JP5176104B2 - エレクトロポレーション装置の制御方法 - Google Patents
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Description
(ヒト及び非ヒト動物)
本発明のエレクトロポレーション装置の制御方法は、ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロポレーション装置の使用に関連している。本明細書において非ヒト動物とは、ヒト以外の霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等の動物を包含している。哺乳類としては、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物が挙げられる。魚類としては、ゼブラフィッシュ、メダカなどが挙げられる。特に、疾患モデルや研究用としては、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタ、ゼブラフィッシュ、メダカなどが好ましく用いられる。なお、本発明におけるヒト及び非ヒト動物は、胚、胎生及び生後個体のいずれの状態も包含するが、本発明の制御方法のほか、非ヒト動物の作製方法、治療剤の探索方法、創薬のための標的遺伝子の探索方法等においては、生後の個体を用いることが好ましい。
本発明の制御方法は、こうした動物の生体組織に配置されたエレクトロポレーション装置の電極に電圧を印加する。動物の生体組織としては、特に限定しない。後述するように生体組織に配置される電極の形態を選択すること及び電極の配置のための生体組織の切開等の処置の採用により、動物の表皮近傍のみならず、内部の生体組織の全てを対象とすることができる。電圧の印加を経皮的に行うことを考慮すれば生体組織は表皮又は表皮下(表皮直下あるいはその近傍)であることが好ましい。このような部位であれば、電極の少なくとも一部がニードル状などであって表皮に侵入可能な形態であれば、容易にこうした部位に電圧を印加することができる。例えば、経皮的に導入操作のしやすい生体組織としては、膝などの各種関節が挙げられる。関節は、表皮直下にあるとともに体外へ突出している点からも好ましい。その他、歯周組織などの口腔内も好ましい。なお、電極形態によっては血管などを介して経管的に到達できる生体組織も好ましい。また、内視鏡手術の手法により経口、経肛門又は経膣的若しくは経腹腔的な手法によって電極を配置可能な生体組織も好ましい。
本発明におけるエレクトロポレーション装置としては、一般的なエレクトロポレーション装置を利用できる。図1には、エレクトロポレーション装置2の一例を示す。エレクトロポレーション装置2は、本体4と、本体4にケーブル14とホルダー12とを介して接続される電極部材20を備えることができる。本体4にはパルス発生手段5を備えることができる。パルス発生手段6は、ケーブル10及びホルダー14内を挿通する導線を介して電極10a、10bに電圧を印加することができる。パルス発生手段6としては、一般交流電源を用いて電気パルスとしてAC(交流)パルス、エクスポネンシャルパルス、DC(直流)パルスなどを印加できるものが知られている。特に限定しないが、DCパルスを印加できるものが好ましい。パルス波形としては、方形波が好ましい。方形波は、セットされた電圧まで急激に上昇し所定時間(パルス長)だけその電圧を維持し、再び急激に0値にまで降下する波形である。より好ましくはこうした方形波を1秒間に複数回、好ましくは99回までの周期で印加できるパルス発生手段を用いる。なお、ここで一周期とは、パルスのオン時間とオフ時間との時間和をいう。
本発明における核酸コンストラクトは、遺伝子の発現を抑制可能に構築されている。本明細書において遺伝子の発現を抑制するとは、遺伝子等をコードするDNAとのハイブリダイズなどの相互作用により転写を阻害するアンチジーン核酸法、mRNAなどのRNAとのハイブリダイズなどの相互作用により転写又は翻訳を阻害するアンチセンス核酸法、mRNAなどの転写物とのハイブリダイズ等の相互作用に基づいて転写物を分解又は翻訳を阻害するRNA干渉法、デコイ核酸法、リボザイム法等によるものが挙げられる。なお、遺伝子発現を抑制するものではないがアプタマーをエレクトロポレーションにより導入することもできる。また、核酸コンストラクトとしては、前駆体マイクロRNA(miRNA)や成熟miRNAなどのmiRNAやその作用を制御する小RNA分子を含んでいる。ここに、本明細書において「核酸」とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸のようなポリヌクレオチドを意味している。また、この用語には、一本鎖(DNA又はRNA、センス又はアンチセンス)又は二本鎖ポリヌクレオチド(DNA又はRNA)が包含される。また、DNA−RNAハイブリッド(二本鎖)やDNA−RNAキメラオリゴヌクレオチド(一本鎖)、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノオリゴヌクレオチドも包含される。さらにまた、ポリヌクレオチドには天然あるいは人工的な修飾が施されていてもよい。なお、本明細書において「RNA干渉」とは、二本鎖RNAによってその配列特異的に標的遺伝子のmRNAなどの転写産物を分解するか又は翻訳を阻害する現象を意味するものとする。RNA干渉によれば、結果として標的遺伝子の発現を抑制することができる。ここで標的遺伝子の発現を抑制するとは、標的遺伝子がコードするmRNAがポリペプチドに翻訳されるのを抑制し又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量が低下することを意味している。
であることが好ましく、より好ましくは2ntである。さらに、shRNAにおけるループ部位は、こうした態様の二重鎖(shRNAにおいてはステム)及び3’末端構造を形成し維持するのを妨げない程度のループ部位の長さを備えていればよい。
(1)標的する遺伝子のCDSにおいてAA(N19)TT、AA(N21)、NA(N21)等となる配列をターゲットとする(siRNAとしてはこれらの配列の第3〜21塩基の19塩基を使用する)、
(2)転写因子の結合部位を避けるためスタートコドンから下流50〜100塩基以上下流側とする、
(3)標的mRNAの予想される二次構造を確認して立体障害により結合しにくい部位を避ける、
(4)BLAST等によるホモロジーサーチによって他の遺伝子と相同性のない配列を選択する、
(5)GC含量を50%前後(特に、47〜52%)とする、等である。
なお、この他ターゲット配列の決定方法を含むsiRNAの設計方法は、http://design.rnai.jp/sidirect/index.php、http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.htmlやRational siRNAdesign for RNA interference (Nature Biotechnology , vol. 22, 326 - 330 (2004), Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese, Stephen Scaringe,William S Marshall & Anastasia Khvorova)、Improved and automated prediction ofeffective siRNA(Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18;319(1):264-74、Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL.)等公開された各種のルールを適宜適用して行うことができる。
次に、こうした核酸コンストラクトを、エレクトロポレーション装置を用いて生体内の細胞に導入する操作及びエレクトロポレーション装置の制御について説明する。図2には、この操作のフローの例を示す。図2には、電圧印加のタイミングやマトリックス材料の添加形態の異なる4種類のフローを示している。図2(a)及び(b)は、核酸コンストラクトの標的組織への供給及び到達後に電圧印加するフローを示し、図2(c)及び(d)は、核酸コンストラクトの標的生体組織への供給及び到達に伴って電圧印加するフローを示す。なお、これら操作フローは説明の容易化のために明示したが、これら4種のフローに示す操作を組み合わせて用いてもよい。また、これらの4種のフローの一部分を組み合わせて用いてもよい。
本発明の非ヒト動物の作製方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物においてRNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な1種又は2種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入することを特徴としている。すなわち、本作製方法は、本発明のエレクトロポレーション装置の制御方法を非ヒト動物のみに適用した態様である。したがって、非ヒト動物、核酸コンストラクト及びエレクトロポレーション装置、その操作等については、上記した範囲の全てが非ヒト動物の作製方法についても適用される。
本発明の治療剤の探索方法は、ヒトの疾患のモデルとなるような病態、遺伝子変異又は生体組織又は細胞の表現型を有する非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物においてRNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な1種又は2種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入し、前記核酸コンストラクトが導入された前記非ヒト動物における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析することを特徴としている。この方法によれば、エレクトロポレーションにより核酸コンストラクトを導入するため、導入した核酸コンストラクトの前記疾患に対する有効性を容易に評価することがで
きる。この結果、本発明によれば、遺伝子治療剤としての核酸コンストラクトを選抜できる有効なスクリーニング系が提供される。
本発明の治療剤の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物においてRNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な1種又は2種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、この非ヒト動物に1種又は2種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析することを特徴とする。この方法によれば、非ヒト動物に対して、エレクトロポレーションにより核酸コンストラクトを導入してヒトの疾患態様を形成し、化合物を投与してその効果を解析するものであるので、非ヒト動物において前記核酸コンストラクトにより形成された疾患態様に対する低分子化合物等の有効性を容易に評価できる。この結果、低分子化合物を有効成分とする薬剤を選抜できる有効なスクリーニング系を提供できる。なお、低分子化合物等の薬剤候補の投与形態は特に限定しないで、経口、注射、注入等従来公知の各種形態を採用できる。
本発明の創薬のための標的化合物の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的としてRNA干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な1種又は2種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入し、前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析することを特徴としている。この方法によれば、前記細胞又は生体組織の表現型を解析することにより、前記疾患の予防又は治療ための標的化合物を見出すことができる。標的化合物を見出すことにより、この化合物を活性化又は阻害する化合物などを探索するスクリーニング系が提供される。なお、この場合の細胞又は生体組織の表現型の解析とは、例えば、こうした細胞又は生体組織の観察や、細胞活性状態、タンパク質の発現量や活性化、各種代謝産物の測定などが挙げられる。なお、疾患関連遺伝子とは、疾患に関連することが明らかである遺伝子のみならず、疾患に関連する可能性のある遺伝子であってもよい。
本実施例では、ヒトVEGF−A(以下、hVEGF−Aという。)(GenBankアクセッション番号NM_003376)のCDS配列に基づいて5種類のsiRNAを作製し、invitroでそのノックダウン効果を検討した。
5種類のsiRNAのhVEGF−Aのターゲット配列を図4及び配列番号:1〜5に示す。なお、図4における遺伝子配列の標記はCDSとなっている。また、合成したsiRNAのセンス配列を配列番号:6〜10に示し、二重鎖RNAとしての形態を図5に示す。なお、全てのsiRNAは、ターゲット配列に基づいてDharmacon社に依頼して合成させた。
各種のsiRNAを、PC−3細胞におけるhVEGF−A発現の抑制効果により評価した。ヒト前立腺癌細胞PC−3(ATCC)を35mmディッシュにまき(2×105個/皿)、1晩静置後、各siRNAを無血清条件下で陽イオン脂質試薬(リポフェクトアミン・プラス:インビトロジェン社)にてトランスフェクション(37℃、4時間)した。導入後、10%FBS1mlを添加し、6時間培養後、ヘパリン20μg/ml含有無血清培地に交換して16時間培養後に、培養上清を回収し、Quantikinehuman VEGF ELISAキット(R&DSystems社)でhVEGF−A濃度を測定した。結果を、図6に示す。
本実施例では、実施例1の#3siRNA(安定化修飾基で修飾されていない)と、#3siRNAと同じターゲット配列に基づいて安定化されたsiRNAを用いて、hVEGF−A発現の抑制効果を確認した。なお、安定化させたsiRNAは、#3のターゲット配列に基づいてDharmacon社に依頼して、同社による安定化修飾基で修飾したsiRNAであるsiSTABLE(Dharmacon社の商標)として合成させた。
これら2種のsiRNAを、PC−3細胞におけるhVEGF−A発現の抑制効果により評価した。ヒト前立腺癌細胞PC−3(ATCC)を35mmディッシュにまき(2×105個/皿)、1晩静置後、各siRNAを無血清条件下で陽イオン脂質試薬(リポフェクトアミン・プラス:インビトロジェン社)にてトランスフェクション(37℃、4時間)した。導入後、10%FBS1mlを添加し、6時間培養後、ヘパリン20μg/ml含有無血清培地に交換して培養を継続した。導入後、48,72,96,120,144及び168時間後に培養上清を回収し、Quantikinehuman VEGF ELISAキット(R&DSystems社)でhVEGF−A濃度を測定した。なお、#3のターゲット配列に対するスクランブル配列についてのそれぞれ非修飾のsiRNAとDharmacon社によるsiSTABLEによる安定化siRNAについて同様の方法にてVEGF−A濃度を測定した。これらの結果を、図7に示す。
本実施例では、エレクトロポレーションにより、腫瘍にsiRNAを導入するための至適電圧を決定した。エレクトロポレーションによる導入方法を以下に示す。PC−3細胞(3×106個/部位)をヌードマウス(日本SLC:オス、8週齢)の鼠径部に皮下注射(24G針)し、PC−3皮下移植腫瘍(Xenograft)担癌マウスを作成した。細胞移植後、3〜4週間経過すると、同部位に腫瘍が形成された(腫瘍体積=50mm3〜80mm3)。こうしたマウスをエレクトロポレーション実験に用いた。なお、腫瘍体積は次式より求めた。
V=(短軸)2×(長軸)÷2
本実施例では、siRNAの腫瘍内の滞留性について評価した。すなわち、通電導入後に、5,10,15及び20日後に評価し、腫瘍の摘出から凍結切片の作製を行う以外は、実施例3と同様の操作を行い、同様に共焦点レーザー顕微鏡にてCy3標識物を追跡観察した。この結果、Cy3標識安定化siRNAが少なくとも20日間は腫瘍内に滞留することが証明された。
本実施例では、エレクトロポレーションによるsiRNAの抗腫瘍効果(治療効果)について評価した。方法を以下に示す。安定化#3siRNAのPBS溶液(6.25,12.5,25μM液)を、実施例3と同様にしてPC−3皮下腫瘍(治療開始体積=50〜80mm3)に注入し(10μl×2回)、直ちにプレート&フォーク型電極のフォーク側を腫瘍下部に刺し、通電した(設定電圧一律70V)。なお、対照としてPBSを腫瘍に注入し(10μl×2回)、通電する群も設定した。また、スクランブル配列を備える安定化siRNAのPBS溶液(25μM)を注入する(10μl×2回)群も置いた。さらに、通電しない全くの無処置群も置いた。治療開始日をday0とし、day20に2回目の治療を全く同様の手法で再施行し、42日目まで腫瘍径をモニタし、治療効果の指標としては、day0の腫瘍体積(計算式は実施例3に記載)に対する所定日数経過時点での腫瘍体積の比を治療効果の指標とした。なお、各治療群において担癌マウス5匹を対象とした。なお、腫瘍あたりのsiRNAの使用量は以下のとおりであった。結果を図8に示す。
腫瘍あたりのsiRNA量
6.25μM液を20μl注入 125pmol
12.5μM液を20μl注入 250pmol
25μM液を20μl注入 500pmol
本実施例では、安定化#3siRNA単体のPBS溶液(12.5μM)をsiRNA溶液と用いる以外は、実施例3と同様にしてPC−3皮下腫瘍(治療開始体積=50〜80mm3)に注入し(10μl×2回)、直ちにプレート&フォーク型電極のフォーク側を腫瘍下部に刺すとともに、プレート型電極を表皮に当接させて皮下腫瘍を挟持して通電した(設定電圧一律70V)。なお、siRNAは、腫瘍あたり250pmolとなるように導入した。また、比較例として、未修飾#3siRNA(12.5μM)とアテロコラーゲン(1.75%)とを含有する溶液をsiRNA量が同量となるように皮下腫瘍に注入(10μl×2回)する群も設定した。さらに、対照例としてPBSを皮下腫瘍に注入し(10μl×2回)、通電する群も設定した。初回治療日をday0とし、20日後にもう一度、上記治療を行い、40日後まで腫瘍の大きさをそれぞれにつき計測した。結果を図11に示す。
本実施例では、エレクトロポレーションに使用する電極形状と通電量について検討した。実施例3と同様にしてヌードマウス皮下にPC−3(ヒト前立腺癌)細胞を移植して腫瘍を形成し、腫瘍体積が50〜80mm3程度となった腫瘍組織に対して、一対のプレート状電極(プレート電極(白金の長方形プレート状電極:6.67mm×3.87mm)ネッパジーン社製))とプレート状電極とニードル状電極(図1に示すような形態を備えるプレート&フォーク型電極(白金の長方形プレート状電極:6.67mm×3.87mm、ステンレス製フォーク状電極:フォーク3本、長さ6.67mm、間隔1.3mm、ネッパジーン社製))とを用いて組織障害が生じない程度の電圧(70V)を印加したときの腫瘍内の実測抵抗値及び実測電流値を計測した。なお、一対のプレート状電極は、表皮を介して腫瘍の側面から固形腫瘍を挟持するように配置し、プレート状電極及びニードル状電極は、ニードル状電極を皮下固形腫瘍の底部の下に刺し込むとともにプレート状電極を表皮を介して固形腫瘍の上方に配置して挟持するようにした。また、各実測値は、それぞれの電極形状につき5つの固形腫瘍を用いて計測したものである。エレクトロポレーション装置としては、CUY21(ネッパジーン社製)を用い、各実測値の計測のための通電条件(‘通電条件は、Pon=50msec,Poff=100msecで3回パルス発信した後、極性を切り替えて、同様に3回パルス発信して、合計6回パルス発信した。)は同一とした。結果を表1に示す。
配列番号6〜10: sense sequence of siRNA
Claims (11)
- ヒト及び非ヒト動物を含む動物における経皮的エレクトロポレーション装置であって、
前記動物の表皮下に存在する標的組織に対して配置される一対の電極であって、一方の電極は、前記標的組織を覆う表皮表面に配置可能なプレート状電極であり、他方の電極は、前記標的組織又はその近傍に穿刺して配置可能な互いに平行な2本以上のニードルを備えるニードル状電極であり、前記プレート状電極と前記ニードル状電極とは前記標的組織を対向して挟持可能である前記一対の電極と、
前記一対の電極間に方形波の電圧パルスを印加可能なパルス発生部と、
を備える、装置。 - さらに、把持して開閉可能な一対の脚部を有するホルダーであって、前記脚部の各先端に前記プレート状電極と前記ニードル状電極とをそれぞれ有するホルダーを備える、請求項1に記載の装置。
- 前記ニードルは、前記核酸コンストラクトを含む液体が通過可能な中空部と開口とを備える、請求項1又は2に記載の装置。
- 前記パルス発生部は、前記一対の電極に50V以上70V以下の電圧を印加可能である、請求項1〜3のいずれかに記載の装置。
- 前記核酸コンストラクトによって皮下疾患の治療をする皮下疾患治療用である、請求項1〜4のいずれかに記載の装置。
- 前記標的組織は固形腫瘍を含み、前記皮下疾患は固形腫瘍である、請求項5に記載の装置。
- 前記遺伝子は、血管内皮増殖因子遺伝子であり、前記疾患は、血管新生阻害によって進行抑制、改善又は治療が可能な疾患である、請求項5又は6に記載の装置。
- 非ヒト動物の作製方法であって、
前記非ヒト動物の皮下の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを請求項1〜7のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて導入する工程、
を備える、方法。 - 治療剤の探索方法であって、
ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、
該非ヒト動物の表皮下の生体組織の細胞内に対して、請求項1〜7のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて、前記非ヒト動物において所定の遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを導入する工程と、
前記核酸コンストラクトが導入された前記非ヒト動物における病態又は前記生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。 - 治療剤の探索方法であって、
非ヒト動物の表皮下の標的組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを請求項1〜7のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、
この非ヒト動物に化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。 - 創薬のための標的化合物の探索方法であって、
非ヒト動物の表皮下の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的として遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを請求項1〜7のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて導入する工程と、
前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。
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