CN108841865A - 一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用，属于神经系统基因功能研究技术领域。本发明小鼠脊髓体外电转基因方法，包括：将胚鼠从母鼠子宫中取出，剥离出所述胚鼠的脊髓，将含有目的基因的质粒注射到所述离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。将电转后的脊髓进行组织切片培养，利用该方法可以建立小鼠脊髓电转组织切片培养模型，为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法，从而寻找治疗脊髓疾病的有效手段；该方法更适合神经元的动态变化观察，是介于活体与细胞之间的一种研究技术。

Description

一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培 养模型建立方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种小鼠脊髓体外电转基因方法、小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法及其应用，属于神经系统基因功能研究技术领域。
背景技术
哺乳动物胚胎发育是在母体内进行，因此，在胚胎发育过程进行神经节系统异常的研究较为困难。小鼠是一种常用的实验模式动物，在前期的研究过程，我们已经在小鼠模型中进行了小鼠子宫内电转基因技术，该技术实现了在小鼠胚胎早期大脑皮层外源基因的异常表达，在特定阶段进行分析其对大脑皮层的影响(杨慈清,李小英,卢习,等.小鼠子宫内电转基因方法的建立[J].解剖学杂志,2013,36(2):170-172.)。随着活体电转基因技术的出现，可以实现外源基因在活体中不同组织器官的异常表达。脊髓是中枢神经系统重要的组成部分，具有十分重要的功能，比如反射、运动、传导等。脊髓一旦出现损伤，将会给机体造成严重的后果，比如肌肉萎缩，呼吸麻痹，甚至死亡(Danesin Cathy,SoulaCathy.Moving the Shh Source over Time:What Impact on Neural CellDiversification in the Developing Spinal Cord？[J].J Dev Biol, 2017,5(2):1-17；O'Shea Timothy M,Burda Joshua E,Sofroniew Michael V.Cell biology of spinalcord injury and repair.[J].J.Clin.Invest,2017,127(9):3259-3270.)。
脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，它的正常发育对机体至关重要，一旦其中某些基因的表达出现异常，就出对它的结构和功能产生一定的影响，从而对机体造成损伤。小鼠胚胎是一种研究中枢神经系统基因功能的常用动物模型，子宫内基因电转技术的应用，使外源基因在小鼠胚胎大脑皮层中异常表达成为可能。将外源基因注入大脑中的特定部位，用于研究外源基因的异常表达对特定部位神经发育的影响，杨慈清等利用子宫内基因电转技术成功的在大脑皮层部位表达了GFP阳性细胞(杨慈清,李小英,卢习,等.小鼠子宫内电转基因方法的建立[J].解剖学杂志,2013,36(2):170-172.)。但是在研究鼠胚脊髓神经发育时，要准确的将外源基因注入胚鼠脊髓腔并进行电转，操作难度过高，不易实现，目前未见相关研究报道。
杨慈清等利用鸡胚的原位活体电转技术，将pCAGGS-GFP质粒转染到脊髓一侧，成功的建立了一种鸡胚脊髓活体电转的技术(杨慈清,毛会丽,林俊堂.鸡胚培养及活体电转基因方法的建立[J].解剖学报,2012,43(04):564-568.)。但到目前为止，未见在小鼠脊髓中进行电转基因的研究，由于在小鼠子宫内将外源基因准确注射到胚胎脊髓腔内非常困难，因此外源基因难以转入脊髓中，对于外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响的研究，也遇到了很大的困难。因此，建立胚胎发育过程脊髓中外源基因异常表达模型对于脊髓异常结构形成的研究具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠脊髓体外电转基因方法，该方法为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法。
本发明还提供了一种小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法，该方法能够制备出小鼠脊髓电转组织体外培养切片。
本发明还提供了上述模型建立方法的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种小鼠脊髓体外电转基因方法，包括：将含有目的基因的质粒注射到胚鼠离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。脊髓为长管状，电极位于脊髓宽度方向左右两侧。
所述胚鼠离体脊髓由如下方法获得，将胚鼠从母鼠子宫中取出，剥离出所述胚鼠的脊髓，得离体脊髓。
本发明中建立一种小鼠胚胎早期脊髓体外电转基因方法，并可以在电转后对脊髓进行切片，然后进行组织片培养，在培养过程中对外源基因对神经元的作用进行观察和分析，是介于活体与细胞之间的一种研究技术，该技术为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法。本发明中的方法取出胚胎并剥离脊髓，有便于在显微镜下观察并准确操作，降低了操作难度，并在电转后短时间内实现脊髓切片并培养，保证了细胞不会死亡，该方法需要与组织片培养技术结合。
所述胚鼠应为11-13天的胚鼠。本发明的电转基因方法适合选用胚胎发育在11-13d的早期胚胎，胚鼠脊髓腔在发育最初阶段是慢慢扩大的过程，到11d左右，腔体最大，随着发育的继续，到13d左右，腔体封闭。当胚胎小于11天时，胚鼠个体太小，脊髓难以剥离；当胚胎发育大于13d后，脊髓腔体便封闭，无法将质粒注入到脊髓腔，很难实现正确转染。因此，优选的，本申请的方法选用11天的胚鼠。
在剥离脊髓时，将胚鼠的脊髓连同椎管一同剥离。
所述注射为用显微注射毛细玻璃针通过吹入的方式将所述质粒注射到脊髓腔内。该操作在体视显微镜下进行。
所述电转的条件为：电压33-37V，每次脉冲55-65ms，间隔95-105ms，电脉冲5-7次。
优选的，所述电转的条件为：电压35V，每次脉冲60ms，间隔100ms，电脉冲6次。
将胚鼠从母鼠子宫中取出时，连同胎盘一同取出，以延长胎鼠存活时间。
一种小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法，将上述电转脊髓包埋进入琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后进行切片，将得到的切片贴到微孔膜上进行培养。该方法中的组织切片培养模型非常适合用于外源基因功能研究。
在切片时，切下的组织片直接落入预冷的人工脑脊液中。所述人工脑脊液由以下组分组成：NaCl 7.371g，KCL 0.186g，NaH2PO4·2H2O 0.177g，NaHCO3 1.512g，CaCl20.266g， MgCl2·6H2O 0.19g，C6H12O6·H2O 2.16g，加入去离子水定容至1L。
所述琼脂糖为3.5-4.5％的琼脂糖，优选的为4％的琼脂糖。
所述微孔膜的孔径为0.35-0.45μm，优选的为0.4μm。微孔膜的大小约为30mm的正方形，是适合组织生长的悬挂式细胞培养皿膜。0.4μm的孔径可以允许营养物质通过，同时组织片上的细胞可以铺展到膜上进行生长。
上述的模型建立方法在探索胚鼠脊髓发育过程中外源基因功能研究中的应用。
具体的，将得到的电转脊髓包埋进入琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后进行切片，将得到的切片贴到微孔膜上进行培养，培养后进行固定、染色，通过观察切片上外源基因的异常表达情况来研究外源基因的功能。
在实际的培养时，将微孔膜转移到6孔培养板内，在每个培养孔内加1ml组织培养液，在该状态下，培养液刚好与组织片下放接触，但是没有将组织片浸没，保证了组织片下放的细胞能够获得营养，而上方能够充分的暴露在培养液外进行气体的交换，在这种培养条件下保证了组织不会漂浮，同时也保证了组织片不会坏死。
更为具体的，电转完成后将脊髓包埋进入4％的琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后将琼脂块裁剪合适大小，并固定在振荡切片机载物台合适的位置上，然后在槽内加入预冷的人工脑脊液，随后按照振幅1.5mm，速度0.5mm/s，切片厚度300μm的条件切片。将切片捞起后贴到0.4μm的微孔膜上，随后将微孔膜小室放入盛有1mL培养液的六孔板内，最后将六孔板放入5％CO2，37℃的培养箱内培养。
本发明先用上述小鼠脊髓体外电转基因方法得到电转脊髓，并对电转后的脊髓进行组织片培养，在培养过程中对外源基因功能进行研究。该方法在小鼠胚胎发育的11d到13d时，将小鼠胚胎从子宫内取出，放入37℃预热的生理盐水中；在体视显微镜下，将胚鼠脊髓连同椎管取出，在脊髓腔中吹入含有目的基因的质粒并进行电转；之后将电转过的脊髓包埋到琼脂糖中并切片，厚度300μm，将切片贴入微孔膜上，放入培养基中培养；在培养过程可以对组织片上被转染神经元进行观察，并对其功能进行分析。该技术为外源基因在小鼠胚胎发育过程在脊髓中对神经元的影响提供了一种新的研究方法，解决了小鼠胚胎发育过程脊髓中无法进行活体内电转基因的技术难题，更适合神经元的动态变化观察，是介于活体与细胞之间的一种研究技术。
附图说明
图1为实施例1中从胚鼠取出到脊髓切片培养整个完整的技术流程图；A：从孕鼠子宫内取出胚鼠；B：将脊髓连同椎管分离出来；C、D：将pCAGGS-GFP质粒注入脊髓腔；E：进行脊髓电转；F：将电转后的脊髓包埋；G：将琼脂块固定在载物台上；H：进行脊髓切片； I：将6-8片脊髓片放入微孔膜内进行培养；J：培养36h后，荧光体视显微镜下观察脊髓片情况；K：脊髓转染侧表达阳性GFP细胞；缩写：sp：spinal cord(脊髓)；nc：notochord(脊索)；rf：roofplate(顶板)；fp：floor plate(基板)；
图2为实施例1电转后脊髓切片培养36h后得到的组织切片染色结果图；其中，A、D、G为DAPI染色结果；B、E、H为GFP表达结果；C、F、I为各自叠加图；E为B图的局部放大，H为E图的局部放大；F为C图的局部放大，I为F的局部放大图；缩写：sp：spinal cord (脊髓)；ne：neuroepithelium(神经上皮)；rf：roof plate(顶板)；fp：floor plate(基板)；标尺，A-F为50μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本实施例中用到的材料与仪器如下所示：
报告基因pCAGGS-GFP质粒(绿色荧光蛋白)由Redies博士馈赠，实验室扩增提取；研究所用孕鼠为本实验室饲养的C57小鼠；质粒DNA大提试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)；4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Roche)；Neurobasal培养基(美国Invitrogen公司)；悬挂式细胞培养皿(PICM03050，美国Millipore公司)；SZM45体视解剖显微镜(浙江舜宇仪器有限公司)；CUY-21(BEX)多功能活体电转仪(日本NEPA公司)；M205FA型倒置体视显微镜(德国Leica公司)；VT1200S型振荡切片机(德国Leica公司)；P-2000拉针仪(美国Sutter公司)；激光共聚焦显微镜(Olympus ix81，日本Olympus Corporation公司)。
本实施例中主要试剂的配制如下所示：
1)人工脑脊液的配制(1L)
取NaCl 7.371g，KCL 0.186g，NaH2PO4·2H2O 0.177g，NaHCO3 1.512g，CaCl20.266g， MgCl2·6H2O 0.19g，C6H12O6·H2O 2.16g，加入去离子水定容至1L，调节pH值为7.2-7.4，使用0.22μm的滤膜过滤除菌。
2)神经元培养液的配制
取50mL离心管，在其中加入45mL的Neurobasal培养基，再加入10％的血清，1％的双抗和1％的谷氨酰胺，混合均匀使用。
本实施例中小鼠脊髓体外电转基因方法，包括如下步骤：
取怀孕11天的小鼠，腹腔注射4.3％的水合氯醛麻醉小鼠。在超净工作台内，将小鼠子宫内胚胎取出(小鼠胚胎取出时连同胎盘一同取出，延长胎鼠存活时间)，并放入37℃预热的生理盐水中(如图1A所示)。在体视显微镜下，将胚鼠的脊髓连同椎管一同剥离(如图1B 所示)，将浓度0.5g/L的pCAGGS-GFP质粒1μL用显微注射毛细玻璃针在体视显微镜下注射到脊髓腔内(如图1C、D所示)，将电极放到脊髓的两侧(电极位于脊髓宽度方向左右两侧)，其中正极放到需要转染一侧，使用电转仪进行电转(如图1E所示)，电转的条件电压35V，每次脉冲60ms，间隔100ms，电脉冲6次。
本实施例中小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法，包括：
1)脊髓组织切片
将上述电转完成后将脊髓包埋进入4％的琼脂糖(如图1F所示)中，待琼脂糖完全凝固后将琼脂块裁剪合适大小，并固定在振荡切片机载物台合适的位置上(如图1G所示)，然后在槽内加入预冷的人工脑脊液，随后按照振幅1.5mm，速度0.5mm/s，切片厚度300μm的条件切片(如图1H所示)。切片后由于组织结构比较微小，因此，将组织切片与琼脂一同转移到30mm悬挂式细胞培养皿膜上，具体的，将切片捞起后贴到0.4μm的微孔膜上(如图1I 所示)，随后将微孔膜小室放入盛有1mL培养液的六孔培养板内，最后将六孔板放入5％CO2，37℃的培养箱内培养。
2)染色及观察
36h后，将培养的脊髓片从培养箱中取出，倒掉培养液，在荧光体视显微镜下观察脊髓片培养情况(如图1J、1K所示)，将生长状况良好的脊髓片放入24孔板内，在孔板中加入3 mL的4％多聚甲醛(Paraformaldehyde PFA)固定30分钟，使用1×TBS洗三遍，每次5分钟。然后使用0.1％的TritonX-100透膜30分钟，用1×TBS洗三遍，每次5分钟。最后滴加含有DAPI的封片剂染色10分钟，盖上盖玻片，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
3)结果
电转后的组织通过切片后培养36h后荧光显微镜下进行观察可以看出，在脊髓一侧实现了报告基因GFP的表达(如图1J、K所示)。结果表明，通过体外电转实现了外源基因载体进入脊髓上皮细胞内，并在培养过程能够进行表达。
脊髓片培养36h后，在激光共聚焦显微镜下观察脊髓培养组织片GFP更为具体的表达状况如图2A-2I所示。从结果中可以看到，在转染一侧，有大量GFP阳性表达的细胞(图2B)，并有明显的轴突突起，轴突的投射方向基本趋于一致，从脊髓内向外侧边沿投射(图2C)。而GFP阳性表达的神经元并不是集中在脊髓上皮层，部分细胞在轴突的引导下向脊髓灰质区进行迁移(图2C，箭头所示)，这种结果我们将图进一步放大后会更清楚(图2D-2F)。这也说明被转染的神经上皮细胞进一步分化形成神经元后，在轴突的引导下会向特定部位进行迁移(图2F)，进一步将图局部放大后会发现单个神经元的结构更为清晰(图2G-2I)。在该过程，可以在培养过程进行观察单个神经元的动态变化过程，通过共聚焦显微镜的time-lapse 功能，进行观察外源基因异常表达后对神经元迁移、突起形成及路径选择等的影响。
这种现象是神经元分离后进行培养所不能观察到的。这也是组织片培养与细胞分离培养最大的不同，组织片培养过程，虽然组织离开机体，缺乏机体的调控，但是细胞仍然是在组织片上进行存活，受到组织片上各种因子及相邻细胞的影响。因此，通过活体电转后对脊髓片进行切片培养能够很好的实现外源基因功能的研究，该结果更接近于活体内的结果。
通过本发明中的小鼠脊髓体外电转基因方法成功的实现了pCAGGS-GFP质粒在鼠胚脊髓中的阳性表达，在激光共聚焦显微镜下，可以清晰的观察到神经元的形态和结构。该方法克服了子宫内小鼠胚胎脊髓难以实现电转技术的难题，降低了实验难度，提高了实验成功率，为研究脊髓外源基因的异常表达提供了更为简便的方法。无论是冰冻切片方法还是转染后神经元分离培养的方法，都会对神经元造成很大的损伤，对观察单个神经元的结构造成很大影响，然而脊髓片培养很好的解决了这个问题，由于脊髓片存在一定的厚度，它可以最大程度的维持神经元的完整，对研究单个神经元的结构以及行为具有重大意义。将这一方法和活细胞工作站相结合，我们能够记录单个神经元一段时间内的迁移、轴突投射和路径的选择等变化情况，从而进一步了解脊髓发育过程；也可以异常表达某种脊髓疾病相关外源基因，记录该基因异常表达后神经元异常现象，探索疾病基因如何发挥功能，导致疾病发生。

Claims (10)

1.一种小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：包括：将含有目的基因的质粒注射到胚鼠离体脊髓的脊髓腔内，然后将电转仪的电极放到脊髓的两侧，其中正极放到需要转染一侧，进行电转，得电转脊髓。
2.根据权利要求1所述的小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：所述胚鼠为11-13天的胚鼠。
3.根据权利要求1所述的小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：所述注射为用显微注射毛细玻璃针通过吹入的方式将所述质粒注射到脊髓腔内。
4.根据权利要求1所述的小鼠脊髓体外电转基因方法，其特征在于：所述电转的条件为：电压33-37V，每次脉冲55-65ms，间隔95-105ms，电脉冲5-7次。
5.一种小鼠脊髓电转组织切片培养模型建立方法，其特征在于：将权利要求1得到的电转脊髓包埋进入琼脂糖中，待琼脂糖完全凝固后进行切片，将得到的切片贴到微孔膜上进行培养。
6.根据权利要求5所述的模型建立方法，其特征在于：所述琼脂糖为3.5-4.5％的琼脂糖。
7.根据权利要求5所述的模型建立方法，其特征在于：所述微孔膜的孔径为0.35-0.45μm。
8.根据权利要求5所述的模型建立方法，其特征在于：在切片时，切下的组织片直接落入预冷的人工脑脊液中。
9.如权利要求5所述的模型建立方法在探索胚鼠脊髓发育过程中外源基因功能研究中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：通过观察切片上外源基因的异常表达情况来研究外源基因的功能。
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