非ヒト動物において RNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な 1種又は 2種以上 の核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入し、前記核酸コンストラクトが導 入された前記非ヒト動物における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析す ることを特徴としている。この方法によれば、エレクト口ポレーシヨンにより核酸コンスト ラクトを導入するため、導入した核酸コンストラクトの前記疾患に対する有効性を容易 に評価することがで
きる。この結果、本発明によれば、遺伝子治療剤としての核酸コンストラクトを選抜で きる有効なスクリーニング系が提供される。
[0087] なお、本発明の探索方法における非ヒト動物、核酸コンストラクト、エレクト口ポレー シヨン装置及びその操作等については、上記した範囲の全てが適用される。また、ヒ トの疾患モデルとなるような病態又は遺伝子変異を有する非ヒト動物は、上記非ヒト動 物の作製方法において記載したような手法で作製することができる。
[0088] (治療剤の探索方法：低分子化合物などの薬剤） 本発明の治療剤の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動 物において RNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な 1種又は 2種以上の核酸 コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部 においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成するェ 程と、この非ヒト動物に 1種又は 2種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織 若しくは細胞の表現型を解析することを特徴とする。この方法によれば、非ヒト動物に 対して、エレクト口ポレーシヨンにより核酸コンストラクトを導入してヒトの疾患態様を形 成し、化合物を投与してその効果を解析するものであるので、非ヒト動物において前 記核酸コンストラ外により形成された疾患態様に対する低分子化合物等の有効性を 容易に評価できる。この結果、低分子化合物を有効成分とする薬剤を選抜できる有 効なスクリーニング系を提供できる。なお、低分子化合物等の薬剤候補の投与形態 は特に限定しないで、経口、注射、注入等従来公知の各種形態を採用できる。
[0089] (創薬のための標的化合物の探索方法）
本発明の創薬のための標的化合物の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞 内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的として RNA干渉等により遺伝子の 発現を抑制可能な 1種又は 2種以上の核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンによ り導入し、前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解 析することを特徴としている。この方法によれば、前記細胞又は生体組織の表現型を 解析することにより、前記疾患の予防又は治療ための標的化合物を見出すことがで きる。標的化合物を見出すことにより、この化合物を活性化又は阻害する化合物など を探索するスクリーニング系が提供される。なお、この場合の細胞又は生体組織の表 現型の解析とは、例えば、こうした細胞又は生体組織の観察や、細胞活性状態、タン パク質の発現量や活性化、各種代謝産物の測定などが挙げられる。なお、疾患関連 遺伝子とは、疾患に関連することが明らかである遺伝子のみならず、疾患に関連する 可能性のある遺伝子であってもよい。
[0090] 以上説明したように、本発明の各種の実施形態によれば、いずれも、 RNA干渉等 により遺伝子の発現を抑制可能な 1種又は 2種以上の核酸コンストラクトを動物の細 胞又は生体組織の少なくとも一部にエレクト口ポレーシヨンにより導入することにより、 簡易に、迅速に、生体内において RNA干渉等による遺伝子サイレンシングによるノッ クダウンを実現させることができる。特に、 siRNAや shRNA、より好ましくは siRNAで ある RNAコンストラクトを直接生体にエレクト口ポレーシヨンすることにより、直接的に 生体において遺伝子サイレンシングが可能となっている。
実施例
[0091] 以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本 発明を限定するものではない。
[0092] (実施例 1)
本実施例では、ヒト VEGF—A (以下、 hVEGF—Aという。 ) (GenBankァクセッショ ン番号 NM— 003376)の CDS配列に基づいて 5種類の siRNAを作製し、 invitro でそのノックダウン効果を検討した。
[0093] < siRNAの作製 >
5種類の siRNAの hVEGF— Aのターゲット配列を図 4及び配列番号：:!〜 5に示す 。なお、図 4における遺伝子配列の標記は CDSとなっている。また、合成した siRNA のセンス配列を配列番号： 6〜： 10に示し、二重鎖 RNAとしての形態を図 5に示す。な お、全ての siRNAは、ターゲット配列に基づいて Dharmacon社に依頼して合成さ せた。
[0094] < siRNAの評価 >
各種の siRNAを、 PC— 3細胞における hVEGF—A発現の抑制効果により評価し た。ヒト前立腺癌細胞 PC— 3 (ATCC)を 35mmディッシュにまき（2 X 105個/皿）、 1晚静置後、各 siRNAを無血清条件下で陽イオン脂質試薬（リポフエクトァミン 'ブラ ス：インビトロジェン社）にてトランスフエクシヨン（37°C、 4時間）した。導入後、 10%F BSlmlを添加し、 6時間培養後、へパリン 20 i g/ml含有無血清培地に交換して 1 6時間培養後に、培養上清を回収し、 Quantikinehuman VEGF ELISAキット（R &DSystems社)で hVEGF—A濃度を測定した。結果を、図 6に示す。
[0095] 図 6に示すように、 # 2及び # 3の siRNAが高レ、 hVEGF— A抑制効果を示し、 # 3 の siRNAが最も高レ、抑制効果を示した。
[0096] (実施例 2) 本実施例では、実施例 1の # 3siRNA (安定化修飾基で修飾されてレ、なレ、）と、 # 3 siRNAと同じターゲット配列に基づレ、て安定化された siRNAを用いて、 hVEGF - A発現の抑制効果を確認した。なお、安定化させた siRNAは、 # 3のターゲット配列 に基づレ、て Dharmacon社に依頼して、同社による安定化修飾基で修飾した siRNA である siSTABLE (Dharmacon社の商標）として合成させた。
[0097] < siRNAの評価 >
これら 2種の siRNAを、 PC— 3細胞における hVEGF—Α発現の抑制効果により評 価した。ヒト前立腺癌細胞 PC— 3 (ATCC)を 35mmディッシュにまき（2 X 105個/ 皿）、 1晚静置後、各 siRNAを無血清条件下で陽イオン脂質試薬（リポフエクトァミン' プラス:インビトロジェン社）にてトランスフエクシヨン（37°C、 4時間）した。導入後、 10 %FBSlmlを添加し、 6時間培養後、へパリン 20 μ g/ml含有無血清培地に交換し て培養を継続した。導入後、 48, 72, 96, 120, 144及び 168時間後に培養上清を 回収し、 Quantikinehuman VEGF ELISAキット（R&DSystems社）で hVEGF A濃度を測定した。なお、 # 3のターゲット配列に対するスクランブル配列について のそれぞれ非修飾の siRNAと Dharmacon社による siSTABLEによる安定化 siRN Aについて同様の方法にて VEGF— A濃度を測定した。これらの結果を、図 7に示す
[0098] 図 7に示すように、 # 3安定化 siRNAは導入 48時間後には約 70%のノックダウン 率であつたが、時間の経過とともに RNAi効果を強く発揮する傾向があった。 # 3非 修飾 siRNAは、徐々に RNAi効果が減弱していく傾向が認められた力 168時間後 において # 3非修飾 siRNAの RNAi効果は、依然として安定化 siRNAの約半分程 度を維持していた。 # 3siRNAのスクランブル配列を備える siRNAは、いずれも（安 定化タイプも非修飾タイプの双方）、 RNAi効果を全く示さな力つた。なお、 mock (導 入脂質試薬のみ）でも、 hVEGF—Α分泌量は変化しなかった。
[0099] (実施例 3)
本実施例では、エレクト口ポレーシヨンにより、腫瘍に siRNAを導入するための至適 電圧を決定した。エレクト口ポレーシヨンによる導入方法を以下に示す。 PC— 3細胞（ 3 X 106個/部位）をヌードマウス（日本 SLC：ォス、 8週齢）の鼠径部に皮下注射（24 G針)し、 PC— 3皮下移植腫瘍 (Xenograft)担癌マウスを作成した。細胞移植後、 3 〜4週間経過すると、同部位に腫瘍が形成された (腫瘍体積 = 50mm3〜80mm3)。 こうしたマウスをエレクト口ポレーシヨン実験に用いた。なお、腫瘍体積は次式より求め た。
V= (短軸） 2 X (長軸）÷ 2
[0100] ネンブタール麻酔 (補助麻酔:エーテル吸入）して四肢を固定した。また、図 1に示 すような形態を備えるプレート &フォーク型電極（白金の長方形プレート状電極：6. 6 7mm X 3. 87mm,ステンレス製フォーク状電極：フォーク 3本、長さ 6. 67mm,間隔 1. 3mm、ネッパジーン社製）のプレート状電極側にあらかじめ PBSを浸したパッドを 貼っておいた。安定ィヒ siRNAの PBS溶液を 10 /i lずつ計 2か所、合計 20 μ 1を盛り 上がった皮下腫瘍の中央部に注入した。フォーク状電極側を皮下腫瘍下部に刺し、 プレート状電極を腫瘍上部の表皮にかぶせて挟持した。この状態で CUY21 (ネッパ ジーン社製）にて通電した。通電条件は、 Pon= 50msec, Poff = 100msecで 3回 ノルス発信した後、極性を切り替えて、同様に 3回パルス発信して、合計 6回パルス 発信した。
[0101] 至適電圧の決定にあたっては、 siRNAとして Cy3標識した # 3siSTABLE—modi fiedsiRNA (Dharmacon社に合成依頼した。）を用いて、 siRNAの腫瘍への導入 における至適電圧を決定した。 Cy3標識安定ィ匕 siRNA (40 μ M)を腫瘍あたり 20 μ 1 (10 μ I X 2か所）づっ注入し、上記方法にて、エレクト口ポレーシヨンを施した。電圧 を 35, 50, 60, 70, 90， 100Vに設定し、通電を行い、実際に腫瘍に流れた実効電 流値を記録した。 24時間後に腫瘍を摘出、凍結切片を作成し、共焦点レーザー顕 微鏡にて Cy3の赤色蛍光を観察 '追跡した。また、サイトツタス 'グリーン (インビトロジ ェン社)試薬にて、細胞の核を染色した（緑色蛍光）。 Cy 3標識安定化 siRNA (40 μ Μ)を腫瘍あたり 20 μ 1 (ΐ 0 μ ΐ Χ 2)づっ注入後、通電しない群も合わせて検討した。 これらの結果から、 50V以上 70V以下の設定電圧で通電すると siRNAが効率よく細 胞内に導入されることがわかった。
[0102] (実施例 4)
本実施例では、 siRNAの腫瘍内の滞留性について評価した。すなわち、通電導入 後に、 5, 10， 15及び 20日後に評価し、腫瘍の摘出から凍結切片の作製を行う以外 は、実施例 3と同様の操作を行い、同様に共焦点レーザー顕微鏡にて Cy 3標識物を 追跡観察した。この結果、 Cy3標識安定化 siRNAが少なくとも 20日間は腫瘍内に滞 留することが証明された。
[0103] (実施例 5)
本実施例では、エレクト口ポレーシヨンによる siRNAの抗腫瘍効果 (治療効果）につ いて評価した。方法を以下に示す。安定化 # 3siRNAの PBS溶液（6. 25, 12. 5, 2 5 μ M液）を、実施例 3と同様にして PC— 3皮下腫瘍 (治療開始体積 = 50〜80mm3 )に注入し（10 μ I X 2回）、直ちにプレート &フォーク型電極のフォーク側を腫瘍下部 に刺し、通電した (設定電圧一律 70V)。なお、対照として PBSを腫瘍に注入し（10 μ I X 2回）、通電する群も設定した。また、スクランブル配列を備える安定化 siRNA の PBS溶液（25 μ Μ)を注入する（10 μ I X 2回）群も置いた。さらに、通電しない全く の無処置群も置いた。治療開始日を dayOとし、 day20に 2回目の治療を全く同様の 手法で再施行し、 42日目まで腫瘍径をモニタし、治療効果の指標としては、 dayOの 腫瘍体積 (計算式は実施例 3に記載）に対する所定日数経過時点での腫瘍体積の 比を治療効果の指標とした。なお、各治療群において担癌マウス 5匹を対象とした。 なお、腫瘍あたりの siRNAの使用量は以下のとおりであった。結果を図 8に示す。 腫瘍あたりの siRNA量
6. 25 μ Μ夜を 20 μ 1注人 125pmol
12. 5 μ Μ夜を 20 μ 1注人 250pmol
25 μ Μ夜を 20 μ 1注人 500pmol
[0104] また、治療開始 40日目の腫瘍の外観の写真を図 9 (a)〜（d)に示す。図 9 (a)は、 安定化 siRNAであって、 siRNA量が 500pmolZ腫瘍（エレクト口ポレーシヨンあり） の腫瘍外観であり、図 9 (b)は、 PBSのみ（エレクト口ポレーシヨンあり）の腫瘍外観で あり、図 9 (c)は、スクランブル配列を備えるスクランブル化 ·安定化 siRNAであって、 siRNA量が 500pmol/腫瘍（エレクト口ポレーシヨンあり）の腫瘍外観であり、図 9 (d )無処理（エレクト口ポレーシヨンなし）の腫瘍外観である。
[0105] さらに、安定化 siRNA (500pmol/腫瘍）によって治療を施した腫瘍及びスクラン ブル化'安定ィ匕 siRNA500pmol/腫瘍）を投与した腫瘍について、腫瘍内微小血 管密度を CD31 (血管内皮細胞上の表面抗原）をマーカーとした免疫化学的染色法 にて測定した。治療開始から起算して、 10、 20、 30日目の腫瘍について検討した。 結果を図 10に示す。
[0106] 図 8に示すように、安定化 siRNAについては、腫瘍あたりの siRNA量が 250pmol 及び 500pmolのとき、ほぼ同等の治療効果 (抗腫瘍効果）が認められた。一方、同 量が 125pmolのときには、これらよりは治療効果が減弱した。また、図 8及び図 9に示 すように、スクランブルでは、全く治療効果は認められなかった。さらに、 PBSを注入 してから通電する群も治療効果が認められず、通電なしの無処置群と同等であった。 通電による組織障害による癌退縮は全く観察されなかった。以上のことから、エレクト 口ポレーシヨンによる siRNAのデリバリーは、簡易かつ迅速な手法であるとともに局所 適用に優れ、さらに、高い治療効果が得られることがわかった。
[0107] また、本発明者らが既に行ったァテロコラーゲンを用いる siRNAデリバリー法による 結果（Υ· Takeiら、 CANCER RESEARCH 64, 3365-3370， MAY 15， 2004)と比較する と、本実施例のエレクト口ポレーシヨンによるデリバリー法において腫瘍あたりの siRN A量が 250pmol時の治療効果力 ァテロコラーゲンデリバリー法おいて同量が 500p mol時の治療効果と一致していた（なお、ァテロコラーゲンデリバリー法では、非修飾 siRNAを用いている。）。以上のことから、エレクト口ポレーシヨンによる siRNAデリバ リーはァテロコラーゲン一ゲンデリバリー法に匹敵するか又はそれ以上の有効性を有 していることがわかった。
[0108] さらに、図 10に示すように、安定ィ匕 siRNAにより治療群では、スクランブル配列を 備える安定化 siRNA治療群と比較して、明らかに腫瘍内微小血管密度が減少して いた。以上の結果より、本治療による癌増殖抑制効果は siRNAによる腫瘍内 hVEG F_A量の低下に起因する腫瘍内血管新生の抑制のメカニズムによるものであること が証明された。
[0109] (実施例 6)
本実施例では、安定化 # 3siRNA単体の PBS溶液（12. 5 μ M)を siRNA溶液と 用いる以外は、実施例 3と同様にして PC— 3皮下腫瘍 (治療開始体積 = 50〜80m m3)に注入し（10 μ I X 2回）、直ちにプレート &フォーク型電極のフォーク側を腫瘍 下部に刺すとともに、プレート型電極を表皮に当接させて皮下腫瘍を挟持して通電し た（設定電圧一律 70V)。なお、 siRNAは、腫瘍あたり 250pmolとなるように導入した 。また、比較例として、未修飾 # 3siRNA (12. 5 μ Μ)とァテロコラーゲン（1.75%)と を含有する溶液を siRNA量が同量となるように皮下腫瘍に注入（10 μ 1 X 2回）する 群も設定した。さらに、対照例として PBSを皮下腫瘍に注入し（10 μ I X 2回）、通電 する群も設定した。初回治療日を dayOとし、 20日後にもう一度、上記治療を行い、 4 0日後まで腫瘍の大きさをそれぞれにっき計測した。結果を図 11に示す。
[0110] 図 11に示すように、安定化 # 3siRNA単体をエレクト口ポレーシヨンにて導入した 群（図中、白抜き丸印）は、未修飾の # 3siRNAをァテロコラーゲンで導入した群（比 較例）（黒三角印）よりも治療効果があった。以上のことから、 siRNAのエレクトロボレ ーシヨンによる導入方法によれば、ァテロコラーゲン導入法よりも優れた siRNAの作 用発現効果、すなわち、遺伝子発現抑制効果及び腫瘍抑制効果が得られることがわ かった。
[0111] (実施例 7)
本実施例では、エレクト口ポレーシヨンに使用する電極形状と通電量について検討 した。実施例 3と同様にしてヌードマウス皮下に PC— 3 (ヒト前立腺癌）細胞を移植し て腫瘍を形成し、腫瘍体積が 50〜80mm3程度となった腫瘍組織に対して、一対の プレート状電極（プレート電極（白金の長方形プレート状電極： 6. 67mm X 3. 87m m)ネッパジーン社製） )とプレート状電極とニードル状電極（図 1に示すような形態を 備えるプレート &フォーク型電極（白金の長方形プレート状電極： 6. 67mm X 3. 87 mm、ステンレス製フォーク状電極：フォーク 3本、長さ 6. 67mm,間隔 1. 3mm、ネッ パジーン社製） )とを用いて組織障害が生じなレ、程度の電圧（70V)を印加したときの 腫瘍内の実測抵抗値及び実測電流値を計測した。なお、一対のプレート状電極は、 表皮を介して腫瘍の側面から固形腫瘍を挟持するように配置し、プレート状電極及 びニードル状電極は、ニードル状電極を皮下固形腫瘍の底部の下に刺し込むととも にプレート状電極を表皮を介して固形腫瘍の上方に配置して挟持するようにした。ま た、各実測値は、それぞれの電極形状につき 5つの固形腫瘍を用いて計測したもの である。エレクト口ポレーシヨン装置としては、 CUY21 (ネッパジーン社製）を用レ、、各 実測値の計測のための通電条件（'通電条件は、 Pon= 50msec, Poff= 100msec で 3回パルス発信した後、極性を切り替えて、同様に 3回パルス発信して、合計 6回パ ルス発信した。）は同一とした。結果を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000037_0001
[0112] 表 1に示すように、プレート状電極とニードル状電極とを用いた場合には、一対のプ レート状電極を用いた場合と比較して抵抗値には有意差はなかった力 S、有意に高い 電流値が計測された。本発明者は、腫瘍組織への siRNAの効率的な導入には、 0. 2アンペア程度の電流量であるという知見を得ており、当該知見によれば、プレート状 電極を用いた場合、腫瘍組織に生体障害性の低い 70Vの印加電圧では、 siRNAの 安全な導入は期待できないことが推測される。なお、印加電圧を増大させれば、電流 量が増大するが、組織障害や脱落が生じてしまレ、生体に対する安全性を確保できな い場合も起こりうる。
[0113] このようなプレート状電極とニードル状電極との配置態様によれば、ニードル状電 極とプレート状電極とを対向させることで、両電極で皮下組織を直接挟持しても、ある いはニードル状電極は皮下に配置しプレート状電極については表皮を介して挟持し ても、固形腫瘍等の生体組織を確実に挟持するとともに、電極間距離を一定とするよ うに挟持することができる。このために、高い電流量が得られやすいと推測される。さ らに、腫瘍内部は、血管新生が活発であり血管透過性の高いため、こうした組織近傍 にニードル状電極が差し込まれることで、電流量を確保しやすいと考えられる。以上 のことから、プレート状電極とニードル状電極との組み合わせが生体組織を直接ある いは皮下組織を低侵襲的に表皮を介して間接的に挟持してエレクト口ポレーシヨンを 実現するのに好ましいといえる。 [0114] さらに、標的とする生体組織が腫瘍組織（特に、皮下腫瘍組織)であり、導入する si RNA等の核酸コンストラクトの標的遺伝子が血管内皮増殖因子 (VEGF)である場 合には、プレート状電極及びニードル状電極との組み合わせが適切であり、上記した 固形腫瘍に対する配置態様での電圧印加によるエレクト口ポレーシヨンが有効である と考免られる。
[0115] 本出願は、 2005年 7月 16日に出願された日本国特許出願第 2005— 207067号 を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが引用により含まれる。 産業上の利用の可能性
[0116] 本発明は、エレクト口ポレーシヨン装置の製造及びその利用に有用である。 配列表フリーテキスト
[0117] 酉己歹 (J番号 1〜5： target sequence of siRNAto human VEGF—A
酉己歹1 J番号 6〜10 : sense sequence of siRNA

Claims

請求の範囲
[I] ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクト口ポレーシヨン装置の制御方法であ つて、
前記動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトの存在下、前記動 物の生体組織に対して配置される前記エレクト口ポレーシヨン装置の電極に電圧を印 加する工程、
を備える、方法。
[2] 前記核酸コンストラクトは、一本鎖又は二本鎖 DNA、一本鎖又は二本鎖 RNA、 D
NA— RNAノヽイブリツド及び DNA—RNAキメラオリゴヌクレオチドから選択される、 請求項 1に記載の方法。
[3] 前記核酸コンストラクトは、前記動物において RNA干渉を発現可能な核酸コンスト ラクトである、請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 前記核酸コンストラクトは、 siRNAである、請求項 3に記載の方法。
[5] 前記核酸コンストラクトは、修飾により血清中での安定性が向上されている、請求項
1〜4のいずれかに記載の方法。
[6] 前記核酸コンストラクトは、ヒト血清中での半減期が 50時間以上である、請求項 5に 記載の方法。
[7] 前記核酸コンストラクトは、血管新生を促進する遺伝子を標的として RNA干渉を発 現可能なコンストラクトである、請求項 1〜6のいずれかに記載の方法。
[8] 前記遺伝子は、血管内皮増殖因子遺伝子である、請求項 7に記載の方法。
[9] 前記生体組織は、固形腫瘍を含む、請求項:!〜 8のいずれかに記載の方法。
[10] 前記生体組織は表皮又は表皮下に存在する組織である、請求項：!〜 9のいずれか に記載の方法。
[I I] 前記電極に電圧を印加するのと先立って若しくは印加後又は同時に、前記生体組 織又はこれらの近傍に生分解性マトリックス材料を供給する工程を備える、請求項 1 〜10のいずれかに記載の方法。
[12] 前記電圧印加工程は、前記核酸コンストラクトを前記生体組織又はその近傍に供 給した後又は供給しつつ前記生体組織に対して配置される前記電極に電圧を印加 する工程である、請求項:!〜 11のいずれかに記載の方法。
[13] 前記電極は、少なくとも一つのプレート状電極を備えている、請求項:!〜 12のいず れかに記載の方法。
[14] 前記電極は、 1本又は 2本以上のニードル状電極を備えている、請求項 1〜： 13のい ずれかに記載の方法。
[15] 前記ニードル状電極には、前記核酸コンストラクトを含む液体が通過可能な中空部 と開口とを備える、請求項 14に記載の方法。
[16] 前記エレクト口ポレーシヨン装置は対極となる電極としてプレート状電極とニードル 状電極とを備える、請求項 1〜： 15のいずれかに記載の方法。
[17] 前記プレート状電極は前記核酸コンストラクトを導入しょうとする生体組織の表面に 対して配置し、前記ニードル状電極は前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置 する、請求項 1〜： 16のいずれかに記載の方法。
[18] 前記生体組織は皮下固形腫瘍であり、前記プレート状電極は、前記皮下固形腫瘍 を覆う表皮表面に当接して配置し、前記ニードル状電極は、前記生体組織又はその 近傍に穿刺して配置する、請求項 17に記載の方法。
[19] 前記電極に印加する電圧は 50V以上 70V以下である、請求項 1〜： 18のいずれか に記載の方法。
[20] ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクト口ポレーシヨン装置の制御方法であ つて、
前記動物において RNA干渉を発現可能な siRNAの存在下、前記動物の表皮下 の罹患組織の下部に配置されたニードル状電極と前記罹患組織を覆う表皮表面に 配置されたプレート状電極とに対して所定の電圧を印加する工程、
を備える、方法。
[21] 前記動物はヒトであり、前記罹患組織は血管新生阻害によって進行抑制、改善又 は治療が可能な組織を含んでレ、る、請求項 20に記載の方法。
[22] 非ヒト動物の作製方法であって、
前記非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑 制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入する工程、 を備える方法。
[23] 前記核酸コンストラクトは、疾患関連遺伝子を標的として RNA干渉を発現可能な核 酸コンストラクトである、請求項 22に記載の作製方法。
[24] 非ヒト動物の作製方法であって、
ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞 の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、
該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制 可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入する工程、
を備える方法。
[25] 治療剤の探索方法であって、
ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞 の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、
該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制 可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入する工程と、
前記核酸コンストラクトが導入された前記モデル動物における病態又は前記生体 組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。
[26] 治療剤の探索方法であって、
非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制 可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入して前記非ヒト動物の少 なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を 形成する工程と、
この非ヒト動物に化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型 を解析する工程と、
を備える、方法。
[27] 創薬のための標的化合物の探索方法であって、
非ヒト動物の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的とし て遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクト口ポレーシヨンにより導入 するェ
程と、
前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析する 工程と、
を備える、方法。
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