CN103695311A - 一种电转染装置及使用该装置的鸡胚视顶盖电转染方法 - Google Patents

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杨慈清
王聪睿
李小英
林俊堂
范文艳
李琼
刘彦礼
付苏雷
贾阳阳
李晗
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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Abstract

本发明公开了一种电转染装置及使用该装置的鸡胚视顶盖电转染方法，该电转染装置包括用于与电源供应器测试端连接的第一电极和第二电极，所述第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，所述针形电极呈弧形。本发明采用2个分别独立的电极，放置位置和角度可以灵活调整；本发明的第二电极为针形电极，直径较细，在放入鸡胚视顶盖底部时，不会对组织或卵黄膜造成损伤，避免由此引起的胚胎死亡，且能够起到良好的导电作用，同时该针形电极呈弧形，弧形设计能够在不损伤鸡胚的情况下起到固定鸡胚视顶盖的作用。

Description

一种电转染装置及使用该装置的鸡胚视顶盖电转染方法
技术领域
本发明涉及一种电转染装置，同时还涉及使用该电转染装置的鸡胚视顶盖电转染方法。
背景技术
神经元的迁移对于神经系统的形成以及发挥正常功能起着重要的作用，许多疾病就与神经元的迁移障碍有关。由于禽类视顶盖的分层结构比哺乳类动物大脑皮质层的结构更复杂，因此研究其细胞的迁移机制相对更为困难。目前，神经元的迁移机制以及大脑皮层发生机制尚不明确，与神经发生相关的分子功能以及信号调节通路还有待进一步研究。
对神经元迁移发生紊乱相关分子机制的研究，必须借助活体动物模型，而神经系统是形成较早的一个庞大系统，研究早期影响中枢神经系统发育相关分子需要在胚胎发育过程中进行干预，由此进一步分析其作用。基因打靶技术是目前活体内基因沉默和超表达成熟的技术，而在发育生物学研究领域广泛使用的模式动物鸡胚中无法进行基因打靶，近年来建立的活体电转基因技术实现了鸡胚发育过程基因的抑制表达和超表达。
从最早1998年Ochiai H等首次在鸡胚中实现转基因成功的报道以来，建立在鸡胚活体电转模型上开展了一系列研究。从目前研究进展来看，实现早期脊髓内转染成功率和胚胎的成活都是比较高的，而且开展的研究也是较多，是因为鸡胚脊髓中的转染最佳时间在E2.5-E3，此时胚胎较小，采用开窗培养的方法能够方便的进行转染，由于脊髓转染电极大多采用针状电极，体积较小，只需要蛋壳侧面打开较小的窗口就可以进行电击。但是目前，针对鸡胚神经元迁移研究最佳部位视顶盖的研究并不多，主要原因在于在胚胎发育6天（E6）以后，胚胎将会下沉到蛋清中，此时无法进行转染，从发育的时间上看最佳视顶盖转染的时间是在E5。但是由于在E5时胚胎较大，视顶盖转染无法采用针状电极，多采用板状电极，而板状电极较大，蛋壳开窗由于窗口的限制，很难准确放置，转染成功率低，而且直接利用现有电极不能够实现转染到视顶盖正确的部位。
发明内容
本发明的目的是提供一种电转染装置。
本发明的目的还在于提供一种使用电转染装置的鸡胚视顶盖电转染方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种电转染装置，包括用于与电源供应器测试端连接的第一电极和第二电极，所述第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，所述针形电极呈弧形。
该装置还包括电源供应器，所述电源供应器的测试端经两个独立的导线分别与第一电极和第二电极连接。
各导线与对应电极的连接部位设有手柄。
所述的第一电极为椭圆形的板形结构。
所述的第二电极由铂金或黄金材料制成。
所述第二电极截面为直径0.3-0.5mm的圆形。
本发明采用2个分别独立的电极，放置位置和角度可以灵活调整；本发明的第二电极为针形电极，直径较细，在放入鸡胚视顶盖底部时，不会对组织或卵黄膜造成损伤，避免由此引起的胚胎死亡，且能够起到良好的导电作用，同时该针形电极呈弧形，弧形设计能够在不损伤鸡胚的情况下起到固定鸡胚视顶盖的作用；本发明的第一电极为板形电极，由于板形结构的面积较大，放置在视顶盖上方（注入质粒一侧）时，能够增加质粒的转染面积，提高转染效率和成活率。
本发明各导线与对应电极的连接部位设有手柄，便于操作时手握。
本发明的第二电极由铂金或黄金材料制成，具有良好的导电性能。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种使用电转染装置的鸡胚视顶盖电转染方法，包括以下步骤：
1）鸡胚培养
a）将新鲜受精鸡蛋清洗、擦干，孵育，孵育第3天取出鸡蛋，在鸡蛋钝端侧面间隔1cm处分别打孔，从钝端侧面开孔处吸取蛋清；
b）然后密封开孔，继续孵育至第5天，从鸡蛋正上方开孔处开口，暴露胚胎，进行转染；
2）鸡胚转染
在孵育第5天时，将质粒液注射到视顶盖内，将第二电极插入视顶盖底部，将第一电极放置在被转染视顶盖上方，在电压18V，电脉冲长度60ms，间隔100ms，电脉冲6次条件下转染即可；其中第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，针形电极呈弧形。
所述孵育温度为37.5-37.8℃，湿度为60%-65%。
所述取出蛋清的量为3-4ml。
所述注射质粒液的量为1-2μl；所述质粒液中质粒的浓度为2-4μg/μl。
步骤2）转染过程中，第一电极放置于被转染视顶盖的正上方，即注射质粒位置的上方，无需插入卵黄膜内，只是接近视顶盖浸入蛋清即可，而且不需要接触视顶盖。
本发明无需将鸡胚转移到培养皿中去壳培养后电转染，而是可以直接在蛋壳内进行操作。由于本发明所采用的电转染装置设计了2个单独的电极，能够分开来进行放置，只需要将鸡胚侧面打开窗口即可。本发明在鸡胚孵育第3天（E3）时从鸡胚的钝端用注射器取出部分蛋清，主要目的是在E5时开口的时候防止损伤胚胎，但与以往操作不同的是，本发明取出蛋清后无需开口，而是将鸡胚钝端侧面的2个孔密封，待培养至E5时再开口转染，这样能大大降低鸡胚污染的机会，提高鸡胚的存活率。本发明在鸡胚孵育第5天（E5）时进行转染，此时鸡胚是悬浮在整个蛋清的最上面，只需要将视顶部位的一层薄膜用尖头镊子撕破暴露视顶就可以进行转染，整个转染过程是在体视显微镜下进行，能够准确看到质粒注射的部位和电击的部位，操作简单，在电压18V，电脉冲长度60ms，间隔100ms，电脉冲6次条件下转染，鸡胚成活率高，转染后鸡胚发育时间更长，可以实现整个鸡胚在蛋壳内发育过程基因功能的研究。
附图说明
图1为本发明用于鸡胚视顶盖转基因的电转染装置的结构示意图。
具体实施方式
实施例1
实施例1是本发明提供的用于鸡胚视顶盖转基因的电转染装置的具体实施例，如图1所示，一种电转染装置，包括电源供应器1和经两个独立的导线2分别与电源供应器1测试端连接的第一电极3和第二电极4，所述第一电极3为椭圆形的板形电极，第二电极4为针形电极，所述针形电极呈弧形，由铂金材料制成；所述第二电极4截面为直径0.3mm的圆形；各导线2的与对应电极的连接部位设有手柄5。
实施例2
实施例2是本发明提供的鸡胚视顶盖的电转染方法的具体实施例，包括以下步骤：
1）鸡胚培养
a）将新鲜受精鸡蛋用温水洗净、擦干，水平放入恒温恒湿培养箱孵育，孵育温度为37.8℃，湿度为60%，孵育至第3天取出鸡蛋，不转动方向水平放置，在鸡蛋钝端侧面间隔1cm处用10ml注射器针头分别打一个孔，用带有针头的注射器将针头刺入钝端侧面开孔处吸取4ml蛋清；
b）然后密封两个开孔，继续孵育至第5天，从鸡蛋正上方开口，暴露胚胎，进行转染；
2）鸡胚转染
在孵育第5天时，将1μl、质粒浓度为4μg/μl的质粒液注射到一侧视顶盖内，将第二电极插入视顶盖底部，将第一电极放置在被转染视顶盖上方，在电压18V，电脉冲长度60ms，间隔100ms，电脉冲6次条件下转染即可；其中第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，针形电极呈弧形。
实施例3
实施例3是本发明提供的鸡胚视顶盖的电转染方法的具体实施例，包括以下步骤：
1）鸡胚培养
a）将新鲜受精鸡蛋用温水洗净、擦干，水平放入恒温恒湿培养箱孵育，孵育温度为37.8℃，湿度为60%，孵育至第3天取出鸡蛋，不转动方向水平放置，在鸡蛋钝端侧面间隔1cm处用10ml注射器针头分别打一个孔，用带有针头的注射器将针头刺入钝端侧面开孔处吸取3ml蛋清；
b）然后密封两个开孔，继续孵育至第5天，从鸡蛋正上方开口，暴露胚胎，进行转染；
2）鸡胚转染
在孵育第5天时，将2μl、质粒浓度为2μg/μl的质粒液注射到一侧视顶盖内，将第二电极插入视顶盖底部，将第一电极放置在被转染视顶盖上方，在电压18V，电脉冲长度60ms，间隔100ms，电脉冲6次条件下转染即可；其中第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，针形电极呈弧形。
本发明的各实施例中，第二电极的截面也可以为其他直径的圆形，如0.5mm。
本发明的各实施例中，第二电极也可以由其他导线材料制成，如黄金。

Claims (10)

1.一种电转染装置，包括用于与电源供应器测试端连接的第一电极和第二电极，其特征在于，所述第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，所述针形电极呈弧形。
2.根据权利要求1所述的电转染装置，其特征在于，该装置还包括电源供应器，所述电源供应器的测试端经两个独立的导线分别与第一电极和第二电极连接。
3.根据权利要求1或2所述的电转染装置，其特征在于，各导线与对应电极的连接部位设有手柄。
4.根据权利要求1或2所述的电转染装置，其特征在于，所述的第一电极为椭圆形的板形结构。
5.根据权利要求1或2所述的电转染装置，其特征在于，所述的第二电极由铂金或黄金材料制成。
6.根据权利要求1或2所述的电转染装置，其特征在于，所述第二电极截面为直径0.3-0.5mm的圆形，头部为光滑的圆头。
7.一种使用权利要求1所述电转染装置的鸡胚视顶盖电转染方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）鸡胚培养
a）将新鲜受精鸡蛋清洗、擦干，孵育，孵育第3天取出鸡蛋，在鸡蛋钝端侧面间隔1cm处分别打孔，从钝端侧面开孔处吸取蛋清；
b）然后密封开孔，继续孵育至第5天，从鸡蛋正上方开孔处开口，暴露胚胎，进行转染；
2）鸡胚转染
在孵育第5天时，将质粒液注射到视顶盖内，将第二电极插入视顶盖底部，将第一电极放置在被转染视顶盖上方，在电压18V，电脉冲长度60ms，间隔100ms，电脉冲6次条件下转染即可；其中第一电极为板形电极，第二电极为针形电极，针形电极呈弧形。
8.根据权利要求7所述的鸡胚视顶盖电转染方法，其特征在于，所述孵育温度为37.5-37.8℃，湿度为60%-65%。
9.根据权利要求7所述的鸡胚视顶盖电转染方法，其特征在于，所述取出蛋清的量为3-4ml。
10.根据权利要求7所述的鸡胚视顶盖电转染方法，其特征在于，所述注射质粒液的量为1-2μl；所述质粒液中质粒的浓度为2-4μg/μl。
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